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UE Spécifique ANALYSE ET METHODES D’ ETUDE DU GENOME

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UE Spécifique. ANALYSE ET METHODES D ’ ETUDE DU GENOME. I- STRUCTURE DU GENOME. Organisation Composition Les différentes séquences Le gène. INTRODUCTION. Ensemble du matériel génétique d ’ un organisme - PowerPoint PPT Presentation

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ANALYSE ET METHODES D’ ETUDE DU GENOME

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I- STRUCTURE DU GENOME

• Organisation • Composition • Les différentes séquences• Le gène

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INTRODUCTION

• Ensemble du matériel génétique d’un organisme

• Il est constitué d’ADN pour la majorité des organismes

• Certains virus ont un génome constitué d‘ARN • La taille du génome varie en fonction des

espèces

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ORGANISATION

• Chez la majorité des bactéries ( procaryotes) le génome est contenu dans UN seul chromosome circulaire

• Le génome peut être linéaire (actinomycètes)• Chez les eucaryotes : ADN nucléaire , ADN

mitochondrial

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DENSITE DES GENOMES

• Chez E.Coli , le génome est composé presque exclusivement de gènes

• 4.6 Mégabases / 4000 Gènes / soit 950/MGb

• Chez l’Homme • 3200 Mégabases / 25000 Gènes / 8 / MGB

• La quasi-totalité génome bactérien est codant !

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Espèce Humaine

• Génome nucléaire: 3,2 109 pb pour n chromosomes et répartis dans 22 autosomes + 2 chromosomes sexuels

• Génome mitochondrial : 16 559 pb, épisome • Aucune corrélation entre la taille du génome

et la complexité des organismes • Plus grands génomes : > 150 109 pb : pins,

plantes

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COMPOSITION DU GENOME HUMAIN

Des gènes : environ 25 000 composés de séquences codantes ( exons) et non codantes (les introns, séquences régulatrices; promoteur, silencer, enhancer …)

régions codantes : 1.5% du génome ; introns 25%, région régulatrices: 5% Des Pseudogènes 1.5% De très nombreuses séquences répétèes 60% Autres régions non codantes : séquences uniques ou très peu répétées 7%

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Séquences répétées

• Répétées en Tandem • minisatellites : des séquences de 10 à 25 pb

sont répétées un grand nombre de fois • ( empreintes génétiques) • microsatellites : 1à 5 pb répétées x fois sur

plusieurs kb • ADN satellite : centromères , télomères ( 10%

du génome humain)

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MicrosatellitesDispersés sur tout le génome 1 à 5 nucléotides

CopiesA(n) / T(n) 107

(CG)n / (CA)n/ (GT)n 7 106

(CT)n / (GA)n 3 x 106

Les plus étudiés (CG; CA)n

CGCGCGCG

TANDEM

CG n = 23 n = 15n = 20

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• Séquences répétées dispersées Les SINE(s) blocs de 130 à 500 pb ( Alu) Les LINE(s) blocs de 5- 7 kb Les LTR(s) quelques dizaines de paires de bases ( 400 000 copies) Les transposons ( 300 000 copies)

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Séquences répétés dispersées

SINEs : Famille ALU

Copies : 7 105

ALU ALU

104 pb

250-400 pb

250-400 pb

Famille Kpn (L1)

1300 pb copies 6 104

Peuvent être transcrites

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Séquences SINEs

ALU REPEAT

120 135 290

(AAA)n

AT RICHGC RICH GC RICH

(AAA)n

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Eléments transposables

IS éléments

2600 – 700 pb

5' 3'

CTGACTT

3' 5'

TTCAGTC

Répétition aux extrêmités (Maïs)

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Gène

Séquence d'acides nucléiques contenant une

information codée, transmissible, pour la production

régulée d'un ARN (transcription), ce dernier pouvant

être traduit en une chaîne polypeptique

Certains gènes codent seulement des ARN sans

traduction en protéine

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Les gènes des rétrovirus sont constitués d'ARN

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Pseudogènes

• Séquences partiellement homologues aux gènes qui ne donnent jamais de protéines correspondantes

Soit anciens gènes fonctionnels qui ont muté

Soit des ARN retro-transcrit ADN intégration ADN génomique ( transposition)

