Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuaklararası...

Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel

Etkileşme Seminerleri Programı

Dr. Nejat F. ECZACIBAŞI Toplantısı 07-09 Mart 2012 Erciyes, Kayseri

SEMİNER ÖZETLERİ

C.Kemal BUHARALIOĞLU Elif ÇADIRCI

H. Burak KANDİLCİ Seyhan ŞAHAN FIRAT

Hale TUFAN

Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Programı

Dr. Nejat F. Eczacıbaşı Toplantısı, 7-9 Mart 2012, Erciyes, Kayseri

PROGRAM

7 Mart 2012, Çarşamba

1600 Açılış

Prof. Dr. Öner SÜZER TFD Yönetim Kurulu Başkanı

1630 Dr. Nejat F. ECZACIBAŞI anısına

Dr Suphi AYVAZ Eczacıbaşı Tıp Ödülleri ve Bilimsel Araştırma Destekleri Genel Sekreteri

1700 Dalak Tirozin Kinazının Damar Düz Kası ve Endotel Hücrelerinde Anjiyotensin II Aracılıklı İşlevlerinin Araştırılması

C. Kemal BUHARALIOĞLU Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

1745 Tartışma

1815 Septik Ratlarda Bozulmuş İnflamatuvar Cevap, Organ Hasarı ve Mortalitenin Önlenmesinde Yeni Bir Hedef: Periferik 5HT-7 Reseptörleri

Elif ÇADIRCI Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

1900 Tartışma

8 Mart 2012, Perşembe

0900 Memeli Kardiyomiyositlerinde Na+/H+ Değiş-Tokuşcusunun Akut ve Uzun Süreli Hipoksiye Olan Duyarlılığı: ATP ve MikroRNA’ların Rolünün İncelenmesi

H. Burak KANDİLCİ Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi

0945 Tartışma

1600 DOCA-Tuz ile Oluşturulan Hipertansiyona Sitokrom P450 1B1’in Katkısı

Seyhan ŞAHAN FIRAT Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi

1645 Tartışma

1715 Serin/Treonin Kinaz Geni Transfekte Edilmiş Kardiyak Projenitör Hücrelerin Elektrofizyolojik Özellikleri ve Ko-Kültür Ortamında Kardiyak Miyozitler ile İnteraksiyonu

Hale TUFAN

1800 Tartışma

1830 Meslekte 40. yılını dolduran Farmakologlara plaket takdimi

1930 R. Kazım TÜRKER Genç Farmakolog Teşvik Ödülü-2011 Ödül Töreni

9 Mart 2012, Cuma

0900 Kapanış

Toplantının sponsorları • Abdi İbrahim İlaç San. ve Tic. A. Ş. (Kurumsal sponsor) • Commat Ltd.

1

İzmir’de 1913 yılında dünyaya gelen Dr.

Nejat F. Eczacıbaşı, ilk ve ortaokulu

İzmir’de, liseyi İstanbul’da Robert Kolej’de

okudu. 1930’larda Heidelberg

Üniversitesi’ndeki kimya yükseköğreniminin

ardından, Chicago Üniversitesi’nde master

ve Berlin Üniversitesi’nde de doktora yaptı.

1937’de doktorasını verdikten sonra Kaiser

Wilhelm Enstitüsü’nde, hormonlar üzerine

yaptığı çalışmalar nedeniyle, 1939’da Nobel

Ödülü’nü kazanan Prof. Butenandt’ın

yanında, biyokimya alanında iki yıl süreyle

araştırmalarda bulundu.

Dr. Eczacıbaşı, Türkiye’ye dönüşünde,

İstanbul’da 1942 yılında ilaç ve giderek

seramik sağlık gereçleri üretimine başladı.

İlk modern Türk ilaç fabrikası olan

Eczacıbaşı İlaç tesislerini, 1952’de, Levent’te

kurdu. Kartal ve Bozüyük’teki Eczacıbaşı

Seramik tesisleri, Karamürsel’deki İpek Kağıt

fabrikaları O’nun öncülüğünde ortaya çıktı.

1990’larda, ilaç, yapı ve temizlik kağıtları

alanlarında üretimde bulunan bir dizi tesisin

yanı sıra, sermaye piyasasından dış ticaret

ve bilgi iletime kadar uzanan günümüzde 39

kuruluştan oluşan Eczacıbaşı Topluluğu’nun

kurucusu ve Onur Başkanı Dr. Nejat F.

Eczacıbaşı, sanat ve kültür alanındaki geniş

katkılarıyla da tanınmaktaydı. Dr.

Eczacıbaşı, TÜSİAD, Türk Eğitim Vakfı ve

İzmir Kültür, Sanat ve Eğitim Vakfı’nın

kuruluşlarında görev aldığı gibi, İstanbul

Kültür ve Sanat Vakfı, Ekonomik ve Sosyal

Etüdler Konferans Heyeti ile Dr. Nejat F.

Eczacıbaşı Vakfı’nın kurucusu ve Yönetim

Kurulu Başkanı’ydı. Dr. Eczacıbaşı’nın

öncülüğünde 1959’da dönemin anıt

hocalarıyla kurulan Eczacıbaşı Bilimsel

Araştırma ve Ödül Fonu ise, bugüne kadar

tıp, kimya ve eczacılık dallarında 174

bilimsel araştırma projesi için gerekli

finansmanı sağlarken, 31 Eczacıbaşı Tıp

Bilim Ödülü, 38 Tıp Teşvik Ödülü ile

armağanlandırdı.

Dr. Nejat F. Eczacıbaşı’na, çeşitli alanlardaki

üstün katkıları nedeniyle, Türkiye Kızılay

Derneği Şeref Madalyası, Federal Almanya

Cumhuriyeti Büyük Hizmet Nişanı, İtalyan

Hükümeti Cavalliere Officiale Nişanı,

Avusturya Hükümeti Büyük Gümüş Onur

Nişanı, T.C. Dışişleri Bakanlığı Üstün Hizmet

Ödülü ile Boğaziçi Üniversitesi, Orta Doğu

Teknik Üniversitesi, İstanbul Üniversitesi ve

Hacettepe Üniversitesi’nin onursal doktora

diplomaları verilmişti.

Dr. Eczacıbaşı, anılarını Kuşaktan Kuşağa

(1982), görüşlerini ise, dünyadan

ayrılışından kısa süre önce bitirdiği

İzlenimler, Umutlar (1994) adlı yapıtlarında

dile getirdi.

İngilizce, Almanca ve Fransızca bilen Dr.

Nejat F. Eczacıbaşı, 1946 yılında Beyhan

Eczacıbaşı ile evlendi. Oğulları Bülent ve

Faruk Eczacıbaşı’ndan Emre, Esra, Sinan ve

Murat adlarında dört torunu vardır.

Dr. Nejat F. Eczacıbaşı 6 Ekim 1993’te

Amerika’da vefat etti.

Dr. Nejat F. Eczacıbaşı

Dr Suphi Ayvaz

Eczacıbaşı Tıp Ödülleri ve

Bilimler Araştırma

Destekleri Genel Sekreteri

3

Dalak Tirozin Kinazının Damar Düz Kası ve Endotel Hücrelerinde Anjiyotensin II Aracılıklı İşlevlerinin Araştırılması C. Kemal BUHARALIOĞLU Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin

GİRİŞ VE AMAÇ

Renin anjiyotensin sistemi (RAS) kardiyovasküler işlevlerin düzenlenmesinde önemli role sahiptir. Anjiyotensin II, RAS’nin biyolojik olarak etkin ve başlıca bileşenidir; damar düz kas (DDK) hücrelerinde kasılmaya neden olmakta ve sodyum ve su homeostazının sürdürülmesine katkıda bulunmaktadır (Navar, 1997; Touyz, 2003). Anjiyotensin II düzeylerinin artması ise hipertansiyon, kalp yetmezliği, ateroskleroz ve damar hasarı sonrası restenoz gelişimine katkıda bulunmaktadır (Rakugi et al., 1994; Feng et al., 2001; Weiss et al., 2001; Kobori et al., 2007). Ayrıca, anjiyotensin II kardiyak miyositler, fibroblastlar ve DDK hücrelerinde büyüme ve enflamasyona neden olmaktadır. DDK hücrelerinde büyüme ve göçten anjiyotensin II’ye ait anjiyotensin 1 reseptörleri (AT1) sorumludur. Ayrıca bu etkiye, reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve serin treonin ve tirozin kinazların etkinleşmesi katkıda bulunmaktadır. Bunlar, mitojen ile etkinleşen protein kinazlar (mitogen-activated protein kinases; MAPKs) (Touyz and Schiffrin, 2000; Touyz, 2004; Clempus and Griendling, 2006), ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz (extracellular signal regulated kinase; ERK1/2), p38 mitojen ile etkinleşen protein kinaz (p38 mitogen-activated protein kinase; p38 MAPK), c-Jun N-terminal kinaz (c-JNK) (Servant et al., 1996; Natarajan et al., 1999; Xi et al., 1999; Kyaw et al., 2004; Ohtsu et al., 2005; Lee et al., 2007), fokal adezyon kinaz ailesi, protein tirozin kinaz, prolince zengin tirozin kinaz II (proline-rich tyrosine kinase 2; Pyk2) ve c-Src (Eguchi et al., 1998, 1999, 2001; Rocic and Lucchesi, 2001; Touyz et al., 2001; Saito et al., 2002; Kyaw et al., 2004) olarak sıralanabilir.

Anjiyotensin II endotel hücrelerinde ise anjiyojeneze neden olmaktadır. Anjiyotensin II düşük konsantrasyonlarda (10 nM) anjiyojenezi stimüle ederken, yüksek konsantrasyonlarda inhibe etmektedir (Weiss et al., 2001). Endotel hücrelerinde VEGF ekspresyonunun anjiyotensin II ile

arttığı gösterilmiştir (Carmeliet, 2005, Montezano et al., 2008). Damar endoteli büyüme faktörü (vascular endothelial growth factor; VEGF)’nin endotel hücreleri üzerindeki etkileri ise başlıca iki reseptör aracılığı ile ortaya çıkmaktadır: VEGF reseptörü 1 (VEGFR-1; Flt-1) ve VEGFR-2 (Flk-1/KDR) (Chintalgattu et al., 2003). İnsan umbilikal ven endotel hücrelerinde anjiyotensin II ile oluşan proliferasyonun Flt-1 nötralize edici antikor ile önlendiği bildirilmiştir (Herr et al., 2008).

Bir reseptör ile kenetli olmayan tirozin kinaz olan dalak tirozin kinaz (Dtk)’nin hematopoietik hücreler dışındaki etkileri yeni anlaşılmaya başlanmıştır. Dtk endotel hücrelerinde eksprese edilmektedir ve bu hücrelerde morfojenez, büyüme ve hayatta kalma (survival) gibi işlevlerdeki rolü gösterilmiştir. Ek olarak, in vivo damar bütünselliğinin sürdürülmesine katkıda bulunmaktadır (Inatome et al., 2001, Yanagi et al., 2001). Ayrıca, Src ailesi tirozin kinazların; Dtk ile asosiye oldukları ve onu etkinleştirdikleri bildirilmiştir (Kurosaki et al., 1994). Daha önce DDK hücreleri ile yaptığımız çalışmalarda, anjiyotensin II’nin Dtk’yi p38 MAPK ile aktive olan c-Src ile etkinleştirerek hipertrofi ve göçe yol açtığını gösterdik (Mugabe et al., 2010, Yaghini et al., 2007). Bu veriler, anjiyotensin II’nin epidermal büyüme faktörü reseptörü (epidermal growth factor receptor; EGFR) EGFR transaktivasyonu ve VEGF ekspresyonuna neden olarak Flt-1 veya Flk-1 aracılığıyla Dtk’yı uyarması sonucunda anjiyojenezi başlatabileceğini göstermiştir.

Çalışmalarımızda, RAS’nin başlıca efektörü anjiyotensin II aracılığı ile DDK hücre göçünde Dtk’nin rol alıp almadığı ve bu olayın sinyal ileti mekanizması araştırılmıştır. Endotel hücrelerinde ise anjiyotensin II ile oluşturulan anjiyojenez sürecine, Flt-1 aracılığı ile Dtk etkinleşmesinin katılıp katılmadığı hipotezi test edilmiştir. Bu hipotezi test etmek için Dtk ve EGFR inhibitörlerinin ve Dtk gen sessizleştirilmesi-nin (gene silencing) etkileri in vitro

4

anjiyojenez modeli olan kapiler tüp oluşumunda (EA.hy926 kullanılarak) ve ex vivo bir model olan sıçan aort halkaları dallanma modelinde araştırılmıştır.

GEREÇ VE YÖNTEM

Hücre Kültürü Çalışmaları

Sıçan Aort Damar Düz Kas Hücre Kültürü

Çalışmalarımızdaki tüm deneyler National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, 1996) ile uyumlu olan Institutional Animal Care and Use Committee’nin kabul ettiği protokole göre gerçekleştirilmiştir. DDK hücreleri 250–350 g ağırlığındaki erkek Sprague-Dawley sıçanların (Harlan, Indianapolis, IN) torasik aortlarından izole edilerek kültürü yapılmıştır (Uddin et al., 1998). Bu hücreler 37˚C’de %5 CO2 ortamda %10 fetal sığır serumu (fetal bovine serum; FBS) ve %1 penisilin/ streptomisin ve %0.01 amfoterisin-B (Sigma, St. Louis, MO) içeren kültür ortamı Medium M199 ile inkübe edilmiştir. Hücre göçü deneyleri için 4.-6. pasajlardaki DDK hücreleri, farklı maddelerin uygulanmasın-dan önce %0.5 FBS içeren M-199 ile 48 saat inkübe edilmiştir. Tripan mavisini dışarıda bırakma yöntemi ile kimyasal inhibitörler veya plazmitlerle transfeksiyon deneylerin-den sonra hücrelerin canlılığında bir değişim olmadığı görülmüştür.

Endotel Hücre Kültürü

İnsan umbilikal ven endotel hücre kökenli EA.hy926 hücreleri Dr. Cora-Jean S. Edgell (North Carolina Üniversitesi, Chapel Hill, NC)’den sağlanmıştır. Bu hücreler %10 fetal sığır serumu (fetal bovine serum; FBS) ve %1 penisilin/streptomisin ve %0.01 amfoterisin-B (Sigma, St. Louis, MO) içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle kültür ortamı (Dulbecco's modified Eagle’s medium; DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA) ile 37˚C’de %5 CO2 ortamda %90 yoğunluğa ulaşıncaya kadar inkübe edilmiştir. Farklı maddelerin uygulanmasından önce %1 FBS içeren DMEM-199 ile 48 inkübe edilmişlerdir.

Hücre Göçü Eseyi (Yara İyileşmesi Yöntemi)

DDK hücre kültüründe hücre göçü deneyleri, Waters ve ark. (1999) tanımladığı “yara iyileşmesi” yöntemi ile yapılmıştır. Bu

yöntem kısaca, %80-100 yoğunlukta (confluent) DDK hücresi içeren her bir kuyucukta steril pipet ucuyla 1-1.5 mm genişliğinde düz bir çizgi şeklinde “yara” oluşturulmuştur. Hücreler serum içermeyen M199 kültür ortamı ile iki kez yıkanarak görüntüleri Nikon TE300 inverted mikroskop (CoolSnap FX charge-coupled device camera; Roper Scientific, Trenton, NJ ve Optiscan ES102 motorized stage system; Prior Scientific, Rockland, MA ekipmanlarına sahip) kullanılarak MetaMorph Image Analysis programı ile kayıt edilmiştir (0. saat). Hücreler inhibitörler ile 30 dakika inkübe edildikten sonra anjiyotensin II (200 nM), EGF (100 ng/ml) veya taşıyıcıları ile uyarılmış ve 24 saat sonra tekrar görüntüleri alınmıştır. Her bir yara lokalizasyonu için x, y ve z koordinatları belirlenmiş ve göç deneyleri süresince aynı bölgenin fotoğrafları çekilmiştir. Yara alanı ölçümlerinde aynı kuyucuktan 3 alana ait ölçümlerin ortalaması National Institutes of Health ImageJ 1.6 programı kullanılarak hesaplanmıştır. Veriler 0. saatteki alan %100 (kontrol) kabul edilerek ve 0. ve 24. saatte hücrelerin kapladığı alanın farkının oranı olarak gösterilmiştir. Çeşitli uygulamaların hücrelerin kapladığı alan üzerine etkileri ise kontrole göre % değişim (kontrolün yüzdesi) olarak belirtilmiştir.

Şekil 1. Yara iyileşmesi yönteminde anjiyotensin II

(Ang II) ile oluşturulan hücre göçüne ait mikroskop görüntüsü.

DDK Hücrelerinin Plazmitler, RNAi ve Adenovirüs Probları ile Transfeksiyonu

Tüm transfeksiyon deneyleri daha önce tanımlanmış olan prosedüre göre gerçekleştirilmiştir (Yaghini et al., 2007). Kısaca, %60-80 yoğunlukta (subconfluent) DDKH boş vektör (empty vector; EV) (pALTERMAX), wild type (WT) ya da dominant negatif (DN) (Y525F/Y526F) Dtk (Dr. H. Band, Harvard Medical School, Boston, MA tarafından sağlanmıştır) ile %2

5

FBS içeren M-199 içerisinde 1 µg plazmide 25 µl transfeksiyon reajanı Effectene (QIAGEN, Valencia, CA) oranında 48 saat süresince inkübe edilmiştir. Diğer bir grup deneyde, subconfluent DDK hücreleri, üretici firmanın belirttiği şekilde, Src RNAi, pozitif kontrol dupleksi (Pos. Dup.) (her biri 100 pmol, TriFECTa kit; Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) veya taşıyıcıları (vehicle) ile 48 saat transfekte edilmiştir. Diğer deneylerde ise subconfluent DDK hücreleri kısmi etkin (partially active; PA, AxSrcY416F/Y527F), dominant negatif Src mutantı (DN, AxSrc Kinase Dead, Dr. R. Baron, Yale School of Medicine, New Haven, CT tarafından sağlanmıştır) veya boş adenovirüs (empty adenovirus; EV, 10 multiplicity of infection) ile 48 saat transdükte edilmişlerdir.

In vitro Anjiyojenez Eseyi: Kapiler Tüp Oluşumu

EA.hy926 hücreleri %90 yoğunluğa ulaşınca FBS içermeyen kültür ortamı ile 24 saat inkübe edilmişlerdir. Bazı deneylerde, hücreler farklı kimyasalların ya da nötralize edici antikorun varlığına belirtilen süre boyunca maruz bırakılmışlardır. Tripsinizasyon sonrası hücreler sayılmış ve 4 x10

4 hücre/ml olacak şekilde %1 FBS ve

agonistlerin belirtilen derişimlerini içeren DMEM içerisinde tekrar süspande edilmiştir. Hücreler kuyucuklara eklenmeden önce kuyucuklar büyüme faktörü azaltılmış Matrigel (0.1 ml /kuyucuk, BD Biociences, Bedford, MA) ile kaplanmış ve 37°C’de 30 dakika beklenilerek polimerize olması sağlanmıştır. Hücre büyümesi ve üç boyutlu hücre organizasyonları 16 saat sonra Olympus CKX41 inverted faz-kontrast mikroskop ve Altra20 CMOS dijital kamera (Olympus America Inc., Melville, NY) ile izlenmiş ve fotoğrafları çekilmiştir. Endotel hücrelerinin oluşturdukları ağ yapılarının uzunlukları ImageJ programı (National Institutes of Health; http://rsb.info.nih.gov/ij) ile hesaplanmıştır. Sonuçlar her kuyucuktan 3 fotoğrafik alandaki toplam tüp uzunluğunun ortalaması olarak gösterilmiştir.

