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2

Sommaire Remerciements ........................................................................................................................... 3 

Liste des abréviations ................................................................................................................. 4 

Résumé ....................................................................................................................................... 6 

I.  Introduction ......................................................................................................................... 7 

1.  Le cancer du sein ............................................................................................................. 7 

2.  NGF et ses deux récepteurs TrkA et p75NTR ................................................................... 8 

3.  NGF et cancer du sein ................................................................................................... 10 

4.  Inhibition par les kinoïdes ............................................................................................. 11 

II.  Un exemple de résultats obtenus avec la stratégie kinoïde ........................................... 14 

1.  L’immunisation IFN-K induit-elle la production d’anticorps anti‐huIFNα2b et sont-ils neutralisants ? ....................................................................................................................... 14 

2.  Y a-t-il activation de la mémoire immunitaire après immunisation IFN‐K ? .............. 15 

3.  Les anticorps induits sont-ils spécifiques de l’IFNα ? .................................................. 16 

•  huIFNα ....................................................................................................................... 16 

•  huIFNβ ....................................................................................................................... 17 

•  huIFNγ ....................................................................................................................... 17 

4.  Les anticorps induits peuvent-ils neutraliser les séra de patients atteints de SLE ? ...... 17 

5.  Conclusion ..................................................................................................................... 17 

III.  Projet de recherche ........................................................................................................ 19 

1.  Production des kinoïdes ................................................................................................ 19 

2.  Choix des peptides ........................................................................................................ 20 

3.  Immunisation des souris BALB/c ................................................................................. 21 

4.  Tests in vitro .................................................................................................................. 21 

5.  Tests in vivo ................................................................................................................... 23 

•  Xénogreffes et traitements par le kinoïde .................................................................. 23 

•  Analyse des effets des anticorps générés sur les xénogreffes ................................... 23 

IV.  Perspectives ................................................................................................................... 25 

V.  Références bibliographiques ......................................................................................... 26 

VI.  Annexes ......................................................................................................................... 29 

   

3

Remerciements 

Nous tenons tout d’abord à remercier Laurence Nieto et Rémy Poupot pour avoir

organisé et coordonné ce projet de recherche passionnant.

Nous remercions notre référent Rémy Poupot, pour nous avoir proposé un thème de

projet scientifique innovant ; en particulier, pour les échanges autour des divers aspects du

projet. Merci pour l’attention portée à nos réflexions et idées autour du projet.

Nous tenons aussi à remercier toute l’équipe pédagogique de la formation Expression

génique et protéines recombinantes pour leurs enseignements de qualité et leurs disponibilités,

et plus particulièrement Laurent Paquereau, Vincent Ecochard et Pascal Demange pour leurs

soutiens techniques et pour les réponses données à nos interrogations multiples.

Notre reconnaissance va également à Honoré Mazargui et Nathalie Doncescu de la

plate-forme de synthèse de l’IPBS ainsi qu’à Denis Hudrisier pour la pertinence de leurs

conseils.

Pour finir, nos remerciements vont aussi aux relectrices de notre rapport Loubna

Lamkharbech, Mylène Camus et Manon Durand.  

   

4

Liste des abréviations 

A549 : Cellules adénocarcinome d’épithélium pulmonaire

ATCC : American Type Culture Collection BDNF : Brain Derived Neurotrophin Factor

CRD : Cystein Rich Domain

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

EMCV : Encephalomyocarditis virus

EMEM : Eagle’s Minimal Essential Medium

ERK : Extracellular signal-regulated kinase

HER2 : Human Epidermal Growth Factor Receptor-2

hu : Humain

IFN : Interféron

IFNgf : Interféron α2b humain cross-linkés seuls

IFN-K : Kinoïde interféron α2b humain

IgG : Immunoglobuline

IL : Interleukine

IPBS : Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale

KLH : Keyhole Limpet Haemocyanin

LT : Lymphocyte T

mAb : Monoclonal Antibody

MAPK : Mitogen-activated protein kinase

MCF-7 : Michigan Cancer Foundation-7

MDBK : Madin-Darby Bovine Kidney

MTS/PMS : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)/phenazine methosulfate

NBEC : Normal Breast Epithelial Cells

NC50 : 50% de capacité de neutralisation

   

5

NF-κB : Nuclear Factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NGF : Nerve Growth Factor

NT : Neurotrophine

NTR : Neurotrophin Receptor

OPD : o-phenylènediamine dihydrochloride

p75NTR : p75 Neurotrophin Receptor

PBS : Phosphate Buffered Saline

PI3K : Phosphatidylinositol 3-Kinase

SCID : Severe combined immunodeficiency

SLE : Systemic Lupus Erythematosus

SVF : Sérum de Veau Fœtal

TGF : Transforming Growth Factor

TNF : Tumor Necrosis Factor

TNF-R : Tumor Necrosis Factor Receptor

TRAIL : Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing Ligand

TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling

Trk : Tropomyosin-Related Kinase

VEGF : Vascular endothelial growth factor

VSV : Virus de la stomatite vésiculaire

 

   

6

Résumé 

Alors que les cancers du sein in situ sont de nos jours bien soignés, de meilleurs

traitements restent à mettre en place pour les cancers du sein invasifs, mal soignés. Les

cellules tumorales sécrètent la neurotrophine NGF pour stimuler leur développement

(prolifération, invasion, …). Les effets de NGF sont dus à l’activation de ses deux récepteurs,

TrkA et p75NTR, qui sont surexprimés dans les cancers du sein. Ce facteur de croissance, ainsi

que ces deux récepteurs, apparaissent donc être de nouvelles cibles thérapeutiques

prometteuses pour traiter le cancer du sein.

Nous avons choisi de nous appuyer sur la technologie des kinoïdes, basée sur le

principe de l’immunisation active, dans le but de développer un traitement ciblant à la fois

NGF, TrkA et p75NTR. Le kinoïde, complexe composé du KLH, une protéine fortement

immunogène, sur lequel nos cibles protéiques seront greffées, va être reconnu par le système

immunitaire. Une forte production d’anticorps polyclonaux dirigés contre les cibles greffées

sera alors induite. Ainsi, nous projetons de produire des kinoïdes monospécifiques (ciblant

une seule de nos trois cibles) avec différentes séquences peptidiques pour chacune des trois

cibles dans le but de sélectionner in vitro les séquences pour lesquelles les anticorps générés

auront la meilleure réponse anti-tumorale. La capacité des anticorps (produits après

immunisation des souris avec le kinoïde) à inhiber les effets de NGF sur des cellules de

cancer du sein humain sera évaluée sur des cellules de cancer du sein humaines. A partir de

ces séquences, un kinoïde trispécifique sera réalisé, et l’efficacité des anticorps produits

seront testés in vitro comme précédemment mais aussi in vivo sur des souris xénogreffées

avec des cellules cancéreuses humaines.

L’objectif de ce projet est d’effectuer la preuve de concept de l’approche utilisant un

kinoïde trispécifique.

