Docteur Laurent PELLETIERAnnée universitaire 2010/2011

Université Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits réservés.

UE2 : Biologie cellulaire

Chapitre 4 :La communication inter-

cellulaire via les récepteurs membranaires

Récepteurs membranaires

• Propriétés générales

• Mise en évidence – caractérisation

• Structure

• Divers types de récepteurs

Récepteurs membranaires« Ligand »

Récepteur

Milieu extracellulaire

Membraneplasmique

Cytosol« Effecteur

primaire »

« 2nd

messager »

« Transduction »

« Effecteursecondaire »

Récepteurs membranaires

Ehrlich, 1910 : « Pour qu’une substance puisse agir, elle doit se fixer »

Récepteurs membranaires

R membranaires : protéines membranaires intrinsèquesreconnaissant des molécules hydrophiles(peptides, protéines…)

3 Domaines :- Extracellulaire

hydrophile (glycosylé)site de reconnaissance & fixation spécifique du ligand

- TransmembranaireSéquence(s) hydrophobe(s)

- IntracellulaireDomaine fonctionnel (Transduction)

Mono / multimère

Récepteurs membranaires

Ligand

libre Récepteur Complexe L-R

Liaison de faible énergieL. hydrogèneL. Van der WaalsL. ioniquesL. hydrophobes

Grand nombre

Sensibles l’environnement (pH, ions…)

Récepteurs membranaires

Mise en évidence

1. Liaison du ligand marqué (3H, 125I, 14C…)

2. Lavage

3. Mesure du ligand fixé

Interaction ligand-récepteur :

• Réversible

• Haute affinité

• Spécificité

• Capacité limitée

Récepteurs membranaires

K

RLRL

dRL ]][[RL ][

10-8 M

Récepteurs membranairesTous les ligands sont-ils égaux devant un

récepteur ?

Signal intracellulaire

Agoniste

Signal intracellulaire

Antagoniste

AgonisteLigands

Antagoniste - Compétitifs- Non compétitifs

« Substance qui se lie à un récepteur spécifique sans provoquer son activation mais qui peut bloquer l’action d’un médiateur agoniste »

« Agent qui se lie à un récepteur spécifique en induisant son activation »

Ligands / Agonistes / Antagonistes

- Curare, -bungarotoxine

- Tétracaïne et Proadifen

Ligands / Agonistes / Antagonistes

Récepteurs membranaires

FGF

ChondrocytesChondrocytes- Cellules épithéliales (vessie, prostate)- lignée B - Cellules épithéliales (vessie, prostate)- lignée B

Prolifération Prolifération

Carcinome Hypochondroplasie,Nanisme thanatophore

FGF-R3 FGF-R3

+

VEGF-A

VEGF-R1 VEGF-R2

Membrane plasmique

Cytosol

+1 ligand → x récepteurs

VEGF-B

+

&x ligands → 1 récepteur

Cellule endothéliale

Récepteurs membranairesExemples

-+

Ang-1 Ang-2

Tie-2

1 ligand → plusieurs récepteurs

Récepteurs membranaires

1 récepteur → plusieurs ligands

Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)Effet cellulaire = F (récepteur, ligand, type cellulaire)

1 ligand + 1 récepteur → plusieurs effets (cellules)

Sans oublier les interactions entre les voies de signalisation !!!

Purification difficile car - concentration basse

- protéines membranaires

Marquage d’affinité

Chromatographie d’affinité

Clonage par expression

Récepteurs membranairesPurification

L marqué R L-R

NH2│

NH2│

NH2│

NH2│

+

L-R

C — C│ │NH NH│ │

O O

Réactif de pontage

ex : N-hydroxysuccinimide (NHS)

→ Visualisation de R-L*

→ Caractérisation moléculaire (PM en SDS-PAGE)

→ Purification

PurificationMarquage d’affinité

- Support solide + ligand spécifique (agoniste / antagoniste)

PurificationChromatographie

d’affinité

- R retenu par liaison au ligand

- R élué par ligand en excès (ou pH, force ionique)

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Récepteur canal ionique

Ionotropique Métabotropique

Canal ionique = pore aqueux → transport passif d’ions (sens gradient électrochimique)

Ionotropique Métabotropique

Acétylcholine Nicotinique

(muscle squelettique)

Muscarinique

(muscle cardiaque)

Glutamate NMDA, AMPA, kainate mGluR

GABA(Ac. -amino butyrique)

GABAA GABAB

Autres Sérotonine Adrénaline (β-adr.)

