Mes tous premiers remerciements s'adresse à mes parents, mon frère et ma grand-mère,

qui malgré l'océan qui nous sépare ont su me soutenir, m'encourager et suttout êh-e toujours très

présents pour moi.

Je ne saurais remercier suffisamment mon CO-directeur. le Dr Sylvain Moineau, pour

m'avoir très chaleureusement accueillie dans son laboratoire et de m'avoir si bien dirigée tout au

long de ma mahise. Un gros merci, à mon directeur, le Dr R-E Sirnard pour m'avoir permis de

faire ce projet

Plusieurs personnes m'ont été d'un très grand secours durant toute la période du projet

Ainsi. je voudrais remercier tout spécialement le Dr Ismail Fliss pour son soutien et son

encadrement et le Dr Eric Emond pour tous ses précieux conseils.

Je ne peux passer sous silence ma famille canadienne: l'équipe du Dr Moineau, à

commencer par papa et mes deux sœurs (Isabelle et Denise) avec qui je ne peux compter tout les

moments agréables passés ensemble. Eric Emond, Eric Dion, Nathalie, Khady, Steve, Fred,

Julie, L i e .... vous m'avez tous aidé à un moment où à un auire dans ma maiirise, je vous en

remercie, mais encore plus pour voire amitit et pour l'ambiance au laboratoire.

Je voudrais aussi remercier le groupe Immunova pourla production des anticorps et pour

m'avoir assez souvent accueiilie dans leur laboratoire. Un gros memi à Diane Montpetit pour

avoir si gentillement accepté de faire mes photos en microswpie éléctronique.

Mes derniers remerciements s'adressent au CORPAQ et le CRSNG pour leur support

financier.

Le phage 438 appanenant à l'espèce c2 a été purifié et utilisé pour immuniser des souris

de type BalWc. Deux anticotps monoclonaux (2A5 et 6G7) d'isotype IgG2a ont été sélectionnés

parce qu'ils réagissaie~t conw tous les représentants de I'espèce c2 testés. Les anticorps sont

spécifiques à cette espèce et ne réagissent pas avec les phages des autres espèces (936 et P335).

ni avec les extraits ceUulaires de Lactococcus lacris, ni avec l'ADN phagique. Par

irnmunornicroscopie, il a été démontré que ces anticorps reconnaissent uniquement des protéiines

de la tête du phage. Des analyses de type Western ont démoneé que ces anticorps ne réagissent

pas avec des protéines dénaturées. En ajoutant à cette technique un traitement de renaturation,

les anticorps ont réagi avec deux p r o t é i s majeures de la tête du phage ayant des poids

moléculaire mpectifs de 170 kDa et 80 kDa Des tests d'inhibition ont démontn5 qu'il s'agissait

bien de deux anticorps différents. Ces anticorps pourraient é!x très utiles pour la détection et

l'identification rapide des phages de I'espèce c2 en i n d u s ~ e fromagère.

Sandra Chibani

Etudiante

Luctococcuc lacrir est u W dans la production de produits laitiers fermenté< tels le

Chcddar, cottage ou crème sure. Les bactériophages sont les principaux agents responsables de

l'inhibition partielle ou totale des fermentations. Trois espèces de phages sont problématiques

en indusme fromagère (c2, 936 et P335). Une étude au début des années 90 a démond que

l'espèce c2 serait la plus courante dans les indusmes québécoises. Différentes méthodes sont

présentement utilisées en indusnie pour d5teck.r ces phages. La plupart sont des méthodes

indirectes. Elles ont le désavantage d'étre coûteuses et lentes. Le but de cette recherche est de

développer un outil immunologique simple et rapide pour détecter les phages de l'espèce c2.

Un phage appartenant à ceite espèce a été purifié et utilisé pour immuniser des souris de

type Balblc. Suite à une fusion avec des cellules immortelles, des anticorps monoclonaux

diigés contre les phages de l'espèce c2 ont été obtenus. Deux anticorps (2A5 et 6G7) d'isotype

IgGh ont été sélectionnés parce qu'ils réagissaient contre tous les représentants de l'espèce c2

testés. De plus, ces anticorps n'ont pas réagi contre des phages des autres espèces (936 a

P335). N avec des exüaits provenant de la cellule hôte, ci avec de I'ADN phagique. Des

expériences d'immunomicroscopie ont démontré que les anticorps reconnaissent des protéines

suuchuaIes de la tête du phage. Le seuil de détection était de IO7 ufplml. Des expériences de

type Western ont démonnt que ces antiwrps ne réagissent qu'avec des protéines natives. En

ajoutant un üaitement de renahuation, les deux anticorps ont réagit avec les protkiines majeures

de 80 kDa et de 170 kDa de poids moléculairr. O sont des protéines de tîte codées par le mâne

gène.

Ces antiwrps pourraient être t d s utiles pour la détection a l'identification rapide des

phages de l'espèce c2 en indusme fromagère.

AVANT PROPOS ..................................................................... II

RÉSUMÉ CO= .................................................................. JII

RÉSUMÉ ..................................................................... IV

.................................................... v

LISTE .............. ............................................. VI1

LISTE DES FIG- ............................................................ VI11

.................................................................. INTRODUCTIOF& Jx

ITRE 1: Revue de I i w ................................................. 1

1.1 La production fromagère ...................................................... 2

...................................................... 1.2 Les ferments lactique n - 4

1.2.1 Les lactocoques ............................................................................... 4

...................................................................... 1.2.2 Les diiérents ferments 5

13 Les bactériophages de lactocoques ........................................... 7

.................................................. 1.3.1 Classification des phages de lactocoques 7

.............................................. 1.3.2 Caractéristiques des phages de lactocqes 12

............................................................. 1.3.3 Les diiérents types de phages 13

1.3.4 Le cycle lytique .............................................................................. 14

1.4 L'impact des bactériophages en industrie fromagère ...................... 18

1.4.1 La problématique des phages en industrie fromagère .................................. 1 8

1.4.2 Stratégies de lutte conm les phages ....................................................... 22

1.4.2.1 La mtation des ferments .............................................................. -22

vi

1.4.2.2 Utilisation de souches résistantes aux phages ....................................... 24

1.5 Les méthodes de déwction .................................................. 25

1 . 5.1 Les méthodes indirectes .................................................................... 25

1.5.1.1 Le test d'activité ........................................................................ 25

1.5.1.2 Le test de Pearce ........................................................................ 27

1.5.1.3 Le test de l'indicateur .................................................................. 27

1.5.1.4 Le test de turbidité ...................................................................... 28

1.5.15 Le test d'impédance ................................................................... -28

1 S.2 Les méthodes d ic tes ...................................................................... 29

1 S.2.1 L'utilisation de sondes génétiques .................................................... 29

............................................... 1.5.2.2 L'utilisation de tests immunologiques 30

.......................................................... 1 S.3 Enumération des bactériophages 31

1.6 Hypothèses et objectifs ...................................................... 32

Tableau 1: Les différentes espèces des phages de lactocoques ....................................... 11

Table 1. Bacterial strains and bacteriophages used in this study ..................................... 51

Table 2. Characteristics and b i d i g inhibition assays of the two Mabs ............................ 60

Figure ;: Microscopie élecmnique de cinq bactériophages de lactoques de l'espèce c 2 ..... 9

Figure 2: Représentation schématique du cycle lytique des bactériophages ....................... 16

Figure 3: Distribution des phages au sein d'une usine ............................................... 20

Figure 1: Restriction paarnis (EcoFü) of phage DNA (A) with the correspondmg Southem blot probed with phage 438 DNA (B). Lanes 1 & 7. marker 1

kbDNAladder(l.0. 1.6, 2.1, 3.1. 4.1, 5.1, 6.1, 7.1, 8.1. 9.1, 10.2, 11.2, 12.2kb; GIBCOIBRL); lane 2, phage ebl; lane 3, phage c21; lane 4, phage mU, lane 5, phage 438; lane 6, phage 444, lane 8, phage p2

(936 species); lane 9, phage u136 (P335 species) ........................................ 52

Figure 2: Immunoela~on microscopy with gold-iabeled protein A

(particles, 10 nm). (A), phage 438; (B), Mab 6G7; (C), Mab 2A5 .................. 54

Figure 3: Phage smcairal protein pronies as determincd by SDS-PAGE (15%) with

the correspondmg immunobloü using 2A5 and 6G7. Phage proteins were

stained with Coornassie blue. Lane 1, phage 444; lane 2. phage 438, lane

3, phage c2; lane 4, prestained molecular weight marker (25, 32.5. 47.5,

62.83.175 kDa; NE Biolabs) lane 5, Mab 2A5 and phage c2; lane 6, Mab

6G7 and phage c2. ......................................................................... 56

Figure 4: Sensitivity of Mabs 2A5 (A) and 6G7 (B) usmg dot immunoassays ................. 58

INTRODUCTION

La transformation du lait en fromage se pratique depuis des siècles. Produit de manière

empirique, c'es grâce aux navaux de Louis Pasteur sur la nature des fermentations que la

production du fromage devient plus courante. Avec l'utilisation de lait de qualité et la m a i

des ferments lactiques. I'indusnie fromagère a connu un essort fulgurant. Mais l'accroissemm:

considérable de la demande durant les dernières années a engendrt de plus en plus de problèmes

au cours de la fabrication du fromage. La dinicuité majeure à laquelle doivent faire face les

industriels est de produire un fromage d'une qualité constante. Les ferments utilisés ainsi que le

processus de fabrication sont d'une importance capitale pour le maintien de ceme qualité. La

propreté du matériel, la qualité du lait, le temps de pasteurisation sont des facteurs qui peuvent

affecter les ferments. Bien que les industriels maihisent de plus en plus leur production et

dirigent de mieux en mieux leur fermentation, ils doivent toujours faire face aux bactériophages

des bactéries qu'ils utilisent (54,38,27). Ces bactériophages sont des virus capables d'aüaquer

les cellules procaryotes, de les lyser et les rendre inactives.

La fermentation est définie comme étant la uansformation de substances organiques par

des micro-organismes. Le p d é de fabrication du fromage se fait donc dans des conditions

de propreté maximale mais non stérile. Catains bactériophages sont capables de résister à la

pasteurisation et inhiber de façon partielle ou totale la fermentation. Les fromageries du monde

entier sont susceptibles d'être affectées par des contaminations phagiques. De par

l'accroissement de la production de fromage Cheddar, les producteurs de ce type de fromage

semblent être les plus vulnérables. Un nombre important de phages a été isolé à travers le

monde. Ces phages sont regroupés en plusieurs espèces (27) et sont de plus en plus sujets à de

nombreuses études. Trois espèces sont fréquemment rencontrées dans les usines les espèses

~ 2 , 9 3 6 et P335 (35.39).