 

   

7

I. Introduction 

1. Le cancer du sein 

Aujourd’hui, le cancer du sein est le plus répandu chez la femme avec 400 000 décès

par an dans le monde (world cancer report, OMS, 2008). En France, c’est la première cause

de mortalité féminine par cancer. Ce cancer est caractérisé par l’apparition fréquente de

métastases pulmonaires, pleurales, hépatiques, osseuses et cérébrales (Weigelt et al, 2005).

Les métastases représentent la principale cause de mortalité. Il existe différents types de

cancers du sein, les adénocarcinomes étant les plus courants (95%). Les cancers du sein se

développent à partir des canaux (cancers canalaires) et des lobules (cancers lobulaires) de la

glande mammaire. Ils sont dits « in situ » lorsque les cellules cancéreuses sont confinées aux

canaux et lobules, et « infiltrants » lorsque les cellules cancéreuses sont présentes dans les

tissus qui les entourent. Dans ce dernier cas, les cellules malignes se propagent

éventuellement dans les ganglions situés sous les bras (ganglions axillaires) et dans

l'organisme. Le cancer du sein peut survenir aussi chez l'homme, mais il est rare (environ 200

fois moins fréquent que chez la femme).

Il existe à l’heure actuelle cinq types de traitements, seuls ou associés : la chirurgie

(mastectomie ou turectomie), la radiothérapie (curiethérapie et radiothérapie externe), la

chimiothérapie, l’hormonothérapie et le traitement ciblé.

L'hormonothérapie est destinée aux femmes ayant une tumeur du sein

hormono-sensible, définie par la présence de récepteurs aux estrogènes et/ou aux

progestérones, ce qui correspond à plus de 60% des cancers du sein. Cette thérapie permet de

bloquer l'action des œstrogènes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses.

Les nouvelles approches thérapeutiques se caractérisent par une action ciblée

d’anticorps thérapeutiques monoclonaux sur certains processus tumoraux avec une bonne

efficacité et une bonne tolérance. Ces dernières années, les stratégies thérapeutiques dans le

traitement du cancer du sein se sont concentrées sur la manière d’influencer le récepteur

HER2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor-2), dont la surexpression est associée à un

pronostic défavorable. Ce traitement d’anticorps monoclonaux anti‐HER2, trastuzumab

(Herceptin®) ou lapatinib (Tiverb®) peut être utilisé en monothérapie ou en « adjuvant » avec

une chimiothérapie. Pour les cancers du sein de mauvais pronostic qui ne sont ni sensibles au

trastuzumab (Herceptin®), ni à l'hormonothérapie et qui représentent 10 à 15% des cancers du

   

8

sein, un traitement anti‐angiogénique qui cible spécifiquement le récepteur VEGF (Vascular

endothelial growth factor) est en essai (bevacizumab (Avastin®)).

La glande mammaire contient une multitude d’éléments qui travaillent ensemble pour

garantir son état physiologique. Les cellules mammaires s’organisent collectivement pour

autoréguler l’homéostasie du sein. A l’état cancéreux, les cellules mammaires tumorales

détournent les acteurs moléculaires qui participent à son maintien : c’est une activation des

cellules environnantes en faveur de la progression tumorale. L’évolution du cancer du sein est

soumise à l’action de facteurs régulateurs systémiques et locaux. Parmi eux, les facteurs de

croissance jouent un rôle essentiel en favorisant d’une part la croissance et la prolifération de

la tumeur, d’autre part la formation de métastases, en modulant la capacité de migration et

d’invasion des cellules cancéreuses et sur l’angiogénèse. Ces facteurs de croissance peuvent

être sécrétés par les cellules cancéreuses elles-mêmes ou par diverses cellules composant le

stroma (fibroblaste, cellules myoépithéliales, cellules immunitaires).

Parmi ces facteurs de croissance, il a été démontré depuis peu le rôle de NGF (Nerve

Growth Factor) dans le cancer du sein. En effet, les cellules cancéreuses mammaires sécrètent

du NGF qui agit de manière autocrine pour stimuler la survie des cellules cancéreuses de sein

(Dollé et al, 2003).

2. NGF et ses deux récepteurs TrkA et p75NTR 

Le NGF appartient à la famille des neurotrophines (NT). Cette famille compte 3

membres en plus du NGF : BDNF (Brain Derived Neurotrophin Factor), NT3

(neurotrophine 3) et NT4/5 (neurotrophine 4/5). Les gènes des neurotrophines sont très

conservés du fait de leur provenance d’un même gène ancestral (Hallböök, 1999). De ce fait,

les protéines obtenues ont des poids moléculaires très proches (≈ 14 kDa) et leurs synthèses

nécessitent un même processus de maturation.

En effet, la traduction du gène donne naissance à un précurseur protéique, le

préproNT, qui va être séparé de son peptide signal pour donner le proNT. Ce dernier va être

clivé : la partie C‐terminale correspond à la NT mature alors que la partie N-terminale

relarguée est inactive. Le clivage peut être effectué en intracellulaire par des protéases telles

que la furine mais également, en extracellulaire, après sécrétion, par certaines

métalloprotéases ou la plasmine (Hondermarck, 2012). Les proNT pouvant être sécrétées,

elles peuvent donc avoir une activité biologique indépendante de celle de NT.

Figure 1: Structure du monomère de NGF. Les extrémités ainsi que les boucles 1 à 4 (L1 à L4) et les brins β (A, B, C et D) sont identifiés en rouge. Les cystéines et ponts disulfure sont symbolisés en gris et jaune.

9

La structure de NGF révèle une forme allongée dont la partie centrale est formée de

deux paires de brins β antiparallèles. Ces brins sont reliés entre eux par les boucles

numérotées de 1 à 4. La structure du monomère est fixée par la présence de 3 ponts disulfure

qui forment un motif nommé "cystéine-knot" au niveau des parties terminales de la protéine

(figure 1) (Wiesmann & de Vos, 2001). Grâce à ce domaine riche en cystéines, NGF peut

s’homodimériser, de manière non covalente via des interactions hydrophobes, pour former un

complexe de 28 kDa qui va être reconnu par les récepteurs au NGF. Ces derniers sont au

nombre de deux : TrkA (Tropomyosin-related kinase A) et p75NTR (neurotrophin receptor).

TrkA est un récepteur à activité tyrosine kinase appartenant à la famille des

Tropomyosin-related kinases qui compte trois membres : TrkA, TrkB et TrkC. Comme pour

les neurotrophines, ces trois membres dérivent d’un gène ancestral commun (Hallböök, 1999).

De ce fait, leurs poids moléculaires sont proches (≈ 140 kDa) et leurs structures conservées.

Les récepteurs Trk sont des protéines très glycosylées à un seul domaine transmembranaire.

La partie intracellulaire présente 75% d’homologie avec les autres récepteurs à activité

tyrosine kinase du fait de la présence d’un domaine tyrosine kinase. La partie extracellulaire

est composée d’une région riche en leucines avec de part et d’autre une région riche en

cystéines. Sous jacent à ces régions, sont retrouvés deux domaines Immunoglobuline-like

(IgG‐like), IgG‐like1 et IGg‐like2 (figure 2A). C’est d’ailleurs ce dernier domaine qui permet

la fixation des neurotrophines aux Trk entrainant la dimérisation des récepteurs. Les

neutrophines, quant à elles, interagissent avec les récepteurs via deux régions. La première

« conserved patch » correspond à la zone centrale, très conservée, des neurotrophines. La

seconde, « specificity patch » correspond à la partie N-terminale des neurotrophines et c’est à

priori cette partie qui confère la spécificité de liaison de chaque NT à son récepteur

(Wiesmann et al, 1999; Wehrman et al, 2007).