Récepteur canal ionique

Récepteur canal ioniqueRécepteurs cholinergiques

Ionotropique MétabotropiqueType

nicotinique muscariniqueNom

rapide LenteConduction

SNC (10 %)+ SNP

SNC (90 %)+ SNPExpression S.N.

7 5Sous-types

Excitateur Excitateur / InhibiteurEffet

Cell. Musc. Sq.Musc. card.,Cell. Endo.

Expression périphérique

pentamérique : 2, ou

Monomère : 4 hélices (M1-M4)

Récepteur nicotinique

Structure

M2→ Canal

Récepteur nicotinique

Activation

2 Ach → 2

10 000 Na+ / 0.5 s

Récepteur nicotinique

Désensibilisation

Ach rapidement dissociée

AchE

Phosphorylation → fermeture

Récepteur nicotinique

AXONE

MUSCLE

Récepteur nicotinique

La jonction neuro-musculaire

Sarcoplasme

Myofibrille

SarcolemmeCellule satellite

Récepteur nicotinique

La jonction neuro-musculaire

Tubule TCiternes terminales

Triade

MitochondrieSarcolemme

Myofibrille

Myofibrilles Reticulum sarcoplasmique

Filament épaisFilament fin

Récepteur nicotiniqueLa jonction neuro-musculaire

Récepteur nicotinique

R. à la Dihydropyridine

• Sarcolemme (Tubule T)

• Canal Ca2+

• Voltage-dépendant

R. à la Ryanodine

• Mb R. sarcoplasmique

• Canal Ca2+

La jonction neuro-musculaire

Récepteur nicotinique

3.105 Ach /AChE/min

La jonction neuro-musculaire

Récepteur nicotinique

Pharmacologie

Pathologie

• Myasthénie

CH2 CH2 N

CH3

OC

CH3

OCH3

CH3

+ CH2 CH2 N

CH3

OC

NH2

OCH3

CH3

+

Acétylcholine Carbachol

Autres : • Tubocurarine• Physostigmine

Récepteur nicotinique

Et la toxine botulique ?!

Pharmacologie

CH2 CH2 N

CH3

OC

CH3

OCH3

CH3

+

Acétylcholine

Protéine G

Acétylcholine

Effet biologique

Récepteur muscarinique

…

Dépolarisation

…

Hyperpolarisation

Récepteur muscarinique

Récepteur canal ionique

Etude des canaux ioniques et de la perméabilité membranaire

Temps (ms)

Patch clamp

ddp

Echelle : 1 canalPatch clamp

Récepteur canal ionique

Récepteur canal ionique

LigandIons

Cellule attachée

Récepteur-canal Messager intracellulaire

2nd

messager

« Inside out »

Patch clamp

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Protéine│

OH

Protéine│OI

HO – P = O I

OH

Protéine kinase

Protéine phosphatase

H2OPi

Adénine

Ribose ATP ADP

PhosphorylationGénéralités

Groupements phosphate

Phosphorylation

Tyrosine (Y) Sérine (S) Thréonine (T)

Tyrosine kinases

Récepteurs : EGF-R, Ins-R…

Autres : JAK, Src, MEK…

Sérine-thréonine kinases

Ex : MAPKs, PKA, PKC, ERK1,2, Raf…

Généralités

cellules en culture

ElectrophorèseSDS-PAGE

-

+

Coloration Autoradiographie

Stimulus- +

Récepteurs à activité TKMise en évidence de la phosphorylation

de protéines in vitro

Na332PO4

ATP 32P

Extraction protéines

stimulus

Phosphorylation

Un interrupteur biochimique

5’AMP

PhosphorylationProtéine Kinase A(PK AMPc-dépendante)