Ex vivo Anjiyojenez Eseyi: Aortik Halka Yöntemi

Sprague-Dawley sıçanlarının (4-6 haftalık; Charles Rivers, Wilmington, MA) torasik aortları izole edildikten sonra 1 mm kesitleri Matrigel ile kaplanmış kuyucuklara agonistler

ile birlikte eklenmişlerdir. İnhibitörler veya nötralize edici antikorlar agonistlerin eklen-mesinden 30 dakika önce eklenmiştir. Bazı deneylerde aort halkalar 20 pmol Dtk siRNA (sense; 5’-CAC CAU AAA UUU GCA AGG UC-3’, antisense; 5’-GAC CUU GCA AAU UUA UGG UG-3’; ACC #. NM_012758, IDT, Coralville, IA) veya kontrol plazmidi (sense; 5’-AA UUU AUGGAC GUG GCA CUU-3’, antisense; 5’-AA GUG CCA CGU CCA UAA AUU-3’) ile transfekte edilmiştir. Transfeksiyonlar DharmaFECT 1 transfeksiyon reajanı (Dharmacon Inc., Lafayette, CO) ile gerçekleştirilmiştir. Aort halkalarından endotel hücrelerinin dallanmasını kantitatif olarak belirlemek amacıyla dallanmaların alanı Image J programı ile ölçülmüştür. Tüp oluşumu ve aort dallanması deneylerinde anjiyotensin II, EGF veya VEGF yokluğunda tek başına taşıyıcı %100 olarak kabul edilmiştir.

Western Blot Analizi

Dtk ve diğer proteinlerin etkinliği; anti-fosfo ve onlara karşılık gelen fosfo olmayan antikorlar kullanılarak fosforile protein/protein düzeyleri Western blot yöntemi ile belirlenmiştir. İnhibitörler ve/veya agonistlerin uygulanmasından sonra kültürü yapılmış DDK hücreleri lizis tamponu içerisinde sonikasyon işleminden sonra santrifüj edilmiş ve Bradford yöntemi kullanılarak eşit miktardaki protein, Sodyum Dodesil Sülfat-Poli Akrilamit Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılmışlardır. Proteinler nitroselüloz membrana aktarıldıktan sonra %5 yağ içermeyen süt tozu ile bloke edilmiş ve 4°C’de primer antikorlar ile (1:500-1:1000) inkübe edilmişlerdir. Daha sonra Tris ile tamponlanmış salin ve Tween 20 (1X) ile yıkanan blot’lardaki immünoreaktif proteinler kendilerine karşılık gelen horseradish peroxidase ile konjüge sekonder antikorlar ile (1:1000-1:2000) inkübe edildikten sonra ECL Plus Western Blot Detection kiti kullanılarak görüntülenmiştir. Bantların yoğunluğu ImageJ programı kullanılarak belirlenmiştir. VEGF bantlarının yoğunluğu beta-aktine göre normalize edilmiştir. Diğer protein bantlarının yoğunluğu kendilerine karşılık gelen fosforile olmamış antikor bantlarının yoğunluğuna göre normalize edilmiştir ve 0. zamanda elde edilen değer 1 alınarak katları şeklinde artışlar olarak ifade edilmiştir.

http://rsb.info.nih.gov/ij

6

EA Hücrelerinin Dtk shRNA ve kontrol Short Hairpin İnterfering RNA ile transfeksiyonu

Dtk shRNA ve onun kontrol shRNA kodlayan plazmit kiti GeneSuppressorTM (IMG-808) Imgenex (San Diego, CA)’den sağlanmıştır. EA.hy926 hücreleri Effectene transfeksiyon reajanı (Qiagen, Valencia, CA) kullanılarak

üretici önerisine göre (0.2 g plasmit (10%

FBS içeren DMEM içerisinde) için 50 l Effectene 24 saat inkübasyon) geçici transfeksiyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. 24 saat sonra Western blot analizi ile Dtk shRNA’sinin susturucu etkisi doğrulanmıştır.

İstatistiksel Analiz

Veriler tek yönlü ANOVA ve ardından Newman-Keuls Çoklu Karşılaştırmalar Testi ile analiz edilmiştir. İki grup arasındaki farklılıklar ise unpaired Student's t testi ile belirlenmiştir. En az üç farklı deney sonuçları ortalama ± standart hata (SH) olarak ifade edilmiştir. İstatistiksel olarak 0.05’ den daha küçük P değerleri anlamlı kabul edilmiştir.

BULGULAR

Şekil 2. Piketanol, anjiyotensin II (AngII) ile uyarılan DDK hücre göçünü inhibe etmektedir. A, Dtk inhibitorü piketanol (PIC)’ün Ang II (200 nM)

ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * AngII yokluğunda elde edilen değere göre ve

† taşıyıcı

(Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). B,

Piketanolün Ang II ile uyarılmış sıçan aort DDK hücrelerinde fosfo (p)-Dtk (Syk), p-Src, p-ERK1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi.

Şekil 3. Dominant negatif Dtk (DN Syk) plazmitleriyle geçici transfeksiyon anjiyotensin II (Ang II) ile oluşan DDK hücre göçünü inhibe etmektedir. A, Wild type (WT) veya DN Dtk’nın Ang

II (200 nM) ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * AII yokluğunda elde edilen değere göre,

†

taşıyıcı (Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). B, WT

veya DN Dtk ile geçici transfeksiyonunun Ang II (200 nM) ile uyarılmış DDK hücrelerinde fosfo (p)-Dtk, p-Src, p-ERK1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi.

Şekil 4. Anjiyotensin II (Ang II) ile oluşan DDK hücre göçü c-Src bağımlıdır. A, c-Src inhibitörü

PP2’nin Ang II ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * AII yokluğunda elde edilen değere göre ve

†

taşıyıcı (Veh) grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel (P<0.05). B, PP2’nin Ang II ile uyarılmış

DDK hücrelerinde fosfo (p)-Tyr (p-EGFR), (p)-Dtk, p-Src, p-ERK1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi.

7

Şekil 5. Anjiyotensin II (AngII) ile oluşan DDK hücre göçü p38 MAPK aracılıklıdır. A, p38 MAPK

inhibitörü SB202190 (SB)’nin Ang II ile uyarılmış DDK hücre göçü üzerine etkisi. * Ang II yokluğunda elde edilen değere göre ve

† taşıyıcı (Veh) grubunda

karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). B, SB’nin Ang II ile uyarılmış DDK

hücrelerinde fosfo (p)-Tyr (p-EGFR), (p)-Dtk, p-Src, p-ERK1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi.

Şekil 6. Anjiyotensin II (AngII) ile artan DDK hücre göçü EGFR transaktivasyonu ile etkinleşen c-Src bağımlıdır. A, EGFR inhibitörü

AG1478’in Ang II ile uyarılmış sıçan aort DDK hücre göçü üzerine etkisi. * Ang II yokluğunda elde edilen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05) B, AG1478’in Ang II ile uyarılmış sıçan

aort DDK hücrelerinde fosfo (p)-Tyr (p-EGFR), (p)-Dtk, p-Src, p-ERK1/2 ve p-p38 MAPK protein düzeyleri üzerindeki etkisi.

8

Şekil 7. Anjiyotensin II (ANG II), EGF ve VEGF EA.hy926 (EA) hücrelerinde tüp oluşumunu ve sıçan aort halkalarında kapiler dallanmayı artırmaktadır. A-E: EA hücreleri (0, 3, 12 ve 24 saat) ve sıçan aort düz kas hücreleleri (A-C) ve sıçan aort halkaları (D-E) ANG II, EGF veya VEGF

taşıyıcısı (DMEM) ile 16 saat ve 3–5 gün inkübasyonlarının tüp oluşumu ve aortik dallanma üzerine etkisini gösteren faz-kontrast mikroskop görüntüleri. Tüp oluşumlarının uzunluğu In vitro Anjiyojenez Eseyi’nde tanımlandığı gibi ölçülmüştür (B, alt). Aortik dallanmaların uzunluğu Ex vivo Anjiyojenez Eseyi’nde tanımlandığı gibi ölçülmüştür (E, alt). ANGII, EGF veya VEGF yokluğunda tek

başına taşıyıcı %100 olarak kabul edilerek uygulamaların değerleri normalize edilmiştir. * 0. saatte vehikül ile elde edilen değere göre (B, C ve E, alt) ve

† vehikül ile elde edilen değere göre

istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05). Büyütme:

x 100. Skala: 200 m.

Şekil 8. ANG II ile oluşturulan tübülojenez ve sıçan aort dallanması Flt-1 aracılıklı olmasına karşın, bu değişikliklere Flk-1 aracılık etmemektedir. EA.hy926 hücreleri ve sıçan aort

halkaları Flt-1 nötralize edici antikoru (Flt-1/Fc; 5

g/ml) veya Flk-1 inhibitörü SU1498 ile inkübe edildikten sonra ANG II ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aort dallanmasına (B) ait etkinin kantitatif

analizi. * ANG II, EGF veya VEGF yokluğunda elde edilen değere göre ve

† Flt/Fc taşıyıcısı (Vehicle)

grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05).

9

Şekil 9. ANG II ile artan VEGF ekspresyonu Flt-1 veya Flk-1 aracılıklı değildir. (A) EA hücrelerinde,

farklı sürelerde (0, 0.17, 0.5, 1.4 ve 16 saat) uygulanmış ANG II'nin VEGF ekspresyonuna etkisi. (B) ve (C): EA hücrelerinde ANG II'nin VEGF

ekspresyonunu artırıcı etkisine Flt-1 nötralize edici

antikoru (Flt-1/Fc, 5 g/ml) (B) veya Flk-1 inhibitörü

SU-1498 (10 M) (C) etkisi. * 0. saatteki (A, alt) ve

Ang II taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05).

Şekil 10. ANG II, EGF ve VEGF ile artan Flt-1 fosforilasyonu Flt-1/Fc ile inhibe olurken SU-1498 ile değişmemektedir. VEGF ile artan Flk-1 fosforilasyonu ise SU-1498 inhibe olurken Flt-1/Fc ile değişmemektedir. (A–C): EA hücrelerinde,

farklı sürelerde (0, 0.17, 0.5, 1.4 ve 16 saat) uygulanan ANG II (10 nM; A), EGF (10 ng/ml; B) ve VEGF (50 ng/ml; C)'in p-Flt-1 ve p-Flk-1 üzerine etkisi. (D–F): EA hücrelerinde ANG II (10 nM), EGF

(30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml)'in pFlt-1 veya p-Flk-1 düzeylerini artırıcı etkisine Flt-1 nötralize edici

antikoru (Flt-1/Fc, 5 g/ml) veya Flk-1 inhibitörü SU-

1498 (10 M)’in etkisi. * 0. zamandaki (A, alt) ve

ANG II taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve

† Flt-1/Fc veya SU-1498 taşıyıcısı grubunda

karşılık gelen değere göre (D–F, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05).

10

Şekil 11. ANG II, EGF ve VEGF ile başlatılan tüp oluşumu ve aort dallanması EGFR transaktivasyonu ile etkinliği artan Flt-1 uyarılması ile gerçekleşmektedir. (A-B) EA

hücreleri ve rat aort halkaları EGFR inhibitörü AG-1478 (200 nM)'nin ANG II, EGF veya VEGF ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aort dallanmasına (B) ait etkisinin kantitatif analizi. ANGII, EGF veya

VEGF yokluğunda tek başına taşıyıcı %100 olarak kabul edilmiştir. EA hücrelerinde AG-1478 (200 nM) preinkübasyonunun; ANG II (10 nM; C) veya EGF (30 ng/ml; D) ile artan p-EGFR, p-Flt-1 ve p-Flk-1 seviyeleri üzerine etkisinin Western blot ile analizi. *

ANG II, EGF veya VEGF yokluğunda elde edilen değere göre ve

† AG-1478 taşıyıcısı (Vehicle)

grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05).

Şekil 12. ANG II, EGF ve VEGF dalak tirozin kinazı (Syk) fosforile etmektedir. AII ile dalak tirozin kinazı fosforilasyonu, EGF ve VEGF ile değil, AT1R aracılıdır. (A–C) EA hücrelerinde ANG

II (10 nM), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml)'in p-Dtk (p-Syk) protein düzeyi üzerinde zamana bağımlı etkisi. (D-F) EA hücrelerinde ANG II (10

nM), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) ile artan p-Dtk (p-Syk) protein düzeyleri üzerine losartan (10

M) veya PD-123319 (1 M) etkisi. * Ang II taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve

†

losartan taşıyıcısı grubunda karşılık gelen değere göre (D, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05).

11

Şekil 13. ANG II, EGF ve VEGF ile artan tüp oluşumu ve aort dallanması piketanol ile inhibe edilmektedir. (A–B) Dtk inhibitörü piketanolün; EA

hücrelerinde ve sıçan aort halkalarında ANG II (10 nM), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aortik dallanmaya (B) etkisi. (C-E) Piketanolün EA hücrelerinde ANG II (10 nM; C), EGF (30 ng/ml; D) veya VEGF (50 ng/ml; E) ile artan p-Flt-1 ve p-Dtk seviyelerine etkisinin Western blot analizi. * ANG II, EGF veya VEGF taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve

† piketanol taşıyıcısı grubunda karşılık gelen

değere göre (C–E, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P<0.05).

Şekil 14. Dtk (Syk) short hairpin interfering (sh)RNA ve Dtk small interfering (si)RNA ANG II, EGF ve VEGF ile artan, sırasıyla, tüp oluşumu ve aortik dallanmayı önlemektedir. (A-B) EA

hücrelerinde ve sıçan aort halkalarında ANG II (10 nM), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) ile oluşturulan tüp oluşumu (A) ve aort dallanmasına (B) sıçan Dtk siRNA, onun scrambled (SCR) kontrolü veya taşıyıcısının etkisi. (C–E) İnsan Dtk

shRNA, onun kontrol shRNA veya taşıyıcısının EA hücrelerinde ANG II (10 nM), EGF (30 ng/ml) veya VEGF (50 ng/ml) artan p-Flt-1 seviyesine etkisinin Western blot analizi. * ANG II, EGF veya VEGF vehikülü ile elde edilen değere göre;

† Syk shRNA

taşıyıcısı (Vehicle; Veh) grubunda karşılık gelen değere göre (C–E, alt) istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05).

12

Şekil 15. EA hücrelerinde ANG II, EGF ve VEGF ile artan Dtk fosforilasyonuna Flk-1 değil Flt-1 aracılık etmektedir. ANG II ve EGF, ancak VEGF değil, ile artan Dtk fosforilasyonu EGFR aracılıklıdır. (A-C) Flt-1 nötralize edici antikoru (Flt-

1/Fc, 5 g/ml), Flk-1 tirozin kinaz inhibitörü SU-1498

(10 M) veya AG-1478'in EA hücrelerinde ANG II (10 nM; A), EGF (30 ng/ml; B) veya VEGF (50 ng/ml; C) artan p-Dtk seviyelerine etkisinin Western blot analizi. * ANG II, EGF veya VEGF taşıyıcısı (Vehicle) ile elde edilen değere göre ve

† AG-1478

(D–F, alt) veya Flt-1/Fc (A–C, alt) taşıyıcısı

grubunda karşılık gelen değere göre istatistiksel olarak anlamlı farklı (P <0.05).

TARTIŞMA ve SONUÇ

Dtk'nin Anjiyotensin II ile Oluşturulan Damar Düz Kas Göçüne Katılımı ve Sinyal İletimindeki Yeri

Yara iyileşmesi tekniği ile Dtk'nın AII ile oluşturulan DDKH göçüne katkısının araştırıldığı çalışmalarda, bu peptidin DDK hücre göçünü uyarıcı etkisi, Dtk inhibitörü piketanol veya DN Dtk ile transfeksiyon ile geri çevrilirken WT mutant etkisiz kalmıştır. Bu durum, Dtk'nın anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne katkıda bulunduğunu göstermektedir. Piketanol ve DN Dtk mutantı, ancak WT Dtk değil, Dtk fosforilasyonunu azaltırken p38 MAPK ve c-Src fosforilasyonunu değiştirmemiştir. Bu veriler, Dtk'nin anjiyotensin II ile oluşturulmuş DDK hücre göçünü uyarırken kullandığı sinyal ileti yolunda; p38 MAPK ve c-Src'ın Dtk'nin altında yer aldığını (downstream) göstermektedir. Piketanolün anjoyotensin II ile artan ERK1/2 fosforilasyonunu azaltması; ERK1/2'nin Dtk ile etkinleştirildiğini düşündürmektedir. Ancak, DN Dtk mutantı ile yapılan deneylerde Dtk fosforilasyonunun değişmemesi; piketanolün ERK1/2 etkinliğini özgül olmayan bir mekanizma ile azaltabileceği olasılığını ortaya çıkarmaktadır.

c-Src inhibitörü PP2’nin, anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçü ve Dtk fosforilasyonunu bloke etmesi; anjiyotensin II ile DDK hücre yara iyileşmesine Dtk'nin c-Src etkinleşmesi ile katıldığını göstermektedir. p38 MAPK inhibitörü SB202190’nın anjiyotensin II ile oluşturulan yara iyileşmesini ve c-Src ve Dtk fosforilasyonunu önlemesi; p38 MAPK'nin anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne c-Src ile etkinleşen Dtk aracılığı ile katılabileceğini düşündürmektedir. c-Src'ın anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne ERK1/2'yi etkinleştirerek katıldığı bilinmektedir (Kyaw et al., 2004). Bizim çalışmamızda, ERK1/2 inhibitörü PP2; anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücrelerinde yara iyileşmesini bloke etmiştir ve PP2 ERK1/2 fosforilasyonunu azaltmıştır. Ancak, DN Dtk mutantı ERK1/2 fosforilasyonunu değiştirmemiştir. Bu veriler, anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçüne c-Src ile uyarılan ERK1/2 Dtk'dan bağımsız olarak katıldığı görüşünü desteklemektedir.

13

EGFR Transaktivasyonunun Anjiyotensin II ile Oluşturulan DDK Hücre Göçüne Katkısı

Anjiyotensin II'nin EGFR transaktivasyonu ile ERK1/2 ve p38 MAPK etkinleştirdiği bilinmektedir (Eguchi et al., 1998). Anjiyotensin II ile EGFR transaktivasyonu c-Src aracılığı ile gerçekleşmektedir (Eguchi et al., 1999; Touyz et al., 2002). Bu yüzden, c-Src; Dtk, ERK1/2 ve p38 MAPK'ı EGFR transaktivasyonu ile etkinleştirebilir. c-Src inhibitörü PP2’nin anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçü ve EGFR fosforilasyonunu azaltması, ancak piketanol veya DN Dtk mutantının etkisiz olması; p38 MAPK ile etkinleşen c-Src’ın anjiyotensin II ile oluşturulan EGFR transaktivasyonu ve DDK hücre göçüne Dtk’dan bağımsız olarak aracılık ettiğini göstermektedir. Bu görüşü doğrulayan diğer bir veri, c-Src RNAi veya DN c-Src’ın anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçü, c-Src, ERK1/2 ve EGFR fosforilasyonunu azaltması ancak p38 MAPK üzerine etkisiz olmasıdır. c-Src’ın EGFR transaktivasyonu ile anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücre göçünü Dtk’den bağımsız olarak gerçekleştirdiği görüşümüzü; EGFR blokörü AG1478’in anjiyotensin II ile oluşturulan DDK hücresinde yara iyileşmesini ve EGFR fosforilasyonunu inhibe etmesi ancak Dtk ve c-Src üzerine etkisiz olması bulgusu da desteklemektedir. p38 MAPK inhibitörü SB202190’ın c-Src ve EGFR fosforilasyonunu azaltması p38 MAPK ile etkinleşen c-Src’ın anjiyotensin II aracılı DDK hücre göçünü hem Dtk hem de EGFR transaktivasyonu ile gerçekleştirebileceğini göstermektedir. EGFR transaktivasyonu ile anjiyotensin II aracılıklı ortaya çıkan DDK hücre göçü ERK1/2 ve p38 MAPK aracılı olabilir, çünkü anjiyotensin II’nin DDK hücresinde yara iyileştirici etkisi ve ERK1/2 fosforilasyonu, ERK1/2 inhibitörü U0126 ile önlenmektedir.

