FAVV – BESTUUR LABORATORIA / AFSCA – ADMINISTRATION DES LABORATOIRE

LABO: LFSAL SECTION: PHYTO RESIDUS

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VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION

Méthode d’analyse

LAB 23 I-MET LFSAL 086

DETERMINATION DE LA TENEUR EN CARBAMATE

D’ETHYLE DANS LES BOISSONS FERMENTEES PAR GC/MS

Technique GC-MS (simple Quad)

Matrice / Groupe de matrices Matrices : bière, vin, yaourt.

Date de la dernière adaptation 20/03/2013

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Résumé des critères de performances

Groupe de matrice Boissons fermentées Domaine de validation Gamme de quantification 5 à 50 µg/kg

Modèle mathématique Linéaire Etalonnage

Critère sur l'étalonnage ± 10 %

Critère sur l'identification par temps de rétention

± 0,1 min Spécificité

Technique analytique Spectrométrie de masse

LOQ 5 µg/kg LOQ

LOD 2,5 µg/kg LOD

Critère sur le rendement entre 70 et 120 %

Justesse Rendement le plus bas observé 82% 84% 89%

Rendement le plus haut observé 117% 105% 109%

Rendement moyen obtenu 99% 96% 100%

CVr MAX (= 2/3 CVHOR) 21%

Répétabilité CVr 9,0% 5,5% 6,0%

Répétabilité 2,48 µg/kg 1,49 µg/kg 1,69 µg/kg

CVr MAX (= 2/3 CVHOR) 32% Reproductibilité intra-laboratoire

CVr 9,0% 5,9% 6,0%

Reproductibilité 2,48 µg/kg 1,59 µg/kg 1,69 µg/kg

Incertitude de mesure basée sur la fidélité intermédiaire et le biais

24,3% 19,3% 16,6% Incertitude de

mesure

bière vin yaourt

La validation répond aux exigences de la procédure LAB 00 P180 (excepté qu’en l’absence de

cadre légal, la validation n’a été effectuée qu’à un niveau, à savoir 10 µg/kg).

Le laboratoire qui veut appliquer cette méthode doit démontrer que les critères ci-dessous

soient remplis :

Reproductibilité intra-laboratoire : doit satisfaire à l’ équation d’Horwitz.

Justesse : Participation à des tests inter-laboratoires (ou comparaison avec un laboratoire

accrédité) et obtention de résultats corrects. A défaut, les rendements sur des échantillons

supplémentés seront utilisés pour évaluer la justesse (les résultats devront être compris entre 70

et 120 %).

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Contrôle de 1 ère ligne : les contrôles décrits au § 11.1 à 11.4 de la méthode doivent être

respectés.

Historique de validation

Edition Révision par/date Motif de la révision Modifications

1 Etienne-Thewissen Fabian 03/03/2013

Adaptation au nouveau template Adaptation au template « Dossier de validation ».

2 Etienne-Thewissen Fabian /De Tandt Thierry 20/06/2013

Adaptation pour publication Mise en page et structuration du dossier adaptées.

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VALIDATIERAPPORT – RAPPORT DE VALIDATION

Méthode d’analyse

LAB 23 I-MET LFSAL 086

DETERMINATION DE LA TENEUR EN CARBAMATE D’ETHYLE

DANS LES BOISSONS FERMENTEES PAR GC/MS

Technique Méthode GC/MS

Matrice / Groupe de matrices Bière, vin, yaourt

Type de validation Totale, effectuée à 1 niveau de concentration.

Responsable

ETIENNE-THEWISSEN Fabian/

Responsable Deptt Phyto/Résidus

Rédaction par

Etienne Thewissen Fabian : Resp. Deptt

De Tandt Thierry : Expert technique

20/06/2013

Signatures:

Sé

Collaborateurs Experts techniques : Offermanne Marie-Christine , De Tandt Thierry, Pallares Olivier

Assistant technique : Delbrouck Stany

Période de validation Début : 2006

Fin : 2010

Méthode approuvée et jugée

convenable pour la routine par

Etienne Thewissen Fabian

Responsable de section

03/03/2013

Signatures:

Sé

Ce qui suit est une description des résultats de l'étude de validation comme indiqué dans l'étape 8 de la procédure LAB

P 00 180.

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Résumé des données de validation

Table des matières.

