XRCC1, un élément clef de la réparation des lésions de

l’ADN couplée à la réplication

Thèse présentée pour obtenir le grade de Docteur de l’Université Louis Pasteur – Strasbourg I

Nicolas Lévy22 novembre 2007

Dessin de N.Bouvier pour G.Almouzni

Thèse réalisée au sein du département Intégrité Du Génome de l’ UMR 7175, ESBS,

sous la direction de Josiane et Gilbert de Murcia

Modification de base:Désamination spontanée,

Alkylation, Oxydation

Cassuresimple-brin

(SSB)

Siteabasique

Cassuredouble-brin

(DSB)

Dimère dethymine

G

T

Nucléotidesmésappariés

Réactions spontannéesAgents alkylants

Radicaux oxygénésRayons X

Rayons XRadiomimétiques

Rayons UV Erreurs dela réplication

BER SSBR

DSBR:NHEJ

HRNER MMR

Les différents types de lésions de l’ADN

Adapté de D.M.Wilson III et al., Encyclopedia of Respiratory Medicine, Ed. Elsevier, 2005

5'5'

P OH

5'5'

P OH

-Rays, ROS...

• Recrutement de XRCC1 assemblage du complexe de réparation Lig3Lig3

XRCC1XRCC1

• Traitement des extrémités de la lésion Lig3Lig3

POH

PNKPNK

XRCCXRCC1

• Remplissage de la brèche

PNKPNK

Lig3Lig3

PARP-2PARP-2PolßPolß

XRCC1XRCC1

PARP-1PARP-1

FEN1FEN1

Adapté de Whitehouse et al. (2001) Cell 104, 107-117

• Ligation des extrémités de la lésion

PolßPolß

XRCC1XRCC1

Lig3Lig3

PARP-1PARP-1 PARP-2PARP-2

Réparation des cassures simple-brin de l’ADN (SSBR)

• Reconnaissance de la base endommagéeAPE1

XRCC1XRCC1

• Reconnaissance de la cassure simple-brin (SSB)

P OH

PARP-1PARP-1

LA famille PARP

Schreiber et al., Nature Reviews, 2006

La réaction de poly(ADP-ribosyl)ation

Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006

Poly(ADP-ribose)(PAR)

PARP-1

ADN

Schreiber et al., Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2006

Les rôles de la poly(ADP-ribosyl)ation

PARylation des histones

X-ray Repair Cross Complementing group 1, XRCC1

Protéine sans activité enzymatique : rôle de plateforme d’interaction et d’organisationDeux domaines homologues à l’extrémité C-terminale de BRCA1 (BRCT)Recrutée en quelques secondes au niveau des coupures de l’ADN sur le PAR synthétisé par PARP-1

Anti-PAR Anti-XRCC1 DAPI + merge

Recrutement de XRCC1 au niveau des lésions de l’ADN

Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR)

Cassures double-brin de l’ADN (DSB):Hautement toxiques pour la cellule : pertes de fragments de chromosomes, translocations... Directes (rayonnements ionisants, drogues radiomimétiques)Indirectes (réplication d’un ADN endommagé)

Deux voies de réparation des DSB:Recombinaison homologue (RH) : phases S tardive et G2 du cycle cellulaireRecombinaison non homologue (NHEJ) : tout au long du cycle cellulaire

Rothkam et al., Mol. Cel. Biol., 2003

Réparation des cassures double-brin de l’ADN (DSBR) par NHEJ

• Reconnaissance du DSB par Ku70/Ku80, sous-unités de DNA-PK

• Fixation de DNA-PKcs, assemblage de l’holoenzyme DNA-PK

• Alignement des deux extrémités de la lésion

• Ligation finale des deux extrémités de la cassure double-brin

Helleday et al., DNA Repair, 2007

DNA-PKDNA-PKcs

LigIV/XRCC4/XLF

Ku70/Ku80

Réplication de l’ADN

Duplication fidèle du matériel génétique de la cellule avant sa division

Deux étapes principales : initiation et élongation•Initiation : synthèse d’un oligonucléotide ARN/ADN servant d’amorce aux ADN polymérases réplicatives•Elongation : recrutement de l’anneau de processivité PCNA et des ADN polymérase réplicatives hautement fidèles et processives

Initiation

Elongation

Brin discontinu

Brin continu

Arezi et al., TIBS, 2000

L’ADN primase agit comme frein moléculaire au cours de la réplication de l’ADN (Jong-Bong Lee et al., Nature 439, 621-624)

p58 est la sous-unité régulatrice de l’ADN primase eucaryote

Complexe tetramérique chargé de la synthèse des amorces d’ARN/ADN nécessaires à l’initiation de la réplication et à la synthèse des fragments d’Okazaki•L’ADN primase p48-p58 synthétise la portion ARN des amorces •L’ADN polymérase synthétise la portion ADN des amorces