Anjiyotensin II'nin Neden Olduğu Tüp Oluşumu ve Kapiler Dallanma Flt-1 Aracılıklıdır.

Anjiyotensin II ile EA hücrelerinde tüp oluşumu ve sıçan aort halkalarında kapiler dallanma AT1 reseptör blokörü losartan ile önlenirken AT2 reseptör blokörü PD-123319 etkisizdi (veriler sunulmamıştır). Bu durum, daha önce yapılan çalışmalarla uyumlu olarak, anjiyotensin II aracılıklı anjiyojenezin

AT1 reseptörleri aracılığıyla ortaya çıktığını göstermektedir.

Anjiyotensin II, EGF ve VEGF; EA hücrelerinde tüp oluşumu ve sıçan aort halkalarındaki dalllanmayı Flt-1’i nötralize edici antikor, Flt-1/Fc, önlerken; Flk-1 blokörü SU-1498’in etkisiz olması; anjiyotensin II, EGF ve VEGF aracılı tüp oluşumu ve aortik dallanmaya Flk-1 değil de Flt-1’in aracılık ettiğini düşündürmektedir. Yüksek konsantrasyonlarda SU-1498 (25

M)’in VEGF ile oluşan EA hücrelerindeki tüp oluşumunu önlemesi; VEGF'in diğer iki agonistten farklı olarak, Flk-1 aracılığı ile de tüp oluşumunu uyardığını göstermektedir.

Anjiyotensin II ayrıca VEGF ekspresyonunu da uyarmaktadır ve VEGF'nin anjiyojenezi başlıca Flt-1 aracılığıyla uyardığı bildirilmiştir (Chintalgattu et al., 2003). Bu çalışma, anjiyotensin II ile uyarılan anjiyojeneze VEGF'in aracılık edebileceğini düşündür-mektedir. Bizim çalışmamızda da, anjiyotensin II VEGF ekspresyonunu ve Flt-1 fosforilasyonunu artırmış ancak Flk-1 fosforilasyonunu etkilememiştir. Elde ettiğimiz veriler, anjiyotensin II ile tüp oluşumunda VEGF'in katılımını tamamen dışarıda bırakamamaktadır. Öte yandan, aşağıdaki bulgulardan dolayı, bu durum olası gözükmemektedir: 1) Anjiyotensin II, EA hücrelerinde 5 dakika içinde Flt-1 fosforilasyonuna neden olmaktadır. Ancak, VEGF ekspresyonu 1 saat içinde hafif bir artış göstermiş ve en yüksek seviyesine 16 saat içinde ulaşmıştır. 2) Anjiyotensin II, Flt-1 fosforilasyonuna neden olurken Flk-1 fosforilasyonunu etkilememiştir. Ancak, VEGF hem Flt-1 hem de Flk-1 fosforilasyonuna neden olmuştur. 3) Yüksek derişimlerde anjiyotensin II (100 nM) VEGF ekspresyonunu artırırken bu derişimde anjiyotensin II'nin tüp oluşumuna etkisi 10 nM ile kıyaslandığında daha az olmuştur (veriler sunulmadı).

Anjiyotensin II Aracılı Tübülojenez ve Aortik Dallanma EGFR Transaktivasyonu Aracılıklıdır.

Anjiyotensin II'nin DDK hücre proliferasyonu ve göçünü, EGFR transaktivasyonu ile uyardığı (Mugabe et. al., 2010) ve heparin bağlayıcı EGF'in anjiyotensin II ile oluşturulan neovaskülarizasyona katıldığı gösterilmiştir. Bizim aşağıdaki verilerimiz anjiyotensin II aracılıklı tübülojenez ve aortik

14

dallanmanın da EGFR transaktivasyonu aracılıklı olduğunu göstermektedir: 1) EGF, EA hücrelerinde tübülojenezi ve sıçan aort halkalarında dallanmayı artırmaktadır. 2) EGF ve anjiyotensin II EA hücrelerinde EGFR fosforilasyonunu artırmaktadır. 3) EGF ve anjiyotensin II’nin bu etkileri EGFR blokörü AG-1478 ile önlenmektedir. Ayrıca, 1) EGF, EA hücrelerinde tübülojenezi ve sıçan aort halkalarında dallanma artışı; VEGF nötralize edici antikor Flt-1/Fc ile önlenirken Flk-1 antagonisti SU-1498 etkisiz kalmıştır. 2) EGF, Flt-1 fosforilasyonunu artırırken, Flk-1 fosforilasyonunu değiştirmemiştir ve Flt-1 fosforilasyonundaki artış Flt-1/Fc ile önlenirken SU-1498 ile değişmemiştir. 3) VEGF ile oluşan tübülojenez ve aortik dallanma ve ayrıca Flt-1 ve Flk-1 fosforilasyonu EGFR blokörü AG-1478 ile bloke olmamamıştır. Tüm bu veriler, anjiyotensin II ile oluşan anjiyojenezin EGFR transaktivasyonu ile Flt-1 fosforilasyonu aracılıklı ve VEGF ekspresyonundan bağımsız bir şekilde geliştiği görüşünü desteklemektedir.

Dtk'nin Anjiyojenez Üzerine Etkisi

Anjiyotensin II'nin EGFR transaktivasyonu ile anjiyojeneze neden olma mekanizmasını daha fazla aydınlatabilmek için Dtk'nin bu olaydaki rolü araştırılmıştır. Bulgularımıza göre: 1) Anjiyotensin II, EGF ve VEGF Dtk fosforilasyonunu artırmaktadır. 2) Anjiyotensin II’nin, ancak EGF ve VEGF’in değil, Dtk fosforilasyonunu artırıcı etkisi AT1 reseptör blokörü losartan ile önlenirken AT2 reseptör blokörü PD-123319 etkisiz kalmıştır. 3) Dtk inhibitörü piketanol anjiyotensin II, EGF ve VEGF ile EA hücrelerinde tüp oluşumunu ve Dtk fosforilasyonunu, ayrıca aort halkalarında kapiler dallanmayı önlemiştir. Bu veriler, Dtk'nın anjiyotensin II ile oluşan anjiyojeneze katkısı olduğunu göstermektedir. EA hücrelerinde insan Dtk shRNA, ancak onun kontrol shRNA değil, tüp oluşumu ve Dtk fosforilasyonunu azaltması, ayrıca aort halkalarının Dtk siRNA'sı ile transfeksiyonu sonucu kapiler dalllanmayı önlemesi de yukarıdaki çıkarımı desteklemektedir. Aşağıdaki verilerimiz anjiyotensin II ile oluşturulan anjiyojenez sürecinin AT1 reseptörleri aracılığıyla EGFR transaktivasyonuna neden olarak Flt-1 fosforilasyonu ve Dtk etkinleşmesine neden olduğunu göstermektedir: 1) Dtk inhibitorü

piketanol ve Dtk shRNA, EGF ve VEGF ile oluşturulan tübülojenez ve Dtk fosforilasyonunu önlemiştir. 2) Piketanol ve Dtk siRNA, EGF ve VEGF ile uyarılan aort halkalarındaki kapiler dallanmayı inhibe etmiştir. 3) Anjiyotensin II ile artan Dtk fosforilasyonu AT1 reseptör blokörü losartan ile önlenirken AT2 reseptör blokörü PD-123319 etkisiz kalmıştır. 4) Flt-1/Fc; anjiyotensin II, EGF ve VEGF ile artan Dtk fosforilasyonunu önlerken, SU-1498 etkisizdi. 5) Piketanol veya Syk shRNA; EGF ve VEGF ile artan, sırasıyla, EGFR ve Flt-1 fosforilasyonunu ve Flt-1 ve Flk-1 fosforilasyonunu değiştirmemiştir. 6) VEGF ile artan Dtk fosforilasyonu EGFR blokörü AG-1478 ile değiştirmemiştir.

Sonuç olarak, bizim çalışmamız anjiyotensin II ile uyarılan anjiyojenez sürecinde (EA hücrelerinde tüp oluşumu ve sıçan aort halkalarında kapiler dallanma) EGFR transaktivasyonu sonucu gerçekleştiğini ve daha sonra Flt-1 fosforile olarak Dtk’nin etkinleşmesine yol açtığını ve bu durumun VEGF ekspresyonundan bağımsız olduğunu göstermektedir (Şekil 16).

Şekil 16. Anjiyotensin II (ANG II) ile uyarılan

anjiyojenez için önerdiğimiz mekanizma.

Anjiyotensin II, VEGF ekspresyonundan bağımsız

olarak, EGFR transaktivasyonu ile ve ardından Flt-1

fosforilasyonu ve Dtk (Syk)’yi etkinleştirilerek

anjiyojeneze neden olmaktadır. HB-EGF: heparin-

bağlayıcı EGF.

Destek

Bu çalışma National Heart, Lung, and Blood Institute Grant R01-079109-05 tarafından desteklenmiştir. C.

Kemal Buharalıoğlu, TÜBİTAK tarafından 2219- Doktora sonrası araştırma bursuyla desteklenmiştir.

15

KAYNAKLAR

Carmeliet, P. (2005) Angiogenesis in life, disease and medicine. Nature 438: 932–936.

Chintalgattu, V., Nair, D.M., Katwa, L.C. (2003) Cardiac myofibroblasts: a novel source of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors Flt-1 and KDR. J Mol Cell Cardiol 35: 277–286.

Clempus, R.E. ve Griendling, K.K. (2006) Reactive oxygen species signaling in vascular smooth muscle cells. Cardiovasc Res 71: 216–225.

Eguchi, S., Dempsey, P.J., Frank, G.D., Motley, E.D., Inagami, T. (2001) Activation of MAP kinases by angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Metalloproteasedependent EGF receptor activation is required for activation of ERK and p38 MAP kinase but not JNK. J Biol Chem 276: 7957–7962.

Eguchi, S., Iwasaki, H., Inagami, T., Numaguchi, K., Yamakawa, T., Motley, E.D., Owada, K.M., Marumo, F., Hirata, Y. (1999) Involvement of PYK2 in angiotensin II signaling of vascular smooth muscle cells. Hypertension 33: 201–206.

Eguchi, S., Numaguchi, K., Iwasaki, H., Matsumoto, T., Yamakawa, T., Utsunomiya, H., Motley, E.D., Kawakatsu, H., Owada, K.M., Hirata, Y., et al. (1998) Calcium-dependent epidermal growth factor receptor transactivation mediates the angiotensin IIinduced mitogen-activated protein kinase activation in vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 273: 8890–8896.

Feng, T.C., Ying, W.Y., Hua, R.J., Ji, Y.Y., de Gasparo, M. (2001) Effect of valsartan and captopril in rabbit carotid injury. Possible involvement of bradykinin in the antiproliferative action of the renin-angiotensin blockade. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst 2: 19–24.

Herr, D., Rodewald, M., Fraser, H.M., Hack, G., Konrad, R., Kreienberg, R., Wulff, C. (2008) Regulation of endothelial proliferation by the renin-angiotensin system in human umbilical vein endothelial cells. Reproduction 136: 125–130.

Kobori, H., Nangaku, M., Navar, L.G., Nishiyama, A. (2007) The intrarenal reninangiotensin system: from physiology to the pathophysiology of hypertension and kidney disease. Pharmacol Rev 59: 251–287.

Kyaw, M., Yoshizumi, M., Tsuchiya, K., Kagami, S., Izawa, Y., Fujita, Y., Ali, N., Kanematsu, Y., Toida, K., Ishimura, K. et al. (2004) Src and Cas are essentially but differentially involved in angiotensin II-stimulated migration of vascular smooth muscle cells via extracellular signal-regulated kinase 1/2 and c-Jun NH2-terminal kinase activation. Mol Pharmacol 65: 832–841.

Lee, H.M., Lee, C.K., Lee, S.H., Roh, H.Y., Bae, Y.M., Lee, K.Y., Lim, J., Park, P.J., Park, T.K., Lee, Y.L. et al. (2007) p38 mitogen-activated protein kinase contributes to angiotensin II-stimulated migration of rat aortic smooth muscle cells. J Pharmacol Sci 105: 74–81.

Montezano, A.C., Callera, G.E., Yogi, A., He, Y., Tostes, R.C., He, G., Schiffrin, E.L., Touyz, R.M. (2008) Aldosterone and angiotensin II synergistically stimulate migration in vascular smooth muscle cells through c-Src-regulated redoxsensitive RhoA pathways. Arterioscler Thromb Vasc Biol 28: 1511–1518.

Mugabe, B.E., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Buharalioglu, C.K., Waters, C.M., Malik, K.U. (2010) Angiotensin II-induced migration of vascular smooth muscle cells is mediated by p38 mitogen-activated protein kinase-activated c-Src through spleen tyrosine kinase and epidermal growth factor receptor transactivation. J Pharmacol Exp Ther 332: 116–124.

Nakashima, H., Frank, G.D., Shira, H., Hinoki, A., Higuchi, S., Ohtsu, H., Eguchi, K., Sanjay, A., Reyland, M.E., Dempsey, P.J., Inagami, T., Eguchi, S. (2008) Novel role of protein kinase C-delta Tyr 311 phosphorylation in vascular smooth muscle cell hypertrophy by angiotensin II. Hypertension 51: 232–238.

Natarajan, R., Scott, S., Bai, W., Yerneni, K.K., Nadler, J. (1999) Angiotensin II signaling in vascular smooth muscle cells under high glucose conditions. Hypertension 33: 378–884.

Navar, L.G. (1997) The kidney in blood pressure regulation and development of hypertension. Med Clin North Am 81: 1165–1198.

Ohtsu, H., Mifune, M., Frank, G.D., Saito, S., Inagami, T., Kim-Mitsuyama, S., Takuwa, Y., Sasaki, T., Rothstein, J.D., Suzuki, H. et al. (2005) Signal-crosstalk between Rho/ROCK and c-Jun NH2-terminal kinase mediates migration of vascular smooth muscle cells stimulated by angiotensin II. Arterioscler Thromb Vasc Biol 25: 1831–1836.

16

Rakugi, H., Wang, D.S., Dzau, V.J., Pratt, R.E. (1994) Potential importance of tissue angiotensin-converting enzyme inhibition in preventing neointima formation. Circulation 90: 449–455.

Rocic, P. ve Lucchesi, P.A. (2001) Down-regulation by antisense oligonucleotides establishes a role for the proline-rich tyrosine kinase PYK2 in angiotensin IIinduced signaling in vascular smooth muscle. J Biol Chem 276: 21902–21906.

Sada, K., Takano, T., Yanagi, S., Yamamura, H. (2001) Structure and function of Syk protein-tyrosine kinase. J Biochem 130: 177–186.

Saito, S., Frank, G.D., Motley, E.D., Dempsey, P.J., Utsunomiya, H., Inagami, T., Eguchi, S. (2002) Metalloprotease inhibitor blocks angiotensin II-induced migration through inhibition of epidermal growth factor receptor transactivation. Biochem Biophys Res Commun 294: 1023–1029.

Servant, M.J., Giasson, E., Meloche, S. (1996) Inhibition of growth factor-induced protein synthesis by a selective MEK inhibitor in aortic smooth muscle cells. J Biol Chem 271: 16047–16052.

Touyz, R.M. (2003) The role of angiotensin II in regulating vascular structural and functional changes in hypertension. Curr Hypertens Rep 5: 155–164.

Touyz, R.M. (2004) Reactive oxygen species and angiotensin II signaling in vascular cells—implications in cardiovascular disease. Braz J Med Biol Res 37: 1263–1273.

Touyz, R.M., He, G., Wu, X.H., Park, J.B., Mabrouk, M.E., Schiffrin, E.L. (2001) Src is an important mediator of extracellular signal-regulated kinase 1/2-dependent growth signaling by angiotensin II in smooth muscle cells from resistance arteries of hypertensive patients. Hypertension 38: 56–64.

Touyz, R.M., Schiffrin, E.L. (2000) Signal transduction mechanisms mediating the physiological and pathophysiological actions of angiotensin II in vascular smooth muscle cells. Pharmacol Rev 52: 639–672.

Weiss, D., Sorescu, D., Taylor, W.R. (2001) Angiotensin II and atherosclerosis. Am J Cardiol 87: 25–32.

Xi, X.P., Graf, K., Goetze, S., Fleck, E., Hsueh, W.A., Law, R.E. (1999) Central role of the MAPK pathway in ang II-mediated DNA synthesis and migration in rat vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 19: 73–82.

Inatome, R., Yanagi, S., Takano, T., Yamamura, H. (2001) A critical role for Syk in endothelial cell proliferation and migration. Biochem Biophys Res Commun 286: 195–199.

Yaghini, F.A., Li, F., Malik, K.U. (2007) Expression and mechanism of spleen tyrosine kinase activation by angiotensin II and its implication in protein synthesis in rat vascular smooth muscle cells. J Biol Chem 282: 16878– 16890.

Yanagi, S., Inatome, R., Ding, J., Kitaguchi, H., Tybulewicz, V.L., Yamamura, H. (2001) Syk expression in endothelial cells and their morphologic defects in embryonic Syk-deficient mice. Blood 98: 2869–2871.

* * * * *

17

ÖZGEÇMİŞ

1. KİMLİĞİ:

Adı, soyadı: Cüneyt Kemal BUHARALIOĞLU

Doğum yeri ve tarihi: Ankara, 27.09.1973

Medeni hali: Bekâr

İş adresi: Mersin Üniversitesi Yenişehir Kampüsü Eczacılık Fakültesi, Mersin

Telefon: 0506 402 56 82

Fax:

e-posta: [email protected]

2. EĞİTİM ÖYKÜSÜ:

Ortaöğrenim: Kabataş Erkek Lisesi

Lisans: Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi

Yüksek Lisans: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı

Doktora: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı

3. MESLEKİ DENEYİMLERİ:

Ar. Gör: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (1994-1996)

Dr. Ar. Gör.: Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (1996-2001)

Yrd. Doç. Dr.: Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi (2003- )

Yrd. Doç. Dr.: T.C. Sağlık Bakanlığı İlaç Eczacılık Genel Müdürlüğü (Yurtiçi görevlen-dirme; 1 Temmuz -3 Ağustos 2007)

4. YÜKSEK LİSANS TEZİ:

Sıçanlarda İndometazinle Oluşturulan Gastrik Mukozal Ülserler Üzerine K

+ Kanal

Açıcılarının Etkileri

Danışman: Doç. Dr. Fatma AKAR

5. DOKTORA TEZİ:

Sıçan Aortasında Hipertonisitenin Oluşturduğu Kastırıcı Etkiye Aracılık Eden Yolakların İncelenmesi

Danışman: Prof. Dr. Fatma AKAR

6. PROJELER:

1. Buharalıoğlu, C.K., Kaçan, M., Gilik, D., Sarı, A.N., Şahan-Fırat, S., Korkmaz, B., Tunçtan, B.; "Sıçanlarda Endotoksin ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması" Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-SBE F (MK) 2011-5 YL (17 Eylül 2011-17 Eylül 2012; devam ediyor).

2. Şahan-Fırat, S., Gilik, D., Kaçan, M., Sarı, A.N., Buharalıoğlu, C.K., Korkmaz, B., Tunçtan, B.; "Sıçanlarda Zimosan ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması" Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-SBE F (DG) 2011-5 YL (17 Eylül 2011-17 Eylül 2012; devam ediyor).

