VALIDATION DE FACTEURS POTENTIELS DE ......(RbAp46), Siva, PGD2S, Ki67 et p53. L’analyse...

ION POPA

VALIDATION DE FACTEURS POTENTIELS DE CHIMIORÉSISTANCE DU CANCER DE L’OVAIRE

PAR IMMUNOHISTOCHIMIE

Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de maîtrise en médecine expérimentale pour l’obtention du grade de maître ès sciences (M. Sc.)

FACULTÉ DE MÉDECINE

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2006 © Ion Popa, 2006

i

Résumé court

En comparant des tumeurs chimiosensibles et chimiorésistantes par la technologie de

micropuces d’ADN on a développé un panel de gènes qui peuvent prédire la réponse à la

chimiothérapie. L’objectif de l’étude présent est d’évaluer par immunohistochimie (IHC)

sur des blocs de «tissue array» la capacité de prédire la réponse à la chimiothérapie et

l’importance pour quelques protéines correspondantes. Les gènes sélectionnés pour être

validés sont : GST, MMP1, Fos-B, CTSL2, HSP10, CD36, MIP2 (CXCL2), RBBP7

(RbAp46), Siva, PGD2S, Ki67 et p53. L’analyse statistique montre une association entre la

réponse complète, HSP10 et p53 (p=0,07 et 0,06 respectivement), entre la survie sans

progression HSP10 et MMP1 (p=0,007 et 0,08 respectivement) et entre la survie et HSP10,

MMP1 et Ki67 (p=0,02, 0,09 et 0,04 respectivement). Le profil du cancer ovarien avec une

bonne réponse à la chimiothérapie que nous avons trouvé est: MMP1 négatif, HSP10, p53

et Ki67 positifs. Un index pronostique basé sur ces 4 marqueurs apporte des informations

pronostiques supplémentaires que chaque marqueur individuellement.

ii

Résumé long

Introduction : En comparant des tumeurs chimiosensibles et chimiorésistantes par la

technologie de micropuces d’ADN on a développé un panel de gènes qui peuvent prédire la

réponse à la chimiothérapie. L’objectif de l’étude présent est de valider par

immunohistochimie (IHC) quelques protéines correspondantes et d’évaluer leur capacité de

prédire la réponse à la chimiothérapie et leur importance comme facteurs pronostiques.

Matériel et méthode : Dix gènes ont été sélectionnés pour être validés : GST, MMP1, Fos-

B, CTSL2, HSP10, CD36, MIP2 (CXCL2), RBBP7 (RbAp46), Siva, et PGD2S. L’IHC

avec les anticorps correspondants et en plus Ki67 et p53 a été réalisé sur 3 blocs de tissue-

array qui contiennent du tissu tumoral de 158 cas.

Résultats : L’analyse statistique montre une association entre la réponse complète et

HSP10 (p=0,07) et p53 (p=0,06), entre la survie sans progression et HSP10 (p=0,007,

HR=0,641, IC à 95% 0,54-0,91), et MMP1 (p=0,08, HR=1,48, IC à 95% 0,89-2,47), et

entre la survie globale et HSP10 (p=0,02, HR=0,6, IC à 95% 0,38-1,05), MMP1 (p=0,09,

HR=1,6, IC à 95% 0,82-3,18) et Ki67 (p=0,04, HR=0,67, IC à 95% 0,35-0,96).

Conclusions : L’étude démontre que l’analyse par micropuces couplée avec l’IHC est une

approche valide pour identifier des marqueurs de chimiorésistance. L’analyse par

micropuces et l’IHC sont des méthodes complémentaires. Le profil du cancer ovarien

chimiosensible que nous avons trouvé est: MMP1 négatif, HSP10, p53 et Ki67 positifs. Un

index pronostique basé sur ces 4 marqueurs apporte des informations pronostiques

supplémentaires que chaque marqueur individuellement.

iii

Abstract

Background Combination chemotherapy with taxol and a platinum compound is the

current regimen of choice for the treatment of advanced epithelial ovarian cancer. Using

DNA microarray technology we have developed a gene predictor model that could be used

as prognostic determinant of treatment outcome. In the present study we tried to validate

some of the gene expression by immunohistochemistry (IHC).

Design We selected 10 genes to be validated: GST, MMP1, Fos-B, CTSL2, HSP10, CD36,

MIP2 (CXCL2), RBBP7 (RbAp46), Siva, and PGD2S. Antibodies against corresponding

proteins and p53 and Ki-67 were tested on 3 tissue array blocks containing tumoral tissue

from 158 ovarian cancer patients.

Results A statistically significant association or a trend was found between the response to

chemotherapy and HSP10 (p=0,07) and p53 (p=0,06), between progression-free survival

and HSP10 (p=0,007, HR=0,641, 95% CI 95% 0,54-0,91), and MMP1 (p=0,08, HR=1,48,

95% CI 0,89-2,47), and between overall survival and HSP10 (p=0,02, HR=0,6, 95% CI

0,38-1,05), MMP1 (p=0,09, HR=1,6, 95% IC 0,82-3,18) and Ki67 (p=0,04, HR=0,67, 95%

CI 0,35-0,96).

Conclusion Our study demonstrated that gene expression analysis coupled with IHC

represents a valuable approach to identify prognostic markers in ovarian carcinoma. We

found that the good responders to chemotherapy display overexpression of HSP10, p53 and

Ki67b and decreased expression of MMP1 compared with the non-responders. A

prognostic index based on these 4 markers adds supplemental prognostic information than

any marker individually.

iv

Mes remerciements les plus sincères à mes directeurs de recherche, Dr Bernard Têtu, Dr Dimcho Bachvarov et Dr. Isabelle Bairati. Le

soutien auquel j’ai eu droit tout au long de ces travaux, qu’il soit moral, intellectuel ou

financier restera la bases de ma future carrière. Merci mille fois.

Merci aux pathologistes et résidents en patho de l’Hôtel- Dieu de Québec,

pour leur accueil chaleureux. À Dr Isabelle Bairati et à François Harel, pour leur aide

préciese et leurs conseils. À Danielle Murry et aux techniciens et techniciennes en patho, dont l’aide est

infiniment appréciable. À tous ceux qui m’ont soutenu du début à la

fin de ce projet. Les derniers remerciements à ma famille

pour leur patience et leur compréhension. Je dédie ce travail à mes parents

et spéciaementl à mon père, professeur de chimie,

qui m’a inculqué dès mon enfance

la passion pour la science.

v

Table des matières Résumé court ...........................................................................................................................i Résumé long .......................................................................................................................... ii Abstract................................................................................................................................. iii Table des matières ..................................................................................................................v Liste des tableaux................................................................................................................. vii Liste des figures .................................................................................................................. viii Liste des abréviations..............................................................................................................x 1. Introduction.....................................................................................................................1

1. 1. Épidémiologie.........................................................................................................1 1.2. Facteurs de risque et de protection pour le cancer ovarien.....................................2

1.2.1. Facteurs de risque majeurs..............................................................................2 1.2.2. Facteurs de risque mineurs .............................................................................3 1.2.3. Facteurs de protection.....................................................................................4

1.3. Dépistage et diagnostic ...........................................................................................4 1.4. Lésions prénéoplasiques et modèles de carcinogenèse du cancer ovarien .............6 1.5. Traitement ...............................................................................................................8 1.6. Suivi ........................................................................................................................9 1.7. Mécanismes de chimiorésistance..........................................................................11 1.8. Les recherches actuelles sur la chimiorésistance du cancer .................................12

2. Hypothèse et objectifs.......................................................................................................15 3. Matériel et méthodes.........................................................................................................24

3.1. Les prélèvements pour la banque de tumeurs .......................................................24 3.2. La cohorte d’étude ................................................................................................24 3.3. Les blocs de «tissue array» ...................................................................................25 3.4. L’immunohistochimie (IHC) ................................................................................28 3.5. Les variables .........................................................................................................32

3.5.1. Les marqueurs IHC.......................................................................................32 3.5.2. Autres facteurs pronostiques.........................................................................32 3.5.3. Les événements.............................................................................................33

3.6. L’analyse statistique ..................................................................................................34 4. Résultats........................................................................................................................36

4.1. Caractéristique clinique des patientes...................................................................36 4.2. Les marqueurs tumoraux ......................................................................................40

4.2.1. Description des marqueurs tumoraux ...........................................................40 4.2.2. Relations entre les marqueurs tumoraux et les facteurs de risque ................41 4.2.3. Relations entre les marqueurs tumoraux et la réponse à la chimiothérapie..42 4.2.4. Relations entre les marqueurs tumoraux et la survie sans progression.........43 4.2.5. Relations entre les marqueurs tumoraux et la survie globale .......................43

5. Discussion.....................................................................................................................54 5.1. Facteurs cliniques liés à la chimiorésistance .............................................................54 5.2. Marqueurs moléculaires.............................................................................................55 5.2.1. MMP1 .....................................................................................................................55 5.2.2. HSPE1 (HSP10)......................................................................................................58 5.2.3. FosB........................................................................................................................60

vi

5.2.4. GST.........................................................................................................................61 5.2.5. Les cathepsines .......................................................................................................62 5.2.6. CD36.......................................................................................................................63 5.2.7. RbAp46 (RBBP7) ...................................................................................................64 5.2.8. Siva .........................................................................................................................65 5.2.9. MIP2 (alias CXCL2 ou GRO-beta) ........................................................................65 5.2.10. Prostaglandine D2 synthétase (PTGD2S).............................................................67 5.2.11. Ki67 et p53............................................................................................................68 5.2.12. L’index pronostique (IP) basé sur 4 marqueurs (MMP1, HSP10, Ki-67, p53) ....68 5.3. Lien entre l’expression génique et l’expression protéique ........................................69

6. Conclusion ........................................................................................................................70 Bibliographie ........................................................................................................................71 Annexe : courbes de survie et images IHC...........................................................................89

vii

Liste des tableaux Tableau 1 : La survie à 5 ans pour le cancer ovarien..............................................................4 Tableau 2 : Caractéristiques des tumeurs analysées par micropuces d’ADN.......................17 Tableau 3A : Gènes surexprimés dans les cas chimiorésistants ...........................................18 Tableau 3B : Gènes surexprimés dans les cas chimiosensibles............................................19 Tableau 3C : Gènes avec une expression différente pour les tumeurs chimiorésistantes et

chimiosensibles groupés selon leur rôle biologique .....................................................21 Tableau 3D : Les 43 gènes avec une expression différentielle selon la réponse à la

chimiothérapie ..............................................................................................................22 Tableau 4 : Les anticorps pour IHC......................................................................................31 Tableau 5 : La technique IHC...............................................................................................31 Tableau 6 : Caractéristiques cliniques des patientes.............................................................38 Tableau 7 : Incidence cumulative de progression et de décès ..............................................39 Tableau 8: Tableau de fréquence pour les marqueurs IHC ..................................................45 Tableau 9: Relation entre CD36 et les facteurs pronostiques...............................................45 Tableau 10 : Relation entre HSP10 et les facteurs pronostiques ..........................................46 Tableau 11 : Relation entre Fos-B et les facteurs pronostiques............................................46 Tableau 12 : Relation entre MMP1 et les facteurs pronostiques ..........................................47 Tableau 13 : Relation entre GST et les facteurs pronostiques..............................................47 Tableau 14 : Relation entre la pan-cathepsine et les facteurs pronostiques..........................48 Tableau 15 : Relation entre p53 et les facteurs pronostiques ...............................................48 Tableau 16 : Relation entre Ki67 et les facteurs pronostiques .............................................49 Tableau 17 : L’index pronostique (IP)..................................................................................49 Tableau 18 : Relation entre les marqueurs tumoraux et la réponse à la chimiothérapie ......50 Tableau 19 : Relation entre les marqueurs tumoraux,t les caractéristiques cliniques et la

réponse complète à la chimiothérapie...........................................................................51 Tableau 20 : Relations entre les facteurs pronostiques et la survie sans progression...........52 Tableau 21 : Relations entre les marqueurs tumoraux et la survie sans progression............52 Tableau 22 : Relations entre les facteurs pronostiques et la survie ......................................53 Tableau 23 : Relations entre les facteurs pronostiques et la survie ......................................53

viii

Liste des figures Figure 1. Vue générale de l’étude.........................................................................................16 Figure 2 : Le «tissue arrayer» ...............................................................................................27 Figure 3 : Lames de «tissue array» .......................................................................................27 Figure 4 : Distribution des patientes selon l’âge...................................................................37 Figure 5 : La répartition des cas selon la réponse clinique...................................................39 Figure 6 : l’importance des MMPs dans l’évolution du cancer. ...........................................55 Figure 7 : activation réciproque des MMPs..........................................................................56 Figure 8 : la voie de synthèse des prostaglandines ...............................................................67 Figure 9A : La survie sans progression ................................................................................89 Figure 9B : La survie globale ...............................................................................................89 Figure 10A : La survie sans progression en fonction du stade .............................................90 Figure 10B : La survie globale en fonction du stade ............................................................90 Figure 11A : La survie sans progression en fonction du grade ............................................91 Figure 11B : La survie globale en fonction du grade ...........................................................91 Figure 12A : La survie sans progression en fonction du type de chimiothérapie.................92 Figure 12B : La survie globale en fonction du type de chimiothérapie................................92 Figure 13A : La survie sans progression en fonction du CA125 initial ...............................93 Figure 13B : La survie globale en fonction du CA125 initial ..............................................93 Figure 14A: La survie sans progression selon l’expression du CD36..................................94 Figure 14B: La survie globale selon l’expression du CD36.................................................94 Figure 15A: La survie sans progression selon l’expression du HSP10 ................................95 Figure 15B: La survie globale selon l’expression du HSP10 ...............................................95 Figure 16A: La survie sans progression selon l’expression du Fos-B..................................96 Figure 16B: La survie globale selon l’expression du Fos-B.................................................96 Figure 17A: La survie sans progression selon l’expression du MMP1 ................................97 Figure 17B: La survie globale selon l’expression du MMP1 ...............................................97 Figure 18A: La survie sans progression selon l’expression du GST....................................98 Figure 18B: La survie globale selon l’expression du GST...................................................98 Figure 19A: La survie sans progression selon l’expression de la pan-cathepsine................99 Figure 19B: La survie globale selon l’expression de la pan-cathepsine...............................99 Figure 20A: La survie sans progression selon l’expression du p53 ...................................100 Figure 20B: La survie globale selon l’expression du p53 ..................................................100 Figure 21A: La survie sans progression selon l’expression du Ki67 .................................101 Figure 21B: La survie globale selon l’expression du Ki67 ................................................101 Figure 22A: La survie sans progression selon l’IP .............................................................102 Figure 22B: La survie globale selon l’IP ............................................................................102 Figure 23 : coloration IHC pour CD36...............................................................................103 Figure 24 : coloration IHC pour la pan-cathepsine............................................................103 Figure 25 : coloration IHC pour Fos-B...............................................................................103 Figure 26 : coloration IHC pour GST.................................................................................104 Figure 27 : coloration IHC pour HSP10 .............................................................................104 Figure 28 : coloration IHC pour Ki-67 ...............................................................................104 Figure 29 : coloration IHC pour MMP1 .............................................................................105 Figure 30 : coloration IHC pour p53 ..................................................................................105

x

Liste des abréviations

IHC = immunohistochimie

CD36 = antigène leucocytaire humain CD36

HSP10 = protéine de choc thermiqu avec le poids moléculaire de 10 kDa (aussi connue

comme HSPE1)

Fos-B = la protéine Fos-B

MMP1 = métalloprotéase de type 1

GST = glutathion S-transférase

P53 = la protéine p53 mutante où les mutations structurales ont altéré la conformation

moléculaire tridimensionnelle

RbAp46 = retinoblastoma associated protein 46 (aussi connue comme RBBP7 ou

retinoblastoma binding protein 7)

Siva = la protéine pro-apoptotique Siva

MIP2 = macrophage inhibitor protein 2 (aussi connue comme CXCL2 ou GRO-beta)

PTGD2S = prostaglandine D2 synthétase

IP = index pronostique basé sur 4 marqueurs (MMP1, HSP10, Ki-67, p53)

SSP = survie sans progression

SG = survie globale

H&E = hématoxyline et éosine

PBS = tampon phosphate saline (phosphate buffered saline)

1

1. Introduction

1. 1. Épidémiologie

Le cancer représente un problème de santé publique au Canada et dans le monde. Selon

Statistique Canada (1), 38% des femmes et 43% des hommes auront un cancer au cours de

leur vie, et 1 Canadien sur 4 décédera de cancer. Le coût supporté par la société canadienne

s’élève à plus de 14 milliard de dollars par an (1998), le troisième rang, après les maladies

cardio-vasculaires et les maladies de l’appareil locomoteur.

En 2004, on estime qu’environ 145000 nouveaux cas de cancer ont été diagnostiqués au

Canada (74800 hommes et 70700 femmes) et que plus de 68000 décédés y sont attribuables

(dont 36200 hommes et 32100 femmes).

Le cancer ovarien est le 6e cancer diagnostiqué chez la femme, soit 4% des nouveaux cas et

la 5e cause de décès par cancer. En 2004, l’incidence a été de 12 :100000 pour tout le pays;

au Québec, le taux d’incidence est le plus élevé des provinces, soit 13 :100000. La

mortalité a été de 7 :100000 au pays et la même pour le Québec.

En chiffres absolus, on estime en 2004 que 2300 Canadiennes ont eu un diagnostic de

cancer ovarien, dont 630 au Québec, et 1550 en sont décédées. Plus de femmes meurent

chaque année d’un cancer ovarien que de tous les autres cancers gynécologiques (2).

Malgré le taux d’incidence pour tous les sièges qui a doublé dans les 30 dernières années,

l’incidence du cancer ovarien est en baisse (1,3). Ainsi, en 1975, l’incidence était de

13,7 :100000, pour atteindre un niveau record de 15,4 en 1981. À partir de 1998,

l’incidence est tombée sous 12 :100000 et en 2004 elle a connu une des valeurs les plus

basses, soit 11,7 :100000.

Le cancer ovarien épithélial apparaît souvent chez les femmes autour de la ménopause;

environ la moitié des femmes ont plus de 65 ans (4), et moins de 1% ont moins de 20 ans.

2

La majorité des cancers ovariens apparaît sur une base sporadique et seulement 5-10% sont

héréditaires. Pour ces cas, la maladie débute 10 ans plus tôt (5) et débutera encore plus

précocement dans les générations futures (6).

La survie moyenne à 5 ans pour tous les stades et formes histologiques confondus est de

37%, probablement parce que 70% des cas sont découverts à un stade avancé (III et IV). La

survie est encore plus réduite si la femme a plus de 70 ans (7) en raison d’un stade plus

avancé au diagnostic.

1.2. Facteurs de risque et de protection pour le cancer ovarien

1.2.1. Facteurs de risque majeurs

Plusieurs facteurs de risque ont été recherchés; parmi eux, les plus importants sont une

histoire familiale de cancer de l’ovaire et les altérations génétiques.

L’histoire familiale donne un risque relatif de 9,4% (2). Le substrat génétique est

représenté par les gènes BRCA1 et BRCA2 mutés et le syndrome Lynch 2.

Le gène BRCA1 normal a des fonctions multiples comme régulateur de transcription et de

réparation d’ADN. Les mutations de BRCA1 comptent pour environ 50% des cas de cancer

de sein avec un déterminant héréditaire et pour 80% des cas avec histoire familiale de

cancer du sein et de l’ovaire (8). Plusieurs mutations sont actuellement connues, les unes

associées avec une probabilité élevée de développer un cancer, comme L1407P, M1628V,

T1685I, A1752P, G1788V, V1809F et W1837R, les autres étant associées avec un risque

faible, comme H1402Y, H1421Y, S1512I et M1628T(9). Même si le risque de cancer est

élevé, plusieurs facteurs peuvent le modifier (10). Le modèle de transmission pour le gène

muté est autosomal dominant avec pénétration variable.