Le complexe ADN polymérase -primase

Les cellules EM9 déficientes en XRCC1 présentent 12x plus d’échanges de chromatides sœurs (SCE) que les cellules sauvages (Dillehay et al., Mutat. Res., 1983)

La mutation du domaine BRCT1 entraîne une diminution de la survie des cellules après traitement au MMS (Taylor et al., Mol. Cell. Biol., 2002)

La mutation du domaine BRCT1 entraîne un défaut de redémarrage de la synthèse d’ADN après traitement au MMS (Kubota et al., Nucl. Acids Res., 2003)

XRCC1 interagit avec l’anneau de processivité PCNA et colocalise avec cette protéine au niveau des foyers de réplication (Fan et al., Nucl. Acids Res., 2004)

Les cellules traitées par ARN interférence dirigé contre XRCC1 s’accumulent en phase S 24h après traitement au MMS (Brem et al., Nucl. Acids Res., 2005)

Un rôle pour XRCC1 dans le coordination entre réparation et réplication de l’ADN ?

Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli

Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose

Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa

Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés

Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse

p58

DNA-PKcs

GST GST-BRCT1

PARP-1

PCNA

GST-BRCT1

Dimèrede GST

GST

ab

c

de

GS

T-X

RC

C1 1-170

170-428282-428314-428427-633

GST a b c d e WB

XRCC1 et p58 interagissent in vitro

XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 de l’ADN primase après traitement à l’hydroxyurée

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est suffisant pour l’interaction avec p58

Far western blot Anti-XRCC1Amido black

XRCC1 interagit avec la moitié N-terminale de p58

XRCC1

p58 N C1 6 12 G266 509

NLS

-HU +HU

XRCC1 et p58 interagissent in vivo

XRCC1 et p58 colocalisent dans les foyers de réplication des cellules traitées par hydroxyurée

Le poly(ADP-ribose) et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

Test de mobilité électrophorétique:Le PAR et l’ADN sont en compétition pour un même site de fixation sur p58

Le PAR inhibe la liaison de p58 à l’ADN substrat

par sa moitié N-terp58 lie le PAR

Influence du PAR sur l’activité primase

La fixation de PAR par p58 inhibe l’activité primase de p48-p58 in vitro

La liaison du PAR à p58 inhibe fortement l’activité primase du complexe p48-p58

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent une forte automodification de PARP-1 et une forte hétéromodification de XRCC1 au niveau de son domaine BRCT1

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux élevés de PAR

DAPI GFP-BRCT1 Anti-PAR Colocalisation

Les cellules surexprimant le domaine BRCT1 de XRCC1 présentent des niveaux significatifs de PAR nucléaire en absence de traitement, et des niveaux très élevés de PAR après endommagement de l’ADN

2n 4n 2n 4n

XRCC1 est nécessaire à la progression des fourches de réplication sur un ADN endommagé

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 perturbe fortement la progression des cellules à travers le cycle cellulaire, après traitement au MNU

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 entraîne une accumulation des cellules en début de phase S : la réplication est inhibée, ralentie

La surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 inhibe la progression des fourches de réplication sur un ADN

endommagé

Xenopus laevis:

- Allotétraploïde- 36 chromosomes- 20-22°c température optimale de croissance- ♀ 11cm / ♂ 6cm- œufs 1,2-1,3 mm Ø- 1000 à 6000 œufs/ponte- temps de génération >2 ans

Microinjection,Extraits d’œufs ,

Réplication in vitro

Le modèle Xenopus laevis

Extraits d’oeufs de xénope

ADN matrice

Formation d’une Membrane nucléaire

Cycle unique et complet de réplication de l’ADN

Système acellulaire :

Immunodeplétion (anticorps anti-XRCC1)

Utilisation d’inhibiteurs PARP/PARG

Addition de protéines recombinantes (BRCT1 / BRCT2)

Traitement de la chromatine par des agents génotoxiques

-Analyse des cinétiques de réplication-Analyse des protéines (WB, IF)-Analyse de la taille des ADN synthétisés

Réplication de l’ADN dans les extraits d’œufs de xénope

XRCC1 est une protéine fortement conservée au cours de l’évolution

~ 80% d’homologie de séquence entre la protéine humain et celle de xénope> 90% d’identité de séquence au niveau du domaine BRCT1

@XRCC1Pc souris A

Xenop

us e

gg

extra

cts

HeLa

cells

@PARP1Pc souris EGT69

Xenop

us e

gg

extra

cts

HeLa

cells

X.l. XRCC1 BRCT1 ralentit la réplication des ADN endommagés

Analyse des cinétiques de réplication de l’ADN

L’addition de GST-BRCT1 recombinant dans les extraits d’œufs de xénope freine la réplication des ADN endommagés

