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RECONSTITUTION D'UNE UNITÉ TRANSCRIPTIONNELLE À PARTIR DU PROMOTEUR DU GÈNE DU RÉCEPTEUR AUX ŒSTROGÈNES DE

TRUITE ARC-EN-CIEL DANS LA LEVURE SACCHAROMYCES CEREVISI/E.

R. METIVIER (1), F. PETIT (2), Y. VALOTAIRE (1) et F. PAKDEL (1)

( 1 ) E q u i p e d ' E n d o c r i n o l o g i e Moléculaire d e la r e p r o d u c t i o n , U P R E S - A C N R S 6 0 2 6 , équipe associée I N R A , Université d e R e n n e s 1 , C a m p u s d e B e a u l i e u , 3 5 0 4 2 R e n n e s C e d e x , F r a n c e .

( 2 ) B a y l o r Collège o f M e d i c i n e , D e p a r t m e n t o f B i o l o g y , T e x a s Médical C e n t e r , O n e B a y l o r P l a z a , H o u s t o n , T e x a s 7 7 0 3 0 , U S A .

RÉSUMÉ

C h e z t o u s l e s o v i p a r e s , le f o i e e s t l 'un d e s p r i n c i p a u x o r g a n e s c i b l e s d e l 'oes t rad io l d o n t l ' ac t i on e s t médiée p a r u n récepteur spécifique, l 'ER. D e s études préliminaires o n t montré, à l a f o i s in vivo e t e n c u l t u r e d'hépatocytes, q u e le gène d u récepteur a u x œstrogènes d e t r u i t e a r c - e n - c i e l Oncorhynchus mykiss ( r t E R ) e s t régulé p o s i t i v e m e n t p a r l e s œstrogènes. D ' a u t r e s t r a v a u x o n t également m i s e n évidence l ' i n f l u e n c e p o s i t i v e d e f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n tissus-spécifiques s u r l ' e x p r e s s i o n d e c e gène.

A u c o u r s d e c e t r a v a i l , n o u s a v o n s étudié l'unité t r a n s c r i p t i o n n e l l e constituée d ' u n f r a g m e n t d e 0 ,2 k b d u p r o m o t e u r r t E R caractérisé a u l a b o r a t o i r e , d a n s u n o r g a n i s m e u n i c e l l u l a i r e : la l e v u r e Saccharomyces cerevisiœ. N o u s a v o n s montré q u e le r tER , l u i -même, était c a p a b l e d ' a c t i v e r c e p r o m o t e u r . D e p l u s , c o m m e d a n s d e s c e l l u l e s d e mammifères, le f a c t e u r h C o u p - T F I ( " h u m a n - r e l a t e d C h i c k e n O v a l b u m i n U p s t r e a m P r o m o t e r T r a n s c r i p t i o n F a c t o r I") e s t c a p a b l e d ' a u g m e n t e r l ' a c t i va t i on d u e a u r t E R . O n a d o n c reconstitué, d a n s le système hétérologue d e l e v u r e , u n e unité t r a n s c r i p t i o n n e l l e c o m p l e x e q u i p o u r r a i t c o n s t i t u e r u n modèle a p p l i c a b l e à l ' a n a l y s e d e différents f a c t e u r s (métaux l o u r d s , xénobiotiques, f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n ) interférant a v e c l'autorégulation d u gène r t E R .

RECONSTITUTION OF A COMPLEXTRANSCRIPTIONAL UNIT FROMTHE RAINBOW TROUT ESTROGEN RECEPTOR GENE IN YEAST SACCHAROMYCES

CEREVISI/E.

ABSTRACT

In a i l o v i p a r o u s , l i ve r c e l l s r e p r e s e n t o n e o f t h e m a i n E 2 - t a r g e t t i s s u e w h e r e e s t r o g e n r e c e p t o r ( E R ) c o n s t i t u t e s t h e m e d i a t o r o f e s t r o g e n a c t i o n . W e p r e v i o u s l y s h o w e d t h a t r a i n b o w t r o u t Oncorhynchus mykiss e s t r o g e n r e c e p t o r ( r t E R ) g e n e e x p r e s s i o n is u p -r e g u l a t e d b y e s t r o g e n s , b o t h in vivo a n d i n h e p a t o c y t e c e l l s . O t h e r w o r k s s h o w e d a p o s i t i v e i n f l u e n c e o f c e l l - s p e c i f i c f a c t o r s o n t h e t r a n s c r i p t i o n s t a t e o f t h i s g e n e .

Article available at http://www.kmae-journal.org or http://dx.doi.org/10.1051/kmae:1998029

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T h e a b s e n c e o f n u c l e a r r e c e p t o r s a n d a c o n s e r v e d t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y b e t w e e n t h e y e a s t a n d h i g h e r e u c a r y o t e s m a k e s y e a s t a v a l u a b l e S y s t e m fo r t h e détermination o f t h e f a c t o r s i m p l i c a t e d in t h e régulation o f t h e r t E R g e n e . In t h i s r e p o r t , w e a n a l y s e a 0 . 2 k b f r a g m e n t o f t h i s g e n e p r o m o t e r in t h e y e a s t Saccharomyces cerevisiae, a n d s h o w t h a t t h e s t a b l e e x p r e s s i o n o f r t E R a l l o w s a h i g h h o r m o n e - d e p e n d e n t t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v a t i o n o f t h i s p r o m o t e r . M o r e o v e r , t h e h u m a n - r e l a t e d C h i c k e n O v a l b u m i n U p s t r e a m P r o m o t e r T r a n s c r i p t i o n F a c t o r I ( h C o u p - T F I ) is a b l e , a s i n m a m m a l i a n c e l l s , t o e n h a n c e t h e a u t o r e g u l a t i o n o f t h e r t E R g e n e p r o m o t e r .

T h u s , t h i s p a p e r d e s c r i b e s t h e r e c o n s t i t u t i o n of a h o r m o n e - r e s p o n s i v e t r a n s c r i p t i o n u n i t i n y e a s t . B e c a u s e o f t h e m u l t i p l e e f f e c t s of x e n o b i o t i c s o n t h e r e p r o d u c t i v e a x i s , t h i s S y s t e m w o u l d b e a n i n t e r e s t i n g m o d e l t o b e t e s t e d fo r t h e s c r e e n i n g o f t h e e f f e c t s o f s u c h molécules o n t h e t r a n s c r i p t i o n s t a t e o f t h e r tER g e n e .