L’affinité de NGF pour TrkA est de l’ordre du nanomolaire (10-9M) mais se trouve

considérablement augmentée en présence du second récepteur p75NTR (10-11M) (Wehrman et

al, 2007).

Ce second récepteur, p75NTR appartient à la famille des récepteurs TNF (Tumor

Necrosis Factor). Ces récepteurs sont liés soit à l’apoptose, soit à la survie, soit les deux en

fonction des voies de signalisations activées. Ils sont essentiellement caractérisés par la

présence de domaines riches en cystéines CRD (en général, une répétition de six cystéines).

La partie extracellulaire de p75NTR est composée de quatre domaines riches en cystéines ainsi

Figure 2A: Représentation schématique des récepteurs tyrosine kinase A, B et C (TrkA, TrkB et TrkC). Chaque récepteur est composé d'un domaine riche en leucines (II), de deux domaines riches en cystéines (I et III), de deux domaines immunoglobuline-like (IV et V), d'un domaine transmembranaire et d'un domaine intracellulaire avec un domaine tyrosine kinase.

Figure 2B : Représentation schématique du récepteur p75NTR. Le récepteur est composé dans son domaine extracellulaire de 4 régions riches en cystéines, d'un domaine transmembranaire, d'un domaine intracellulaire contenant le domaine chopper juxtamembranaire et six hélices α du domaine de mort.

10

que de sites de glycosylation. La partie intracellulaire compte quant à elle un domaine de mort

(Death Domain) composé de 6 hélices qui diffèrent de ceux des autres membres de TNF-R de

par l’orientation de la première hélice. Aussi, on retrouve le domaine Chopper, nécessaire et

suffisant pour induire la mort cellulaire (Coulson et al, 2000) (figure 2B). NGF interagit en

dimère via ses boucles 1 et 4 avec les CRD1 et 2 et via la boucle 2 avec la jonction

CRD3/CRD4 de p75NTR dimérique (He & Garcia, 2004). L’affinité de liaison de p75NTR est la

même pour toutes les neurotrophines, à savoir de l’ordre du nanomolaire.

Il a également était montré que ces deux récepteurs peuvent former des hétérodimères

avec la protéine sortiline et que le ligand de ces complexes est le proNGF (Feng et al, 2010;

Demont et al, 2012). Dans le cancer du sein, seul l’hétérodimère TrkA/sortiline est retrouvé

(Demont et al, 2012).

3. NGF et cancer du sein 

Depuis une dizaine d’années, NGF et ses récepteurs TrkA et p75NTR apparaissent

comme de nouvelles cibles thérapeutiques possibles dans le cancer du sein. En effet, même si

les mécanismes moléculaires impliqués restent peu caractérisés, l’implication de ces trois

molécules dans le développement du cancer du sein a été clairement démontrée. NGF et ses

récepteurs sont surexprimés dans la plupart des cancers du sein (Dollé et al, 2003; Reis-Filho

et al, 2006; Lagadec et al, 2009) et stimulent la croissance tumorale via différentes voies

(Molloy et al, 2011; Hondermarck, 2012). Cette surexpression ne corrèle cependant avec

aucun facteur clinico-pathologique (Adriaenssens et al, 2008).

L’effet mitogénique de NGF sur les cellules cancéreuses a été décrit (Descamps et al,

1998) pour plusieurs lignées humaines de cancer du sein. Cet effet dose-dépendant est

spécifique des cellules cancéreuses puisque NGF n’induit pas la prolifération des cellules

NBEC (Normal Breast Epithelial Cells) non cancéreuses. Des expériences d’inhibition ont

montré que cet effet mitogénique est dû à l’activation de MAPK (Mitogen-activated protein

kinase) suite à l’interaction de NGF avec son récepteur TrkA. La stimulation de la

prolifération a également été démontrée in vivo chez des souris immunodéficientes SCID

(Severe Combined Immunodeficiency) xénogreffées avec des cellules de cancer du sein

humaines (Adriaenssens et al, 2008; Lagadec et al, 2009).

NGF favorise également le développement tumoral en augmentant la résistance à

l’apoptose des cellules de cancer du sein (Descamps et al, 2001; Adriaenssens et al, 2008;

Figure 3 : Les effets de NGF dans le cancer du sein. NGF stimule la croissance tumorale via sa liaison avec ses deux récepteurs TrkA et p75NTR ainsi qu’avec l’hétérodimère TrkA/sortiline.

11

Verbeke et al, 2010). Cet effet, montré à la fois in vitro et in vivo est dû à p75NTR et à la voie

NF-κB (Nuclear Factor-kappa B) activée en aval du récepteur.

La croissance tumorale dépend aussi de la vascularisation de celle-ci. L’effet

proangiogénique de NGF montré in vivo (Romon et al, 2010) se fait via TrkA qui active la

voie PI3K (Phosphatidylinositol 3-Kinase) et ERK (Extracellular signal-Regulated Kinase).

De plus, NGF et TrkA sont impliqués dans la migration et la formation de métastases

de cancer du sein (Adriaenssens et al, 2008; Lagadec et al, 2009). En effet, la surexpression

de cette neurotrophine cause une augmentation du nombre de métastases, notamment au

niveau du foie, des poumons et du cerveau.

Les cellules cancéreuses sont également connues pour leur pouvoir invasif. Il a été

montré que NGF via son récepteur TrkA stimule l’invasion des cellules de cancer du sein

(Lagadec et al, 2009). La forme non mature de cette neurotrophine, proNGF, est également

capable d’augmenter le pouvoir invasif des cellules tumorales en se fixant à l’hétérodimère

TrkA/sortiline (Demont et al, 2012).

L’inhibition de NGF et de ses récepteurs a permis de montrer, à la fois in vitro sur des

cellules de cancer du sein en culture et in vivo chez des souris immunodéficientes SCID

xénogreffées avec des cellules de cancer du sein humaines, une diminution de la croissance

tumorale, de la vascularisation, de l’invasion, de la migration, de la formation de métastases

ainsi qu’une augmentation du nombre de cellules apoptotiques (Descamps et al, 1998, 2001;

Adriaenssens et al, 2008; Lagadec et al, 2009; Verbeke et al, 2010; Romon et al, 2010).

NGF et ses récepteurs sont impliqués dans de nombreux processus essentiels au

développement et à la croissance tumorale (figure 3). Du fait de leur surexpression dans la

majorité des cancers du sein, ils apparaissent comme de bonnes cibles thérapeutiques, plus

universelles que les molécules actuellement ciblées (notamment HER2). Bien que l’inhibition

de NGF dans le traitement de la douleur ait montré des effets négatifs sur les articulations

(Holmes, 2012), les expériences d’inhibition réalisées dans le cadre du cancer du sein

montrent de nombreux effets positifs prometteurs pour une thérapie ciblée anti-NGF.