BRCA2 a une fonction de «genome caretaker»; ses mutations sont reliées à une instabilité

génomique (11) et à l’accumulation de mutations (12). Les femmes porteuses de mutations

de BRCA2 ont un risque moins élevé de développer un cancer ovarien que les porteuses de

3

BRCA1 (13). Le cancer ovarien détecté chez les patientes avec mutations BRCA1/2 est

généralement de type histologique séreux papillaire et de grade élevé (14).

Le syndrome Lynch 2/HPNCC donne une susceptibilité de développer des cancers digestifs

et gynécologiques (côlon, ovaire, endomètre). Les «mismatch repair genes» qui ont des

fonctions de réparation d’ADN (MSH2, MLH1, PMS1, et PMS2 (15)) sont mutés dans ce

syndrome. Un cancer ovarien peut se développer dans 10% des porteuses.

Les femmes avec une surcharge familiale de cancers ovariens (trois ou plus parmi les

parents de premier dégrée) ou avec une mutation BRCA1 détectée chez une membre de la

famille peuvent être sélectionnées pour des tests génétiques et des manœuvres

thérapeutiques à but préventif (16). L’ovariectomie préventive est indiquée après l’âge de

35 ans, habituellement si la femme ne désire plus avoir d’enfants. Malheureusement, un

certain pourcentage de ces femmes développera un cancer d’origine péritonéale (17).

1.2.2. Facteurs de risque mineurs

Les nullipares ont un risque légèrement plus élevé de développer un cancer ovarien (18;19)

et le risque diminuerait avec le nombre de naissances (20); d’autres études ne trouvent

aucune association entre le nombre d’enfants et le risque (21).

L’âge tardif de la ménopause et le début précoce des menstruations s’associent à un risque

faible ou nul de cancer ovarien (18,22-24)

La thérapie hormonale de substitution n’augmente pas le risque de développer un cancer

ovarien (20,25), bien que certains auteurs affirment le contraire (26). Les inducteurs

d’ovulation ont un rôle nul (27,28) ou «possible» (29) notamment le clomiphene (30).

L’obésité (31), la consommation d’alcool (32,33), de viande rouge (34) ou de graisses

d’origine animale (32) ne sont pas associés ou sont faiblement associés au risque de

développer un cancer de l’ovaire.

4

1.2.3. Facteurs de protection

Les contraceptifs oraux administrés pour 5 ans et plus offrent une protection contre le

risque de développer un cancer ovarien (19,35) qui se poursuit longtemps après l’arrêt de la

médication (36,37). Une certaine protection est aussi obtenue en consommant des acides

gras polyinsaturés (38,39), des huiles végétales (40), des légumes et des fruits (41,42) et

une hystérectomie avec ligature tubaire (43).

1.3. Dépistage et diagnostic

La survie à 5 ans des patientes atteintes de cancer ovarien dépend essentiellement du stade.

Tel qu’indiqué au tableau 1, la survie est de 92% au stade IA, pour atteindre 12% au stade

IV (2,44). Au cours des 30 dernières années, ce pronostic sombre pour les cas avancés n’a

pas été changé (45).

Tableau 1 : La survie à 5 ans pour le cancer ovarien Stade % survie à 5 ans IA 92% IB 85% IC 82% IIA 67% IIB 56% IIC 51% IIIA 39% IIIB 26% IIIC 17% IV 12%

Bien que le diagnostic précoce du cancer ovarien soit fortement souhaitable, il n’existe

actuellement aucun programme national de dépistage (46).

L’examen clinique permet de détecter surtout les cas avancés et la valeur du dépistage est

controversée (47). Les symptômes sont multiples et non-spécifiques (48) : un malaise

abdomino-pelvien, sensation de plénitude, distension, gonflement ou crampes abdominales,

5

perte de poids, fatigue, dyspnée, nausée, diarrhée ou constipation, problèmes urinaires,

saignement vaginal anormal, relations sexuelles douloureuses, fièvre, douleurs dorsales

(49).

Comme outils complémentaires de diagnostic, on utilise l’échographie et le dosage de

l’antigène CA125.

L’échographie a une valeur prédictive positive faible, soit d’environ 7,7% (50). Seulement

une faible proportion des cas diagnostiqués par échographie sont palpables en clinique (51).

La technique peut rarement distinguer entre une tumeur bénigne et maligne. De plus, les

cancers d’origine péritonéale, où les ovaires sont de taille normale, sont encore plus

difficilement détectables (45). Pour compliquer le tableau, on sait que le volume ovarien est

variable selon l’âge (52). L’échographie Doppler transvaginale n’apporte pas de bénéfices

supplémentaires (52,53) et le taux de résultats faux positifs est très élevé, 43% selon

«Prostate, Lung, Colorectal, and Ovarian Cancer Screening Trial» (54, 55). Même pour les

cas où il y a une histoire familiale de cancer ovarien, seulement 30% des cas avec une

échographie positive ont vraiment un cancer (53). Les conséquences émotionnelles en cas

de résultat faux positif sont très importantes et par la suite la compliance au programme de

dépistage est réduite (56). Dans la pratique courante, un seul test anormal n’est pas une

indication pour une intervention chirurgicale (57).

Le CA125 est une glycoprotéine de haut poids moléculaire appartenant à la famille des

mucines (58,59) codée par le gène MUC16 (60). Cette protéine a été identifiée avec

l’anticorps OC125 dans des cultures de cellules du cancer ovarien (61,62). Le CA125 est

un antigène de différenciation du canal müllerien, sécrété par près de 83 % des cancers

ovariens. Sa spécificité atteint 60% et son niveau sérique dépend de la masse tumorale (63).

La valeur normale est <35U/ml. Une valeur initiale sous 500 UI/ml est associée à la

possibilité de résection complète de la tumeur (64).

Le potentiel du CA125 comme test de dépistage est basé sur la constatation que son niveau

sérique est élevé quelques années avant que l’examen clinique devienne positif (65). Un

test multimodal qui combine le dosage de CA125 et l’échographie a une meilleure

sensibilité (66,67).

6

La principale faiblesse du CA125 comme test de dépistage réside dans sa faible spécificité

et sensibilité. Seulement 50% des cancers de stade I ont un CA125 élevé, tandis que des

niveaux sériques augmentés au-dessus de 35 UI/ml ont été détectés dans une grande variété

de conditions non tumorales (grossesse normale et ectopique, maladie inflammatoire

pelvienne et abcès tubo-ovarien, tuberculose, endométriose, ascite non néoplasique (68),

cirrhose (69)), tumeurs ovariennes bénignes (cystadénome séreux et mucineux, fibrome,

thécome, tumeur de Brenner (70)), léiomyome utérin (71) et autres types de cancer (utérus

(72), poumon (73), vessie, estomac, foie, leucémie myéloïde chronique en crise blastique

(74), lymphome non hodgkinien (75)).

En conclusion, il n’existe aucun programme de dépistage pour le cancer ovarien et les tests

actuellement disponibles ne sont pas efficaces, même pour les femmes à risque.

L’échographie donne un taux élevé de résultats faux positifs, entraînant un grand nombre

d’interventions chirurgicales pour des conditions bénignes et génèrant un état d’anxiété

important parmi les patientes (76). De nouvelles techniques de dépistage, comme les

«proteomics», ainsi que la chimioprévention sont présentement au stade expérimental (77-

80).

1.4. Lésions prénéoplasiques et modèles de carcinogenèse du

cancer ovarien

Le diagnostic final réside sur l’examen histopathologique. Dans ce chapitre on discute les

modèles de carcinogenèse et les lésions prénéoplasiques.

Le revêtement de surface ovarien est reconnu comme le tissu d’origine pour la grande

majorité des cancers épithéliaux (81). En 1971, Fathalla a proposé la théorie de l’ovulation

incessante pour en expliquer la pathogénie (82). Il suppose que le traumatisme provoqué

par l’ovulation et l’exposition subséquente de l’épithélium au liquide folliculaire riche en

œstrogène peut avoir une relation avec le développement du cancer. Sa théorie a été

ultérieurement validée par de nombreuses études cliniques cas-témoins (83-86), des

expériences sur des animaux (87-89) et des cultures de cellules (90). Quelques facteurs de

risque non génétiques discutés au paragraphe 1.2.1 confirment cette hypothèse.

7

Bien que cette théorie n’explique pas l’apparition de toutes les formes histologiques du

cancer ovarien (91), elle est tout de même acceptée aujourd’hui, sous la réserve que

d’autres facteurs interviennent également (androgènes, progestérone, gonadotrophines

(84,92-94).

Les lésions pré-néoplasiques du cancer ovarien ne sont pas très bien définies. Chez les

souris, on a démontré que l’ovulation continue stimule la prolifération de l’épithélium de

surface et détermine l’apparition de kystes multiples (88,95) qui ressemblent aux kystes

séreux chez les humains. Les femmes ayant une histoire familiale positive et par

conséquent un risque de développer un cancer ovarien au-dessus de la moyenne présentent

un nombre significativement plus élevé d’invaginations corticales profondes de

l’épithélium de surface, souvent avec des projections papillaires multiples, kystes

épithéliaux d’inclusion, pseudo stratification et papillomatose de l’épithélium de surface

(96,97). Chez les femmes avec un cancer ovarien, ces kystes sont plus nombreux à l’ovaire

controlatéral (98).

À l’aide d’expériences in vivo avec des cultures de cellules et des modèles animaux, on a

tenté d’élucider la progression de l’épithélium normal vers la tumeur (88-90,99). La

dysplasie de l’épithélium a été décrite par analyse d’image microscopique : les noyaux des

cellules dysplasiques sont augmentés de volume, la chromatine est plus dense et irrégulière,

la membrane nucléaire est sinueuse (100-102). La dysplasie ainsi définie peut être

rencontrée dans 75% des ovaires réséqués dans un but prophylactique. La néoplasie

intraépithéliale ovarienne présente, par définition, des cellules stratifiées avec perte de

polarité et des noyaux atypiques (103). Les cellules dysplasiques ont des caractères

immunohistochimiques (IHC) spécifiques (perte du collagène IV et laminine, surexpression

de Cox-2, Ki-67, p53, CA125, Bcl-2, des récepteurs pour œstrogène et progestérone (104-

106)). Les concepts de dysplasie et néoplasie intraépithéliale ovarienne n’ont pas été

largement acceptés depuis leur description.

8

1.5. Traitement

Le cancer ovarien est traité actuellement par une approche combinée - chirurgie de

cytoréduction et chimiothérapie. La maladie résiduelle post-chirurgie à un impact très

important sur la survie et est un des meilleurs prédicteurs de récidive des cas avancés (III et

IV) (107,108). Ainsi, une masse tumorale résiduelle de plus que 2 cm affecte de façon

substantielle la survie (109,110).

Les cas avancés reçoivent aussi une chimiothérapie avec un dérivé de platine – carboplatin

ou cisplatin – et paclitaxel (taxol). La thérapie standard consiste aujourd’hui en six cycles

de carboplatin et paclitaxel administrés à 3 semaines d’intervalle (111). Les combinaisons

carboplatin-paclitaxel et cisplatin-paclitaxel sont comparables en terme d’efficacité (112) et

les dérivés de platine ne présentent pas une résistance croisée avec les taxanes (113).

Le traitement avec cisplatin et cyclophosphamide est moins toxique mais aussi moins

efficace (114,115).

Les patientes répondent bien à la chimiothérapie mais une récidive survient majoritairement

dans les 2 premières années (116,117). Une deuxième chirurgie est parfois envisagée mais

ses bénéfices restent incertains, la littérature fournissant des résultats contradictoires (118-

120).

Une deuxième chimiothérapie peut être efficace. On peut utiliser soit un seul agent, comme

le taxol (121,122), les dérivés de platine (123-127) ou encore des régimes combinés, platine

et taxol (128).

Comme alternatives on peut administrer soit des combinaisons de trois drogues (129), soit

de nouveaux médicaments. La doxorubicine liposomale (130) a un effet modéré; le

topotecan a une efficacité modeste et des effets secondaires parfois importants (131,132); la

gemcitabine est modérément active mais sa toxicité peut être sévère (133,134).

9

Plusieurs approches de traitements sont maintenant à un stade expérimental. On peut citer,

sans dresser de liste exhaustive, les inhibiteurs d’angiogenèse, la thérapie génique et les

modulateurs de chimiorésistance (135-137).

La radiothérapie a seulement un rôle palliatif, pour contrôler la récurrence locale et la

douleur (138,139).

1.6. Suivi

Le suivi des patientes traitées pour un cancer ovarien épithélial se fait par l’examen

clinique, les méthodes d’imagerie et les marqueurs sériques.

Le CA125 est le plus important marqueur sérique pour le suivi des cancers ovariens non-

mucineux (140,141). La récidive est à considérer quand le CA125 dépasse 100 U/ml. Les

valeurs dynamiques en temps de redoublement sont des facteurs pronostiques importants

(142). Une élévation aiguë de CA125 après la première dose de chimiothérapie est un

témoin de destruction massive des cellules tumorales et représente un bon signe de réponse

au traitement (63). Le CA125 n’est pas toujours fiable pour détecter la récidive : un sous-

groupe de patientes peut présenter une maladie évolutive documentée par l’examen clinique

ou radiologique mais avec un CA125 normal (143).

L’antigène CA19-9 est un marqueur utile pour le suivi du cancer de pancréas et du côlon et

l’antigène CA15-3 pour le cancer du sein; des valeurs élevées peuvent être détectées dans

les cancers ovariens de type mucineux.

La gonadotrophine chorionique (hCG) est une protéine glycosilée sécrétée par les cellules

syncytiotrophoblastiques du placenta. hCG maintien la fonction du corps jaune au cours de

la grossesse précoce, promeut la stéroïdogénèse placentaire et le développement des

gonades fœtales. Le hCG est un dimère composé par deux unités a et b qui ressemble de

point de vue structural aux FSH, LH et TSH (145). Le trophoblaste néoplasique

(choriocarcinome, mole invasive) sécrète une protéine hyperglycosylée et les cancers

nontrophoblastiques seulement la fraction b. Un niveau sérique élevé (>1 ng/ml) est

identifié dans les tumeurs ovariennes trophoblastiques et les tumeurs testiculaires non-

10

séminomateuses, tandis que des niveaux plus réduits (<1 ng/ml) peuvent exister dans des

tumeurs de sites variés (estomac, foie, poumon, vessie, pancréas, côlon, col, endomètre,

myélome multiple) (146).

L’alfa-fœtoprotéine (AFP) est une protéine similaire à l’albumine (147), synthétisée

normalement par le foie fœtal. Chez la femme enceinte, le dosage aide à détecter

précocement certaines anomalies fœtales (spina bifida, anencéphalie, omphalocèle,

tétralogie de Fallot, atrésie duodénale, syndrome de Turner, décès intra-utérine, syndrome

de Down). Sa présence est anormale dans le sérum des femmes non-enceintes et des

hommes, indiquant une pathologique tumorale (tumeurs de sinus endodermique, cancer du

foie, estomac, pancréas, rein, lymphome) ou non-tumorale (cirrhose, hépatite) (148-150).

L’AFP est utilisée en clinique pour le suivi des tumeurs ovariennes à cellules germinales.

L’antigène carcino-embryonnaire (CEA) est une protéine isolée dans la muqueuse

intestinale de sujets atteints de cancer colique et dans l'endoderme de l'embryon. La

protéine est exprimée à la surface des cellules néoplasiques et peut être détectée dans le

sérum. Le dosage sérique montre la présence de taux supérieurs à 2,5 ng/ml dans le sérum

non seulement de presque tous les sujets atteints du cancer du côlon mais aussi dans

d’autres cancers (sein, tractus digestif, poumon, pancréas, prostate, ovaire, foie) ou

maladies non cancéreuses (colite ulcérative, polypes adenomateux, cirrhose). Le fait que cet

antigène peut également être retrouvé chez les sujets éthyliques le rend inutilisable comme

moyen de dépistage du cancer. Par contre, son étude s'est avérée particulièrement utile pour

la surveillance postopératoire des cancers surtout coliques, mais aussi des cancers du sein

(144).

Des nouveaux marqueurs sériques ont été testés pour détecter la récidive des cancers

ovariens, comme : «cancer-associated serum antigen» (151), «tissue polypeptide specific

antigen» (152), «human tissue kallikrein 10» (153,154), «sialyl TN» (155). Leur utilité

clinique reste à déterminer.

11

1.7. Mécanismes de chimiorésistance

La chimiorésistance est un problème majeur dans le traitement des cancers. Les tumeurs

peuvent présenter une résistance intrinsèque ou acquise. La chimiorésistance peut impliquer

plusieurs mécanismes, comme l’influx diminué et l’afflux augmenté de substances actives,

l’inactivation du médicament, la modification des cibles moléculaires, la réparation ou la

réversion des modifications cellulaires induites par les molécules actives ou l’abolition de

l’apoptose (156).

Le transport transmembranaire peut affecter l’efficacité des substances comme les taxanes,

anthracyclines, alcaloïdes de la pervenche, irinotecan, methotrexate. Les mécanismes

cellulaires responsables de ce type de résistance comprennent le «reduced folate carrier»

(RFC) et les molécules de transport du groupe ABC qui comptent des dizaines de membres,

comme la glycoprotéine P (P-gp) et le «multidrug resistance protein» (MRP). Le rôle de la

P-gp est important dans le cancer ovarien (157,158) et les inhibiteurs de P-gp font l’objet

d’essais cliniques (136,159).

L’inactivation enzymatique diminue la quantité de drogue qui peut se lier à sa molécule

cible intracellulaire. Parmi les enzymes impliquées on peut citer le dihydropyrimidine

dehydrogenase (DDP), glutation S-transpherase (GSH) et les métallothioneines.

La modification des molécules cibles peut être d’importance majeure pour le

développement de la chimiorésistance. Ainsi, les mutations des topoisomerases sont

responsables pour la résistance à l’etoposide et le doxorubicine tandis que le changement de

la dynamique des microtubules et des différents isotypes tubulaires amène une résistance

aux taxanes et aux alcaloïdes de pervenche.

La réparation d’ADN par «nucleotide excision repair» ou NER joue un rôle important dans

la résistance contre les dérivés de platine, comme le cisplatin ou oxaliplatin.

Pour un seul médicament la résistance est souvent multifactorielle. Ainsi, l’activité du

cisplatine peut être diminuée par une accumulation réduite dans le cytoplasme, inactivation

par l’entremise du glutathione ou metallothioneines, le NER et une tolérance accrue (160).

12

1.8. Les recherches actuelles sur la chimiorésistance du cancer

Si les cliniciens pouvaient prédire et éventuellement contrer la chimiorésistance, l’efficacité

de la chimiothérapie serait beaucoup améliorée (161,162). De nombreux marqueurs de

chimiorésistance ont été testés, mais à date aucun n’a trouvé une application clinique.

Récemment, des études d’expression génique par micropuces d’ADN ont montré des

résultats encourageants (163). Pour le cancer de sein, cette technologie peut distinguer les

cas en fonction de la sensibilité aux divers médicaments, leur agressivité et leur évolution

(164-169). Des recherches similaires ont été menées sur une grande variété de cancers,

comme le lymphome malin folliculaire (170), la leucémie aiguë lymphoïde (171), le cancer

de l’œsophage (172), du côlon (171), du pancréas (173), du poumon (174), du col utérin

(175), ainsi que le mésothéliome (176). Pour le cancer ovarien, des patrons d’expression

génique identifiés par l’analyse des micropuces peuvent différencier les cas en fonction de

leur récidive tardive ou précoce (177-180).

Par la technologie des micropuces d’ADN on peut aussi différencier les cancers et le tissu

normal correspondant (181), les cancers selon leur organe d’origine (182), les tumeurs au

stade précoce ou tardif (183), les types histologiques distincts de cancer d’un même organe

(184). On peut aussi essayer d’élucider les mécanismes moléculaires d’action des drogues

(185,186), les modifications cellulaires post-chimiothérapie (187) ou avoir un aperçu des

modèles de chimiorésistance (156). Des bases de données sont en cours de développement

à partir de la sensibilité des tumeurs aux différents médicaments (188,189).