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• ANATOMIE DU GENE globine

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Exon IIIExon II IVS2IVS1

1 3130 104 105 146

1600 pb

Gène globine

Zone

des

pro

mot

eurs

5' U

TR

3' U

TR

Exon I

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Région régulatrice en 5'Zone des promoteurs

-105 -100

CAP

-70-80 -30 -25

CACCC CACCC CCAAT TATA A/T A A/T

G CCCCCA

G

Facteurs de transcription

Site d'initiation de la transcription

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Région 5' non Traduite5' UTR

Région 5' UTR - Attachement aux ribosomes - Régulation transcription +/-

8 - 13 +30...... CACCATG

0

CTTCTG

+50

Codon initiateurCAP

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ExonPartie codante d'un gène protéine

Exon 1

ATG

IVS1

Exons Traduction protéine

30

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IVS1

130 pbExon 2

GT

Donneur de l'épissage

AG

Accepteur de l'épissage

Zone non traduite

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AAAAAA

AATAAA20

132 Nucléotides

STOP146

AATAAA : Signal de polyadénylation

: Clivage de l'ARN après transcription

(AAAAA)n : Stabilise l'ARN ( ajouté après la transcription)

Région 3' UTR

Codon 147

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II ETUDE DU GENOME

A- Les expériences fondamentales qui ont révélé l’ existence de l’ADN comme Génome

• L’ Etude du génome complet d’un individu est très récente et découle du séquençage d’un génome entier ( début XXI)

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• C’est l’analyse de l‘ADN• Elle était indirecte avant l’invention des

techniques du séquençage (1977) • Elle utilisait l’étude des protéines qui

renseignaient indirectement sur les gènes • Des mutants de bactéries , de drosophiles

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Origines de l’étude du Génome• Dès le XIX siècle : l’étude de la transmission des caractères sur

des critères d’analyses qualitatives et statistiques ( Lois de Mendel 1860)

Mise en évidence de l ’ADN (1865)

Génétique formelle Morgan ( 1920 drosophile) critères d’analyses qualitatives et statistiques

• Puis des techniques bactériologiques et biochimiques ont permis de franchir une étape dans le degré d’investigation de l’étude des génomes ( 1920-1952)

• Structure ADN (1953 )

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Expérience de Griffith (1928)

Bactérie : Diplococcus pneumoniae

2 souches S = capsule polysaccharidique

> infectieux R = dépourvue de capsule

> non infectieux

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Des lots de souris

• Groupe1 : Injection souche S à des souris > pneumonie

• Groupe 2 : Injection souche R > pas d’infection

• Groupe 3 : Injection d’une souche R + souche S préalablement tuée par la chaleur

• => pneumonie

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RESULTAT

• Le sang des souris du groupe 3 est mis en culture : on recueille soit des souches R soit des souches S virulentes ...

• L’expérience fût refaite en 1944 avec la conclusion que l’ADN était le matériel héréditaire

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Avery, Mac Leod, Mac Carthy

• Interprétation : Les souches S tuées sont capables d’induire une transformation des bactéries R en bactéries S

Quelle est la nature de ce matériel transmissible ? • En ajoutant l’ ADN purifié des souches S à des

colonies de type R les colonies R > S • Les autres fractions (polysaccharides,protéines) n’ont

pas de pouvoir transformant...

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• Lorsque l’ADN des souches S est traité par la DNAse avant d’être ajouté aux bactéries de souche R > pas de bactérie de type S

• La transformation des souches R en souche S est la conséquence d’un transfert d’ADN

• L’ADN est donc le matériel génétique

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De 1944 à 1952 une partie de la communauté scientifique n’était toujours pas convaincue par cette conclusion et l’hypothèse que les protéines étaient le matériel héréditaire était encore défendue

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• Colette VENDRELY ( professeur d’embryologie à Amiens ) & R. VENDRELY démontrent en 1949 que la quantité d‘ADN présente dans les gamètes est la moitié de celle contenue dans les cellules somatiques.

• Ce résultat est le seul travail français internationalement cité comme contribution majeure à la preuve de l’ADN comme matériel héréditaire

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UN pas décisif vers la découverte de la structure de l ’ADN

En 1950 Erwin Chargaff découvre que l'adénine et la thymine existent en quantités égales, et qu'il en est de même de la guanine et de la cytosine, d'où la célèbre équation

% A = % T % G = % C

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Expérience Hershey & Chase

• 1952, ils démontrent en utilisant le phage T2 traité au tritium * (acides nucléiques radio-actifs) que les ADNs répliqués sont radioactifs.