Différentes mesures de précautions sont prises par les industriels pour limiter la

propagation de ces phages. Différentes méthodes de détection ont &té developpées. La plupart

sont indirectes puisqu'eiles mesurent l'effet du phage lors d'une fermentation et non le phage

lui-même. Leurs principaux mconvénients sont leur lenteur, leur coût et leur inconstance.

Quelques méthodes direaes existent mais sont difficilement applicables en industrie. Mais

malgré tous les efforts déployés. les bactériophages restent omniprésents dans les fromageries

(51).

Ce mémoire comprend deux chapitres. Le premier chapitre imite de la situation que l'on

rewouve dans la plupart des fromageries. 11 commence par aécrire les rudiments de la

production de fromage et les ferments utilisés dans une usine tout en se limitant aux lactocoques.

Les bactériophages de lactocoques et leur impact en industrie sont imités ainsi que les méthodes

de détection disponibles. Le second chapike imite de la production et de la caractérisation

d'anticorps monoclonaux dirigés mue les phages de l'espèce c2, qui constitue l'objectif

principal de ce projet de maîîse.

Revue de !ittérature

1.1 La production ïromagère

Le fromage remonte aux temps des premiers Egyptiens et des Grecs. Fabriqué de

manière très artisanale. il prolongeait la conservation du lait De p m sa grande valeur nutritive,

il a permis à plusieurs civilisations de se prémunir des famines. Au début des annéCs 1600,

c'est le gouverneur Samuel de Champlain qui a innoduit les premières vaches laitières au

Canada. Ce n'est qu'au 20ème siècle que les industries fromagères sont nées au d é p d de

I'enmprise familiale délaissée depuis lors (13).

A l'origine, le fromage était produit par acidiFcation spontanée du lait cru. En fait. ce

sont les bactéries lactiques contenues dans le lait qui engendraient sa fermentation. Pour les

entreprises familiales, obtenir un produit fermenté de qualité constante était très dificile.

Actueiiement. grâce aux techniques acquises et à l'utilisation de ferments lactiques sélectionnés,

les industries dirigent chaque étape de la fermentation (9).

La msformation du lait en fromage se fait en plusieurs étapes. Le chou d'un lait de

haute qualité microbiologique et chimique est une étape imporîante. Le but d'une fromagerie est

en fait d'extraire du lait sa matière azotée, sa matière grasse et ses minéraux (13). Les &ines

du lait repdsentent 80% des pro6mes du fromage (29). Au début du processus de fabrication

du fromage, le lait est acidifié en hansfomiant le lactose en acide lactique grâce à l'ajout de

ferments préalablement sélectionnés. L'acide lactique a des répercussions sur les quaiitis

organoleptiques du fromage. modifie les conditions physico-chimiques du milieu (18). I1

abaisse le pH, influence les réactions enzymatiques et cont~ôle la flore contaminante. Les

protéases des bactéries complémentent d i f f h t e s enzymes du lait et hydrolysent les wt ines en

peptides de faible poids moléculairr et en acides aminés (29). Ces derniers ont un r61c

fondamental dans la t c x m et dans le développement de la saveur du fromage. Lt lait est séparé

en un caillé qui deviendra hmage et en lactosérum. C'est la cascade d'actions des enzymes

protéolyiiques des bactéries qui permet la formation d'un gel durant I'étape de coagulaiion

subséquente (29). Vient ensuite i'étape d'égoumge où cn procède à la synérèse du gel, soit

i'élimination du lactosérum de la masse du caillé. EUe est importante dans le sens où la texture

du caiiié final dépend du de@ de déshydratation imposé. L'addition de sel tel que le NaCl

permet d'une part d'assaisonner et d'égoutter le caillé et d'auue part d'&ter I'acidificacion et

d'inhiber les mauvaises fermentations.. Il limite aussi le développement de coliformes

responsables des mauvaises saveurs du fromage. Au cours de l'étape d'affinage et de

maturation, Sachirité enzymatique se poursuit et les caractéristiques organoleptiques (couleur,

texture, saveur) du fromage se développent (13.18).

Il existe une très grande variété de fromages et chacune des étapes du processus de

fabrication sont ajustées en fonction du produit final vonlu. La parricularité du fromage Cheddar

est d'avoir une &tape dite de *cheddarisation». EUe permet de produire un fromage à pâte bien

ferme. Lc caillé est sorti du bassin et pressé. Aprts coagulation, il est coupé et chauffé à 38OC

ce qui le raffermit C'est I'étape principale de lu cheddarisaticn. Elle permet d'éliminer i'aspect

granuleux du fromage. Après avoir été souiirés, les blocs de caillé formés subissent une série de

retournements. Ils sont coup% pour éliminer complètement le petit lait et maximiser l'uniformité

du salage. Le fromage obtenu est mis en moule et pressé. Tous ces htements permeaent

d'augmenter la fermeté (13).

Durant l'année 1996, 60% de la prùduction de laii, soit 4.7 miliions de tonnes, a été

txansformée en produits laitiers fermentés. Au cours de cette même année, 296,000 tonnes de

fromages ont été produits au Canada. principalement dans la province de Québec (52% de la

production totale). Les fromages fermes et &-fermes représentent 80% de: cette production.

Le principal fromage ferme produit est k Cheddar avec 116,000 tonnes dont une bonne partie

est export& v m les Etats-Unis, la Grande Bretagne et le Japon (5.6).

1.2 Les ferments lactiques

A travers le monde, les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation de plusieurs

produits laitiers. On retrouve principalement le yoghoun le fromage, le beurre et la crème sure.

Les bactéries lactiques réfèrent à à p n d groupe de bactéries et de plusieurs sous-groupes. ils

ont tous à sentier métabolique similaire. Leur principal produit final est l'acide lactique

nécessaire pour la production de fromage. Diérents genres bactériens sont remuvés au sein de

cette famille. Les ferments lactiques utilisés pour les produits laitiers renferment essentiellement

les genres: iucrococcus, iuctobacillus, Leuconostocs, Pediococcus et Sirep~ococcus. (21) Les

lactocoques sont utilisés pour la production de Cheddar.

1.2.1 Les lactocoques

Les lactocoques sont des bactéries à Gram positif, sphériques. non mobiles, formant des

chaînettes de deux ou plusieurs cellules. Ils sont anaérobes facultatifs et ne possèdent pas de

catalase. Des carbohydrates sont indispensables pour leur croissance Le genre Lucwcoccw

renferme cinq espèces: L. iactis, L. gmieœ, L. piscium, L. plnntarwn, L. rafimiuctis.

L. iuctis contient trois sous espèces: L. lactis ssp iactis, L. Iocris ssp cremoris et L. iactis ssp

diaccryiuctis. ils produisent principalement de l'acide lactique à panir de différents sucres tels, le

lactose, le glucose et le galactose: on parle alors de bactiries homofermentaires. Les lactocoques

sont des ferments dits mésophiles car leur tempéraDire optimale de croissance varie niae 25 et

30°C. Toutefois, les membres de la sousespèce &cris poussent à des températures plus élevées

allant jusqu'à 40°C. On les retrouve dans la naDire et principalement dans le lait et cmains

végét3ux (21.44).

Plusieurs baciéries lactiques isolées du lait sont auxotrophes à différents acides aminés.

La croissance de la bactérie est donc dépendante de leur présence dans le milieu de c u l m .

Selon la bactérie, la nécessité en acides aminés varie de 4 à 14 aa . Dans le lait, la quantité

d'acides aminés libres et de peptides est réduite. Les d i e s qui constituent 80% des pmtties

du lait, contiennent tous les acides aminés nécessaires à la croissance des bactéries lactiquer.

Ces dernières se sont donc do& d'un système protéolytique très performant capable de

dégrader les diiérentes caséines (29). Ainsi, les diffkrentes protéases réduisent les d i e s du

lait en peptides et acides aminés. C'est ce= activité protéolytique qui est exploitée par les

industriels dans la production de fromage. D'autes fonctions sont amibuées aux bactéries

lactiques dont la réduction du potentiel redox et la fermentation du ci- permeüant ainsi la

production de cenains arômes surtout chez la sous-espèce diaceryloctis.

1.2.2 Les différents ferments

Deux types de ferments peuvent être utilisés en industrie: les ferments indéfinis (ou

mixtes) et les ferments définis. Dans les deux types, les espèces bactériennes contenues dans la

culture sont connues (35, 12). Le choix des genres de bactéries lactiques présentes est très

important pour l'industriel. En effet, pour chaque type de produis laitiers, des espèces

particulières sont nécessaires. Les lactocoques sont principalement utilisés pour la fabrication de

fromage, tel que le Cheddar ou encore le cottage et la crème sure. Pour produire du yoghourf

on utilisera plut6t des bactéries thennophiles, soit les streptocoques et les lactobacilles. Pour le

mozarella, c'est un mélange de streptocoques et de lactobacilles qui est utilisé (12).

Dans un ferment mixte, le nombre et le ratio des souches sont inconnus. Ces cultures

sont isolées à partir de lait fermenté naturellement et ont été cultivées pendant plusieurs années.

Leur composition actuelle en souches doit être b-ès différente de la culture originale. Un ferment

d t i i par contre, est composé d'une à six souches bien déterminées (35). Leur nombre et leur

ratio sont connus. Ces souches sont choisies par les indusmels en fonction de leur capacité à

développer une saveur particulière dans le fromage. Elles répondent à plusieurs critères: elles

résistent à différentes tempéraaires et sont capables de produire de l'acide lactique avec une

bonne activité protémique et peptidasique durant l'étape de cuisson. Elles ne contiennent

aucun inhibiteur bactérien telles les bactériocines. En plus, elles doivent être tolérantes aux sels,

risisrantes aux phages et elles ne doivent pas servir de souches indicatrices pour des phages

tempérés. Tous ces parametres sont nécessaires pour minimiser les risques d'inhibition du

ferment Pour la production de Cheddar, les cultures définies sont les plus souvent employées.

Elles assurent la continuité du produit en un temps bien précis (12.35).

Plusieurs milieux peuvent être utilisés pour propager les ferments, parmi lesquels, on

retrouve bien évidemment le lait, le lait écrémé, le lait reconstitué à 10% avec de la poudre de lait

ou encore le lait fomfié d'ingrédients à bonne valeur nutritionnelle. Ce sont des milieux testés

contre des résidus d'antibiotiques et aseptisés grâce à un uaitement thermique (12, 35). Les

industries utilisent aussi du lactosérum comme milieux de culaire avec un contrôle de pH. Par

ajout de NH,OH ou de NaOH. le pH est maintenu à 6.0 durant toute la croissance des ferments.

C'est un moyen peu coûteux car l'usine récupère son lactosérum de la veille (12).