Plusieurs nouvelles techniques ont été utilisées pour caractériser les cellules cancéreuses.

La «comparative genomic hybridization» ou CGH est une méthode par laquelle on peut

identifier la perte ou le gain de matériel génique chromosomique (190). Les «arrays des

anticorps» pour caractériser le profil des protéines représente un outil important pour tester

de nouveaux médicaments, ainsi que leur efficacité et cytotoxicité (191-193). Les

marqueurs génétiques peuvent être validés au niveau de l’ADN, l’ARN ou les protéines sur

des «tissues microarrays» qui contiennent un grand nombre de tissus en paraffine

(194,195).

13

Une nouvelle approche pour documenter la sensibilité des tumeurs à la chimiothérapie est

basée sur des cultures de cellules tumorales provenant de tumeurs primaires, ascite ou

liquide pleural. ChemoFx® est un test breveté qui mesure la réponse individuelle des

cellules tumorales à certains médicaments; le résultat est présenté comme le pourcentage

des cellules viables après le traitement comparé au témoin. Un rapport préliminaire

démontre que le test peut offrir des informations utiles aux cliniciens (196).

Une étude sur la chimiorésistance du cancer ovarien a été réalisée dans notre laboratoire.

Notre étude a été conçue en plusieurs étapes complémentaires (voir figure 1). Dans la

première partie on a analysé l’expression génique par la technologie de micropuces d’ADN

sur des échantillons de tumeurs primaires prélevés suite à une opération pour un cancer

ovarien avancé, afin d’identifier un patron moléculaire permettant de prédire la réponse à la

chimiothérapie. Cette première cohorte compte 25 cas avec un comportement clinique

«extrême», soit une progression sous chimiothérapie ou une récidive dans les 6 premiers

mois pour le groupe résistant (15 cas) soit une réponse complète et une récidive tardive

après 30 mois ou plus pour le groupe sensible (10 cas). En plus, notre cohorte est

homogène du point de vue histologique – carcinomes de type séreux papillaire - sachant

que les formes différentes de cancer ont un profil génique spécifique. Quelques

caractéristiques cliniques de ces patientes sont présentées dans le tableau 2.

Les 25 cas ont été initialement analysés de façon indépendante au niveau de leur expression

génique, puis comparés pour identifier les gènes spécifiques pour le groupe sensible et

résistant.

Suite à l’analyse comparative, nous avons retenu les marqueurs génomiques ayant une

différence statistique significative (p<0,001) et avec une différence d’expression entre les 2

groupes d’au moins 2 fois. Après l’application des critères de sélection, on a identifié 230

gènes sous-exprimés et 60 sur-exprimés dans les cas chimiosensibles et 163 gènes sous-

exprimés et 20 sur-exprimés dans les cas chimiorésistants. Les données sont présentées

dans les tableaux 3A, B et C. Une combinaison de 43 gènes peut différencier les cas selon

la période de temps jusqu’à la récidive, avec un seuil entre 21 et 22 mois (tableau 3D).

14

La prochaine étape visait la validation des résultats obtenus. Une deuxième cohorte

comptant 17 patientes avec des cancers ovariens a été formée, dont 15 avec des cancers

séreux papillaires, 1 cancer à cellules claires et 1 cancer de type endométrioïde. Seize cas

ont été correctement classifiés selon la réponse à la chimiothérapie en utilisant la

combinaison de 43 gènes et le seuil de 21-22 mois (316, 317).

15

2. Hypothèse et objectifs

Un pourcentage relativement important de patientes avec un cancer ovarien avancé répond

favorablement à la chimiothérapie initiale. Cependant, la récidive y répond habituellement

moins bien. Nous croyons qu’une étude visant à identifier et à valider des marqueurs qui

peuvent prédire la réponse à la chimiothérapie serait particulièrement pertinente.

Hypothèse : nous supposons que les protéines traduites à partir des gènes decrits à la

section 1.8 et au tableau 3D devraient aussi être des marqueurs potentiels associés à la

réponse clinique à la chimiothérapie.

L’objectif principal : l’étude actuelle vise à tester l’hypothèse selon laquelle la sur ou la

sous-expression de gènes identifiés par la technologie des micropuces peuvent aider à

prédire la réponse à la chimiothérapie. L’étude a été appliquée par immunohistochimie sur

une troisième cohorte indépendante. Comme l’IHC est une méthode techniquement simple,

les résultats pourraient éventuellement être utilisés en clinique pour individualiser la

chimiothérapie des patientes atteintes d’un cancer ovarien. Les marqueurs pour lesquels un

anticorps commercial est disponible ont été choisis pour être validés, soit : CD36, Fos-B,

MMP1, GST, CTSL2, HSP10 (HSPE1), Siva, RBBP7 (RbAp46), PTGD2S et CXCL2

(MIP2).

Les objectifs secondaires sont : étudier la prévalence de l’expression des marqueurs et

leur association avec d’autres facteurs pronostiques traditionnels et corréler l’expression de

ces marqueurs avec la survie sans progression et la survie globale.

16

Figure 1. Vue générale de l’étude. Les cas sont analysés par la technologie des micropuces d’ADN pour

identifier des marqueurs génétiques de pronostic. Les protéines correspondantes seront validées par IHC sur

des blocs de tissue array (selon Kallioniemi et al (194)).

17

Tableau 2 : Caractéristiques des tumeurs analysées par micropuces d’ADN No Code Âge SSP (mois) Type histologique Stage Grade Chimiothérapie 1S O-158 64 ≥ 60 ASP IV 2 Carbo-Txl 2S O-165 66 ≥ 60 ASP + EC IIIC 2 Carbo-Txl 3S O-169 68 ≥ 60 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 4S O-217 55 45 ASP IV 2 Cis-Txl 5S O-269 72 ≥ 39 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 6S O-301 56 ≥ 36 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 7S O-315 55 ≥ 31 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 8S O-324 54 ≥ 32 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 9S O-382 77 30 ASP + SCC IIIC 3 Carbo-Txl 10S O-400 53 ≥ 31 ASP + CCC IIIC 2 Carbo-Txl No Code Âge SSP (mois) Type histologique Stage Grade Chimiothérapie 1R O-137 58 6 ASP IIIC 2 Carbo-Txl 2R O-259 52 4 ASP IIIC 2 Carbo-Txl 3R O-462 51 3 ASP IV 3 Carbo-Txl 4R O-536 45 2 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 5R O-542 67 4 ASP IIIC 2 Carbo-Txl 6R O-132 83 0 ASP IIIC 3 Carbo-Cy 7R O-154 79 0 ASP IIIC 2 Carbo-Cy 8R O-221 83 0 ASP IIIC 3 Carbo-Cy 9R O-226 68 0 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 10R O-456 54 0 ASP IIIC 3 Carbo-Cy 11R O-255 74 0 ASP IV 3 Carbo-Txl 12R O-347 55 0 ASP IIIC 2 Carbo-Txl 13R O-454 63 0 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 14R O-543 64 0 ASP IIIC 3 Carbo-Txl 15R O-123 78 0 ASP IIIC 3 Carbo-Cy Abréviations: ASP, adénocarcinome séreux papillaire ; CCC carcinome à cellules claires;

SCC, carcinome squameux; EC, carcinome endométrioïde; Cis, cisplatin; Carbo,

carboplatin; Txl, taxol; Cy, cyclophosphamide; SSP, survie sans progression

18

Tableau 3A : Gènes surexprimés dans les cas chimiorésistants No Fold

change Nom Genebank Description

1 5,471 HBB BC007075 hemoglobin, beta 2 3,627 SAA1 NM_000331 serum amyloid A1 3 3,547 PTGDS AK075333 prostaglandin D2 synthase 21kDa (brain) 4 3,381 NR4A3 NM_173200 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3 5 3,115 CD36 M98398 CD36 antigen (collagen type I receptor,

thrombospondin receptor) 6 2,944 SYCP2 BC040566 synaptonemal complex protein 2 7 2,787 DF NM_001928 D component of complement (adipsin) 8 2,728 TLE4 AB033087 transducin-like enhancer of split 4 (E(sp1) homolog,

Drosophila) 9 2,703 SAA2 NM_030754 serum amyloid A2 10 2,614 CXCL2 NM_002089 chemokine (C-X-C motif) ligand 2 11 2,585 SELE M30640 selectin E (endothelial adhesion molecule 1) 12 2,567 NR4A1 BC016147 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 1 13 2,566 TLR8 AF246971 toll-like receptor 8 14 2,561 VIP AY101765 alpha-2 macroglobulin family protein VIP 15 2,559 HBG2 NM_000184 hemoglobin, gamma G 16 2,521 ZFP36 M92843 zinc finger protein 36, C3H type, homolog (mouse) 17 2,396 CXCL2 BC015753 chemokine (C-X-C motif) ligand 2 18 2,263 FOSB NM_006732 FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B 19 2,221 XLKD1 AF118108 extracellular link domain containing 1 20 2,198 FGFRL1 AF279689 fibroblast growth factor receptor-like 1 21 2,172 CCL2 M24545 chemokine (C-C motif) ligand 2 22 2,143 GEM U10550 GTP binding protein overexpressed in skeletal muscle23 2,092 PLEK BC018549 pleckstrin 24 2,087 HBG1 BC020719 hemoglobin, gamma A (cDNA clone MGC:22503

IMG:4732536) 25 2,073 NR4A2 BC009288 nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2 26 2,072 DPEP1 J05257 dipeptidase 1 (renal) 27 2,014 HRAS AF493916 v-Ha-ras Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog28 2,008 MGC1733

0 BC011049 HGFL gene

19

Tableau 3B : Gènes surexprimés dans les cas chimiosensibles No Fold

change Nom Genebank Description

1 2,013 PURB AY039216 purine-rich element binding protein B 2 2,028 SPINK1 M11949 pancreatic secretory trypsin inhibitor; Human

pancreatic secretory trypsin inhibitor (PSTI) mRNA, complete cds.

3 2,049 CCT6A L27706 chaperonin containing TCP1, subunit 6A (zeta 1) 4 2,049 LAMA3 L34155 laminin, alpha 3 5 2,053 GPR49 AF062006 G protein-coupled receptor 49 6 2,057 PKHD1L1 NM_177531 polycystic kidney and hepatic disease 1 (autosomal

recessive)-like 1 7 2,066 PRSS16 AF052514 protease, serine, 16 (thymus) 8 2,083 PSMA2 NM_002787 proteasome (prosome, macropain) subunit, alpha

type, 2 9 2,083 AHCY BC011606 S-adenosylhomocysteine hydrolase

10 2,087 CKS2 BC006458 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 11 2,087 IL1R2 BC039031 interleukin 1 receptor, type II 12 2,092 RAB38 BC015808 RAB38, member RAS oncogene family 13 2,105 PSPH Y10275 phosphoserine phosphatase 14 2,105 TMEM14B BC013913 transmembrane protein 14B 15 2,136 ASRGL1 BC021295 asparaginase like 1 16 2,136 F11R NM_144504 F11 receptor 17 2,141 NDUFB3 BC018183 NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta

subcomplex, 3, 12kDa 18 2,150 MAGEF1 BC010056 melanoma antigen, family F, 1 19 2,155 PGRMC1 Y12711 progesterone receptor membrane component 1 20 2,164 HSPE1 BC023518 heat shock 10kDa protein 1 (chaperonin 10) 21 2,169 PRSS2 BC030260 protease, serine, 2 (trypsin 2) 22 2,173 SNRPE X12466 small nuclear ribonucleoprotein polypeptide E 23 2,183 ACAT2 AF356877 acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2 (acetoacetyl

Coenzyme A thiolase) 24 2,183 PCDHB2 AK027526 protocadherin beta 2 25 2,192 HIST1H4B NM_003544 histone 1, H4b 26 2,192 HIST1H4I NM_003495 histone 1, H4i 27 2,192 SLC6A7 AK096607 solute carrier family 6 (neurotransmitter transporter,

L-proline), member 7 28 2,197 PDCD5 BC015519 programmed cell death 5 29 2,197 RFC5 BC001866 replication factor C (activator 1) 5, 36.5kDa 30 2,212 ASNS BC014621 asparagine synthetase 31 2,217 ACAT2 NM_005891 acetyl-Coenzyme A acetyltransferase 2 (acetoacetyl

Coenzyme A thiolase) 32 2,217 MYCBP BC008686 c-myc binding protein 33 2,232 HEC BC035617 highly expressed in cancer, rich in leucine repeats

20

34 2,247 BUB1 AF046078 BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog (yeast)

35 2,252 MELK D79997 maternal embryonic leucine zipper kinase 36 2,262 UGT2B7 BC030974 UDP glycosyltransferase 2 family, polypeptide B7 37 2,283 H2AV BC000098 histone H2A.F/Z variant 38 2,283 LDHB BC015122 lactate dehydrogenase B 39 2,288 SLC2A1 K03195 solute carrier family 2 (facilitated glucose

transporter), member 1 40 2,293 WAC BC004258 WW domain-containing adapter with a coiled-coil

region 41 2,298 EYA2 NM_172112 eyes absent homolog 2 (Drosophila) 42 2,336 HMGB2 X62534 high-mobility group box 2 43 2,358 HIST1H2B

G NM_003518 histone 1, H2bg

44 2,375 DOCK5 AK024569 dedicator of cytokinesis 5 45 2,380 EYA2 NM_172113 eyes absent homolog 2 (Drosophila) 46 2,386 GPR27 AB040799 G protein-coupled receptor 27 47 2,403 HIST1H4C AY128656 Homo sapiens clone HIST1H4C histone H4 gene,

complete cds. 48 2,427 LAMB3 D37766 laminin, beta 3 49 2,577 LAMC2 X73902 laminin, gamma 2 50 2,590 PCDHB5 BC001186 protocadherin beta 5 51 2,624 SCGB2A1 AF071219 secretoglobin, family 2A, member 1 52 2,652 DJ79P11.1 BC015522 X-linked protein 53 2,673 CDCA1 AK093348 cell division cycle associated 1 54 2,717 ZNF183 BC000266 zinc finger protein 183 (RING finger, C3HC4 type) 55 2,865 SLC3A1 NM_000341 solute carrier family 3 (cystine, dibasic and neutral

amino acid transporters) 56 2,881 CTSL2 AB001928 cathepsin L2 57 2,881 FOLR1 M28099 folate receptor 1 (adult) 58 2,881 SCGB1D2 AJ224172 secretoglobin, family 1D, member 2 59 2,915 SGNE1 NM_003020 secretory granule, neuroendocrine protein 1 (7B2

protein) 60 3,039 KIAA1324 BC031648 maba1 61 3,095 MMP1 X54925 matrix metalloproteinase 1 (interstitial collagenase) 62 3,144 GSTA1 S49975 glutathione S-transferase A1 63 3,174 SCGB1D1 NM_006552 secretoglobin, family 1D, member 1 64 3,267 SOX2 NM_003106 SRY (sex determining region Y)-box 2 65 3,448 SCGB2A1 NM_002407 secretoglobin, family 2A, member 1 66 3,610 TACSTD1 AK026585 tumor-associated calcium signal transducer 1 67 4,464 BEX1 NM_018476 brain expressed, X-linked 1

21

Tableau 3C : Gènes avec une expression différente pour les tumeurs chimiorésistantes et chimiosensibles groupés selon leur rôle biologique A. Selected down-regulated genes in the chemoresistant tumors*

Gene Symbol Function CDCA1, FGF18, TOPK, PPIA, FGFR3, MAD2L1, EDN3, REG1B, MIA, AKR1C3, TM4SF8, HEC, CXCL10, CKS1B, ANLN, NPM1

cell proliferation and cell cycle control

LAMA3), LAMB3, LAMC2, PCDHB2 PCDHB5, CDH16 , CDH 19, REG1B

cell adhesion

SLC3A1, SLC35F3, KCNJ16, S100A2, SLC2A1, CACNA2D3, SLC26A9, FOLR1, SLC9A9, SLC25A4

membrane transport

HPGD, LRIG1, NME1, NME2 tumor (including ovarian tumor) suppression

UNG2, RFC5 DNA repair FGFR3, PDCD5, TGM1 apoptosis SCGB2A1, SCGB2A2, SCGB1D1, HSPA4 antagonists of the neoplastic

phenotype TNNI3 angiogenesis inhibitor AMY2B, CTSL2, TACSTD1, VIL1 tumor marker MMP1, TFPI2 (inhibitor of cell invasiveness) cancer invasion B. Selected up-regulated genes in the chemoresistant tumors*

Gene Symbol Function ECGF1, APO E, IGF2R, CCL2, ARHGAP18, RHPN1, HDAC7A, laminin α5

ovarian malignancy and tumor progression

NECL1, MAP3K11 cell migration and invasion LITAF, STAB1, CCL2 inflammation ABCA7, GCLC chemoresistance C. Selected down-regulated genes in the chemosensitive tumors*

Gene Symbol Function HOXB13, CXCL2, CCK, FGFRL1, MMP19, VIP, gastrin, ITGBL1, MAGE-C1, MLC1, TKTL1, SELE, PPP2R1A, IL-6, IDAX, ACE, CNR1, STX11, ARRB1, MMEL2, AREG

tumor invasion and progression

hemoglobins β and γ-G, SAA1, SAA2, CD36, ITGBL1, PLAT, kallikrein 10, S100A1, HPSE2, ATF3, HYAL1, LOC63928, DIS3, DPEP1

ovarian and other tumor markers

FABP4, LPL, CD36, PAFAH2, APO C-I, APO L-4, adipsin, SLC27A1,

lipid metabolism and transport

SAA1, CXCL2, IL1F8, MASP2, CRLF2 inflammation MYCN, NPM2, RAS-D2, RAD9A oncogenes *filtered on 2-fold change; p = 0.001

22

Tableau 3D : Les 43 gènes avec une expression différentielle selon la réponse à la chimiothérapie Prognostic

Strengtha

Gene

symbol

Gene name Functions Elevated

levels in:

18.79 MPZL1 myelin protein zero-like 1 sensitive

18.27 TOPK T-LAK cell-originated protein kinase kinase activity; increased expression in

highly malignant cells

sensitive

17.79 LSM7 LSM7 homolog, U6 small nuclear

RNA

mRNA processing

sensitive

17.79 WDR12 WD repeat domain 12 sensitive

17.00 PTGDS prostaglandin D2 synthase inflammation; role in ovarian cancer

progression

resistant

17.00 PSMD14 proteasome 26S subunit, non-

ATPase, 14

protease activity; confers chemoresistance

to tumor cells

sensitive

16.53 SNRPC small nuclear ribonucleoprotein C mRNA splicing sensitive

16.53 LDHB lactate dehydrogenase B ovarian tumor marker sensitive

16.53 NOP5/58 nucleolar protein NOP5/NOP58 chaperone activity sensitive

16.17 PRO1855 hypothetical protein PRO1855 sensitive

16.12 cyclophilin-related pseudogene sensitive

16.12 MRPS24 mitochondrial ribosomal protein S24 protein synthesis sensitive

15.95 HCAP-G chromosome condensation protein G cell cycle control sensitive

15.36 PSMD1 proteasome 26S subunit, non-

ATPase, 1

protease activity; role in apoptosis of

leukemia cells

sensitive

15.34 MGC12197 hypothetical protein LOC51319 sensitive

15.34 ZNF155 zinc finger protein 155 (pHZ-96) transcription sensitive

15.34 CAP2 adenylate cyclase-assoc. protein, 2 adenylate cyclase activation sensitive

15.18 clone IMAGE:5314816 sensitive

15.18 DAP13 13kDa differentiation-associated

protein

cell differentiation sensitive

15.18 RBBP7 retinoblastoma binding protein 7 cell proliferation; important role in

physiology and pathology of ovarian

tissue

sensitive

14.89 C6orf129 chromosome 6 ORF 129 sensitive

14.89 NDUFB4 NADH dehydrogenase 1 β4 electron transport; different NADH

dehydrenase subunits are implicated in

tumor progression

sensitive

14.56 HSPC132 hypothetical protein HSPC132 sensitive

14.27 FLJ10637 hypothetical protein FLJ10637 sensitive

14.27 hypothetical protein FLJ25804 sensitive

23


14.27 Siva CD27BP (Siva) apoptosis; potentiator of cisplatin-based

chemotherapy

sensitive



14.23 DPP7 dipeptidylpeptidase 7 aminopeptidase (hydrolase) activity resistant

14.23 COX8 cytochrome C oxidase VIII electron transport sensitive


14.23 ACADVL acyl-Coenzyme A dehydrogenase lipid metabolism; altered expression

linked to carcinogenesis

resistant

14.17 CCT6A chaperonin containing TCP1, subunit

6A

radioresistance of cancer cells (Higo et al,

2005)

sensitive

13.86 ALDH9A1 aldehyde dehydrogenase 9, member

A1

electron transport and oxidoreductase

activity; implicated in ovarian carcino-

genesis and chemoresistance

sensitive

13.78 STC2 stanniocalcin 2 signal transduction; associated with tumor

ER status in breast cancer cells

sensitive

13.78 ACAT2 acetoacetyl Coenzyme A thiolase lipid metabolism; biomarker for

hepatocellular carcinoma

sensitive

13.78 ZNF180 zinc finger protein 180 (HHZ168) transcription sensitive

13.72 GPR49 G protein-coupled receptor 49 signal transduction; involved in the

development of hepatocellular carcinomas sensitive

13.72 HSPA4 heat shock 70kDa protein 4 stress response; confers apoptosis of

ovarian cancer cells

sensitive

13.72 DUSP2 dual specificity phosphatase 2 protein dephosphorylation resistant

13.23 AD024 AD024 protein mitosis sensitive

13.23 BRRN1 barren homolog (Drosophila) chromosome condensation sensitive

aAs determined by the 'Support Vector Machines' algorithm of the GeneSpring Class

Prediction analysis.