A. Généralités sur le carbamate d’éthyle

B. Critères de validation

1. Domaine de validation

2. Modèle de régression

3. Sélectivité

4. Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire

5. Justesse

6. Robustesse

7. LOD

8. LOQ

C. Résultats

1. Domaine de validation

2. Modèle de régression

3. Sélectivité

4. Répétabilité et reproductibilité intra-laboratoire

5. Justesse

6. Robustesse

7. LOD

8. LOQ

9. Incertitude de mesure

D. Conclusion

Annexe 1 : Chromatogrammes

Annexe 2 : Spectre de masses

Annexe 3 : Flowchart de la méthode

Annexe 4 : Photos

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A. Généralités sur le carbamate d’éthyle

« Le carbamate d’éthyle est naturellement présent dans les aliments fermentés tels que le pain, la sauce de

soja, le yaourt et le vinaigre, ainsi que dans les boissons alcoolisées tels que le vin, la bière, les spiritueux et,

plus particulièrement, les eaux-de-vie de fruits à noyau. Plusieurs précurseurs présents dans les aliments et

les boissons tels que l’acide cyanhydrique, l’urée et l’éthanol peuvent conduire à la formation de carbamate

d’éthyle pendant le traitement et la conservation des aliments.

Le carbamate d’éthyle est un composé génotoxique et cancérogène multi-site chez les animaux et il est

probablement cancérogène aussi chez l’homme. La Commission européenne a demandé au groupe

scientifique CONTAM d’émettre un avis scientifique sur les risques pour la santé humaine liés à la présence

de carbamate d’éthyle et d’acide cyanhydrique dans les aliments et les boissons alcoolisées, en particulier

les eaux-de-vie de fruits à noyau …. Le groupe scientifique a conclu que le carbamate d’éthyle dans les

boissons alcoolisées constitue un risque pour la santé, notamment lorsqu’il s’agit d’eaux-de-vie de fruits à

noyau. … Des mesures de limitation devraient être prises afin de réduire les taux de carbamate d’éthyle

dans certaines boissons alcoolisées telles que les eaux-de-vie de fruit. »*

*source : EFSA (European Food Safety Authority) - extrait du résumé « Carbamate d’éthyle et acide cyanhydrique dans les aliments et

les boissons », avis du groupe scientifique sur les contaminants, question N° EFSA-Q-2006-076, adopté le 20 septembre 2007.

Actuellement, les analyses servent à la collecte de données (monitoring) à la demande de la Commission

Recommandation de la Commission du 2 mars 2010 concernant la prévention et la réduction de la

contamination des eaux de vie de fruits à noyaux et des eaux de vie de marc de fruits à noyau par le

carbamate d’éthyle ainsi que le suivi des teneurs en carbamate d’éthyle dans ces boissons (recommandation

2010/133/UE).

Carbamate d’éthyle

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B. Critères de validation

1. Domaine de validation

Le domaine de validation de la méthode sera caractérisé par la gamme de concentration où la méthode aura

été validée et les matrices analysées.

En l’absence de cadre légal sur cet analyte, la méthode doit pouvoir mesurer des traces de carbamate

d’éthyle. Une teneur de 10 µg/kg est généralement admise pour ce type de trace.

2. Modèle de régression

La courbe d’étalonnage sera construite sur un minimum de 5 points et le modèle de régression appliqué

devra conduire à une déviation inférieure à 10% entre la concentration extrapolée et la concentration

théorique.

3. Sélectivité

En fonction de la technique analytique, la spécificité d'une méthode peut être appréciée sur base du temps

de rétention, de la spécifité avec un réactif, d'un spectre UV ou de masse,....

4. Répétabilité et reproductibilié intra-laboratoire

La répétabilité et la reproductibilité intra-laboratoire seront calculées à partir de minimum 3 séries de 3

essais. Pour être dans les conditions de reproductibilité intra-laboratoire, il faut faire varier au moins un

paramètre (analyste, jour, appareil,...) d'une série à l'autre.

Les %RSDr et %RSDRW calculés devront être inférieurs ou égaux aux valeurs maximales admissibles

découlant de l'équation d'Horwitz :

- %RSDr < CVHor x 2/3

- %RSDRw < CVHor

5. Justesse

En l’absence de CRM, le rendement apparent sera estimé à la place de la justesse. Le rendement sera

estimé au départ d’échantillons supplémentés en éthyle carbamate et devra être compris entre 70% et

120%.

Dans la mesure du possible, le laboratoire participera à des études inter-laboratoires et la justesse sera

estimée sur base du Z-score : -2 < Z-score <2

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6. Robustesse

Les facteurs principaux risquant d’influencer le résultat doivent être envisagés au cours de la validation de la

méthode (Ex : opérateur, jours, colonne, insert, entretien du système, etc…). La robustesse est évaluée par

le respect des critères de qualité de la méthode.

7. LOD

La limite de détection de la méthode correspondra à pouvoir détecter l'analyte dans la matrice à la moitié de

la concentration du premier niveau d'étalonnage.

