V. Lalande Service de Bactériologie-Virologie Hôpital Saint-Antoine.

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Bacille de Koch 1882Bacille de Koch 1882

Bacille acido-alcoolo-résistantBacille acido-alcoolo-résistant

Croissance lenteCroissance lente

Diagnostic bactériologique:Diagnostic bactériologique:

70% des tuberculoses 70% des tuberculoses

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Auramine O

Ziehl-NeelsenZiehl-Neelsen

X X 10001000

X400X400

Sensibilité Temps de lecture (2 (2 min)min)

artefact

Microscope Fluorescence ou Microscope Fluorescence ou LEDLED

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Tuberculoses pulmonaires (M+)Tuberculoses pulmonaires (M+)Adulte 60 - 80%Enfant < 20%HIV 40 - 50%

Tuberculoses extra-pulmonairesTuberculoses extra-pulmonairesM+ 10 - 40%

Non spécifique: BAAR Peu sensible : 5.103 à 104 BAAR/ml

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Milieu solideMilieu solide

3 à 6 sem.

Identification Identification biochimiquebiochimique

3 sem.3 sem.

AntibiogrammAntibiogrammee

3 à 4 sem.3 à 4 sem.

PrélèvementFluidification - Fluidification -

DécontaminationDécontamination

Culot de centrifugation

Délai de 4 à 12 semaines

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Milieu solideMilieu solide

3 à 6 sem.

Identification Identification biochimiquebiochimique

3 sem.3 sem.

AntibiogrammAntibiogrammee

3 à 4 sem.3 à 4 sem.

PrélèvementFluidification - Fluidification -

DécontaminationDécontamination

Culot de centrifugation Amplification Amplification géniquegénique

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Réponse rapide Réponse rapide (24h) Bonne spécificité (95 – 100%)

Manque de sensibilitéManque de sensibilité (M-) Faux négatif (inhibiteur, faible volume d’échantillonfaible volume d’échantillon)

Faux positifFaux positif Contamination croisée

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Nbre Nbre d’études d’études inclusesincluses

Type de Type de tuberculosetuberculose

Sensibilité Sensibilité (%)(%)

SpécificitéSpécificité(%)(%)

Sarmiento et al 2003

50 Pulmonaires(M-)

9 -100 25 -100

Piersimoni and Scarparo, 2003

>50 Pulmonaires et extraPulm

27-100 91-100

Pai, 2003 49 Méningite 0-100 0-100

Pai, 2004 40 Pleurésie 20-100 53-60

AmplicorAmplicor™ Cobas Roche (PCR)AMTDTAMTDT ™ Gen-Probe Amplification-transcript° (TMA)LCx -MTB™ Abbott Amplification-ligation (LCR)

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RecommandationsRecommandations actuellesactuelles Ne remplace pas le diagnostic traditionnelNe remplace pas le diagnostic traditionnel Toujours associée à la cultureToujours associée à la culture Analyse critiqueAnalyse critique

Un résultat négatif n’exclut pas le diagnostic de Un résultat négatif n’exclut pas le diagnostic de tuberculosetuberculose

Un résultat positif doit être confronté à la cliniqueUn résultat positif doit être confronté à la clinique Utilisation préférentielle sur les prélèvements M+Utilisation préférentielle sur les prélèvements M+

traitement orienté et levée d’isolementtraitement orienté et levée d’isolement Ne pas utiliser pour le suivi du traitementNe pas utiliser pour le suivi du traitement

ATS, recommandations 1997

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Quantitative nested RT, Quantitative nested RT, Applied BiosytemsApplied Biosytems

Takahashi et al JCM, 2008

•XpertXpert™™ MTB , Cepheid MTB , CepheidPCR Multiplex (MTB et PCR Multiplex (MTB et rporpoBB S et S et mutants)mutants)M+ M+ (Se : 100%) (Se : 100%) M-C+ M-C+ (Se :70%) Spe (Se :70%) Spe 96%96%Inactivation /cartouche unitaire (90 Inactivation /cartouche unitaire (90 min)min)ECCMID 2008, Jones et alECCMID 2008, Jones et al

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Milieu solideMilieu solide

3 à 6 sem.