24

3. Matériel et méthodes

3.1. Les prélèvements pour la banque de tumeurs

Le tissu tumoral utilisé dans toutes les étapes du projet provient de patientes opérées pour

un cancer ovarien à l’Hôtel-Dieu de Québec entre 1998 et 2003. La banque de tumeur de

l’Hôtel-Dieu de Québec compte actuellement plus de 800 tumeurs ovariennes et plus de

5000 d’autres tissus tumoraux et normaux.

Les prélèvements pour la recherche ont été faits à partir de tissu frais reçu dans le

laboratoire de pathologie. Une partie du tissu ovarien frais est congelée en azote liquide et

une autre est incluse en paraffine. Un échantillon prélevé de façon stérile sert à réaliser des

cultures de cellules tumorales. Le tissu congelé est gardé à –80°C pour des études

ultérieures (197).

Avant d’utiliser le tissu congelé on effectue des coupes à 4 μm au cryostat, colorées à

l’hématoxyline et éosine (H&E) pour vérifier l’histologie et le pourcentage de tissu tumoral

présent sur le prélèvement.

3.2. La cohorte d’étude

Les critères d’inclusion et d’exclusion pour cette étude étaient :

avoir du tissu disponible dans la banque de tumeur ovarienne;

les tumeurs ovariennes devaient être des carcinomes de type séreux papillaire, de

stade III et IV selon FIGO;

les patientes devaient avoir reçu une chimiothérapie selon les protocoles;

les dates d’administration et de fin de traitement devaient être connues;

la réponse clinique et l’évolution ultérieure devaient être disponibles;

25

les femmes qui ont reçu une chimiothérapie avant la chirurgie ont été exclues parce

que cela pourrait interférer avec le marquage.

Pour ce projet de recherche on a retrouvé dans labanque de tumeurs 235 carcinomes

ovariens de type séreux papillaire stade III et IV. Six patientes ont refusé la chimiothérapie,

10 n’ont pas reçu la chimiothérapie à cause du décès postopératoire (entre 11 jours et 2

mois), 34 ont un dossier clinique incomplet (traitement administré dans d’autres centres

hospitaliers et la date de début et de fin de la chimiothérapie inconnue, pas d’évaluation

post-chimiothérapie, évolution ultérieure inconnue), pour un cas le stade initial n’a pas pu

être établi, pour un autre cas l’origine ovarienne a été reconsidérée et pour 17 cas le

traitement n’était pas encore terminé. Huit cas ont été exclus pour avoir reçu la

chimiothérapie avant la chirurgie. Finalement, notre cohorte est formée de 158 cas qui ont

reçu la chimiothérapie après la chirurgie et pour lesquels l’évolution clinique est connue.

Les informations cliniques ont été révisées et enregistrées selon le formulaire de collecte

des données. Pour chaque cas on a noté les données d’identification, le diagnostic

histologique, le stade, le grade, le traitement initial, les caractéristiques de la tumeur

résiduelle après chirurgie, les types et les dates d’administration de la chimiothérapie, la

réponse clinique, le statut vital au dernier suivi et l’évaluation dynamique du CA-125.

Les patientes ont été suivies jusqu’au décès ou jusqu’à juillet 2004.

3.3. Les blocs de «tissue array»

Les blocs de paraffine et les lames pour les patientes de la cohorte ont été retrouvés dans les

archives du service de pathologie. Les lames ont été réexaminées pour noter le pourcentage

de tissu tumoral et vérifier le type histologique et le grade (198,199). Les zones tumorales

ont été marquées sur les lames et les aires correspondantes ont été identifiées sur les blocs

en paraffine, pour prélever les carottes qui serviront à la construction des «tissue arrays».

On a accordé priorité aux tumeurs ovariennes primaires, mais quand la tumeur primaire

était de dimensions réduites on a prélevé les carottes à partir des implants péritonéaux.

26

La construction des blocs de tissue array a été réalisée à l’aide d’un instrument spécifique

(Beecher Instruments, Sun Prairie, WI) doté d’un bras mobile qui contient deux poinçons

calibrés (figure 2). Le premier sert à réaliser un trou de 0,6 mm de diamètre dans le bloc de

paraffine récepteur, le deuxième sert à prélever une carotte de tissu tumoral, qui sera placée

dans le trou. Le bras mobile peut être déplacé sur les 2 axes à l’aide des vis micrométriques

et le prélèvement suivant est placé à 0,4 mm de distance. Pour chaque cas on a prélevé 3

carottes de tissu tumoral pour maximiser le nombre des cas interprétables (200). Autour des

carottes de tissu tumoral on a placé une colonne de tissu musculaire lisse qui sert à

diminuer la perte des carottes marginales pendant la technique et comme témoin interne

pour l’IHC (figure 3).

Les 158 cas de la cohorte ont été repartis de façon aléatoire pour réaliser 3 blocs de tissue

array, selon le schéma de randomisation généré par le site Randomization.com

(http://www.randomization.com).

Pour chaque bloc de «tissue array» on a créé un document MS-Excel pour noter l’intensité

du marquage de chaque carotte et finalement retracer les cas. Pendant la lecture des lames,

les valeurs correspondantes à l’intensité du marquage ont été notées dans les champs

appropriés.

Des coupes en paraffine de 4 μm d’épaisseur ont été faites à partir de chaque bloc. La

première coupe colorée avec H&E sert à vérifier la qualité des carottes de tissu prélevé. Les

coupes subséquentes servent pour les colorations immunohistochimiques.

27

Figure 2 : Le «tissue arrayer» (Beecher Instruments, Sun Prairie, WI). Une vis micrométrique déplace le bras mobile. À l’aide d’une première aiguille (rouge), un trou de 0,6 mm en diamètre est fait dans le bloc de paraffine récepteur; avec une deuxième aiguille on fait un prélèvement de tissu tumoral de 0,6 mm en diamètre et 3-4 mm en profondeur, qui sera placé dans le trou. Par la suite, le bras se déplace de 1 mm sur l’axe Y. Quand la ligne des tissus tumoraux est complète, le bras se déplace de 1 mm sur l’axe X et le cycle recommence.

Figure 3 : Lames de «tissue array». Chaque colonne contient 9 carottes (3 cas, 3 prélèvements/cas) placées à 0,4 mm de distance. Les plages de 5 cas sont séparées par des espaces libres de 1 mm. Des prélèvements du muscle lisse sont placés autour qui servent de témoin interne et minimise la perte des carottes de tissu tumoral.

28

3.4. L’immunohistochimie (IHC)

L’immunomarquage a été réalisé selon la technique avec avidine et biotine. Les coupes de

4 μm sont déposées sur une lame de microscope chargée électrostatiquement (Surgipath,

Richmond, IL), et incubées à 37oC pendant la nuit. Le jour suivant, les lames sont

déparaffinées par 2 passages de 5 minutes dans toluène et réhydratées par 2 passages de 3

minutes dans de l’éthanol de 100%, 2 à 4 minutes dans de l’éthanol 95% et 1 passage final

dans l’eau distillée.

À cette étape, pour la majorité des anticorps on a réalisé le démasquage de l’antigène soit

par traitement thermique (pour CD36, MIP2, Fos-B, HSP10, pan-cathepsin, MMP1, GST,

Ki67 et p53) dans un four à micro-ondes, 5 minutes à 120°C dans un tampon citrate, soit

par digestion enzymatique avec pronase (pour prostaglandin D synthétase et Siva). Aucun

traitement n’est requis pour RbAp46. Le traitement par la chaleur permet la destruction des

ponts de méthylène inter et intramoléculaires induites par l’aldéhyde formique pendant la

fixation, ce que modifie la conformation tridimensionnelle des protéines et masque les sites

antigéniques (201). Le pH du tampon utilisé pendant le traitement thermique peut

influencer le processus de démasquage. Le meilleur tampon pour un anticorps est établi

suite à des tests comparatifs. Pour nos anticorps le tampon contient du citrate monosodique

à pH=6, donc faiblement acide. Après le traitement thermique, les lames sont ensuite

refroidies pendant 25 minutes à la température ambiante.

La pronase (pronase E, EM Science, Gibbstown, NJ) a une action similaire au traitement

thermique, soit la dégradation des ponts formés entre les aminoacides qui entrent dans la

structure des protéines pour déplier ainsi les molécules et exposer les sites antigéniques.

L’enzyme est un extrait purifié et lyophilisé de Streptomyces griseus. Les lames ont été

incubées 15 minutes à 37oC dans une solution d’enzyme 0,1%.

Suite à la récupération des antigènes, les lames sont placées 5 minutes dans du tampon PBS

à pH presque neutre (entre 7.28 et 7.60). À l’aide d’un crayon Dako spécial on marque le

contour de la coupe pour éviter que les solutions utilisées au cours du protocole se

déversent sur toute l’étendue de la lame.

29

Pour la coloration IHC les lames sont placées à la température de la pièce dans une

chambre humide qui contient une petite quantité d’eau. Les coupes ne doivent jamais

s’assécher pendant l’incubation parce que l’assèchement entraîne la création des liaisons

non spécifiques et contribue à l’augmentation du bruit de fond. Les tissus sont par la suite

recouverts 5 minutes de peroxyde d’hydrogène 3% pour bloquer l’activité de la peroxydase

endogène présente dans les cellules et ainsi réduire le bruit de fond, puis elles sont rincées

en PBS. Le surplus de liquide est enlevé et on ajoute le sérum bloquant pour 15 minutes. Le

sérum bloquant contient 60 μl de sérum de lapin dilué dans 12 ml PBS; pour les anticorps

de chèvre (Siva et MIP2) on utilise la même concentration de sérum de bœuf. Le sérum

bloquant réduit le bruit de fond en bloquant les sites de liaison non spécifiques. Suivant

l’incubation avec le sérum bloquant on enlève le liquide doucement, sans rinçage.

Les anticorps primaires préalablement dilués dans le tampon spécial (Dako antibody

dilution buffer) sont déposés sur les lames; 1 ml de solution est suffisant pour environ 10

lames. Les dilutions des anticorps primaires, les temps d’incubation, ainsi que le système

de récupération d’antigène et d’amplification du signal sont détaillés aux tableaux 4 et 5.

Pour le témoin négatif on remplace l’anticorps par du PBS. Comme témoin positif, dans

chaque cas, on a utilisé le cas qui exprime le plus fortement le marqueur à l’analyse par

micropuces d’ADN, et aussi des témoins positifs suggérés dans la littérature (tableau 5).

La période d’incubation est de 1 heure à la température de la pièce, sauf pour HSP10 (4oC

pendant la nuit) et la prostaglandine D synthétase (2 heures à la température de la pièce).

Ensuite les lames sont rincées au PBS, le surplus de liquide est enlevé et on applique

l’anticorps secondaire pendant 15 minutes (solution 1, «biotinylated link anti-mouse anti-

rabbit» pour les anticorps de souris et lapin et «biotinylated link anti-mouse anti-rabbit anti-

goat» pour les anticorps de chèvre, Dako). L’anticorps secondaire réagit avec l’anticorps

primaire et sa partie biotinylée va réagir avec la streptavidine. Après le lavage en PBS on

applique le complexe streptavidine-peroxydase (solution 2, streptavidin conjugate to

horseradish peroxydase, Dako) pendant 15 minutes.

Les lames sont rincées au PBS et incubées 5 minutes avec du DAB (3,3-diaminobenzidine,

Dako). Cette solution, préparée juste avant l’utilisation, contient 1 goutte de DAB

30

concentré dans 1 ml de tampon. Le DAB est le substrat chromogénique pour la peroxydase,

qui marque en brun le site d’interaction antigène-anticorps. Finalement, les lames sont

rincées avec de l’eau distillée et contre-colorées 5 minutes avec de l’hématoxyline.

Trois anticorps montraient une coloration très faible sur les témoins positifs (CD36, Fos-B,

MMP1) et ont nécessité l’utilisation d’un système d’amplification du signal (CSA Ancillary

System, Dako). Cette méthode très sensible est utilisée pour mettre en évidence des

antigènes qui autrement étaient considérés non réactifs : avec ce système, l’anticorps

primaire peut être jusqu’à 200 fois plus dilué que par la technique classique avec avidine-

biotine. Après l’application de l’anticorps secondaire les lames sont incubées dans la

chambre humide avec le complexe streptavidine-biotine, l’agent d’amplification (biotinyl

tyramide), et le complexe streptavidine-peroxydase, 15 minutes pour chaque étape.

Finalement on continue avec le substrat chromogénique (DAB) et l’hématoxyline. Comme

cette méthode est extrêmement sensible, plusieurs précautions doivent être prises pour

réduire le bruit de fond. Ainsi, la peroxydase endogène et les immunoglobulines doivent

être bloquées (avec le peroxyde d’hydrogène et le sérum bloquant respectivement) et les

lames doivent être rincées pendant 5 minutes dans 3 bains de PBS après chaque étape.

Un fois la coloration terminée, les lames sont déshydratées en alcool éthylique à

concentration croissante (50%, 75%, 90% et alcool absolu), trempées en xylène et

finalement couvertes avec un film transparent à l’aide d’un appareil automatique

(TissueTek, Sakura Finetechnical, Tokyo, Japon).

31

Tableau 4 : Les anticorps pour IHC No Nom Clone Description

1 PgD Synthétase

Cayman, 10004344

Anticorps polyclonal de souris contre la prostaglandin D synthétase (lipocalin-type, beta trace)

2 CD36 SCBT,, sscc--2211777722

Anticorps monoclonal de souris contre l’antigène leucocytaire humain CD36

3 MIP2 SCBT,, sscc--11338888

Anticorps polyclonal de chèvre contre un déterminant antigénique C-terminal de MIP-2 (CXCL2)

4 Fos-B SCBT,, sscc--88001133

Anticorps monoclonal de souris contre la séquence 75-150 d’amino-acides de la protéine Fos B humaine

5 HSP10 SCBT,, sscc--2200995588

Anticorps polyclonal de lapin qui reconnaît un déterminant antigénique correspondant à la sequence 1-102 de la protéine HSP10 d’origine humaine

6 Pan-cathepsin

SCBT,, sscc--2255553377

Anticorps polyclonal de lapin qui reconnaît un déterminant antigénique correspondent à la équence 34-333 (C terminal) d’amino-acides de la cathepsine L d’origine humaine

7 MMP1 SCBT,, sscc--2211773311

Anticorps monoclonal de souris contre la séquence 366-376 d’amino-acides de la protéine humaine MMP-1

8 GST Abcam,, aabb885566--66

Anticorps monoclonal de souris contre la protéine GST3 formées par 2 dimères idéntiques de 27 kDa

9 Siva SCBT,, sscc--77443366

Anticorps polyclonal de chèvre contre un determinant antigénique localisé au N-terminal de la protéine Siva d’origine humaine

10 RbAp46 Abcam,, aabb33553355

Anticorps monoclonal de souris contre la protéine RbAp 46/RBBP (retinoblastoma associated protein 46)

11 Ki67 Dako, MIB1

Anticorps monoclonal de souris contre la protéine Ki-67 et les fragments recombines de la molecule Ki-67

12 p53 Dako, PAb240

Anticorps monoclonal de souris contre un determinant antigénique de la protéine p53, exprimé seulement dans les formes mutantes où les mutations structurales ont altéré la conformation moléculaire tridimensionnelle

Cayman = Cayman Chemicals, Ann Arbor, Mi; SCBT = Santa Cruz Biotecnology Inc., Santa Cruz, CA; Abcam = Abcam Inc,

Cambridge, MA; Dako = DakoCytomation Inc., Carpinteria, CA

Tableau 5 : La technique IHC No Nom Dilution Démasquage Incubation Amplif. Témoins

1 PgD synthétase

1 :500 Pronase 2h/t pièce Non Carcinome du poumon non à petites cellules

2 CD36 1 :100 Micro-ondes 1h/ t pièce CSA Carcinome de prostate, testicule normal 3 MIP2 Micro-ondes 1h/ t pièce Non Adénocarcinome de pancréas, foie

normal 4 Fos-B 1 :500 Micro-ondes 1h/ t pièce CSA Carcinome du sein 5 HSP10 1 :100 Micro-ondes 4oC pendant

la nuit Non Adénocarcinome du côlon, carcinome

du col de l’utérus 6 Pan-

cathepsin 1 :100 Micro-ondes 1h/ t pièce Non Carcinome du sein, adénocarcinome du

côlon 7 MMP1 1 :250 Micro-ondes 1h/ t pièce CSA Carcinome du sein, adénocarcinome du

côlon 8 GST 1 :1 Micro-ondes 1h/ t pièce Non Adénocarcinome du côlon 9 Siva 1 :10 Pronase 1h/ t pièce Non Adénocarcinome du côlon

10 RbAp46 1 :500 Non 1h/ t pièce Non Carcinome du sein 11 Ki67 1 :75 Micro-ondes 1h/ t pièce Non Carcinome ovarien séreux papillaire 12 p53 1 :500 Micro-ondes 1h/ t pièce Non Carcinome ovarien séreux papillaire

32

3.5. Les variables

3.5.1. Les marqueurs IHC

Dans ce projet on a évalué l’impact sur la survie globale et la survie sans progression des

12 marqueurs : MMP1, HSPE1 (HSP10), Fos-B, GST, pan-cathepsine, CD36, Siva, MIP2

(CXCL2), PTGD2S, RbAp46 (RBBP7), p53 et Ki67.

Le seuil de positivité est considéré à 5% pour p53 et à 20% pour Ki67 (302). L’échelle

d’expression pour les autres anticorps est basée sur le consensus canadien pour Her2/neu

(http://machaon.fmed.ulaval.ca/bmpatho) qui combine l’intensité du marquage et le

pourcentage de cellules positives. Ainsi, le résultat est positif si au moins 10% des cellules

tumorales ont un marquage modéré ou fort. Quand moins de 10% des cellules sont

fortement positives ou plus de 10% présentent un signal faible, le résultat est considéré

négatif.

