Wartel Morgane - M2 MBVB Système de sécrétion de type II et Sécrétine.

Wartel Morgane - M2 MBVB

Système de sécrétion de type II

et

Sécrétine

La sécrétion

Figure 1 Sécrétion chez les bactéries à Gram –

MI : Membrane interneME : Membrane externe

Milieu extérieur

Cytoplasme

ME

Périplasme

MI

2

Les différents systèmes de sécrétion

Figure 2 Les différents de systèmes de sécrétion

3

Büttner and Bonas, 2002

Type VI secretion system

Le système de sécrétion de type II

Figure 3 Sécrétion en 2 étapes

Milieu extérieur

ME

Périplasme

MI

Cytoplasme

2. Sécrétion

1. Exportation

(SEC ou TAT)

4

Le système de sécrétion de type II

Figure 4 Modèle d’assemblage du TIISS

5

OM

IM

Filloux, 2004

Les sécrétines

Les sécrétines sont des protéines qui forment de larges canaux dans la membrane externe

Les sécrétines sont impliquées dans différents processus :

- le système de sécrétion de type II

- le système de sécrétion de type III

- les pili de type IV

- la sécrétion des bactériophages filamenteux

6

Les sécrétines

Les sécrétines forment des complexes multimériques (12 à 15 SU) très stables.

Figure 5 Monomère de sécrétine (A) ; Complexe de sécrétines (B)Les dimensions indiquées et le nombre de monomères (SU) présents dans le complexe final varient d’un système à l’autre 7

Bitter, 2003

8

Les sécrétines

Quelques exemples de sécrétines

PilQ chez N. meningitidis et M. xanthus

OutD chez E. chrysanthemi

PulD chez K. oxytoca

Partie C terminale communePartie N terminale variable

TIISS

Pili de type IV

La sécrétine PulD

- protéine intégrale de la membrane externe de 68 Kda

- possède un peptide signal en N-terminal

- forme un dodécamère (12 SU) dans la membrane externe très stable

- copurifie avec PulS

Figure 6 Multimère de PulD

14 nm

7 nm

9

La sécrétine PulD

PulS :

chaperonne spécifique de PulD

nécessaire pour la protection de PulD de la protéolyse

nécessaire pour la localisation de PulD dans la membrane externe

10

PulD peut s’insérer dans la membrane externe si :

elle est exportée dans le périplasme (via SEC)

elle est localisée à la membrane externe grâce à PulS

→ Rôle de PulS ?

11

La sécrétine PulD

Ingrid Guilvout, Mohamed Chami, Andreas Engel, Anthony P Pugsley, and Nicolas Bayan

Novembre 2006, The EMBO Journal

Bacterial outer membrane secretin PulD assembles and

inserts into the inner membrane in the absence of its pilotin

- Domaine N : prolongements dans le périplasme ; contient le peptide signal (SEC)

- Domaine C (262-616) : région de la membrane externe obtenue par protéolyse limitée

- Domaine S : site de liaison pour la chaperonne PulS

Figure 8 Dodécamère de PulD En bleu: domaine C

Figure 7 Schéma de PulD13

N— —C

1 262 616 660

Domaine CDomaine N Domaine S

Périplasme

Membrane externe

Liaison PulS

Introduction

Chami M. et al, 2005

Introduction

Etude de la multimérisation et l’insertion dans la membrane de 2 formes de PulD :

PulD : forme WT

PulD-CS : domaines C et S fusionnés au peptide signal

→ Expression dans l’hôte hétérologue E. coli

N— —C

Domaine C Domaine S

14

N— —C

1 262 616 660


Périplasme

Membrane externe

Liaison PulS

Figure 9 Localisation des monomères de PulD et PulD-CS en présence de PulS par flottaison sur gradient de sucrose (traitement au phénol, western blot avec AC α-PulD)

→ PulD-CS est principalement localisée dans la membrane externe en présence de PulS

15

30 % de sucrose

60 % de sucrose

Echantillon

I - PulD-CS forme des dodécamères dans la membrane externe

Figure 10 Analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de PulDhis et PulD-CShis en présence de PulS (solubilisation des multimères avec ZW3-14, purification sur colonne de cobalt)

: Formes multimériques de PulDhis ou PulD-CShis

→ PulD-CS forme un multimère16


Figure 11 A: Microscopie électronique à transmission de PulD-CShis purifiées en présence de PulS B: Microscopie cryo-électronique du complexe PulDhis en présence de PulS (issue de Chami et al, 2005) Encadrés en bas: images moyennées avec une vue du haut et une vue de côté C: Schéma d’un multimère de PulD-CShis