8. LOQ

La limite de quantification de la méthode correspondra à pouvoir quantifier l'analyte dans la matrice à la

concentration du premier point d'étalonnage.

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C. Résultats

Note : l’ensemble des données brutes ayant servi à la validation sont disponible au laboratoire de Liège.

1. Domaine de validation

Le but de la méthode est de quantifier le carbamate d’éthyle dans les boissons fermentées à des

concentrations supérieures à 10 µg/kg. Le dossier de validation présente les résultats obtenus pour les

matrices prévues par la DG Contrôle à l’époque de la validation, à savoir :

- Bière

- Vin

- Yaourt

Lors de la validation, la gamme de concentration couverte allait de 5 à 50 µg/kg. Plus tard, ayant reçu de

nouvelles matrices (alcools de fruits à noyaux, eau-de-vie), des niveaux de calibration ont été ajoutés pour

pouvoir mesurer des hautes concentrations. La gamme de concentration actuelle va jusqu’à 1000 µg/kg.

2. Modèle de régression

La droite d’étalonnage mettant en relation la concentration et le facteur de réponse (signal analyte / signal

standard interne) est construite sur un minimum de 5 points. Lors des essais de validation, les modèles de

régression quadratique et linéaire ont été testés. Ils répondent tous deux au critère fixé : maximum 10% de

déviation entre la concentration mesurée et la concentration théorique.

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3. Sélectivité

La technique utilisée (GC-MS) est sélective par définition (sélectivité basée sur des critères scientifiques

fiables tels que le temps de rétention, la présence des ions diagnostiques et la dilution isotopique).

Dans la méthode, la quantification du carbamate d’éthyle et de son isotope se fait sur base du temps de

rétention et des ions caractéristiques m/z 62 et 64 respectivement (voir annexe 1).

Une identification par spectre de masse est également possible (voir annexe 2).

4. Répétabilité et reproductibilié intra-laboratoire

Toutes les RSD de répétabilité et de reproductibilité intra-laboratoire satisfont à l’équation d’Horwitz.

Matrice Concentration

(µg/kg)

Répétabilité

(µg/kg) = r

Reproductibilité

(µg/kg) = R

CVr Max (%)

= 2/3 CVHor

CVr

(%)

CVR Max (%)

= CVHor

CVR

(%)

Bière 10 2,48 2,48 21 8,99 32 8,99

Vin 10 1,49 1,59 21 5,52 32 5,9

Yaourt 10 1,69 1,69 21 6,01 32 6,01

5 7,5

10

15

30

50

0 10 20 30 40 50 60

Facte

ur

de r

ép

on

se d

es levels

Teneur en Carbamte d'éthyle (µg/kg)

Exemple de courbe d'étalonnage - Régression linéaire

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5. Justesse

5.1 Rendement apparent

5.1.1 Bière

Lors de la validation, la présence d’éthyle carbamate a systématiquement été observée. Dès lors, la valeur

du blanc matrice sera soustraite dans le calcul du rendement apparent.

Rendement (%) Série 1 Série 2 Série 3

Spiked 1 106,8 98,7 81,9

Spiked 2 94,3 110,7 96,9

Spiked 3 93,3 105,2 99,5

Spiked 4 94,3 93,8 90,9

Spiked 5 96,1 96,0 96,9

Spiked 6 109,9 92,8 116,9

Moyenne 99,1 99,5 97,2

Le rendement apparent de chaque essai respecte le critère 70%-120%.

5.1.2 Vin

Rendement (%) Série 1 Série 2 Série 3 Série 4

Spiked 1 83,5 96,9 97,9 96,7

Spiked 2 88,2 103,0 94,4 92,0

Spiked 3 97,0 100,9 91,7 91,6

Spiked 4 99,5 88,8 102,2 99,7

Spiked 5 87,8 103,8 104,5 98,6

Spiked 6 97,9 101,8 94,7 93,1

Moyenne 92,3 99,2 97,6 95,3

Le rendement apparent de chaque essai respecte le critère 70%-120%.

5.1.3 Yaourt

Rendement (%) Série 1 Série 2 Série 3

Spiked 1 107 100 97

Spiked 2 109 98 99

Spiked 3 103 94 100

Spiked 4 91 109 97

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Spiked 5 107 89 104

Spiked 6 97 103 105

Moyenne 102 99 100

Le rendement apparent de chaque essai respecte le critère 70%-120%.

5.2 Test inter-laboratoires

Le laboratoire participe à des études inter-laboratoires en fonction des circuits disponibles. Actuellement,

Bipea propose un circuit boissons fermentées alcoolisées.