INTRODUCTION

L e s oestrogènes s o n t u n e c l a s s e d ' h o r m o n e s stéroïdes p r i n c i p a l e m e n t synthétisées p a r l e s o v a i r e s , exerçant d e s e f f e t s spécifiques s u r d e s o r g a n e s c i b l e s à proximité o u à p l u s g r a n d e d i s t a n c e d e l e u r l i e u d e sécrétion. L ' i n f l u e n c e d e c e s médiateurs a u n i v e a u d e s c e l l u l e s c i b l e s s e t r a d u i t p a r u n e m o d i f i c a t i o n d e l ' e x p r e s s i o n d e gènes d i t s h o r m o n o -dépendants. C e phénomène p a s s e p a r l' intermédiaire d ' u n récepteur spécif ique m a j o r i t a i r e m e n t localisé d a n s le n o y a u ( Y A M A M O T O , 1 9 8 5 ; P I C A R D e t Y A M A M O T O , 1 9 8 7 ) . C h e z t o u s les vertébrés, l ' oes t rad io l j o u e u n rôle c le f d a n s le contrôle d e la f o n c t i o n d e r e p r o d u c t i o n . C e c i e s t corrélé c h e z l a t ru i te a v e c l ' e x p r e s s i o n d u récepteur d a n s d e s o r g a n e s i n t e r v e n a n t d a n s la f o n c t i o n d e r e p r o d u c t i o n c o m m e le fo i e , l ' h y p o t h a l a m u s e t l ' h y p o p h y s e ( P A K D E L et al., 1 9 9 4 ; A N G L A D E et al., 1 9 9 4 ) .

C e récepteur fa i t p a r t i e d e l a s u p e r f a m i l l e d e s récepteurs nucléaires o u f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n ligand-dépendants ( E V A N S , 1988 ; B E A T O , 1 9 8 9 ) . L e m o d e d ' a c t i o n d e t o u s c e s récepteurs es t m a i n t e n a n t b i e n c o n n u et r e p o s e s u r le même p r i n c i p e : la l i a i s o n d e l ' h o r m o n e a u récepteur p r o v o q u e la dimérisation d u c o m p l e x e hormone/récepteur ( K U M A R e t C H A M B O N , 1 9 8 8 ; W A N G et al., 1 9 9 4 ) p u i s la l i a i s o n spécifique d u dimère à u n élément cis di t H R E ( " H o r m o n e R e s p o n s i v e Elément"), o u spécifiquement d a n s le c a s d u récepteur a u x œstrogènes ( E R ) à u n "Œstrogen R e s p o n s i v e Elément" ( E R E ) , présent s u r le p r o m o t e u r d e s gènes c i b l e s . Lié à s o n élément d e réponse, l 'ER i n f l u e s u r la t r a n s c r i p t i o n d e s gènes c i b l e s grâce à s e s d o m a i n e s d e t r a n s a c t i v a t i o n ( W E B S T E R et al., 1 9 8 8 ; K U M A R e t C H A M B O N , 1 9 8 8 ) qu i p e u v e n t i n t e r a g i r a v e c la m a c h i n e r i e d e t r a n s c r i p t i o n d e b a s e ( c o m p l e x e A R N polymérase II e t T F I I D constitué d u f a c t e u r T B P e t d e s T A F s ) o u b i e n a v e c d e s f a c t e u r s intermédiaires d e t r a n s c r i p t i o n , o u T I F ( B E A T O e t SÂNCHEZ-PACHECO, 1 9 9 6 ) .

U n e caractéristique d e la p l u p a r t des gènes c o d a n t p o u r les m e m b r e s d e c e t t e s u p e r f a m i l l e e s t la régulation p a r l e u r p r o d u i t protéique. C e s autorégulations p o s i t i v e s o u négatives p e u v e n t avo i r l i eu a u x n i v e a u x t r a n s c r i p t i o n n e l , p o s t - t r a n s c r i p t i o n n e l o u même p o s t - t r a d u c t i o n n e l , c e s phénomènes étant tissus-dépendants. E n e f fe t , c h e z le rat , t a n d i s q u e l e s t a u x d ' A R N m E R s o n t réduits d a n s l'utérus après t r a i t e m e n t à l 'oes t rad io l ( E 2 ) , i ls a u g m e n t e n t d a n s le f o i e ( S H U P N I K et al., 1 9 8 9 ; K O R I T N I K et al., 1 9 9 5 ) . C h e z la t r u i t e , l 'E2 i n d u i t f o r t e m e n t l ' e x p r e s s i o n d u gène d u récepteur a u x œstrogènes ( r t E R ) d ' e n v i r o n 1 0 - 1 5 f o i s d a n s le f o i e ( P A K D E L et al., 1 9 9 1 ) e t d ' e n v i r o n 2 fo is d a n s le c e r v e a u antérieur ( S A L B E R T e r al., 1 9 9 1 ) . D ' a u t r e s t r a v a u x m o n t r e n t q u e l 'E2 a u g m e n t e le n i v e a u t r a n s c r i p t i o n n e l (d'à p e u près 5 f o i s ) e t p o s t - t r a n s c r i p t i o n n e l ( d ' e n v i r o n 3 fo is ) d u gène r t E R d a n s le f o i e ( F L O U R I O T et al., 1 9 9 6 ) .

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L ' a c t i v a t i o n d e gènes œstrogène-dépendants p a r l 'ER p e u t être potentialisée p a r rétablissement d ' i n t e r a c t i o n s protéiques e n t r e l 'ER e t d ' a u t r e s f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n . C e s d e r n i e r s p e u v e n t être liés à l ' A D N s u r d e s s i t e s p r o c h e s o u d i s t a n t s d e s E R E . C ' e s t le c a s d u gène d e la vitellogénine II d u p o u l e t d o n t le p r o m o t e u r possède u n E R E c a p a b l e d ' a g i r e n s y n e r g i e a v e c u n G R E / P R E ( " G l u c o c o r t i c o i d " o u " P r o g e s t e r o n R e s p o n s i v e Elément", C A T O e f al., 1 9 8 8 ) . C ' e s t également le c a s d u gène d e la g o n a d o t r o p h i n e II ( G T H I I ) d u s a u m o n où r t E R a g i t e n s y n e r g i e a v e c le récepteur o r p h e l i n S F 1 ( " S t e r o i d o g e n i c F a c t o r 1 " , L E DRÉAN et al., 1 9 9 6 ) . D ' a u t r e s t r a v a u x o n t démontré u n e i n t e r a c t i o n d i r e c t e e n t r e la f o n c t i o n t r a n s a c t i v a t r i c e hormono-dépendante A F - 2 de l 'ER o u d ' a u t r e s récepteurs nucléaires c o m m e le récepteur a u x h o r m o n e s thyroïdiennes ( T R ) o u à l ' ac i de rétinoïque ( R A R e t R X R ) , e t u n c o a c t i v a t e u r , T I F 2 ( " T r a n s c r i p t i o n a l I n t e r m e d i a r y F a c t o r 2 " , V O E G E L et al., 1 9 9 6 ) . C e t t e i n t e r a c t i o n p r o v o q u e u n e a u g m e n t a t i o n d e l'activité A F - 2 d u récepteur. U n te l phénomène a également été observé a v e c le f a c t e u r S R C - 1 ( " S t e r o i d R e c e p t o r C o a c t i v a t o r 1"), m a i s d e manière p l u s étendue, c a r S R C - 1 s t i m u l e l'activité A F - 2 d e s E R , G R , P R , R X R e t T R ( O N A T E et al., 1 9 9 5 ) . L e f a c t e u r R I P 1 4 0 ( " R e c e p t o r - l n t e r a c t i n g P r o t e i n " ) caractérisé p a r C A V A I L L E S et al., 1 9 9 4 p e r m e t q u a n t à lu i d ' a u g m e n t e r l'activité A F - 2 d e l 'ER d a n s la l e v u r e ( J O Y E U X et al., 1 9 9 7 ) , m a i s également d e r e n d r e e f f i c a c e l a réponse a u x œstrogènes à p l u s f a i b l e c o n c e n t r a t i o n d ' E 2 .