3. Tunçtan, B., Serin, M.S., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Sarı, A.N., Endotoksemik sıçanlarda dayanıklı 20-HETE analoğu 5,14-HEDGE'nin CYP2C23'e bağımlı renal epoksijenaz ile çözünebilir epoksit hidrolaz ekspresyon ve etkinliği üzerindeki etkisinin proinflamatuvar sitokin oluşumu ve MEK1/ERK1/2/NF-

B yoluyla ilişkilendirilerek araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-ECZ F FB (BT) 2010-5 B, Araştırıcı, (Kasım 2010-Kasım 2012; devam ediyor).

4. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Serin, M.S., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Cüez, T., Sari, A.N., Endotoksemik sıçanların kardiyak, renal ve vasküler dokularında nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz ve sitokrom P450 4A enzimleri arasındaki etkileşmelerin mekanizmasının moleküler düzeyde araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje no: 109S121, Araştırıcı, (Kasım 2009-Kasım 2012; devam ediyor).

5. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat, S., Cüez, T., Sarı A.N., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerinde azalmanın eşlik ettiği hipotansiyona COX-2 Ürünlerinin

mailto:[email protected]

18

Katkısının Araştırılması. Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Araştırıcı, (Temmuz 2010; Ocak 2012).

6. Malik, K.U. (Principal Investigator), Eicosanoids-induced vascular growth during injury. National Institute of Health National Heart, Lung, and Blood Institute, University of Tennessee Health Science Center, Grant 5R01HL07910905, Araştırıcı (Temmuz 2007–Haziran 2009).

7. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat, S., Endotoksemik sıçanlarda ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje no: 106S299 (SBAG-3508), Araştırıcı, (Şubat 2007-Şubat 2009).

8. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat, S., Demiryürek, A.T., Endotoksemik sıçanlarda mitojen ile aktive edilen protein kinaz kinaz 1/ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Doktora Tez Projesi, Mersin, Proje no: BAP SBE EMB (RBK) 2006-3 DR, Araştırıcı, (Kasım 2006-Kasım 2009).

9. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyona sitokrom P450 ve siklooksijenaz-2 ürünlerinin katkısı. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP ECZF EMB (BT) 2006-3, Araştırıcı, (Kasım 2006-Ağustos 2008).

10. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Doğruer, Z.N., Tamer, L., Buharalıoğlu, C.K., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyonda mitojen ile aktive edilen kinaz - ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz (ERK1/2) yolunun öneminin araştırılması, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP ECZF EMB (BT) 2004-3, Araştırıcı, (Haziran 2005-Aralık 2006).

11. Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Özveren, E., Korkmaz, B., Atik, U.,

Sitozolik fosfolipaz A2 enziminin sepsis patojenezindeki rolü ve farmakolojik inhibisyonunun öneminin araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP ECZ F EMB (KB) 2003-1, Proje Yöneticisi, (2003-2006).

12. Buharalıoğlu, C.K., Özbaşoğlu, O., Tunçtan, B., Korkmaz, B., Şahan-Fırat, S., Yalçın, A., Endotoksin ile oluşturulan inflamatuvar hiperaljezide talidomidin etkilerinin incelenmesi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Yüksek Lisans Tez Projesi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (OÖ) 2006-3 YL, Proje Yöneticisi, (2006-2007). (2007 yılında TÜBİTAK 2219 Yurt Dışı Bursu kapsamında post-doc olarak ABD’de bulunmam nedeniyle Proje Yöneticiliği Prof. Dr. Bahar TUNÇTAN’a devredilmiştir.)

13. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Özveren, E., Buharalıoğlu, C.K., Endotoksin ile oluşan vasküler hiporeaktivitede G proteini ile kenetli alfa-adrenerjik reseptör/mitojen ile aktive edilen kinazlar yolu ile sitozolik fosfolipaz A2 ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz enzimleri arasındaki ilişkinin mekanizmalarının sıçan aortunda araştırılması, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP SBE EMB (RBK) 2003-1 YL, Araştırıcı, (Haziran 2003-Haziran 2004).

14. Tunçtan, B., Özveren, E., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., G proteini ile kenetli reseptörler ile ilişkili sinyal ileti yolunda endotoksin ile sıçan mezenterik arterinde oluşan değişikliklerin mekanizmalarının araştırılması, Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP ECZ F MB (BT) 2002, Araştırıcı, (Ocak 2003-Haziran 2004).

15. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Özveren, E., Korkmaz, B., Tamer, L., Atik, U., Endotoksin ile oluşturulan

inflamatuvar hiperaljezide NF-B, nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz ve poliADP-riboz sentazın rolü, Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Mersin, Araştırıcı, (Eylül 2002-Aralık 2004).

16. Uydeş-Doğan, B.S., Buharalıoğlu, C.K., Sayar, E., Gastrik mukus sekresyonunda

19

potasyum kanallarının işlevi, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, EF-02/98-02, Ankara, Araştırıcı, (1998-2000).

17. Kanzık, İ., Uydeş-Doğan, B.S., Buharalıoğlu, C.K., İlter, Ö., Etanolle indüklenen gastrik ülserde potasyum kanal işlevinin araştırılması, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, SBE 11 / 98-01, Ankara, Araştırıcı, (1998-2000).

18. Akar, F., Buharalıoğlu, C.K., Uydeş, S., Tufan, H., Gastrik asit sekresyonunda potasyum kanallarının rolü, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, SBE 11 / 96-8, Ankara, Araştırıcı, (1996-1998).

19. Kanzık, İ., Akar, F., Buharalıoğlu, C.K., Peptik ülserde potasyum kanal işlevinin araştırılması, Gazi Üniversitesi, Araştırma Fonu, SBE 11 / 94-23, Ankara, Araştırıcı, (1994-1997).

20. Akar, F., Tufan, H., Buharalıoğlu, C.K., Preeklampsili kadınların umbilikal ve omental arterlerinde potasyum kanal fonksiyonlarının incelenmesi, TÜBİTAK-SBAG, AYD 116, Ankara, Araştırıcı, (1994-1997).

7. BURSLAR: TÜBİTAK 2219- Doktora sonrası araştırma bursu

8. ÜYELİKLER:

1. Türk Farmakoloji Derneği 2. Kronobiyoloji Derneği 3. Farmasötik Bilimler Ankara Derneği 4. American Heart Association & American

Stroke Association 5. Atatürk Kültür, Dil ve Tarih Yüksek

Kurumu İlaç ve Eczacılık Terimleri Çalışma Grubu Üyesi (2004; devam ediyor)

6. Türk Farmakopesi Çalışma Grubu Üyesi (2010; devam ediyor)

7. Mersin Üniversitesi, Proje Bilgilendirme ve Destek Birimi Üyesi (2011; devam ediyor)

8. Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Yayın Değerlendirme Komisyonu (2011; devam ediyor)

9. YABANCI DİL: İngilizce

YAYIN LİSTESİ

Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan Araştırma Makaleleri

1. Buharalioglu, C.K., Akar, F., “The reactivity of serotonin, acetylcholine and KCl-induced contractions to relaxant agents in the rat gastric fundus”, Pharmacol Res, 45(4), 325-331 (2002).

2. Deliorman, D., Calis, I., Ergun, F., Uydes-Dogan, B.S., Buharalıoglu, C.K., Kanzik, I., “Studies on the vascular effects of the fractions and phenolic compounds isolated from Viscum album ssp. Album”, J Ethnopharmacol, 72 (1-2), 323-329 (2000).

3. Akar, F., Uydes-Dogan, B.S., Buharalioglu, C.K., Abban, G., Heinemann, A., Holzer, P., van de Voorde, J., “Protective effect of cromakalim and diazoxide and proulcerogenic effect of glibenclamide on indomethacin-induced gastric injury”, Eur J Pharmacol, 374, 461-470 (2000).

4. Dayioglu, E., Buharalioglu, C.K., Saracoglu F., Akar F., “The effects of bumetanide on human umbilical artery contractions”, Reproductive Sciences, 14, 246-252 (2007).

5. Tunctan, B., Korkmaz, B., Dogruer, Z.N., Tamer, L., Atik, U., Buharalioglu, C.K., “Inhibition of extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) activity reverses endotoxin-induced hypotension via decreased nitric oxide production in rats”, Pharmacol Res 56(1), 56-64 (2007).

6. Korkmaz, B., Ozveren, E., Buharalioglu, C.K., Tunctan, B., “Extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2) contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via nitric oxide and prostacyclin production in rat aorta”, Pharmacology, 78(3), 123-128 (2006).

7. Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tunctan, B., “Involvement of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II to endotoxin-induced vascular hyporeactivity in rat superior mesenteric artery”, Pharmacol Res, 54(3), 208-218 (2006).

20

8. Tunctan, B., Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tamer, L., Degirmenci, U., Atik, U., “Nitric oxide reverses endotoxin-induced inflammatory hyperalgesia via inhibition of prostacyclin production in mice”, Pharmacol Res, 53(2), 177-192 (2006).

9. Tunctan, B., Korkmaz, B., Yildirim, H., Tamer, L., Atik, U., Buharalioglu, C. K., “Reversal of endotoxin-induced hypotension by inhibition of inducible nitric oxide synthase activity is associated with improved oxidative status in rat heart, aorta and mesenteric artery”, Turkish Journal of Medical Sciences, 36, 71-80 (2005).

10. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., “20-HETE Agonist, N-[20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienoyl]glycine, Opposes the Fall in Blood Pressure and Vascular Reactivity in Endotoxin-Treated Rats”, Shock, 30(3), 329-335 (2008).

11. Mugabe, B.E., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Buharalioglu, C.K., Waters, C.M., Malik, K.U., “Angiotensin II-Induced Migration of Vascular Smooth Muscle Cells is Mediated by p38 Mitogen-Activated Protein Kinase-Activated c-Src through Spleen Tyrosine Kinase and Epidermal Growth Factor Receptor Transactivation”, J Pharmacol Exp Ther, 332(1), 116-24 (2010).

12. Cuez, T., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunctan, B., “A Synthetic Analog of 20-HETE, 5,14-HEDGE, Reverses Endotoxin-Induced Hypotension via Increased 20-HETE Levels Associated with Decreased iNOS Protein Expression and Vasodilator Prostanoid Production in Rats”, Basic and Clinical Pharmacology Toxicol, 106(5), 378-88 (2010).

13. Tunctan B., Korkmaz, B., Cuez, T., Kemal Buharalioglu, C., Sahan-Firat S., Falck, J., Malik, K.U., “Contribution of Vasoactive Eicosanoids and Nitric Oxide Production to the Effect of Selective Cyclooxygenase-2 Inhibitor, NS-398, on Endotoxin-Induced Hypotension in Rats”, Basic Clin Pharmacol Toxicol, Apr 23 (2010).

14. Korkmaz, B., Buharalioglu, K., Sahan-Firat, S., Cuez, T., Tuncay Demiryurek, A., Tunctan, B. “Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC/PKG pathway associated with peroxynitrite formation contributes to hypotension and vascular hyporeactivity in endotoxemic rats” Nitric Oxide, 24(3):160-72 (2011).

15. Buharalioglu, C.K., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Sari, A.N., Malik, K.U., Tunctan, B., “Piroxicam reverses endotoxin-induced hypotension in rats: contribution of vasoactive eicosanoids and nitric oxide” Basic Clin Pharmacol Toxicol, 109(3):186-94 (2011).

16. Buharalioglu, C.K., Song, C.Y., Yaghini, F.A., Ghafoor, H.U., Motiwala, M., Adris, T., Estes, A.M., Malik, K.U., “Angiotensin II-induced process of angiogenesis is mediated by spleen tyrosine kinase via VEGF receptor-1 phosphorylation” Am J Physiol Heart Circ Physiol, 301(3): H1043-55 (2011).

17. Buharalioglu, C.K., Ugur, M., Akar, F., “The characteristics of contractions to hyperosmolar stress in rat aorta”, Int J Pharmacol, DOI: 10.3923/ijp.2011 (2011).

Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri

1. Buharalioglu, C.K., Song, C.Y., Yaghini, F.A., Ghafoor, H.U., Estes, A.M., Malik, K.U., "Angiotensin II-induced angiogenesis is mediated by spleen tyrosine kinase via epidermal growth factor receptor-stimulated vascular endothelial growth factor receptor 1 phosphorylation independent of vascular endothelial growth factor expression”, 63

rd High Blood Pressure Research

Conference, Chicago, IL, USA, September 23-26, Program /Abstract No: P212, 110 (2009).

2. Buharalioglu, C.K., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Ghafoor, H.U., Estes, A.M., Malik, K.U., "Spleen tyrosine kinase mediates angiotensin II- and vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis", Experimental Biology, New Orleans, LA,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20456329






21

USA, April 18-22, Program/Abstract No: 625.9/472, FASEB J 23 (2009).

3. Buharalioglu, C.K., Ozbasoglu, O., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yalcin, A., Tunctan, B., “Thalidomide potentiates analgesic effect of COX inhibitors on endotoxin-induced

hyperalgesia by modulating TNF-, PGE and NO synthesis in mice” Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 742.4/1561, FASEB J 23 (2009).

4. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yildirim, H., Tamer, L., Buharalioglu, C.K., Falck, J.R., Malik, K.U., ”Increased production of 20-HETE contributes to the effects of COX inhibitors to prevent the decrease in lipid peroxidation and increase in catalase activity during endotoxemia” Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 937.13/658, FASEB J 23 (2009).

5. Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Demiryurek, T.A., Sahan-Firat, S., Cuez, T., Tunctan, B., “Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC/PKG pathway contributes to the fall in blood pressure and vascular reactivity in endotoxemic rats”, Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 932.5/1009, FASEB J 23 (2009).

6. Sahan-Firat, S., Korkmaz, B., Cuez, T., Ayaz, L., Tamer, L., Buharalioglu, C.K., Sari, A.N., Tunctan, B., “Prostaglandins contribute to endotoxin-induced increase in lipid peroxidation via nitric oxide production during endotoxemia in rats”, Experimental Biology, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: LB368/656, FASEB J 23 (2009).

7. Sahan-Firat, S., Canacankatan, N, Korkmaz B, Yildirim, H., Tamer, L., Buharalioglu C.K., Sari, AN., Tunctan, B., “Differential regulation of oxidative stress by NO in vascular and nonvascular tissues of endotoxemic rats”, Experimental Biology, San Diego, CA, USA, April 5-9, FASEB J Abstract No: 5981 (2008).

8. Yaghini, F.A., Mugabe, B.E., Buharalioglu, C.K., Estes, A.M., Malik,

K.U., "Mechanism of angiotensin II-induced c-Src activation in vascular smooth muscle" Experimental Biology, San Diego, CA, USA, April 5-9, FASEB J Abstract No: 22:911.5 (2008).

9. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, JR., Yildirim, H., Tamer, L., Roman, RJ., Malik, KU., “20-HETE agonist, N-[20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienoyl]glycine, opposes the endotoxin-induced fall in blood pressure and the decrease in vascular reactivity and lipid peroxidation and increased catalase activity via inhibition of NO production in rats”, Experimental Biology, San Diego, CA, USA, April 5-9, FASEB J Abstract No: 6051 (2008).

10. Buharalioglu, C.K., Dayıoglu, E., Saracoglu, F., Akar, F., “The effects of bumetanide on human umbilical artery contractions”, XVth World Congress of Pharmacology, Beijing, China, Abstract Book, P110064 (2006).

11. Tunctan, B., Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., “Calcium/ calmodulin dependent protein kinase II contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via prostaglandin production in rat mesenteric artery”, Experimental Biology, San Diego, CA, USA FASEB J 19(5), p. A1551, Abstract No: 877.6 (2005).

12. Tunctan, B., Korkmaz, B., Ozveren, E., Buharalioglu, C.K., “Mitogen-activated protein kinase signalling cascade contributes to endotoxin-induced hyporeactivity via nitric oxide and prostaglandin production in rat thoracic aorta, ” Experimental Biology, San Diego, CA, USA FASEB J 19(5), p. A1551, Abstract No: 877.5 (2005).

Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri

1. Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tunctan, B., “Inhibition of inducible nitric oxide synthase restores attenuation of endothelium-dependent and endothelium-independent relaxations in rat superior mesenteric artery exposed to endotoxin”, 8

th International Symposium

on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-8),

22

Ankara, Turkey, Abstract Book, P121 (2006).

2. Akar, F., Buharalioglu, C.K., “The involvement of MLCK in hypertonicity-induced contraction in vascular smooth muscle”, 7

th International Symposium on

Resistance Arteries, Muskoka Sands, Ontario, Canada, Abstract Book, P.105 (2001).

3. Akar, F., Buharalioglu, C.K., ”The role of endothelium and Na-K-2Cl cotransport in hypertonicity-induced contractions”, 7

th

International Symposium on Resistance Arteries, Muskoka Sands, Ontario, Canada, Abstract Book, P.85, (2001).

4. Buharalioglu, C.K., Akar, F., “Losartan differentially affects hypertonic sucroce and NaCl induced contractions in rat aorta”, 2

nd International Forum on

Angiotensin II Receptor Antagonism, Monte-Carlo, Abstract Book, P.1.6 (2001).

5. Deliorman, D., Calis, I., Ergun, F., Uydes-Dogan, S., Buharalioglu, C.K., Kanzık, I., “Studies on the vascular effect of fractions and phenolic compounds isolated from Viscum Album SSP. Album”, 2000 Years of Natural Products Research, Amsterdam, Netherlands, Abstract Book, P.192 (1999).

6. Uydes-Dogan, B.S., Sayar, S., Buharalioglu, C.K., Kanzık, I., Akar, F., “Effects of K

+ channel openers

cromakalim and diazoxide on gastric acid secretion in the pylorus-ligated rats”, 32

nd

Annual Meeting, European Society for Clinical Investigation, Cracow, Poland, Eur. J. Clin. Invest., 55( Suppl.1), 266 (1998).

7. Akar, F., Buharalioglu, C.K., Uydes-Dogan, B.S., Kanzık, I., “The investigation of effects of K

+ channel

openers on gastric injury and contractions in rats”, XXXIII. International Congress of Physiological Sciences, IUPS, St. Petersburg, Russia, Abstract Book, P009.09 (1997).

8. Tufan, H., Buharalioglu, C.K., Uydes-Dogan, B.S., Kanzık, I., Akar, F., “K

+

channel active agents can play a role in indomethacin-induced gastric mucosal injury in rats”, 10

th International

Conference on Prostaglandins and

Releated Compounds, Vienna, Austria, Prostaglandin Leukot. Essential Fatty Acids, 55(Suppl.1), P260 (1996).

9. Cüez, T., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunçtan, B., “Endotoksemik sıçanlarda N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin eNOS, iNOS ve hsp90 protein ekspresyonu ile prostanoit ve 20-HETE düzeyleri üzerindeki etkisi”, XX. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 262, Bildiri No: P-082 (2009).

10. Şahan-Fırat, S., Canacankatan, N., Korkmaz, B., Yıldırım, H., Tamer, L., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., “Endotoksemik sıçanların karaciğerinde artan oksidatif stres üzerinde indüklenebilir nitrik oksit sentaz inhibisyonunun etkisi”, 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim, Özet Kitabı, s. 378, Bildiri No: P104 (2007).

11. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., “Endotoksin ile olusan nitrik oksit aracilikli hipotansiyon ve vaskuler hiporeaktivite üzerinde selektif 20-hidroksieikozatetraenoik asit agonisti N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil] glisinin etkileri”, 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim, Özet Kitabı, s. 212, Bildiri No: S-02 (2007).

12. Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek A.T., Şahan-Fırat S., Tunçtan, B., “Endotoksemik sıçanların torasik aortasında gelişen vasküler hiporeaktiviteye indüklenebilir nitrik oksit sentaz/çözünebilir guanilil siklaz/protein kinaz G yolunun katkısı”, 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim, Özet Kitabı, s. 211, Bildiri No: S-01 (2007).