→ Comme PulD, PulD-CS forme un dodécamère localisé dans la membrane externe

→ Le domaine N n’influence ni la dodécamérisation, ni la localisation dans la membrane externe

14 nm

7 nm

A B C

17

PulD-CShis PulD



II – PulD forme des dodécamères dans la membrane interne en absence de PulS

Figure 12 Analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie de PulDhis et PulD-CShis en présence ou non de PulS

: Formes multimériques de PulDhis ou PulD-CShis

→ PulD et PulD-CS forment des multimères en absence de PulS18

Figure 13 Microscopie électronique à transmission (B; C; D) et cryo-électronique (A) A: PulDhis purifiées en présence de PulS (issue de Chami et al, 2005) B: PulDhis purifiées en absence de PulS C: PulD-CShis purifiées en présence de PulS D: PulD-CShis purifiées en absence de PulS Encadrés en bas: images moyennées avec une vue du haut et une vue de côté

→ PulD et PulD-CS forment des dodécamères en absence de PulS

19

B

PulDhis

D

PulD-CShisPulDhis + PulS PulD-CShis + PulS

CA



Figure 14 Localisation des multimères de PulD en absence de PulS par flottaison sur gradient de sucrose

→ Les multimères de PulD et PulD-CS sont localisés dans la membrane interne en absence de PulS

→ PulD et PulD-CS ne forment pas d’agrégats en absence de PulS

20

30 60% sucrose

Membrane interne

Membrane externe


Figure 15 Microscopie électronique de vésicules de membrane internes de E. coli (purifiées à partir du gradient de sucrose) produisant PulD (A); ou PulD-CS (B) en absence de PulS.

: Multimère de sécrétine

Selon les auteurs, les vésicules de membrane interne portent des multimères de PulD ou PulD-CS

21

PulD PulD-CS

III – En absence de PulS, PulD s’insère dans la membrane interne

Figure 16 Extraction de PulD-CShis, de PspA et SecG par différentes concentrations d’urée (traitement au phénol, western blot avec AC α-PulD, AC α-PspA, AC α-SecG) PspA: protéine périphérique de la membrane interne SecG: protéine intégrale de la membrane interne

Selon les auteurs, PulD-CS et PulD se comportent comme des protéines intégrales de la membrane interne 22

L’urée permet de libérer les protéines périphériques de la membrane interne, mais pas les protéines intégrales de la membrane interne


Définition de la réponse au choc phagique : Elle a lieu suite à la perméabilisation de la membrane interne d’E. coli. Elle est caractérisée par une production massive de PspA.

Figure 17 Les protéines de la membrane interne sont séparées par SDS-PAGE puis révélées avec des AC-anti PspA

→ En l’absence de PulS, il y a induction de la réponse au choc phagique

23


Figure 18 Induction de la production de PspA en présence de différentes formes de PulD, en absence de PulS (Western blot avec AC α-PulD et AC α-PspA) D640::TEV: forme efficacement des multimères D281::TEV et N533::TEV: ne forment pas de multimères

→ La réponse au choc phagique est dépendante de la multimérisation de PulD

→ L’ensemble des résultats prouve qu’en absence de PulS, PulD et PulD-CS s’insèrent dans la membrane interne, et forment probablement un pore

24


PulD-CS est adressée à la membrane externe en présence de PulS

PulD-CS forme des dodécamères « PulD-like » dans la membrane externe en présence de PulS

→ La moitié C terminale de PulD (domaines C et S) est un module autonome pour la dodécamérisation et pour l’insertion dans les membranes

→ La moitié N terminale n’influence pas ces 2 propriétés

→ Quel est l’intérêt d’avoir produit PulD-CS pour la suite de l’article ?