PKA

Phosphodiesterase(PDE)PP AMPcATP

PhosphorylationProtéine Kinase A

• AMPc

• PKA

Cytoplasme

Noyau

Glycogène synthase

Glycogène synthase

Glycogènen+1

Glycogène + UDP-glucosen

Phosphorylation

Phosphorylase kinase

Phosphorylasekinase

PKA

Glycogène phosphorylase

Glycogène phosphorylase

Glycogènen

Glycogène n-1+

glucose 1-PGlycolyse

PPPhosphorylasekinase

PPGlycogènePhosphorylase

PPGlycogènesyntase

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Domaine extracellulaire :

N-terminal, glycosylé, riche en cystéines,

Site de reconnaissance du ligand

Récepteurs à activité TKCaractères communs

Domaine transmembranaire :

hélice , 22-25 aa

Domaine intracellulaire

C-terminal, domaine activité TK,

Tyrosines

Protéines transmembranairesN

C

Récepteurs à activité TK

Principe d’activation

Principe d’activation

P

P

P

P

P

P

Récepteurs à activité TKMise en évidence de l’autophosphorylation

Méthode historique :

ATP 32P

Na332PO4

EGF

Lysat cellulaire

Electrophorèse + autoradiographie

Récepteurs à activité TKMise en évidence de l’autophosphorylation

EGF-R

UnT EGF

170 kDa

Pi-EGF-R 170 kDa

UnT : Non traité (Témoin)EGF : cellules stimulées avec l’EGF

Récepteurs à activité TKPrincipe d’activation

??

Opération séduction en Espagnela biocel…

Récepteurs à activité TKPrincipe d’activation

Récepteurs à activité TKEGF-R

Récepteurs à activité TKEGF-R

• SH1 : Tyrosine Kinase activity

• SH2 : pTyr-Met/Val-X-Met

• SH3 : R-X-X-P-X-X-P

• SH4 : myristylation

N CSH4 SH3 SH2 SH1

Domaines SH = Src homology domains

Récepteurs à activité TKEGF-R

Src1911, Peyton ROUS Rous Sarcoma Virus (RSV) Gag, pol, env, src

Oncogène, proto-oncogèneV-src, c-src1966, Nobel

Récepteurs à activité TKEGF-R

Récepteurs à activité TK

SH3SH2

GRB-2(Growth Receptor Binding protein)

SH3

SOS(Son Of Sevenless)

Pro-richRasGEF

EGF-R

Récepteurs à activité TKEGF-R

Ras/GDP

Ras

21 kDa

Monomère

GTPase

GTP / GDP

Active / Inactive

Proto-oncogène

Récepteurs à activité TKEGF-R

GAP

SOS (GEF)

GEF : Guanine nucleotide Exchange FactorGAP : GTPase Activating Protein

Récepteurs membranairesRécepteur à activité TK

PP

membrane

EGF

RasRas RasGTPGTP MAPKKK

ERK1/2 ERK1/2

Noyau

MAPK

MEK MEKMAPKKPP

PP PP

SOSSOSGRB2GRB2

GDP RafRaf

MAPK… : Mitogen-Activated Kinase (Kinase…)MEK : MAPK/ERK KinaseERK : Extracellular signal-Regulated Kinase

Cytoplasme

Récepteurs membranaires

ERK

P P

ERK

P P

MEKATP

ADP

SRF : Serum Response FactorSRE : Serum Response Element

Récepteurs membranaires

ERK

P P

ERK

P P

MEKATP

ADP

SRF : Serum Response FactorSRE : Serum Response Element

Récepteurs à activité TKEGF-R

Récepteurs à activité TKEGF-R

Récepteurs à activité TKEGF-R - Cross-Talk

P

membrane

GF

PLC

RasGRF

Ras RasGTP

PIP2GDP

DAG

IP3

[Ca2+]Cm

Cm : calmoduline

Ca2+-dependent Ras activation

Voie PLCγ Voie Ras

Récepteurs à activité TKEGF-R

Récepteurs à activité TKPI3K = phosphatidylinositol-3-OH kinaseLipide kinase 3’ du cycle inositol des phospho-inositides membranaires.