13. Korkmaz, B., Özveren, E., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., “Sıçan torasik aortunda endotoksin ile oluşan nitrik oksit ve prostaglandin aracılıklı hiporeaktiviteye mitojen ile aktive edilen protein kinaz sinyal ileti yolu katkıda bulunur”, XVIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim 2005, s. 341, SP42 (2005).

23

14. Tunçtan, B., Özveren, E., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Tamer, L., Değirmenci, U., Atik, U., “Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı inflamatuvar hiperaljezide nükleer transkripsiyon faktörü K B, siklooksijenaz ve poli-ADP-riboz sentazın rolü”, XVIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim 2005, s. 301, S21 (2005).

15. Buharalıoğlu C.K., Korkmaz B., Yıldırım H., Tamer L., Atik U., Tunçtan B., “Nitrik oksidin böbrek sitozolik fosfolipaz A2 aktivitesini azaltıcı etkisi endotoksin ile oluşan hipotansiyona katkıda bulunabilir”, XVIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim 2005, s. 154, P15 (2005).

16. Tunctan, B., Ozveren, E., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Tamer, L., Atik, U.,

“Role of NF-B and nitric oxide synthase in endotoxin-induced inflammatory hyperalgesia”, 17

th National Congress Of

Pharmacology, 1st Clinical Pharmacology

Symposium & Joint Meeting of the Turkish & Dutch Pharmacological Societies, Antalya, 17-21 October, Turkey, Abstract Book, P56 (2003).

17. Buharalıoğlu, C.K., İlter, Ö.R., Akar, F., Uydeş-Doğan, B.S., “Potasyum kanal açıcılarının sıçanlarda etanolle oluşturulan gastrik mukozal lezyonlar üzerine etkisi”, Türk Farmakoloji Derneği, XV. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 1-5 Kasım, Manavgat, 08-32 (1999).

18. Buharalıoğlu, C.K., Uydeş-Doğan, B.S., Kanzık, İ., Akar, F., “Sıçanlarda indometazin ülseri üzerine çeşitli vazoaktif bileşiklerin etkisi”, Türk Farmakoloji Derneği, XIII. Ulusal Kongresi, 4-8 Kasım, s. 88, Tekirova-Antalya (1996).

19. Köksoy, C., Kuzu, A., Buharalıoğlu, C.K., Uydeş-Doğan, B.S., Akar, F., Kesenci M., “İntestinal iskemi-reperfüzyon hasarının çeşitli damar yatakları üzerine olan etkileri”, VIII. Ulusal Vasküler Cerrahi Kongresi, 20-23 Nisan, s. 27 (1996).

Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Yapılan Sözlü Sunumlar

1. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Cüez, T., Sari, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Buharalioğlu, C.K., Şahan Firat, S., Schunk, W.H.,

Serin M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., "Sıçan ve Farelerde Oluşturulan Deneysel Septik Şok Modelinde 20-HETE Analoğu 5, 14-HEDGE’nin Hipotansiyonu ve Mortaliteyi Önleyici Etkisine iNOS, COX-2, CYP4A1 ve NADPH Oksidazın Etkisi", XXI. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Bildiri no: S-4, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Kongre Merkezi, Eskişehir, 2011

2. Sari, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Şahan Firat, S., Buharalioğlu, C.K., Vezir, Ö., Korkmaz, B., Cüez, T., Sucu, N., Tunçtan, B., "Sıçanlarda Oluşturulan Periferik İskemi/Reperfüzyona Bağlı Hedef Organ Gastrokinemus Kası ve Uzak Organ Böbrek Zedelenmesine RhoA/Rhokinaz/ERK1/2/ İNOS/NADPH Oksidaz Yolunun Katkısı”, XXI. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Bildiri no: S-3, Eskişehir Osmangazi Üniversitesi Kongre Merkezi, Eskişehir, 2011

3. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sarı, A.N., Kacan, M., Gilik, D., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Schunck, W.H, Serin, M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., “Contribution of iNOS, COX-2 and CYP4A1 to the Protective Effect of a Synthetic Analog of 20-HETE, 5,14-HEDGE, Against Endotoxin-İnduced Hypotension and Mortality in Experimental Model of Septic Shock in Rats and Mice”, 10th World Congress on Inflammation, Paris, France, OC-059, Inflammation Research 60 (Suppl. 1), S55, 2011

4. Korkmaz, B., Cüez, T., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek, A.T., Şahan Fırat, S., Sarı, A.N., Tunçtan, B., “Endotoksemik sıçanlarda gelişen kaspaz-3 aracılıklı apoptoza ve oksidatif strese MEK1/ERK1/2/iNOS yolunun katkısı”, XX. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 141, Bildiri No: S-01 (2009).

5. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Buharalıoğlu, C.K., Yıldırım, H., Sarı, A.N., Tamer, L., Falck, J., Malik, K.U., “Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerindeki azalmanın eşlik ettiği oksidatif stres ve inflamasyon üzerinde yapay bir 20-HETE analoğu olan N-[20-

24

hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin etkisi”, XX. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 129, Bildiri No: SS-01 (2009).

6. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Buharalıoglu, C.K., Sahan-Fırat, S., Falck, J., Malik, K.U., "Interactions between Cytochrome P4504A, Cyclooxygenase and Nitric Oxide Synthase during Endotoxemia: Therapeutic Implications for Inflammatory Diseases" EHRLICH II - 2

nd World

Conference on Magic Bullets, Celebrating the 100

th Anniversary of the Nobel Prize

Award to Paul Ehrlich, Nurnberg, Germany, October 3-5, Abstract Book, p. A-330 (2008).

* * * * *

NOTLAR

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

…………………………………………………

25

Septik Sıçanlarda Bozulmuş İnflamatuvar Cevap, Organ Hasarı ve Mortalitenin Önlenmesinde Yeni Bir Hedef: Periferik 5HT7 Reseptörleri

Elif ÇADIRCI Atatürk Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Erzurum

GİRİŞ VE AMAÇ

Sepsis; şok, organ yetmezliği ve ölüme kadar giden, acil tedavi edilmesi gereken sistemik bir enfeksiyon hastalığıdır ve gelişen tedavi yöntemlerine rağmen yüksek mortalite ile seyreden bir hastalık olma özelliğini korumaktadır (Alberti et al., 2002). Sepsis veya septik şok ciddi hipotansiyon, metabolik asidoz, sistemik inflamatuvar yanıt (SIRS), doku hasarı ve çoklu organ yetmezliği, akut respiratuvar distres sendromu (ARDS) ve/veya akut akciğer hasarı (ALI) ve hatta ölümle sonlanabilen kompleks bir patofizyolojik süreçtir (Ozdulger et al., 2003). Sepsis fizyopatolojisinde mikrobiyal patojenler ve inflamatuvar yanıt yer almaktadır. Dokularda oluşan enfeksiyon ve travmatik hasar vücutta hümoral sistemi aktive eder ve çeşitli sitokinler salınır. Sonuç, sistemik inflamatuvar yanıt, hemostatik değişiklikler ve organ hasarının ortaya çıkmasıdır (Bone, 1991; Hotchkiss and Karl, 2003). Sepsiste ortaya çıkan sistemik inflamatuvar yanıt, zıt etki gösteren molekül, mediatör ve sitokinlerle dengelenmeye, düzenlenmeye çalışılır. Bu süreçte sepsise neden olan endotoksin ile uyarılan monositlerden tümör nekrozis faktör (TNF), interlökin 1 (IL-1), IL-6, IL-8 ve trombositleri aktive eden faktör (PAF) salınır. TNF ve IL-1 inflamatuvar sitokinlerin prototipini oluşturur-ken, IL-10 anti-inflamatuvar sitokinlerin prototipidir. Sepsis indüksiyonundan sonra kısa sürede TNF ve IL-1 salınır. Bunlar ikinci sıra sitokinlerin, lipid mediatörlerin ve reaktif oksijen metabolitlerinin salınımına neden olur (Karaali and Tabak, 2009 ; Yorganci, 2005). Son yapılan çalışmalarda oksidatif stresin sepsise bağlı mortalite ve organ hasarında oldukça önemli roller oynaya-bileceği gösterilmiştir.

Oksidanlar inflamasyonda ve birçok doku hasarında belirgin bir role sahiptir (Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010; Shah et al., 2007). Fizyolojik şartlarda serbest oksijen radikalleri ve endojen süpürücü anti-oksidanlar arasında bir denge mevcutken (Gutteridge and Mitchell, 1999) sepsiste aşırı oksijen radikali üretimine bağlı olarak bu denge bozulur (Coskun et al., 2011).

Sepsise bağlı olarak karaciğer (Collin and Thiemermann, 2003), kalp (Verma et al., 2009) ve böbrek (Yang et al., 2009) gibi vital organlarda oluşan yetmezliklerde ve özellikle akciğerlerde oluşan ARDS ve ALI’da proinlamatuvar sitokinler kadar artmış reaktif oksijen radikallerinin (ROS) üretimi de göze çarpmaktadır (Albayrak et al., 2011; Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010).

Serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) depresyon, anksiyete, sirkadyen ritim, şizofreni, blumia nervoza, anoreksia nervosa, astım, vb. birçok hastalığın patofizyolojisinde rol alan biyolojik bir amindir (Yang et al., 2006). Aslında serotoninin 14 farklı reseptör alttipinin olması, bu nörotransmitterin geniş fizyolojik etkilerin açıklanmasına kolaylık getirmektedir (MaassenVanDenBrink et al., 2008). 5-HT7 de serotoninin en son keşfedilen ancak en az karakterize edilmiş reseptörlerinden biridir (Hedlund, 2009; Hedlund et al., 2004; Hedlund and Sutcliffe, 2004). Doku dağılımı araştırıldığında özellikle beyin dokusunda talamus, hipotalamus, serebral korteks, hipokampüs ve amigdalada bulunduğu gösterilmiştir (Neumaier et al., 2001; To et al., 1995; Tsou et al., 1994). Ancak bu reseptörlerin periferdeki ekspresyonları ile ilgili çalışmalar oldukça kısıtlıdır. Periferde düz kaslar üzerinde bulunmalarından dolayı muhtemel etkileri araştırılmış ve irritable bowel sendromda rol aldığı gösterilmiştir (Beattie and Smith, 2008; Hedlund, 2009). Bu reseptörlerin pulmoner, koroner arterler ve aort gibi arterlerde bulunduğu gösterilmiştir (Nilsson et al., 1999; Ullmer et al., 1995). 5-HT7 reseptörlerinin olgunlaşmamış T hücrelerinde bulunduğu ve uyarılmalarının T hücrelerinin foksiyon-larında ve aktivasyonlarında rol aldıkları gösterilmiştir (Leon-Ponte et al., 2007). 5-HT’nin monositlerde de 5-HTR1 ve/veya 5-HT7 reseptörleri aracılığı ile monositik apoptozisi önlediği gösterilmiştir (Soga et al., 2007). Stefulj ve arkadaşlarının çalışmasında sıçan immun doku hücrelerinde serotonin reseptörlerinin ekspresyonu çalışılmış ve timüs, periferal

26

lenfositler, dalak ve mitojenle aktive edilmiş dalak hücrelerinde 5-HT7 mRNAsı tespit edilmiştir (Stefulj et al., 2000). 5-HT7 reseptörlerinin insan (Heidmann et al., 1997) ve sıçan (Shen et al., 1993; Stefulj et al., 2000) immun dokularında varlığı, enflamasyonda ve sepsiste oluşan immun cevapta bu reseptörlerin de rolü olabileceğini düşündürmektedir. Ancak literatürde 5-HT7 reseptörlerinin sepsiste ve sepsise bağlı gelişen akciğer hasarındaki rolünü araştıran bir çalışma bulunmamaktadır.

Bu nedenle bu çalışmanın amacı, çekal ligasyon ve puncture (CLP) ile indüklenen polimikrobiyal sepsis modelinde 5-HT7 reseptörlerinin muhtemel rolünü göstermek, sepsise bağlı mortalitede önemli olan akciğer dokusunda 5-HT7 reseptör dağılımını incelemek ve septik sıçanlara 5-HT7 reseptör agonist ve antagonisti uygulanmasının sepsisin normal gidişini nasıl değiştireceğini gözlemleyerek yeni ilaç araştırmalarına ışık tutmaktır.

GEREÇ VE YÖNTEM

Hayvanlar

Bu çalışmada Atatürk Üniversitesi Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezinden temin edilen ve ağırlıkları 200-220 gram arasında değişen toplam 80 adet Albino Wistar erkek sıçan kullanıldı. Hayvanlar deney öncesi gruplar halinde laboratuvarda normal oda sıcaklığında (22

o

C) barındırıldı ve beslendi. Çalışmanın Atatürk Üniversitesi Rektörlüğü Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu Başkanlığı tarafından etik kurallara uygun olduğu onaylandı.

Kimyasallar

Çalışmada 5-HT7 reseptör agonisti olarak AS-19 (Cat. No. 1968; TOCRIS Bioscience;), antagonisti olarak ise SB 269970 hydrochloride (Cat. No. 1612; TOCRIS Bioscience) kullanıldı. Biyokimyasal, histopatolojik ve moleküler analiz için gerekli olan bütün kimyasallar SIGMA Co. (Almanya)’den temin edildi.

Deney grupları

1. Sham (n=20)

2. CLP (n=20)

3. CLP+Agonist- AS-19 (n=20)

4. CLP+Antagonist- SB 269970 (n=20)

İlaç uygulaması

Deney gruplarına 5-HT7 agonisti AS-19 (Bosker et al., 2009; Hedlund, 2009) ve antagonisti SB 269970 (Forbes et al., 2002; Thomas et al., 2003) 10 mg/kg dozunda intraperitoneal yoldan verildi. Toz halindeki maddelerin çözelti haline getirilmesi için 100 mM DMSO kullanıldı. Sham gruba da aynı DMSO çözeltisi aynı yoldan uygulandı. İlaç uygulamaları sepsis indüksiyonundan 30 dk önce ve 8 saat sonra olmak üzere iki kez tekrarlandı.

Polimikrobiyal sepsis modeli

Sıçanlarda CLP modeli ile polimikrobiyal sepsis modeli oluşturmak için 24 saat aç bırakılan sıçanlara ilaç uygulamalarından 30 dk sonra 20 mg/kg tiopental sodyum ile anestezi yapıldı. Anestezi sonrasında sıçanların karın orta hatta yaklaşık 3 cm çapında insizyon yapılarak ve periton karın kasları geçilerek dışarı alınan çekum 3.0 sutur ile bağlandı. Ayrıca çıkarılan çekum distalinden 16 G bir iğne yardımıyla karşılıklı 2 adet çift delik açıldı. Sonrasında çekum ve bağırsak bölümü yerine koyularak batın kapatıldı ve dikildi. Her hayvana sıvı takviyesi olarak 2 ml serum fizyolojik verildi. Operasyon sonrasında sıçanlar kafeslerinde 16 saat gözlendi. 16. saatin sonunda sağ kalan hayvanlardan grup başına rastgele 6 hayvan seçilerek ötenazi yapıldı, kan ve doku örnekleri alındı. Biyokimyasal analiz için dokular hemen -80

0C’ye konuldu.

Moleküler analiz için dokular sıvı azotta dondurulduktan sonra -80

0C’de saklandı.

Her deney grubunda sağ kalan diğer hayvanlar 72 saat boyunca izlenmeye devam edildi.

Biyokimyasal analizler

Kanlardan elde edilen serumlarda TNF-α (Invitrogen; KRC33012), IL-1β (Invitrogen; KRC0012) ve IL-6 (RayBiotech; Cat-ELR-IL6-001) seviyeleri üretici firmanın talimatlarına göre ELISA kiti ile ölçüldü. Ayrıca her bir sıçan akciğeri oksidatif stres yönünden değerlendirildi. Bu amaçla sıçan akciğerlerinde, 8-izoprostan (Cell Biolabs Inc; STA-337), superoksit dismutaz (SOD) (Cayman; 706002), ve glutatyon (GSH) (Cell Biolabs; STA-312) seviyeleri yine ELİSA kitleri ile ölçüldü. Tüm ölçümler 2 kez tekrarlandı ve ortalamaları alındı.

27

Western Blot

Dokular sıvı azot ile toz haline getirildikten sonra, RIPA tamponunda ultra-turraks ile homojenize edildi. Daha sonra doku lizatları Lowry metoduna göre (Lowry et al., 1951) protein miktarları tayin edildi. Her bir doku lizatından 20 µg olacak şekilde %10’luk SDS PAGE jeline (Mini-Protean TGX; BIORAD) yüklendi. Protein standardı olarak Precion Plus Protein Standart (BIORAD) 7 µL yüklendi ve Tris/Glisin/SDS yürütme tamponu ile 130 voltta yürütüldü. Yürütme sonrası jeldeki ayrışan proteinler PVDF membrana (Trans-Blot Turbo Transfer Pack; BIORAD) Trans-Blot Turbo Transfer System (BIORAD) aracılığı ile aktarıldı. Membran transfer sonrası %5’lik BSA’da 1 saat 40C’de bloke edildi. 5 dakika TBST tamponu ile yıkandı. Primer antikor olarak 5-HT7 reseptörüne spesifik poliklonal antikor (Ab13898; Abcam) sekonder antikor olarak HRP-conjugate poliklonal antikor (Ab6751; Abcam) kullanıldı. Referans protein olarak β-aktin (Ab8227; Abcam) seçildi. Kemilumi-nasans ışıma için Super-signal West Pico ECL substrat (PIERCE; 34077) kullanılarak Fusion Fx (Vilber Lourmat) cihazında görüntülendi. Hedef protein β-aktin’e göre normalize edildi.

Histopatolojik analizler

Histolojik prosedür: Elde edilen doku örnekleri 48-52 saat boyunca %4’lük formaldehit ile fikse edildi. Fiksasyondan sonra 6 saat boyunca yıkandı ve giderek artan alkol serilerinden geçirildi. Daha sonra 10’ar dakika 2 kez ksilol uygulaması ile dokunun sertleşmesi sağlandı. En son aşamada ise dokular 60ºC etüv içerisindeki eriyik halde bulunan parafin serilerinden geçirilerek gömüldü. Elde edilen parafin bloklardan rutin histokimyasal, immun-histokimyasal ve stereolojik incelemeler amacıyla mikrotom yardımıyla 5 µm kalın-lığında yaklaşık 20-25 adet kesit elde edildi.

Rutin histokimyasal prosedür: Elde edilen kesitler yaklaşık 1 saat boyunca deparafinizasyon amacıyla 65ºC’lik etüvde bekletildi ve daha sonra 2 adet ksilen serisinden, giderek artan alkol serilerinden geçirildi. Daha sonra çeşme suyunda yıkanan kesitlerin; Hematoksilen, asit-alkol ve Eozin serilerinden geçirilerek boyanması sağlandı. Son aşamada ise yıkama, giderek artan alkol serileri ve ksilol serilerinden geçirilen kesitler entellan ile kapatıldı. HE boyanan kesitler kamera ataçmanlı

mikroskop (Olympus BH40®) yardımıyla görüntülenerek değerlendirildi.

Akciğerde enflamasyon skorlaması: Sistematik olarak kesilen ve rastgele örneklenen kesit

ler perivasküler alandaki enflamasyon derecesine aşağıdaki şekilde göre skorlandı: 0: hücre yok; 1: az miktarda hücre; 2: perivasküler alanın periferal kısımlarında birçok hücre; ve 3: perivasküler alanda çok sayıda hücre (Singh et al., 2005).