Les ferments peuvent être utilisés sous différentes formes. On les retrouve lyophilisés,

congelés, concentrés-congelés, super-concentrés et lyophilisés en présence d'agents

cryoprotecteurs. Ce sont les ferments concentrés-congelés qui sont les plus populaires malgré

leur coût élevé. ils peuvent être inoculés directment dans le bassin de lait Ils permettent

d'éviter la sous-culiure et par le fait même réduire les risques de contamination. Le ratio reste

plus stable et la variabilité génétique du ferment est moins affect& (12.35).

1.3 Les bactériophages de lactocoques

Frederick W. Twort en 1915 fut le premier chercheur à mentionner l'existence de virus

capable de lyser des ceiiules (1). En 1917, Félix Hubert d'HéreUe, chercheur canadien à

l'institut Pasteur de Paris, d é f i t les bactériophages comme des microbes invisibles capables

d'infecter des bactéries. De nos jours, on dénombre plus de 4000 phages isolés et décrits dans

plus de 100 genres bactérien. (2).

Les virus sont classés en différents morphotypes selon leur morphologie. Les

principaux critères sont la forme générale, les dimensions et structures de la tête et de la queue,

les siructures secondaires telles la plaque basale ainsi que la nature de l'acide nucléique du virus.

Les bactériophages de lactocoques sont constitués d'une tête icosahédrique et d'une queue non-

conûactile. La capside du phage est composée d'un noyau d'acides nucléiques entour6 d'une

couche protéique. La queue est une fuie structure protéique qui pane t l'infection de l'hôte. On

rerouve c h u certains phages une plaque basale à l'extrémité de la queue. Cette structure est

impliquée dans l'adsorption du phage à la bactérie. Les morphologies et dimensions varient

selon l'espèce de phages (Fig.1).

1.3.1 Classification des phages d e lactocoques

Plusieurs critères sont utilisés pour classer les phages. Les principaux sont la

morphologie et l'homologie d'ADN. D'autres critères tels le profil protéique, le profil de

resmction ou encore le spectre lytique, sont exploités d'avantage à des fins de caractérisation que

de classification. Douze espèces de phages de lactoques ont été répertoriées en se basant sur

les critères de morphologie et d'homologie d'ADN (27.8.48).

La microscopie élecaonique nous permet de déterminer la morphologie des phages. Dix

espèces de phages de lactocoques, ont été classées par le Comité International de Taxonomie des

Virus comme appartenant à la famille des Siphoviridne (tableau 1). ils se distinguent des aunes

familles par leur longue queue non conhadie (1. 27). De part leur importance. les phages de

l'espèce c2 ont rfmmnent été cataiogués comme appartenant à un des six genres de la famille

des Sipohoviridae (47). Deux morphotypes sont couramment rencon& chez les phages de

lactocoques appartenant à cette famille. il s'agit du morphotype BI, le plus fréquent, caraainsé

par une petite tête isomémque et du morphotype B2, caractérisé par une tête allongée et dans

lequel on retrouve l'espèce c2. Les phages de c m dernière espèce sont caractérisés par une tête

allongée d'environ 60 x 40 nm et une queue non contractile de 100 nm. Dans le morphotype

BI, on reaouve les phages des espèces 936 et P335, deux espèces souvent rencontr€es dans

l'industrie fromagère. ils ont une tête isomémque de diamèire inférieur à 60 nm et une longue

queue non contractile de moins de 200 nm (27).

Pa& les phages de lactocoques, on retrouve aussi deux espèces appartenant à la famille des

Podoviridae. iis sont caractérisés par une courte queue non-contractile. L'espèce PO34 a un

morphotype C2 avec une tête allongie de 65 x 44 nm et une queue de 25 nm. L'espèce KSY 1,

qui elle appariient au morphotypt C3, est caractérisée par une téte très ailongée de 240 x 50 nm

et une courte queue de 30 nm (27).

Dans toutes les fromageries à travers le monde, il semble que seulement trois espèces

sont fréquemment rencontrées: les e $ c e ~2 ,936 et P335 (35, 38). Les phages de i'espèce c2

sont retrouvés principalement au Canada, en Russie et en Australie. Les phages de l'espèce 936

sont les plus fréquents et se retrouvent un peu partout dans le monde (37). La plupart ont &

isolés aux Etats-Unis. au Canada et m Nouvelle Zélande. On les retrouvent aussi a France, en

Fiande, en Irlande, en Bulgarie, en Inde, cn Argentine, au Danemark et en Memagne (35).

Figure 1: Microscopie élecEo~que de cinq bactériophages de lactocoque de Sespèce c2.

Grossissement de 135 000X.

Tableau 1: Les différentes espèces des phages de lactocoques

ïphoviriàae let 'iphoviriàae 7 Podoviridae += PO34

Dimension (nm) Morphologie

Tête - 60x30

1.3.2 Caractéristiques des phages de lactocoques

Depuis les dix dernières années, de plus en plus de recherches se font sur la génétique

des bactériophages de lactocoques. Composé d'ADN double brin, le ghome des phages de

lactocoques contient 60 à 6 5 4 de A+T (26). La raille du génome varie en fonction de la

morphologie des phages. Les phages à tête allongée ont un génome variant de 18 à 22 kb,

tandis que les phages à petites têtes isométriques ont un ghome de 29 à 40 kb. La plupart des

phages de lactocoques ont un génome linéaire contenant des bouts cohésifs aux extrémités.

L'homologie d'ADN représente un outil indispensable pour la classification des phages

de lactocoques. Plusieurs €rudes ont démon& qu'aucune homologie n'existait entre les phages

d'espèces différentes, alors qu'une grande homologie existe entre les phages d'une même espèce

(3, 8, 25, 26, 38, 45, 46). Les profils de restriction permettent de différencier les phages au

sein d'une même espèce. L'ADN des phages de lactocoques a en général un nombre restreint de

sites de reconnaissance d'enzymes de restriction, ce qui facilite leur différentiation (45).

Du point de vue smctural, les phages de lactocoques sont composés de 1 à 3 protéines

majeures et de nombreuses protéines mineures (3. 40, 45, 46). Les protéines sont dites

majeures lorsqu'eiies sont en plus grandes concenrrations que les aurres protéines dites

mineures. JB phages d'une même espèct semblent avoir le même nombre de protéines

majeures. Les phages à petite tête isoméwique (espèce 936 et P335) contiennent en général 1

protéine majeure de 35 kDa de poids molénilak, tandis que les phages de l'espèce c2 à rête

allongée ont 3 protéines ma;eures ayant respectivement 30, 80 et 170 kDa de poids molhiaire

(33).

Le génome de deux phages de I'espècc c2 a été séquencé. le phage c2 et bIL67 (33, 49).

Une grande homologie de séquence est retrouvée ennt ces deux génomes. Les trois protéiines

majeures des 2 phages ont plus de 90% d'homologie en acides aminés (33). Chez les phages à

tête isométrique de l'espèce 936. le génome de phage skl (10) a été sequencé au complet tandis

qu'une partie de bIL41 et F4-1 a tté séquencé (42.11). Une identité de 9 7 4 est retrouvée pour

la protéme majeure de ces phages. Dans une récente étude. la proErne majeure de 80 kDa de

cinq phages de l'espèce c2 a été séquencée et une homologie en acides aminés supérieure à 9 0 4

a été trouvée (30). il en a été de même pour la protéme majeure de 35 kDa de cinq phages de

l'espèce 936. il semble que les protéines majeures chez les phages de chacune des espèces 936

et c2 soient quasi-identiques, mais il n'existe aucune homologie enüe les protéiines des Lcux

espèces (30).

1.3.3 Les différents types de phages

On distingue deux types de phages: les phages virulents et les phages tempérés. Les

phages virulents peuvent êüe considérés comme des parasites génétiques de la cellule. Ces

phages ne peuvent pas se répliquer par eux-mêmes. Après avoir infecté une cellule. ils

s'emparent de sa machinerie pour produire d'aurres particules phagiques. On parle alors d'un

cycle lytique qui ennaîne la lyse bactérieme et la libération de phages dans le milieu environnant

(7). Ce groupe de phages lytiques constirne le groupe le plus problématique pour I'induhe

fromagère (Fig. 2). Les phages texnpérés intègrent le chromosome des bactéries. Le prophage

ainsi fonné se réplique normalement et le génome de phage inséré est nansmit aux différentes

cellules filles. Après induction, l'ADN de phage se détache du chromosome bactérien et se

réplique al03 selon un cycle lytique (41).

1.3.4 Lecycleiyt ique

Le cycle lytique débute par une étape d'adsorption où le pSage vient se lier à la ceEule au

niveau de réccpieurs spécifiques. Ces récepteurs semblent êûe de mime protéique et certains

sucres peuvent Eire liés à ces récepteurs (41). La plupart des bactériophages de lactocoques ont

une plaque basale à I'extrémité de leur queue. La smcture protéique de cette plaque est

importante pour la reconnaissance des récepieurs cellulaires. Deux modes d'adsorption ont été

proposés. Le premier et le plus courant, évoque la présence d'un nombre limité de récepteurs

phagiques sur la membrane bactérienne. Il existe toutefois cettains phages qui adhèrent de façon

homogène sur toute la surface de la cellule. L'adsorption reste un phénomène tks spécifique où

un nombre resireint de phages peuvent se lier à une bactérie. La présnice de cations divalnits, le

Ca- en particulier, est essentielle à l'adsorption (41).

Une fois le phage fixé à la surface de la cellule son ADN naverse la queue du phage et est

éjecté dans la bactérie. La particule phagique vidée de son ADN, reste à l'extérieur de la cellule.

En présence de cet ADN, le métabolisme bacrérien est arrêté et toute la machinerie cellulaire va

servir à la synthèse de nouvelles particules phagiques. L'ADN de phage, jusqu'alors linéaire

dans la capside se circularise dans la bactérie grâce à ses extdmités cohésives. La réplication

des phages se fait grâce à la machinerie cellulaire. L'ARN est mscrit, les protéines sont

traduites et des têtes de phages sont formées. L'ADN répliqué se condense et pénèûe dans la

capside phagique. Des queues de phages viennent compléter les particules phagiques (41.35).

Plusieurs bactériophages sont ainsi formbs. La lyse bactérienne a lieu grâce à une lysine

produite par les phages, capable de dégrader le peptidoglycan de la paroi cellulaire. Plusieurs

lysines de phages de lactoques ont Cté séquencécs et des études ont démontri que Ic spcctn

d'action des lysines n'est pas aussi spécifique que le spemx lytique du phage. Ceat enzyme

perce la membrane de la bacténe mais ne peut inrcïvenir que de l'extérieur de la cellule. Une

holine de phage semble percer la membrane à partir de l'intérieur de h bactérie et faciite le

transport de la lysine de la cellule au milieu environnant Une fois la paroi celluiaire brisée, les

particules phagiques formées sont larguées dans le milieu et peuvent infecter les bactéries

avoisinantes. Pour les phages de lactocoques, la période de latence, soit le temps nécessaire au

phage pour effectuer un cycle lytique, est de trente à soixante minutes. Le nombre de phages

libérés dépend du phage en question et peut aller de 2 à 105 particules phagiques. Ainsi à partir

d'un phage. 100 particules peuvent être formées en 30 minutes. La propagation du phage peut

donc être très rapide au dépend de la bactérie (35).