PI(4,5)P2 PI (3,4,5)P3 >> PI PI(3)P ; PI(4)P PI(3,4)P2

Hétérodimères :

• p110 (110 kDa) : Sous-unité catalytique

• p85 (85 kDa) : Sous-unité régulatrice (2 domaines SH2)

An aval…• PKB (Akt) & PDK (Phosphoinositide-Dependent Kinase)• Pleckstrin Homology domain (PH)

Récepteurs à activité TKPI3K

PIP3PIP2

Récepteurs à activité TKIns-R

PI3K Grb2/SOS & RasIRS : Insulin Receptor Substrate

Récepteurs à activité TKIns-R

Défaut dans la voie de signalisation de l’insuline Conséquences :

• Hyperglycémie,• Glycosurie,• …

• Type 1

Diabète juvénile ou diabète sucré insulino-dépendant (IDDM)

• Type 2

Diabète sucré non insulino-dépendant (NIDDM)

Pathologie

Récepteurs à activité TKEn médecine…

EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

EGF-R/

ErbB-1

EGF-R/

ErbB-1

EGF-R/

ErbB-1

EGF-R/

ErbB-1

EGF-R/

ErbB-1

EGF-R/

ErbB-1ErbB-2ErbB-2

EGF-R/

ErbB-1

EGF-R/

ErbB-1

ErbB3 ou 4ErbB3 ou 4

EGF

Récepteurs à activité TKEn médecine…

• EGFR/ErbB-1• 30 % des cancers du poumon• Agressivité, mauvais pronostic

• ErbB-2 (HER2/neu)– Normal: 20 000 - 100 000 recepteurs à la surface d’une cellule– nombreux cancers (cell. épithéliales) → 1-2 106 récepteurs– Cancer du poumon : Agressivité, survie courte– Oncogène +++– Orphelin

• ErbB-3, ErbB-4

EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

Récepteurs à activité TKEn médecine…

Surexpression de ErbB-2 : Immunohistochimie

EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

Tumeur du poumonErbB-2 +

Tumeur du poumonErbB-2 + + +

myc cyclin D1

Jun Fos

RR

Effets de l’activation de Tyrosine Kinase de EGFR

K K

Transcription génique et progression du cycle

EGF & cellules cancéreuses

Invasion & metastasesAngiogenèse

myc cyclin D1

Jun Fos

RR

Effets de l’activation de Tyrosine Kinase de EGFR

K K

Transcription génique et progression du cycle

MAPK

MEK

RAS RAFSOS

GRB2

Prolifération

PI3-K

AKT

Inhibition de l’apoptose

PP

P

EGF & cellules cancéreuses

Invasion & metastasesAngiogenèse

myc cyclin D1

Jun Fos

RR

EGR, ErbB, IRESSA, Herceptine & Cie…

K K

Transcription génique et progression du cycle

MAPK

MEK

RAS RAFSOS

GRB2

Prolifération

PI3-K

AKT

Inhibition de l’apoptose

PP

P

EGF & cellules cancéreuses

Récepteurs à activité TK

En médecine…

Herceptin® (Trastuzumab)

EGR, ErbB, Herceptine et Cie…

• Anticorps monoclonal

• Humanisé

• IV

• ErbB-2

• Inhibiteur

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Récepteurs membranaires

Erythropoïétine (EPO),

Granulocyte Colony-Stimulating Factor (G-CSF),

Granulocyte Macrophage Colony-stimulating Factor (GM-CSF),

Thrombopoïétine (TPO),

Prolactine (PRL),

Hormone de croissance (hGH)