4. Inhibition par les kinoïdes 

Les principales stratégies d’inhibition actuellement utilisées en thérapie reposent sur

l’utilisation d’antagonistes chimiques ou peptidiques ainsi que d’anticorps monoclonaux. Ces

Figure 4: Principe de fonctionnement d’un kïnoide. Des épitopes de cytokine sont gréffés sur une glycoprotéine (KLH) pour donner un kinoïde. L’injection de ce kinoïde dans un organisme déclenche une réaction immunitaire qui génère des anticorps polyclonaux neutralisants dirigés contre les épitopes de la cytokine cible.

12

deux stratégies sont spécifiques et efficaces mais présentent certains inconvénients,

notamment la fréquence d’administration des traitements. De plus, les anticorps

monoclonaux, même humanisés peuvent, à long terme, déclencher une réponse immunitaire

anti-anticorps et donc ne plus être efficaces. Les kinoïdes, une nouvelle technologie brevetée

en 2004 par Néovacs, permettent d’inhiber la molécule d’intérêt sans les inconvénients des

stratégies classiques de traitement par anticorps monoclonal.

En effet, l’immunisation par des kinoïdes présente l’intérêt majeur de déclencher une

réponse immunitaire du patient, dirigée contre des haptènes (petites molécules ou peptides

non immunogènes isolément) greffés sur une grosse glycoprotéine très immunogène qu’est le

KLH (Keyhole Limpet Haemocyanin) (figure 4). Le second intérêt de cette stratégie est de

générer des anticorps polyclonaux qui permettent un ciblage plus efficace de la protéine cible

que les traitements à base d’anticorps monoclonaux. Jusqu'à présent, toutes les

expérimentations ont été faite dans le but de déclencher une réponse immunitaire contre des

cytokines : VEGF (Rad et al, 2007; Nair et al, 2007), IFNα (Interféron α) (Bizzini et al, 1999;

Zagury et al, 2009; Mathian et al, 2011), TNFα (Tumor Necrosis Factor α) (Le Buanec et al,

2006; Semerano et al, 2011; Assier et al, 2012), TGFβ (Transforming Growth Factor β) et

IL-13 (Interleukine-13) (Jing et al, 2012). Toutes ces études démontrent que les kinoïdes sont

bien tolérés chez la souris comme chez les patients, et produisent des anticorps polyclonaux

qui neutralisent la cytokine cible. Les résultats sont supérieurs ou égaux aux thérapies par

anticorps monoclonaux. L’immunisation par des kinoïdes entraine des effets durables qui

nécessitent deux à quatre injections contre une vingtaine d’injections par an avec les anticorps

monoclonaux. Cette immunisation active et continue permet donc de garder une expression

basale des cytokines et ainsi de diminuer les effets secondaires. De plus, le coût d’un

traitement par kïnoide est inférieur à celui des anticorps monoclonaux. Il faut signaler que

cette méthode génère une quantité significative d’anticorps anti-KLH bien que les études

publiées ne mettent pas en évidence d’effets indésirables, le KLH étant issu d’un organisme

phylogénétiquement éloigné de l’Homme.

Parmi les kinoïdes développés par la société Néovacs, les plus avancés sont ceux

dirigés contre IFNα et TNFα qui sont en phase II des essais cliniques.

Notre projet propose d’adapter cette stratégie d’immunisation par kinoïde pour traiter

le cancer du sein. Cette nouvelle thérapie pourrait présenter une alternative pour les patients

résistantes aux traitements conventionnels. Pour la première fois, nous proposons de cibler,

Figure 5 : Shéma de principe du projet. Des épitopes de NGF, p75NTR et TrkA sont gréffés sur un KLH. L’injection de ces kinoïdes dans un organisme déclenche une réaction immunitaire qui génère des anticorps polyclonaux neutralisants dirigés contre NGF, p75NTR et TrkA et bloquants les effets oncogènes des voies de signalisations de NGF.

13

avec un kinoïde trispécifique, la neurotrophine NGF ainsi que ses deux récepteurs TrkA et

p75NTR. Cette immunisation devrait donc générer des anticorps polyclonaux neutralisants

permettant de bloquer les effets des voies de signalisation de NGF à savoir : la mitogénèse, la

résistance à l’apoptose, l’angiogénèse et la formation de métastases dans les cancers du sein

(figure 5).

Après avoir présenté un article sur l’utilisation d’un kinoïde pour traiter le lupus

érythémateux disséminé (SLE) et les avantages de la technologie kinoïde, nous détaillerons

notre projet de recherche « un kinoïde trispécifique pour traiter le cancer du sein ».

Figure 6A : Production d’anticorps anti-huIFNα2b par les souris immunisées par IFN-K. 2x3 groupes de 10 souris sont immunisées par injection intra musculaire soit avec IFNgf soit avec IFN-K avec des doses de 3, 10 ou 30 μg. Un test ELISA permet de titrer la présence d’anticorps anti-huIFNα2b dans le sérum de chaque souris.

Figure 6B : Test de neutralisation des huIFNα2b par les anticorps produits après immunisation. Test de protection antiviral (VSV) par huIFNα2b sur cellules MDBK. 25 U d’huIFNα2b sont utilisées dans chaque test en solution avec différentes dilutions de sérum. Les souris sont considérées comme non réactives si le titrage de la NC50 n’est pas détectable pour la plus faible dilution de (1/500).

14

II. Un exemple de résultats obtenus avec la stratégie kinoïde 

L’interféron α (IFNα) joue un rôle central dans la pathogénèse du SLE et est considéré

comme une cible pour son traitement. Cet interféron existe sous la forme de 13 sous-types

(IFNα1, 2a, 2b, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 16, 17 et 21). L’article présenté ici (Mathian et al, 2011)

s’intéresse à la capacité d’induire la production d’anticorps neutralisants anti-interféron α

humain (huIFNα), chez des souris immunotolérantes pour huIFNα2b, par immunisation active

avec l’huIFNα2b-kinoïde (IFN-K).

1. L’immunisation  IFN­K  induit­elle  la  production  d’anticorps 

anti‐huIFNα2b et sont­ils neutralisants ? 

Les expérimentations ont été effectuées sur des souris FVB/N modifiées

génétiquement pour exprimer et tolérer l'interféron α2b humain (huIFNα2b).

Les souris sont immunisées au jour 0 et au jour 21 avec des doses différentes soit

d'IFN-K (Kinoïde = huIFNα2b cross-linkés avec KLH) soit d'IFNgf (témoin = huIFNα2b

cross-linkés entre eux). Trois dosages sont testés : 3, 10 ou 30 μg pour les deux

immunisations et chaque test a été fait sur 10 souris. Les souris sont tuées au 32e jour et les

séra sont récupérés. Un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) est effectué sur

chaque sérum pour titrer la quantité d’anticorps anti-huIFNα2b et anti-KLH. L’ELISA est

réalisé en ajoutant 100 ng par puits d’huIFNα2b ou de KLH dans du tampon PBS (Phosphate

Buffered Saline). Différentes dilutions de chaque sérum sont testées. Les anticorps sont titrés

à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à la peroxydase qui, en présence d’OPD

(o-phénylènediamine dihydrochloride) va donner une couleur orangée proportionnelle à la

quantité d’anticorps fixés à 490 nm. Le titre correspond à la dilution nécessaire pour obtenir

50% de l’absorbance maximale.

