Université Cheikh Anta Diop de Dakar - Sénégal (1...Université Cheikh Anta Diop de Dakar - Sénégal
UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR FACULTE …
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r UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES .... . . . . . ...... .. .... . . . . . ........ DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIES CHIMIE ET BIOCHIMIE DES PRODUITS NATURELS MEMOIRE PRESENTE LE8 Novembre 1993 PAR SERIGNE MBACKE DIOP SUJET: INFLUENCES DE LA CONCENTRATION INITIALE EN GLUCOSE ET EN MATIERES AZOTEES SUR LA CROISSANCE ET LE METABOLISME DELA CTOBA CILLUS DKP EN CULTURE CONTINUE IURY PRESIDENT: Mr. ABDOULA YB SAMB EXAMINATEURS: MM MOMAR DIENG JEAN LORQUIN MOUHAMÀDOU DIOP SALL EMMANUEL TINE ANNEE UNIVERSITAIRE 1992 - 1993
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UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKARFACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES. . . . . .. . . . . ... . . .. .. . . . . . . . . .. .. . .
DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIESCHIMIE ET BIOCHIMIE DES PRODUITS NATURELS
MEMOIRE PRESENTE LE 8 Novembre 1993
PAR
SERIGNE MBACKE DIOP
SUJET: INFLUENCES DE LA CONCENTRATION INITIALE EN
GLUCOSE ET EN MATIERES AZOTEES SUR LA CROISSANCE
ET LE METABOLISME DELACTOBACILLUS DKP EN CULTURE
CONTINUE
IURY
PRESIDENT: Mr. ABDOULAYB SAMB
EXAMINATEURS: MM MOMAR DIENG
JEAN LORQUIN
MOUHAMÀDOU DIOP SALL
EMMANUEL TINE
ANNEE UNIVERSITAIRE 1992 - 1993
YI. M.9L !F.9l9If.ILL'E
.9l. trous !M'ES .9l9If.IS
REMERCIEMENTS
Le présent rapport est l'aboutissement du travail derecherche que nous avons effectué depuis deux ans auLaboratoire de Biotechnolog~e et d'Energétique (LBE) del'ENSUT. .
Nous exprimonsMouhamadou DIOPavoir accepté,préparation derecherches.
toute notre reconnaissance au ProfesseurSALL directeur -du laboratoire pour nous yfourni les conditions favorables à la
ce travail, et pour avoir supervisé nos
Qu'il nous soit permis de remercier M. Yannick COMBET-BLANC,chercheur à l'ORSTOM, pour nous avoir initié aux techniquesde la Microbiologie anaérobie, et aidé à réaliser cetravail.
Nous remercions tout particulièrement M. Emmanuel TINE,maître-assistant à l'ENSUT, qui nous a fait bénéficier deses nombreux conseils et nous a apporté une aide active dansl'élaboration et la présentation de ce mémoire de DEA. Nouslui exprimons toute notre gratitude~
Nous adressons nos remerciements au Professeur AbdoulayeSAMB qui nous fait l'honneur d'accepter la présidence de cejury.
Nous exprimons nos plus sincères remerciements à MM. MomarDIENG Professeur à la Faculté des Sciences et Techniques,Jean LORQUIN chercheur à l'ORSTOM pour avoir accepté dejuger ce travail et d'être membres du jury.
Que M. Demba SOW, maître-assistant à l'ENSUT, trouve icil'expression de notre reconnaissance pour son précieuxconcours dans la réalisation matérielle de ce document.
Nous tenons également à remercier notre ami Marne CambelDIENG pour nous avoir initié au traitement informatique, etdonné un avis critique sur ce travail.
A nos camarades de laboratoire Pape SENE, Gabriel DAH-ZOGBO,et Robert MBIAKE, nous disons merçi pour l'aide précieuse etla disponibilité dont ils ont toujours fait montre.
Nous ne saurions terminer sans associer à ces remerciementsSamba BARRY, technicien au laboratoire, pour son appui toutau long de ce travail.
A mes amis Ibou K. Gueye, Jules, Nabou, Jackie... , à mesfrères Pape, Ousin, et à tous çeux qui, de près ou de loin,auront contribué à la matérialisation du présent document,je traduis mes vifs remerciements.
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YATP
LDH :.
LYSmATp:
I%PDH
PFLpiqATP:
Acé
ADN
ADP
ASPATP
AZTBiom:CoA
D.O
D
Eth
FDP
HK
Lac
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ABREVIATIONS
Acétate
Acide désoxyrubonucléique
Adénosine di-phosphateAcide aspartiqueAdénosine tri-phosphate
,Charge azotée, substances azotées
Biomasse
Coenzyme ADensité optique
Taux de dilutionEthanolFructose di-phosphate
Hexokinase
LactateLactico-déshydrogén~se
LysineEnergie de maintenance pour l'ATP
Energie de maintenance pour le glucose
Pyruvate déshydrogénase
Pyruvate formiate lyase
Phosphate inorganique, minéral
taux de production spécifique d'ATPtaux spécifique de production en produits (qAcé, qLac... )taux spécifique de consommation du substrat (qGlc,qAZT)
Thiamine pyrophosphate
BiomasseRendement maximal en ATP
Rendement en ATP
11%C
%
Rendement maximal (ou réel, ou vrai) de la croissanceRendement des produits en fonction du substrat
Rendement des produits en fonction de la biomasse
Rendement théorique de la croissance
Taux spécifique de croissance
Pourcentage de recouvrement en carbone
conversion G -----> P : Taux de conversion du glucoseen produits (lactate, produits hétérolactiques)
FAD;FADB,B:
G6P-DB :
Gli,Glr,Glc:
NAD; NADB,B:
NADP;NADPB,B:
Flavine adénine dinucléotide (forme oxydée; forme
réduite)Glucose-6-phosphate déhydrogénaseGlucose initial, résiduel, consommé
Nicotinamide adénine dinucléotide forme réduite;
forme oxydée
Nicotinamide adénine dinucléotide phosphate formeréduite; forme oxydée
1. INTRODÙCTIOH
Utilisés. d'abord de manière .empirique depuis près de 6000
ans pour des fermentations alimentaires (pain, vin, cidre,
charcuterie, fromage, bières... ), les microorganismes sont
devenus, avec le développement des sciences biologiques, un
outil performant en biotechnologie.
Avec la révolution de la biologie causée par la
découverte, puis le développement des manipulations
génétiques, on peut à présent contraindre des organismes à
produire en masse une substance donnée. Ainsi on utilise les
microorganismes pour la transformation de produits agricoles,
la production de médicaments et vaccins, la synthèse de
composés organiques variés, la protection de l'environnement,
la production d' énergie, la synthèse de produits alimentaires...
Le Laboratoire de Biotechnologie et d' Energétique de
l'ENSUT mène en collaboration avec l'ORSTOM, un programme
d'étude portant sur les organismes produisant du biogaz et
ceux fermentant les produits locaux. Les résultats de ce
programme devrait permettre d'utiliser dans l'industrie les
organismes dont la physiologie et le métabolisme présentent un
intérêt.
C'est ainsi· qu'a été isolé dans ce laboratoire en 1988, à
partir du vin de palme, une bactérie lactique qui
appartiendrait au genre Lactobacillus. Ce Lactobacillus DKP
qui fermente bon nombre de sucres (D-glucose, lactose,
saccharose, amidon) présente des dispositions intéressantes en
cultures non renouvelées (batch). Homofermentaire ou
hétérofermentaire selon les conditions imposées, L. DKP est
thermophile modéré avec un optimum à 52°C, avec une vitesse de
croissance élevée sur milieù riche à pH 7.
L'objet de notre travail est d'étudier le comportement de
cette bactérie en cultures continues (chemostat). Pour ce
faire nous nous proposons:
- Dans un premier temps d "analyser l'influence de la
source d'énergie et de carbone ainsi que du substrat azoté sur
la croissance quand ceux-ci sont des facteurs limitants.
- D'étudier dans ces deux cas l'influence de la variation
du taux de croissance sur le métabolisme glucidique et la
formation de biomasse.
- Et enfin de déterminer pour L. DKP les paramètres'
spécifiques tels que l'énergie de maintenance, le rendement
énergétique, et le taux de consommation de substrat dans le
cas de cultures continues.
II. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
Plu~ieurs genres bactériens sont utilisés en
Biotechnologie pour la production d'acide lactique. Ce sont
notamment les genres: Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc,
Lactobacillus. Nous nous sommes intéressé à ce dernier.
1. LE GENRE LACTOBACILLUS
Les bactéries du genre Lactobacillus sont des bacillesGRAM+, régulières, non sporulantes. Ce genre appartient à la
famille des 'LACTOBACILLACEAE dont l'espéce type est
Lactobacillus delbrueckii (Leichman 1896) Beijerinck 1901).
Les bactéries du genre Lactobacillus ont habituellement
un aspect long et mince, avec une grande variabilité au
niveau de cette morphologie.' Elles peuvent devenir des
bâtonnets gros et courts, ou prendre finalement un aspect
coccobacillaire voire corynébactérien. La taille et le degré
de courbure de ces batonnets dépend de l'âge de la culture,
de la composition du milieu et de la pression partielle en
oxygene. (4, 36)
Ces bacilles présentent fréquemment une formation en
chaînettes, selon le pH du milieu et le stade de
croissance(4, 28). Immobiles le plus souvent,on rencontre
chez les Lactobacillus des cas de mobilité avec alors un type
d'implantation ciliaire péritriche. Cette mobilité observée
lors de l'isolement disparaît souvent après divers repiquages
sur milieux artificiels (4).
En microscopie électronique on observe le profil type de
la paroi cellulaire de bactéries GRAM+. Cette paroi conti~nt
des acides téichoïques et un peptidoglycane dont la séquence
des acides aminés constitutifs est de type LYS-D-ASP associé
à des polysaccharides par des liaisons phosphodiesters (4,
3S) •
Sur milieu gélosé on observe généralement de petites
colonies convexes, lisses, luisantes et opaques, s,ans
pigments à bords reguliers. La croissance en milieu liquide
se fait dans tout le volume mais les cellules précipitent en
'fin de croîssance. Le dépot est homogène, 'rarement granuleux
ou visqueux.