Figure 2: Représentation schématique du cycle lytique des bactériophages.

Lyse

Réplication

1.4 L'impact des bactériophages en industrie fromagère

1.4.1 La problématique des phages en industrie fromagère

L'accroissement considérable de la production de fromage au début du 19ème siècle a

engendré l'apparition de nombreuses dicultés dans les usines fromagères. La contamination

par les phages demeure cependant le problème majeur pour cette industrie.

ïi a été démonüé qu'un virus bactérien était le principal responsable de l'absence

d'activité métaboiique d'un ferment durant la production fromagère. Cet échec de la

fermentation lactique a été observé pour la première fois en 1935 en Nouvelle-Zélande par

Whithead et Cox (54). ils peuvent aller jusqu'à inactiver complètement le ferment L'impact

économique réel des phages sur l'industrie fromagère est difficile à évaluer. Mais, on estime

que 7% des fermentations lactiques sont affectées par les phages (35).

Le lait cru est un habitat naturel pour les phages. Le procédé de pasteurisation ne permet

pas d'obtenir un lait stérile. Les bactériophages s'introduisent dans une usine par le biais du lait

Certains d'entre eux résistent à la pasteurisation et se propagent très rapidement au sein 3e

l'usine (34). On les retrouve dans les cuves et dans Vair ambiant de l'usine. Le lactosérum

semble être le «réservoir des phages* (Fig. 3). Au moment de la synérèse, le lactosérum est

séparé du caillé. S'il y a eu présence de phages, les cuves ainsi que les équipements sont

conraminés et les phages peuvent se propager dans des endroits sû-atégiques de l'usine. Les

producteurs de fromage Cheddar sont particulièrement affectés par le problème de phages. Par

contre, pour la production de yoghourt. ritape de synérèse n'est pas nécessaire et le problème

de phages est peu ou pas existant (17).

Pour le Cheddar. les indusniels utilisent de manière rép€titive les ferments ce qui faciite

la propagation des phages. En effet, les phages sont spécifiques à une souche particulière. Si le

même ferment est réutilisé à plusieurs qrises, l'hôte du phage étant toujours présente. le phage

ne peut que se propager, tandis que si l'hôte est absente, le phage sera dilué. Les entreprises

produisant des laits fermentés sont moins sensibles aux phages. Eues utilisent des volumes de

lait beaucoup plus petits et n'ont pas besoin de séparer le lactosénun ce qui réduit grandement les

risques de contamination (17).

La présence de phages en usine dépend aussi de la vitesse de propagation de la cellule.

Pour le Cheddar, les enaeprises utilisent des lanocoques dont la division cellulaire a lieu 1 à 6

fois durant une production. Pendant la production d'un camembert ou d'un fromage Feta, les

bactéries lactiques se divisent 6 à 12 fois. Thbriquement, !e Cheddar serait moins vuinérable

que le camembert d o n que pratiquement c'est l'inverse qui a lieu. Er effet, pour le fromage

Fera ou le camembert, la présence des phages ralentit le ferment mais la microflore du lait

continue à produire de l'acide lactique. Par contre durant la cheddarisation, il y a une étape de

salage qui réduit la multiplication des ferments et de la microflore du lait (31).

En résumé, le processus de la fermentation du lait a lieu dans des conditions non stériles

et cet environnement est propices à la contamination phagique.

Figure 3: Distribution des phages au sein d'une usine. Q ï i de McInthyre et a1 (34))

AIT

Run off 10 rlver

Effluent whey (irrigationlFertiliration)

Raw milk (Wild hostslphage)

Grass Trouoh waler

Cow \

Stratégies d e lutte contre les phages

Pour ralentir la contamination phagique, les industriels misent d'abord sur la propreté de

l'usine. Il est essentiel que toutes les salles ainsi que les équipements soient très propres. Pour

ce faire, ils utilisent des désinfectants chlorés à 500 ppm. La plupart des entreprises isolent la

salle de culture pour limiter la contamination. Un changement d'air s'effectue aux 5 à 9 minutes

et l'atmosphère est atomisée régulièrement Des lavages de tous les équipements ont lieu çnm:

chaque production. Malgré toutes ces précautions d'hygiène, les phages anivent à s'implanter

dans l'usine (17).

1.4.2.1 La rotation des ferments

Pour lutter con- les phages, les industxiels se sont concends d'avantage sur la manière

d'utiliser les ferments. Les premières culaires utilisées en usine éîaient des ferments mutes sous

forme de poudre qui provenaient d'Europe. C'est avec I'utilisation de ces ferments que

Whitehead en 1930 a observé les premiers phages (54). Plus tard, il isole des souches à paxtir

de ces culairrs et introduit en Nouvelle Zélande, l'utilisation de ferments définis en usine laitière

(22). Le problème de phages est resté prCsent malgré tout et prendra de l'ampleur avec la

mécanisation de la production et la demande croissante de fromages. A ce moment aux USA,

pour se prémunir des phages, on utilise davantage les ferments mixtes. De par la grande

diversité des souches contenues dans ces ferments le problème des phages est limité. En effet,

même si une souche est allaquée par des phages, il restera toujours d'aums souches pour

prendre la relève (22, 12). Un milieu de cullue inhibiteur des phages a été mis au point au

début des années 60 (14). Il contient des sels tels que le phosphate qui permettent de chélata le

calcium f r e i i t ainsi l'adsorption des phages. On y ajoutait aussi des nutriments. des

vitamines, des acides aminés et des extmits cellulaires qui favorisent la croissance des bactéries.

Ces milieux sont utilisés actuellement en Amérique du Nord. ïis ont toutefois plusieurs

inconvénients. En plus d'être coûteux pour I'indusuie, leur efficacité n'est pas maximale (17).

Ils peuvent aussi favoriser la croissance d'une souche plutôt qu'une autre et ainsi modifier le

ratio de souches dans un ferment, principalement dans un ferment mixte. L'utilisation de

ferments conccniréscongelés se fait de plus en plus couramment dans les usines du monde

entier (22). En Nouvelle Zélande, en plus d'une hygiène très sévère et l'utilisation de ferments

défuiis, ils ont implanté un système de rotation de ces ferments. Cene méthode se base sur les

connaissances nouvellement acquises du fonctionnement des bactériophages vis à vis de leur

souche hôte. En effet, les phages sont n-ès spécitiques aux souches et une bactérie infectée par

une espèce de phages est en général insensible aux autres espèces (22). Le principe du système

de rotation des culhurs fait intervenir plusieurs souches non apparentées c'est à d i des

bactéries sensibles B des phages d'espèce diiérente. Ainsi, lorsqu'un des ferments définis est

utilisé et que des phages apparaissent, I'usine change de culture et prend une culture insensible

au phage présent (17.35). Ce dernier est alors dilué à une ûï?s faible concenmtion. La rotation

introduite dans les usines de la Nouvelle Zélande impliquait six souches choisies pour leur

insensibilité à toute la banque de phages déjà retrouvés. Après quelques temps quatre de ces

souches ont été affectées. La plupart des usines ont alors utilisé la paire de souches restantes.

Pour certaines entreprises, ces souches sont restées efficaces pendant plus de 4 ans (22).

Le système de rotation implique que la souche sensible au phage présent dans l'usine ne

peut être utilisée que pendant quelques jours. Toutefois pour un indusuiel, le choix de souches

est en générai très limité. En effet, il ne faut pas perdre de vue le maintien de la qualité du

fromage. Plus la quantité de fromage à produire est importante, plus les ferments seront utilisés

et plus grand sont les risques d'accidents phagiques. Dans un tel cas. la souche préférée de

i'indusuiel ne peut être réutiiisée sporadiquement, surtout si elle est sensible aux phages.

ïi a été difficile d'implanter aux Etats-Unis le système de paires de souches en rotation

développé en Nouvelle Zélande. La plupart des ferments utilisés aux USA étaient des ferments

mixtes. Ces derniers favorisent la présence de beaucoup plus de phages différents puisque le

répertoire de souches est plus important (17).

1.4.2.2 Utilisation d e souches résistantes aux phages

Aujourd'hui, le système de rotation de ferments définis e n utilisé dans la plupart des

usines. Mais ce n'est toujours pas un système infaillible. Pour remédier de manière plus

efficace aux problèmes de phages de nouvelles stratégies sont recherchées. Les chenhem

tentent de plus en plus de développer des ferments capables de résister à ces phages. Chez L.

lacris, des plasmides contenant des mécanismes naturels de résistance ont été isolés. Quatre

systèmes de défense contre les phages ont été étudiés. Chacun de ces mécanismes intervient à

différents niveaux du cycle lytique du phage. Le premier interfere au niveau de l'adsorption.

Les récepteurs phagiques retrouvés à la surface de la bactérie sont bloqués par la production de

substances masquantes. Le phage ne peut plus venir se b e r à la surface de la cellule et la

baciéne est épargnée. Le second, intervient au niveau de l'injection de L'ADN du phage dans la

cellule. ï e phage s'adsorbe à la surface de la bactérie mais son ADN ne peut atteindre son

cytoplasme et le cycle infectieux n'a pas lieu. Le troisième mécanisme de défense est un système

de resniction et de modification que possède la bactérie. Lorsque I'ADN phagique atteint le

cytoplasme des enzymes de resmction viennent cliver cet ADN tandis qu'une méthylase protège

l'ADN cellulaire. Le dernier système implique I'avortcment de l'infection phagique. Lcs

plasmides codant pour ce genre de mécanismes affectent le cycle lytique du phage après

l'injection de I'ADN dans le cytoplame. L'infection est bloquée, la cellule meurt et la

propagation des phages est limitée. Pour mieux comprendre ces mécanismes deux revues de

l i n t r a m sont fortement conseillées (16.19).

1.5 Les méthodes de détection

L'importance des phages au sein d'une usine va dépendre du type de culaire utilisée.

Une usine qui n'utiliserait qu'une souche comme ferment serait a-ès vulnérable aux phages. Une

concennation de IO3 ufplml de phages niffirait pour inhiber totalement sa fermentation.

hrsqu'un indusiriel utilise une culuue définie composée de souches sensibles non apparentées,

la production d'acide n'est ralentie qu'à une concentration de 10' ufp/ml de phages. Si une

culaire mixte est utilisée, des concentrations de los *ml à 10' ufp/ml peuvent ralentir la

fermentation (35.51).