25

Discussion

PulS n’est pas nécessaire pour la formation des dodécamères de PulD

Le rôle de PulS est d’empêcher la localisation des dodécamères de PulD dans la membrane interne

En absence de PulS, les dodécamères de PulD s’insèrent dans la membrane interne car :

- les vésicules de membrane interne contiennent des multimères de PulD

- Le test à l’urée suggère que PulD est une protéine intégrale de la membrane interne

- L’induction de la réponse au choc phagique dans les cellules produisant PulD sans PulS est en accord avec la formation d’un poredans la membrane interne

26

→ PulD est une protéine de membrane externe qui peut s’insérer efficacement dans la membrane interne pour former un pore en absence de sa chaperonne

27

In Vitro Multimerization and Membrane Insertion of Bacterial Outer Membrane Secretin PulD

Ingrid Guilvout, Mohamed Chami, Catherine Berrier, Alexandre Ghazi,

Andreas Engel, Anthony P. Pugsley and Nicolas Bayan

Juin 2008, JMB

Introduction

2 formes de PulD sont étudiées dans cet article :

PulD : forme native sans le peptide signal

PulD-CS : domaines C et S

→ Expression dans l’hôte hétérologue E. coli pour les expérience in vivo (en+ IPTG)

N— —C


N— —C

Domaine C Domaine S

29

Membrane externe

Liaison PulS

Périplasme

PulD et PulD-CS sont synthétisées in vivo et in vitro sans leur peptide signal

Etude de l’insertion de PulD et PulD-CS dans la membrane interne de bactéries et dans des liposomes artificiels

Etude 2 autres sécrétines :

- OutD de E. chrysanthemi, nécessite OutB (PulS-like) pour sa localisation dans la membrane externe

- PilQ de N. meningitidis, nécessite PilW et Omp85 pour sa multimérisation et son insertion dans la membrane externe

Introduction

30

I – Synthèse et multimérisation de PulD, OutD et PilQ sans leur peptide signal, in

vivo

31

Figure 19 Synthèse in vivo de différentes sécrétines. Analyse par Western Blot.

- : Sans traitement ; U : Traitement à l’urée ; P : Traitement au phénol

→ PulD et OutD pourraient multimériser in vivo en absence de leur peptide signal

→ PilQ ne multimériserait pas in vivo en absence de son peptide signal

→ La capacité de PulD, OutD et PilQ à multimériser est en accord avec leur toxicité

Croissance en +IPTG

Arrêt immédiat

Arrêt immédiat

Arrêt au bout de 30

minutes

Croissance normale

(e)

Croissance normale

II – Synthèse et multimérisation de PulD en présence de lipides, in vitro

Figure 20 Synthèse in vitro de PulD et PulD-CS en présence de Brij-35 (1 et 2) ou de liposomes (3 et 4) (western blot avec AC α-PulD et AC α-PulD-CS)-: Pas de traitement; + : Traitement au phénol

→ Le détergent Brij-35 inhibe la multimérisation de PulD in vitro

→ Les liposomes semblent stimuler la formation de multimères de PulD in vitro

32

III – Les multimères de PulD s’insèrent dans des liposomes in vitro

33

Centrifugation à 23000g pendant 10 minutes

Culot : - Liposomes

- PulD et PulD-CS

- GFP (protéine soluble) ?

→ PulD et PulD-CS sont associés aux liposomes

Figure 21 Localisation de PulD synthétisée in vitro en présence de liposomes par flottaison sur gradient de sucrose (Western blot avec AC α-PulD)

→ Les liposomes marqués avec un colorant fluorescent flottent en haut du gradient (35% de sucrose)

→ PulD et PulD-CS flottent en haut du gradient (35% de sucrose)

→ Ceci suggèrent que les multimères de PulD et PulD-CS sont associés aux liposomes

GFP flotte en haut du gradient (35% de sucrose)34


Figure 22 Effet de l’urée sur la sédimentation de PulD et PulD-CS synthétisée in vitro en présence de liposomes (traitement au phénol, analyse SDS-PAGE colorée au bleu de Coomassie)-: Sans traitement; + : Traitement à l’urée

→ La GFP n’est pas retrouvée dans le culot

→ PulD et PulD-CS sont retrouvées dans le culot après le traitement à l’urée

→ PulD et PulD-CS seraient insérées les liposomes

35

Centrifugation 23000g 10 minutes

Culot + Urée

Centrifugation 285000g 30 minutes

Culot


36

PulD-CS PulD

Figure 23 Analyse par microscopie électronique de PulD-CS (a) et PulD (b) synthétisées in vitro en présence de liposomes Multimère de sécrétine inséré dans le liposomeEncadré: Multimère de sécrétine purifié avec ZW3-14 Vue de côté Vue du dessus

→ On observe des multimères de PulD-CS et de PulD

→ Les multimères de PulD-CS sont similaires aux multimères de PulD-CS extraits de membranes bactériennes

→ PulD-CS s’assemble en complexe dodécamérique dans les liposomes


Figure 24 Analyse par microscopie cryo-électronique de PulD-CS synthétisées in vitro en présence de liposomes

Encadré: Image moyennée

Selon les auteurs, la présence de multimères dans le périmètre du liposome suggère qu’ils sont insérés dans la membrane

37


Figure 25 a : Microscopie électronique de OutD synthétisée in vitro en présence de liposomes.