Le genre Lactobacillus croît dans des conditions
d'anaérobiose ou de microaérophilie. Toutefois, la présence
d'oxygène peut selon l'espèce concernée, inhiber ou activer
la croissance, ou encore modifier dans un sens ou dans
l'autre le metabolisme des sucres (l, 6, 7).
L~s Lactobacillus ne réduisent pas les nitrates et ne
liquifient pas la gélatine non plus. Ils ne présentent ni
catalase ni cytochromes pour effectuer la phosphorylation
oxydative, toutefois un nombre rest~eint de souches décompose
les peroxydes par une pseudocatalase (4, 35).
Le pourcentage G +C de l'ADN (nombre de couples guanine
+ cytosine pour 100 couples de bases de l'ADN) est compris
entre 32% et 53%(20).
Les exigences nutritionnelles en acides aminés, peptides,
acides nucléiques et dérivés, vitamines, sels d'acides gras
ou esters d'acides gras, sucres fermentescibles sont
complexes. En effet les Lactobacillus n'exigent pas seulement
les sucres, comme source d'énergie et de carbone, mais aussi
des nucléotides, des acides aminés et des vitamines.
Les exigences en nutriments sont généralement
caractéristiques de chaque espéce, et même de souches
particulières. Ces exigences seraient le résultat d'un
certain nombre de défections mineures au niveau du génome
(4) •
Le métabolisme de ces bactéries est fermentatif,
obligatoirement saccharoclastique(4). Un large spectre de
sucres est utilisé. 50% au moins des métabolites formés est
constitué par de l'acide lactique. Les autres produits du
métabolisme outre le lactate peuvent être: les acides
acétique, formique ou succinique; l'ethanol, le gaz
carbonique. Suivant les espéces, les conditions culturales et
le milieu de départ, on peut aussi trouver du glycérol, de
l'acétoïne ou d'autres composés à quatre atomes de carbone(7,
40, 41).
On classe ces bactéries lactiques en Homofermentaires _
lorsque la production de lactate à partir du glucose dépasse
85% et Hétérofermentaires lorsque la quantité produite est
comprise entre 50% et 85%(35).
Certaines souches de Lactobacillus peuvent aussi produire
des macromolécules telles que les antibiotiques. C'est le cas
de L.delbruecki , L.reuteri • L.acidophilus (42, 43, 44),
L. brevis, L. casei (25). Ils peuvent .aussi produire des
enzymes extracellulaires comme la polygalacturonase
(pectinase) libérée par L.plantarum (31).
Généralement le genre Lactobacillus présente un
intervalle de température de croissance compris entre 2°C et
53°C avec un optimum entre 30°C et 40°C. La croissance
s'arrête à 55°C pour toutes les espéces recensées.
Les pH optimum de croissance sont légèrement acide, entre
4,5 et 6,4. Cependant certaines espéces telles que
Lactobacillus suebicus se développent encore à un pH de 2,8
(19). Globalement une diminition du pH n'a pas un ef fet
inhibiteur sur les bactéries lactiques (5).
selon la température optimale de croissance et les
produits du métabolisme fermentatif, le genre Lactobacillus
est subdivisé en trois principaux sous-groupes par Orla
Jensen (1919, 1943). Les tests suivants .(Rogosa 1970)
permettent de caractériser cette subdivision :
- Production de gaz carbonique à partir du glucose ou du
gluconate
- Présence de FDP aldolase
7
- Absence de production de mannitol à partir du fructose
- Croissance à 15°C et à 45°C
- Exigence en thiamine pour la croissance
Les trois sous groupes du genre Lactobacillus présentent
les caractéristiques suivantes:
-THERMOBACTERIUM: les ba~téries de ce sous-groupe sont
homofermentaires strictes car n'utilisent que la voie
d' Embden-Meyerhof. Les hexoses sont fermentés presque
exclusivement en lactàte. Les pentoses et le gluconate ne
sont pas fermentés.
-STREPTOBACTERIUM: ce sont des hétérofermentaires
facultatifs. Elles utilisent le plus souvent le glucose par
la voie d'Embden-Meyerhof, mais elles utilisent aussi la voie
des pentoses phosphates.
-BETABACTERIUM: Elles n'utilisent que la voie des
pentoses phosphates et sont de ce fait des hétérofermentaires
strictes.
L'électrophorèse.et l'homologie des enzymes, les études
sérologiques, les relations génotypiques (composition en
ba~es de l'ADN et Hybridation) couplées au séquençage des
acides aminés du peptidoglycane de la paroi bactérienne sont
largement utilisées aujourd'hui pour caractériser les sous
groupes et espèces du genre ~actobacillus.
2. NUTRITION DES BACTERIES LACTIQUES
2.1-SUBSTRAT ENERGETIQUE ET CARBONE
Les lactobac~llus utilisent presque exclusivement les
sucres comme source de carbone et d'énergie. L'énergie
nécessaire à l'accomplissement de leurs fonctions vitales est
obtenue essentiellement par dégradation des carbohydrates, et
stockée sous forme d'ATP.
La dégradation de ces sucres selon l'organisme considéré
(en fonction de son équipement enzymatique) peut emprunter
plusieurs voies métaboliques. Ainsi ces organismes
anaérobies, par absence de la chaine respiratoire, réalisent
une oxydation incomplète du glucose en général par voie
fermentative.
Notons toutefois que certains organismes utilisent
d'autres molécules telles que l'arginine comme seule source
d'énergie (46). D'autres organismes comme L.plantarum,
utilisent en plus du glucose, un substrat énergétique
supplémentaire tel que le citrate (18).
2.1.1- METABOLISME DU GLUCOSE
Deux principales voies cataboliques sont utilisées par
les bactéries lactiques: la voie d' Embden-Meyerhoff ou
glycolyse, et la voie des pentoses.
L'aptitude à utiliser l'une de ces voies (ou les deux)
est d'ordre génétique, et permet une classifiqation de ces
organismes.
al-La voie d'Embden-Meyerhoff:
L" equation globale de la glycolyse peut être ainsi
résumée:
1 GLUCOSE + 2NAD+ + 2ADP + pi -------> 2PYRUVA'lES + 2NADH2 + 2ATP
Dans le détail nous obtenons (fig.l):
- Phosphorylation initiale du Glucose en Glucose-6-P.
- Altération de la structure cyclique du Glucose et
isomérisation en Fructose-6-P.
- Nouvelle phosphorylation donnant du Fructose-l, 6
Diphosphate.
- A l'aide d'une aldolase ce 1,6-FDP est scindé en D
Glycéraldehyde-P et Dihydroxyacétone-p.
- Oxydation du 3-Phosphoglycéraldehyde en présence de
phosphate minéral (Pi) et de NAD+, qui donne l'acide 1,3
Diphosphoglycérique.
a
'GLUCOSE 1
L,- ATP
""~ ADPGLUCOSE-G-P- ~ ~ G-PHOSPHOGLUCONATEl "NADP+' ~ NADP+, NADPH,H+ CD NADPH,H+
FRUCTOSE-G-P RIBU QSE S-PJr-ATP 14~ADP tL
FRUCTOSE-l-G-P RIBOSE s-PÂ
/ ,/ "
)1 "DIHYDROXYACETONE-P ..........-_.._ GLYCERA~EHYDE- ':l_P ACETYL-P
P 2NADf ~
i 2~AD~H+ 1 \1,3-DIPHOSPHOGLYCERATE 1 \v---- 2ADP 1
~ 2ATP \2-PHOSPHOGLYCERATE 1 \
* /"PHOSPHOENOLPYRUVATE / \. F2ADP/ l
2ATP , ,
1 PYRUVATE 1 1ETHANOL 1 lACETATE 1
SCHEMA1: PRINCIPALES VOIES DE DEGRADATION DU GLUCOSE
GLYCOLYSE
PENTOSES-P
10
- Ce composé par transformations successives génère de
l'ATP et le 2-phosphoglycérate qui par déshydratation évolue
en phosphoénolpyruvate (PEP) et en pyruvate (2, 8, 27).
La régulation de la glycolyse se fait essentiellement par
l'ATP. Des concentrations élevées d'ATP inhibent l'activité
de la phosphofructokinase enzyme catalysant la transformation
de fructose-6-P en fructose 1,6-P.
L'accumulation d' ATP inhibe de ce fait la glycolyse,
permettant à la cellule d'utiliser le glucose à d'autres
fins. Il s'agit d'une orientation des activités métaboliques
vers d'autres voies (46).
b)-Voie des Pentoses phosphates:
C'est une voie d'oxydation du glucose branchée en
parallèle sur la glycolyse (fig 1). Les premières réactions
utilisées par les Lactobacillus hétérofermentaires sont:
_ Oxydation du Glucose-6-P, is~u de la phosphorylation du
glucose, en 'acide 6-phosphogluconique par l'intervention de
NADP+.
Cet acide 6-phosphogluconique, à nouveau oxydé en 3,
est décarboxylé en ribulose-S-P qui, sous l'action de pentose
isomérase, s'isomérise en ribose-S-P.
Ce dernier, à l'aide de la pentulose phosphate
cétolase, se clive en glycéraldehyde-P et en acétyl-P.