İmmunhistokimyasal prosedür: Polilizinli lama alınan kesitler immunhistokimyasal boyama cihazında (Leica Bond-Max®), 5HT-7 Ab Leica Bond Polymer Refine Detection Kit® ile boyandı. 5HT-7 Ab ile boyanan kesitlerde + boyanma paterni gösteren interstisyel alanda bulunan peribronşial makrofajlar ve lenfositler, alveol duvarını oluşturan tip-1 pnömositler, damar endotel hücreleri tespit edildi. NF-κB’nin değerlendirilmesi için gruplara ait parafin bloklardan yeni kesitler alınarak NF-κB immunhistokimyasal boyası uygulandı. NF-κB için akciğer dokusunda nükleer boyanmanın olduğu alanlar değerlendirildi.

İstatistiksel Analiz

Elde edilen sonuçlar ortalama±standart sapma olarak gösterildi. Elde edilen sayısal bulguların değerlendirilmesi için tek yönlü varyans analizinde Tukey testi kullanıldı. Sağkalım sürelerinin değerlendirilmesinde çift yönli varyans analizinde faktöryel tasarıma uygun olarak Tukey testi yapıldı. P< 0.05 anlamlı olarak kabul edildi.

BULGULAR

Sağkalım süresi

Deney gruplarının gözlenmesi sonucunda sham grubunda 72 saat boyunca ölüm gözlenmemiştir. CLP grubundaki hayvanlar ortalama 16,71 saat yaşamışken, CLP+agonist grubunda bu süre ortalama 35,43 saate çıkmıştır. CLP antagonist grubunda ise CLP grubuna göre anlamlı bir fark gözlenmemiştir (Şekil 1).

28

Şekil 1. Deney gruplarında 72 saat içinde sağkalan

hayvan sayısı.

Biyokimyasal bulgular

Sitokinler

Çalışmada serum TNF-α, IL-1β ve IL-6 seviyelerinin CLP grubunda sham gruplara göre anlamlı derecede yüksek olduğu, septik sıçanlara agonist uygulamasının bu değerleri anlamlı şekilde düşürdüğü ancak antagonist uygulamasının anlamlı bir değişikliğe neden olmadığı görüldü (Şekil 2, 3, 4).

Şekil 2. Deney gruplarında serum TNF-α değerleri

(*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı).

Şekil 3. Deney gruplarında serum IL-1β değerleri


Şekil 4. Deney gruplarında serum IL-6 değerleri


Oksidatif stres bulguları

Akciğer dokularında yapılan ELİSA analizleri sonucunda septik akciğer dokularında lipid peroksidasyonu belirteci olan 8-izoprostan miktarının sham gruplara göre anlamlı derecede artmış olduğu gözlendi (Şekil 6). CLP grubuna AS-19 uygulanması bu artışı anlamlı şekilde azaltırken SB269970 uygulanan CLP grubunda septik sıçanlara göre anlamlı bir fark yoktu. Dokuda antioksidan seviyenin göstergesi olan SOD ve GSH seviyeleri ise CLP grubunda sham gruba göre anlamlı şekilde azalmışken, AS-19 uygulaması bu durumu düzeltti (Şekil 7-8).

Şekil 5. Deney gruplarında akciğer 8-izoprostan

değerleri (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı).

Şekil 6. Deney gruplarında akciğer GSH değerleri


29

Şekil 7. Deney gruplarında akciğer SOD değerleri


Moleküler bulgular

Yürütme sonrasında Sham grubunda 5-HT7 reseptör varlığı belirlendi. CLP uygulanan bütün sıçan gruplarında bu reseptör ekspresyonunda artış gözlenirken, CLP gruplarına agonist uygulaması bu artışı anlamlı azalttı. Antagonist grubunda ise ekpresyonda bir miktar artış vardı ancak anlamsızdı (Şekil 8, 9)

Şekil 8. Sham ve CLP gruplarında 5-HT7 proteinine

(50 kDa) ait bant görüntüleri

Şekil 9. Sham ve CLP gruplarında 5-HT7 proteinin

miktarları (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı).

Histopatolojik bulgular

Konvansiyonel ışık mikroskobu bulguları

Sham grubuna ait bulgular: Sham grubuna ait H&E ile boyanmış kesitler incelendiğinde terminal bronşioller, alveoller, vasküler yapılar ve çok az miktarda interstisyel doku varlığı gözlendi (Resim 1A-D). Terminal bronşiollerin lümeni tek katlı kübik epitel hücreleri ve lümene doğru çıkıntı yapan clara hücreleri ile döşeliydi (Resim 1D). Etrafında ise ince düz kas tabakası bulunmakta, en dış kısımda ise tek tük interstisyel dokuya ait hücreler izlenmekteydi (Resim 1D). Vasküler yapılar da lümene doğru çıkıntı yapan endotel hücreleri ve onu çevreleyen düz kas tabakası ile birlikte kolaylıkla ayırt edilebilmekteydi (Resim 1A, C). Alveoller; oldukça ince duvarlı, bol kapillere sahip şekilde izlenmekteydi (Resim 1A-D ).

Resim 1. Sham grubuna ait akciğer kesitleri. Bv:

kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor: 0,84

CLP uygulanan gruba ait bulgular: CLP uygulanan gruba ait H&E boyalı akciğer preparatlarında ilk bakışta interstisyel alanda inflamatuar hücre infiltrasyonu ile birlikte eritrosit ekstravazasyonu dikkati çekmek-teydi (Resim 2A). İnflamatuar hücre infilt-rasyonu aynı zamanda bronşiol duvarları ve vasküler yapıların duvarlarında da izlenmekteydi (Resim 2B,C). Alveolar yapılar incelendiğinde ise alveolar septalarda kalınlaşma ve irregülasyon, kapillerlerde de dilatasyon tespit edildi (Resim 2A,B,D).

30

Resim 2. CLP grubuna ait akciğer kesitleri. Bv: kan

damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor: 2,71.

CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait preparatlar incelendiğinde, CLP uygulanan gruba göre inflamasyonun daha önce bahsedilen tüm alanlarda oldukça azaldığı gözlendi (Resim 3A,B,C). Bunun yanında alveollerde de CLP grubuna göre kalınlaşma, irregülarite ve kapiller dilatasyonda azalma mevcuttu (Resim 3B, D).

Resim 3. CLP + agonist grubuna ait akciğer

kesitleri. Bv: kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor: 1,86

CLP uygulanan ve antagonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait akciğer kesitleri incelendiğinde inflamatuar hücre infiltrasyonu ve eritrosit ekstravazas-yonunun CLP uygulanan gruba göre daha şiddetli olduğu gözlendi (Resim 4A-D). Ayrıca diğer gruplardan farklı olarak pekçok damarda total obstrüksiyon ve çevresindeki hücrelerde nekroz tespit edildi (Resim 4C). Ayrıca alveol duvarlarında kalınlaşma, irregülarite ve kapiller dilatasyon da CLP uygulanan gruba kıyasla daha şiddetliydi (Resim 6A-D).

Resim 4. CLP + antagonist grubuna ait akciğer

kesitleri. Bv: kan damarları, a: alveol, TB: terminal bronşiol. Boya; H&E, kesit kalınlığı:5 µm. Ortalama skor:2,77

Şekil 10. Konvansiyonel ışık mikroskobu

skorlamasından elde edilen sayısal veriler. (*CLP grubuna göre p<0,05 oranında anlamlı).

İmmunhistokimya bulguları

5HT-7 bulguları

Sham grubuna ait bulgular: Sham grubuna ait 5HT-7 ile boyanmış akciğer kesitleri incelendiğinde tutulumun oldukça az olduğu gözlendi. Tutulum interstisyel hücrelerle sınırlı olarak tespit edildi. (Resim 5 A,B).

Resim 5. Sham grubuna ait immünhistokimyasal

olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, ok: 5HT-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı: 5 µm, barlar:10 µm.

31

CLP uygulanan gruba ait bulgular: CLP uygulanan gruba ait kesitlerde immün-pozitivitenin sham gruplarına göre çok fazla miktarda olduğu belirlendi. İnterstisyel alandaki tutulum terminal bronşiol çevresindeki alanda gruplar halindeydi (Resim 6A). Ayrıca büyük ve orta çaplı damarların endotel hücrelerinde de tutulum izlenmekteydi (Resim 6A). Alveollerin arasındaki interstisyel hücrelerde ve alveolleri oluşturan tip-1 pnömositlerde de tutulum oldukça belirgindi (Resim 6B).

Resim 6. CLP uygulanan gruba ait

immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, ok:5HT-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı 5 µm, barlar:10 µm.

CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait preparatlarda 5HT-7 tutulumu terminal bronşiollerin periferinde, 1-2 hücreyle sınırlı şekildeydi (Resim 7A). Ayrıca interstisyel alandaki hücrelerde CLP grubundaki kadar şiddetli olmayan tutulum mevcuttu. Alveolleri oluşturan hücrelerde boyanma CLP grubundan çok daha azdı (Resim 7B).

Resim 7. CLP + agonist ilaç uygulanan gruba ait

immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, RB: respiratuar bronşiol, ok:5HT-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm.

CLP uygulanan ve antagonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Terminal

bronşiolleri döşeyen epitel hücrelerinde tutulum gözlenmezken, alveolleri döşeyen tüm hücrelerde ve interstisyel hücrelerde kuvvetli pozitiflik mevcuttu (Resim 8A). Ayrıca daha küçük bronşiolleri döşeyen epitel hücrelerinde de kuvvetli pozitiflik mevcuttu (Resim 8B).

Resim 8. CLP + antagonist ilaç uygulanan gruba ait

immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, ok:5HT-7 immunpozitivite gösteren yapılar. Boya: 5HT-7, kesit kalınlığı 5 µm, barlar:10 µm.

NF-κB boyası

Sham grubuna ait bulgular: Sham grubuna ait NfκB ile boyanan akciğer kesitlerinde terminal bronşiol bazalindeki hücrelerde çok az miktarda nükleer immünpozitiflik gözlendi (Resim 9A). Ek olarak alveoller ve aradaki interstisyumdaki vasküler yapılara ait hücrelerde de sadece sitoplazmik pozitiflik izlendi (Resim 9B).

Resim 9. Sham grubuna ait immunhistokimyasal

olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi gösteren yapılar. Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm.

CLP uygulanan gruba ait bulgular: CLP uygulanan gruba ait akciğer kesitlerinde ise terminal bronşiol epitelinde yaygın nükleer immünpozitiflik, bununla birlikte terminal bronşiol çevresinde nükleer immünpozitif boyanmış yaygın enflamasyon tespit edildi (Resim 10A). Alveolleri oluşturan hücrelerde

32

ve intersitisyuma ait kan damarlarının endotel hücrelerinde de nükleer immünpozitiflik mevcuttu (Resim 10B).

Resim 10. CLP uygulanan gruba ait

immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar, ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi gösteren yapılar. Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm.

CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: CLP uygulanan ve agonist ile tedavi edilen gruba ait kesitlerde hem terminal bronşiolü oluşturan epitel hücrelerinde hem de alveolü oluşturan hücrelerin pek azında nükleer pozitiflik mevcuttu (Resim 11A, B).

Resim 11. CLP + agonist ilaç uygulanan gruba ait

immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar, siyah ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi gösteren yapılar, beyaz ok: nükleer NfκB immunpozitivitesi göstermeyen yapılar Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm.

CLP uygulanan ve antagonist ile tedavi edilen gruba ait bulgular: Bu gruba ait akciğer kesitlerinde ise CLP grubuna benzer şekilde bronşiollere ait hücrelerde ve çevresindeki kan damarlarına ait endotel hücrelerinde nükleer immünpozitiflik çok fazlaydı (Resim 12A). Ayrıca alveollerde ve interalveolar septumlarda nükleer immün-pozitiflik göstermeyen hücre neredeyse hiç bulunmamaktaydı (Resim 12A).

Resim 12. CLP + antagonist ilaç uygulanan gruba

ait immunhistokimyasal olarak boyanmış kesitler. TB: terminal bronşiol, a: alveol, Bv: damar. Boya: NfκB, kesit kalınlığı 5 µm, barlar: 10 µm.

TARTIŞMA ve SONUÇ

Bu çalışmada CLP ile indüklenen polimikrobiyal sepsis modelinde 5-HT7 reseptörlerinin rolü gösterilmiştir. Yine sepsise bağlı mortalitede önemli olan akciğer dokusunda 5-HT7 reseptör varlığı incelenmiş, 5-HT7 reseptör agonist ve antagonistinin polimikrobiyal sepsis ile indüklenen akut akciğer hasarı üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Ayrıca çalışmamızda serum sitokin seviyeleri, akciğerdeki histopatolojik değişiklikler ve oksidatif stress parametreleri, akciğerlerde NF-κB ve 5-HT7 boya tutulumu ve ayrıca akciğerde 5-HT7 reseptör mRNA’sının sepsise bağlı olarak değişen miktarı gösterilmiştir.

CLP ile indüklenen sepsis, insanlarda bağırsak perforasyonu ve bakteriyel enfeksiyonun oluşturduğu klinik tabloyu taklit eden bir hayvan modelidir (Chen et al., 2001; Hubbard et al., 2005; İskit, 2005). Bu sepsis modelinde 16-20. saatler intra-abdominal sepsisin geç fazı olarak kabul edilir (Wang et al., 1997). Bu çalışmada da 16. saat, geç fazın başlangıcı olarak değerlendirilmiş ve bu saatte deney hayvanlarından kan ve doku örnekleri alınmıştır. Aynı zamanda çalışmada hayvanlar 72 saat boyunca mortalite açısından gözlenmiştir. Sham gruplarında 72 saat boyunca mortalite gözlenmezken CLP grubunun ortalama hayatta kalma süresi 16,71 saat olarak belirlenmiştir. CLP grubu hayvanlara 5-HT7 reseptörlerinin selektif agonisti olan AS-19 (Bosker et al., 2009; Hedlund, 2009) uygulandığında ortalama yaşam süresi 35,43 saate kadar çıkmıştır ancak antagonist olarak SB 269970 (Forbes et al., 2002; Thomas et al., 2003) verilen

33

grupta ortalama sağkalım süresi septik gruptan farksız bulunmuştur. Hayvanlardaki sağkalım oranları yapılan histopatolojik analizlerle de desteklenmektedir. Şöyle ki septik sıçanların akciğerinde inflamatuvar hücre birikimi skorlandığında, CLP grubu hayvanların akciğerinde sham gruplara göre oldukça yüksek enflamasyon skorları elde edilmiş olmasına rağmen; 5-HT7 reseptör agonisti uygulanması bu enflamasyonu anlamlı şekilde azaltmış ancak antagonist uygulanmış septik akciğerler ile CLP grubu akciğerleri arasında anlamlı bir fark gözlenmemiştir.

Bizim çalışmamızda da gösterdiğimiz gibi, septik sıçanlarda mortalite oldukça yüksek oranda olup (Coskun et al., 2011; Otero-Anton et al., 2001) bu mortalitenin en önemli nedeninin akut akciğer hasarı olduğu öne sürülmüştür (Cadirci et al., 2010; Vincent, 2011). Daha önceki çalışmalarımızda da akciğer hasarı önlenen sıçanlarda mortalitenin anlamlı azaldığını ortaya koymuştuk (Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010). Çalışmamızda elde ettiğimiz sağkalım süreleri ile sepsise bağlı gelişen akciğer hasarında 5-HT7 reseptörlerinin uyarılmasının koruyucu etkili olduğunu gösterdik. 5-HT7 reseptörlerinin immun yanıt hücreleri olan monositler (Soga et al., 2007), T hücreleri (Leon-Ponte et al., 2007) ve timüs, periferal lenfositler, dalak ve mitojenle aktive edilmiş dalak hücrelerinde gösterilmiş olması (Stefulj et al., 2000) bu reseptörlerin uyarılmasının akciğerdeki koruyucu etkiye aracılık etmiş olabileceğini düşündürmek-tedir. Daha önceki çalışmalarda da periferal dokularda 5-HT, mast hücreleri, bazofiller ve enterokromafin hücrelerde salındığı ve inflamasyon sırasında ekstraselüler 5-HT seviyesinin oldukça arttığı gösterilmiştir (Matsuda et al., 1997). Bu kapsamda 5-HT bir immunmodülatör olarak değerlendirile-bilir. Soga et al. tarafından 5-HT1 ve 5-HT7 reseptörlerinin monosit apoptozisinin önlenmesinde rol aldığı gösterilmiş (Soga et al., 2007), ve bu etkinin 5-HT7 reseptör uyarılmasına bağlı olarak LPS’li monosit kültürlerinde intrasellüler siklik adenozin fosfatı artırıp sitokinlerin üretimini indüklemesine bağlı olabileceğini (Durk et al., 2005) öne sürmüştür.

Deneysel sepsis modellerinde ve klinik çalışmalarda proinflamatuvar ve potansiyel olarak ototoksik mediyatörlerin salıverildiği gösterilmiştir. Makrofaj kaynaklı proinflama-

tuvar sitokinler olan TNF-α, IL-1β ve IL-6 septik şok ve çoklu organ yetmezliğinin patogenezinde önemlidir (Damas et al., 1992). Sepsise bağlı olarak gelişen akut akciğer hasarının patogenezinde de bu inflamatuvar mediyatörlerin oldukça önemli bir rolü vardır (Bhatia and Moochhala, 2004). Bu çalışmada CLP yapılan sıçanlarda serum TNF-α, IL-1β, and IL-6 seviyeleri anlamlı derecede yükselmiş ve 5-HT7 reseptörlerinin AS-19 ile uyarılması sitokinlerdeki bu artışı önlemiştir. Bu bulgular sitokin seviyelerinin artmış olduğu diğer çalışmalarla desteklenmektedir (Cadirci et al., 2010; Li et al., 2009a). TNF-α inflamatuvar yanıt içinde birçok önemli sürece katkıda bulunur (Kuwano and Hara, 2000). Diğer yandan IL-6 da nötrofil migrasyonunda önemli role sahiptir; sepsisin oluşumuna katkıda bulunan bir mediatör olduğu için sepsisin şiddetinin gösterilmesi için kullanılır (Li et al., 2009b; Remick et al., 2005). Bu sitokinlerden TNF-α ve IL-1β alveolar iyon miktarını azaltarak sıvı transferini ve sonuç olarak pulmoner ödem oluşumunu azaltırlar (Braun et al., 2005). Dürk et al. tarafından yapılan çalışmada da 5-HT7’nin monositler üzerinde oluşturduğu etkiler incelenmiş ve 5-HT4 ve 5-HT7 reseptör agonist ve antagonistlerinin monositlerden IL-1β, IL-6 ve TNF-α gibisitokinlerin salınımının düzenlenmesine katkıda bulunduğu ve monositlerden cAMP salınımını artırdığı gösterilmiştir (Durk et al., 2005). Bizim bulgularımız 5-HT7 agonist uygulamasının serum sitokin seviyelerini azaltmasının yanı sıra akciğer dokularında yapılan immunhistokimyasal boyamada CLP uygulamasının NF-κB pozitifliğini artırdığını da gösterdi. Agonist uygulaması NF-κB boyasında daha az tutuluma neden oldu. NF-κB aktivasyonu ve ardından birçok proinflamatuvar molekülün ekspresyonunun artışı enflamasyon patogenezinde (Sakurai et al., 1999) ve buna bağlı olarak TNF-a, IL-6 vb birçok inflamatuvar sitokinin trans-kripsiyonunun düzenlenmesinde merkezi role sahiptir (Shen et al., 2009). Bizim bulgularımız da akciğer NF-κB aktivasyonu artmış septik ratlarda serum TNF-α, IL-6 ve IL-1β seviyelerinin arttığını göstermiştir. Oksidatif stresin de NF-κB transkripsiyonunu upregüle ettiği ve antioksidanların artmış NF-κB transkripsiyonunda downregülasyon yaptığı gösterilmiştir (van den Berg et al., 2001). Bu çalışma 5-HT7 reseptör agonisti olan AS-19’un çeşitli enflamatuvar hastalıkların başlamasında ve devamında