: Multimère de OutD b : Synthèse in vitro de PilQ en présence de Brij-35 (+ Brij) ou de liposomes (+ Lip) (Western blot avec AC α-PilQ)

→ Les multimères de OutD sont associés à la membrane des liposomes

→ PilQ forme uniquement des monomères en présence de liposomes

IV – Multimérisation de OutD et PilQ in vitro

38

In vivo et in vitro, PulD et OutD en absence de leur peptide signal, peuvent multimériser et s’insérer dans une bicouche lipidique

In vivo et in vitro, PilQ en absence de son peptide signal, ne formerait pas de multimères en présence d’une bicouche lipidique

→ Ces résultats concordent avec le besoin ou non de facteur(s) additionnel(s) pour la multimérisation de la sécrétine et son insertion dans la membrane

39

Discussion

Utilisation d’un système de transcription-traduction couplé in vitro qui permet en présence de liposomes de synthétiser, d’assembler et d’insérer dans une membrane un complexe multimérique

L’insertion des multimères de PulD dans les liposomes a été vérifiée par :

- leur coflottaison dans un gradient de sucrose

- leur résistance à l’extraction par l’urée

- la microscopie électronique

→ Les pores de sécrétines sont ouverts ou fermés in vitro ?

40

PulD a la capacité spontanée de multimériser et de s’insérer dans une bicouche lipidique

PulS empêche l’insertion spontanée des multimères de PulD dans la membrane interne

La famille des sécrétines peut-être divisée en 2 sous-groupes :

- Les sécrétines qui peuvent multimériser et s’insérer spontanément dans une membrane (PulD et OutD impliquées dans le TIISS)

- Les sécrétines qui nécessitent un ou plusieurs partenaires pour multimériser et s’insérer dans une membrane (PilQ impliquée dans les pili de type IV)

41

Conclusion générale

Membrane interne

Périplasme

Membrane externe

SEC

PulD

PulS

LolA

PulD

PulS

PulD

1

2

3

4 5

42

LolB

5 : Multimérisation de PulD et insertion dans la membrane externe

4 : PulS se lie à LolB, libération de LolA

3 : Formation rapide d’un complexe PulD-PulS-LolA

2 : Translocation au travers de la membrane interne via SEC

1 : Synthèse dans le cytoplasme

En présence de PulS

+LolA

→ Pourquoi utilisation de la voie Lol ?

Membrane interne

Périplasme

Membrane externe

SEC

PulD

PulS

LolA

PulD

LolB

PulS

PulD

PulD

1

2

3

4 5

6 7

43

6 : Multimérisation de PulD

7 : Insertion par défaut dans la membrane interne

En absence de PulS

+LolA

→ PulD a une voie de biogénèse différente des autres protéines intégrales de

la membrane externe

44

Membrane interne

Périplasme

Membrane externe

SEC

PulS

LolA

PulD

LolB

PulS

PulD

1

2

3

4 5

Skp

Omp85

Skp

5 : Multimérisation et insertion dans la membrane externe

4 : Prise en charge par le complexe Omp85

3 : Prise en charge par Skp et transport à travers le périplasme

2 : Translocation au travers de la membrane interne via SEC ou TAT

1 : Synthèse dans le cytoplasme

+LolA

Localisation correcte de PulD « au dessus » du TIISS

45

Membrane interne

Périplasme

Membrane externe

PulD

PulE

PulG?PulF

Références

Bayan N., Guilvout I., Pugsley A.P. - Secretins take shape 2006

Bitter W. – Secretins of Pseudomonas aruginosa : large holes in the outer membrane 2003

Filloux A. - The underlying mechanisms of type II protein secretion 2004

Büttner D., Bonas U. - Port of entry, the type III secretion translocon 2002

Chami M., Guilvout I., Gregorini M., Remigy H., Muller S.A., Valerio M., Engel A., Pugsley A.P., Bayan N. - Structural Insights into the Secretin PulD and Its Trypsin-resistant Core 2005

Cours de TAP 2007-2008 de S. Bleves et R. Voulhoux

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