Alors que l'acétyl-P évolue' en acétate et éthanol, le
glycéraldehyde-P rejoint la voie glycolytique pour donner le
pyruvate. Cette voie métabolique permet, en plus du gain
d'une molécule d'ATP à partir de l'acétyl-P, la synthèse de
nucléotides et d'acides nucléiques. (2, 34, 39)
2.1.2-DEVENIR DU PYRUVATE:
Les organismes anaérobies sont dépourvus de chaîne
respiratoire leur permettant de réoxyder le NADH,H+ en NAD+,
enzyme nécessaire au redémarrage de la glycolyse. Les
Lactobacillus comme les autres bactéries fermentaires vont
11
utiliser le pyruvate, ou un dérivé, pour cette réoxydation
(2, 20): fig 2
_ Dans le cas de l'homolactisme le pyruvate, en présence
de lactico-déshydrogénase (LDH) , réoxyde le NADH, H+ en
produisant essentiellement du L(+)-lactate.(l, 13, 32, 39)
NADH, H + NAD +
PYRUVATEr----\..~-,A~--__I....~ L _ LACTATELDH
En anaérobiose stricte les lactobacillus
hétérofermentaires produisent du formiate par l'intervention
de pyruvate formiate lyase (PFL) et de coA.L'acétyl CoA
obtenu en même temps réoxydera le NADPH,H+ pour donner de
l'éthanol et de l'acétate en quantité équimolaire. (1, 13,
32, 39)
CoA
2 PYRUVATES--\.....-.....-----I....~ 2FORMIATES +lETHANOL + lACETATEPFL
En cas d'absence ou d'inhibition de la PFL, une pyruvate
déshydrogénase (PDH) intervient, en présence de thiamine
pyrophosphate (TPP). L'acétyl CoA intermédiaire est ainsi
obtenu, via l'acétaldehyde-TPP (11, 13, 41).
_ La production d' acétoïne, de diacétyl, de 2,3
butanediol, de succinate et même d'acétate supplémentaire,
dépend des souches et de conditions particulières de cultures
(oxygénation, présence de sucres autres que le glucose, de
certains cofacteurs, de citrate). (6, 7, 18)
La régulation de la voie homolactique se fait par la LDH
qui est activée par le fructose diphosphate (FDP); la PFL
enzyme-clé de la voie hétérolactique, est inhibée par contre
par des concentrations élevèes de trioses-P (11, 40, 41) et
surtout par l'oxygène (1, 7). Dans les deux cas la
concentration initiale en glucose est importante, et c'est
elle qui détermine la voie empruntée par le pyruvate.
17
1 GLUCOSE 1
1
FRUCT~SE 1,6-P -,1 1Activation, le±)
- -TRIOSE-Pl '- NAD+
- '_NADH,H + J~ \., 1 .. 1 LACTATE 1
r1
Inhibitipn
0 1,2
1 FORMIATE 1 Acétyl CoA Pi
NA"DH,H;( ':!...tJ~NAD+7 .4 6 ~Co'I
Acétaldéhyde Acétyl-P
NADH,H+ 5
NAD+
7
1 ETHANOL 1 1 ACETATE 1
1 _ Lactico-déshydrogénase
2 _ Pyruvate formiate Iyase
3 _ Pyruvate déshydrogénase4 _ Aldéhyde déshydrogénase5 _ Alcool déshydrogénase
6 _ Phosphate acétyl transférase7 _ Acétyl kinase
Schéma 2: METABOLISME DU PYRUVATE
(principales voies, régulation, enzymes mises en jeu)
1 ~
2.2-SUBSTRAT AZOTE
Les espèces microbiennes hétérotrophes ont besoin de
source d'azote organique ou minéral. Outre son rôle dans
l'édification cellulaire, (20, 27, .34) les nutriments azotés
sont aussi des stimulants de la croissance (33).
Certains n'obtiennent leur azote que par l'intermédiaire
de peptones (petits polypeptides) résultant de l'hydrolyse de
protéines. Ces peptones doivent contenir un ou plusieurs
acides aminés essentiels tels que le tryptophane ou l'acide
glutamique.
Certaines bactéries lactiques peuvent utiliser l'ammoniac
comme source d'azote. Cest le cas de Streptococcus bovis
(48). Cet ammoniac provient soit des sels d'ammonium (sulfate
ou phosphate), ou du catabolisme des acides aminés.
Les extraits de levure, qui sont utilisés comme source
d'azote dans les milieux de culture des Lactobacillus,
contiennent en plus des N'-am~nes, des sucres, des sels
minéraux, et des facteurs de croissance.
2.3 FACTEURS DE CROISSANCE
La culture sur milieux synthétiques de bactéries
hétérotrophes révèle une exigence en substances complexes ne
pouvant provenir que de synthèses à partir des substrats
carboné et azoté disponibles. Elles sont classées en trois
groupes:
2.3.1 VITAMINES:
Elles jouent surtout le rôle de coenzymes. C'est le cas
de nlcotinamide (NAD), de flavine (FAD, FMN) , de thiamine,
indispensables dans les reactions du métabolisme énergétique.
1L1.
COENZYMES FONCTIONS
vitamine B6 Coenzyme fondamentale de la biosynthèse des
(Pyridoxine) acides aminés (catalyseur des réactions detransamination et de décarboxylation)
vitamine BI Coenzyme intervenant dans le cycle de Krebs et
(Thiamine) la décarboxylation oxydative de l'acidepyruvique
Coenzyme A Coenzyme en cause dans le fonctionnement de
(dérivé de nombreux systèmes enzymatiques,l'acide particulièrement dans la synthèse des acidespantothénique) gras, la décarboxylation de l'acide pyruvique,
etc.
Acide foliquE Transfert de radicaux monocarbonés (-COO,CH20H, -CH=NH, - CH3, etc.
Biotine Coenzyme des réactions de transport du C02·(Vitamine H)
Coenzymes Constituants fondamentaux des coenzymesd'oxyda- pyrimidiques comme le NAD, le NADP, qui
réduction interviennent dans les réactions de la chaîne
respiratoire
vitamine B2 constituant fondamental des coenzymesflaviniques, comme le FAD, qui participent aufonctionnement des déshydrogènases.
Tableau 1: Action coenzymatique de quelques vitamines
nécessaires aux bactéries hétérotrophes
Certaines de ces vitamines comme les acides pantothéniqueet nicotinique sont exigées par presque toutes les espèces du
, ,genre Lactobacillus, d'autres telles que la thiamine sontexclusives des espèces hétérofermentaires.(4)
2.3.2 BASES PURIQUES ET PYRIMIDIQUES
Pour certaines espèces la synthèse de métabolites aussi
essentiels que les bases puriques et pyrimidiques (entrant
lt:
dans la composition des acides nucléiques) n'est pas
possible. Il doivent être fournis comme tels. Ainsi
Lactobacillus delbrueckii exige des dérivés d'acides
nuléiques pour sa croissance (47).Ces bases sont également identifiées comme facteurs de
croissance contenus dans les extraits de levure (33) et les
infusions de blé (15).
2.3.3 ACIDES AMINES
Les acides aminés nécessaires à l'édification des
protéines cellulaires ne sont pas tous élaborés par
interconversion des voies métaboliques. Dans ce cas ils
doivent être fournis préformés. On comprend dès lors
l'importance de l'extrait de levure comme stimulant de la
croissance, puisque contenant 18 acides aminés; le
tryptophane étant majoritaire (80% ) de la fraction la plus
stimulante pour Streptococcus lactis (33). S.bovis utilise la
glutamine plutôt que son dérivé acide (14) alors que la
phénylalanine stimule la croissance de L.casei (15).
On peut toutefois noter qU'outre ces trois catégories de
substances d'autres peuvent jouer le rôle de facteurs de
croissance. Il en est ainsi pour L. ca sei avec des
polypeptides, des peptides pour S.lactis, des composés azotés
simples pour Lactobacillus et Leuconostoc. Certains auteurs
pensent que des éléments minéraux tels Fe, Mg, et Mo
(présents dans l'extrait de levure) stimulent la croissance
(33) •
le:..
III. MATERIEL ET METHODE
1 LE MICROORGANISME
La souche utilisée est une bactérie lactique isolée du
vin de palme en 1988 par une équipe de chercheurs du
Laboratoire de Biotechnologie et d'Energétique. Les études
préliminaires montrent qU'elle ,appartient au genre
Lactobacillus, et au sous-genre Streptobacter ium.
Lactobacillus DKP présente les caractéristiques suivantes:
- Un optimum de température à 52°C , la crois sance
s'arrête à 60°C.
- Des pH compris entre 5,5 et 8,5 avec un optimum à 7,2
(16) .
- L. DKP a une croissance rapide sur milieux riches, son
taux de croissance spécifique maximal (pmax) serait voisin de
1,5 h- 1 (10).
- Le pourcentage molaire moyen en bases (G + C) de l'ADN
est de 37,2%
- Un large spectre de sucres est utilisé par L. DKP : D
glucose, lactose, saccharose, amidon. Le métabolisme du
glucose est fermentatif, hétérolactique facultatif (10, 16).
- Une observation directe au microscope photonique nous
~ontre que L. DKP se présente sous la forme d'un bacille
grêle très mobile, caractère peu commun au genre.
Des travaux en vue de compléter l'identification
taxonomique se poursuivent.
2 LES MILIEUX DE CULTURE
2.1 LE MILIEU DE DEMARRAGE
Le milieu de démarrage dérive du milieu de culture mère
dont la composition est la suivante:
17
Glucose
Extraits de levure
Biotrypcase
Solution minérale SMY*
20 g/l
10 g/l
10 g/l
100 ml/l
La concentration en
azotés (biotrypcase,extraits
facteur à étudier. En azote
seront de 3 à 6 g/l AZT; 2g/1
prises quand le glucose est le
glucose ou en produits
de levure) est fonction du
limitant, les concentrations
de glucose et 5 g/l AZT seront
facteur limitant.
2.2 LES MILIEUX POUR L'INOCULUM
On ensemence 2ml de la souche dans 38ml d'un milieu
liquide dont la composition est la suivante:
Glucose 5g/1; Extraits de levures 5g/1; NH4Cl 0,5g/1;
(NH4)2S04 0,5g/1; Tween 80 0,5g/1; Solution minérale SMX* 8ml;
Solution tampon phosphaté* 80ml; Eau distillée qsp 1000ml.
2.3 LES MILIEUX D'ALIMENTATION
Ces milieux dérivent aussi du milieu de base. Leur
composition sera différente selon le facteur à étudier:
- Dans le cas des cultures en azote limitant on utilise
un excès de glucose (concentrations toujours voisines de
35g/1). Les concentrations en azote varient alors de 0,43 g/l
à 8,10 g/l.
Lorsque le glucose est le facteur limitant la
croissance, la concentration en produits azotés est fixée à
environ 4,94 g/l.
Dans les deux cas la concentration de la solution
minérale SMY* du milieu de base reste inchangée.