• Les protéines ne sont pas radioactives donc ne se répliquent pas …

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Découverte de la structure de l’ADN

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“ It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism

for the genetic material ” .

• « Il n’ a pas échappé à notre attention que la les appariements spécifiques que nous proposons suppose immédiatement un mécanisme de copie du matériel génétique »

• Le modèle de réplication semi-conservatif sera prouvé en 1958 par Meselson et Stalh

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Le modèle semi conservatif de la réplication

• Le bon modèle pour 3 possibilités

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modèle conservatifA partir d'une molécule d'ADN bicaténaire "mère", on forme une nouvelle molécule d'ADN bicaténaire.On garde donc ici une molécule "mère", non modifiée (elle est donc conservée), tout en "créant" une nouvelle molécule ("fille").

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On ne conserve aucun brin intact.La copie se réalise par fragments dispersés dans l'ensemble de l'ADN, permettant de former les deux molécules d'ADN bicaténaires "filles".

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Dissociation des deux brins de la molécule d'ADN bicaténaire "mère".

Chaque brin sert donc de matrice à la synthèse d'un brin complémentaire, l'ensemble reformant une molécule d'ADN bicaténaire. Chaque nouvelle

molécule "fille" ne conserve donc que la moitié de la molécule mère

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Dans le tube 0 la totalité de l’ADN est marqué à l’ azote 15 ( les 2 brins) . Après une réplication la moitié de l’ADN est radio actif . Au fur et à mesure des réplications la quantité d’ADN marqué diminue l’ADN au profit d’abord d’ ADN hybride , puis d’ADN froid.

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Le résultat observé après séparation des ADNs répliqué correspond au modèle semi conservatif

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Propriétés physico-chimiques• Déroulement de tout l’ ADN d’une cellule d’un

individu : 1.6 Mètre • Déroulement de l’ADN de toutes les cellules

d’un individu : diamètre du système solaire! • ADN cellulaire : 6,6-6,4 x 10 9 pb (2n)

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Quelques valeurs …• Pb = 6 .10 9

• Masse Moléculaire = 2x330 g x 6.109 /6,02.1023 moles de nucléotides

• > = 6,6.10-12 g d’ADN

• Il y a environ 6 picogrammes d’ADN dans une cellule diploide

• 1 µg d’ADN génomique -> 10-6 g /6.6 10-12 g/cellule >> • 107 cellules diploides

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II ETUDE DU GENOME

• B) LES OUTILS

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B- 1- PURIFICATION DE l’ ADNMéthode au Phénol / Chloroforme

• Purification des cellules • Lyse des cellules ( SDS, Lysozyme) • Action protéinase K, Rnase • Extraction au phénol • Action du CHCl3• Précipitation dans l’éthanol en milieu salin • Re-suspension en présence de tampon TRIS -

EDTA ( 1 mM) ( 100 microG / microl)

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B-2 Les Enzymes de Restriction

• Sont des ciseaux moléculaires qui hydrolysent l’ADN; Ils reconnaissent des séquences palindromiques (Ex RADAR)

• Ils permettent de mette en évidence des variations de séquence ( polymorphismes, mutations)

• Ils sont utilisés en génie génétique ( clonage) • En diagnostic de routine en génétique

médicale

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Des enzymes de Restriction

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• 5'-G*GATCC-3' Bam HI • 3'-CCTAG* G-5’

• 5 '-G -3' --- 5'- GATCC-3' • 3'-CCTAG-5' ----> 3'- G-5'

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B-3 L’ Hybridation et les sondes

• Hybridation par complémentarité de séquence et appariement des bases

• Sonde : petite séquence d'ADN ou d'ARN marquée par un composé fluorescent, ou radioactif

• Les sondes doivent être spécifiques d’une séquence et très sensibles.