Chromatine non traitée Chromatine traitée MMS

Analyse de la taille des ADN répliqués sur gel alcalin

X.l. XRCC1 BRCT1 bloque l’initiation de la réplication des ADN endommagés

Accumulation de complexes de pré-

initiation

Défaut d’association de PCNA sur la

chromatine

Inhibition de l’initiation de la réplication

L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par XRCC1 BRCT1 est dépendant de sa PARylation

Analyse des cinétiques de réplication de la chromatine endommagée au MMS

+GST-BRCT1

+ GST-BRCT1+ inhibiteur PARP KU0058948

+ GST

L’inhibition de la réplication des ADN endommagés par le domaine BRCT1 de XRCC1 dépend de sa modification par PARP-1

Modèle : XRCC1 interagit avec p58 pour freiner la réplication des ADN endommagés afin de préserver

l’intégrité du génome

Identification de nouveaux partenaires protéiques du domaine BRCT1 de XRCC1

Surexpression du domaine BRCT1 de XRCC1 en fusion avec la GST dans E. coli

Immobilisation sur colonne de GSH-sepharose

Incubation avec extraits protéiques des cellules HeLa

Elution du GST-BRCT1 et des partenaires co-purifiés

Séparation des protéines par SDS-PAGE et analyse par spectrométrie de masse

p58

DNA-PKcs

GST GST-BRCT1

PARP-1

PCNA

GST-BRCT1

Dimèrede GST

GST

DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1

Far western blotAnti-XRCC1

XRCC1 interagit avec les 3 sous-unités de DNA-PK

ab

c

de

GS

T-X

RC

C1 1-170170-428282-428314-428427-633

GST a b c d e

DNA-PK interagit avec le domaine BRCT1 de XRCC1

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK sur son domaine BRCT1 en réponse aux rayons

ionisants

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vivo par DNA-PK en réponse aux rayonnements ionisants

ab

c

de

GS

T-X

RC

C1 1-170

170-428282-428314-428427-633

GST a b c d e

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est phosphorylé in vitro par DNA-PK

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK au niveau de sa sérine 371

DNA-PK

S371

Un seul motif potentiel de phosphorylation par DNA-PK de type SQ au sein du domaine BRCT1 de XRCC1 : SQ 371/372

La sérine 371 de XRCC1 constitue le site de phosphorylation par DNA-PK

XRCC1 dimérise via son domaine BRCT1 et la phosphorylation de la sérine 371 entraîne la

dissociation du dimère XRCC1

ab

cd

e

GS

T-X

RC

C1 1-170

170-428282-428314-428427-633

XRCC1

Le domaine BRCT1 de XRCC1 est une interface de dimérisation

La phosphorylation de la sérine 371 entraîne la dissociation du dimère XRCC1

DNA-PK

Le dimère XRCC1 stimule l’activité kinase de DNA-PK in vitro

GSTS15

P

P53

XRCC1 stimule fortement l’activité kinase de DNA-PK

C’est la forme dimère de XRCC1 qui possède cette capacité à stimuler DNA-PK

Le mutant S371L de XRCC1 entraîne la persistance de cassures double-brin de l’ADN

EM9(Déficientes en XRCC1)

EM9XRCC1 wt

EM9 XRCC1S371L

NT

1G

y/1

H

Immunofluorescence: anti-H2AX

Foyers H2AX = sites de cassures double-brin de l’ADN

Le mutant non phosphorylable S371L de XRCC1 entraîne une persistance des DBS alors qu’il est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK

Le dimère XRCC1 est capable de stimuler l’activité kinase de DNA-PK, mais sa dissociation est importante pour la suite du mécanisme de réparation des DSB

Modèle : XRCC1 agit comme commutateur entre les voies

de SSBR et DSBR

XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

XRCC1 interagit avec la sous-unité p58 du complexe ADN polymérase -primase pour

freiner la réplication des ADN endommagés

XRCC1 est phosphorylé par DNA-PK et stimule l’activité de cette kinase pour favoriser la réparation des DSB générés

lors de la réplication de l’ADN

PARP-1 interagit avec l’ADN polymérase et inhibe son

activité en l’hétéromodifiant (Eki et al., FEBS Letters , 1994;

Simbulan-Rosenthal et al., Biochemistry, 1996; Dantzer et al., Nucl. Acids Res.,

1998)

PARP-1 interagit avec DNA-PK et stimule son activité kinase

en l’hétéromodifiant (Ruscetti et al., J. Biol. Chem., 1998)

XRCC1 et PARP-1 forment un couple étroitement lié et agissent de façon synergique pour inhiber la réplication des

ADN endommagés et pour organiser la transition entre SSBR et DSBR

XRCC1 et PARP-1 dans la coordination entre réparation et réplication de l’ADN

XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

Chimiothérapies, radiothérapies : endommagement de l’ADN de cellules tumorales pour provoquer leur mort.