3 PREPARATION D'UNE CULTURE CONTINUE
La culture continue de L. DKP a été menée dans un
fermenteur Wheaton de 250ml de volume utile 200 ml.
* Pour la canposition voir annexe
1R
1 INSTALLATION
Les différentes ouvertures du réacteur sonthermétiquement fermées avec des bouchons munis de septum. Desaiguilles piquées à travers les septa permettent l'arrivée de
gaz et des différentsmilieux, le prélèvement des échantillons et la sortie de
milieu. Un orifice dans le septum du bouchon central permetla suspension de l'électrode pH stérilisablei le pH estcontrôlé par l'arrivée de soude au niveau du même septum.
Les conditions d'anaérobiose sont assurées par un courant
permanent d'azote gazeux au niveau du fermenteur, suffisantpour chasser tout l'air.
Une agitation de 100 tours/mn est maintenue toute ladurée de la fermentation (agitateur ROTOLAB).
Un régulateur de pH (New Brunswick Scientific Co. modelpH 4000) qui active des valves ajoute de la soude 3N aufermenteur dès que le pH dépasse 7,2. Un pH de 7,1 ± 0,1 est
ainsi mainte'nu toute la durée de la fermentation.
La température constante du réacteur est assurée par un
courant d'eau de 50 oC , chauffé par un
thermoplongeur(Bioblock Scientific), et circulant entre lesparois du fermenteur.
Durant toute la fermentation des pompes péristaltiques
(GILSON) sont utilisées pour approvisionner le réacteur en
milieu neuf, à un taux constant. Une deuxième serie de pompes
péristaltiques (Interscience), opérant à un flux plus élevé,maintient le volume dans le fermenteur constant en aspirant
tout· excédent du volume utile. Le débit est calculé à partir
du volume de milieu déversé dans le fermenteur, par unité detemps.
Les bouteilles de milieux, avec les mêmes conditions
d'anaérobiose, sont maintenues en agitation constante à latempérature du laboratoire.
Dans les conditions de limitation en azote une bouteille
de milieu glucosé (MB), exempte de substrat azoté, assure lacontinuité de la culture. Un flacon contenant les differents
lq
milieux azotés (MD), sans glucose, apporte le complément
nutritif.
3.2 CONDUITE DE LA FERMENTATION
La culture continue débute par l'injection d'un inoculum
dans le milieu de démarrage stérile. Cet inoculum est un
batch d'environ 8 heures, de 2 ml de culture mère de L. DKP
dans 38 ml de milieu pour inoculum, de manière à avoir une
concentration approximative de 1.106 cellules/ml.
Les prélèvements pour la lecture de la densité optique
sont faits à partir du milieu fermenté. L'échantillon est
pr~levé dans un tube stérile contenant une soluton
acidifiante (voir annexe) pour arrêter la croissance
microbienne. Le volume de solution acidifiante diffère selon
que l'on effectue une simple mesure de densité optique (0,5
ml) ou que l'on conserve l'êchantillon en vue d'une analyse
(1 ml).
La prise d'êchantillon est effectuée en fonction du taux
de dilution entre 8 à 12 heures après l'incubation, et toute
les heures jusqu'à la stabilisation de la croissance.
4 METHODES DE MESURE DES PARAMETRES ETUDIES
4.1 MESURE DE LA CROISSANCE
On mesure la densité microbienne dans le fermenteur par
lecture de la densitê optique(D.O) avec un spectromètre
(Spectronic BAUSCH & LOMB Inc. modèle 21). Pour de trop
fortes concentrations bactêriennes , des dilutions appopriées
sont faites avec une solution de dilution (voir annexe)
Il existe un rapport entre 0.0 et poids sec de cellules.
Il diffère selon les bact~ries; pour L. DKP ce rapport est de
0,359/1 de poids sec par unité de D.O (10). La quantité de
biomasse est donc déduite à partir des mesures de D.O.
20
4.2 DETERMINATION DU TAUX DE DILUTION
Le taux de dilution(D) est le rapport entre le débit de
milieux entrant (ou sortant) et le volume utile du
fermenteur. Ce débit est obtenu par mesure du volume de
milieu déversé par unité de temps. Le volume utile du
reacteur est mesuré après la fermentation.
4.3 DOSAGE DES PRODUITS FINAUX
Les concentrations en Lactate, Acétate, et Ethanol du
milieu fermenté sont obtenues par dosages chromatographiques;
celles du glucose résiduel le sont par dosages enzymatiques.
4.3.1 DOSAGES CHROMATOGRAPHIQUES
Un chromatographe en phase gazeus~ Delsi Instruments
serie 300, équipé d'un détecteur à ionisation de flamme, est
utilisé pour les dosages chromatographiques.
a)_ Préparation de l'échantillon
DOSAGE DU LACTATE
La premiére opération est une méthylation:
- 0,5 ml de l'échantillon
- 0,5 ml de l'étalon interne (isobutyrate 300,15 mM)
- 2 ml de methanol
- 0,4 ml d'acide sulfurique à 50%
On agite, puis on porte au bain-marie à 50 oC pendant 30
mn et on laisse refroidir. On procéde ensuite à l'extraction
du lactate méthylé:
- 1 ml d'eau distillée
- 0,5 ml de chloroforme
On injecte 1 ~l de cette solution dans la colonne de
neopentyl glycol adipate
21
DOSAGE DE L'ACETATE
- 0,5 ml de l'êchantillon
- 0,5 ml d'~talon interne (butyrate 24,35 mM + 180,41 mM
acide orthophosphorique)
On injecte 1 III de la solution dans la colonne de
neopentyl glycol adipate.
DOSAGE DE L'ETHANOL
- 0,5 ml de l'~chantillon
- 0,5 ml d'êtalon interne(60,35 ml de propanol-1)
Pour chacun des produits une gamme étalon est faite pour
êtablir une relation entre surface de pics et concentrations.
L'êtalon interne permet de corriger les légères
variations dans le volume injectê.
b)_ Conditions opératoires fixées
- tempêrature de l'injecteur 250 oC
- tempêrature du détecteur 250 oC
- température du four 170 oC
Colonne neopentyl glycol adipatez
- Pression azote 1,8 bar
- D~bit air 180 ml/h
- Dêbit hydrogène 25 ml/h
Colonne Porapack
- Pression azote
- Dêbit air
- dêbit hydrogène 75
1,2 bar
480 ml/h
ml/h
4.3.2 DOSAGE ENZYMATIQUE
Le principe de ce dosage est le suivant:
Le D-Glucose est phosphorylê en glucose-6-phosphate en
prêsence d'hexokinase(HK) et d'ATP avec formation simultanêe
d'ADP
D-Glucose +H.K
-----I~... Glucose-6-P + ADP
22
En présence de glucose-6-p déshydrogénase(G 6 P-DH), le
G6P est oxydé par du NADP en Gluconate-6-p avec formation de
NADPH,H+.
+'G-6-P + NADP
G6P-DH------1....~ Gluconate-6-P + NADPIl,II+
On utilise les Kits Boehringer-Mannheim (cat. n° 716 251)
qui permettent de doser 4 ~g à 50 ~g de D-Glucose à 340 nm
après lecture de la DO au spectromètre uv.
La formule générale de calcul des concentrations pour ce
type de dosage esta
c = v . PM. DOE • d • v. 1000
Oùa
- C =
v =PM =E =
concentration de la substance testée (g/l)
volume final (ml)
poids moléculaire de la substance testée (g/mol)coefficient d'absorption du NADH (6,3 l.mmol- 1 •
cm-1 à 340nm)
- d = chemin optique (cm)
- v = volume de l'échantillon (ml)
- Si l'échantillon est dilUé, le résultat est multiplié
par un facteur de dilution F.
23
5 DETERMINATION DES PARAMETRES ETUDIES
5.1 PARAMETRES DE LA CROISSANCE
Vitesse spécifique de croissance(p)
Le taux (ou vitesse) spécifique de croissance, ~, est pardéfinition la quantité de poids sec for~e par mg de cellules
par heure (mg/mg poids sec par h ou h-l). On obtient ~ par la
relation suivantes
Il =
Lorsque la fermentation est en régime permanent et
stabilisé (conditions réunies lors des mesures) ~ estidentique à 0 le taux de dilution (rapport entre le débit
entrant et le volume utile). C'est donc invariablement que
l'on utilise l'un ou l'autre paramétre.(22, 24, 30, 35)
5.2 PARAMETRES DU METABOLISME
Une grande partie du substrat utilisé sera métabolisée.
La valeur du substrat métabolisé (ds/dt métabolisé) est
donnée pars
ds/d~ m'~. - ~ (Si - Sr)
Où Si, Sr sont les valeurs des substrats initial et
résiduel
Une fois métabolisé le substrat sera trans formé en
biomasse, produits, et en énergie de maintenance.
5 • 2 • 1 BIOMASSE
Le rendement théorique de la biomasse Yx/s est obtenu en
faisant le rapport entre les dérivées de la biomasse et du
substrat considéré (glucose ou nutriments azotés).
Yx/s - dx/ds
24
Ceci donne dans la pratique 1
Yx/s - X/Si-Sr
Ce paramètre exprime la masse de cellules obtenue par
mole (glucose) ou par g (AZT) de substrat considéré.
On peut aussi exprimer à partir de cette équation le taux
spécifique de consommation du substrat qs:
qs - ~ / Yx/s
5.2.2 MAINTENANCE
L'énergie de maintenance par mole de glucose consommé est
obtenue en utilisant l'équation de Pirt (1965):
l/Yx/s - ~~ + l/YO (1)
où ma est le coefficient de maintenance, YG le rendement
maximal de la croissance
L'équation (1) peut être transformée comme suit:
(2)
En traçant la courbe qs en fonction de ~ on détermine mG
par extrapolation à ~ =0 • YG est aussi obtenu graphiquement.