• Utilisation diagnostique

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10-3 104101100

10-2

102

20

100

60

Rapide Lent

Taux de Renaturation

SIMPLE

BRIN

%

Cot (mole sec .l-1)

ADN hautement répétitif

ADN moyennement répétitif

ADN peu répétitif

Copies uniques

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B-4 Application sondes et ER : "POLYMORPHISME"Plusieurs Formes

Toute variation de séquence de l'ADN, qu'elle soit ponctuelle ou qu'elle intéresse une répétition de mini / micro satellites est un polymorphisme si sa fréquence est 1 % dans une population donnée

à une fréquence < 1 % mutation (privée)

Les polymorphismes sont soit :

- Neutres

- Avantageux

- Désavantageux

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L'ADN n'est pas un élément statique

Il est sujet à des modifications transmissibles

Les variations de séquence sont appelées

polymorphismes lorsqu'elles surviennent à une fréquence

> 0.01 (moins de 1 % : mutations)

L'hétérozygotie moyenne de l'ADN humain est d'environ

0,004 (1 base différente toutes les 250 - 300 bases entre 2

allèles ou 2 séquences, entre 2 individus)

Les Polymorphismes

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Le polymorphisme affecte toutes les régions de l'ADN

- Séquences codantes

- Introns

- ADN répété (mini, microsat…)

Il peut modifier :

- 1- Un site de restriction

- 2- La longueur d'un motif répété

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Un polymorphisme peut induire une longueur détectable par enzyme de restriction

Microsatellites

Minisatellites

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Les polymorphismes du DNA servent à son analyse

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RFLP

Un RFLP est défini par un couple : Sonde / Enzyme(Restriction Fragment Lenght Polymorphism)

Sa localisation précise, sa variabilité et sa transmission mendélienne lui confèrent un caractère de marqueur génétique codominant.

Le couple sonde / enzyme se caractérise par : + / - et correspond à un bi-allélisme Les RFLPs sont mis en évidence par la méthode de Southern ou PCRPour être informatif : le RFLP doit être reconnu par une sonde unique

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On distingue des sites de restriction obligatoires (toujours présents) et des sites de restriction variables

Polymorphisme

1

3 42

5

Mst II

Chez un individu sur 100 on découvre

20Kb

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Exemple

EcoR1 reconnaît, puis hydrolyse

5' GAATTC 3'

3' CTTAAG 5'

Si cette séquence est mutée l'enzyme ECOR1 ne peut plus hydrolyser l'ADN à cet endroit.

A B

GAGTTCCTCAAG(A + B)

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Marqueur

Eco RI+Gène

Position non connue avec précision

Eco R1-

M

Gène muté maladie

Ces fragments peuvent être différencier par leur taille

5kb

4kb

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Polymorphisme de Répétition

EcoRI EcoRI

200 pb

EcoRI EcoRI

300 pbsonde

200300

A/B A/A B/B

(CA)n

+ 2(CA)n

Allèle A

Allèle B

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III- LES TECHNQIUES

A - La méthode PCR

Polymerase chain reaction

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Avantage de la Technique • Elle permet d’étudier un segment d’ ADN au sein

de tout le génome si l’on connaît sa séquence • Elle permet de recopier ce segment

(amplification des millions de fois et de le visualiser par une méthode électrophorétique

• Par coloration au bromure d’éthidium ou autre colorant

• Ce segment peut être par la suite traité pour mettre en évidence une mutation

• Pour le cloner

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Principe

• Succession de réactions de réplication d'une matrice double brin d'ADN.

• Chaque réaction met en oeuvre deux amorces oligonucléotidiques dont les extrémités 3-prime pointent l'une vers l'autre.

• Les amorces ou «primers» en anglais définissent alors, en la bornant, la séquence à amplifier.

• Les amorces sont orientées dans le sens 5’ vers 3’

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• Chaque produit de chaque étape de synthèse sert de matrices pour les étapes suivantes. Au lieu d'être linéaire, l'amplification obtenue est exponentielle.

• Imaginée par K. Mullis en 1985 (Prix Nobel de Chimie dès 1993), la technique connaît un essor considérable à partir de la commercialisation (vers 1988), d'une ADN polymérase résistante aux températures élevées (la Taq polymérase), qui permet une automatisation de la technique en supportant les sauts de température

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On opère avec des sauts de température à chaque étape

• EN effet, une température dite d’annealing permet l’hybridation de l’amorce avec l’ADN

• ( 56°) • A une autre température , c’est l’ élongation

ou extension ( 72 ° C) • A une dernière température les brins amplifiés

sont séparés : température de dénaturation • ( 94°c )

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• On peut ainsi amplifier assez facilement une région couvrant 2000 pb

• Des amplifications de morceaux plus longs sont possibles mais plus délicates ( 10 000 pb)

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B- GAP-PCR / Application de la méthode PCR au diagnostic de grandes délétions

Les délétions mises en évidence par la méthode PCR

Des amorces choisies pour être très éloignées l’une de l’autre lorsqu’il n’existe pas de délétion ,

ne permettront pas un amplification En cas de délétion, les amorces sont rapprochées

et l’ADN amplifié signe alors une délétion.