Identification Identification biochimiquebiochimique

3 sem.3 sem.

AntibiogrammAntibiogrammee

3 à 4 sem.3 à 4 sem.

PrélèvementFluidification - Fluidification -

DécontaminationDécontamination

Culot de centrifugation

Milieux Milieux liquidesliquides

RespirométrieRespirométrie

1 à 4 sem.

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VisualisatiVisualisation des on des

coloniescolonies

Bact/Alert™ pH

MGIT™960MGIT™960 O2 O2 fluo fluo

Respirométrie non Respirométrie non radiométriqueradiométrique

Milieux liquidesMilieux liquides

Lecture hebdomadaire Lecture index de croissance

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METHODES M+ (Jour) M- (Jour) M+ et M- (J)

Bactec MGIT 960 1111 16.116.1 12.712.7

L.Jensen 21.421.4 26.726.7 22.822.8

Coletsos 21.321.3 26.826.8 22.722.7

Middelb. 7H11 10.410.4 20.720.7 1313

L.J+Colet+7H11 12.212.2 23.323.3 15.5

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L.J4 tubes 4 tubes = 2,6 €= 2,6 €

30j20j

ID+ ATB 20j

10j

ID + ATB 50j 60j

24j

15j

Liquide +Automate

Microscopie + Microscopie -

Culture

1 tube 1 tube = 4,5 € = 4,5 €

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Milieu solideMilieu solide

3 à 6 sem.

Identification Identification biochimiquebiochimique

3 sem.3 sem.

AntibiogrammAntibiogrammee

3 à 4 sem.3 à 4 sem.

PrélèvementFluidification - Fluidification -

DécontaminationDécontamination

Culot de centrifugation

Milieux Milieux liquidesliquides

RespirométrieRespirométrie

1 à 4 sem.

IdentificationPar Sondes

2 H

Identification par PCR

8 H

M+M+Identification

par PCR8 H

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• sans PCR, sondes d’hybridation pour culturesans PCR, sondes d’hybridation pour culture

•Accuprobe® (Gen-Probe) Accuprobe® (Gen-Probe) : ARN ribosomal

M.Tb complex, MAC, M.kansasii, M.gordonae

• avecavec PCR, sur prélèvement M+ et sur culturePCR, sur prélèvement M+ et sur culture

•INNO-LiPAINNO-LiPA™™ Mycobacteria Mycobacteria (Innogenetics) :

spacer 16s-23s : 16 espèces (dont Mtb complex)

•Genotype™ CM/AS Genotype™ CM/AS (Hain Lifescience) :

23s gene : 31 espèces (dont Mtb complex)

•GenotypeGenotype ™ ™ MTBC MTBC (Hain Lifescience), multiplex

PCR:

23s, RD1, gyrB : différentiation Mtb complex

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Conj. Control-MYC-MTBMTB--

MKA-1-MKA-2-MKA-3-

MXEMXE-MGOMGO-MAIS-MAV-MIN-MSC-

MCH-1MCH-1-MCH-2MCH-2-MCH-3-MCH-3-

1. 1. M. tuberculosisM. tuberculosis 2. 2. M. kansasiiM. kansasii (I) (I) 3. 3. M. kansasiiM. kansasii (II) (II) 4. 4. M. kansasiiM. kansasii (III-V) (III-V) 5. 5. M. xenopiM. xenopi 6. 6. M. gordonaeM. gordonae 7. 7. M. aviumM. avium 8. 8. M. intracellulareM. intracellulare 9. 9. M. scrofulaceumM. scrofulaceum10. 10. MAISMAIS11. 11. M. chelonaeM. chelonae (I-IV) (I-IV)12. 12. M. chelonaeM. chelonae (III) (III)13. 13. M. chelonaeM. chelonae (I) (I)14. 14. Pas de Pas de MycobacteriumMycobacterium

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

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Milieu solideMilieu solide

3 à 6 sem.