Cytokines

Interleukines (IL)

Récepteurs membranaires

Cellulesouche

Cellule hématopoïétique

pluripotente

CSFFlt3L

Erythrocyte

BFU-E

Méga-caryocyte

CFU-GEMMProgéniteurmyéloïde

CFU-GM

Eosinophile

Neutrophile

Mastocyte

Macrophage

Cellule dendritique

Basophile

Progéniteurlymphoïde

Lymphocyte B

pré-T

Lymphocyte T

pré-B

Récepteurs membranairesEPO-R

165 AA ~ 40% glucides

Erythropoïétine

• Produite par le rein

• Progéniteurs érythrocytaires

• Anémie

Récepteurs membranairesEPO-R

Cellule souche BFU-E CFU-E

Réticulocyte Globule rouge

EPOEPO

EPOEPO EPOEPOEPOEPO

ProliférationProlifération

MaturationMaturation

Récepteurs membranairesEPO-R

Récepteurs membranairesEPO-R

EpoR

Epo

IP : anti-EpoRWB : anti PY

- +

Récepteurs membranairesEPO-R

PPPP

PPPP

JAKJAKJAKJAK

JAK = Janus Kinase ou Just Another Kinase

JAKJAKJAKJAKPPPP

Noyau

CytosolCytosol

Récepteurs membranairesEPO-R

PPPP

PPPP

Transcription

JAKJAK JAKJAKPPPP

STATSTAT

STATSTAT

PPPPSTATSTAT

STATSTAT

STATSTAT STATSTATPP PP

STAT : Signal Transducing Transcription Activator

Récepteurs membranairesEPO-R

Récepteurs membranairesEPO-R

PJAK JAK

P

P

JAK JAKP

SHP-1 : SH2- containingphosphotyrosine Phosphatase -1

CIS : Cytokine Inducible SH2-containing proteinsSOCS : Suppressor of Cytokine Signalling

CIS CIS

CISP

PP P

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Substrats cytosoliques, membranaires

CD45 / Leucocyte Common Antigen

1 Chaîne transmembranaire.

Cell. hémato. & cell. immun.

Récepteurs membranaires

Récepteur phosphotyrosine phosphatase

Récepteursmembranaires

À activité enzymatique

Sans activitéenzymatique

RTK(RYK)

Canaux ioniques

Couplés Prot G

R cytokines

RTP(RYP)

Récepteurs membranaires

Et les autres !Et les autres !

Récepteurs membranairesRécepteur guanylyl cyclase

Facteur Natriurétique Atrial (ANF)• Détection de l’extension (stretch) des fibres musculaires des

oreillettes

prohormone ANFPro-ANF (126 aa) (28 aa)

Récepteurs membranaires

Récepteur guanylyl cyclase

Domaine TK

Domaine GC

Mb pl

Récepteurs membranairesRécepteur guanylyl cyclase

• ANF → R Guanylyl cyclase → cGMP → PKG → phosphorylations(→ GMP (PDE))

• Rein : natriurèse (sortie Na+ + H2O) → volume plasmatique

Cellules musculaires lisses : relaxation → vasodilatation

PA

Récepteurs membranaires

Récepteur guanylyl cyclase

Récepteurs membranairesRécepteur guanylyl cyclase

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1998

"for their discoveries concerning nitric oxide as a signalling molecule in the cardiovascular system"

Robert F. Furchgott

USASUNY Health Science Center Brooklyn, NY, USA 1916 -

Louis J. Ignarro

USAUCLA School of Medicine Los Angeles, CA, USA 1941 -

Ferid Murad

USA University of Texas, Health Science Center Dallas, TX, USA 1936 -

Récepteur guanylyl cyclaseRécepteurs membranaires

Récepteurs membranaires

Hanahan and WeinbergCell 100:57

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