Dodé C, Krishnamoorthy R, Lamb J, Rochette J. Br J Haematol.1993 Jan;83(1):105-11

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Distance entre A4 et A9 = 1800 pb : si les gènes alpha 1 et alpha 2 sont présents la Région amplifiée est de 194pb entre A4 et A1B. Si ,les deux gènes sont délétés la distance entre A4 et A9 est raccourcie et l’amplification révèle un fragment de 550pb.

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C- LA PCR INVERSE ou Reverse Transcriptase PCR ( RT-PCR)

• La RT-PCR a été mise au point pour utiliser les ARN comme matrice d'amplification de la PCR

• On isole des ARN m par purification spécifique de de ces derniers• Ils sont ensuite « recopiés » en ADN par une

enzyme : la transcriptase reverse • On réalise une PCR comme précédemment • Le produit final est un ADN dont l'un des brins est

complémentaire de l'ARN d'intérêt et l'autre brin a la même séquence que cet ARN d'intérêt (à la substitution près de U par T).

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Difficultés Techniques

• La contamination des échantillons par de l'ADN génomique est une des principales difficulté de cette technique. En effet, l'ADN génomique peut entrer en compétition avec l'ADNc pour lors de l'étape d'hybridation des amorces. Diverses parades sont alors utilisées :

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Parades

• 1 Des ARNm eucaryotes polyadénylés peuvent être purifiés par chromatographie de l'ARN cellulaire total sur une colonne où sont immobilisés des oligo-dT (oligonucléotides constitués de désoxythymidines).

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• 2 Les ADN présents dans l'échantillon peuvent être détruits par ajout d'une activité désoxyribonucléase (dépourvue d'activité ribonucléase).

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• 3 Choisir les amorces aux bornes d'un intron. Ainsi, les produits d'amplification issus de l'ADNc et ceux issus d'ADN génomique contaminant seront distingués selon leur taille : les fragments issus de l'ADN génomique (contenant l'intron) auront une taille supérieure aux fragments d'amplification issus de l'ADNc (ne contenant pas l'intron).

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D- MUTAGENESE DIRIGEE

• Réalisation d’une amorce mutée

• l'extrémité 3' doit rester complémentaire de la séquence de matrice à amplifier (initiation de la polymérisation) l'extrémité 5' qui peut porter de nombreuses modifications : des mutations ponctuelles, des sites de restriction, des séquences de recombinaison etc.

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Mutation à des extrémités

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Principe • Les amorces 1 et 2 sont des amorces mutées (la

région 5' qui porte la mutation est symbolisée par un rectangle rouge). Obtenues par synthèse chimique .Ces amorces sont complémentaires (le recouvrement des régions 5' mutées en rouge est particulièrement important pour la suite). Les amorces 3 et 4 bornent le segment d'ADN à modifier. Elles détermineront la longueur du produit final.

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• Deux réactions de PCR sont effectuées en parallèle : Une PCR avec les amorces 2 et 3 donne un produit d'amplification correctement muté dans la région désirée, mais de petite taille

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• Une PCR avec les amorces 1 et 4 donne aussi un produit muté, mais toujours de taille insuffisante.

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• Les deux produits de PCR sont purifiés , il s'agit surtout d'éliminer les amorces 1 et 2

• On regroupe dans le même tube tous les produits PCR

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• Ils possèdent en commun la région mutée (région d'ADN possédant un rectangle rouge). L'hybridation de ces deux fragments par cette partie commune est critique pour la dernière étape.

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• Une dernière PCR utilisant les amorces 3 et 4 est alors réalisée sur ce mélange et donne, en effet, un fragment de la taille souhaitée contenant la mutation.

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IV LE SEQUENCAGE

• ADN• ARN

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Séquençage de l’ADN . F SANGER (1977)

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Séquençage de l’ADN :Walter GILBERT

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LE SEQUENCAGE PAR LA METHODE DE SANGER

• On copie le brin à séquencer de telle sorte que les copies soient radioactives (ou repérables par un autre marquage : fluorescence )

• Soit la séquence suivante à déterminer :

• 3’ …… G C A T G A T C G G 5’ • ……Amorce présentera une extrémité 3’ OH libre

• Il faut choisir une amorce complémentaire d’un bout de séquence connue

• • •

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• La DNA polymérase réplique 5' 3' à partir 3'OH libre de l’amorce

• en présence d'un 2, 3 didéoxynucléotide la réplication est stoppée.