A i n s i , s i l 'ER et , d e manière p l u s générale, l es f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n p e u v e n t réguler la t r a n s c r i p t i o n d e gènes, la présence d e c o a c t i v a t e u r s médiant l e u r s e f fe ts e s t nécessaire.

D a n s le c a s d u gène d e l a l a c t o f e r r i n e d e s o u r i s , u n e r e l a t i o n négative e n t r e le f a c t e u r d e t r a n s c r i p t i o n C o u p - T F ( " C h i c k e n o v a l b u m i n u p s t r e a m p r o m o t e r T r a n s c r i p t i o n F a c t o r 1") e t l 'ER a été montrée ( S H I G E T A et al., 1 9 9 6 ) . L e récepteur nucléaire o r p h e l i n h C o u p - T F I ( W A N G et al., 1 9 8 9 ) a p p a r t i e n t à u n e f a m i l l e d e protéines d i t e C o u p - T F d o n t l e s m e m b r e s o n t a u départ été identifiés c h e z le p o u l e t s u r le gène d e l ' o v a l o b u m i n e . C e s f a c t e u r s o n t été h a u t e m e n t conservés a u c o u r s d e l'évolution, c a r o n l e s r e t r o u v e d e la d r o s o p h i l e à l ' H o m m e a v e c p l u s d e 9 0 % d ' h o m o l o g i e , suggérant u n e g r a n d e i m p o r t a n c e d e c e s f a c t e u r s d a n s les f o n c t i o n s v i t a l e s . D ' a i l l eu r s , le " k n o c k - o u t " d u gène c o d a n t p o u r C o u p - T F I c h e z la s o u r i s e s t létal ( Q I U et al., 1 9 9 6 ) . O n a montré q u e c e s f a c t e u r s étaient impliqués d a n s d e s régulations d e p r o c e s s u s c o m m e le développement n e u r o n a l ( L U et al., 1 9 9 4 ) o u la myogenèse ( M U S C A T et al., 1 9 9 5 ) . L e s f a c t e u r s d e t y p e C o u p - T F s s o n t exprimés d a n s d e s t i s s u s c o m m e le f o i e o u le système n e r v e u x c e n t r a l ; o n l e s r e t r o u v e c h e z la t r u i t e d a n s c e s t i s s u s ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) , t o u t c o m m e le r t E R ( P A K D E L et al., 1 9 9 4 ; A N G L A D E et al., 1 9 9 4 ) . Récemment, u n e i n t e r a c t i o n p o s i t i v e e n t r e h C o u p - T F I e t le r t E R p o u r la régulation d u gène r t E R a été m i s e e n évidence p a r c o t r a n s f e c t i o n s d a n s d e s c e l l u l e s d e mammifères ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) .

L e système d e l e v u r e Saccharomyces cerevisiœ e s t u n modèle p o u r d e n o m b r e u s e s études d e génétique e t d e b i o l o g i e moléculaire. E n e f fe t , e n dépit d u fait q u e la l e v u r e s o i t u n o r g a n i s m e s e r a p p r o c h a n t d e s bactéries p a r c e r t a i n s a s p e c t s de s o n m o d e d e v i e , s o n o r g a n i s a t i o n c e l l u l a i r e ( n o y a u , m i t o c h o n d r i e s , c y t o s q u e l e t t e ) et l e s mécanismes moléculaires d e b a s e d e réplication, d e r e c o m b i n a i s o n , d e d i v i s i o n c e l l u l a i r e e t d e métabolisme s o n t caractéristiques d ' u n e u c a r y o t e . C e système possède p l u s i e u r s a v a n t a g e s :

• S. cerevisiœ possède u n développement r a p i d e et e s t cultivée c o m m e d e s bactéries e n m i l i e u s o l i d e o u l i q u i d e . L a p l u p a r t d e s t e c h n i q u e s b i o l o g i q u e s d e sélection o u b i o c h i m i q u e s développées p o u r l e s bactéries p e u v e n t être transposées à la l e v u r e .

• L e s expériences d e t r a n s f o r m a t i o n d e l e v u r e s o n t s i m p l e s à m e t t r e e n œuvre, e t p e r m e t t e n t d ' o b t e n i r d e s t r a n s f o r m a n t s s t a b l e s , c o n t r a i r e m e n t a u x systèmes m a m m a l i e n s où l ' e x p r e s s i o n d e gènes exogènes e s t le p l u s s o u v e n t t r a n s i t o i r e .

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• D e n o m b r e u x f a c t e u r s t r a n s c r i p t i o n n e l s s o n t extrêmement b i e n conservés d e p u i s la l e v u r e j u s q u ' a u x mammifères. E n e f fe t , d e s f a c t e u r s régulateurs m a m m a l i e n s t e l s q u e d e s récepteurs nucléaires p e u v e n t être r e c o n n u s p a r la m a c h i n e r i e d e t r a n s c r i p t i o n d e l e v u r e . M E T Z G E R et al. ( 1 9 8 8 ) o n t e n e f fe t reconstitué u n système œstrogéno-dépendant e n u t i l i s a n t l 'ER h u m a i n e t u n gène r a p p o r t e u r a r t i f i c ie l . L e même t y p e d'expérience a été réalisé a v e c le récepteur a u x g l u c o c o r t i c o i d e s ( S C H E N A e t Y A M A M O T O , 1 9 8 8 ) , c e l u i a u x h o r m o n e s thyroïdiennes ( O H A S H I et al., 1 9 9 1 ) , m a i s également le r t E R ( P E T I T et al., 1 9 9 5 ) . D e surcroît, l e s f a c t e u r s d e l e v u r e T F I I D o u G a l 4 s o n t c a p a b l e s d ' a c t i v e r la t r a n s c r i p t i o n d e gènes c i b l e s d a n s différentes c e l l u l e s d e mammifères ( W E B S T E R et al., 1 9 8 8 ; K A K I D A N I e t P T A S H N E , 1 9 8 8 ) .

• D a n s le c a s d e l'étude d e récepteurs nucléaires d ' e u c a r y o t e s supérieurs, la l e v u r e présente l ' a v a n t a g e d'être dépourvue d e t e l l e s protéines. Il n'y a d o n c p a s d'interférences a v e c le récepteur exogène.