Plusieurs méthodes ont été développées pour la détection des phages en usine. On

distingue les méthodes indirectes et les méthodes d i t e s . Les premières mesurent l'effet du

phage sur un échantillon de lait ou de iactosémm et les secondes mesurent la présence du phage

lui-même.

1.5.1 Les méthodes indirectes

1.5.1.1 L e test d'activité

La première méthode de détection a été élabo+x par Whitehead et Cox en 1936 (24). Un

échantillon de lait ou de lactosénim suspecté de contenir des phages était mélangk à une souche

pure dans un milieu gélosé. La présence de phage était wnfïrmée avec l'apparition de m e de

lyse à la surface de la gélose. La méthode 6tait limitée à des souches pures. Une autre méthode

basée, cette fois, sur ia quantité d'acide lactique produite par un inoculum de 1% dans du lait,

incubé pendant 5 à 6 heures à 30'C a été développée. L'acidité d'une culaire était mes& en

présence et en absence d'échantillon suspect6 de conmir des phages. Cet échantillon &ait

considéré comme contaminé par des phages lorsque la production d'acide était réduite de 10% el

plus (51).

C'est sur ce principe que ce sont basés les m t s d'activité couramment employés

aujourd'hui. Plusieurs modifications ont été apportées. Les échantillons suspectés de contenir

des phages peuvent être de la poudre de lait, des échantillons de fromage, du lait, du iactosérum

ou encore des ferments. La poudre de lait est simplement diluée (1: 10) dans de l'eau stérile a

les échantiilons de fromage sont traités avec du cime de sodium (2%) mélangé à du phosphate

de potassium (2%) et sont homogénéisés. Tous les différents types d'échantiilons doivent être

clarifiés avant d'être testés. Le pH est d'abord ajusté à 4.5 pour précipiter les caséines. Les

échantillons sont ensuite cenaifugés à 5000 g pendant 20 minutes ou filtrés. Ces traitements

permettent d'éliminer les débris bactériens. Les échantiilons sont ensuite flués une seconde fois

avec un filtre de 0.45 p. Tous les ferments sont maintenus congelés. En cas de nécessité les

cultures sont inoculées dans du lait écrémé stérile ou du M17. Pour permetk aux phages de se

propager s'ils sont présents, du chlorure de calcium (10 mi@ est ajouté au milieu (51).

Sur les filtrais deux types de tests ont lieu. Le premier sert à détecter les phages et le

second, des inhibiteurs qui ont le même effet sur le ferment que les phages. Trois tests sont

effectués: le premier contient le flaat suspecté de contenir des phages. Le second contient le

méme filtrat traité à la chaleur et refroidit et permettra de déceler les inhibiteurs, le phage étant

inactiver par la chaleur. Le troisième est le contrôle: il ne contient pas d'échantillon suspect.

Trois milieux différents peuvent être utilisés pour tester ces filtrats: du lait pasteurisé, due lait

thexmisé ou du lait stérile. Pour fain les mrs, 1 ml de filûat est ajouté à 50 ml de milieu inoculé

à 1% avec une culture.. Après une incubation de 6 heures à 30°C l'acidité et le pH sont mesurés

et comparés au contrôle. Si la production d'acide souvent mesurée en degrés Domic est

diminuée de 10% ou plus, ou que la différence de pH est supérieure à 0.2 unité de pH entre le

filuat non mité à la chaleur et le contrôle (alors qu'il n'y pas de différence entre le f l m t traité à

la chaleur et le conaôle), i'&hanriUm de départ est contaminé par des phages. Ce test d'activité

est le plus î%quemment employé en industrie. Ii est toutefois peu conseillé pour des cultures

mixtes (51).

1.5.1.2 Le test de Pearce

ïi existe d'autres méthodes d t détection indinctes Eès intéressantes. Parmi eues. on

reaouve le test de Pearce (43). ii s'agi<. aussi d'un test d'activité, mais qui simule la sitution

retrouvée dans une fromagerie. Les échantillons suspectés de contenir des phages sont haités

comme pour un test d'activité habituel mais ils subissent en plus, tous les traitements de chaleur

infiigés lors du processus de fabrication du fromage. il est ainsi possible de tenir compte de

l'effet de la tempéraiure sur les mécanismes de défense de la bactérie. Ce test détecte les phages

qui pounaient se propager pendant les différents changements de températures.

1.5.1.3 Le test de l'indicateur

Le test de l'indicateur est aussi basé sur le p ~ c i p e du test d'activité. Ii fait en plus

intervenir un indicateur d'oxydoriduction ou de pH tel le bleu de méthylène (52. 15) ou le

bromocrésol pourpre (50). Un des indicateurs est ajouté à 10 ml de milieu à une concentration

de 10 cig/ml. L'avantage de cette méthode est que la baisse de pH est visible par colorimétrie.

En e f f e ~ s'il y a baisse de pH le bleu de méthylène devient incolore ou le bromocrésol pourpre

passe du bleu au jaune. En présence de phage la baisse de pH est ralentie et le changement de

couleur ne se fait pas. Pour une culnue mixte, il est possible de voir grâce à cc test l'effet de la

contamhation phagiqoe sur le ferment Ii arrive souvent dans une telle culture qu'une des

souches arrive à reprendre le dessus sur les contarninants. La production d'acide est plus taniive

mais suffisante pour obtenir un bon fromage. Avec le test d'indicateur il est possible d'observer

ce retard de production. ii est aussi possible d'effectuer ce test sur microplaque. Un grand

nombre de filtrats peut alors êire testé (51).

1.5.1.4 Le test de turbidité

Le test de turbidité est aussi une auire méthode indirecte de détection des phages. Basée

sur le même principe, elle compare I'absorbance mes& à 600 nm de 10 ml du milieu Ml7

inoculé à 1% avec un ferment au même essai supplémenté de 10 mM CaCI, et d'un échantillon

suspecté de contenir des phages incubis pendant au moins 6 heures à 30'C. La densité optique

(DO) est mesurée aux heures. Une DO d'une culiure qui pousserait sans phage serait supérieure

à 1.0 unité de D O et le milieu serait uouble. En présence de phages, les cellules sont lysées et la

D O chute. Ce test ne peut êae utilisé que pour des souches pures (51).

1.5.1.5 Le test d'impédance

Ur. autre moyen de détecter les phages est basé sur les modifications des propriétés

électriques du lait (35, 51). La présence de phage afiecte l'impédance électrique et la

conductance du lait Lors du ralentissement de la produaion d'acide, la quantité de métabolites

présents dans le milieu est afiictée et l'impédance aussi. ii existe des insüuments tel un

bactomère (53). qui sont capables de mesurer les différentes variations de l'impédance du lait

durant le processus de fabrication. CeDe technique très coûteuse a l'avantage de mesum une

grande quantité d'échantillons de manièrr très rapide.

Toutes ces méthodes peuvent êw uutilisées en industrie. Mais, leur premier dCsavantage

est d ' ê e indirectes. En plus de ne pas m e m en 6vidence le phage lui-même, elles présentent

d'auires inconvénients. La présence de faux positifs est possible et des tests d'énumération de

phages doivent être faits en plus de ces techniques. Lcs stratégies utilisées sont coûteuses et

lenres. Les tests demandent un minimum de 6 heures alors que I'indumiel voudrait éüe au

courant d'une contamination dans la premièn heure du processus de fabrication.

1.5.2 Les méthodes directes

PYéSentement, il existe seulement quelques méthodes directes de détection des phages de

L lactis. Leur avantage majeur est de détecter le phage lui-même dans l'échantillon à analyser.

Deux types de méthodes directes ont été développés. Le premier type de méthode est basé sur

l'existence d'homologie d'ADN entre les phages d'une mérne espèce et la deuxième méthode fait

intervenir l'immunologie.

1.5.2.1 L'utilisation Ce sondes génétiques

Moineau et al. (40). ont développé trois sondes génétiques dirigées contre les trois

espèces de phages les plus souvent n n c o n ~ e s en industrie, soient les espèces c2, 936 et P33.5.

Chacune des sondes permet de détecter tous les phages de la méme espèce. La technique a été

basée sur des analyses de type dot blot Dans un hybridot, les &hanrillons suspectés de contenir

des phages sont déposés sur une membrane de nylon. Après avoir été lysés in situ, on procède

à l'hybridation avec les sondes génétiques. Chacune des sondes va s'hybrider avec les

échantiiions contenant des phages qui lui sont homologues. Par cette méthode, il est possible de

tester plusieurs échantillons qui proviennent de sources différentes (lait ou lactosérum). Un

traitement de clarification est toutefois nécessaire. Il consiste en un ajout de 50 mM d'EDTA,

20% Triton X-100 et en un chauffage de 60°C pendant 5 minuces. Il reste que cette méthode

présente des inconvénients de taille. ïi s'agit d'une technique difïicilemmt applicable en

industrie; elle fait intervenir un appareillage peu commun en usine. Elle est aussi assez lente

puisque le résultat ne peut êm obtenu qu'après 24 heures. Le seuil de détection de cette

méthode est de 107 ufplml ce qui est peu sensible pour des fins industrielles.

1.5.2.2 L'utilisation de tests immunologiques

Plusieurs études ont démon* que les phages d'une même espèce possèdent un profil

protéique similaire, en partinilier au niveau des protéines majeures de shucclire. Les phages de

l'espèce c2 ont tous trois protéines majeures ayant une irès grande homologie en acides aminés.

Les phages des espèces 936 et P335 ont une seule protéine majeure. II est donc possible de

produire des anticorps conte des phages d'une même espèce. Lembke et Teuber (32) ont

développé des anticorps polyclonaux contre le phage PO08 de l'es* 936 et le phage POO1 de

l'espèce c2. Un ELISA basé sur ces anticorps a été conçu. Toutefois la méthode ne déte& que

10' ufplml de phages ce qui est une fois de plus peu sensible. Kolher et Milstem ont développé

en 1975 (28) une marégie relativement simple permettant d'obtenir des anticorps monoclonaux

par une technique de fusion cellulaire. La flexibilité de la réaction antigène-anticorps et ses

nombreuses propriétés thermodynamiques font que les méthodes immunologiques sont simples

et rapides à exécuter. Un autre ELISA a été développé en 1993 pour la détection de phages de

l'espèce P335 (36). Cette fois, des anticorps monoclonaux dirigés con= la protéine majeure du

phage u136 de I'espècc P335 ont été produits. Des échantillons infectés avec des phages de

l'espèce P335 autre que le phage uU6 préalablement clarifié peuvent ê te détectés par cet ELISA.