• Statistiquement on observera des fragments d'ADN de tailles différentes en fonction de l'incorporation du 2, 3 didéoxynucléotide pendant la réplication du brin à séquencer

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•Tube 1

• 4dNTP, ddGTP• 3' GCATGATCGG• CG#

• CGTACTAG#

• Tube 2• 4dNTP, ddATP• 3'GCATGATCGG• CGTA#

• CGTACTA#

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• Tube 3• 4dNTP, ddCTP• 3' GCATGATCGG 5'

• ddC #

• CGTAC#

• CGTACTAGC#

• CGTACTAGCC#

• Tube 4• 4dNTP, ddTTP• 3' GCATGATCGG 5'• CGT#

• CGTACT#

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Tube 1 : ddGTP1er fragment : 2 bases2nd fragment : 8 bases

Tube 2 : ddATP1er fragment : 4 bases2nd fragment : 7 bases

Tube 3 : ddCTP1er fragment : 1 base2nd fragment : 5 bases3ème fragment : 9 bases4ème fragment : 10 bases

Tube 4 : ddTTP1er fragment : 3 bases2nd fragment : 6 bases

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• Remarques :• Il n'y a jamais deux fois la même taille quelque

soit le tube examiné• Les produits sont radioactifs, ils vont être

repérés par autoradiographie après électrophorèse en gel d'acrylamide.

• Les fragments migreront d'autant plus vite que leur masse moléculaire est faible.

• La lecture se fera de 5’ vers 3 ‘ en commençant par les fragments les plus petits ( du bas vers le haut)

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• On lit donc

• Lecture : 5' CGTACTAGCC 3'• Séquence : 3' GCATGATCGG 5‘

• On donne le produit complémentaire du produit de lecture :

• 3’ …… G C A T G A T C G G 5’

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Sanger Centre-Cambridge

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Sequençage direct de l’ARN • ON ne transforme pas en cDNA • Des séquences de poly T sont bloquées sur un support• Le support capture les ARN par leur extrémité poly A • 3’dA : 3’ Desoxy A bloque la fin de séquence d’ARN • Il sont ensuite complétés avec addition de Thymidine

non marquée • Puis bloqués avec des nucléotides fluorescents A et C

et G , dit terminateurs + Polymérase. • Cette méthode permet le début d’une lecture par

fluorescence là où commence le RNA et ne lit pas le poly A .

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V- ANALYSE DE l’ADN Par les méthodes de séparation de fragments

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La Séparation des fragments d’acides nucléiques

V-A Techniques Electrophorétiques

Les macromolécules chargées électriquement peuvent migrer dans un champ électrique.

La densité de charge par unité de longueur est la même dans l’ARN et l’ADN (contrairement aux protéines). La migration s’effectue du Pôle - vers le Pôle + du générateur.

La différence de migration se fera donc par la taille Le support de migration ( acrylamide, agarose) jouant un rôle de filtre, les fragments les plus petits migreront plus rapidement que d’autres plus longs dans le dispositif classique.

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Coloration au Bromure d’éthidium sous lampe UV

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La migration s’effectue du haut vers bas . Les fragments les plus petits sont

en bas du gel de migration

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Électrophorèse d’ADN humain sans hydrolyse par ER : Smear

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V-B LA METHODE DE SOUTHERN

• http://www.univrouen.fr/ABISS/L1/WEB/empreinte/southernblot.html

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• 1) Extraction de l'ADN des différents génotypes à analyser

• 2) Digestion de l'ADN par un enzyme de restriction. On obtient alors des fragments d'ADN de longueurs différentes selon les individus. Cette différence de taille est due a une différence du nombre de site de restriction qui varie selon les individus. l'ADN à analyser est fragmenté en séquences plus ou moins longues en fonction du polymorphisme de longueur des fragments de restriction.

SOUTHERN BLOT

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• 3) Ces fragments de restriction sont séparés selon leur taille par une électrophorèse en gel d'agarose. L'ADN étant chargé négativement, il migre de la cathode vers l'anode. Les fragments les plus petits sont les plus rapides.