C e système e u c a r y o t e s i m p l e c o n s t i t u e d o n c u n système hétérologue possédant u n e m a c h i n e r i e d e t r a n s c r i p t i o n d e b a s e et qu i p e r m e t d e s ' a f f r a n c h i r d e l ' i n f l uence d e récepteurs nucléaires et d e f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n tissus-spécifiques. O n p e u t d o n c a i n s i étudier l ' a c t i v a t i o n d ' u n p r o m o t e u r exogène pa r u n o u d e s f a c t e u r s c h o i s i s .

L e b u t d e c e t r ava i l était la r e c o n s t i t u t i o n d ' u n e unité t r a n s c r i p t i o n n e l l e œstrogéno-dépendante, le p r o m o t e u r d u gène r t E R , d a n s le système hétérologue d e l e v u r e . L e t e s t d e v a l i d a t i o n d u système r e p o s a i t s u r l ' o b t e n t i o n d ' u n e a c t i v a t i o n p a r l ' E 2 , e t éventuel lement d ' u n e f fe t coopératif e n t r e le r t E R et h C o u p - T F I ; c e q u i p e r m e t t r a i t d e c o n f i r m e r d a n s u n c o n t e x t e dépourvu d e f a c t e u r endogène la coopération observée d a n s d e s c e l l u l e s d e mammifères ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) .

MATÉRIEL ET MÉTHODES

Constructions plasmidiques

L e s méthodes utilisées relèvent d e s procédés d e c l o n a g e s t a n d a r d . L ' A D N c d u r t E R a été i n t r o d u i t ( P E T I T et al., 1 9 9 5 ) d a n s le s i te B a m H I d u v e c t e u r d ' e x p r e s s i o n d e l e v u r e Y E p u c G ( d o n d u Dr . B .S . K a t z e n e l l e n b o g e n ) , q u i e s t u n p l a s m i d e m i x t e levure/bactérie p o r t a n t u n gène d e résistance à l 'Amp i c i l l i ne , e t u n gène d e sélection p o u r le t r y p t o p h a n e (gène T R P 1 c o d a n t p o u r u n e e n z y m e d e la v o i e d e biosynthèse d u t r y p t o p h a n e ) . A f i n d ' e x p r i m e r le f a c t e u r h C o u p - T F I d a n s la l evu re , il a f a l l u s o u s - c l o n e r s o n A D N c d a n s le s i t e u n i q u e d e c l o n a g e B g l l l d u p l a s m i d e p E M B L y e 3 0 / 2 ( d o n d u Dr. J . H . C a m o n i s ) p o r t a n t u n gène d e résistance à l ' A m p i c i l l i n e , et u n gène d e sélection p o u r la l e u c i n e (gène L E U 2 c o d a n t p o u r u n e e n z y m e d e la v o i e d e biosynthèse d e la l e u c i n e ) . P o u r c e l a , n o u s d i s p o s i o n s d e l ' A D N c h C o u p - T F I d a n s le s i t e E c o R I d u p l a s m i d e p E C E ( c o n s t r u c t i o n a i m a b l e m e n t f o u r n i e p a r le Dr. M . P f a h l ) . C e p l a s m i d e possédant u n s i te B g l l l ( c o m p a t i b l e B a m H I ) e n a m o n t d u s i t e E c o R I e t u n s i t e B a m H I e n a v a l d e l ' A D N c , l ' A D N c a été s o r t i p a r u n e d o u b l e d i g e s t i o n B a m H I / B g l I I , e t i n t rodu i t d a n s le s i t e B g l l l d u v e c t e u r p E M B L .

L e p l a s m i d e r a p p o r t e u r utilisé e s t le p L G A - 1 7 8 , qu i p o r t e u n gène d e résistance à l ' A m p i c i l l i n e , e t u n gène d e sélection pou r l 'U rac i l e (gène U R A 3 ) , a i n s i q u e le gène r a p p o r t e u r L a c Z c o d a n t p o u r la 3 - G a l a c t o s i d a s e placé s o u s le contrôle d u p r o m o t e u r m i n i m a l d u gène C y c 1 ( c o d a n t p o u r u n i s o c y t o c h r o m e c d e l e v u r e ) . L e s o u s - c l o n a g e d u f r a g m e n t 0 , 2 k b d u p r o m o t e u r r t E R a été réalisé d a n s le s i t e X h o l d e c e v e c t e u r , situé e n a m o n t d u p r o m o t e u r C y c 1 . C e f r a g m e n t a été o b t e n u grâce à la t e c h n i q u e d e polymérisat ion en chaîne ( P C R ) , à l ' a ide de d e u x oligonucléotides spécifiques.

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1998) 350-351 :609-621 — 61 3 —

F i g u r e 1

C o n s t r u c t i o n p r o m o t r i c e ut i l isée e t s o n act iv i té 3 - G a l a c t o s i d a s e . A . R e p r é s e n t a t i o n s c h é m a t i q u e d u p r o m o t e u r d u g è n e r t E R . L e f r a g m e n t -247/ -40 c o n t i e n t les é l é m e n t s p r i n c i p a u x r e s p o n s a b l e s d e l 'autorégula t ion d e c e g è n e : F P 3 = s é q u e n c e d e t y p e O c t ; d e m i - E R E e t E R E .

B. L a c o n s t r u c t i o n 0,2 k b a é té insérée d a n s le s i t e d e r e s t r i c t i o n X h o l d u v e c t e u r r a p p o r t e u r p L G A - 1 7 8 s i tué d a n s le p r o m o t e u r m i n i m a l d e l ' i s o c y t o c h r o m e C q u i cont rô le l ' e x p r e s s i o n d u g è n e r a p p o r t e u r L a c Z.

C. A p r è s i n t r o d u c t i o n d a n s la l e v u r e d u v e c t e u r r a p p o r t e u r p L G A - 1 7 8 a y a n t intégré o u n o n le f r a g m e n t 0,2 k b , e t 4 h d ' i n c u b a t i o n a v e c s o i t 10 n M d ' œ s t r a d i o l s o i t d e l 'éthanol 1 0 0 % , l 'activité B-Gal a é t é d o s é e e n u t i l i s a n t d e l ' O N P G c o m m e s u b s t r a t . L e s v a l e u r s s o n t r e p r é s e n t é e s e n m o y e n n e ± S E M d e 4 e x p é r i e n c e s i n d é p e n d a n t e s .

F i g u r e 1 rS-Galactosidase a c t i v i t y o f t h e r e p o r t e r c o n s t r u c t .

A . S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e r t E R g e n e p r o m o t e r . T h e -247 / -40 f r a g m e n t i n c l u d e s t h e t h r e e e l e m e n t s i m p l i c a t e d in t h e a u t o r e g u l a t i o n o f t h i s g e n e : F P 3 a r e a r e s e m b l i n g t o a b i n d i n g - s i t e f o r a n O c t - l i k e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ; a n ERE a n d a n h a l f - E R E .