5.2.3 PRODUITS
On exprime les rendements des produits en fonction de la
biomasse (Yp/x), et en fonction du substrat (Yp/s)
Yp/x - p /X
Avec P concentration du produit en g/l, et X est la
biomasse exprimée en g/l. De cette équation on déduit la
productivité en métabolite:
qp - ~/Yp/x
25
Le rendement en produit est alors le rapport entre le
taux de production (productivité) du métabolite et le taux de
consommation du substrats
Yp/s - qp/qs
_ Le rapport molaire en produit est le quotient de la
concentration en lactate sur la somme des concentrations
d'acétate et éthanol (lactate/ éthanol + acétate). Ce rapport
permet de suivre l'évolution du métabolisme du glucose.
Les voies métaboliques de la dégradation du glucose
peuvent être définies avec le calcul du pourcentage de
conversion du glucose en lactates% conversion G ----->L = L/Glc • 100
L et Glc correspondent aux concentrations respectives du
lactate et du glucose consommé.
_ Le pourcentage de recouvrement en carbone (% C)des
produits du métabolisme sur le glucose traduit l'orientation
du métabolisme glucidique; il permet de confirmer si tout le
glucose a été utilisé pour l'élaboration de certains produits
du métabolisme.
%C _ (nL. L) + (nA. A) + (nE. TI)
nG. G
Avec L, A, E et G concentrations respectives de lactate,
acétate, éthanol, et glucose. Les coefficients nX
représentent le nombre de carbone par mole du produit
considéré. Il est exprimé pars
nX - 12 CI... / PMx
12 =poids molaire du carboneC/m =nombre d'atomes de carbone par molécule
PMx =poids moléculaire du produit X.
26
5 .3 PARAMETRES ENERGETIQUES
L'énergie issue du catabolisme du glucose est stockée
sous forme d' ATP. Le gain net d' ATP par mole de glucose
transformé en pyruvate est de 2 moles; la formation d'acétate
donne un supplément d'une mole d' ATP. Toutefois, tout le
glucose n'est pas fermenté (il sert de source de carbone et
d'énergie) et la partie dissimulée est approchée par
l'équation suivante 1 (38)
Ole. diBBimul~ - 180 -5/4Yglc
180
Par conséquent le taux spécifique de production d'ATP,
qATP, est ainsi calculé (35)1
qATP = 2qGlc (180 -S/4Yglc) + qu:é
180
En utilisant l'équation déduite de celle de Pirt commeprécedemment on obtient YATP et sa valeur maximale Ymax, ainsi
que le coefficient de maintenance pour l'ATP (mATP)1
qATP - ~/YATP - ~/Ymax + mATP
27
1 GLUCOSE LIMITANT
Le glucose est un facteur limitant pour la croissance de
L. DKP jusqu'à une concentration de 20 g/l (16). Il nous a
paru int~ressant, à une concentration moyenne de 8,2 g/l de
glucose, d'~tudier les effets de cette limitation du substrat
~nerg~tique sur L. DKP en culture continue. La variation dutaux de dilution D (de 0,18 à 1,26 h- 1 ) permettra de suivre
cet effet sur la croissance et le métabolisme fermentatif.
1.1 INFLUENCE DU TAUX DE DILUTION SUR LA
CROISSANCE
1.1.1 Evolution de la biomasse
0,6
0,5
é3'llt.O....... 0,4u
"1'~ 0,3I:l:l
0, 2 -+---r-.....__---,.-----,----,.------r---r---r--.----r-~___y-.....____i
-0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40p.(.-I)
Fig t: EvoluLion de la biomasse en fonction du taux de croissunœ
La fig. 1 permet d'appr~cier l'augmentation linéaire de
la croissance en fonction de D. La croissance se stabilise à
partir d'un taux de dilution optimum de 0,82 h- 1 • Les taux de
dilution superieurs à 1h-1 affectent la croissance de la
bact~rie.
La d~termination de la quantité maximale de biomasse
Xmax, obtenue dans ces conditions, a pu être faite en
28
considêrant les parties ascendante et stationnaire de cette
courbe. La reprêsentation en double inverse de cette branche
d'hyperbole est une droite (fig.2).
y = 1,533 + 0,41 lx R = 0,98
3,5
2,5
1,5 -t--....,..---r-~--.,r---~--r---..------.---'---,.---.
1 2 3 4 5 6 111'
Fig. 2: repr6sentation en double r6ciproque de la biomasse en fonction dc /1
L'intersection de cette droite avec l'axe des ordonnées
correspond à I/Xmax. Les rêsultats expêrimentaux obtenus
correspondent à une quantitê maximale de biomasse de 0,65
g/l.
1.1.2 Rendements de la croissance
Le rendement de la croissance YX/s, à une concentration
de glucose constante, donne en fonction de D la même allure
de courbe que la figure 11
29
70
Q
! 60
b.O
li' 50b.ODM
40
30-0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40 D(h-I)
lïg 3: Rendement de la croissance en foncl.ion du taux de dilution
La comparaison entre le rendement de la croissance (fig.
3) et l'évolution de la biomasse (fig. 1), en fonction du
taux de dilution, nous permet de conclure que les meilleurs
rendements, 64 g de biomasse par mole de glucose consooonée,
sont obtenus aux mêmes optima que la croissance. Ceçi
s'explique par l'évolution du taux de consommation spécifique
du glucose (qGlc) qui est une fonction du taux de dilution
(fig.3)
0,03y =O,(X)2 + O,016x R =0,97
1,40 D(h-I)1,200,00 +-.......,--,----,r---r--r---r--..----,---r---r-..,---,---.----,
-0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00
fig. 4: Taux de consommation du glucose ~n ronclion du Laux de dilution
30
A partir de ce graphe nous pouvons déduire le' rendementmaximal de la croissance Ya (ou rendement vrai). L'équation
modifiée de Pirt nous permet de déterminer ce rendement à
partir des
qGlc = ma + Il/Ya
et de l'équation de la droite qGlc =f(Il), où Il = 0:
qGlc =0,01611 + 0,002
La résolution de système d'équation donne une valeur de YG
égale à 62,5 g en poids sec de cellules par mole de glucose
consommée.
La quantité de glucose destinée à la maintenancecellulaire ma est obtenue à Il =0. La valeur expérimentale
obtenue sur la fig. 3 est desma = 0,002 mole de glucose par g de cellules par h.
1.2 INFLUENCE SUR LE METABOLISME FERMENTATIF
1.2.1 Formation de produits
Produits obtenus et recouvrement en carbone
Les produits attendus du métabolisme glucidique sont
principalement le lactate, mais aussi l'éthanol, l'acétate et
le formiate. Les concentrations en métabolites (éthanol,
acétate et lactate) ont pu être déterminées. Le tableau 2
traduit leur importance relative dans le milieu de culture.
31
D Produits dos's % C
Glucose Lactate Acétate Ethanol
(heure-1 ) (g/l) (g/l) (g/l) (g/l)
0,18 1,46 0,00 0,47 0,23 52
0,31 1,45 0,00 0,59 0,27 64
0,61 1,46 0,03 0,41 0,22 49
0,82 1,44 0,08 0,39 0,22 52
0,97 1,44 0,13 0,33 0,19 48
1,26 1,36 0,17 0,41 0,20 61
Tableau 2: Bilan du métabolisme glucidique et recouvrement en carbone .
La moyenne du pourcentage de recouvrement du carbone (%C)
avoisine 54,33 %. Seul un peu plus de la moitié du glucose
consommé (Glc) se retrouve dans les trois produits du
métabolisme. Ces résultats s'accordent avec le fait que le
formiate (non déterminé) lors du clivage du pyruvate est
égal, du point de vue molaire, à la somme acétate + éthanol.
A cela s'ajoute la part de carbone entrant dans l'édification
de la biomasse cellulaire.
Interconversion des voies métaboliques
La figure 5 représente l'évolution des produits de la
fermentation en fonction du taux de dilution D. Ces résultats
permettent de déterminer la voie métabolique empruntée par L.
DKP pour le métabolisme du glucose.
32
0,6
Q 0,5-lMli' 0,4's1 0,3Pot
0,2
0,1
-a- Acé.... Eth.. lac
1,40
D (h-l)
0,0 +-....,......-IIr---tl.......,=:;::::::;...-....,......---.----.-----r-r---.--~__,
-0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Fig. 5: Evolution des produits du métabolisme
Il ressort de ces résultats que les produits issus de lavoie métabolique hétérolactique, acétate et éthanol, sont
prédominants comparés au lactate (produit de l'homolactisme)
à tous les taux de dilution étudiés. Cependant on note un
accroissement progressif de la concentration en lactate de 0
g/l à 0,17 g/l corrélativement à l'augmentation du taux de
dilution, alors que l'acétate et l'éthanol connaissent une
évolution inverse avec des concentrations maximalesrespectives de 0,59 g/l et 0,27 g/l à un taux de dilution de0,3 h- 1 •
Taux de conversion et rapport molaire des produits
La détermination du pourcentage de conversion (du glucose
en lactate et en produits hétérolactiques) ainsi que celle du
rapport molaire de lactate/acétate+éthanol permettent unemeilleure connaissance des processus métaboliques:
33
D %Glc ->Lac %Glc->Bétéro Rapport molaire
.(heure-1 ) Lac/Act§ + Eth
0,18 0,00 47,9 0
0,31 0,00 59,3 0
0,61 2,10 43,2 0,03
0,82 5,6 42,4 0,08
0,97 9,0 36,1 0,15
1,26 12,5 44,9 0,16
Tableau 3: conversion du glucose et rapport molaire entre produits
L. DKP, dans les conditions de substrat énergétique
limitant, ne produit pas de lactate aux faibles taux de
dilution (0,18 h-1 et 0,31 h- 1 ); le taux de conversion du
glucose en lactate est nul. La fermentation emprunte
essentiellement la voie hétérolactique.
L'augmentation linéaire de ce taux de conversion jusqu'à
12,5 %, de même que l'accroissement du rapport molaire de 0 à
0,16 traduisent une modification du régime métabolique de
l'hétérolactisme vers l'homolactisme. Toutefois, la tendance
métabolique dominante est nettement à l' hétérolactisme
(conversion de 47,9% à 44,9%).