Identification Identification biochimiquebiochimique

3 sem.3 sem.

AntibiogrammAntibiogrammee

3 à 4 sem.3 à 4 sem.

PrélèvementFluidification - Fluidification -

DécontaminationDécontamination

Culot de centrifugation

Milieux Milieux liquidesliquides

1 à 4 sem.

AntibiogrammAntibiogrammee

liquideliquide2 sem.2 sem.

M+M+Détermination par PCR de la

résistance RMP et INH

8 H

Détermination Détermination de la de la

résistance par résistance par PCRPCR

MODSCulture +

ATBgramme

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MMicroscopic icroscopic OObservation bservation DDrug rug SSusceptibility usceptibility (MODS)(MODS) 12 puits/échantillon dont 8 puits antibiotiques12 puits/échantillon dont 8 puits antibiotiques

Sachet fermé Étuve CO2Sachet fermé Étuve CO2 Examen microscopique journalierExamen microscopique journalier

microscope à inversion de phasemicroscope à inversion de phase Sensibilité de la culture, délai médian Sensibilité de la culture, délai médian = 7 jours= 7 jours Concordance 100% RMP et 97%INHConcordance 100% RMP et 97%INH

Moore D. et al NEJM 2006, Shiferaw et al JCM 2007Caws et al, PloS ONE 2007,

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NRA Nitrate reduction assayNRA Nitrate reduction assay Culture en milieu solide + Antibiogramme / Culture en milieu solide + Antibiogramme /

colorimétriquecolorimétrique

Musa et al JCM 2005 Détection de la résistance à la rifampicineDétection de la résistance à la rifampicine

Culture en milieu liquide Sel de tétrazoliumCulture en milieu liquide Sel de tétrazolium

Abate et al JCM 2004

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PCR Multiplex, prélèvement M+ et PCR Multiplex, prélèvement M+ et

cultureculture

•INNO-LiPAINNO-LiPA™™ Rif TB Rif TB (Innogenetics) : Rifampicine

Rifampicine : Gène rpoB + Mtb complex

•MTBDR™ MTBDR™ (Hain Lifescience) : Rifampicine +

Isoniazide

Gène rpoB et gène katG + Mtb complex

•MTBDR plusMTBDR plus ™ ™ (Hain Lifescience), multiplex PCR:

Gène rpoB et gène katG + gène inhA + Mtb

complex•Line Probe Assay (PCR) : Line Probe Assay (PCR) : fluoroquinolonesGène gyrAGiannoni et al AAC 2005

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505 516516 526526 531531

WT1WT6

WT5WT4

WT3WT2

WT7 WT8

rpoB MUT1 (D516V)

rpoB MUT2A (H526Y)rpoB MUT2B (H526D)

rpoB MUT3 (S531L)

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Wild typerpoB

WT katGinhA

MutantMutantss

MutantMutantss

MutantMutantss

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OrigineOrigine RMPRMPRR

INHINHRR

INH INH basbas

niveauniveau

INH INH haut haut

niveauniveau

Causse et al Int J Tuberc lung Dis 2008

18 M+/41 souches

100%100%(36)(36)

94,6%94,6%(37)(37)

NA NA

Hilleman et al JCM 2007

72 M+/125 souches

98,7%98,7%(106)(106)

91%91%(116)(116)

NA NA

Lacoma et al JCM 2008

65 éch/62 souches

98,3%98,3%(51)(51)

79%79% 63%63%(27)(27)

86%86%(21)(21)

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Des tests rapides pour la tuberculose a Des tests rapides pour la tuberculose a bacilles résistants vont être disponibles bacilles résistants vont être disponibles dans les pays en développementdans les pays en développement

Azerbaïdjan, Bangladesh, Côte d'Ivoire, Ethiopie, Géorgie, Indonésie, Kazakhstan, Kirghizistan, Lesotho, Moldova, Myanmar, Ouzbékistan, République démocratique du Congo, Tadjikistan, Ukraine et Viet Nam.