B . T h e 0.2 k b c o n s t r u c t o f t h e r t E R p r o m o t e r g e n e w a s c l o n e d i n t h e X h o l s i te o f t h e C Y C 1 p r o m o t e r o f t h e p L G A - 1 7 8 r e p o r t e r p l a s m i d .

C. Y e a s t s t r a i n i n c l u d i n g e i t h e r p L G A - 1 7 8 o r p L G A - 1 7 8 / 0 . 2 k b w a s g r o w n in t h e a b s e n c e o r p r e s e n c e o f 1 0 ' ^ M e s t r a d i o l , a n d a D - G a l a c t o s i d a s e a s s a y w a s p e r f o r m e d . V a l u e s r e p r e s e n t t h e m e a n ± S E M f o r a t l e a s t f o u r i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .

I n t r o d u c t i o n d e s c o n s t r u c t i o n s d a n s la l e v u r e

La s o u c h e d e levu re u t i l i sée es t Saccharomyces cerevisiœ B J 2 1 6 8 ( p e p 4 - 3 ,

pre 1-407, prb 1-1122, ura 3 -52 , trp 1 , Jeu 2) p r o v e n a n t d u Yeast G e n e t i c S tock Center ,

Berke ley , CA . Elle es t cu l t i vée d a n s un mi l ieu "Comp le t M in ima l D ropou t m e d i u m " (CM)

c o m p r e n a n t 0 , 1 3 % d'un m é l a n g e d 'ac ides a m i n é s ( "Dropout Powder" : A U S U B E L et al.,

1989) , sans t rp, leu ou ura à ra jouter ensu i te af in d 'assurer les sé lec t ions , 6 , 7 % d e "Yeast

N i t rogen Base " , 0 , 5 % de ( N H 4 ) 2 S 0 4 et 1 % de dex t rose .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1998) 350-351 :609-621 — 6 1 4 —

C e s c e l l u l e s s o n t transformées p a r la méthode décrite p a r A U S U B E L et al. ( 1 9 8 9 ) q u i e s t fondée s u r l ' u t i l i sa t ion d'acétate d e l i t h i um, p u i s sélectionnées p a r leu r capacité à croître e n m i l i e u C M complété o u n o n e n l euc ine o u t r y p t o p h a n e . C e t t e méthode nécessite l ' e m p l o i d ' A D N p u r , o b t e n u p a r u n e préparation Qiagen™ Midikit™.

Dosage de la B-Galactosidase

C e d o s a g e e s t effectué s e l o n la méthode décrite p a r A U S U B E L et al. e n 1 9 8 9 , après i n c u b a t i o n d e s l e v u r e s p e n d a n t 4 h à 30°C en présence d e 1 7 - 6 c e s t r a d i o l à 10"° M . L'activité B - G a l a c t o s i d a s e e s t dosée grâce à l ' emp lo i d ' O N P G (Ortho-Nitrophényl B -D -G a l a c t o p y r a n o s i d e ) : o n q u a n t i f i e e n s u i t e la f o r m a t i o n d u p r o d u i t coloré p a r spectrophotométrie à 4 2 0 n m . C e t t e activité est exprimée e n unités M i l l e r ( M I L L E R , 1 9 7 2 ) .

D a n s t o u t e s les expériences réalisées d a n s c e t r a v a i l , p o u r c h a q u e c o n d i t i o n , le d o s a g e a été réalisé 2 f o i s s u r t r o i s c l o n e s indépendants p r o v e n a n t d e 2 o u 3 t r a n s f o r m a t i o n s différentes : o n d i s p o s e d o n c p o u r c h a q u e t y p e d e t r a n s f o r m a n t d e 12 à 1 8 p o i n t s , c e c i p e r m e t t a n t d ' e x p r i m e r l es v a r i a t i o n s e n S E M .

RÉSULTATS

Le promoteur du gène rtER est inductible par l'E2 dans des levures exprimant le rtER

A f i n d'étudier l'autorégulation d u gène r t E R , s o n p r o m o t e u r a été isolé et séquence ( L E R O U X et al., 1 9 9 3 ) a v a n t d'être étudié par délétions s u c c e s s i v e s e n t r a n s f e c t i o n d a n s d e s c e l l u l e s d e mammifères. C e c i a p e r m i s de délimiter l e s séquences impliquées d a n s l'autorégulation : e l l e s s o n t i n c l u s e s d a n s u n f r a g m e n t d e 0 ,2 k b a l l a n t d e la p o s i t i o n - 4 0 à -2 4 8 ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 5 , 1 9 9 6 ; L E DRÉAN et al., 1 9 9 5 ) . D e s expériences d e p r o t e c t i o n à la D N a s e à l ' a ide d ' e x t r a i t s nucléaires d e f o i e d e t r u i t e l es o n t caractérisées c o m m e u n E R E i m p a r f a i t situé e n t r e l e s p o s i t i o n s - 8 0 e t - 6 8 ( L E DRÉAN et al., 1 9 9 5 ) , u n d e m i - E R E e n p o s i t i o n - 1 0 0 e t u n e région di te F P 3 c o n t e n a n t u n s i t e d e t y p e Octamère ( O c t ) à - 1 3 2 ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 6 ) - cf. f ig . 1 A .

L ' a p p r o c h e s u i v i e ic i e s t fondée s u r le d o s a g e d e l'activité d u gène r a p p o r t e u r Lac Z porté p a r le v e c t e u r p L G A - 1 7 8 e t m i s s o u s la dépendance t r a n s c r i p t i o n n e l l e d u f r a g m e n t 0 , 2 k b caractérisé. C e c i a été réalisé p a r l ' i nser t ion d e c e f r a g m e n t d e 0 , 2 k b d a n s le s i t e X h o l situé d a n s l e p r o m o t e u r m i n i m a l du gène d e l ' i s o c y t o c h r o m e c-1 d e l e v u r e , c o m p r e n a n t u n e T A T A - b o x e n p o s i t i o n - 5 0 (cf. f i g . 1 B ) . C e t t e c o n s t r u c t i o n a été i n t r o d u i t e d a n s l e s l e v u r e s S. cerevisiae B J - 2 1 6 8 q u i ne c o n t i e n n e n t p a s d e r t E R . Simultanément, d e s c o t r a n s f o r m a n t s e x p r i m a n t d e façon s t a b l e le r t E R ( p l a s m i d e Y E p r t E R ) e t possédant l a c o n s t r u c t i o n r a p p o r t r i c e s o n t réalisés et sélectionnés p a r l e u r a u x o t r o p h i e p o u r le t r y p t o p h a n e e t l ' u rac i le . O n m e s u r e d o n c l'éventuelle a c t i v a t i o n t r a n s c r i p t i o n n e l l e d u gène r a p p o r t e u r Lac Z p a r r t E R d a n s l e s l e v u r e s transformées, après 4 h d ' i n c u b a t i o n a v e c so i t 1 0 n M d'œstradiol s o i t d e l'éthanol (témoin). D a n s c e système reconstitué, l 'oes t rad io l pénètre d a n s l e s c e l l u l e s d e l e v u r e j u s q u ' a u n o y a u e t s e l ie a u r t E R exprimé d e façon s t a b l e grâce a u p r o m o t e u r f o r t d e l e v u r e G P D - P (Glycéraldéhyde-3-phospate déshydrogénase). C e t t e l i a i s o n p r o v o q u e la dimérisation d u c o m p l e x e Hormone/Récepteur q u i v a a l o r s s e f i xe r s u r l e s éléments d e réponse situés s u r le p r o m o t e u r exogène apporté p a r le v e c t e u r r a p p o r t e u r p L G / 0 , 2 k b . L e dimère p e u t a l o r s i n t e r a g i r a v e c l es f a c t e u r s généraux d e la t r a n s c r i p t i o n endogène d e levu re p o u r réguler l'activité t r a n s c r i p t i o n n e l l e d u gène r a p p o r t e u r L a c Z . C e c i s e t r a d u i t p a r une v a r i a t i o n d e s quantités d ' e n z y m e s B - G a l q u i e s t dosée p a r u n e méthode d e colorimétrie c l a s s i q u e e m p l o y a n t d e l ' O N P G c o m m e s u b s t r a t (cf. f i g . 2 ) .