1.2.2 Rendements en produits
Les rendements produitsl biomasse, Yp/x, sont très
différents suivant les métabolites comme le montre le tableau
4:
34
D Y Lac Y Acé Y Et.h
(heure-1 ) (q/q) (q/q) (a/a)
0,18 0,00 1,74 0,85
0,31 0,00 1,84 0,84
0,61 0,06 0,77 0,43
0,82 0,16 0,77 0,43
0,97 0,26 0,65 0,37
1,26 0,44 l,OS 0,51
Tableau 4: Evolution des rendements en produits
- Ylact/x est globalement faible avec un maximum de
0,44g/g de cellule enregistré, au taux de dilution le plusélevé (1,26 h-1).
- Contrairement aux rendements en Ylact/x, les valeurs deYacé/x ne suivent pas de manière linéaire l'augmentation de D.
La plus grande valeur, 1,84g de lactate pour 19 de biomasse,est certes obtenue à un taux de dilution faible 0,31 h- 1 ;
mais des rendements importants 1,74 et 1,05g/g sont observésrespectivement à 0,18 h-1 et 1,26 h-1 •
- Les mêmes remarques sont valables pour Yéth/x avec
néanmoins, le meilleur rendement 0, 85g /g pour la valeurminimale de D (0,18 h-1 ).
Les rendements produits/ glucose consommé sont exprimés à
travers les pourcentages de conversion.
1.3 INFLUENCE SUR LA PRODUCTION D'ENERGIE
Taux de production d'ATP, rendement en ATP
Les valeurs de qATP (taux de production spécifique d'ATP)et YATP sont calculées à partir du taux de consommation
35
spécifique du glucose qGlc et du taux de production
spécifique ::rAcé (tab. 5 •
D qGlc qATP y ATP
(heure-1 ) (mol/q.h) (mol/q.h) (q/mol)
0,18 0,005 0,014 12,86
0,31 0,008 0,021 14,76
0,61 0,011 0,022 27,73
0,82 0,013 0,024 34,17
0,97 0,015 0,027 35,93
1,26 0,024 0,039 23,77
Tableau 5: Evolution du taux de production et du rendement en ATP
Alors que qATP varie dans le même sens que le taux de
croissance, YATP n'est pas toujours limité par p. A partir
d'un taux de dilution de 0,97 h- 1 il apparait un autre
facteur limitant comme on peut le constater sur la Fig.6.
".., 40
~i 30-•.SralM 20-
0,80 1,00 1,20 1,40p(h-l)
10 -+----.--~---r-r_-r----,......._.....-__r-~.....,...-~__r-.---...,
-0,00 0,20 0,40 0,60
Fig. 6: Rendement ATP en fonction de Jl
36
Aux plus faibles valeurs de ~ les rendements sont faibles(12,86 g en poids sec d'organismes par mole d'ATP).
Rendement maximal en ATP et énergie de maintenance
Le rendement maximal en ATP (Ymax) et le coefficient de
maintenance pour l'ATP sont calculés à partir des résultatsexpérimentaux.
0,06:a- y =0,007 + 0,029x R =0,88
I!I.0,05
SI.S 0,04•.,-~
0,03
.. 0,02li
0,01-~ 0,00;,1
-0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
Fig.?: qATP en fonction de JlJl(h-l)
La fonction qATP = f (~) permet de tirer l'équation de ladroite suivante:
y = 0,007 + 0,029x
Cette équation de la forme:
qATP = mATP + ~/Ymax
Nous donne par sa résolution mATP = 0, 007mol ATP / gbiom.h, et Ymax = 34,48 g de biomasse par mole d'ATP.
La valeur maximale theorique de 35,96 g/mol ATP n'est pas
atteinte, 0,007mole d'ATP étant utilisée pour la maintenance
cellulaire.
37
2 AZOTE LIMITANT
La concentration de 3,5g/l en azote est limitante pour lacroissance dans les cultures en batch (10). Nous avons alorsessayé, à partir de charges azotées variant entre 0,43g/l et
8, 19/1, de voir l'influence de cette limitation sur lemétabolisme de L. DKP et sur sa croissance dans un chemostat.
Pour cela nous avons fait varier le taux de dilution de 0,16h-1 à 1,05 h-1•
2.1 ETUDE DE LA CROISSANCE
2.1.1 Production de biomasse
La production de biomasse en fonction du taux de dilution
et de la concentration en matières azotées est donnée par la
figure 8.
1,50
1,25
C-1,00-b.O....... 0,75lI:I
tata 0,50<:E:0 0,25....= 0,00
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
1,02
7,0 8,0 AZT (g/l)
Fig. 8: Evolution de la biomasse en fonction de AIT et de D
Ce graphe permet de faire les observations suivantes:
- AZT est limitante pour la croissance à faibles
concentrations (de 0,43 g/l à 3,61 g/l). En effet pour les
concentrations inférieures à 3,61g/l on note une augmentation
linéaire de la biomasse avec la charge azotée. Au delà cet
effet s'atténue puis disparait, laissant apparaître une
38
croissance limite Xmax pour chaque valeur de D étudiée (à
1,02 h-1 on note une valeur de xmax égale à 0,65g/1).
- Le taux de dilution influe également sur la croissance
du microorganisme. L'augmentation de D a pour effet de
diminuer la production de la biomasse avec comme conséquence
des valeurs de Xmax faibles. La détermination puis la
comparaison entre ces valeurs permet de mieux apprécier les
variations de la croissance cellulaire.
Xmax à 0,16 h- 1 peut être déterminée par la
représentation en double inverse de la biomasse en fonction
de la charge azotée.
y = 0 /226 + 0/976x R = 1,003,0
2,5
l>4 2,0-...1,5
1,0
0,5
0,00,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 lIAZT
F~. 9: Représenafunendouble inveœ de X=f(A21) à 0 ,16 h-l
On a une relation de type l/X = 0,226 + 0,976/AZT.
L'intersection de cette droite avec l'axe des ordonnées
donne l'inverse de la croissance maximale, d'où Xmax = 4,42
g/l.
La diminution du taux de dilution de 1,02' h- 1 à 0,16 h- 1
accroît de 6,8 fois la production maximale de biomasse.
2.1.2 Rendements de la croissance
Le graphe 10 exprime le rendement de la croissance
(AZT/X) en fonction de D.
39
12
10
4
2
0,800,600,400,20 1,00D(h-l)
Fig. 10: Rendement (AZT/X) en fonction du taux de dilution
O+---r----.--"""T'"---T'----r----.---,r---~-.....___.
0,00
Les meilleurs rendements (les plus faibles rapports
AZT!X) sont obtenus aux plus faibles taux de dilution. A une
valeur de D égale à 0,16 h- l il faut 1, 06g d' AZT pour
produire 1 9 de biomasse. Ce rendement diminue ensuite de
manière exponentielle puisqu'il faut 10,2 9 de AZT pour
obtenir 19 de biomasse à un taux de dilution de 0,8 h- l •
2.2 ETUDE DU METABOLISME GLUCIDIQUE
2.2.1 Les produits obtenus
Les concentrations en lactate, acétate et ethanol ont été
déterminées en fonction de la charge azotée. On note des
variations quantitatives de ces produits à D = 0,16 h- 1 (tab.
5) •
AZT Lact. Acé. Eth. Rapport
{CTI1 } {CTIl} {CTIl} {CTIl} Lact/Acé+Eth
0,43 1,86 0,42 0,28 2,65:1
0,50 2,81 0,48 0,34 3,43:1
0,71 3,77 0,68 0,60 2,94:1
1,67 7,82 1,78 1,49 2,39:1
2,51 9,64 2,32 2,14 2,16:1
Tableau 6: Evolution des produits du métabolisme en fonction de AZT à
D = O,16h-1
40
On constate une augmentation de tous les produits du
métabolisme avec la charge azotée. Notons aussi les quantités
de produits relativement plus importantes pour les charges
azotées de 1,67g/1 et 2,51g/l. Le lactate est cependant plus
important que les autres métabolites comme l'indique le
rapport molaire. La même évolution par rapport à AZT est
constatée pour toutes les valeurs de D étudiées; à D=1,02 h- l
on obtient les valeurs du tableau 7.
AZT Lact. Acé. Eth. Rapport
(qll) (qll) (qll) (qll) Lact/Acé+Eth
1,10 0,11 0,11 0,08 0,57:1
1,47 0,20 0,12 0,04 1,25:1
2,56 0,28 0,21 0,07 1,00:1
2,73 0,34 0,23 0,10 1,03:1
3,61 0,51 0,27 0,16 1,19:1
5,44 0,61 0,41 0,23 0,95:1
Tableau 7: Evolution des produits du métabolisme en fonction de
AZT à D = 1,02 h- 1
Même si tous les produits du métabolisme s'accumulent
comme on peut le constater dans le tableau 7, les
concentrations obtenues sont toutefois plus faibles. Le
rapport entre le lactate et les autres métabolites varie
également d'une concentration en AZT à l'autre.
Le taux de dilution (Tab. 8) induit une variation des
métabolites dans le même sens que l'AZT.
D Lact. Acé. Eth. Rapport
(h-l) (qll) (qll) (qll) Lact/Acé+Eth
0,16 2,81 0,48 0,34 3,43:1
0,53 0,22 0,14 0,07 1,05:1
0,66 0,10 0,09 0,04 0,77:1
0.80 0,06 0.07 0.02 0,67:1
Tableau 8: Evolution des métabolites en fonction de D à 0,59 AZT
41
Ce tableau montre que pour une charge azotée fixe
(O,5g/1) on a:
- Une variation importante des produits, inversement
proportionnelle au taux de dilution. De 0,16 h- 1 à 0,8 h- 1
les concentrations en lactate, acétate et ethanol diminuent
46,8 fois; 6,8 fois et 17 fois, respectivement.
- Le rapport molaire du lactate sur les autres produits
diminue également passant de 3,4 pour 0,16 h- 1 à 0,7 pour 0,8
h- 1 • La variation de ce dernier facteur nous amène à poser
l 'hypothèse d'un changement dans la voie métabolique du
glucose.
2.2.2 Changement de voie métabolique
Le recouvrement en carbone et les pourcentages de
conversion, en fonction des concentrations en AZT et du taux
de dilution (Tab. 9 et 10) témoignent de ce changement de
voie métabolique.