3.5.2. Autres facteurs pronostiques

Dans notre étude on a évalué l’effet potentiellement confondant d’autres facteurs

pronostiques, comme l’âge, le stade, le grade, le CA125 initial et le type de chimiothérapie.

L’âge a été traité soit comme variable continue soit en catégories (intervalles <55, entre 55

et 64 et > 65 ans).

Les stades III A, B et C selon FIGO ont été regroupés parce que le stade IIIA et IIIB

représentaient 1% et 2% respectivement de la population à l’étude. Pour les calculs

statistiques on a comparé les stades III et IV.

Les grades 1 et 2 selon Silverberg (198) ont été regroupés, étant donné que le grade 1

représentait seulement 5% des cas. Pour des fins statistiques, on a considéré les grades 1 et

2 versus le grade 3.

33

Pour le CA125 initial on a considéré la médiane (800 UI/ml) comme valeur de référence.

Pour les analyses statistiques on a défini 3 catégories, soit <800, >800 et une catégorie pour

les valeurs manquantes.

La chimiothérapie avec taxol et un dérivé de platine a été comparée avec les autres

combinaisons de médicaments. Par ailleurs, on a comparé la thérapie «standard» (6 cycles

de taxol et carboplatine administrés à 3 semaines d’intervalle) et non-standard (d’autre

combinaisons et/ou un nombre de cycles différent de 6).

3.5.3. Les événements

a) La réponse clinique à la chimiothérapie

Définir les événements est une étape très importante pour toute analyse statistique.

Notre premier événement est la réponse clinique à la chimiothérapie. En fonction de la

réponse clinique à la chimiothérapie, les cas sont classés en 4 groupes selon les critères de

RECIST (309).

La réponse complète est notée lorsqu’aucune maladie résiduelle n’est détectable après la

chimiothérapie, soit par l’examen clinique ou par les méthodes d’imagerie et que le CA125

est dans la limite normale.

Une réponse partielle est documentée quand la masse tumorale diminue de plus que 50%

mais reste encore détectable par les examens cliniques ou paracliniques, ou le CA125 reste

au-dessus de la valeur normale définie en 1.3 (141).

La maladie est stable quand la masse tumorale dans son plus grand diamètre varie entre

moins de 50% et plus de 25% de sa taille initiale après le traitement.

La progression est notée en présence de l’augmentation de plus de 25% de la masse

tumorale, de l’apparition d’une nouvelle lésion ou quand le CA125 a doublé entre 2

mesures successives et que la valeur maximale est au-dessus de 100 U/ml (310).

34

Dans notre étude, la réponse partielle et la stabilité ont été regroupées parce que la maladie

résiduelle après la chirurgie est souvent difficile à quantifier et plutôt mentionnée dans le

protocole opératoire comme «maladie résiduelle importante», «plusieurs nodules tumoraux

non réséqués» ou «masse tumorale résiduelle pelvienne».

b) La survie sans progression

Un autre événement étudié est la survie sans progression (SSP). La survie sans progression

est un événement majeur dans la recherche en oncologie, surtout pour évaluer l’efficacité

des nouveaux traitements. Le temps zéro peut être défini soit comme la date de la première

chimiothérapie (202-205), la date de randomisation pour les nouveaux essais cliniques

(206-211), la date du diagnostic (212) ou de la chirurgie (213). L’événement final est la

progression, la récidive (définies en 3.2.), le décès ou le dernier contact avec la patiente.

Dans notre étude, la SSP est calculée de la date de la chirurgie jusqu’à la date du 1er des 3

événements suivants : la récidive, le décès ou le dernier contact avec la patiente.

c) La survie globale

La survie globale (SG) est calculée selon les mêmes critères que la SSP, sauf que la date

finale est la date du décès. Pour les patientes non décédées, on considère la date du dernier

contact avec la patiente.

La survie sans progression est un paramètre plus fiable que la survie globale, parce que

après la récidive ou la progression de la maladie les patientes reçoivent différents types et

combinaisons de médicaments, de la radiothérapie ou de nouveaux traitements. La survie

globale semble être une issue moins appropriée dans notre cas (111) car nous ne disposons

pas des données concernant les traitements subséquents et nous ne pouvons donc pas en

prendre compte pour modéliser la survie globale.

3.6. L’analyse statistique

Les distributions des marqueurs tumoraux ont été comparées selon les niveaux des autres

facteurs pronostiques à l’aide du test du chi-carré. La régression logistique a été utilisée

35

pour estimer les associations (rapport de cotes, RC) entre la réponse complète à la

chimiothérapie et les différents marqueurs tumoraux. Le modèle de Cox a été utilisé pour

estimer les associations (rapport de risque, RR) entre la SSP et les marqueurs tumoraux, de

même que les associations entre la survie et les marqueurs tumoraux. Les analyses

multivariées ont été réalisées afin de prendre en compte les facteurs potentiellement

confondants (l’âge, le stade, le grade, le traitement et le CA125 initial). Un test statistique

est considéré significatif si p<0,05.

36

4. Résultats

4.1. Caractéristique clinique des patientes

Notre cohorte compte 158 patientes avec une tumeur ovarienne de type histologique séreux

papillaire. L’âge moyen est de 61 ans, avec un minimum de 28 et un maximum de 88. La

distribution selon les groupes d’âge est présentée à la figure 4. On observe deux pics

d’incidence, soit un entre 51 et 55 ans, suivi d’un deuxième entre 61 et 75 ans. Bien

qu’aucune preuve n’existe, on peut supposer que le premier groupe présente une

prédisposition familiale plus importante.

Les tumeurs sont en grande partie de grade élevé, soit 5% de grade 1, 29% de grade 2 et

66% de grade 3. Le stade est III et IV pour tous les cas de la cohorte, soit 78% de stade III

et 22% de stade IV (tableau 6).

Dans l’histoire médicale on voit que 17 femmes ont eu un 2e cancer, soit du sein (n=10), du

tractus digestif, (n=3), de l’endomètre (n=1), de la peau (n=2) ou un lymphome malin

(n=1). Deux patientes ont eu 2 autres tumeurs en plus du cancer ovarien (sein et peau et

sein et côlon, respectivement). Une histoire familiale de cancer est notée au dossier

hospitalier dans 55% des cas. Environ 25% des cas ont eu une histoire familiale de cancer

du sein, 6% de cancer de l’ovaire, 8 % de cancer de l’endomètre, 20% de cancers digestifs

et 26% d’autres types. De plus, 4% des cas ont une histoire familiale de cancer du sein et de

l’endomètre et 4% ont une histoire de cancers du sein et de l’ovaire. Dans 24% des cas il y

a plusieurs cancers dans la famille.

Dans notre cohorte, 14,5% des patientes ont reçu un traitement combinant la carboplatine et

la cyclophosphamide, 71% ont reçu un dérivé de platine et le taxol et 14,5% un autre type

de traitement. Trois pourcent de nos patientes ont reçu 5 cycles ou moins, 72% ont reçu 6

cycles et 25% ont reçu 7 cycles ou plus.

37

On a noté 97 réponses complètes, 29 réponses partielles ou maladies stables et 32

progressions sous chimiothérapie. Le temps médian de suivi (jusqu’au décès ou la dernière

consultation) est de 26,1 mois. Le décès est constaté dans 64 cas (figure 5 et tableau 7). On

observe que 50% des cas de progression ou de récidive surviennent dans les 12 premiers

mois. À 5 ans, 43% des patientes sont en vie et 13% sont en rémission. Les courbes de

l’analyse de SSP et SG sont présentées dans l’annexe.

>8176-80

71-7566-70

61-6556-60

51-5546-50

41-45<40

Perc

ent

20

10

0

Figure 4 : Distribution des patientes selon l’âge

38

Tableau 6 : Caractéristiques cliniques des patientes Variable Niveau n/N %

Âge < 50 27/158 (17.1)

50-69 89/158 (56.3)

70 et + 42/158 (26.6)

Grade 1 8/158 ( 5.1)

2 45/158 (28.4)

3 105/158 (66.5)

Grade 1 et 2 53/158 (33.5)

3 105/158 (66.5)

Stade IIIABC 123/158 (77.8)

IV 35/158 (22.2)

Type de chimio Platine + taxol 112/158 (70.9)

Autre 46/158 (29.1)

CA125 initial < 800 72/158 (45.6)

> 800 69/158 (43.7)

nd 17/158 (10.8)

39

Figure 5 : La répartition des cas selon la réponse clinique

Tableau 7 : Incidence cumulative de progression et de décès Even. T (mois) À risque Even. Survie (%) IC à 95%

Rec-Pr 0 158 0 100 [ 100; 100]

12 76 77 50.2 [42.4; 58.1]

24 30 119 22.0 [15.3; 28.6]

36 21 125 17.5 [11.3; 23.7]

48 15 126 16.4 [10.2; 22.6]

60 7 129 12.8 [ 6.8; 18.9]

Décès 0 158 0 100 [ 100; 100]

12 137 11 92.8 [88.7; 96.9]

24 84 38 72.7 [65.2; 80.2]

36 48 54 56.8 [47.8; 65.9]

48 25 62 44.7 [34.3; 55.1]

60 13 63 42.9 [32.3; 53.4]

Even=événement, Rec-Pr=récidive ou progression, t=temps, IC=intervalle de confiance

158 patientes au départ

97 réponses complètes (61.4%)

29 rép partielles/stabilité (18.4%)

32 progressions sous chimio (20.3%)

77 récidives (1 constatée au décès)

21 progressions

31 décès (31/97 = 32.0%)

12 décès (12/29 = 41.4%)

21 décès (21/32 = 65.6%)

40

4.2. Les marqueurs tumoraux

4.2.1. Description des marqueurs tumoraux

Les cellules tumorales positives pour MMP1 présentent un marquage granulaire

cytoplasmique. Les cellules stromales sont généralement négatives. Dans le tableau de

fréquence (tableau 8) on observe que seulement 12% des cas ont un marquage IHC positif

pour MMP1.

Les cellules tumorales ont un marquage cytoplasmique pour CD36 et les cellules stromales

sont négatives. Un marquage positif est observé dans 19% des cas.

Les cellules tumorales positives pour HSPE1 (HSP10) présentent un marquage

cytoplasmique granulaire. Un marquage d’intensité variable est observé dans des cellules

stromales dispersées et surtout des cellules périvasculaires. Seul le marquage des cellules

tumorales a été pris en considération. Environ 43% des cas présentent un marquage positif.

Le marquage pour FosB est cytoplasmique et granulaire, surtout vers le pôle basal des

cellules tumorales. Les cellules stromales n’ont pas un marquage détectable. Environ 20%

des cas ont un marquage positif pour Fos-B.

Le marquage pour GST est cytoplasmique diffus et les cellules stromales ne marquent pas.

Globalement, 27% des cas sont positifs pour GST.

Le marquage pour la pan-cathepsine est cytoplasmique et surtout localisé au pole basal des

cellules tumorales. Un marquage positif est également observé dans les cellules stromales

mononuclées. Seul le marquage des cellules tumorales a été gradé. Pour notre cohorte, 31%

des cas sont positifs pour la pan-cathepsine.

Dans notre étude on a utilisé des anticorps de chèvre dirigés contre des fractions

antigéniques de Siva et MIP2 (CXCL2). Malgré tous les essais avec des différentes

concentrations de l’anticorps, temps et température d’incubation, systèmes de récupération

41

de l’antigène et amplification du signal, aucun marquage détectable n’a été obtenu pour ces

anticorps.

La prostaglandine D2 synthétase (PTGD2S) est présente sous forme de marquage

cytoplasmique faible dans moins de 5% des cas. Étant donné le taux très faible de

positivité, les données ne sont pas interprétables du point de vue statistique.

Les cellules tumorales présentent un marquage diffus, nucléaire et cytoplasmique pour

RbAp46 (RBBP7). Les cellules stromales présentent un degré variable de positivité. Seul le

marquage nucléaire des cellules tumorales a été gradé. Malgré des ajustements de la

concentration de l’anticorps ainsi que du temps et de la température d’incubation, presque

la totalité des cellules présentent un marquage très intense. Pour cette raison, les données ne

sont pas statistiquement interprétables.

La protéine p53 mutée donne un marquage nucléaire. Bien que quelques cellules tumorales

présentent également un marquage cytoplasmique, seul le marquage nucléaire non

équivoque a été gradé. Le tableau 8 montre que 58% des cas sont positifs pour p53.

Le Ki67 marque les cellules tumorales dans 48% des cas. Seul le marquage nucléaire

intense a été gradé.

Des photos montrant le marquage IHC pour les anticorps utilisés sont présentées dans

l’annexe (figures 23 à 30).

4.2.2. Relations entre les marqueurs tumoraux et les facteurs de risque

Il n’y a pas d’association entre les facteurs pronostiques et CD36, HSP10 et Fos-B (tableau

9 à 17).

La positivité de MMP1 varie selon l’âge (p=0,01), les femmes âgées ayant un taux de

positivité plus élevé. La positivité de MMP1 varie aussi selon le stade (p=0,07), avec un

taux de positivité supérieur pour le stade III.

GST est associé à la valeur du CA125 initial (p=0,02).

42

La pan-cathepsine dépend du grade (p=0,02), le taux de positivité du marqueur est plus

élevé parmi les femmes avec un grade 3. Le CA125 élevé correspondant à un marquage

plus intense pour la pan-cathepsine (p=0,0085).

p53 a tendance à être positif chez les femmes les plus âgées (p=0,06) mais l’association est

à la limite de la signification statistique. Il varie aussi selon le CA125 initial.

Ki67 est dépendent du grade (p=0,03), le grade 3 ayant le plus grand taux de positivité du

marqueur.

L’index pronostique dépend du grade, le grade 3 ayant un index plus élevé.

4.2.3. Relations entre les marqueurs tumoraux et la réponse à la

chimiothérapie

L’analyse univariée (tableau 18) montre qu’il y a un lien entre HSP et p53 et la réponse à la

chimiothérapie (p=0,07 et 0,06 respectivement), mais les associations restent à la limite de

la signification statistique. Pour p53, le taux de positivité le plus élevé est associé à la

réponse complète, alors que pour HSP10 le taux de positivité est plus élevé quand il y a une

réponse complète ou partielle.

L’analyse univariée (tableau 19) montre que p53 et l’IP sont associés à la réponse complète

à la fin de la chimiothérapie. Les patientes ayant un p53 positif ont 2,18 fois plus de chance

d’avoir une réponse complète (p=0,02) que les patientes ayant un p53 négatif.

Un index pronostique (IP) a été conçu a partir de 4 marqueurs : MMP1, HSP10, Ki67 et

p53. Pour chaque cas, un point était attribué en présence d’un p53 positif, un index de

prolifération plus grand que 20%, la protéine HSP10 positive et le MMP1 négatif. Les cas

avec un index de 2 ou moins ont été comparés aux cas avec un index de 3 ou plus. Les

patientes ayant un index positif ont 2,11 fois plus de chance d’avoir une réponse complète

(p=0,02) que les patientes ayant un index négatif.

43

4.2.4. Relations entre les marqueurs tumoraux et la survie sans

progression

L’analyse de Kaplan-Meier pour la SSP (annexe, figures 9A à 22A) montrent que les 2

courbes diffèrent de façon statistiquement significative pour HSP10 (log-rank test =0,01) et

l’IP (log-rank test=0,001). On observe une tendance pour Ki67 (log-rank test=0,13).

L’analyse univariée (tableau 20) démontre que la SSP est associée au stade (p=0,02). Les

patientes ayant un stade IV ont 1,6 fois plus de risque d’avoir une progression (IC à 95% :

1,06-2,38) que les patientes avec un stade III. La SSP est aussi associée au type de la

chimiothérapie, les patientes ayant un traitement avec taxol et carboplatin ont moins de

chance d’avoir une progression (RR : 0,66, IC à 95% : 0,47-0,93, p=0,02). La positivité

pour HSP10 est associée à une meilleure SSP (RR : 0,64, IC à 95% : 0,45-0,91, p=0,01).

On observe une association similaire pour l’IP (RR : 0,56, IC à 95% : 0,4-0,8, p=0,0003).

L’analyse multivariée (tableau 21) ajustée pour l'âge, le stade, le grade, le type de

chimiothérapie et le CA125 initial montre que HSP10 (p=0,01) peut prédire la réponse

complète. Les patientes avec un HSP10 positif ou un IP positif ont moins de chance d’avoir

une progression (RR 0,63, IC à 95% : 0,44-0,91). On observe une association similaire pour

l’IP (RR 0,5, IC à 95% : 0,4-0,8). MMP1 a une tendance à être positif chez les femmes

ayant une progression (p=0,09). Les patientes ayant un MMP1 positif ont 1,59 fois plus de

chance d’avoir une maladie active (IC à 95% : 0,93-2,77). Les patientes avec un Ki67

positif ont aussi tendance à avoir moins de progression (RR=0,71, IC à 95% : 0,49-1,01).

4.2.5. Relations entre les marqueurs tumoraux et la survie globale

Les courbes de Kaplan-Meier pour la SG sont présentées en annexe (figures 9B à 22B). La

SG diffère significativement en fonction du type de chimiothérapie ainsi que du taux

d’expression de HSP10, de GST et de l’IP.

L’analyse univariée (tableau 22) montre que les patientes qui reçoivent une chimiothérapie

autre qu’avec taxol et carboplatin ont une survie diminuée (RR : 0,44, IC à 95% 0,26-0,74,

44

p=0,002) par rapport aux patientes qui reçoivent un schéma avec taxol et carboplatin. Le

CA125 initial élevé au-dessus de la moyenne (p=0,05) est associé à une mortalité plus

importante (RR : 1,72, IC à 95% 0,99-2,97, p=0,05). On observe une même association

quand le CA125 est non disponible (RR : 3,78, IC à 95% 1,77-8,07, p=0,0006).

Les patientes de stade IV ont tendance à avoir une mortalité plus importante (RR : 1,54, IC

à 95% : 0,88-2,70, p=0,13) que les patientes de stade III, mais cette association est à la

limite de la signification statistique.

L’analyse multivariée (tableau 23) ajustée pour l'âge, le stade, le grade, le type de

chimiothérapie et le CA125 initial montre qu’un HSP positif est associé à une mortalité

plus réduite (RR : 0,572, IC à 95% : 0,34-0,97, p=0,04).

Un Ki67 élevé (RR : 0,593, IC à 95% : 0,35-0,99, p=0,05) ainsi qu’un index pronostique de

3 et plus (RR : 0,49, IC à 95% : 0,29-0,84, p=0,0088) sont associés à une mortalité reduite.

Les femmes ayant un MMP1 positif et un GST positif semblent avoir un risque augmenté

de mortalité par rapport à celles n’exprimant pas ces marqueurs (RR : 1,82, IC à 95% :

0,88-3,78, p=0,10 et RR : 1,48, IC à 95% : 0,86-2,56, p=0,15 respectivement), mais aucune

de ces associations n’est statistiquement significative.