Bull. Fr. Pêche PIscic. (1998) 350-351:609-621 — 6 1 5 —

L E V U R E Saccharomycea cerevitiae)

Xénob lo t iques

O N P G

• - G a l a c t o s e

O -nitrophénol

Figure 2 Schématisation du système de levure. Dans ce système, l'œstradiol pénètre jusque dans le noyau où il se lie au rtER exprimé de façon stable. Cette liaison provoque la dimérisation du complexe Hormone/Récepteur et sa fixation au niveau du promoteur exogène porté par le vecteur rapporteur pLGA-178. La variation de l'activité transcriptionnelle du gène rapporteur Lac Z résultante se traduit par une modulation des quantités d'enzymes f)-Gaiactosidase. Ces quantités sont dosées par une méttiode de colorimétrie classique en ajoutant de l'ONPG après perméabilisation des cellules de levure. L'action des xénoblotiques sur ce système peut donc être suivie par les variations de l'activité B-Galactosidase.

Figure 2 Schematic representation of the yeast system. As in mammalian cells, the estradiol binds a specific receptor in the nucleus, ER which is stably product thanks to the strong promoter of the YEprtER expression plasmid. Upon estrogen binding, ER dimerizes and binds to the exogen promoter brought by the pLGA-178 reporter plasmid. Thus, the activity of the Lac Z gene is modulated as the quantity of his product, the B-Galactosidase enzyme. The amount of this protein is quantified by addition of ONPG after permeabilization of the yeast cells. Xenobiotics interfering with this mechanism may thus be seen by the variations of the B-Galactosidase activity.

Les transformants n'exprimant pas de récepteurs possèdent une activité 3-Galactosidase faible, inférieure à 1 U, comme les témoins transformés par le vecteur pLGA-178 sans insert (cf. fig. 10). Ceci indique donc que les séquences portées par le promoteur ne peuvent interagir avec les facteurs de transcription endogènes de levure ou du moins pas pour induire fortement la transcription du gène se situant en aval.

Bull. Fr Pèche Piscic (1998jm•35^ : 609-621 — 616 —

0) « (0

•o ^

i l

<

6 0—1

5 0 H

4 0 H

3 0 - -J

2 0—^

I — 6 0

H 5 0

4 0

H 3 0

u <

U 2 0 «

2 5 « = 2s o ^ (B

H i o

F i g u r e 3 L e p r o m o t e u r d u g è n e r t E R e s t i n d u c t i b l e p a r l 'E2 d a n s la l e v u r e . D e s l e v u r e s B J 2 1 6 8 s o n t t r a n s f o r m é e s par la c o n s t r u c t i o n p L G A - 1 7 8 / 0 , 2 k b s e u l e o u c o t r a n s f o r m é e s a v e c le v e c t e u r d ' e x p r e s s i o n Y E p r t E R , a v a n t d 'ê t re i n c u b é e s e n p r é s e n c e o u e n a b s e n c e d 'œstrad io l . L 'act ivi té D - G a l a c t o s i d a s e résul tante e s t d o s é e a p r è s a d d i t i o n d ' O N P G . L e s v a l e u r s s o n t i n d i q u é e s e n m o y e n n e ± S E M , l ' expér ience é tant réa l isée 4 f o i s .

F i g u r e 3 r t E R g e n e p r o m o t e r i s f u n c t i o n a l i n y e a s t .

Y e a s t s t r a i n B J 2 1 6 8 w a s t r a n s f o r m e d by p L G A - 1 7 8 / 0 . 2 k b r e p o r t e r p l a s m i d a l o n e o r t o g e t h e r w i t h Y E p r t E R e x p r e s s i o n v e c t o r . Y e a s t s w e r e g r o w n o n s e l e c t i v e m e d i u m c o n t a i n i n g o r n o t 1 0 ' ^ M e s t r a d i o l . T h e B - G a l a c t o s i d a s e a s s a y w a s m e a s u r e d i n y e a s t e x t r a c t s . V a l u e s r e p r e s e n t t h e m e a n ± S E M f o r at l e a s t f o u r i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .

Le r tER p résen te une act iv i té basa le en a b s e n c e d 'œst rad io l , représen tan t 1 5 % de

l ' induct ion m a x i m a l e o b t e n u e en p r é s e n c e de l ' ho rmone (cf. f ig . 3) . En effet, on obt ient une

ac t iv i té B-Gal en p résence d 'œst rad io l de 47 Uni tés Mil ler pour le r tER.

A ins i , le f r a g m e n t de 0,2 kb du promoteur du g è n e r tER est fonc t ionne l d a n s la

levure ; il es t ac t ivé par rE2 lo rsque le r tER est exp r imé de façon s tab le .

I n f l u e n c e t r a n s c r i p t i o n n e l l e d e h C o u p - T F I

R é c e m m e n t , il a é té m o n t r é q u e le fac teur h C o u p - T F I est capab le d 'augmen te r

l ' ac t i v i t é t r a n s a c t i v a t r i c e d u r t E R d a n s d e s c e l l u l e s d e m a m m i f è r e s C H 0 - K 1

c o t r a n s f e c t é e s avec le p r o m o t e u r du g è n e r t E R ( L A Z E N N E C et al., 1997) . Af in de savoi r si

le s y s t è m e d e levure p e r m e t t a i t de retrouver c e p h é n o m è n e d a n s un c o n t e x t e d é p o u r v u

de h C o u p - T F I e n d o g è n e et d e comp lex i f i e r le s y s t è m e t ransc r i p t i onne l recons t i t ué , on a

fait exp r imer ce fac teur d a n s les ce l lu les de levure. Cec i a é té réal isé par co t rans fo rmat ion

de levures S. cerevisiœ B J 2 1 6 8 par les vecteurs pe rmet tan t l 'express ion de r tER et de

h C o u p - T F I , a ins i que par le p l a s m i d e rappor teur inc luant le f r agmen t 0,2 kb du promoteur .