Résultats obtenus en 2012 :

Référence N° Labo Matrice Résultat

Labo (µg/kg) Cible (µg/kg) Z-Score

Bipea 4-1418 12031193 Armagnac 38.1 43 -0.71

Bipea 1-0655 12031192 Vin rosé 17.3 17 0

Bipea 4-1018 12071069 Tequila 17.3 17 0

Bipea 6-0218 12111918 Cognac 6.46 9 -0.36

Bipea 18-0155 12111917 Vin rouge 13.8 18 -0.6

Bipea 5-0118 12150165 Whisky 14.46 15 -0.18

Bipea 6-0518 12240656 Brandy 20.13 18 0.33

Bipea 7-0418 12381315 Rhum 162.65 173 -0.36

Bipea 3-0255 12381309 Vin blanc 24.29 30 -0.67

Bipea 8-0318 12412345 Calvados 34.45 38 -0.29

Bipea 19-0155 12460721 Vin rouge 40.05 38 0.33

Bipea 4-0818 12500604 Eau de vie 715.5 710 0.05

L’ensemble des Z-scores obtenus pour les boissons fermentées alcoolisées sont compris entre -2 et 2

démontrant ainsi que la méthode est adaptée à l’analyse du carbamate d’éthyle dans ces matrices.

6. Robustesse :

Sur la durée de la validation, l’entretien complet du système a été réalisé plusieurs fois. Différents

opérateurs ont participé à la validation de l’analyse. L’ensemble des critères de qualité de la méthode ont été

systématiquement respectés.

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7. LOD :

La limite de détection de la méthode correspond à pouvoir détecter l'analyte dans la matrice à la moitié de la

concentration du premier niveau d'étalonnage. La LOD est de 2,5 µg/kg.

8. LOQ :

La limite de quantification de la méthode correspond à pouvoir quantifier l'analyte dans la matrice à la

concentration du premier point d'étalonnage. La LOQ de la méthode est de 5 µg/kg.

9. Incertitude de mesure

L’incertitude de mesure a été calculée suivant la procédure LAB 00 P 508 « DETERMINATION DE

L’INCERTITUDE DE MESURE POUR LES ANALYSES CHIMIQUES QUANTITATIVES », avec l’approche

TOP-DOWN, à partir des séries d’échantillons supplémentés à 10 µg/kg.

Les incertitudes de mesure basées sur la fidélité intermédiaire et le biais ainsi calculées sont :

- Bière : 24,3 %

- Vin : 19,3 %

- Yaourt : 16,6 %

D. Conclusion

L’ensemble des résultats obtenus lors des essais de validation montre que la méthode est adaptée à

l’analyse du carbamate d’éthyle dans les boissons fermentées.

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Annexe 1 : Chromatogrammes

Chromatogramme d’une bière ayant une teneur en carbamate d’éthyle 12 µg/kg

Chromatogramme : bière (Chimay bleue) contenant 12 µg/kg en carbamate d’éthyle (chromatogramme de gauche : m/z = 64 :

Carbamate d’éthyle d5 ; chromatogramme de droite : m/z = 62 : Carbamate d’éthyle).

Chromatogramme d’un vin ayant une teneur en carbamate d’éthyle de 3,7 µg/kg

Chromatogramme : vin contenant 3,7 µg/kg en carbamate d’éthyle (chromatogramme de gauche : m/z = 64 : Carbamate

d’éthyle d5 ; chromatogramme de droite : m/z = 62 : Carbamate d’éthyle).

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Annexe 2 : spectre de masses

Spectre du carbamate d’éthyle : acquisition TIC m/z: 50 – 250

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Annexe 3

Flow chart : « Détermination de la teneur en carbamate d’éthyle dans les boissons

fermentées par GC/MS/MS»

10 g échantillon

(vinaigre : neutralisation préalable)

+ 1 g NaCl

(+ 100 µl sol. dopage si échantillon dopé)

Agitation manuelle

+ 10 g terre de diatomée

5 min agitateur

10 min de stabilisation sur Chem-Elute

Echantillon épais Echantillon fluide

Transfert sur colonne en verre

Elution avec

100 ml de CH2Cl2

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Annexe 3 (suite)

Flow chart : « Détermination de la teneur en carbamate d’éthyle dans les boissons

fermentées par GC/MS/MS»

Evaporation jusqu’à environ 500µl

+200 µl SI

éluat

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Annexe 4 : Photos

Prise d’essai

Homogénéisation

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Annexe 4 : Photos (suite)

Extraction sur colonne Chemelut

Concentration au rotavapor

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Annexe 4 : Photos (suite)

Analyse par GC-MS