45

Tableau 8: Tableau de fréquence pour les marqueurs IHC Variable Niveau n/N % MMP1 Négatif 139/158 (88.0) Positif 19/158 (12.0) CD36 Négatif 128/158 (81.0) Positif 30/158 (19.0) HSP10 Négatif 90/158 (57.0) Positif 68/158 (43.0) FOSB Négatif 127/158 (80.4) Positif 31/158 (19.6) GST Négatif 116/158 (73.4) Positif 42/158 (26.6) PAN-CATHEPSIN Négatif 109/158 (69.0) Positif 49/158 (31.0) P53 Négatif 67/158 (42.4) Positif 91/158 (57.6) Ki67 < 20 83/158 (52.5) 20 et + 75/158 (47.5) IP Négatif 86/158 (54.4) Positif 72/158 (45.6)

Tableau 9: Relation entre CD36 et les facteurs pronostiques CD6 Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 39/128 (30.5) 11/30 (36.7) 0.74 55-64 33/128 (25.8) 8/30 (26.7) 65 et + 56/128 (43.8) 11/30 (36.7) Moy ± SD 61.5 ± 11.3 59.5 ± 14.0 0.40 Grade 1-2 42/128 (32.8) 11/30 (36.7) 0.68 3 86/128 (67.2) 19/30 (63.3) Stade IIIabc 102/128 (79.7) 21/30 (70.0) 0.25 IV 26/128 (20.3) 9/30 (30.0) Agent Carbo+Taxol 67/128 (52.3) 17/30 (56.7) 0.88 Cisp+Taxol 24/128 (18.8) 4/30 (13.3) Carbo+Cycloph 18/128 (14.1) 5/30 (16.7) Autre 19/128 (14.8) 4/30 (13.3) Carbo+ Autre 61/128 (47.7) 13/30 (43.3) 0.66 Taxol Carbo+Taxol 67/128 (52.3) 17/30 (56.7) Type Non standard 65/128 (50.8) 18/30 (60.0) 0.36 chimio Standard 63/128 (49.2) 12/30 (40.0) CA125 < 800 56/128 (43.8) 16/30 (53.3) 0.19 initial > 800 60/128 (46.9) 9/30 (30.0) nd 12/128 ( 9.4) 5/30 (16.7)

46

Tableau 10 : Relation entre HSP10 et les facteurs pronostiques HSP Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 26/90 (28.9) 24/68 (35.3) 0.60 55-64 23/90 (25.6) 18/68 (26.5) 65 et + 41/90 (45.6) 26/68 (38.2) Moy ± SD 61.3 ± 12.6 60.9 ± 10.9 0.83 Grade 1-2 33/90 (36.7) 20/68 (29.4) 0.339 3 57/90 (63.3) 48/68 (70.6) Stade IIIABC 69/90 (76.7) 54/68 (79.4) 0.68 IV 21/90 (23.3) 14/68 (20.6) Agent Carbo+Taxol 51/90 (56.7) 33/68 (48.5) 0.55 Cisp+Taxol 13/90 (14.4) 15/68 (22.1) Carbo+Cy 14/90 (15.6) 9/68 (13.2) Autre 12/90 (13.3) 11/68 (16.2) Carbo Autre 39/90 (43.3) 35/68 (51.5) 0.31 +Taxol Carbo+Taxol 51/90 (56.7) 33/68 (48.5) Type de Non standard 49/90 (54.4) 34/68 (50.0) 0.57 chimio Standard 41/90 (45.6) 34/68 (50.0) CA125 < 800 41/90 (45.6) 31/68 (45.6) 0.93 initial > 800 40/90 (44.4) 29/68 (42.6) nd 9/90 (10.0) 8/68 (11.8) Moy ± SD 1666 ± 2457 2449 ± 3899 0.14

Tableau 11 : Relation entre Fos-B et les facteurs pronostiques FOSB Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 39/127 (30.7) 11/31 (35.5) 0.85 55-64 33/127 (26.0) 8/31 (25.8) 65 et + 55/127 (43.3) 12/31 (38.7) Moy ± SD 61.4 ± 11.3 60.0 ± 14.0 0.55 Grade 1-2 42/127 (33.1) 11/31 (35.5) 0.79 3 85/127 (66.9) 20/31 (64.5) Stade IIIABC 101/127 (79.5) 22/31 (71.0) 0.30 IV 26/127 (20.5) 9/31 (29.0) Agent Carbo+Taxol 67/127 (52.8) 17/31 (54.8) 0.88 Cisp+Taxol 24/127 (18.9) 4/31 (12.9) Carbo+Cy 18/127 (14.2) 5/31 (16.1) Autre 18/127 (14.2) 5/31 (16.1) Carbo Autre 60/127 (47.2) 14/31 (45.2) 0.83 +Taxol Carbo+Taxol 67/127 (52.8) 17/31 (54.8) Type de Non standard 64/127 (50.4) 19/31 (61.3) 0.27 chimio Standard 63/127 (49.6) 12/31 (38.7) CA125 initial < 800 55/127 (43.3) 17/31 (54.8) 0.16 > 800 60/127 (47.2) 9/31 (29.0) nd 12/127 ( 9.4) 5/31 (16.1) Moy ± SD 2059 ± 3288 1735 ± 2580 0.63

47

Tableau 12 : Relation entre MMP1 et les facteurs pronostiques MMP1 Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 48/139 (34.5) 2/19 (10.5) 0.01 55-64 38/139 (27.3) 3/19 (15.8) 65 et + 53/139 (38.1) 14/19 (73.7) Moy ± SD 60.0 ± 1.7 69.1 ± 9.7 0.0016 Grade 1-2 45/139 (32.4) 8/19 (42.1) 0.39 3 94/139 (67.6) 11/19 (57.9) Stade IIIABC 105/139 (75.5) 18/19 (94.7) 0.05 IV 34/139 (24.5) 1/19 ( 5.3) 0.07

(Exact) Agent Carbo+Taxol 75/139 (54.0) 9/19 (47.4) 0.84 Cisp+Taxol 25/139 (18.0) 3/19 (15.8) Carbo+Cy 19/139 (13.7) 4/19 (21.1) Autre 20/139 (14.4) 3/19 (15.8) Carbo Autre 64/139 (46.0) 10/19 (52.6) 0.58 +Taxol Carbo+Taxol 75/139 (54.0) 9/19 (47.4) Type de Non standard 71/139 (51.1) 12/19 (63.2) 0.32 chimio Standard 68/139 (48.9) 7/19 (36.8) CA125 < 800 62/139 (44.6) 10/19 (52.6) 0.14 initial > 800 64/139 (46.0) 5/19 (26.3) nd 13/139 ( 9.4) 4/19 (21.1) Moy ± SD 2069 ± 3271 1416 ± 2033 0.45

Tableau 13 : Relation entre GST et les facteurs pronostiques GST Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 38/116 (32.8) 12/42 (28.6) 0.72 55-64 31/116 (26.7) 10/42 (23.8) 65 et + 47/116 (40.5) 20/42 (47.6) Moy ± SD 61.0 ± 11.8 61.6 ± 12.3 0.77 Grade 1-2 40/116 (34.5) 13/42 (31.0) 0.67 3 76/116 (65.5) 29/42 (69.0) Stade IIIABC 89/116 (76.7) 34/42 (81.0) 0.57 IV 27/116 (23.3) 8/42 (19.0) Agent Carbo+Taxol 67/116 (57.8) 17/42 (40.5) 0.02 Cisp+Taxol 22/116 (19.0) 6/42 (14.3) Carbo+Cy 11/116 ( 9.5) 12/42 (28.6) Autre 16/116 (13.8) 7/42 (16.7) Carbo+ Autre 49/116 (42.2) 25/42 (59.5) 0.05 Taxol Carbo+Taxo 67/116 (57.8) 17/42 (40.5) Type de Non standard 55/116 (47.4) 28/42 (66.7) 0.03 chimio Standard 61/116 (52.6) 14/42 (33.3) CA125 < 800 52/116 (44.8) 20/42 (47.6) 0.02 initial > 800 56/116 (48.3) 13/42 (31.0) nd 8/116 ( 6.9) 9/42 (21.4) Moy ± SD 2054 ± 3254 1820 ± 2888 0.71

48

Tableau 14 : Relation entre la pan-cathepsine et les facteurs pronostiques PANC Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 31/109 (28.4) 19/49 (38.8) 0.34 55-64 28/109 (25.7) 13/49 (26.5) 65 et + 50/109 (45.9) 17/49 (34.7) Moy ± SD 62.3 ± 11.3 58.5 ± 12.8 0.06 Grade 1-2 43/109 (39.4) 10/49 (20.4) 0.02 3 66/109 (60.6) 39/49 (79.6) Stade IIIABC 85/109 (78.0) 38/49 (77.6) 0.95 IV 24/109 (22.0) 11/49 (22.4) Agent Carbo+Taxol 65/109 (59.6) 19/49 (38.8) 0.11 Cisp+Taxol 16/109 (14.7) 12/49 (24.5) Carbo+Cy 14/109 (12.8) 9/49 (18.4) Autre 14/109 (12.8) 9/49 (18.4) Carbo+ Autre 44/109 (40.4) 30/49 (61.2) 0.02 Taxol Carbo+Taxol 65/109 (59.6) 19/49 (38.8) Type de Non standard 52/109 (47.7) 31/49 (63.3) 0.07 chimio Standard 57/109 (52.3) 18/49 (36.7) CA125 < 800 58/109 (53.2) 14/49 (28.6) 0.0085 initial > 800 39/109 (35.8) 30/49 (61.2) nd 12/109 (11.0) 5/49 (10.2) Moy ± SD 1529 ± 2942 3038 ± 3413 0.0082

Tableau 15 : Relation entre p53 et les facteurs pronostiques P53 Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 22/67 (32.8) 28/91 (30.8) 0.06 55-64 23/67 (34.3) 18/91 (19.8) 65 et + 22/67 (32.8) 45/91 (49.5) Moy ± SD 59.6 ± 11.9 62.3 ± 11.8 0.15 Grade 1-2 27/67 (40.3) 26/91 (28.6) 0.12 3 40/67 (59.7) 65/91 (71.4) Stade IIIABC 52/67 (77.6) 71/91 (78.0) 0.95 IV 15/67 (22.4) 20/91 (22.0) Agent Carbo+Taxol 37/67 (55.2) 47/91 (51.6) 0.80 Cisp+Taxol 10/67 (14.9) 18/91 (19.8) Carbo+Cy 9/67 (13.4) 14/91 (15.4) Autre 11/67 (16.4) 12/91 (13.2) Carbo+ Autre 30/67 (44.8) 44/91 (48.4) 0.65 Taxol Carbo+Taxol 37/67 (55.2) 47/91 (51.6) Type de Non standard 33/67 (49.3) 50/91 (54.9) 0.47 chimio Standard 34/67 (50.7) 41/91 (45.1) CA125 < 800 32/67 (47.8) 40/91 (44.0) 0.46 initial > 800 26/67 (38.8) 43/91 (47.3) nd 9/67 (13.4) 8/91 ( 8.8) Moy ± SD 1146 ± 1799 2596 ± 3736 0.007

49

Tableau 16 : Relation entre Ki67 et les facteurs pronostiques Ki67 < 20% > 20% Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 28/83 (33.7) 22/75 (29.3) 0.25 55-64 17/83 (20.5) 24/75 (32.0) 65 et + 38/83 (45.8) 29/75 (38.7) Moy ± SD 60.9 ± 13.0 61.3 ± 10.5 0.83 Grade 1-2 34/83 (41.0) 19/75 (25.3) 0.03 3 49/83 (59.0) 56/75 (74.7) Stade IIIABC 63/83 (75.9) 60/75 (80.0) 0.53 IV 20/83 (24.1) 15/75 (20.0) Agent Carbo+Taxol 43/83 (51.8) 41/75 (54.7) 0.97 Cisp+Taxol 15/83 (18.1) 13/75 (17.3) Carbo+Cy 13/83 (15.7) 10/75 (13.3) Autre 12/83 (14.5) 11/75 (14.7) Carbo+ Autre 40/83 (48.2) 34/75 (45.3) 0.71 Taxol Carbo+Taxol 43/83 (51.8) 41/75 (54.7) Type de Non standard 46/83 (55.4) 37/75 (49.3) 0.44 chimio Standard 37/83 (44.6) 38/75 (50.7) CA125 < 800 43/83 (51.8) 29/75 (38.7) 0.22 initial > 800 33/83 (39.8) 36/75 (48.0) nd 7/83 ( 8.4) 10/75 (13.3) Moy ± SD 1815 ± 2858 2215 ± 3497 0.45

Tableau 17 : L’index pronostique (IP) IP Négatif Positif Variable Niveau n/N % n/N % P Âge < 55 26/86 (30.2) 24/72 (33.3) 0.91 55-64 23/86 (26.7) 18/72 (25.0) 65 et + 37/86 (43.0) 30/72 (41.7) Moy ± SD 60.7 ± 12.8 61.7 ± 10.7 0.58 Grade 1-2 35/86 (40.7) 18/72 (25.0) 0.03 3 51/86 (59.3) 54/72 (75.0) Stade IIIABC 66/86 (76.7) 57/72 (79.2) 0.71 IV 20/86 (23.3) 15/72 (20.8) Agent Carbo+Taxol 46/86 (53.5) 38/72 (52.8) 0.98 Cisp+Taxol 16/86 (18.6) 12/72 (16.7) Carbo+Cy 12/86 (14.0) 11/72 (15.3) Autre 12/86 (14.0) 11/72 (15.3) Carbo+ Autre 40/86 (46.5) 34/72 (47.2) 0.92 Taxol Carbo+Taxol 46/86 (53.5) 38/72 (52.8) Type de Non standard 46/86 (53.5) 37/72 (51.4) 0.79 chimio Standard 40/86 (46.5) 35/72 (48.6) CA125 < 800 41/86 (47.7) 31/72 (43.1) 0.75 initial > 800 37/86 (43.0) 32/72 (44.4) nd 8/86 ( 9.3) 9/72 (12.5) Moy ± SD 1657 ± 2507 2424 ± 3803 0.15

50

Tableau 18 : Relation entre les marqueurs tumoraux et la réponse à la chimiothérapie RC RP/stable Progression Var Niv n/N % n/N % n/N % p CD6 Nég 78/97 80.4 3/29 79.3 27/32 (84.4) 0.85 Pos 19/97 19.6 6/29 20.7 5/32 (15.6) HSP Nég 51/97 52.6 5/29 51.7 24/32 (75.0) 0.07 Pos 46/97 47.4 4/29 48.3 8/32 (25.0) FOSB Nég 77/97 79.4 3/29 79.3 27/32 (84.4) 0.81 Pos 20/97 20.6 6/29 20.7 5/32 (15.6) MMP1 Nég 87/97 89.7 6/29 89.7 26/32 (81.3) 0.42 Pos 10/97 10.3 3/29 10.3 6/32 (18.8) GST Nég 73/97 75.3 1/29 72.4 22/32 (68.8) 0.76 Pos 24/97 24.7 8/29 27.6 10/32 (31.3) PANC Nég 67/97 69.1 0/29 69.0 22/32 (68.8) 0.90 Pos 30/97 30.9 9/29 31.0 10/32 (31.3) P53 Nég 34/97 35.1 5/29 51.7 18/32 (56.3) 0.06 Pos 63/97 64.9 4/29 48.3 14/32 (43.8) Ki67 Nég 49/97 50.5 6/29 55.2 18/32 (56.3) 0.81 Pos 48/97 49.5 3/29 44.8 14/32 (43.8) IP Nég 46/97 47.4 6/29 55.2 24/32 (75.0) 0.02 Pos 51/97 52.6 3/29 44.8 8/32 (25.0) RC=réponse complète, RP=réponse partielle

51

Tableau 19 : Relation entre les marqueurs tumoraux,t les caractéristiques cliniques et la réponse complète à la chimiothérapie Var Niv Fréq n Év n (%) OR

brut IC à 95% P

Âge < 50 27 (17.1) 19 (70.4) 1.0 50-69 89 (56.3) 53 (59.6) 0.62 [0.25;1.57] 0.31 70 et + 42 (26.6) 25 (59.5) 0.62 [0.22;1.74] 0.36 Grade 1-2 53 (33.5) 35 (66.0) 1.0 3 105 (66.5) 62 (59.0) 0.74 [0.37;1.48] 0.39 Stade IIIABC 123 (77.8) 79 (64.2) 1.0 IV 35 (22.2) 18 (51.4) 0.59 [0.28;1.26] 0.17 CA125 < 800 72 (45.6) 47 (65.3) 1.0 Init. > 800 69 (43.7) 45 (65.2) 0.99 [ 0.5; 2] 0.99 nd 17 (10.8) 5 (29.4) 0.22 [0.07; 0.7] 0.01 CD6 Nég 128 (81.0) 78 (60.9) 1.0 Pos 30 (19.0) 19 (63.3) 1.11 [0.49;2.52] 0.80 HSP Nég 90 (57.0) 51 (56.7) 1.0 Pos 68 (43.0) 46 (67.6) 1.59 [0.83;3.09] 0.16 FOSB Nég 127 (80.4) 77 (60.6) 1.0 Pos 31 (19.6) 20 (64.5) 1.18 [0.52;2.67] 0.69 MMP1 Nég 139 (88.0) 87 (62.6) 1.0 Pos 19 (12.0) 10 (52.6) 0.66 [0.25;1.74] 0.40 GST Nég 116 (73.4) 73 (62.9) 1.0 Pos 42 (26.6) 24 (57.1) 0.78 [0.38;1.61] 0.50 PANC Nég 109 (69.0) 67 (61.5) 1.0 Pos 49 (31.0) 30 (61.2) 0.99 [ 0.5;1.98] 0.97 P53 Nég 67 (42.4) 34 (50.7) 1.0 Pos 91 (57.6) 63 (69.2) 2.18 [1.14; 4.2] 0.02 Ki67 Nég 83 (52.5) 49 (59.0) 1.0 Pos 75 (47.5) 48 (64.0) 1.23 [0.65;2.35] 0.52 IP Nég 86 (54.4) 46 (53.5) 1.0 Pos 72 (45.6) 51 (70.8) 2.11 [1.09;4.09] 0.03

52

Tableau 20 : Relations entre les facteurs pronostiques et la survie sans progression Analyse univariée Prédic Niveau Fréq n(%) Év n (%) HR IC à 95% P Âge < 55 50(31.6) 41(82.0) 1.0 55-64 41(25.9) 33(80.5) 0.83 [0.52;1.31] 0.41 65 et + 67(42.4) 56(83.6) 1 [0.67; 1.5] 0.99 Grade 1-2 53(33.5) 42(79.2) 1.0 3 105(66.5) 88(83.8) 1.25 [0.86; 1.81] 0.23 Stade IIIABC 123(77.8) 98(79.7) 1.0 IV 35 (22.2) 32(91.4) 1.59 [1.06; 2.38] 0.02 Agent Carbo+Taxol 84(53.2) 64(76.2) 1.0 Cisp+Taxol 28(17.7) 25(89.3) 1.45 [0.91; 2.31] 0.11 Carbo+Cy 23(14.6) 21(91.3) 1.52 [0.93; 2.5] 0.09 Autre 23(14.6) 20(87.0) 1.61 [0.97; 2.68] 0.06 Carbo+ Autre 74(46.8) 66(89.2) 1.0 Taxol Carbo+Taxol 84(53.2) 64(76.2) 0.66 [0.47; 0.93] 0.02 CA125 < 800 72 (45.6) 60(83.3) 1.0 initial > 800 69 (43.7) 56(81.2) 0.95 [0.66; 1.37] 0.79 nd 17 (10.8) 14(82.4) 1.52 [0.85; 2.73] 0.15

Tableau 21 : Relations entre les marqueurs tumoraux et la survie sans progression Analyse univariée Analyse ajustée § Préd Niv Fréq n (%) Évén n (%) HR IC à 95% P HR IC à 95% P CD6 Négatif 128 (81.0) 103 (80.5) 1.0 1.0 Positif 30 (19.0) 27 (90.0) 1.134 [0.74; 1.73] 0.56 1.055 [0.673; 1.653] 0.81 HSP Négatif 90 (57.0) 80 (88.9) 1.0 1.0 Positif 68 (43.0) 50 (73.5) 0.641 [0.45; 0.91] 0.01 0.602 [0.417; 0.870] 0.007 FOSB Négatif 127 (80.4) 102 (80.3) 1.0 1.0 Positif 31 (19.6) 28 (90.3) 1.155 [0.76; 1.76] 0.50 1.069 [0.687; 1.663] 0.76 MMP1 Négatif 139 (88.0) 113 (81.3) 1.0 1.0 Positif 19 (12.0) 17 (89.5) 1.48 [0.89; 2.47] 0.13 1.614 [0.936; 2.785] 0.08 GST Négatif 116 (73.4) 92 (79.3) 1.0 1.0 Positif 42 (26.6) 38 (90.5) 1.25 [0.86; 1.83] 0.24 1.079 [0.725; 1.606] 0.70 PANC Négatif 109 (69.0) 88 (80.7) 1.0 1.0 Positif 49 (31.0) 42 (85.7) 0.982 [0.68; 1.42] 0.92 0.917 [0.610; 1.378] 0.67 P53 Négatif 67 (42.4) 55 (82.1) 1.0 1.0 Positif 91 (57.6) 75 (82.4) 0.815 [0.58; 1.15] 0.24 0.828 [0.580; 1.181] 0.29 Ki67 < 20 83 (52.5) 71 (85.5) 1.0 1.0 20 et + 75 (47.5) 59 (78.7) 0.764 [0.54; 1.08] 0.12 0.722 [0.505; 1.033] 0.07 Index 0-1-2 86 (54.4) 76 (88.4) 1.0 1.0 3-4 72 (45.6) 54 (75.0) 0.562 [ 0.4; 0.8] 0.0013 0.516 [0.356; 0.748] 0.0005