Un t é m o i n s a n s vec teur d 'express ion YEpr tER a été réal isé af in d 'observer l'effet de

h C o u p - T F I seu l sur le p romoteu r .

Bull. Fr. Pêche Piscic. (1998) 350-351 ; 609-621 — 61 7 —

9 0

8 0 -

7 0 -

6 0 -

5 0 -

4 0 -

3 0 -

2 0 -

1 0 -

r t E R

p E M B L y e 3 0 / 2

h C o u p - T F I

0,2 kb-Cyc1-Lac Z.

t é m o i n

+ E2

T

9 0

1 -80

1-70 I" 1-60 1 ^ H 5 0 s ë

h 4 0 11 O *

1-30 2 -a (5

1-20 es

- 1 0

- 0

+ +

F i g u r e 4

E f f e t coopéra t i f e n t r e h C o u p - T F I e t r t E R p o u r l ' i n d u c t i o n t r a n s c r i p t i o n n e l l e d u

g è n e r t E R .

L e s l e v u r e s o n t é t é t r a n s f o r m é e s p a r le v e c t e u r r a p p o r t e u r p L G A - 1 7 8 / 0 , 2 k b e t

p a r le p l a s m i d e e x p r i m a n t r t E R e t / o u p E M B L / C o u p , a v a n t d 'être i n c u b é e s 4 h e n

p r é s e n c e o u n o n d ' œ s t r a d i o l 10 n M . L ' i n d u c t i o n t r a n s c r i p t i o n n e l l e résul tante e s t

m e s u r é e p a r d o s a g e d e l 'activité B-Gal a v e c d e l ' O N P G . U n t é m o i n e s t réal isé p a r

d o s a g e d e l 'act ivi té d u p r o m o t e u r s e u l ( t r a n s f o r m a t i o n d u v e c t e u r r a p p o r t e u r

s e u l ) , e t u n a u t r e t é m o i n e s t e f fec tué p a r c o t r a n s f o r m a t i o n d e Y E p r t E R et d e

p E M B L y e 3 0 / 2 q u i e s t le v e c t e u r d a n s l e q u e l a é té s o u s - c l o n é l ' A D N c c o d a n t p o u r

h C o u p - T F I . L e s v a l e u r s s o n t r e p r é s e n t é e s e n m o y e n n e ± S E M d e 4 e x p é r i e n c e s

i n d é p e n d a n t e s .

F i g u r e 4

h C o u p - T F I e n h a n c e s r t E R t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y in y e a s t .

Y e a s t s t r a i n B J 2 1 6 8 c o n t a i n i n g t h e p L G A - 1 7 8 / 0 . 2 k b r e p o r t e r p l a s m i d w a s

t r a n s f o r m e d w i t h Y E p r t E R , p E M B L - h C o u p - T F I o r b o t h e x p r e s s i o n v e c t o r s . A

c o n t r o l w a s p e r f o r m e d b y c o t r a n s f o r m a t i o n o f t h i s y e a s t s t r a i n w i t h Y E p r t E R

a n d p E M B L y e 3 0 / 2 , a n d a n o t h e r b y t r a n s f o r m a t i o n w i t h t h e r e p o r t e r p l a s m i d

a l o n e . T h e B - G a l a c t o s i d a s e a s s a y w a s m e a s u r e d i n y e a s t e x t r a c t s . V a l u e s

r e p r e s e n t t h e m e a n ± S E M f o r a t l e a s t f o u r i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s .

La f igure 4 m o n t r e l'effet de h C o u p - T F I c o e x p r i m é avec r tER e n p r é s e n c e ou non

d 'œst rad io l sur le vec teu r rappo r teu r p L G A - 1 7 8 / 0 , 2 kb. O n peu t obse rve r u n e augmen ta t i on

de l 'activité B-Gal de l 'ordre de 2 fo is, en p r é s e n c e de h C o u p - T F I . Par cont re , en absence

de r tER, le récep teu r nuc léa i re o rphe l in h C o u p - T F I n'est pas c a p a b l e d' induire la

t ranscr ip t ion du g è n e rappor teur .

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A f i n d e vérifier si c e t e f fe t n'était p a s u n a r t e fac t , o n a effectué u n e c o t r a n s f o r m a t i o n d e l e v u r e s p a r le v e c t e u r r a p p o r t e u r i n c l u a n t la c o n s t r u c t i o n 0 , 2 k b , le p l a s m i d e d ' e x p r e s s i o n Y E p r t E R e t le p l a s m i d e p E M B L y e 3 0 / 2 q u i e s t le v e c t e u r d ' e x p r e s s i o n utilisé p o u r e x p r i m e r le f a c t e u r h C o u p - T F I . L'activité B - G a l mesurée n e diffère p a s d e c e l l e o b t e n u e a v e c d e s l e v u r e s transformées p a r p L G A - 1 7 8 e t Y E p r t E R , c e q u i i n d i q u e q u e l 'e f fe t observé précédemment était b i e n dû à la c o e x p r e s s i o n d e r t E R e t d e h C o u p - T F I .

DISCUSSION

D a n s l e f o i e d e t r u i t e e t l e s c u l t u r e s d'hépatocytes, l ' e x p r e s s i o n d u gène r t E R e s t régulée p o s i t i v e m e n t p a r l ' oes t rad io l ( F L O U R I O T et al., 1 9 9 6 ; P A K D E L et al., 1 9 9 1 ) . U n e séquence d e 0 , 2 k b a été identifiée d a n s c e p r o m o t e u r c o m m e r e n f e r m a n t l e s p r i n c i p a u x éléments r e s p o n s a b l e s d e l'autorégulation de c e gène ( L E DRÉAN e r al., 1 9 9 5 ; L A Z E N N E C et al., 1 9 9 6 ) , le. u n E R E , u n d e m i - E R E e t u n e séquence d e t y p e O c t p o u v a n t l ie r d e s f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n p o t e n t i e l s (par e x e m p l e : C / E B P , A P - 1 o u H N F - 5 ) . A f i n d ' a n a l y s e r c e t t e unité t r a n s c r i p t i o n n e l l e hormono-dépendante, n o u s a v o n s tenté d e la r e c o n s t i t u e r d a n s u n système hétérologue d e l evu re p a r e x p r e s s i o n s t a b l e d e r t E R s e u l o u e n c o m b i n a i s o n a v e c h C O U P - T F I d a n s c e s ce l l u l es .