34

muhtemel terapötik etkinliğinin NF-κB inhibisyonuna bağlı olarak oksidatif stresin azalmasına ve aynı zamanda proinflama-tuvar sitokinlerin azalmasına bağlı olabileceğini öne sürmektedir. Nötrofillerden artmış ROS üretimi akciğer hasarına neden olan mekanizmalardan biri olarak görülmektedir (Fink, 2002). Sepsis vakalarında antioksidan sistemin ciddi şekilde etkilenmesi ve plazma lipid peroksidasyon son ürünlerinin anlamlı derecede artması sepsise bağlı akciğer hasarında oksidatif stresin oldukça artmış olduğunu göstermektedir (Metnitz et al., 1999). SOD ve GSH antioksidan sistem içinde yer alan ana parametrelerdir. Bu antioksidanlar toksik serbest radikallerin sitotoksik etkilerini azaltırlar (Fink, 2002) ve birçok sepsis çalışmasında akciğer dokusun-daki seviyelerinin azaldığı gösterilmiştir (Cadirci et al., 2011; Cadirci et al., 2010; Coskun et al., 2011; Qiao et al., 2011; Starr et al., 2011). Bizim çalışmamız-da AS-19 septik sıçanlarda antioksidan enzim aktivitesini artırmıştır. AS-19 verilen septik sıçanların akciğer dokularında hem SOD aktivitesinin hem GSH miktarı tedavi edilmemiş CLP grubuna göre anlamlı artış göstermiştir. Doku lipid peroksidas-yonunun son ürünlerinden olan 8-isoprostan miktarının da CLP grubunda artmış olmasına rağmen AS-19 uygulanan septik sıçanlarda azalmış olması, AS-19’un akciğerde oluşan oksidatif stresi azalttığını göstermektedir. Oksidatif hasarın bir göstergesi olan lipid peroksidasyonu membran geçirgenliğinde değişmelere, böylece protein degradas-yonunda artmaya ve sonuçta hücrelerde lizise neden olabilir (Garcia et al., 1997). Sıçanlarda ve insanlarda CLP ile indüklenen sepsiste doku LPO seviyelerinin oldukça arttığı gözlenmiştir (Ortolani et al., 2000). Bunların yanında biz de çalışmamızda doku LPO konsantrasyonunun hassas bir belirteci olan 8-izopostan (Wood et al., 2003) miktarının daha önce de bildirildiği üzere akciğerlerde (Razavi et al., 2005) artmış olduğunu gördük. Agonist uygulamasının 8-isoprostan seviyesini düşürmesi 5-HT7 reseptörlerinin uyarılmasının akciğer dokusunda oksidatif stresi de azaltarak koruyucu etki oluşturduğunu düşündürdü. Bu veriler 5-HT7 agonisti verilen sıçanlarda daha az mortalite gözlenmesinin AS-19’un CLP’ye bağlı oluşan sitokin yanıtını azaltmasına, akciğerde oluşan oksidatif stresi azaltmasına ve buna bağlı akciğer

hasarını önlemesine bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle 5-HT7 reseptörlerinin uyarılması şiddetli sepsise bağlı akciğer hasarının önlenmesinde güçlü bir terapotik hedef teşkil edebilir.

5-HT7 reseptörlerinin uyarılmasının akciğerlerde koruyucu etki oluşturmuş olması, genelde beyinde varlığı gösterilmiş ancak periferdeki varlığı üzerine çalışmalar kısıtlı olan (Segura et al., 2010) bu reseptörün akciğerlerde eksprese olduğunu ve bu ekspresyonun inflamatuvar bir uyarı olan sepsisle arttığını düşündürmektedir. Birçok çalışmada 5-HT2A reseptörlerinin havayolu düz kası membranlarında bulunduğu gösterilmiştir (Cazzola and Matera, 2000; Rhoden et al., 2000; Yang et al., 1994). Ancak 5-HT7 reseptörlerinin pulmoner yerleşimleri oldukça az incelenmiştir (Segura et al., 2010). Bunun üzerinde yaptığımız immunhistokimyasal çalışmada akciğerlerden alınan kesitlerde 5-HT7 boyası ile immun boyama yapılmış ve CLP grubunda sham gruba kıyasla oldukça yüksek tutulum görülmüştür. Daha önce Segura et al. tarafından kobaylar üzerinde yapılan bir çalışmada 5-HT7 reseptör antagonisti olan SB269970 antijenle indüklenen havayolu aşırı-duyarlılığını azaltmış, izole organ banyosunda ise başka bir 5-HT7 reseptör agonisti olan LP44 trakede kasılma cevaplarını artırmıştır (Segura et al., 2010). Segura et al. çalışmalarıda 5-HT7 reseptörlerinin yanısıra 5-HT2A ve 5-HT4 reseptörlerinin de havayolu duyarlılığında rol aldığını göstermiş ancak RT-PCR çalışmasında ne sensitizasyonun ne de antijene maruz kalmanın akciğer 5-HT2A mRNAsını değiştirmediğini öne sürmüşlerdir. Bizim çalışmamızda olduğu gibi bu çalışmada da normal olmayan koşullarda 5-HT7 reseptörleri devreye girdiği anlaşılmaktadır. Ancak yazarlar bu etkinin pulmoner nöroendokrin hücreler aracılığı ile gerçekleştirdiğini öne sürmüş, 5-HT7 reseptörlerinin akciğerlerdeki varlığı ile ilgili detaylı inceleme yapmamışlardır. Bu bakımdan bizim çalışmamız akciğer dokusunda 5-HT7 reseptör varlığını immunhistokimyasal olarak gösteren ilk çalışmadır. Çalışmamızda immun boyama sonrasında en yüksek tutulum CLP grubunda görülmüş, AS-19 uygulanan dokularda boyanma oranı azalmıştır. Bu durum 5-HT7 reseptörlerinin uyarılmasının iyileştirici etkisinden dolayı inflamatuvar yanıtın azalmasına ve sonuçta akciğerdeki

35

5-HT7 reseptör yoğunluğunun azalmasına bağlı olabilir. Ancak septik akciğerlerdeki boyanmanın sham gruba göre artması, 5-HT7 reseptörlerini taşıdığı daha önceden gösterilmiş olan monositler, T hücreleri, ve periferal lenfositlerin (Leon-Ponte et al., 2007; Soga et al., 2007; Stefulj et al., 2000) aşırı inflamatuvar yanıt sonucu akciğerlerde toplanmasından kaynaklanıyor da olabilir. Bu nedenle akciğerlerde sepsise bağlı değişen 5-HT7 reseptör ekspresyonunun daha iyi anlaşılması için Western Blot çalışması gerçekleştirilmiştir.

Western blot analizinde, doku lizatlarında 5-HT7 mRNA’sı incelendi. Yapılan yürütmede sham grubunda 5-HT7 reseptör varlığı belirlenmiştir. Akciğer dokusunda 5-HT7 reseptör mRNA’sının ilk kez gösteriliyor olmasından dolayı bu çalışma bir ilktir. Çalışmamızda CLP uygulanan bütün sıçan gruplarında bu reseptör ekspresyonunda artış gözlenmesi bu reseptörlerin enflamatuvar bir uyarım karşısında ekspresyonunun arttığını ve bu artışın sepsis patofizyolojisine katkıda bulunuyor olabileceğini göstermiştir, CLP gruplarına agonist uygulaması reseptör ekspresyonunu anlamlı azaltırken antagonist uygulanması ekpresyonu CLP grubuna göre bir miktar artırmış ancak bu artış anlamlı bulunmamıştır.

SONUÇ

Bu çalışmamız periferik 5-HT7 reseptörlerinin CLP ile indüklenen sepsiste çok önemli rollerinin olduğunu ilk kez gün yüzüne çıkarırken;

1. Bu reseptörlerin bir agonist ile uyarılmasının sepsise bağlı artmış mortaliteyi oldukça azalttığını,

2.Sepsis ile artmış ve mortaliteden büyük oranda sorumlu akciğer hasarını azalttığını,

3. Tüm bu önemli etkilerini sepsis şiddetinin göstergesi olan serum sitokin seviyelerini ve sitokin salınımını tetikleyen akciğer NFKB miktarını azaltarak, ayrıca organ hasarında rol alan doku oksidatif stresini azaltıp, antioksidan sistemi güçlendirerek ortaya koyduğunu göstermiştir.

Tüm bu bulgular; 5-HT7 reseptörlerinin uyarılmasının bozulmuş inflamatuvar cevaba bağlı oluşabilecek organ hasarı ve mortalitenin önlenmesinde yeni bir hedef olabileceğini göstermiştir.

TEŞEKKÜR

Prof. Dr. Fatma Göçer, Prof. Dr. Cemal Gündoğdu, Prof. Dr. Bünyami Ünal, Doç. Dr. Zekai Halıcı, Doç. Dr. Ahmet Hacımüftüoğlu, Yrd. Doç. Dr. Abdulmecit Albayrak, Yrd. Doç. Dr. Yasin Bayır, Yrd. Doç. Dr. Emre Karakuş, Yrd. Doç. Dr. Deniz Ünal, Arş. Grv. Beyzagül Polat, Arş. Grv. Irmak Ferah, Arş. Grv. Muhammet Yayla, Arş. Grv. Selina Aksak, Yüksek Lisans Öğrencileri Seda Özaltın, Nurcan Yüksel’e, Laboratuvar imkanlarından ve deneyimlerinden yararlandığım ve serotoninle ilgili desteğini esirgemeyen Dr. Trevor Sharp’a en içten teşekkürlerimi sunarım.

* * * * *

KAYNAKLAR

Albayrak, A., Uyanik, M.H., Odabasoglu, F., Halici, Z., Uyanik, A., Bayir, Y., Albayrak, F., Albayrak, Y., Polat, B., Suleyman, H. (2011) The effects of diabetes and/or polymicrobial sepsis on the status of antioxidant enzymes and pro-inflammatory cytokines on heart, liver, and lung of ovariectomized rats. The Journal of Surgical Research 169: 67-75.

Alberti, C., Brun-Buisson, C., Burchardi, H., Martin, C., Goodman, S., Artigas, A., Sicignano, A., Palazzo, M., Moreno, R., Boulme, R., Lepage, E., Le Gall, R. (2002) Epidemiology of sepsis and infection in ICU patients from an international multicentre cohort study. Intensive Care Medicine 28: 108-121.

Beattie, D.T., Smith, J.A. (2008) Serotonin pharmacology in the gastrointestinal tract: a review. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 377: 181-203.

Bhatia, M., Moochhala, S. (2004) Role of inflammatory mediators in the pathophysiology of acute respiratory distress syndrome. The Journal of Pathology 202: 145-156.

Bone, R.C. (1991) The pathogenesis of sepsis. Annals of Internal Medicine 115: 457-469.

Bosker, F.J., Folgering, J.H., Gladkevich, A.V., Schmidt, A., van der Hart, M.C., Sprouse, J., den Boer, J.A., Westerink, B.H., Cremers, T.I. (2009) Antagonism of 5-HT(1A) receptors uncovers an excitatory effect of SSRIs on 5-HT neuronal activity, an action probably mediated by 5-HT(7) receptors. Journal of Neurochemistry 108: 1126-1135.

Braun, C., Hamacher, J., Morel, D.R., Wendel, A., Lucas, R. (2005) Dichotomal role of TNF in

36

experimental pulmonary edema reabsorption. J Immunol 175: 3402-3408.

Cadirci, E., Halici, Z., Odabasoglu, F., Albayrak, A., Karakus, E., Unal, D., Atalay, F., Ferah, I., Unal, B. (2011) Sildenafil treatment attenuates lung and kidney injury due to overproduction of oxidant activity in a rat model of sepsis: a biochemical and histopathological study. Clinical and Experimental Immunology 166: 374-384.

Cadirci, E., Oral, A., Odabasoglu, F., Kilic, C., Coskun, K., Halici, Z., Suleyman, H., Nuri Keles, O., Unal, B. (2010) Atorvastatin reduces tissue damage in rat ovaries subjected to torsion and detorsion: biochemical and histopathologic evaluation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 381: 455-466.

Cazzola, I., Matera, M.G. (2000). 5-HT modifiers as a potential treatment of asthma. Trends in Pharmacological Sciences 21: 13-16.

Chen, J., Raj, N., Kim, P., Andrejko, K.M., Deutschman, C.S. (2001) Intrahepatic nuclear factor-kappa B activity and alpha 1-acid glycoprotein transcription do not predict outcome after cecal ligation and puncture in the rat. Critical Care Medicine 29: 589-596.

Collin, M., Thiemermann, C. (2003) The PPAR-gamma ligand 15-deoxy(delta12,14) prostaglandin J2 reduces the liver injury in endotoxic shock. European Journal of Pharmacology 476: 257-258.

Coskun, A.K., Yigiter, M., Oral, A., Odabasoglu, F., Halici, Z., Mentes, O., Cadirci, E., Atalay, F., Suleyman, H. (2011) The effects of montelukast on antioxidant enzymes and proinflammatory cytokines on the heart, liver, lungs, and kidneys in a rat model of cecal ligation and puncture-induced sepsis. The Scientific World Journal 11: 1341-1356.

Damas, P., Ledoux, D., Nys, M., Vrindts, Y., De Groote, D., Franchimont, P., Lamy, M. (1992) Cytokine serum level during severe sepsis in human IL-6 as a marker of severity. Annals of Surgery 215: 356-362.

Durk, T., Panther, E., Muller, T., Sorichter, S., Ferrari, D., Pizzirani, C., Di Virgilio, F., Myrtek, D., Norgauer, J., Idzko, M. (2005) 5-Hydroxytryptamine modulates cytokine and chemokine production in LPS-primed human monocytes via stimulation of different 5-HTR subtypes. Int Immunol 17: 599-606.

Fink, M.P. (2002) Reactive oxygen species as mediators of organ dysfunction caused by sepsis, acute respiratory distress syndrome, or hemorrhagic shock: potential benefits of resuscitation with Ringer's ethyl pyruvate

solution. Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care 5: 167-174.

Forbes, I.T., Douglas, S., Gribble, A.D., Ife, R.J., Lightfoot, A.P., Garner, A.E., Riley, G.J., Jeffrey, P., Stevens, A.J., Stean, T.O., Thomas, D.R. (2002) SB-656104-A: a novel 5-HT(7) receptor antagonist with improved in vivo properties. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12: 3341-3344.

Garcia, J.J., Reiter, R.J., Guerrero, J.M., Escames, G., Yu, B.P., Oh, C.S., Munoz-Hoyos, A. (1997) Melatonin prevents changes in microsomal membrane fluidity during induced lipid peroxidation. FEBS Letters 408: 297-300.

Gutteridge, J.M., Mitchell, J., 1999. Redox imbalance in the critically ill. British Medical Bulletin 55: 49-75.

Hedlund, P.B. (2009) The 5-HT7 receptor and disorders of the nervous system: an overview. Psychopharmacology 206: 345-354.

Hedlund, P.B., Kelly, L., Mazur, C., Lovenberg, T., Sutcliffe, J.G., Bonaventure, P. (2004) 8-OH-DPAT acts on both 5-HT1A and 5-HT7 receptors to induce hypothermia in rodents. European Journal of Pharmacology 487: 125-132.

Hedlund, P.B., Sutcliffe, J.G. (2004) Functional, molecular and pharmacological advances in 5-HT7 receptor research. Trends in Pharmacological Sciences 25: 481-486.

Heidmann, D.E., Metcalf, M.A., Kohen, R., Hamblin, M.W. (1997) Four 5-hydroxytryptamine7 (5-HT7) receptor isoforms in human and rat produced by alternative splicing: species differences due to altered intron-exon organization. Journal of Neurochemistry 68: 1372-1381.

Hotchkiss, R.S., Karl, I.E. (2003) The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine 348: 138-150.

Hubbard, W.J., Choudhry, M., Schwacha, M.G., Kerby, J.D., Rue, L.W., 3rd, Bland, K.I., Chaudry, I.H. (2005) Cecal ligation and puncture. Shock 24 (Suppl 1): 52-57.

İskit, A.B. (2005) Sepsiste Deneysel Modeller. Yoğun Bakım Dergisi 5: 133-136.

Karaali, R., Tabak, F. (2009) Sepsis Patogenezi. Klinik Gelişim 22: 71-76.

Kuwano, K., Hara, N. (2000) Signal transduction pathways of apoptosis and inflammation induced by the tumor necrosis factor receptor

37

family. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 22: 147-149.

Leon-Ponte, M., Ahern, G.P., O'Connell, P.J. (2007) Serotonin provides an accessory signal to enhance T-cell activation by signaling through the 5-HT7 receptor. Blood 109: 3139-3146.

Li, Q.F., Zhu, Y.S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. (2009a) Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatory effect of isoflurane preconditioning in LPS-stimulated macrophages. ACTA Pharmacologica Sinica 30: 228-234.

Li, Q.F., Zhu, Y.S., Jiang, H., Xu, H., Sun, Y. (2009b) Isoflurane preconditioning ameliorates endotoxin-induced acute lung injury and mortality in rats. Anesth Analg 109: 1591-1597.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of Biological Chemistry 193: 265-275.

Maassen Van Den Brink, A., Centurion, D., Villalon, C.M. (2008) Crosstalk of vascular 5-HT1 receptors with other receptors: clinical implications. Neuropharmacology 55: 986-993.

Matsuda, H., Ushio, H., Geba, G.P., Askenase, P.W. (1997) Human platelets can initiate T cell-dependent contact sensitivity through local serotonin release mediated by IgE antibodies. J Immunol 158: 2891-2897.

Metnitz, P.G., Bartens, C., Fischer, M., Fridrich, P., Steltzer, H., Druml, W. (1999) Antioxidant status in patients with acute respiratory distress syndrome. Intensive Care Medicine 25: 180-185.

Neumaier, J.F., Sexton, T.J., Yracheta, J., Diaz, A.M., Brownfield, M. (2001) Localization of 5-HT(7) receptors in rat brain by immunocytochemistry, in situ hybridization, and agonist stimulated cFos expression. Journal of Chemical Neuroanatomy 21: 63-73.

Nilsson, T., Longmore, J., Shaw, D., Pantev, E., Bard, J.A., Branchek, T., Edvinsson, L. (1999) Characterisation of 5-HT receptors in human coronary arteries by molecular and pharmacological techniques. European Journal of Pharmacology 372: 49-56.

Ortolani, O., Conti, A., De Gaudio, A.R., Moraldi, E., Cantini, Q., Novelli, G. (2000) The effect of glutathione and N-acetylcysteine on lipoperoxidative damage in patients with early septic shock. Am J Respir Crit Care Med 161: 1907-1911.

Otero-Anton, E., Gonzalez-Quintela, A., Lopez-Soto, A., Lopez-Ben, S., Llovo, J., Perez, L.F.

(2001) Cecal ligation and puncture as a model of sepsis in the rat: influence of the puncture size on mortality, bacteremia, endotoxemia and tumor necrosis factor alpha levels. European Surgical Research 33: 77-79.

Ozdulger, A., Cinel, I., Koksel, O., Cinel, L., Avlan, D., Unlu, A., Okcu, H., Dikmengil, M., Oral, U. (2003) The protective effect of N-acetylcysteine on apoptotic lung injury in cecal ligation and puncture-induced sepsis model. Shock 19: 366-372.

Qiao, Y., Bai, X.F., Du, Y.G. (2011) Chitosan oligosaccharides protect mice from LPS challenge by attenuation of inflammation and oxidative stress. Int Immunopharmacol 11: 121-127.

Razavi, H.M., Wang, L., Weicker, S., Quinlan, G.J., Mumby, S., McCormack, D.G., Mehta, S. (2005) Pulmonary oxidant stress in murine sepsis is due to inflammatory cell nitric oxide. Critical Care Medicine 33: 1333-1339.