L’immunisation par IFN-K a induit une production d’anticorps anti-huIFNα2b sur

toutes les souris et pour les 3 doses (figure 6A). On n'observe pas de différences significatives

entre ces trois groupes pour les quantités testées. Les variations de titrage sont très

significatives entre l’immunisation par IFNgf ou par IFN-K à dose équivalente.

L’immunisation par IFN-K induit une forte production d’anticorps anti-KLH pour les

trois doses testées (résultats non montrés).

 

   

Figure 7 : Réponse immunitaire des cellules de souris transgéniques pour huIFNα immunisée par IFN-K. Les splénocytes de souris immunisées avec 30 µg d’IFN-K ont été stimulées avec IFNα ou KLH. (A) La prolifération cellulaire mesurée via l’incorporation de 3H-thymidine est exprimée comme un index de stimulation (SI=coups par minute des cellules stimulées / coups par minutes des cellules non stimulées). L’activation des lymphocytes T mémoire est évaluée par le relargage d’interleukine 2 (IL-2) (B) ou d’IFNγ (C) dans le milieu de culture.

15

Un test de neutralisation (MDBK-VSV) des huIFNα par les anticorps présents dans les

séra de souris a été réalisé.

Chacun des puits contient une dilution de sérum et une quantité fixe de huIFNα2b

(non précisée). L’incubation est faite une heure à température ambiante. Des puits contrôles

sont effectués en remplaçant les échantillons de sérum par un milieu contenant des anticorps

neutralisants anti-huIFNα. Ensuite, 2×104 cellules MDBK (cellules de rein de bœuf) sont

ensemencées dans ce milieu complet pendant une nuit. Après le retrait du milieu et lavage au

PBS, les cellules sont infectées une nuit par le VSV (virus de la stomatite vésiculaire) avec 10

fois la dose requise pour tuer 50% des cellules. La survie cellulaire est déterminée grâce au

test colorimétrique MTS/PMS (réduit en formazan coloré dans les cellules vivantes). La

NC50 (50% de capacité de neutralisation) de l'activité IFN est la dilution de sérum donnant

50% de l'absorbance maximale.

Les anticorps anti-huIFNα2b présents dans le sérum neutralisent les huIFNα2b qui ne

peuvent donc pas empêcher le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) de tuer les cellules

MDBK.

Toutes les doses d’IFN-K ont généré des anticorps neutralisants anti-huIFNα2b (figure

6B). L’effet semble dose dépendant et maximal pour l'immunisation avec 10µg d'IFN-K. Le

nombre de souris réactive au test paraît aussi être dose dépendant avec 50% des souris

réactives à 3 μg, 90% à 10 μg et 100% pour une dose de 30 μg. Aucune souris immunisée

avec IFNgf ne produit d’anticorps neutralisants anti-huIFNα2b détectables sauf une souris sur

les 10 avec la dose de 30 μg.

Les anticorps induits par l’immunisation avec IFN-K neutralisent huIFNα2b.

2. Y a­t­il activation de la mémoire immunitaire  après immunisation 

IFN‐K ? 

Le but de l'expérience est d'évaluer si après immunisation avec IFN-K, il y a une

réponse immunitaire rapide, avec activation des lymphocytes T (LT) mémoire, lors d'une

exposition à l'IFNα ou au KLH.

Deux lots de 10 souris transgéniques et immunotolérantes pour huIFNα2b sont traitées

avec soit du PBS soit avec 30 µg de IFN-K. Les injections sont effectuées aux jours 0 et 21 et

les souris sont tuées au 49e jour. A ce jour, les splénocytes des deux groupes sont prélevés et

Table 2 : Valeurs d’absorbance des sérums (dilution 1:500) de souris avant et 60 jours après immunisation par IFN-K et du contrôle positif avec l’anticorps monoclonal IFNγ. Le test ELISA est réalisé avec un anticorps primaire anti-huIFNγ et un anticorps secondaire anti-souris couplé à la péroxidase de raifort (HRP). La révélation est réalisé après ajout du substrat de la HRP, l’o-phénylènediamine dihydrochloride (OPD) par mesure de l’absorbance à 490 nm. Aucune souris immunisées par IFN-K ne produit d’anticorps anti-huIFNγ. La valeur de p est calculée grâce au test des rangs signés de Wilcoxon : p = 0,25. Le test est réalisé en duplicate et les valeurs représentent la moyenne de ces deux valeurs. OD : absorbance ; SD : écart-type ; IFN : interféron ; mAb : anticorps monoclonal 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

Figure 8 : Capacité de neutralisation des sous-types d’IFNα par les séra de souris immunisées par IFN-K. Une quantité de 4U/puit de chaque sous type d’IFNα est ajoutée sur une gamme des séra de souris immunisées par IFN-K. La NC50 (neutralisation 50%) de chaque sérum a été déterminée.

Table 1 : Capacité de neutralisation des sérums de souris FVB/N 60 jours après immunisation avec IFN-K. La capacité de neutralisation est mesurée grâce au test A549-EMCV. Aucune souris immunisée par IFN-K ne produit d’anticorps anti-huIFNβ. Le test est réalisé en duplicate et les valeurs représentent la moyenne de ces deux valeurs. Ab : anticorps ; hu : humain ; IFN : interféron

16

mis en culture soit dans un milieu non supplémenté, soit dans le même milieu supplémenté

avec 10 µg de huIFNα2b (IFNα) ou 10 µg de KLH. Différents tests de réponses des LT

mémoire sont effectués. En effet, lors de l'activation de LT mémoire, il y a prolifération de

ceux-ci et sécrétion d'interleukine 2 (IL-2) et d'interféron γ (IFNγ) qui activent ensuite la

différenciation d'autres lymphocytes.

La prolifération est évaluée par l'incorporation de thymidine tritiée pendant la phase S

après un pulse de 18h (plus la quantité de thymidine tritiée incorporée est importante, plus il y

a prolifération). La production d’IL-2 et d'IFNγ est analysée par test ELISA.

Les résultats des différents tests (figure 7) montrent que l’IFNα n'induit pas de réponse

immunitaire mémoire à la dose testée contrairement au KLH (qui est en fait reconnu comme

un corps étranger) suite à l'immunisation IFN-K. Les souris étant transgéniques pour huIFNα,

il est cohérent de ne pas avoir de réponse immunitaire envers une molécule du "soi", comme

cela se passe chez l'Homme.

3. Les anticorps induits sont­ils spécifiques de l’IFNα ? 

• huIFNα 

Dans cet article, les auteurs ont étudié la spécificité des anticorps pour différent sous-

types d’IFN, induits par l’IFN-K chez des souris FVB/N transgéniques huIFNα2b.