O n a montré q u e d a n s la l e v u r e , c o m m e d a n s l e s c e l l u l e s d e mammifères ( L A Z E N N E C er al., 1 9 9 7 ; L E DRÉAN et al., 1 9 9 5 ) , c e t t e unité t r a n s c r i p t i o n n e l l e e s t i n d u c t i b l e p a r l 'E2 e n présence d e r t E R ( f i g . 3) .

L'élément F P 3 d u p r o m o t e u r , r e s s e m b l a n t à u n e séquence d e t y p e O c t , a été caractérisé c o m m e p o u v a n t a u g m e n t e r l ' i nduc t ion d u e a u r t E R d a n s d e s c e l l u l e s M C F - 7 ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) p a r r e c r u t e m e n t d e f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n . D a n s la l e v u r e , o n a v u q u e l e s éléments d u p r o m o t e u r n ' i n t e r a g i s s e n t p a s a v e c d e s f a c t e u r s endogènes : a i n s i , d a n s l a l e v u r e , c e t élément n ' es t p a s impliqué d a n s la régulation d u p r o m o t e u r d u gène r t E R .

A i n s i , l e s f a c t e u r s généraux d e t r a n s c r i p t i o n e x i s t a n t c h e z la l e v u r e s o n t c a p a b l e s d ' a s s u r e r l a t r a n s m i s s i o n d u s i g n a l provoqué p a r la l i a i s o n d u dimère r t E R / E 2 s u r s e s éléments d e réponse situés s u r le p r o m o t e u r .

Récemment, i l a été montré q u e le f a c t e u r d e t r a n s c r i p t i o n h C o u p - T F I était c a p a b l e d ' a m p l i f i e r l'activité t r a n s c r i p t i o n n e l l e d u p r o m o t e u r d u gène r t E R e n présence d e r t E R et d'œstradiol d a n s d e s c e l l u l e s d e mammifères ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) . C e c i es t s u r p r e n a n t , c a r l es f a c t e u r s d e t y p e C o u p ont s o u v e n t été décrits c o m m e d e s répresseurs ( T R A N et al., 1 9 9 2 ; L E N G et al., 1 9 9 6 ) , leurs e f f e t s e n t a n t q u e c o a c t i v a t e u r s n'étant p a s c l a i r s a i n s i q u e l ' i m p o r t a n c e p h y s i o l o g i q u e de t e l s phénomènes.

N o u s a v o n s vérifié d a n s la l e v u r e qu i n e possède p a s d e h C o u p - T F I endogène q u ' u n t e l phénomène e x i s t e b i e n . C e phénomène e s t nommé coopération c a r la présence d e h C o u p - T F I a u g m e n t e d e d e u x f o i s l ' i nduc t ion p a r le récepteur d e la c o n s t r u c t i o n p r o m o t r i c e , t a n d i s q u e l e h C o u p - T F I s e u l n e possède p a s d'activité t r a n s c r i p t i o n n e l l e ( f i g . 4 ) . L e s s i t e s p o t e n t i e l s d e l i a i s o n d u f a c t e u r h C o u p - T F I s u r le p r o m o t e u r r t E R o n t été recherchés p a r la t e c h n i q u e d e f o o t p r i n t i n g in vitro. C e s expériences ( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) o n t p e r m i s d e m e t t r e e n évidence la f i x a t i o n d e c e f a c t e u r s u r u n élément " D i r e c t R e p e a t " ( D R ) 2 4 formé p a r l e d e m i - E R E et l e d e m i - s i t e 3 ' d e l ' E R E . h C o u p - T F I s e l ie ra i t s u r c e t élément, m a i n t e n a n t le p r o m o t e u r d a n s u n e c o n f o r m a t i o n o p t i m a l e " o u v e r t e " p e r m e t t a n t u n e m e i l l e u r e accessibilité a u r tER .

A i n s i , d e s i n t e r a c t i o n s a v e c d e s f a c t e u r s t r a n s c r i p t i o n n e l s supplémentaires t i s s u s -spécifiques c o m m e h C o u p - T F I q u i e s t coexprimé a v e c r t E R d a n s le f o i e e t le c e r v e a u

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( L A Z E N N E C et al., 1 9 9 7 ) p e r m e t t e n t d ' a u g m e n t e r e n c o r e la réponse de gènes œstrogéno-dépendants d a n s c e s t i s s u s .

C e modèle d e l e v u r e a été utilisé a f i n d e c r i b l e r u n c e r t a i n n o m b r e d e molécules douées d ' u n e f fe t antiœstrogénique o u œstrogénique ( S H I A U et al., 1 9 9 6 ) . D e s t r a v a u x récents o n t montré q u e d e s métaux l o u r d s o u d e s composés xénobiotiques ( P E T I T et al., 1 9 9 7 ) p o u v a i e n t interférer a v e c le f o n c t i o n n e m e n t d u r t E R d a n s la l e v u r e o u b i e n d a n s d e s c u l t u r e s d'hépatocytes d e t r u i t e . L a r e c o n s t i t u t i o n d ' u n système t r a n s c r i p t i o n n e l c o m p l e x e d a n s l a l e v u r e , q u i a été réalisé i c i , f o u r n i t u n t e s t a t t rac t i f p o u r a n a l y s e r l ' i n f l uence d e c e s composés s u r l'autorégulation d u gène r t E R q u i nécessite l ' i m p l i c a t i o n d e p l u s i e u r s f a c t e u r s d e t r a n s c r i p t i o n d o n t r t E R e t h C o u p - T F I . E n e f fe t , le d o s a g e d e l'activité B - G a l a c t o s i d a s e o b t e n u e d a n s c e système après i n c u b a t i o n a v e c u n e molécule xénobiotique p e u t d o n n e r d e s i n d i c a t i o n s q u a n t a u p o u v o i r p e r t u r b a t e u r d e c e composé p o u r la régulation d u gène r t E R , e t c e c i e n présence o u n o n d ' E 2 : phénomènes d'interférence, d e s y n e r g i e , d e coopération, e t c . .

REMERCIEMENTS

N o u s s o m m e s r e c o n n a i s s a n t s a u D r B . S . K a t z e n e l l e n b o g e n ( U n i v e r s i t y of I l l i no i s , U r b a n a - C h a m p a i g n ) p o u r le d o n d u v e c t e u r d ' e x p r e s s i o n Y e p u c G e t d u v e c t e u r r a p p o r t e u r p L G A - 1 7 8 , a u D r M . P f a h l ( S i d n e y K i m m e l C a n c e r C e n t e r , L a J o l l a ) p o u r le v e c t e u r p E C E - h C o u p - T F I . N o u s r e m e r c i o n s également le D r J . H . C a m o n i s ( I N S E R M U 2 4 8 , Université P a r i s 7 , P a r i s ) p o u r le v e c t e u r d ' e x p r e s s i o n p E M B L y e 3 0 / 2 .

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