Limites : effets secondaires sur les cellules saines de l’organisme, résistance des tumeurs

Inhibition des voies de réparation de l’ADN : potentialisation des traitements anticancéreux

Inhibiteurs PARP : potentialisation des traitements par irradiationeffet important sur les tumeurs liées à BRCA1/2

G. Noël et al., Mol. Cancer Ther., 2006Bryant et al., Nature, 2005

Aptamère (court oligonucléotide à structure tridimensionnelle complexe) :

Forte affinité pour une cible protéique spécifique Inhibition des fonctions de la cible liée

XRCC1 et PARP-1 dans les thérapies anticancéreuses

Inhibition des fonctions du domaine BRCT1 de XRCC1 : perturbation de la prise en charges de lésions au cours de la réplication ainsi que du

NHEJ

Peptide inhibiteur, se liant en dominant négatif au domaine BRCT1 de XRCC1 et empêchant les interactions protéiques normalement

assurées par ce domaine

Accumulation importante de lésions dans l’ADNCiblage spécifique des cellules tumorales en prolifération

A tout le département « Intégrité Du Génome » A tout le département « Intégrité Du Génome » de l’ESBS :de l’ESBS :

http://parplink.u-strasbg.frhttp://parplink.u-strasbg.fr

DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE l’UMR 7175DEPARTEMENT “INTEGRITE DU GENOME” DE l’UMR 7175ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG ECOLE SUPERIEURE DE BIOTECHNOLOGIE DE STRASBOURG

UNIVERSITE LOUIS PASTEURUNIVERSITE LOUIS PASTEURLRC-CEA n° 39LRC-CEA n° 39

boulevard Sébastien Brant, BP 10413 boulevard Sébastien Brant, BP 10413 F-67412 Illkirch Cedex, FranceF-67412 Illkirch Cedex, FranceUn grand merci :Un grand merci :

Au jury :Au jury :Directeur de thèse : Dr. Gilbert de MurciaDirecteur de thèse : Dr. Gilbert de MurciaRapporteur interne : Pr. Philippe CarbonRapporteur interne : Pr. Philippe CarbonRapporteur externe : Dr. Janet HallRapporteur externe : Dr. Janet HallRapporteur externe : Dr. Pablo RadicellaRapporteur externe : Dr. Pablo RadicellaExaminateur : Dr. Domenico MaioranoExaminateur : Dr. Domenico MaioranoInvitée : Dr. Anne BressonInvitée : Dr. Anne Bresson

Au Dr. Marcel Méchali et à tout le Au Dr. Marcel Méchali et à tout le laboratoire « Surveillance et Stabilité du laboratoire « Surveillance et Stabilité du Génome » de l’Institut de Génétique Génome » de l’Institut de Génétique Humaine de MontpellierHumaine de Montpellier

A Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèseA Josiane Ménissier de Murcia, Directrice de thèse

Laboratoire derechercheassocié n° 39V

Activité spécifique : Sa = (CPMi x Fd)/(CdATPxV) (cpm/pmol dATP)

Quantité de dATP incorporée : ndATP = (CPM x Fd)/Sa (pmol)

Masse des nucléotides incorporés : m = ndATP x 4 x 0,33 (ngr)

Pourcentage d’ADN répliqué = m / mchromatin

Inhibition de la réplication indépendante des checkpoints

Perspectives

Etude dans un modèle déficient pour XRCC1 (cellules EM9, extraits

d’oeufs de xénope déplétés pour XRCC1…)

Etude de la réplication sur un substrat synthétique avec des lésions

localisées

La réplication de l’ADN est inhibée par l’interaction entre le

domaine BRCT1 (PAR)ylé de XRCC1 et la sous-unité p58 de l’ADN

primase, en réponse au stress génotoxique, afin de maintenir

l’intégrité du génome (évite les collisions entre les fourches de

réplication et les SSB non réparés, susceptibles de générer des

DSB hautement toxiques)

Arrêt de la réplication par inhibition de l’ ADN primase par le ppGpp en

response stress nutritionel (Wang et al. Cell 128, 865-875)

Stabilisation de la machinerie réplicative sur un ADN endommagé

grâce à l’ATP généré lors de la dégradation du PAR (Maruta et al. Biol. Pharm.

Bull. 30, 447-450)

Conclusions