• 4) LE BLOT / L'ADN est ensuite transféré sous forme dénaturée ( NAOH, KOH, 1M) sur une membrane de nylon. La position relative des fragments d'ADN est préservée durant le transfert.

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• 5 ) L’ HYBRIDATION :

• La membrane est incubée dans une solution contenant une sonde marquée préalablement, soit par la radioactivité, soit chimiquement. La sonde s'hybride alors avec le ou les fragments d'ADN avec lesquels elle présente une homologie.

• On utilise couramment deux types de sondes : • les sondes génomiques (ADNg) • et les sondes d'ADN complémentaire (ADNc).

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• Les sondes génomiques sont obtenues par digestion de l'ADN total du génome nucléaire de l'espèce étudiée à l'aide d'un enzyme de restriction. Les sondes d'ADNc correspondent nécessairement à des gènes exprimés, puisqu'elles sont obtenues à partir des ARN messagers.

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• 6) L'endroit, ou les endroits, où la sonde s'est fixée sont révélés en plaçant la membrane au contact d'un film sensible à la radioactivité (figure), ou en réalisant une réaction enzymatique colorée spécifique..

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4kb

2Kb

4.2Kb

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Interprétation des résultats considérant 2 allèles

Sonde

Sites Eco R1

4Kb 2Kb

Site polymorphe sur le 2 ième allèle :

4.2kb

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Interprétation du résultat

• Des individus sont 4/2 // 4/ 2 (homozygotes) • Des Individus ne montrent aucune hybridation • -- Délétion d’au moins 6 kb (homozygote)

• Le dernier : 4/2 // 4.2/2 : ses deux allèles sont différents ( hétérozygote)

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Diagnostic de la drépanocytose

• Maladie génétique fréquente en Afrique noire au Moyen Orient et en Inde . Maladie récessive

Mutation ponctuelle par substitution Glu > Val sur le gène beta globine ( codon 6)

GAG > GTG Cette mutation supprime un site de restriction

pour l’enzyme Mst II

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LE NORTHERN BLOT

• // Southern BLOT

• Isolement de l’ARN colonne oligo dT• Electrophorèse sans dénaturation , sans

hydrolyse • Hybridation avec une sonde monobrin

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LA GENOMIQUE

• Science des Génomes • La génomique regroupe un ensemble d'analyses qui vont :

• - d’une cartographie physique de l’ADN • - d’ une cartographie des ARN messagers

• - à l'identification de gènes , de • polymorphismes et de séquences d’intérêts

• - à l'étude de leurs fonctions

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Parler de brin sens ou antisens sur l'ADN n'a de sens (humour) que si nous nous plaçons dans le contexte de la transcription.Le brin sens est celui qui a la même séquence nucléotidique que l'ARN messager transcrit (T / U mis a part bien sûr). Le brin antisens sert de matrice à la polymerase.L'ARN est polymerisé de 5' vers 3'.La matrice (brin "antisens") peut donc être représenté du 3' au 5'Le brin complémentaire (brin "sens") est donc représenté du 5' au 3'.

sens 5’ -ATTTGCTGCCTT... TGC-3'antisens 3'-TAAACGACGGAA.. ACG-5'

RNA messager : 5'-AUUUGCUGCCUU..UGC-3’La lecture d’une séquence par la méthode de Sanger lit (en commençant par la talile la plus petite ) de 5’ vers 3’ c’est à dire le brin sens

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Cartographie de l’expression des GENES

• Hybridation de l’ARN sur puces à ADN

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On construit des supports ou chip-arrays .

6.5 millions de brin sur chaque chip

Des Millions de brins de DNA gréffés et accessibles

Brins = 25 base pairs

Chaque grille est un

carré de 11

micromètres

porteur de

séquences d’ ADN

(oligoprobe

( complémentaire à

celle de séquences

de gènes)

Analyse totale du génome par utilisation de l’expression différentielle des gènes

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RNA (purple) has bound to its DNA probe built on the array

RNA

Fluorescent StainBiotin

After staining, RNA (purple) bound to the DNA probe built on the array will fluoresce

Chaque espèce d’ARN va hybrider avec la sonde d’ADN correspondante sur la puce préalablment chargée de sondes d’ADN. La combinaison ARN biotinylé – ADN est fluorescente et donc repérable par un système de lecture approprié