AZT Glc %G-->L %G-->H %C
(q/l) (q/l)
0,54 5,94 32,10 16,84 50,70
1,67 18,36 42,60 17,81 62,43
2,51 17,10 56,40 26,05 85,58
Tableau 9: Evolution des taux de conversion en lactate (%G-->L) et produits
h~t~rolactiques (%G-->B), et du recouvrement en C en fonction de AZT à
0,16 h-1. Glc= glucose consomm~
A un faible taux de dilution (0,16 h- l ) la tendance est
plutôt à l'homolactisme; le taux de conversion en lactate
étant superieur à celui en produits hétérolactiques. La
variation de AZT n'intervient pas dans l'interconversion des
voies métaboliques puisque la tendance est maintenue:
- 32,1% G --> L contre 16,84% G --> H à 0,5g/1 AZT
- 56,4% G --> L contre 26,05% G --> H à 2,51 g/l AZT
Le taux de recouvrement en carbone montre que
l'utilisation du glucose pour la synthèse des trois
métabolites (acétate, lactate, éthanol) dépend de la charge
42
peuvent être faites pour le %C à
de glucose transformée en
n'est importante qu'à partir de
azotée. A une faible concentration AZT, 49,3% du glucose
consommé ne se retrouvent pas dans le lactate, l'acétate et
l'ethanol. A 2,51 g/l de AZT, cette valeur passe à moins de
15%.
AZT Glc %G-->L %G-->H %C
(qll) (qll)
1,10 5,94 1,90 3,22 5,47
1,47 4,78 4,30 3,40 7,87
2,56 5,40 5,20 5,74 Il,39
2,73 6,12 5,60 5,41 Il,39
3,61 1,42 35,90 30,28 69,01
5,44 1,43 42,70 47,55 90,73
Tableau 10: Evolution des taux de conversion en lactate (%G-->L) et
produits hétérolactiques (%G-->8), et du recouvrement en C en fonction
de AZT à 1,02 h-1. Glc c glucose consommé
Les mêmes observations
1,02 h- 1 • La quantité
ethanol,acétate et lactate
3,61 g/l de AZT.
Le métabolisme devient hétérolactique pour cette valeur
du taux de dilution, puisque le %G --> H est superieur ou
sensiblement égal à %G -->L quelle que soit la charge azotée.
2.2.3 Rendements en produits
A partir d'une charge azotée faible (limitante) de 0,5g/l
nous avons suivi l'évolution des rendements produits/biomasse
en fonction du taux de dilution (Fig. Il).
43
6
5~-~ 4
~
; 3;~
21~
~1
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 D (h-l)
Fig. Il: Rendement lactate/biomasse en fonction de D à 0,51 gll AIT
Les meilleurs rendements en acide lactique sont obtenus
aux faibles valeurs du taux de dilution; 19 de biomasse
produit 6 g de lactate à 0,16 h-1• Ce rendement chute ensuite
pour devenir à 0,8 h- 1 égal à 1,2 g de lactate par g de
biomasse.
L'écart entre les meilleurs rendements et les plus
faibles (5 fois plus) rendent compte de la transition de
l'homolactisme vers l'hétérolactisme.
Les rendements des autres
différemment (Fig. 12).
44
métabolites évoluent
1,35 -a- Acé/X 0,75-+- Eth/X
es 1,25 0,65 ~-iD a~ ~
1,1 5 D,55
1,05 0,45
0,95 -t-----.--.--,.----r-~___y-_.__-._____r_-+0,35
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 l,DOD (h-l)
Fig. 12: rendements en acétate(Ace/X) et éthanol(Eth/X) en fonction de D à SOg/l AZT
Alors que le rendement éthanol varie avec D, celui de
l'acétate varie en sens inverse; L'acétate est synthétisé
prioritairement à faible taux de dilution. L'allure du graphe
permet de conclure que la somme de ces produits
hétérolactiques donne un rendement globalement constant.
2.3 PARAMETRES ENERGETIQUES
Au regard de la consommation du glucose nous avons
calculé, de la même manière que pour le glucose limitant, le
taux de production et le rendement en ATP.
La variation de ces paramètres en fonction de la charge
azotée est donnée à faibles taux de dilution (0,16 h- 1 et
0,53 h- 1 )par le tableau Il.
45
AZT y ATP
0,54 0,015 0,032 5,00
1,67 0,013 0,028 6,07
2,51 0,012 0,027 6,67
0,53 h- 1
0,73 0,060 0,120 4,42
1,77 0,032 0,062 8,55
2,67 0,020 0,042 12,62
Tableau Il: Evolution des paramètres énergétiques à faibles
taux de dilution (0,16 h-1 et 0,53 h- 1 )
Alors que les taux de consommation spécifique du glucose
(qGlc) et de production spécifique d'ATP (qATP) évoluent à
l'inverse de la charge azotée, le rendement en ATP varie avec
AZT. On note la diminution de YATP avec le taux de dilution
pour les faibles charges azotées:
- Le rendement est de 5g de biomasse/mole d'ATP à 0,16 h
l pour 0,54g/1 AZT
- Pour une valeur supérieure en AZT (0,73g/l) on obtient
à 0,53 h- l un rendement en ATP de 4,42g/mole.
Cette tendance se maintient puisque pour un taux de
dilution de 1,02 h- l (Tab.12) le rendement à 1,10g/1 AZT
n'est que de 2,12g de cellules/mole d'ATP.
AZT qGlc qATP y ATP
(qll) (mollq.h) (mollq.h) (qlmol)
1,10 0,236 0,471 2,12
1,47 0,125 0,246 4,15
2,56 0,088 0,172 5,93
2,73 0,078 0,151 6,89
3,61 0,013 0,020 48,50
5,44 0,012 0,021 50,00
Tableau 12: Evolution des paramètres énergétiques à 1,02 h-1 •
Ce tableau montre surtout l'évolution des paramètres
énergétiques en fonction de la charge azotée. Elle est
46
identique à celle des faibles valeurs de D lorsque la
concentration en substances azotées est encore limitante.Lorsque AZT atteint la concentration de 3,61g/l, YATP devient
relativement important, 50g de biomasse/mole d'ATP.La production d'ATP évolue inversement au rendement d'ATP
(Fig. 13).
- Aux plus faibles charges azotées on a une production
maximale d'ATP alors que le rendement biomasse/mole d'ATP estrelativement faible.
...... 60 0,50
~-a- yATP a.
50 ..... qATP b.O0,40 -10"4
~i 40il 0,30 .....51 30 ~,0
0,20 -lM
~-20
~ 0,10 11:I'10
~
0 0,001 2 3 4 5 6
AZT(c l1)
Fig. 13: Evolution comparée de qATP et de Y ATP en fonction de AZT
- Lorsque le substrat azoté n'est plus en concentrations
limitantes pour la croissance, la production et le rendement
en ATP tendent à devenir constants.
47
v. DISCUSSION
1 GLUCOSE LIMITANT
Lorsque la source d'énergie et de carbone est en
concentrations limitantes pour la croissance de Lactobacillus
DKP, le taux de dilution D apparaît comme un facteur pouvant
contrôler l'accroissement de la biomasse.
Il ressort de nos résultats que le taux de dilution (qui
est identique au taux de croissance en régime de culture
stabilisé et permanent) est limitant pour la croissance entre
les valeurs 0,16 h- 1 et 0,6 h- 1 (Fig. 1). Au delà, le taux de
croissance est plus faible, tendant à se stabiliser entre 0,8
h- 1 et 1 h- 1 • L'équation des inverses de la biomasse et du
taux de dilution a permis d'estimer une valeur maximale
théorique de la croissance; Xmax = 0,65g/1 de biomasse.
Au delà de 1 h-1 il apparait un autre facteur limitant de
la croissance cellulaire dans le fermenteur. L'influence de
cette nouvelle limitation est notable sur le rendement
biomasse sur glucose consommé Yglc qui, une fois la valeur
maximale de 64 g de biomasse par mole de glucose atteinte à 1
h- 1 , chute progressivement. Toutefois elle n'affecte pas le
taux de consommation spécifique du glucose, qGlc, qui
augmente proportionnellement à D à toutes les valeurs
étudiées.
Ce taux de consommation a, en outre, permis de déterminer
avec l' ~quation de Pirt le rendement maximal réel de la
croissance. Ce rendement dit "vrai" (30) à une valeur de
64,5g/mole. Le coefficient de maintenance pour le glucose (fiG)
a pu être également déterminé, sa valeur est de 0,002 mole de
glucose par gramme de biomasse et par heure. Cette valeur
négligeable du taux de glucose utilisé pour la maintenance
cellulaire et autres fonctions non anaboliques, en culture
continue, confirme les résultats de Major et coll. (21) pour
L. delbrueckii (fiG = -0,03g/mole).
48
Les produits majoritaires du métabolisme du glucose chez
L. DKP sont en cultures discontinues le lactate, l'acétate,
l'éthanol et le formiate (10). La détermination de la
concentration des trois premiers en cultures continues a
permis d'évaluer le recouvrement en carbone: 54 %; le
formiate (non déterminé) représentant du point de vue molaire
la somme acétate + éthanol (schéma 2).
On note une prépondérance de la voie hétérolactique sur
l'homolactisme, avec des concentrations en éthanol et acétate
supérieures aux quantités de lactate obtenues à toutes les
valeurs de D étudiées. Aux faibles taux de dilution notamment
(0,16 h- 1 et 0,31 h-1 ), on ne note pas de production d'acide
lactique. Toutefois la tendance à l'homolactisme lorsque D
augmente est notable; puisque le taux de conversion du
glucose en lactate varie de 0 à 12,5%. Le rapport molaire
(Lactate/ Acétate + Ethanol) varie également de 0 et 0,16.
L'action du taux de dilution sur la disponibilité en
substrat expliquerait les faibles quan:tités de lactate
obtenues. Ainsi à faible taux de dilution la culture, déja
limitée en glucose, se trouve en état de restriction
énergétique. Les voies métaboliques produisant plus d'ATP
sont privilégiées. La voie homolactique ne fournissant que 2
moles d' ATP par mole de glucose consommée, alors que la
formation d'acétate par hétérolactisme génère Imole d'ATP
supplémentaire, on comprend dès lors la prédominance de la
voie hétérolactique dans de telle conditions de culture.