Note: § En contrôlant pour l'âge, le stade, le grade, le type de chimio et le CA125 initial

53

Tableau 22 : Relations entre les facteurs pronostiques et la survie Analyse univariée Préd

Niveau

Fréquencen (%)

Événement n (%)

HR

IC à 95%

P

Âge < 55 50 (31.6) 23 (46.0) 1.0 55-64 41 (25.9) 11 (26.8) 0.50 [0.24; 1.04] 0.06 65 et + 67 (42.4) 30 (44.8) 0.91 [0.53; 1.57] 0.73 Grade 1-2 53 (33.5) 18 (34.0) 1.0 3 105 (66.5) 46 (43.8) 1.43 [0.83; 2.46] 0.20 Stade IIIABC 123 (77.8) 47 (38.2) 1.0 IV 35 (22.2) 17 (48.6) 1.54 [0.88; 2.7] 0.13 Agent Carbo+Taxol 84 (53.2) 21 (25.0) 1.0 Cisp+Taxol 28 (17.7) 17 (60.7) 1.99 [1.05; 3.81] 0.04 Carbo+Cy 23 (14.6) 14 (60.9) 2.49 [1.27; 4.9] 0.0083 Autre 23 (14.6) 12 (52.2) 2.46 [1.21; 5.02] 0.01 Carbo+ Autre 74 (46.8) 43 (58.1) 1.0 Taxol Carbo+Taxol 84 (53.2) 21 (25.0) 0.44 [0.26; 0.74] 0.0022 Type de Non stand 83 (52.5) 44 (53.0) 1.0 chimio Standard 75 (47.5) 20 (26.7) 0.48 [0.28; 0.82] 0.0070 CA125 < 800 72 (45.6) 21 (29.2) 1.0 initial > 800 69 (43.7) 33 (47.8) 1.72 [0.99; 2.97] 0.05 nd 17 (10.8) 10 (58.8) 3.78 [1.77; 8.07] 0.0006

Tableau 23 : Relations entre les facteurs pronostiques et la survie Analyse univariée Analyse ajustée § Préd Niv Fréq n (%) Évén n (%) HR IC à 95% P HR IC à 95% P CD6 Négatif 128 (81.0) 54 (42.2) 1.0 1.0 Positif 30 (19.0) 10 (33.3) 0.709 [0.36; 1.39] 0.31 0.69 [0.335; 1.420] 0.31 HSP Négatif 90 (57.0) 41 (45.6) 1.0 1.0 Positif 68 (43.0) 23 (33.8) 0.631 [0.38; 1.05] 0.07 0.556 [0.328; 0.943] 0.02 FOSB Négatif 127 (80.4) 53 (41.7) 1.0 1.0 Positif 31 (19.6) 11 (35.5) 0.778 [0.41; 1.49] 0.45 0.766 [0.382; 1.536] 0.45 MMP1 Négatif 139 (88.0) 54 (38.8) 1.0 1.0 Positif 19 (12.0) 10 (52.6) 1.615 [0.82; 3.18] 0.16 1.868 [0.900; 3.879] 0.09 GST Négatif 116 (73.4) 40 (34.5) 1.0 1.0 Positif 42 (26.6) 24 (57.1) 1.639 [0.99; 2.72] 0.05 1.499 [0.873; 2.574] 0.14 PANC Négatif 109 (69.0) 40 (36.7) 1.0 1.0 Positif 49 (31.0) 24 (49.0) 1.068 [0.64; 1.78] 0.79 0.803 [0.464; 1.391] 0.43 P53 Négatif 67 (42.4) 23 (34.3) 1.0 1.0 Positif 91 (57.6) 41 (45.1) 1.099 [0.66; 1.83] 0.71 1.161 [0.681; 1.978] 0.58 Ki67 < 20 83 (52.5) 38 (45.8) 1.0 1.0 20 et + 75 (47.5) 26 (34.7) 0.676 [0.41; 1.11] 0.12 0.585 [0.350; 0.978] 0.04 Index Négatif 86 (54.4) 39 (45.3) 1.0 1.0 Positif 72 (45.6) 25 (34.7) 0.579 [0.35; 0.96] 0.03 0.493 [0.290; 0.836] 0.0086

Note: § En contrôlant pour l'âge, le stade, le grade, le type de chimio (standard ou non) et le CA125 initial

54

5. Discussion

5.1. Facteurs cliniques liés à la chimiorésistance

Cette étude a montré que l’on peut identifier des marqueurs pronostiques en comparant des

tumeurs chimiosensibles et chimiorésistantes par micropuces d’ADN et par IHC sur tissu

arrays. En comparaison avec l’IHC standard sur coupes entières, la technique de tissu array

présente comme avantages la simplicité technique, la rapidité de lecture des lames,

l’économie d’anticorps et d’autres substances et une plus grande standardisation. Des

dizaines d’anticorps peuvent être testés sur le même bloc et le tissu d’origine est conservé

pour d’autres études. La méthode est appropriée pour des études rétrospectives, quand le

tissu frais n’est pas disponible pour la biologie moléculaire. Les désavantages sont liés à la

petite taille des carottes. On peut noter le biais de sélection encouru quand le marqueur est

non homogène. Le prélèvement est difficile ou même impossible quand les tumeurs sont de

petites dimensions.

La chimiothérapie a un impact majeur pour la survie des patientes atteintes d’un cancer

ovarien. Il est connu que le traitement avec un dérivé de platine (cisplatin ou carboplatin) et

cyclophosphamide est moins toxique, mais aussi moins efficace que la combinaison dérivée

de platine et taxol. La combinaison cisplatin et taxol a une efficacité comparable à la

combinaison carboplatine et taxol (112). La SSP et la SG sont meilleures pour les patientes

traitées avec platine et taxol (voir l’annexe). Le taux de 60% de RC pour notre cohorte est

conforme à la littérature et aux données du GOG (214;215).

Le stade est un prédicteur pour la SSP, mais pas pour la SG. Le grade ne prédit ni la SSP ni

la SG. Le CA125 initial prédit la SG, les patientes avec un CA125 élevé au-dessus de la

médiane (800 U/ml) ayant une survie plus réduite comparé aux patientes avec un CA125

initial au-dessous de la médiane.

55

5.2. Marqueurs moléculaires

5.2.1. MMP1

Les métalloprotéases (MMPs) représentent une famille d’au moins 20 endopeptidases

impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire, en conditions physiologiques

ou pathologiques. Toutes les MMPs ont un domaine commun (HEXGH) responsable de la

liaison avec un atome de Zn, élément essentiel comme catalyseur (216). Les MMPs jouent

un rôle primordial dans le remodelage des tissus normaux pendant le développement mais

aussi dans l’évolution du cancer. Elles sont impliquées dans la dégradation de la matrice

extracellulaire (ECM) et de la paroi des vaisseaux menant à l’envahissement local, l’entrée

des cellules néoplasiques dans les vaisseaux sanguins ou lymphatiques et leur implantation

dans un organe à distance. Les études récentes démontrent que les MMPs sont importantes

dans la régulation de la croissance de la tumeur primaire ou des métastases et comme

promoteur de l’angiogenèse (figure 20). Les MMPs sont aussi impliquées dans la

pathogénèse des maladies non-tumorales, comme l’arthrite rhumatoïde, l’ostéoarthrite,

l’athérosclérose, l’anévrisme aortique, des maladies bulleuses auto-immunes de la peau, le

vieillissement dermique et les ulcérations chroniques (217).

Figure 6 : l’importance des MMPs dans l’évolution du cancer. De : Chambers AF. et al, J Natl Cancer Inst, 1997

56

Les MMPs sont synthétisées en condition normale par des macrophages, des lymphocytes

T, des neutrophiles, des chondrocytes et des cellules stromales. Les molécules sécrétées

doivent être activées par différentes enzymes pour réaliser leur fonction. Parmi les

activateurs on peut citer la plasmine, la trypsine, la kallikreine, la chymase et la tryptase.

Les MMPs peuvent s’activer mutuellement par un mécanisme complexe en cascade (figure

21). De plus, des substances exogènes peuvent réaliser l’activation, comme les dérives

organiques du mercure, l’oxygène actif et les détergents.

Figure 7 : activation réciproque des MMPs Risto Ala-aho et al, Biochimie, 2005

À date on a identifié 5 groupes majeurs de MMPs, selon leur substrat d’action : les

matrilysines, les collagènases, les stromélysines, les gélatinases et les MMPs membranaires

(218).

Les matrilysines (MMP7 et MMP26) ont la structure moléculaire la plus simple. Elles

dégradent les protéoglycans, les glycoprotéines d’ECM, le collagène de type IV, l’élastine

et la gélatine. Les collagènases dégradent le collagène fibrillaire de type I, II, III, V et IX;

dans ce groupe on inclut la collagènase de type 1 (MMP1 ou collagènase interstitielle), de

type 2 (MMP8 ou collagènase néutrophilique) et de type 3 (MMP13).

57

Les stromélysines dégradent les protéoglycans, les glycoprotéines d’ECM, le collagène de

type IV, et la gélatine (stromélysine 1 ou MMP3 et stromélysine 2 ou MMP10), l’élastine

(métalloélastase ou MMP12), la laminine et la fibronectine (stromélysine 3 ou MMP11).

Les gélatinases dégradent le collagène de type IV, V, VII et X, la gélatine, la laminine et la

fibronectine. De ce groupe font partie les gélatinases A (MMP2) et B (MMP9).

Les MMPs membranaires (MT-MMPs) dégradent la gélatine, la fibronectine et d’autres

composantes de l’ECM. On peut mentionner ici les MT1-MMP (MMP14), MT2-MMP

(MMP15), MT3-MMP (MMP16), MT4-MMP (MMP17), MT5-MMP (MMP21), MT6-

MMP (MMP25).

Parmi les MMPs avec une fonction moins connue on peut citer les MMP 12, 19, 20, 23, 28.

Il y a au moins 4 inhibiteurs de MMPs, (TIMP 1-4) qui forment des complexes avec les

MMPs activées. Les liaisons MMPs-TIMPs sont complexes, avec une expression variable

de ces molécules dans les cellules tumorales et les cellules stromales de voisinage.

Les implications des MMPs dans la progression du cancer ont mené au développement

d’essais cliniques avec des inhibiteurs synthétiques. Tout comme les TIMPs, ces substances

inhibent l’invasion tumorale ainsi que l’angiogènese. Les inhibiteurs synthétiques de

MMPs sont des agents de type cytostatique plutôt que cytotoxiques pouvant être utilisés en

combinaison avec les médicaments classiques suite à la chirurgie de cytoréduction.

Les inhibiteurs de première génération présentaient comme réaction secondaire une toxicité

articulaire importante, limitant ainsi leur application. Le tanomastat (Bayer) est un

inhibiteur de nouvelle génération qui présente moins d’effets indésirables. Néanmoins, les

essais cliniques ont été interrompus suite aux constatations que les patients atteints d’un

cancer de poumon traités avec ce médicament avaient un plus mauvais pronostic que ceux

ayant reçu le placebo et que pour le cancer du pancréas, le traitement classique avec

gemcitabine était supérieur (210).

58

Finalement il faut mentionner que les MMPs ne sont pas les seuls acteurs impliqués dans le

processus de progression tumorale et que de nombreuses enzymes protéolytiques et des

facteurs angiogéniques jouent également un rôle important.

Pour les tumeurs de l’ovaire, les MMP1 et 9 ont été découverts en quantité négligeable

dans les cystadénomes bénins et sur-exprimés dans les cellules tumorales et stromales du

carcinome séreux papillaire (219). L’étude du polymorphisme de la région du promoteur du

gène MMP1 démontre que la mutation 2G est associée à un niveau élevé de MMP1 (220).

Les auteurs suggèrent que ces patientes peuvent avoir une prédisposition plus importante

pour le développement du cancer ovarien, affirmation non confirmée par une étude

subséquente (221).

Pour le cancer du côlon, une surexpression de MMP1 détectée par IHC s’associe à un

mauvais pronostic (222); le même résultat a été observé pour le cancer de l’œsophage(223).

Pour notre cohorte, 19% des cas avec une progression sous chimiothérapie surexpriment le

MMP1, comparé à 10% des cas avec une réponse complète et 10% avec une réponse

partielle. La différence n’est pas significative du point de vue statistique (p=0,42).

Cependant, il y a un risque élevé de progression ou de décès chez ceux qui expriment plus

le MMP1 (p=0,09).

5.2.2. HSPE1 (HSP10)

Les protéines exposent leurs séquences hydrophobes pendant la synthèse, le transport à

travers des membranes mitochondriales ou du réticulum endoplasmique ou encore suite à

l’action des températures élevées. Dans l’environnement aqueux intracellulaire, les sites

hydrophobes peuvent entraîner le pliage et éventuellement la formation d’agrégats

insolubles.

La cellule prévient ces événements par l’entremise des protéines de choc thermique (HSP

ou chaperons) qui forment des complexes stabilisateurs avec les protéines.

59

Les HSP sont présentes de façon constitutive dans les cellules, mais leur synthèse augmente

en condition de stress cellulaire (224).

Présentement on connaît 5 types de HSP primaires, nommés ainsi selon leur poids

moléculaire : HSP27, 60, 70, 90 et 110, et plusieurs co-chaperons de bas poids moléculaire

qui facilitent l’interaction entre le substrat et les HSP primaires, comme HSP10 et 40 (225).

HSP10 exerce sa fonction au niveau intracellulaire, son substrat étant représenté par des

protéines en cours de synthèse (226).

Le rôle des HSP dans le cancer est également important. Pour la prostate, HSP60 et son co-

chaperon HSP10 sont exprimés précocement dans le développement du cancer (227). Pour

le côlon et le col d’utérus, l’expression des HSP 10 et 60 suit la séquence tissue normal –

dysplasie – cancer. L’analyse du profil protéique a démontré que HSP10 peut être considéré

comme un marqueur du cancer du côlon (228;229). De plus, les HSPs 10 et 60 sont plus

fortement exprimés dans le cytoplasme des lymphocytes des ganglions avec métastases du

cancer du côlon que dans les ganglions réactionnels (230).

Les cellules néoplasiques du cancer du sein résistantes à la doxorubicine peuvent exprimer

davantage le HSP27 que les cas sensibles (231). En utilisant la technologie des micropuces

d’ADN on a démontré que l’ARN de HSP10 est plus exprimé dans les cultures de cellules

du cancer du sein suite au traitement avec oxyplatin et 5-FU et que HSP10 peut être

considéré comme marqueur de chimiorésistance (186).

Pour le cancer ovarien, HSP27 ne prédit pas la réponse à la chimiothérapie (232); par

contre, HSP60 peut être un facteur de pronostic, une expression élevée étant associée à une

survie réduite (233). HSP10 a été identifié dans le sérum et l’ascite des patientes atteintes

d’un cancer ovarien. La composante sérique joue un rôle important dans l’inhibition des

lymphocytes T via la suppression du CD3-zeta, permettant ainsi à la cellule tumorale

d’échapper à la surveillance immunitaire (234). Pour le cancer de la tête et du cou HSP27 et

HSP70 ne sont pas associées à la survie (235).

En conclusion, il apparaît que les HSP ont un rôle complexe à jouer dans le cancer et que

leur association avec le pronostic est parfois peu évidente.

60

Dans notre cohorte, 47% des RC, 48% des RP et 25% des progressions sous chimiothérapie

expriment HSP10. Le marquage positif pour HSP10 est associé avec une réponse complète

à la chimiothérapie et une survie meilleure que les cas avec un marquage négatif. Il a été

démontré que le complexe HSP10-HSP60 peut déclencher l’apoptose par l’activation des

caspases (229), ce qui peut expliquer la meilleure réponse à la chimiothérapie des cas avec

une expression élevée de HSP.

Peu de marqueurs étudiés se sont vraiment démarqués, mais la surexpression de HSP10 est

associée de façon significative avec une meilleure survie sans progression et une meilleure

survie globale.

5.2.3. FosB

Les facteurs de transcription du groupe AP1 sont formés par une protéine de la famille Fos

(c-Fos, FosB, et les variantes Fra-1 et Fra-2) qui se dimérise avec une protéine de la famille

Jun (cJun, JunB, JunD). c-Fos, l’analogue humain de l’oncogène rétroviral v-Fos, est

souvent exprimé dans les cellules tumorales et Fra-1 joue un rôle important dans la

progression tumorale, augmentant la motilité et le pouvoir invasif des cellules tumorales du

cancer du sein et du côlon (236).

Les protéines de la famille Fos peuvent entraîner la transformation néoplasique des

fibroblastes et le v-Fos induit un ostéosarcome chez les rongeurs (237).

Pour le cancer du sein, le rôle des protéines du complexe AP1 est controversé. L’ARN pour

FosB est présent dans les plupart des cellules néoplasiques, avec ou sans présence de la

protéine correspondante(238). La protéine FosB a été retrouvée en association avec les

cancers bien différenciés, exprimant les récepteurs hormonaux (239). Des résultats

contradictoires ont été obtenus par RT-PCR pour le cancer inflammatoire du sein, où

l’expression d’ARN pour les gènes JunB et FosB est élevée comparé aux cancers non

inflammatoires (166).

61

Pour le cancer de l’endomètre, c-Fos, Fra-2 et JunB sont plus exprimés dans les cellules

tumorales que dans les tissus normaux. c-Fos corrèle avec les tumeurs de grade élevé (G3)

négatives pour les récepteurs hormonaux (240).

Pour le cancer ovarien, une expérience avec des xénogreffes de tissu tumoral chez la souris

a démontré que FosB est surexprimé suite au traitement avec taxol (241) et que c-Fos

s’associe avec la résistance au cisplatin (242).

Dans notre étude, le marquage pour FosB est cytoplasmique granulaire et surtout localisé

au pôle basal des cellules, bien que le complexe de transcription AP-1 activé, dont Fos-B

fait partie, soit localisé au noyau. Ceci peut être expliqué par la spécificité probable de

l’anticorps utilisé pour l’isoforme protéique synthétisé dans le cytoplasme, qui est par la

suite transporté vers le noyau ou elle suit des modifications conformationnelles qui la rend

active.

Dans notre étude, 21% de cas avec une réponse complète, 21% avec une réponse partielle

et 16% avec une progression sous chimiothérapie ont un marquage positif pour FosB. La

différence n’est pas significative du point de vue statistique.

5.2.4. GST

La famille des glutathion S-transférases (GST) est formée par plusieurs enzymes de

détoxification. On connaît les types alpha, mu, pi et thêta, chacun comprenant plusieurs

isoformes.

L’expression de GST est élevée dans les cellules tumorales du carcinome transitionnel de la

vessie comparé à la muqueuse normale (243). Pour le cancer du poumon, p53 et GST pi

sont des marqueurs indépendants de pronostic (244). GSTA1 prédit une meilleure survie

pour les patientes atteintes d’un cancer du sein (245).