Pour cela, ils ont évalué la neutralisation de l’activité de 12 sous-types de l’IFNα par

les anticorps contenus dans les séra de six lots de souris immunisées par IFN-K. (Il a été

confirmé au préalable que les séra de 15 souris contenaient des anticorps anti-huIFNα2b).

Chaque sérum de lot de souris a été testé indépendamment sur les sous-types d’IFNα et a été

évalué par un test MDBK-VSV. Ce test permet de déterminer une NC50 correspondant à la

dilution du sérum neutralisant 50% de l’activité des IFNα.

Tous les sous-types d’IFNα testés sont neutralisés par les séra de 50% des souris

(figure 8). Le sous-type le plus neutralisé est l’IFNα2a (NC50>16 000). Les séra des souris

immunisées par IFN-K ont une activité diminuée pour les autres sous-types par rapport à

l’IFNα2a (IFNα21 est partiellement neutralisé par les séra).

Figure 9 : Capacité de neutralisation des IFNα contenu dans les sera de patient (SLE) par les sera de souris immunisées par IFN-K. Une quantité variable d’IFNα (U/puit) de chaque patient est ajoutée sur une gamme des séra de souris immunisées par IFN-K. La NC50 de chaque sérum a été déterminée.

 

   

17

• huIFNβ 

Le test de neutralisation A549-EMCV a été réalisé pour montrer que les anticorps

produits par les souris immunisées par IFN-K ne réagissent pas avec l’interféron β (IFNβ). Le

principe de ce test est similaire au test MDBK-VSV. Il est réalisé avec la lignée cellulaire

A549 (cellules de carcinome de poumon humain), le virus de l’encéphalomyocardite (EMCV)

et l’interféron huIFNβ.

Les capacités de neutralisation des séra de différentes souris sont données en

pourcentages pour une dilution d’IFNβ de 1:100 (table 1). On remarque que les séra des

souris immunisées par IFN-K ne sont pas capables de neutraliser l’huIFNβ, ce qui implique

que cette immunisation n’induit pas la production d’anticorps anti-huIFNβ.

• huIFNγ 

Les séra de différentes souris immunisées par IFN-K ont été analysés par ELISA pour

tester la présence d’anticorps anti-huIFNγ. Les résultats (table 2) montrent qu’aucune souris

n’a produit d’anticorps anti-huIFNγ suite à l’immunisation par IFN-K.

Les tests de neutralisation ainsi que le test ELISA permettent de mettre en évidence la

spécificité du kinoïde qui induit la production d’anticorps polyclonaux dirigés uniquement

contre la cytokine d’intérêt IFNα.

4. Les anticorps induits peuvent­ils neutraliser les séra de patients atteints 

de SLE ? 

Les chercheurs ont testé la capacité de six séra (obtenus après immunisation des souris

avec IFN-K) à neutraliser l’IFNα contenu dans les séra de patients ayant le SLE. La NC50 de

chaque sérum des différents lots de souris a été évaluée par un test MDBK-VSV.

Les séra de 139 patients ayant le SLE ont été testés dans cette étude.

Dans tous les cas, les IFNα des patients sont neutralisés par tous les séra testés

(figure 9). De plus, le degré de neutralisation reste identique quelque soit le lot du sérum.

5. Conclusion 

Les résultats montrent que l'immunisation active avec le kinoïde IFN-K induit la

production d'anticorps polyclonaux neutralisants tous les sous-types de huIFNα ainsi que

   

18

l'IFNα des séra de patients atteints de SLE sans induire de réponse mémoire. Cela suggère que

l'immunisation avec IFN-K est une nouvelle stratégie thérapeutique prometteuse pour le

traitement du SLE.

 

   

19

III. Projet de recherche 

L’objectif de ce projet de trois ans est de mettre en place une preuve de concept

montrant l’efficacité d’un kinoïde trispécifique à inhiber les effets de la neurotrophine NGF

(ainsi que proNGF) via ses deux récepteurs TrkA et p75NTR. Cela permettrait de réduire le

développement tumoral dans le cadre du cancer du sein invasif. Le kinoïde trispécifique

permettra, par une immunisation active des patients, une production d’anticorps anti‐NGF,

anti‐TrkA et anti‐p75NTR directement par le système immunitaire des patients.

Les kinoïdes peuvent être obtenus en greffant sur le KLH une molécule entière ou

seulement des peptides issus de cette molécule. Pour notre projet, nous avons choisi d’utiliser

à la fois la molécule de NGF entière recombinante (R&D Systems, UK) et des peptides

synthétiques de NGF, TrkA et p75NTR afin de pouvoir produire plusieurs kinoïdes

monospécifiques dirigés contre NGF, TrkA ou p75NTR. Après avoir identifié pour chaque

cible le kinoïde présentant les meilleurs effets anti-cancéreux in vitro, nous produirons des

kinoïdes bispécifiques NGF‐TrkA, NGF‐p75NTR et TrkA‐p75NTR ainsi qu’un kinoïde

trispécifique NGF‐TrkA‐p75NTR avec le peptide sélectionné pour chaque molécule. Ces quatre

kinoïdes multispécifiques seront testés in vitro. Celui induisant les effets anti-tumoraux les

plus importants sera utilisé pour les tests in vivo chez la souris. Nous nous attendons à obtenir

les résultats les plus probants avec le kinoïde trispécifique.

1. Production des kinoïdes 

Les kinoïdes seront obtenus par conjugaison au glutaraldéhyde entre le KLH et des

peptides, identiques (kinoïdes monospécifiques) ou différents (kinoïdes bi‐ ou trispécifiques).

La méthode de conjugaison utilisée, décrite par Le Buanec et al. en 2006, consiste à faire

réagir les amines primaires du KLH et des peptides afin de coupler ces deux derniers. Le KLH

contient environ une centaine de sites réactifs. L’extrémité N-terminale des peptides n’étant

pas suffisamment réactive pour permettre le couplage, ils doivent contenir à une de leur

extrémité une lysine dont la chaîne latérale contient une amine primaire très réactive.

La conjugaison se fera avec une concentration connue de peptide et de KLH (peptides

en large excès). Nous évaluerons différents ratios peptides/KLH (20:1, 50:1 et 100:1). Le taux

de conjugaison de chaque peptide sera estimé par lecture de la densité optique à 220 nm

(liaison peptidique) avant conjugaison (peptides totaux) et après la conjugaison (peptides non

fixés). Ce calcul nous permettra d’estimer la concentration nécessaire de chaque peptide

 

 

 

 

Figure 10 : Stratégie de production de kinoïdes multispécifiques. Neuf kinoïdes monospécifiques (trois pour chaque cible) avec la protéine entière et deux peptides pour NGF et trois peptides pour chacun des deux récepteurs seront testés in vitro. Après avoir identifié pour chaque cible le kinoïde présentant les meilleurs effets anti-cancéreux in vitro, des kinoïdes bispécifiques NGF-TrkA, NGF-p75NTR et TrkA-p75NTR ainsi qu’un kinoïde trispécifique NGF-TrkA-p75NTR seront produits avec le peptide sélectionné pour chaque molécule.

20

d’estimer la concentration nécessaire de chaque peptide permettant de produire des kinoïdes

multispécifiques contenant des ratios équivalent de chaque peptide. Les kinoïdes seront

purifiés par centricon (cut-off : 100 kDa) pour dessaler l’échantillon et retirer les peptides non

fixés.