Du point de vue énergétique le taux de production
spécifique d'ATP, qATP, continue d'augmenter avec le taux de
croissance lorsque le rendement YATP s'abaisse à un taux de
croissance égal à 1 h- 1 • Ce résultat indique qu'à partir de
cette valeur il y a dissociation entre production d'énergie
par voie catabolique et l'utilisation de cette énergie pour
les réactions de biosynthèse (anabolisme) • C'est le
découplage énergétique que plusieurs auteurs ont observé chez
des bactéries (22, 34, 45).
49
A partir du taux de production d'ATP nous avons déterminé
le coefficient de maintenance pour l'énergie chez L. DKP:
mATP = 0,007mol ATP/g biom • h
Le rendement maximal de la croissance pour l' ATP est par
conséquent déduit du taux de croissance ~ et du coefficient
de maintenance.
Ymax = 34,5 moles d'ATP/g de biomasse
Ce rendement énergétique est relativement important
comparé aux 25, 4g/mol obtenus pour Aerobacter aerogenes
(35),ou aux 24,3g/mol trouvés avec Lactobacillus casei (9).
L'énergie produite après découplage est orientée vers des
réactions de "déversement énergétique" (energy spilling
reactions) , (22, 45). Parmi celles-çi on peut citer 1 a
formation de produits de stockage d'énergie tels que les
polysaccharides. Ce phénomène expliquerait l'aspect visqueux
et trouble observé dans nos cultures à très forts taux de
dilution. Cet aspect de la culture, caractérisé par des amas
cellulaires importants allant jusqu'à la formation de"billes" (1mm <il), n'a pas permis d'évaluer le taux de
croissance aux valeurs supérieures à 1,26 h- 1 •
2- AZOTE LIMITANT
Une double limitation s'exerce sur la croissance de L.
DKP dans les conditions de nos cultures:
- Limitation par la charge azotée identique à celle
observée dans les batch (10). Pour des concentrations en AZT
inférieures à 3,5g/l l'augmentation de biomasse est
proportionnelle à celle de AZT. Au delà, il apparaît une
limitation qui serait liée à un autre nutriment tel que les
oligoéléments.
-Limitation par le taux de dilution à toutes les valeurs
étudiées (de 0,16 h- 1 à 1,26 h- 1). La biomasse s'accroît
substantiellement avec l'élevation de D. La biomasse
maximale, Xmax, la plus importante est alors de 4,42g/l et
est obtenue à 0,16 h-1 •
50
Le rendement AZT/biomasse évolue avec le taux de
dilution. Les meilleurs rendements sont enregistrés à faibles
valeurs de D où seulement 1,06 g AZT produisent 19 de
biomasse.
Ces deux facteurs limitants ont une action double.
A toutes les valeurs du taux de dilution étudiées les
quantités de métabolites augmentent avec AZT jusqu'au delà de
3,5 g/l, concentration limitante pour la croissance. Par
contre l'augmentation du taux de dilution diminue les
concentrations en métabolites (Tab. 5 et 6) et par conséquent
les rendements Produits/Biomasse (Fig. Il).
Elle provoque également une modification de la voie
métabolique. Pour une valeur moyenne de 2,55 g d'AZT et à untaux de dilution de 0,16 h- 1 on enregistre un taux de
conversion du glucose en lactate de 56,4%. Ce taux devient
égal à 5,2% à D = 1,02 h- 1 • Ainsi donc on note une nette
évolution du métabolisme vers l'hétérolactisme en augmentant
le taux de dilution.
Les concentrations élevées en substrat azoté favorisent
outre la formation de lactate, d'acétate, et d'éthanol, celle
d'autres métabolites. Cet effet est beaucoup plus marqué aux
forts taux de dilution (1,01 h-1 ) puisque pour 1,1 g/l d'AZT
seuls 5,47% du carbone se retrouvent dans les produits du
métabolisme (acétate, éthanol et lactate; formiate N.D).
Lorsque la concentration en AZT atteint 5,44 g/l on retrouve
jusqu'à 90,73% du carbone dans le lactate, l'éthanol et
l'acétate.
Différents auteurs (35, 45) s'accordent pour dire que du
point de vue des paramètres énergétiques, l'équation de Pirt,
adéquate pour les cultures où la source d'énergie est
limitante n'est plus valable lorsque celle-çi est en
concentration suffisante. De ce fait nous n'avons pu
déterminer Ymax et mATP. Toutefois nous avons observé que le
taux de production spécifique d'ATP, qATP, diminue de manière
51
inverse à
dilution.
rendement
1,02 h- 1 •
la charge azotée alors qu'il croît avec le taux de
Pour une valeur moyenne de 2,55 g/l d' AZT le
YATP augmente de 0,16 h- 1 à 0,53 h- 1 puis décroît à
Dans les conditions de substances azotées limitantes
l'évolution de ces deux paramètres traduit l'absence de
régulation entre la production d'énergie par catabolisme et
son utilisation pour l'anabolisme. En d'autres termes on note
l'apparition du phénomène de découplage énergétique.
S2
VI. CONCLUSION
Nous avons au cours de ce travail pu étudier l'influence
des concentrations limitantes en glucose et source d'azote
sur la croissance et le métabolisme glucidique de
Lactobacillus DKP.
Nos résultats montrent, dans le cas de limitation en
substrat énergétique, que toute augmentation du taux dedilution (D) jusqu'à 0,6 h- 1 contribue à accroître la
quantité de biomasse.
Au delà de cette valeur nous avons noté l'influence d'un
autre facteur limitant de la croissance qui pourrait être
attribué à un nutriment présent en quantité moindre mais dont
la nature reste à déterminer.
La variation du taux de dilution induit des changements
dans le métabolisme glucidique en l'orientant
préférentiellement vers la voie hétérolactique. Nous avons pu
noter une légère tendance à l'homolactisme aux forts taux de
dilution.
Les constantes de la croissance (Xmax, III<;) et du
métabolisme énergétique (mATP, Ymax), ont pu également être
déterminées.
Aux forts taux de dilution, alors qu'on observe un arrêt
ou une diminution de la croissance, la production d'énergie
se poursuit traduisant le phénomène de découplage
énergétique. Ce surplus d'énergie est dispersé par "energy
spilling" ou stocké dans la formation de produits.
L'aspect visqueux des milieux de culture fermentés aux
forts taux de dilution (D= 1,5 h- 1) pourrait être attribué à
la présence de mucopolysaccharides qu'il serait intéressant
d'identifier.
Par ailleurs nous avons pu au cours de notre étude
montrer que la charge azotée est un facteur limitant au même
titre que le taux de dilution sur la croissance de L. DKP.
S3
Seule la variation du taux de dilution dans les
conditions de l'expérience est responsable de l'orientation
du métabolisme vers l' homolactisme (aux faibles taux de
dilution) ou l'hétérolactisme (aux forts taux de dilution).
Les faibles quantités d' AZT orientent le métabolisme
glucidique vers la formation de produits autres que
l'éthanol, l'acétate, ou surtout le lactate.
Il serait à ce titre intéressant de déterminer les
concentrations de ces produits du métabolisme et de
comprendre les mécanismes réactionnels les générant.
Enfin nous avons noté que les conditions limitantes en
azote aux forts taux de dilution induisent le découplage
énergétique.
S4
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Acidophilucin A, a new heat-labile bacteriocin produced
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VI l 1. ANNEXES
1- SOLUTION MINERALE SMY
NH4Cl
KH2P04
MgS04, 7H20
FeS04, 7H20
Solution minérale de Balch*
Solution oligo-élément~ de Balch**
'l'ween 80H20 q.s.p
30 9
20 9
5 9
50 mg
250 ml
10 ml
10 91000 ml
1.1- *Solution oligoélément de Balch (1979)
MnS04, 2H20 0,5 9MgS04, 7H20 3 9
NaCl 1 9FeS04, 7H20 0,1 9CaCl2, 6H20 0,1 9CaCl 2, 2H20 0,1 9ZnCl2 0,1 9
CUS04, 5H20 0,01 9AlK (S04)2 0,01 9
H3B03 0,01 9Na2Mo04, 2H20 0,01 9
Acide nitraloacétique 1,5 9
H20 q.s.p 1000 ml
1.2- **Solution minérale de Balch (1979)
KH2P04(NH4)2S04
NaClMgS04, 7H20
CaCl2, 2B20
H20 q.s.p
6 96 9
12 92,6 9
0,16 91000 ml
2- SOLUTION TAMPON PHOSPHATE
KH2S04
Na2HP04, 2H20
H20 q.s.p
3- SOLUTION MINERALE SMX
FeS04, 2H20
MgC12, GH20
MnC12, 2H20
CaC12, 2H20
H20 q.s.p
4- SOLUTION ACIDIFIANTE
KH2P04
H2S04 (95°/97°)
H20 q.s.p
5- SOLUTION DE DILUTION
NaCl
H20 q.s.p
Ajuster à pH 4
64
4,2 g
84 g
1000 ml
2 g
50 g
4 g
0,3 g
1000 ml
18 g
13 g
1000 ml
9 g
1000 ml
RESUME
L'influence des concentrations limitantes en glucose et ensubstrat azoté sur la croissance et le métabolisme glucidiquede Lactobacillus DKP a été étudiée en cultures continues.Lorsque le substrat énergétique est limitant pour lacroissance, on note une augmentation proportionnelle de labiomasse avec le taux de dilution. Le métabolisme est" alorspréferentiellement hétérolactique. L'élevation du taux dedilution s'accompagne d'une légère tendance à l'homolactisme,et provoque le phénomène de découplage énergétique.La croissance de L. DKP est aussi limité par les faiblesconcentrations du substrat azoté. La variation de la chargeazotée oriente dans ce cas le métabolisme glucidique vers laformation de produits autres que le lactate, l'acétate etl'éthanol. Le changement homolactisme vers hétérolactisme est,dans ces conditions, sous l'influence du taux de dilution quiinduit également un découplage énergétique pour ses valeursélevées.