Les donnés de la littérature sont contradictoires pour le cancer ovarien. GST est élevé dans

les tumeurs borderline et malignes comparé aux kystes normaux (246,247), mais son

expression n’est pas associée à la cytoréduction (64) ni à la chimiorésistance (232,248). Par

62

contre, le dosage enzymatique a démontré que les cas qui ne répondent pas au traitement

avec les dérivés de platine ont une activité supérieure du GST pi dans les cellules

tumorales. Le GST A1-1 et le MRP1 (multidrug resistance protein 1) semblent conférer la

résistance à clorambucil de façon indépendante (249).

L’analyse par micropuces d’ADN a démontré que le GST M2 est surexprimé dans les

cancers qui répondent à la chimiothérapie (250).

Dans notre cohorte, le marquage pour GST est présent dans 25% des cas qui ont une

réponse complète, 31% des cas avec progression et 28% des cas avec une réponse partielle

ou stabilité. Les différences ne sont pas significatives statistiquement.

5.2.5. Les cathepsines

Les cathepsines (CTS) sont des protéases lysosomales dont on connaît actuellement 11

isoformes (les cathepsines B, C, F, H, K, L, O, S, V, W et X). Les cathepsines sont

sécrétées sous forme inactive (zymogène) et sont activées par le clivage d’aminoacide N-

terminal soit sous l’action de la CTS-D soit par autoactivation dans un milieu acide (251).

Le rôle des CTS dans le métabolisme des protéines est très complexe. Ainsi, la CTS- K est

essentielle pour le remodelage de l’os, les types S, L et probablement F, B et D sont

importantes pour le système immunitaire; la CTS-C est impliquée dans l’activation des

enzymes lysosomales, la synthèse des hormones et angiogenèse.

La fonction anormale des CTS est rencontrée dans l’arthrite rhumatoïde, l’ostéoarthrite,

l’ostéoporose, les maladies neurologiques, les maladies de stockage lysosomal et le cancer.

Dans le processus d’invasion tumorale les CTS provoquent la dégradation de la matrice

extracellulaire, en synergie avec les MMPs.

L’activité des CTS est réglée par les cystatins. Les cystatins protègent la cellule contre la

protéolyse endogène ou exogène et contrôlent le taux de dégradation des protéines (252).

L’augmentation des cystatins (253) ou la diminution de CTS-L (254) dans la cellule

néoplasique atténue son potentiel invasif.

63

Les cellules fibroblastiques transformées spontanément sécrètent une grande quantité de

CTS-L, en corrélation avec le potentiel métastatique. Les cellules tumorales du cancer du

sein, du côlon et du mélanome sécrètent la cathepsine B active. Pour les patients atteints

d’un cancer, le foie et le muscle squelettique sont des sources systémiques de CTS qui,

avec d’autres protéases, produisent l’émaciation caractéristique de la cachexie cancéreuse

(255).

Dans le cancer de l’estomac, une expression élevée des CTS L et B est liée au potentiel

métastatique (256). Un niveau réduit de CTS D (257) ou L (258) dans le cancer du sein

prédit une meilleure survie et une récidive tardive. La CTS-L2 est exprimée dans le cancer

du côlon et du sein, mais pas dans le tissu normal (259). Les patients atteints d’un cancer du

côlon avec un niveau bas de CTS B et L ont une survie meilleure (260). Pour le cancer du

pancréas, les CTS B et L sont des marqueurs pronostiques indépendants (261).

Dans la pathologie de l’ovaire, la CTS-D est associée à une réponse à la chimiothérapie

avec cyclophosphamide et platine (262), mais ne peut pas prédire la survie globale ou la

survie sans récidive (263). Les CTS B et C sont associées à une plus grande agressivité

(264).

L’anticorps utilisé dans notre étude reconnaît les CTS de type C, L et V. L’anticorps est

exprimé dans 30,9% des cas avec une réponse complète et 31,3% des cas avec une

progression sous chimiothérapie. Les différences ne sont pas significatives du point de vue

statistique.

5.2.6. CD36

Le CD36 est une protéine d’adhésion transmembranaire présente normalement à la surface

des cellules endothéliales, des plaquettes et des monocytes. Le CD36 est aussi connu

comme une glycoprotéine plaquetaire IIIB/IV, le récepteur du collagène de type I, le

récepteur de la thrombospondine.

Le CD36 est impliqué dans la régulation de l’angiogenèse par l’entremise de la

trombospondine 1 et 2 (TSP-1 et 2), tel que démontré dans des études sur le développement

64

des follicules ovariens chez les animaux (265,266). La TSP fait partie d’une famille de

substances qui inhibent l’angiogenèse et aussi la croissance des cellules tumorales en

culture (267) et qui ont un rôle régulateur pour la différenciation cellulaire. La TSP peut

provoquer l’apoptose des cellules leucémiques positives pour le CD36 via l’activation de la

caspase-3, tandis que les cellules qui n’expriment pas le CD36 ou dont l’expression est

bloquée par un anticorps spécifique n’entrent pas en apoptose sous l’influence de la TSP

(268).

Dans des cultures de cellules tumorales dérivées du cancer du sein, l’expression du CD36

est régulée par les œstrogènes. Le marqueur est de 30 à 100 fois plus exprimé par les

cellules tumorales moins agressives (269).

Un résultat controversé est présenté par Sugimoto et al (270) qui ont trouvé que CD36 est

surexprimé par le clone K562/ADM dérivé de cellules leucémiques résistantes a

l’adriamycine, bien que leurs expériences démontraient que le CD36 ne peut induire seul la

résistance.

Dans notre cohorte, le pourcentage le plus faible d’expression est observé dans les cas qui

progressaient sous chimiothérapie (16%) contre 20% des cas avec une réponse complète et

19% des RP, en concordance avec la plupart des études de la littérature. Par contre, la

différence n’est pas statistiquement significative.

5.2.7. RbAp46 (RBBP7)

La protéine RBBP7 (retinoblastoma binding protein 7) alias RbAp46 (retinoblastoma

associated protein 46) est un membre de la famille des protéines nucléaires qui interagissent

avec les histones. Son activité est réglée par le gène suppresseur WT1. La fonction

principale de ce gène est l’inhibition de la croissance tumorale et la promotion de

l’apoptose (271-273). L’induction de la RBBP7 active la kinase JNK (c-Jun N-terminal

kinase) et augmente l’apoptose, ralentissant ainsi la croissance des xénogreffes tumorales

chez les souris (274).

65

L’activité de la RBBP7 inhibe le phénotype transformé des cellules du cancer du sein et sa

dysfonction peut être un événement précoce dans le développement du cancer (275,276).

Pour les cellules leucémiques, une expression élevée est associée à la résistance au

traitement (277).

Dans notre cohorte, la grande majorité des cas présentent un marquage positif intense pour

la RBBP7. Les essais pour trouver une échelle d’intensité ont été infrucueux. Les données

ne sont pas interprétables statistiquement.

5.2.8. Siva

La Siva est une protéine pro-apoptotique dont on connaît deux variantes, Siva-1 et 2. Seule

la forme Siva-1 est active. La Siva exerce un rôle indépendant de la voie p53 soit par

l’entremise du Abl et ARG, soit par l’inhibition du bcl-2 et/ou Bcl-XL (187,278-280). La

Siva est aussi le ligand intracellulaire du CD27 et du «death receptor» GITR

(glucocorticoid-induced TNFR family related gene) (281) responsables de l’apoptose des

lymphocytes T. La Siva est aussi impliquée dans le déclenchement de l’apoptose après

l’ischémie ou les infections virales.

L’action de la Siva est synergique avec celle du cisplatin sur des cellules néoplasiques du

cancer du sein (279). Des études avec des micropuces d’ADN ont démontré la fonction pro-

apoptotique de la Siva dans des cellules du cancer du côlon et du foie (282,283).

Pour le cancer de poumon à petites cellules, TIP30, un suppresseur de métastases, induit

une expression élevée de la Siva (280).

Tous les cas de notre cohorte sont négatifs pour Siva.

5.2.9. MIP2 (alias CXCL2 ou GRO-beta)

Les chemokines représentent une famille de plus de 40 molécules de petite taille,

impliquées dans le mouvement des cellules vers un gradient chimiotactique (284). Selon

66

leur structure chimique (l’arrangement des 2 premières molécules de cystéine vers le N-

terminal), les chemokines sont groupés en 4 catégories : CXC, CC, CX3C et XC.

Les récepteurs pour les chemokines sont aussi groupés en 4 catégories (CCR, CXCR, XCR

et CX3CR), bien que les chemokines qui appartiennent à une classe puissent se lier aux

récepteurs d’une autre classe. Ces récepteurs peuvent servir comme voie d’entrée dans la

cellule pour certains virus, comme le VIH qui se lie aux CXCR4 ou CCR5 pour infecter les

lymphocytes T et les monocytes CD4+. Ainsi, les individus qui présentent un récepteur

CCR5 muté développent une résistance à l’infection avec VIH.

Du point de vue fonctionnel, les chemokines sont beaucoup plus difficiles à classer, parce

qu’il n’y a pas de lien direct entre la structure et leur rôle biologique. Le CXCL1 a été

identifié premièrement comme le «melanoma growth stimulatory acticity» (MGSA)(285).

Ultérieurement on a démontré que le CXCL1 et le L2 sont sécrétés principalement par les

fibroblastes et stimulent la croissance des cultures de cellules du mélanome (286). Le

CXCL8 et le récepteur correspondant sont exprimés par les cellules du lymphome

lymhocytique. Le CCL1 est exprimé par les cellules du ATLL, le CCL25 par les cellules du

T-ALL, les CXCL8, 11 et 12 par le myélome, les CXCL9 et 10 et le CCL3, 4, 5 et 11 par

les cellules du lymphome d’Hodgkin, les CCL2, 3, 4 et 5 par les cellules néoplasiques du

cancer ovarien et le CXCL12 est impliqué dans la maturation des lymphocytes B (284).

L’angiogenèse tumorale est promue par plusieurs chemokines, dont les CXCL1, 2, 5, 6, 8,

9, 11, 12, CX3CL1, CCL2, 3, 5, 7, 15, 21, 23, 28 et leurs récepteurs correspondants CCR1,

9 et CXCR4 (287,288). Le CXCL8 est particulièrement impliqué dans l’angiogènese du

cancer ovarien et de la prostate et le CXCL5 est associé au cancer du poumon non à petites

cellules (289).

Le CXCL2 a été premièrement identifié dans les cellules de Kupfer du foie alcoolique

(290). Ultérieurement, un niveau d’expression élevé a été trouvé dans le cancer du pancréas

(291).

Dans notre étude, les cas sont majoritairement négatifs pour le CXCL2 (MIP2).

67

5.2.10. Prostaglandine D2 synthétase (PTGD2S)

Les prostaglandines synthétases (PTGS) sont les enzymes finales de la voie de synthèse des

prostaglandines (PG) et d’autres lipides bioactifs. Dans la même classe on a identifié les

PTGS de type E2, D2 et PGI-S et le thromboxan A2 synthétase (292). Les PTGS sont

présentes dans la grande majorité des tissus et fluides biologiques (293).

La voie des PG est impliquée dans l’angiogenèse et le processus métastatique du cancer du

poumon non à petites cellules (294). La PGD2S est surexprimée dans les méningiomes

(295,296) et le cancer ovarien (297).

Figure 8 : la voie de synthèse des prostaglandines (duBois et al, 2003)

Un très faible pourcentage de nos cas sont positifs pour PTGD2S, ce que rend non

interprétables de point de vue statistique les différences entre les cas sensibles ou résistants

à la chimiothérapie.

68

5.2.11. Ki67 et p53

Ki67 et p53 ont été beaucoup étudiés dans la majorité des cancers. L’index de prolifération

et le statut du p53 ont permis de différencier les cancers ovariens, les tumeurs borderline et

kystes bénins (298-300). Plusieurs études ont identifié une valeur pronostique de ces

marqueurs pour différents types de cancer (301-308, 316, 317).

Dans notre cohorte, un p53 surexprimé a été associé au grade (p=0,02), les cas moins

différenciés exprimant le plus le marqueur. P53 prédit la reponse complète (p=0,02), qui est

associée à un plus grand taux de positivité. Par contre, les courbes de survie sont presque

superposables à partir de 12 mois après la chimiothérapie.

Le Ki-67 corrèle avec le grade (p=0,04), les cas les moins différenciés ayant un taux

d’expression plus élevée. Du point de vue pronostique, on note une tendance pour Ki-67 à

prédire la réponse à la chimiothérapie (p=0,06).

5.2.12. L’index pronostique (IP) basé sur 4 marqueurs (MMP1,

HSP10, Ki-67, p53)

Un index de 0 points était présent dans 2% des cas, 18% avaient 1 point, 35% avaient 2

points, 34% avaient trois points et 11% avaient 4 points.

Les cas avec un index de 3 ou plus ont été comparés avec ceux dont l’index était de 2 ou

moins avec des courbes de Kaplan-Meier et le log-rank test. Ainsi, les cas avec un index de

3 ou plus avaient une survie meilleure comparé aux cas avec un index de 2 points ou moins

(p<0.004). L’IP apportait une information plus significative en ce que concerne le pronostic

que chaque marqueur utilisé séparément.

Si validé sur une nouvelle cohorte prospective, l’IP pourrait être utilisé pour mieux

individualiser le traitement des patientes atteintes par un cancer ovarien avancé.

69

5.3. Lien entre l’expression génique et l’expression protéique

Notre étude nous a permis à démontrer qu’il n’y a pas nécessairement une correspondance

entre le niveau d’expression génique détecté par l’analyse des micropuces et le niveau

d’expression protéique étudié par IHC. Ainsi, seulement 4 marqueurs étudiés ont montre

une association avec la réponse à la chimiothérapie, tandis qu’au niveau génique, tous les

marqueurs y avaient une expression différente selon la réponse à la chimiothérapie. Nos

résultats sont quand même conformes avec les données de la littérature, le manque de

concordance entre le niveau d’ARN et de protéines étant bien connue (311, 312).

Neanmoins, l’approche utilisée dans notre étude est suggérée par plusieurs chercheurs pour

évaluer les nouveaux traitements anticancéreux et trouver des marqueurs pronostiques (313,

314, 315).

70

6. Conclusion

L’analyse d’expression génique et l’IHC sont des méthodes de recherche complémentaires:

la première évalue le processus de transcription génique, la dernière la traduction au niveau

protéique. Cette étude démontre que les deux méthodes couplées représentent une approche

qui permet l’identification des nouveaux marqueurs de pronostic du cancer ovarien.

Nos résultats indiquent que le profil IHC des cas avec une meilleure réponse à la

chimiothérapie est : négatif pour MMP1, positif pour HSP10, index de prolifération élevé,

protéine p53 mutée positive. De plus, l’index pronostique basé sur ces 4 marqueurs offre

des informations cliniques supplémentaires, les cas avec un index de 3 ou plus ayant un

meilleur pronostic que les cas avec un index de 2 ou moins. Ces résultats devront être

confirmés dans une étude prospective.

Comme perspective on se propose la validation de l’IP sur une cohorte prospective et la

construction d’une micropuce avec les 43 gènes qui sera aussi validé sur une cohorte

prospective.

71

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89

Annexe : courbes de survie et images IHC

Figure 9A : La survie sans progression

Figure 9B : La survie globale

90

Figure 10A : La survie sans progression en fonction du stade

Figure 10B : La survie globale en fonction du stade

91

Figure 11A : La survie sans progression en fonction du grade

Figure 11B : La survie globale en fonction du grade

92

Figure 12A : La survie sans progression en fonction du type de chimiothérapie

Figure 12B : La survie globale en fonction du type de chimiothérapie

Kaplan-Meier survival analysisSurvie sans progression by Carboplatine + Taxol

Survival %

Log-rank test p=0.0173

AutreCarbo+Taxo

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Months0 12 24 36 48 60

Number at risk

Autre 74 29 13 9 8 5

Carbo+Taxo 84 47 17 12 7 2

Kaplan-Meier survival analysisSurvie by Carboplatine + Taxol

Survival %


AutreCarbo+Taxo

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Months0 12 24 36 48 60

Number at risk

Autre 74 64 38 24 12 8

Carbo+Taxo 84 73 46 24 13 5

93

Figure 13A : La survie sans progression en fonction du CA125 initial

Figure 13B : La survie globale en fonction du CA125 initial

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par CA125 initial

Survie %


< 800> 800nd

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

< 800 72 36 16 10 9 2

> 800 69 36 12 9 5 5

nd 17 4 2 2 1 0

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par CA125 initial

Survie %

Log-rank test p=0.0014Post-hoc log-rank tests :< 800 vs > 800 p=0.0473< 800 vs nd p=0.0007> 800 vs nd p=0.0225

< 800> 800nd

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

< 800 72 64 41 23 16 7

> 800 69 63 38 22 8 6

nd 17 10 5 3 1 0

94

Figure 14A: La survie sans progression selon l’expression du CD36

Figure 14B: La survie globale selon l’expression du CD36

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par CD6

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 128 61 26 17 12 6

Positif 30 15 4 4 3 1

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par CD6

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 128 107 64 40 21 11

Positif 30 30 20 8 4 2

95

Figure 15A: La survie sans progression selon l’expression du HSP10

Figure 15B: La survie globale selon l’expression du HSP10

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par HSP

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 90 37 14 9 5 3

Positif 68 39 16 12 10 4

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par HSP

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 90 76 49 23 10 6

Positif 68 61 35 25 15 7

96

Figure 16A: La survie sans progression selon l’expression du Fos-B

Figure 16B: La survie globale selon l’expression du Fos-B

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par FOSB

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 127 106 64 40 21 11

Positif 31 31 20 8 4 2

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par FOSB

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 127 61 26 17 12 6

Positif 31 15 4 4 3 1

97

Figure 17A: La survie sans progression selon l’expression du MMP1

Figure 17B: La survie globale selon l’expression du MMP1

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par MMP1

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 139 70 27 18 13 7

Positif 19 6 3 3 2 0

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par MMP1

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 139 121 74 44 23 12

Positif 19 16 10 4 2 1

98

Figure 18A: La survie sans progression selon l’expression du GST

Figure 18B: La survie globale selon l’expression du GST

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par GST

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 116 57 22 14 11 6

Positif 42 19 8 7 4 1

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par GST

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 116 100 60 35 19 9

Positif 42 37 24 13 6 4

99

Figure 19A: La survie sans progression selon l’expression de la pan-cathepsine

Figure 19B: La survie globale selon l’expression de la pan-cathepsine

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par PANC

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 109 52 22 14 9 3

Positif 49 24 8 7 6 4

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par PANC

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 109 91 53 31 16 7

Positif 49 46 31 17 9 6

100

Figure 20A: La survie sans progression selon l’expression du p53

Figure 20B: La survie globale selon l’expression du p53

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par P53

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 67 25 11 8 6 3

Positif 91 51 19 13 9 4

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par P53

Survie %


NégatifPositif

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

Négatif 67 54 29 21 11 5

Positif 91 83 55 27 14 8

101

Figure 21A: La survie sans progression selon l’expression du Ki67

Figure 21B: La survie globale selon l’expression du Ki67

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie sans progression par Ki67

Survie %


< 2020 et +

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

< 20 83 36 12 10 7 4

20 et + 75 40 18 11 8 3

Courbe de survie de Kaplan-MeierSurvie par Ki67

Survie %


< 2020 et +

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Mois0 12 24 36 48 60

Nombre à risque

< 20 83 73 43 23 12 7

20 et + 75 64 41 25 13 6

102

Figure 22A: La survie sans progression selon l’IP

Figure 22B: La survie globale selon l’IP

103

Figure 23 : coloration IHC pour CD36

Figure 24 : coloration IHC pour la pan-cathepsine (cellules tumorales et macrophages positives)

Figure 25 : coloration IHC pour Fos-B

104

Figure 26 : coloration IHC pour GST

Figure 27 : coloration IHC pour HSP10

Figure 28 : coloration IHC pour Ki-67

105

Figure 29 : coloration IHC pour MMP1

Figure 30 : coloration IHC pour p53

VALIDATION DE FACTEURS POTENTIELS DE ......(RbAp46), Siva, PGD2S, Ki67 et p53. L’analyse...

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