Le seuil de détection est de IO7 ufplml. Les anticorps ayant été produits contre une protéine

dénaturée, un mitement de dénaturation de I'khantillon est nécessaire ce qui rallonge la durée

totale à trois heures, ce qui est encore trop long pour l'induslxie. Le seuil de détection est encore

trop élevé mais les résultats sont encourageants dans le sens où il est possible par une méthode

imrnunologique de détecter des phages assez simplement et rapidement.

Énum6ration des bactériophages

De nos jours, pour une industrie, les méthodes i n d i t e s sont encore plus accessibles

que les méthodes directes. Dans ceaains cas. il est nicessaire de connaii la quantité de phages

présents dans un échantillon (51). Les phages peuvent être énumérés de manière quantitative ou

semi-quantitative (test du dépôt).

Le test du dépôt se fait sur péti. R nécessite une gélose contenant 1.5% d'agar. du

milieu Ml7 et du CaCl, 10 mM. Une souche bactérienne pure est ajoutée au même milieu gélosé

à l'état liquide qui contient seulement 0.75% d'agar. Très rapidement ce milieu est dispersé

uniformément sur la gélose. Après solidification, une goutte des échantillons suspectés de

contenir des phages filués est déposée à la surface de la gélose. Une fois séchés, les péms sont

incubés à 30'C pendant toute la nuit S'il y a présence de phages dans les échantillons, des

zones de lyses apparaibnt En faisant plusieurs dilutions de I'échantiiion, on peut déterminer le

quantité approximative de phages. Par ccae méthode, il est possible de tester plusieurs

échantillons simultanément A noter que dans le cas de ferments mixtes ou de ferments définis,

les souches insensibles poussent normalement et masquent la zone de lyse (23).

Avec une méthode quantitative, il est possible d'avoir une valeur plus exacte de la

quantité de phages dans un échantillon. Dans ce cas, le filhat est d'abord dilué. Ensuite, 50 pi

de chaque dilution est mélangé à 50 pi de culhur et ajouté à 3 ml du milieu gélosi liquide. Le

reste de la méthode est la même que pour le test de dépôt Le nombre de plages de lyse obtenu

dans les plus faibles dilutions est compté. En considérant qu'une plage de lyse quivaut à un

phage on obtient le nombre de phages contenus dans l'échantillon. Plusieurs paramètres comme

la wncenQation d'agar utilisé, le pH , l'épaisseur de la gélose influencent ceae méthode. Une

standardisation est donc nécessain (51).

1.6 Hypothèses et objectifs

Dans le domaine médical et vétérinaire, les méthodes immunologiques ont été largement

exploitées pour la détedon d'agents infectieux. Selon la li- plusieurs tentatives

impliquant l'utilisation d'anticorps monoclonaux pour la détection immunologique de phages de

lactocoques, ont eu lieu (32, 36). Dans chacun des cas, cntaines difficultés sont survenues.

Elles touchaient principalement la simplicité, la rapidité et la sensibilité.

Lembke et Teuber (32) ont été les premiers à utiliser des anticorps polyclonaux pour détecter des

bactériophages des bactéries lactiques. La durée globale du test était de 3 heures. Dans ce cas,

ils utilisaient des anticorps polyclonaux ce qui diminue la spécificité du test Un anticorps

polyclonal est un anticorps capable de rcconnaîae diiénnts épitopes tandis qu'il un anticorps

monoclonal est spécifique à une épitope et a une affinité grandement supérieure. Récemment,

Moineau et ai (36) ont produits des anticorps monoclonaux contre une protéine majeur de 35

kDa isolée chez le phage u136 (espèce P335). L'utilisation d'anticorps monoclonaux augmente

la spécificité de la méthode. Mais, les anticorps étant dirigés conw une protéime dénaturée, un

iiaitement de l'échantillon est nicessaire pour avoir une sensibilité satisfaisante. Ainsi, la

simplicité et la rapidité du test sont affectées. Dans les deux cas. le seuil de détection est de 10'

ufp!ml. Or. les phages en indusme deviennent problématiques à une concentration de l d u f p / d

et dans certains cas une centaine de phages suffisent

Dans I'indusme fromagère au Québec, les espèces les plus menaçantes sont tout d'abord

l'espèce c2 (57% des cas), ensuite i'espèce 936 qui touchent 37% des cas. il arrive qu'on

trouve des phages de l'espèce P335 (1.7% des cas) (39). L'abondauce des phages à tête

allongée peut s'expliquer par la nature des systèmes de ferments utilisés au Canada,. Nous

savons que les phages appartenant à une même e s p h ont un profd protéique similaire (3. 40,

45.46). Selon la liaéranirr, les protéines majeures de ces phages ont une grande homologie en

zcides aminés et possèdent un grand pouvoir imrnunogène (16.32.30).

L'objectifgénérai de œ projet est de développer une méthode immunologique simple ct

rapide pour la détection et I'idmtification dans le lait et le lact~senim des phages de lactocoques

appartenant à l'espèce c2.

L'objectif spécifique est de produire et caractériser des anticorps monoclonaux dmgés

contre les phages de i'espècc c2.

Les points culminants du projet vont donc étre de produire des anticorps monoclonaux

ayant une spécificité et une sensibilité adéquate. L'injection à des souris d'un phage purifié de

l'espèce c2. va induire la production d'anticorps monoclonaux. Seuls seront sélectionnés les

anticorps d igés conae plusieurs phages de la même espèce. Ces anticorps nous permemont de

détecter de manière à la fois simple, sensible et rapide les phages de l'espèce c2.

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Monoclonal Antibodies Raised Against Native Major Capsid Proteins of

Lactococcal c2-Like Bacteriophages.

Accepté pour publication dans: Appl. Environ. Mimbiol.

Phage 438, a representative member of the c2 species, was purified by CsCl gradient and used

to immunize BalWc mice. Monoclonal antibdies (Mab) w m raised and c h a m c ~ by

enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Two Mabs narned 2AS and 6G7 of isorype

IgG2a reacted only with phages belonging to the c2 species and not wirh phages of 936 and

P335 species, nor with a Lncrococcui IncnS c d extract and nor with phage DNA.

Immunoelec~onmicroscopy showed that both Mabs rccognized only phage head proteins. They

did not react with any denaaired phage proteins in Western blot However when the

niaocellu!ose membranes were mted with a triton-based buffet to assist in protein renatuiation,

7.45 and 6G7 recognized the two major capsid proteins with a molmlar weight of 80 kDa and

170 kDa Cornpetitive inhibition tests showed that the two Mabs bind to overlapping epitopes.

These Mabs may provide a useful tool for monitoring c2 species during dairy fermentations and

for genetic saidies.

Lacrococcuc h t i s is used for the production of fermented dajr prcducts including cheeses,

butkrmilk and Sour crcam. Occasionally. spontaneous fermentation failures occur during the

manufachire of these products and the main causarive agents are bacteriophages (13. 22, 37).

Lacwcoccur phages are c m n t l y classified into twelve species (613.33). However, only tine

lactococcal phage spxies have ken found to hinder mdusüial mesophiiic milk fermentations.

the prolate-headed c2 species and the isometric-headed 936 and P335 species (22). A previous

study showed that the c2 species was the most cornmon laMcoccal phage species found in

Canadian Cheddar cheese plants (24). The c2 spccies is also the only lactic acid bacteriophage

ranked at the genus level by the International Cornmittee on Taxonomy of V i s e s (31). in fact.

c2 is one of the only six genera in the Siphoviridae family. This taxonomie status emphasiis

the irnpomce of these unique and distinct phages not only to the dairy sector but also to the

field of bacterial vinases.

Lactic phages are naturally found in raw milk, resist pasteurization, have a short latent p e n d

and a large burst size. Therefore, they cm spread rapidly within a checse plant and constant

monitoring is critical (19). Various methods are already avaiiable XI dem phages and they are

divided into two groups, direct and indirect methods. The direct methods, which dem 1yhc

phages or phage components, include plaque assays (IO), DNA probes (25). and Enzyme-

L i e d Immunosorbent Assays (ELISA) (15.21). i n d i t methods de- inhibitory substances

usine starter activitylindicator tests. ATP mcasurement or elecaicai impedence (9.27, 35). Most

phage-testing laboratones are routinely performing starter activity tests and plaque assays

because they give information on the phage sensitivity of Lac[ococcuc s& used m the dairy

plant Both methods are reiiable but rime consuming as results are obtained within a day.

Obviously, on-iine phage detecion in cheese plant is virhially impossible witb such methods.

Furrhmore, they do cot provide information on the nature of the phage species.

Biotcchnology has recently provided tools to engineer phage-resistant starter cultures. These

improved süains rely on tht addition of nahiral plasmids encoding various phage resistance

mechanisms into phage-sensitive süains. For indusmal applications, the selcction of an anti-

phage system to introduce into a phage-sensitive smin depends on the phage species sensitivity

of that particular süain (22). As the next generation of phage resistant strains and rotation

strategies are b c i g inrrcduced into the system, a rapid detection and identification method of

lactococcal phages would be an asset.

Several attempts have b e n made to develop such a detection system. The lack or weak

homology between the genome of different lactococcal phage species was exploited to construct

DNA probes specific to the c2 and 936 species (25). Although many samples could be

processed sirnultaneously, the time required for performing the detedon method was too long.

A PCR assay was m n t l y developed to detect phages of anothn lactic acid bacteria, namely

Sneptococcus fhemphilus (4). In general, DNA techniques rcquire equipment that is not

Radily available in daji plants. On the other hand, the use of antibodies might bc more

appropnate since they are easier to handle. Two ELISA systems have already b e n describecl to

detect L. lactis phages (15.21). The first system employed polyclonal antibodies raised against

native phages of the c2 and 936 species (15). w h e ~ a s the second system used monoclonal

antibodier snecific to the denatured major capsid protein (MCP) of P335 phages (21). The MCP

is the most abundant protein in the phage sbucture and is a suitable target for detection purposes.

provided it is consewed in aii members of the species. Generally, members of the same phage

species have sirnilx structural protein profiles ( 3.2429.30).

In the p n m t study, we report the production and characterization of the first two monoclonal

antibodies specific to the native major capsid protein of lactococcal phages of the c2 species.

Bacterial strains, phages and media. Hosts and phages are listtd in Table 1.

iac~>coccus lacris shains were grown at 30°C in Ml7 broth containhg 0.5% glucose for

LM0230 or 0.5% lactose for indusaial suains (36). Phages werc amplified, purified, and

wncenaated by a discontinuous CsCl gradient (11, 12, 26) followed by a one-step CsCl

gradient Ultracenaifugations were performed with a NVT65 Beckman rotor, at 60,000 rpm for

18 hours.