2. Choix des peptides 

Les peptides utilisés pour la production des kinoïdes seront synthétisés chimiquement

par la plateforme de l’IPBS. Tous les peptides auront une seule lysine dans leur séquence afin

de permettre le couplage au KLH. Cette lysine pourra être présente dans la séquence primaire

des trois cibles (NGF, TrkA et p75NTR) ou ajouter à l’une des extrémités des peptides lors de

la synthèse.

Dans un premier temps, nous avons décidé de tester neuf kinoïdes monospécifiques

(trois pour chaque cible) avec la protéine entière et deux peptides pour NGF et trois peptides

pour chacun des deux récepteurs.

Afin de générer des anticorps neutralisants, le mieux est de choisir des séquences

uniques d'une dizaine d'acides aminés situés dans une zone d'interaction du facteur de

croissance avec son récepteur (Denis Hudrisier, communication personnelle). Nous avons

donc tenu compte des domaines d’interaction ligand‐récepteur (Wehrman et al, 2007) et des

alignements des séquences NGF, BDNF, NT-3 et NT-4 (annexe 1), TrkA, TrkB et TrkC

(annexe 2) et p75NTR et deux TNF-Rs (annexe 3). Ces alignements nous permettent

d’identifier les séquences pour lesquelles nous avons le minimum d’identité avec les autres

membres de leurs familles respectives. Nous avons donc choisi les peptides ayant pour

séquence 40GEVNINNSVFK et 62NPVDSGCRGIBSK pour NGF, 240KSGGLPSLGLTL, 287SVQLHTAVEMK et 329FTEFLEPAANK pour TrkA et 58GANQTVCEPCK, 84KPCTECVGLQSM et 126RVCEAGSGLVFK pour p75NTR.

Les neufs kinoïdes produits à partir de ces huit peptides et de NGF seront criblés in

vitro (figure 10). Si les kinoïdes n’ont pas les effets escomptés, nous pourrons tester d’autres

peptides, éventuellement plus longs, et envisager de produire en système procaryote (E. coli)

les domaines extracellulaires des deux récepteurs afin de les greffer sur le KLH.

   

21

3. Immunisation des souris BALB/c 

Nous utiliserons l’adjuvant de Freund (Sigma) lors des immunisations et des souris

BALB/c (Charles River, France) de huit semaines.

Dans un premier temps, des études d’optimisation nous permettrons de déterminer le

nombre d’injections nécessaires pour obtenir le meilleur taux d’anticorps dans le sérum. Au

jour zéro, nous prélèverons le sérum pré-immun des souris que nous utiliserons comme

« blanc » lors du titrage par ELISA après la vaccination (conservé à -20°C). Nous réaliserons

des injections avec des doses de 50 μg de kinoïdes (équivalent à 100 μl de mélange

kinoïde-adjuvant) par souris en intramusculaire toutes les deux semaines. Une semaine après

chaque rappel, un test ELISA nous permettra de quantifier la production d’anticorps par les

souris immunisées. Une alternance de rappels et de test ELISA seront réalisée jusqu'à ce

qu'une réponse suffisante soit observée.

Les anticorps totaux (pool IgG) seront purifiés sur colonne couplée aux protéines G

(Pierce). Les tests ELISA seront réalisés avec des protéines G greffées au fond des puits

(Pierce).

Des immunisations contrôles seront faites sur un lot de souris avec du KLH seul ou

des agrégats de peptides.

4. Tests in vitro 

Afin de déterminer si les anticorps produits et purifiés sont bloquants, nous allons

vérifier s’ils ont les effets escomptés sur des lignées de cellules de cancer du sein en culture.

En effet, en bloquant TrkA, on attend une diminution de la prolifération, de l’invasion et de la

migration. Pour p75NTR, on attend une augmentation du nombre de cellules apoptotiques. Les

deux effets décrits par le blocage des récepteurs devraient également être retrouvés avec

l’anticorps anti-NGF. Nous réaliserons donc des tests de prolifération, d'apoptose, de

migration et d'invasion.

Les différents tests seront réalisés sur les lignées cellulaires suivantes : MCF-7,

MDA-MB-231, SkBr3, BT-20, T47D (lignées de cancer du sein). Les cellules NBEC (lignée

du sein non cancéreuse) seront utilisées comme contrôle. Toutes les cellules, obtenues auprès

de l'UMR 8527 de Lilles, sont cultivées en milieu EMEM (Eagle’s Minimal Essential

Medium) complémenté avec 10% de SVF (Sérum de Veau Fœtal).

   

22

Les tests seront réalisés selon les protocoles décrits par Descamps et al. en 2001 et par

Lagadec et al. en 2009.

Pour le test de prolifération, les cellules sont privées de sérum après 24h de culture

puis traitées avec NGF dans un milieu EMEM complémenté avec 0,1% SVF. Les cellules

sont ensuite comptées à 24, 48 et 72h avec un compteur de cellules (Beckman Coulter).

Pour les tests d'apoptose, les cellules sont traitées avec NGF pendant 1h après 12h de

privation en sérum. 5 ng/mL de TRAIL (Tumor-necrosis-factor Related Apoptosis Inducing

Ligand) sont ajoutés, en présence de NGF, pendant 6h. Les cellules sont fixées au

paraformaldéhyde, colorées au Hoechst 33258 (Invitrogen) et les cellules et corps

apoptotiques comptées sous microscope à fluorescence. La présence de facteurs

proapoptotiques (caspases 9 et 3) sera également vérifiée par Western Blot.

Les tests de migration et d'invasion sont réalisés sur une membrane de polycarbonate

(pores de 8 µm) sur les inserts Transwell (BD Biosciences) recouverte de GFR-Matrigel

(Growth Factor Reduced) pour les tests d'invasion. Les cellules sont cultivées sur un milieu

EMEM 0,1% SVF complémenté en NGF. Les cellules migrantes et invasives sont fixées au

méthanol, colorées au Hoechst 33258 et comptées sous microscope à fluorescence.

Chacun des tests sera réalisé avec ajout de 200 ng/mL de NGF (Sigma) ou avec ajout

de DMSO dilué au 1:1000 (point contrôle) et par traitement avec les pools d’IgG purifiés

(10 µg/mL et 30 µg/mL) obtenus après immunisation des souris avec les kinoïdes. On aura

donc les conditions suivantes : anti-NGF seul; anti-TrkA seul ; anti-p75NTR seul pour les

kinoïdes monospécifiques ; anti-NGF et anti-TrkA ; anti-NGF et anti-p75NTR ; anti-TrkA et

anti-p75NTR pour les kinoïdes bispécifiques; anti-NGF, anti-TrkA et anti-p75NTR pour le

kinoïde trispécifique. Des contrôles seront réalisés avec des inhibiteurs connus des cibles :

K-252a (10 nM) pour TrkA (Calbiochem), anti-p75NTR humain (10 µg/mL) pour p75NTR

(Promega) et anti-NGF humain (10 µg/mL) pour NGF (Promega).