Phage DNA analysis. F'urified phages (200 pl) were treated with protejnase K at a finai

concentration of 1mghn.i for 2 houn at 37OC. Then, 135 pl of 100 mM ammonium aœtate (pH

7.5) was added followed by an qua1 volume (335 pl) of phenol-chloroform. After

centrifugation at 14,000 rpm for 10 min, supematants were taken and the extraction was

repeated twice. DNA was precipitated with 0.7 volume of isopropanol. After cenaifugation,

pellets were washed with ethanol70% and resuspended in 50 pi of 10 mM Tris (pH 8.0).

Purified DNA was ûxated with R N k H and digested with restriction enzymes as

recommended by the manufacnirrr (Bochringer hlannhekn, Lavai, Qutbcc, Canada). Restriction

fra-mnents were elecuophoresed on a 0.8% agarose gel in TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1

m . EDTA), staining with ethidium bromide, and visuahd by W. Agarose gels were

iransferred to nylon membranes (Hybond-N+, Amersham. Arlington Height, il.) as describe-

previously (26). Phage 438 DNA digested with EcoRV was randody labeled with the DIG

DNA labehg kit (Boehrùiger Mannheim) and used as probe (25). Immunological detection of

DNA was performed according to the manufacturer's insmictions.

Protein profiles. Phage s t n i d proteins were fractionated according to Braun et ai. (3).

Rotein concentrations (15 pg) were estimated by the method of Lowry (16) and were separated

through a 15% SDS-polyacrylamide minigel at 100 V using the Mini-Protean II apparatus (Bio-

Rad Laboratones, Mississauga, On., Canada). Broad range protein MW markers (New England

Biolabs, Mississauga, On.) were used as molecular mass conirols.

Production and purification of monoclonal antibodies. Female BAWc were

imrnunized four tirnes inmperitoneally at 3-week intervals wirh 100 pg of phage 438 emulsifïed

in an equal volume of complete Freund's adjuvant for the first injeciion and in incomplete

Freund's adjuvant for the subsequent injections. Three final booster injections ai one &y

intervals with 100 pg of phage 438 were adminismted inmvenously 3 days pnor to fusion.

Spleen cells were fused with SPZO myelorna celis in the presence of polyethylene glycol 4000

and grown as describe- previously (8). Supematants were screened by direct-biiding ELISA

according to Moineau er al. (21). Irnmulon II microplates (Dynatech laboratones, M c h , Va.)

were coated with 100 ng of phage 438. Hybridorna ceiis that produced antibodies against phage

Q38 at an optical density above 0.7 were kept and re-iested by dit-bimding ELISA against 100

ng of: phages ebl, c2, ml3.438 and 444 (c2 species). phages 47. QI 1 and 442 (936 species),

phage u136 (P335 species), phage 438 DNA and L. [ncrLr ceIl extracü. Hybrid cells that

secreted antibodies reacting only with c2 species were subcloned by the limiting dilution

technique. Two stable clones, 2.45 and 6G7, were obtained. Monoclonal antibodies (Mabs)

were purified through a protein G-sepharose column, eluted with glycine 100 mM, pH 2.5 and

neuPalized with K2HP0, 1 M. Mabs were dialyzed against phosphate buffer saline (137 rnM

NaCl, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na,HP0,.7H20, 1.4 mM K,HPO,, pH 7.4). Mabs were

concenaated with Centricon-100 (Amicon, Oakviie, On., Canada ).

Sensitivity, aff~nity, isotyping and labeling of Mabs. To determine the sensitivity of

the Mabs, diluted phages were sponed onto ni~oce11ulose membrane (Amersham) with a

Hybridot apparatus (GiBCOIBRL, Grand Island, NY). Membranes were sahuated with

phosphate buffer saline -3% bovin serum albumin (PBS3% BSA) for 30 min ai 37'C and

washed twice in TBS-Tween (25 mM Tris, 200 mM NaCI, 0.1% Tween 20, pH 7.4).

Membranes were incubated for an hour at 37'C with the Mabs at a final concentration of 4 pghi

diluted in PBS-0.5% BSA. After 5 washes with TBS-Tween, peroxidase-iabeled goat anti-

mouse IgG (diluted 1:2000 in PBS-0.5% BSA) was added and the membrane was incubated for

30 min at 37OC. After 6 washes. the colorimeîric subsûate (diaminobenzidine, Sigma Chernical,

St-Louis, Mo.) was added at room temperature. Reaction was stopped with water. Mabs

affïuiity was determined by the sarne method, except incubation Limes tested with Mabs were 1,

5, 10, 15. 30 and 60 min. Isotyping was p e r f o d with the Isosmp kit and labeled with the

peroxidase labeling kit (Boehringer Mannheim).

Competitive inbibition immunoassay. Microplates were coated ovemight at 4'C with 25.

50,100 and 200 ng of phage Q38. After saturation with PBS3% BSA and washing with TBS-

Tween, one of the two selected Mabs was added unlabeled at various concenuations (0.1,1.10,

20 @ml) and incubated at 3PC for 30 min After washing, the rexnaining Mab, iabeled with

peroxydase, was diluted 1:2500 in PBS-0.5% BSA and added to microplates for 30 min at

37-C. Following washing, the orthophenylene diamine colorimeîric subsûate was added and the

optical density was mesured at 450 nm. The percent inhibition was caiculated as described

previously (21).

Western and renaturation treatment After separation on SDS-PAGE, proteins were

msfened with a Tram blot apparatus (Bio-Rad) to a niuoce11ulose membrane using Tris-

glycine-methanol buffer (25 mM Tris pH 8.3, 192 mM glycine, 20% methanol) according to

Smbrook et al. (32). Membranes were incubated in a renaturation buffcr (0.1 M Tris-HCI pH

7.0,2% Triton X-100, [28]) for 30 min. After 4 washing (100 mM rnaleic acid, 150 mM NaCI,

0.3% Tween 20, pH 7.5). membranes were incubated ovemight at 4°C in a 2% blocking

solution (Boehringer Mannheim). Labeled-Mabs diiuted 1:2500 were added and inùubated for

30 min at room temperame. Membranes wen washed for 2 hours (4 x 30 min) and Mabs-phage

proteins complexes wen detected wirh rhe cherniluminescence Western blotting kit (Boehringer

Mannheim).

Electron microscopy. Specimens wen observed with a Phiiiips Eh4 410 elecûun

microscope as desctibed prcviously (23). Magnification was monitorcd with catalase crystals

(18). Dimensions wen measured on photopphic print at a magnification of X135.000.

immunoelectronmicroscopy anaiysis was perfomed according to Moineau et al. (21). Mabs

were used at a finai concennation of 0.1 mglrnl and gold-labeled protein A (10 nm) at 3 pghd

(Si-ma).

Characterization of 6 phages from the c2 species. S u members of the c2 species

were obtained h m different international phage collections (Table 1). DNA resaiction paaems

showed that al1 six phages were different (Fig. TA). Southcm blot assays confvmed tha! these

phages share DNA homology (Fig. 1B). No DNA homology was found benveen members of

the three lactococcal species c2, 936, P335 used in this study (Fig. 1B and data not shown).

Observation under an e l m microscope also revealed that the s u phages had the classical

morphology of prolate phages (l), a 40 x 60 nm head and a 100 nm nonconhactile taii (Fig.

2A1.

Production and characterization of two monoclonal antibodies specific to the c2

species. Phages of the c2 species are known to contain tbree major mcturai proteins as well

as a variable number of minor proteins (3.24, 29, 30 and Fig. 3). In this study, we estimated

the size of these 3 major proteins to be 27 kDa, 80 kDa and 170 kDa (Fig. 3). The phage 438

was selected for mice immunizaiion since it could be rcadily amplified and purified at high

concentrations. FoUowing ccll fusion, two Mabs (2A5 and 6G7) were selected for theu

specificity toward the s u native c2-iike phages tested. Both Mabs did not react with phages 47,

QI 1, 442 (936 species) and uU6 (P335 species), as weU as with DNA, L.lactis ce11 extracts,

whey and Ml7 media. Both Mabs were of isocype IgG2a (Table 2).

Binding inhibition assay. To determine if the two selected Mabs biid to different epitopes,

competitive biding inhibition assays were performed usmg native phage 438 as antigen. If the

two Mabs recognize the same epitope, the binding of the fust Mab to phage Q38coated well

would prevent the biding of the second Mab an2 consequentiy the percenage of inhibition

would be high. If the two Mabs rtcognize distinct epitopes, the percenage of inhibition would

be low. When Mab 2A5 was used as first and second antibody the pucentage of inhibition was

90% (Table 2). The perçaitage of inhiiition was only 25% when Mab 6G7 was used in both

incubations and at the same conmnation of Mab 245 (Table 2). Increasing Mab 6G7

concentration in the first incubation or decrcasing the antigen conceaIration in the weiireSU1ted in

inmased biidiig inhibition (results not shown). These results suggest that the first incubation

did not saturate ail 6G7 epitopes available on the native phage. It also suggests the presence of

more 6G7 epitopes than 2A5 on the phage smcture. Alternatively, Mab 6G7 might have less

avidity or unbiid more easily than Mab 2A5. When 2A5 was uscd as the first antibody and 6G7

as the second, the percentage on inhibition was 90%. Thus, the prior incubation of 2A5

prevented the biiding of 6G7. However when 6G7 was incubated first followed by 2A5, the

pertentage of biiding inhibition was only 4%. These results indicate that the 2A5 epitope

overlaps the 6G7 epitope but on the other hand, the 6G7 epitope docs not span the 2A5 epitope.

Based on ail the above results. the two Mabs are different

Immunoelectron microscopy and Western blotting analysis. Since protein A has a

high affmity for the heavy chah of IgG, gold particles iinked to prorein A were used to localue

the antibody biidiig site on the native phage siructure. Gold pdc les were only found dong

the phage head (Fig. 2) indicating that both Mabs reactcd with capsid proteins. Neither Mabs

reacted with any of the c2 phage strucniral protein in classical Western blot assays (data not

shown). However, when the nii~ocellulose was soaked mto a protcin rcnamtion buffer prior

to the antibody reaction. both Mabs recognized the 80 and 170 kDa major stucniral phage

proteins (Fig. 3). It appears that in both cases, epitopes can be renanued after exposing to the

denaturing conditions of SDS-PAGE. The above results indicarcd that the two different Mabs

are specific to the native major capsid proteins of the c2 phages and are most ïikeky

conformation-dependenr

Dot immunoassay. The sensitivity of each Mab was trsted agaiust several phages of the c2

species by dot immunoassay @g 4). For both Mabs IO7 u, 10% pfuiml of phages diluted in

phage buffer or in Ml7 media was detected within one muiute in the presence of 4 W/ml of

peroxidase conjugated antibody (Fig. 4). This results testify a high affinity of both Mabs to

phages of the c2 specics.

Table 1. Bacteriai saains and bacteriophages used in this study.

Snains Relevant characreristics Refercnce

inctococcus lac&

Bacteriophages

c2 c2 1 ebl mu 438 444 ~2 4 7 QI 1 442 u136

Plasmid free, host for phages c2, c21, mU, cbl and p2 UL8 (pS.43). Em', host for phage ui36 indusmai suain, host for phage 4 7 Indusmal strain, host for phage QI 1 Indusaial saah, host for phages 438 and 444 indusmai s m h , host for phage 442

Prolate headed, c2 species Prolate headed. c2 species Rolate headed, c2 species Prolate headed, c2 species Prolate headed, c2 species Rolate headed, c2 species Smali isomemc headed, 936 species Smail isomemc headed, 936 species Small isometric headed, 936 species Smaii isomemc headed, 936 species Smaii isometric headed, P335 species

20 7

22 22 This study 22

K.M. Polzin' This study L.L. McKay' W.E. Sandine" 22 22 LL. McKay 22 22 22 24

K.M. Polzin, New Zealand Dairy Research institute; ' L.L. McKay, University of Minnesota, Minneapolis; 'W.E. Sandiie, Oregon State University, Corvallis.

Figure 1: Restriction patterns (EcoIU) of phage DNA (A) with the comspondig Southem

blot probed with phage 438 DNA (B). Lanes I & 7, marker 1 kb DNA ladder

(1.0. 1.6, 2.1, 3.1, 4.1. 5.1, 6.1, 7.1, 8.1, 9.1. 10.2, 11.2. 12.2kb;

GIBCOIBRL); lane 2, phage ebl; lane 3, phage c21; iane 4, phage ml3; lane 5,

phage 438; iane 6, phage 444; lane 8, phage p2 (936 species); lane 9, phage

11136 (P335 species).

Figure 2: Immunoelecmn mimscopy with gold-labeled protein A (particles, 10 nrn). (A),

phage 438; (B), Mab 6G7; (C), Mab 2A5.

Figure 3: Phage sûucniral protein profiles as dearmined by SDS-PAGE (15%) with the

correspondhg immunoblots using 2.45 and 6G7. Phage proieins were stained

with Coomassie blue. Lane 1, phage 444; lane 2, phage 438, lane 3. phage c2;

lane 4, prestained molecular weight rnarker (25, 32.5, 47.5, 62. 83, 175 kDa;

NE Biolabs); lane 5, Mab 2A5 and phage c2; lane 6, Mab 6G7 and phage c2.

Figure 4: Sensitivity of Mabs 2A5 (A) and 6G7 (B) using dot immunoaswys.

pfu/ml cbl c21 c? ml3 Q3X c2 4 3 8 ni13 cbl c21

ioloO@ O 8 @ Q - Q O Q Q

Table 2. Characteristics and bmding inhibition assays of the two Mabs.

2A5

6G7

3-3

IgGZa

IgGZa

1 O"

1 O"

9211

-5

8813

2 5 ~ 1

Many systems using polyclonal or monoclonal antibodies are available for the rapid det&on

and identification of micrwrganimis in food (5). One of our objectives is to develop such a

sirnilar saategy for lactococcal phages detection. Numerous epidemiological-iike smdies have

clearly showed the divenity of the phage population in dairy plants. At least three genetically

distinct phage species are routinely isolatcd fom miikderived samples. Due to the starter system

used in Canada, the c2 species is îhe most predominant species.

The fmt step involved the development of Mabs that were specific to c 2 U e phages.

immunoelectron microscopy and Western blot assays showed that the two Mabs were r a i d

against the native fonn of the MCP (80 kDa and 170 kDa) of c2-iike phages. Both Mabs

recognized the 6 different members of the c2 species tested. They had a mong affinily for these

phages, since the detedon signals could be obtained within one minute of contact between

phages and Mabs. The two Mabs appeared to recognize overlapping epitopes of the MCP.

Competitive inhibition assays showeù that Mab 2 4 5 inhibited the biding of Mab 6G7, whereas

6G7 did not prevent the b i d i g of 2A5. Therefore, these two Mabs wuld be used to develop

an ELISA-based system, where Mab 6G7 would represent the capture antibcdy and Mab 2A5

the detection antibody.

The wmplete nucleotide sequence of two prolate-hcaded phage genomes have already been

detennind, these phage genome share swong homology at the nuclwtide and arnino acid levcls

(17.34). Amino acid cornparision of 5 deduced MCP of prolate phages showed a 95% identity

indicating that the MCP is highly conserved in this phage species (14). Furthennon, its high

concenhation in the phage mcture makes the MCP an ideal target for immunoassays. In aii the

lactococcal phages of the c2 species studied so far, three major structural proteins (estimated at

27.80 and 170 kDa) as well as numerous minor proteins have been reporied (3.24.29.30). N-

terminai sequencing and immunoelecIronmicroscopy analysis with polyclonal antibodies

revealed that the 27 kDa pmtein is the major tail protein whereas the 80 and the 170 kDa an: the

MCP (17). Both MCP have identical N-terminal sequences and appear to be coded by the same

gene. A shift in the translational rcading h e ahead of the termination codon is probably

responsible for the production of the 170 kDa MCP. Lubbers et al. (17) suggested that these

head proteins may also form multimers.

in earlier studies, Mabs were raised against the MCP of isometric-hcaded phages of the P335

species (21). in this paxticular case, MCP were exüacted from SDS-PAGE gel and used to

imrnunize mice. These Mabs had a much higher &i ty and avidity for the denatured form of the

MCP. ConsequenUy for an optimal phage detection, dairy sarnples had to undergo a

denaturation step pnor to perform the assay. In this study, complete phage panicles were used

for mice immunizations. Lembka and Teuber also used native phages but to develop polyclonal

antibodies against PO08 (936 species) and PO01 (c2 species) (15). Interestingly, both studies

used an ELISA-based system and obtained a similar detection limit of only 107 phages per mi..

Although it was not the objective of this study, a dot irnmunoassay was used to evaluate the two

Mabs for detection purposes. A detection lirnit of IO7 to 10' phages per mL was also obtained.

Obviously before developing a system for on-line monitoring of c2-like phages in dairy plants,

this sensitiviiy wiU need to te substvltially improved. One way to potentially overcome this

problem would be to concentrate phages. Virus precipitation by polyethylene glycol has been

used to enhance the efficiency of hepatite A and rotavirus d e t d o n (38). Immunomagnetic

separation has also b e n used to incrase the sensitivity of d e t d o n methods (2). Thew

techniques could also be adapted for laaococcal phage detection to reduce volumes and remove

potential inhibitors of the antigen-antibody rection.

Nevertheless. 2A5 and 6G7 Mabs already have useful applications in industrial and research

labormries. For example, in dairy laboratones, whey sarnples zre tested on a &y to &y basis

for the presence of phages by plaque assay or the starter aciivity test If a sample tests positive,

the phage wncenaation is likcly to be high. These Mabs wuld then be used to rapidly identify

the presence of c2-like phages in the sample. Consequently, c2-sensitive starter would be

replaced by a non-c2 related culture. These Mabs could also te used in genetic studies. The

P335 Mabs have b e n previously used to saidy the mode of action of abortive infection

mechanisms (23). They might also fmd applications in monitoring the production of MCP

during the lytic cycle of phage c2 (7).

Acknowledgments

We gratefully acknowledge Eric Emond for helpful suggestions. We are also thanldul to Diane

Montpetit (CRDA. AAC. St-Hyacinthe) for the ebtron micrographs and Irnrnunova for

assistance to Mabs production. 'Ris work was supported by a systernic gant from CORPAQ to

R.E.S and by a saategic gram from NSERC to S.M.

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Avec l'augmentation de la production de fromage, les usines ont dû faire face à plusieurs

difficultés. Le fromage fait intervenir des microorganismes et donc nécessite des conditions bien

particulières de fabrication. Avec les connaissances acquises au cours des dernières décennies,

il a été possible de maiiriser la fermentation et de produire un fromage de qualité sensiblement

constante. Toutefois, le problème des phages demeure un problème de raille pour ceüe

industrie.

Maintenir une propreté constante des équipements et de I'environement, tester chacun des

in-ddients font partie des usages d'une fromagerie. Mais il reste que le procédé de fabrication

du fromage est non stérile. JJ est donc toujours possible qu'une faible quantité de phages soit

capable de pénétrer dans l'usine et de se propage,. Le systime de rotation des ferments ainsi

que l'utilisation de souches résistantes aux phages sont de bonnes snatégies pour limiter leur

propagation. L'efficacité de ces systèmes de lute demeure relative et certains phages sont

encore capables d'y échapper et de causer des pertes économiques considérables dans une

fromagerie.

Diérentes méthodes de détection ont été développées. Certaines sont directes d'autres

indirectes. Les usines préfèrent encore utiliser les méthodes indirectes. Celles-ci restent

beaucoup moins chères car elles ne nécessitent pas de gros équipements et sont faciiles à

appliquer. Les méthodes directes connues sont intéressantes car elles permenent d'identifier

l'espèce de phage qui se propage dans l'indusnie. Mais, elles ne sont pas suffisament sensibles

et rapides pour ém plus avantageuses aux yeux d'un producteur de fromage.

69

Des anticorps monoclonaux ont été développés dans ceae énide, ils se sont révélés

spécifiques à une des espèces les plus problématiques dans les fromageries. Ils pourraient être

utilisés dans une méthode Unmunologique pour déttcter les phages de cette espèce. Leur

utilisation serait suffisamment rapide pour ê a applicable en indushie. La méthode aurait aussi

l'avantage d'être d i et tri3 f a d e à utiliser. étant donné qu'eue ne nécessite pas d'équipement

particulier. Toutefois. la méthode aurait un inconvénient de taille, les anticorps ne sont toujours

pas assez sensibles. En effet, à son seuü de détccuon la fermentation est déjà inhibée. Toutes

les méthodes de détection directes développks présentent ce mime problème. senit donc

intéressant d'orienter différemment la recherche et tenter de trouver un moyen de conmuer les

bactériophages afin de réduire les seuils de détection des méthodes.

Les anticorps obtenus ne sont pour l'instant, pas applicables en indushie. Mais il reste

qu'ils permenent de déterminer de manière rapide et fSs spécifique les phages de l'espèce c2.

Pour les producteurs de ferments déstinés aux systèmes de rotation iis pourraient ê a aès utiles

car dans ce cas, il est impératif de connaitre l'espèce de phages capables d'affecter la souche en

question.

Pour mieux se prémunir des bactériophages, il faut mieux les cornaim. Depuis, les

dernières décennies, beaucoup d'études ont été faites à ce sujet, mais il reste que beaucoup de

choses sont encore à apprendre. Les anticorps développés ici représentent un outil qui

permettront de mieux étudier les phages de l'espèce c2.