De plus, des contrôles d’interaction directe entre les kinoïdes et les cellules seront

réalisés afin de tester de potentiels effets activateurs ou inhibiteurs sur nos cibles.

 

 

 

 

 

 

 

 

Table 3 : Récapitulatif des expériences in vivo. Le kinoïde multispécifique induisant les effets anti-tumoraux les plus importants in vitro, est testé in vivo chez la souris. L’efficacité anti-tumorale des anticorps générés chez des souris BALB/c est évaluée in vivo sur des souris SCID xénogreffées avec des cellules cancéreuses humaines (MDA-MB-231 et T-47D).  

N° de lot Nombre de

souris Type de test

Concentration

du traitement

Contrôle du

volume

tumoral

Contrôle

histologique de

la tumeur

1 6

Essai : injection des anticorps générés 8 mg/kg

6

2 6

Essai : injection des anticorps générés 40 mg/kg

6

3 6

Contrôle : inhibiteur Trka (K-252a) 20 nM

6

4 6

Contrôle : anti-p75 5 mg/kg

6

5 6

Contrôle : anti-NGF 5 mg/kg

6

6 6

Contrôle : IgG non relevant 5 mg/kg

6

7 6

Contrôle : injection saline 5 mg/kg

6

23

5. Tests in vivo 

• Xénogreffes et traitements par le kinoïde 

Les tests de criblage in vitro ont permis de sélectionner un kinoïde multispécifique.

Dans l’étape suivante, nous souhaitons évaluer l’effet de notre molécule innovante sur un

modèle animal. Les tests in vivo nous permettrons d’évaluer la capacité des anticorps générés

à agir sur des tumeurs mammaires.

Nous allons mettre en place une expérimentation qui consistera à étudier l’évolution

des tumeurs. Les anticorps polyclonaux produits par les souris BALB/c après immunisation

avec le kinoïde multispécifique seront purifiés et réinjectés à des souris immunodéficientes

(SCID) (IFA Credo, France) préalablement xénogreffées. Afin d’induire des tumeurs chez les

souris, des cellules cancéreuses humaines MDA-MB-231 et T-47D (3.106) seront injectées par

voie sous-cutanée au niveau du flanc des souris SCID de huit semaines (Adriaenssens et al,

2008).

Un premier suivi des xénogreffes sera fait par analyse histochimique. Un deuxième

suivi, consistera en une analyse de l’évolution du volume tumoral par mesure directe des

xénogreffes.

Dix jours après l'injection des cellules cancéreuses (correspondant à un volume de la

xénogreffe d’environ 200 mm3), les anticorps générés seront administrés tous les trois jours

au plus proche de la tumeur. Les traitements se feront systématiquement sur des lots de 12

souris pour les traitements « essais » comme pour les traitements « contrôles ». Après

traitement, chaque lot sera divisé en deux pour le suivi du volume des xénogreffes et pour

l’analyse histologique qui nécessitera de sacrifier l’animal (table 3).

Le sacrifice des souris pour les études histologiques sera fait au bout de 17 jours de

traitement. L’étude du volume tumoral sera poursuivie au-delà des 17 jours afin d’observer

une éventuelle résistance aux traitements.

• Analyse des effets des anticorps générés sur les xénogreffes 

Dans un premier temps, nous nous intéresserons à l’effet des traitements sur l’indice

de prolifération. Les cellules en prolifération seront mises en évidence par détection

immunohistochimique de la protéine Ki-67. Le marquage obtenu avec l’anticorps anti-Ki-67

(ImmunoTech) donne un signal nucléaire et marque en brun-rouge toutes les cellules en

   

24

division. L’indice de prolifération, correspondant au nombre de cellules marquées

positivement pour l’antigène Ki-67, sera évalué pour 1000 cellules comptées et exprimé en

pourcentage.

Dans un deuxième temps, nous évaluerons la capacité des anticorps à induire

indirectement l’apoptose des cellules tumorales. Le nombre de cellules apoptotiques sera

déterminé avec le test TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase biotin-dUTP Nick End

Labeling) (Roche Molecular Biochemicals, IN, USA). Ce test détecte la fragmentation de

l'ADN résultant de la cascade de signalisation apoptotique.

Puis, nous observerons l’impact du traitement sur la densité microvasculaire. Cette

dernière sera mesurée après marquage immunohistochimique des structures vasculaires avec

l'anticorps anti-CD31 (Novus Biological). La protéine CD-31 est retrouvée à la surface des

cellules endothéliales et est utilisée pour démontrer la présence de cellules endothéliales dans

des sections de tissus afin d'évaluer le degré de l'angiogénèse tumorale.

Pour finir, le volume tumoral sera mesuré tous les trois jours en mesurant la longueur

(l) et la largeur (w) de la tumeur. Il sera déterminé par la formule suivante :

.

 

   

25

IV. Perspectives 

A travers ce projet de recherche, notre équipe souhaite utiliser la technique innovante

du kinoïde multispécifique pour traiter le cancer du sein invasif. Nous décrivons dans ce

rapport les différentes étapes et méthodes pour mettre en place cette preuve de concept sur

une durée de trois ans. Si les résultats obtenus avec le kinoïde multispécifique sont

satisfaisants, plusieurs perspectives sont envisageables.

Tout d’abord, il serait intéressant de pouvoir immuniser des souris qui reçoivent la

xénogreffe de cellules cancéreuses. On pourrait envisager d’immuniser avec le kinoïde un lot

de souris, qui serait par la suite irradié dans le but de détruire la moelle osseuse. Cela

permettrait de rendre ces souris immunodéficientes et capables de développer une tumeur

après xénogreffe de cellules cancéreuses. Cette expérience permettrait d’étudier l’effet des

anticorps circulants des souris sur l’implantation et le développement de la tumeur et de

mettre ainsi en évidence l’effet préventif du kinoïde.

De plus, les éventuels effets indésirables du kinoïde seront étudiés en contrôlant le

poids, l’activité et l’espérance de vie des souris traitées en comparaison avec les souris non

traitées.

A la suite de toutes ces expériences, il serait intéressant de déterminer les paramètres

pharmacocinétiques et pharmacodynamiques du kinoïde, ainsi que d’étudier la toxicité de ce

vaccin afin d’envisager une étude en phase clinique.  

   

26

V. Références bibliographiques 

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Bizzini B, Volpato I, Lachgar A, Cohen P & Gringeri A (1999) IFN alpha kinoid vaccine in conjunction with tritherapy, a weapon to combat immunopathogenesis in AIDS. Biomed. Pharmacother. 53: 87–89

Le Buanec H, Delavallée L, Bessis N, Paturance S, Bizzini B, Gallo R, Zagury D & Boissier M-C (2006) TNFalpha kinoid vaccination-induced neutralizing antibodies to TNFalpha protect mice from autologous TNFalpha-driven chronic and acute inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103: 19442–19447

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VI. Annexes 

Annexe 1 : alignements des séquences des précurseurs: NGF, BDNF, NT-3 et NT-4

Annexe 2 : alignement des séquences TrkA, TrkB et TrkC

   

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Annexe 3 : alignement des séquences p75NTR et de deux TNF-R