Remick, D.G., Bolgos, G., Copeland, S., Siddiqui, J. (2005) Role of interleukin-6 in mortality from and physiologic response to sepsis. Infection and Immunity 73: 2751-2757.

Rhoden, K.J., Dodson, A.M., Ky, B. (2000) Stimulation of the Na(+)-K(+) pump in cultured guinea pig airway smooth muscle cells by serotonin. J Pharmacol Exp Ther 293: 107-112.

Sakurai, H., Chiba, H., Miyoshi, H., Sugita, T., Toriumi, W. (1999) IkappaB kinases phosphorylate NF-kappaB p65 subunit on serine 536 in the transactivation domain. The Journal of Biological Chemistry 274: 30353-30356.

Segura, P., Vargas, M.H., Cordoba-Rodriguez, G., Chavez, J., Arreola, J.L., Campos-Bedolla, P., Ruiz, V., Garcia-Hernandez, L.M., Mendez, C., Montano, L.M. (2010) Role of 5-HT2A, 5-HT4 and 5-HT7 receptors in the antigen-induced airway hyperresponsiveness in guinea-pigs. Clin Exp Allergy 40: 327-338.

Shah, S.V., Baliga, R., Rajapurkar, M., Fonseca, V.A. (2007) Oxidants in chronic kidney disease. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 18: 16-28.

Shen, L., Mo, H., Cai, L., Kong, T., Zheng, W., Ye, J., Qi, J., Xiao, Z. (2009) Losartan prevents sepsis-induced acute lung injury and decreases activation of nuclear factor kappaB and mitogen-activated protein kinases. Shock 31: 500-506.

Shen, Y., Monsma, F.J., Jr., Metcalf, M.A., Jose, P.A., Hamblin, M.W., Sibley, D.R. (1993)

38

Molecular cloning and expression of a 5-hydroxytryptamine7 serotonin receptor subtype. The Journal of Biological Chemistry 268: 18200-18204.

Singh, B., Shinagawa, K., Taube, C., Gelfand, E.W., Pabst, R. (2005) Strain-specific differences in perivascular inflammation in lungs in two murine models of allergic airway inflammation. Clinical and Experimental Immunology 141: 223-229.

Soga, F., Katoh, N., Inoue, T., Kishimoto, S. (2007) Serotonin activates human monocytes and prevents apoptosis. The Journal of Investigative Dermatology 127: 1947-1955.

Starr, M.E., Ueda, J., Yamamoto, S., Evers, B.M., Saito, H. (2011) The effects of aging on pulmonary oxidative damage, protein nitration, and extracellular superoxide dismutase down-regulation during systemic inflammation. Free Radic Biol Med 50: 371-380.

Stefulj, J., Jernej, B., Cicin-Sain, L., Rinner, I., Schauenstein, K. (2000) mRNA expression of serotonin receptors in cells of the immune tissues of the rat. Brain, Behavior, and Immunity 14: 219-224.

Thomas, D.R., Melotto, S., Massagrande, M., Gribble, A.D., Jeffrey, P., Stevens, A.J., Deeks, N.J., Eddershaw, P.J., Fenwick, S.H., Riley, G., Stean, T., Scott, C.M., Hill, M.J., Middlemiss, D.N., Hagan, J.J., Price, G.W., Forbes, I.T. (2003) SB-656104-A, a novel selective 5-HT7 receptor antagonist, modulates REM sleep in rats. British Journal of Pharmacology 139: 705-714.

To, Z.P., Bonhaus, D.W., Eglen, R.M., Jakeman, L.B. (1995) Characterization and distribution of putative 5-HT7 receptors in guinea-pig brain. British Journal of Pharmacology 115: 107-116.

Tsou, A.P., Kosaka, A., Bach, C., Zuppan, P., Yee, C., Tom, L., Alvarez, R., Ramsey, S., Bonhaus, D.W., Stefanich, E., et al. (1994) Cloning and expression of a 5-hydroxytryptamine7 receptor positively coupled to adenylyl cyclase. Journal of Neurochemistry 63: 456-464.

Ullmer, C., Schmuck, K., Kalkman, H.O., Lubbert, H. (1995) Expression of serotonin receptor mRNAs in blood vessels. FEBS Letters 370: 215-221.

van den Berg, R., Haenen, G.R., van den Berg, H., Bast, A. (2001) Transcription factor NF-kappaB as a potential biomarker for oxidative stress. The British Journal of Nutrition 86 (Suppl 1): S121-127.

Verma, R., Huang, Z., Deutschman, C.S., Levy, R.J. (2009) Caffeine restores myocardial cytochrome oxidase activity and improves cardiac function during sepsis. Critical Care Medicine 37: 1397-1402.

Vincent, J.L. (2011) Acute kidney injury, acute lung injury and septic shock: how does mortality compare? Contributions to Nephrology 174: 71-77.

Wang, P., Ba, Z.F., Chaudry, I.H. (1997) Mechanism of hepatocellular dysfunction during early sepsis. Key role of increased gene expression and release of proinflammatory cytokines tumor necrosis factor and interleukin-6. Arch Surg 132: 364-369; discussion 369-370.

Wood, L.G., Gibson, P.G., Garg, M.L. (2003) Biomarkers of lipid peroxidation, airway inflammation and asthma. Eur Respir J 21: 177-186.

Yang, C.M., Yo, Y.L., Hsieh, J.T., Ong, R. (1994) 5-Hydroxytryptamine receptor-mediated phosphoinositide hydrolysis in canine cultured tracheal smooth muscle cells. British Journal of Pharmacology 111: 777-786.

Yang, G.B., Qiu, C.L., Zhao, H., Liu, Q., Shao, Y. (2006) Expression of mRNA for multiple serotonin (5-HT) receptor types/subtypes by the peripheral blood mononuclear cells of rhesus macaques. Journal of Neuroimmunology 178: 24-29.

Yang, Q.H., Liu, D.W., Long, Y., Liu, H.Z., Chai, W.Z., Wang, X.T. (2009) Acute renal failure during sepsis: potential role of cell cycle regulation. The Journal of Infection 58: 459-464.

Yorganci, K. (2005) Sepsis Patofizyolojisi. Yoğun Bakım Dergisi 5: 80-84.

* * * * *

39

ÖZGEÇMİŞ

1. KİMLİĞİ:

Adı, soyadı: Elif ÇADIRCI

Doğum yeri ve tarihi: 26.01.1982

İş adresi: Atatürk Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji AD, Erzurum.

Telefon: 0442 2315241

Fax: 0442 2390968



Ortaokul: Erzurum Anadolu Lisesi, 199

Lise: Erzurum İbrahim Hakkı Fen Lisesi, 2000

Lisans: Eczacılık Fakültesi, Atatürk Üniversitesi, Haziran, 2004

Doktora: Tıp Fakültesi-Farmakoloji Anabilim Dalı, Atatürk Üniversitesi, Nisan, 2009


Ar. Gör.: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji A.D. (2004-2009)

Dr. Ar. Gör.: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji A.D. (2009-2010)

Yrd. Doç. Dr.: Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji A.D. (2010-)

Doktora Sonrası Araştırmacı: Oxford Üniversitesi Farmakoloji Departmanı, Oxford, İngiltere (16 Mayıs-15 Eylül 2011).

İdari görevler:

Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı Başkanı: 2010-

Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Staj Komisyonu Başkanı: 2011-

Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurul Üyesi: 2011-

Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Staj Komisyonu Üyesi: 2005-2011

4. DOKTORA TEZİ:

Bazı non-steroidal antiinflamatuvar ilaçların analjezik etki mekanizmasında β-2 adrenerjik reseptörlerin indirekt rolü.

Danışman: Prof. Dr. Halis SÜLEYMAN

5. PROJELER:

Bilimsel Araştırma Projeleri

1. ATAUNİ-BAP-2011/291: Amiodaronun ratlarda oluşturulan deneysel sepsis modelinde koruyucu etkilerinin incelenmesi. (Yürütücü) 2011-Devam Ediyor.

2. ATAUNİ-BAP-2011/52: Ratlarda CLP ile oluşturulan sepsis modelinde beta reseptörlerin etkisinin incelenmesi. (Yürütücü) 2011-Devam Ediyor.

3. ATAUNİ-BAP-2011/17: L-Tipi kalsiyum kanal blokörlerinin sıçanlarda inflamasyon ile oluşturulan osteoporoz modelinde kemik mineralizasyonu üzerine olan etkilerinin araştırılması. (Araştırmacı) 2011-Devam Ediyor.

4. ATAUNİ-BAP-2011/14: Sıçanlarda deneysel miyokard infarktüsünde lasidipin, ramipril ve valsartan’ın akut ve kronik koruyucu etkilerinin incelenmesi (Araştırmacı) 2011-Devam Ediyor.

5. ATAUNİ-BAP-2010/179: Klinik ve deneysel araştırmalar laboratuvarı ve Atatürk Üniversitesi Sağlık Bilimleri Klinik ve Deneysel Araştırma Merkez Müdürlüğünün kurumsal projesi (Güdümlü Araştırma Projesi). (Araştırmacı) 2010-Devam Ediyor.

6. ATAUNİ-BAP-2009/320: Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Laboratuarı kurulumu projesi (Alt Yapı Projesi). (Yürütücü) 2010-2011

7. ATAUNİ-BAP-2009/140: Tiyaneptinin antiülser mekanizmasında adrenerjik reseptörlerin rolünün araştırtması. (Araştırmacı) 2009-2011.

8. ATAUNİ-BAP-2008/199: N-asetil sistein’in gastroprotektif etki sürecinde meydana gelen bazı biyokimyasal değişikliklerin araştırılması. (Araştırmacı) 2008-2011

9. ATAUNİ-BAP-2008/126: Talamus bölgesinde antikanser ilaçların oluşturduğu hipersensitivitede nörotransmitterlerdeki değişimin in vivo voltamerti ile gösterilmesi ve antikanser ilaçların oluşturduğu ağrı yan etkisinin ortadan kaldırılması. (Araştırmacı) 2008-Devam Ediyor.

10. ATAUNİ-BAP-2007/92: Yeni doğan sıçan beyin hücre kültürlerinde glutamat ve


40

histaminle indüklenen nörotoksisite de ve ayrıca hipoksinin oluşturduğu nörotoksisite de kalsiyum kanal blokerlerinin nöroprotektif ve antioksidant etkisinin araştırılması. (Araştırmacı) 2007-2009

Tübitak Projesi Deneyimi

TÜBİTAK-2007/30: Antikanser ilaçların indüklediği ağrı duyarlılık artışının glutamat düzeyiyle ilişkisi. (Araştırmacı) 2007-2011.

6. BURSLAR:

Yurt İçi Doktora Burs Programı – TÜBİTAK

7. ÜYELİKLER:

Türk Farmakoloji Derneği

8. ÖDÜLLER:

1. Atatürk Üniversitesi Rektörlüğü “Sağlık Bilimleri Alanı Etkin Makale Dalı”nda Bilimsel Teşvik Ödülü (2011).

2. Roche Tıp Bilimleri, Osteoporoz alanında ikincilik Ödülü “Halici Z, Borekci B, Ozdemir Y, Cadirci E and Suleyman H, Protective effects of amlodipine and lacidipine on ovariectomy-induced bone loss in rats. European Journal of Pharmacology 579:241-245 (2008).” çalışması ile (2008).

3. Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi ikincisi (2004).

4. Özel Öğrenci Teşvik Ödülü, Eczacılık Ödülleri 2004, Artı Organizasyon + Güncel Eczacılık Dergisi + Marmara Üniversitesi Eczacılık Mezunları Derneği (2004).

9. YABANCI DİL: İngilizce (ÜDS 95)

YAYIN LİSTESİ


1. Cadirci E, Suleyman H, Gurbuz P, Kuruuzum-Uz A, Guvenalp Z: Anti-inflammatory effects of different extracts from three salvia species. Turkish Journal of Biology 2012;36:59-64.

2. Odabasoglu F, Yildirim OS, Aygun H, Halici Z, Halici M, Erdogan F, Cadirci E,

Cakir A, Okumus Z, Aksakal B, Aslan A, Unal D, Bayir Y: Diffractaic acid, a novel proapoptotic agent, induces with olive oil both apoptosis and antioxidative systems in ti-implanted rabbits. Eur J Pharmacol 2012;674:171-178.

3. Cadirci E, Halici Z, Odabasoglu F, Albayrak A, Karakus E, Unal D, Atalay F, Ferah I, Unal B: Sildenafil treatment attenuates lung and kidney injury due to overproduction of oxidant activity in a rat model of sepsis: A biochemical and histopathological study. Clin Exp Immunol 2011;166:374-384.

4. Coskun AK, Yigiter M, Oral A, Odabasoglu F, Halici Z, Mentes O, Cadirci E, Atalay F, Suleyman H: The effects of montelukast on antioxidant enzymes and proinflammatory cytokines on the heart, liver, lungs, and kidneys in a rat model of cecal ligation and puncture-induced sepsis. ScientificWorldJournal 2011;11:1341-1356.

5. Odabasoglu F, Halici Z, Aygun H, Halici M, Atalay F, Cakir A, Cadirci E, Bayir Y, Suleyman H: Alpha-lipoic acid has anti-inflammatory and anti-oxidative properties: An experimental study in rats with carrageenan-induced acute and cotton pellet-induced chronic inflammations. Br J Nutr 2011;105:31-43.

6. Özbakış-Dengiz G, Çadırcı E, Yurdakan G: Histopathologic evaluation of anti-ulcerogenic effect of montelukast in indomethacin-induced experimental ulcer model. Turkish Journal of Gastroenterology 2011

7. Salman S, Kumbasar S, Kumtepe Y, Karaca M, Borekci B, Yildirim K, Alp HH, Cadirci E, Suleyman H: Role of adrenal gland hormones in the anti-inflammatory effect mechanism of tamoxifen, a partial antagonist for oestrogen receptors, and relation with cox levels. Gynecol Endocrinol 2011;27:241-247.

8. Albayrak A, Polat B, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Halici Z, Gulapoglu M, Albayrak F, Suleyman H: Gastric anti-ulcerative and anti-inflammatory activity of metyrosine in rats. Pharmacol Rep 2010;62:113-119.

9. Cadirci E, Altunkaynak BZ, Halici Z, Odabasoglu F, Uyanik MH, Gundogdu C, Suleyman H, Halici M, Albayrak M, Unal

41

B: Alpha-lipoic acid as a potential target for the treatment of lung injury caused by cecal ligation and puncture-induced sepsis model in rats. Shock 2010;33:479-484.

10. Cadirci E, Oral A, Odabasoglu F, Kilic C, Coskun K, Halici Z, Suleyman H, Nuri Keles O, Unal B: Atorvastatin reduces tissue damage in rat ovaries subjected to torsion and detorsion: Biochemical and histopathologic evaluation. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2010;381:455-466.

11. Cadirci E, Suleyman H, Hacimuftuoglu A, Halici Z, Akcay F: Indirect role of beta2-adrenergic receptors in the mechanism of analgesic action of nonsteroidal antiinflammatory drugs. Crit Care Med 2010;38:1860-1867.

12. Kara C, Suleyman H, Tezel A, Orbak R, Cadirci E, Polat B, Kara I: Evaluation of pain levels after nd: Yag laser and scalpel incisions: An experimental study in rats. Photomed Laser Surg 2010;28:635-638.

13. Koc F, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z, Hacimuftuoglu A, Suleyman H: Anti-inflammatory activity of 2,5-dihydroxycyclohepta-2,4,6-trienone in rats. Medicinal Chemistry Research 2010;19:84-93.

14. Suleyman H, Albayrak A, Bilici M, Cadirci E, Halici Z: Different mechanisms in formation and prevention of indomethacin-induced gastric ulcers. Inflammation 2010;33:224-234.

15. Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z, Gundogdu C, Hacimuftuoglu A: Occurrence of anticancer activity of prednisolone via adrenalectomy and inhibition of adrenaline in rats. Int J Cancer 2010;126:1740-1748.

16. Uyanik A, Unal D, Uyanik MH, Halici Z, Odabasoglu F, Altunkaynak ZB, Cadirci E, Keles M, Gundogdu C, Suleyman H, Bayir Y, Albayrak M, Unal B: The effects of polymicrobial sepsis with diabetes mellitus on kidney tissues in ovariectomized rats. Ren Fail 2010;32:592-602.

17. Halici Z, Dursun H, Keles ON, Odaci E, Suleyman H, Aydin N, Cadirci E, Kalkan Y, Unal B: Effect of chronic treatment of haloperidol on the rat liver: A stereological and histopathological study.

Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2009;379:253-261.

18. Karaca M, Odabasoglu F, Kumtepe Y, Albayrak A, Cadirci E, Keles ON: Protective effects of erythropoietin on ischemia/reperfusion injury of rat ovary. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2009;144:157-162.

19. Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z, Polat B, Hacimuftuoglu A, Alp HH: Reason for the aggravation of diseases caused by inflammation and the ineffectiveness of NSAIDs on these diseases in rainy weather. Pharmacol Rep 2009;61:514-519.

20. Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Polat B, Halici Z, Koc F, Hacimuftuoglu A, Bayir Y: Comparative study on the gastroprotective potential of some antidepressants in indomethacin-induced ulcer in rats. Chem Biol Interact 2009;180:318-324.

21. Suleyman H, Dursun H, Bilici M, Cadirci E, Halici Z, Gulaboglu M, Albayrak F: Relation of adrenergic receptors, which have roles in gastroprotective and anti-inflammatory effect of adrenal gland hormones, with cyclooxygenase enzyme levels in rats. J Physiol Pharmacol 2009;60:129-134.

22. Borekci B, Kumtepe Y, Karaca M, Halici Z, Cadirci E, Albayrak F, Polat B, Suleyman H: Role of alpha-2 adrenergic receptors in anti-ulcer effect mechanism of estrogen and luteinising hormone on rats. Gynecol Endocrinol 2009;25:264-268.

23. Borekci B, Cadirci E, Albayrak A, Suleyman H, Halici Z, Kadanali S: Effects of progesterone on fsh-stimulated indomethacin ulcers in rats. Fertil Steril 2008;90:1899-1903.

24. Halici Z, Borekci B, Ozdemir Y, Cadirci E, Suleyman H: Protective effects of amlodipine and lacidipine on ovariectomy-induced bone loss in rats. Eur J Pharmacol 2008;579:241-245.

25. Halici Z, Karaca M, Keles ON, Borekci B, Odabasoglu F, Suleyman H, Cadirci E, Bayir Y, Unal B: Protective effects of amlodipine on ischemia-reperfusion injury of rat ovary: Biochemical and histopathologic evaluation. Fertil Steril 2008;90:2408-2415.

42

26. Halici Z, Keles ON, Unal D, Albayrak M, Suleyman H, Cadirci E, Unal B, Kaplan S: Chronically administered risperidone did not change the number of hepatocytes in rats: A stereological and histopathological study. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2008;102:426-432.

27. Halici Z, Suleyman H, Cadirci E: Effects of calcium channel blockers on hyaluronidase-induced capillary vascular permeability. Arch Pharm Res 2008;31:891-899.

28. Odabasoglu F, Halici Z, Cakir A, Halici M, Aygun H, Suleyman H, Cadirci E, Atalay F: Beneficial effects of vegetable oils (corn, olive and sunflower oils) and alpha-tocopherol on anti-inflammatory and gastrointestinal profiles of indomethacin in rats. Eur J Pharmacol 2008;591:300-306.

29. Suleyman H, Cadirci E, Albayrak A, Halici Z: Nimesulide is a selective cox-2 inhibitory, atypical non-steroidal anti-inflammatory drug. Curr Med Chem 2008;15:278-283.

30. Suleyman H, Halici Z, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Bilen H: Indirect role of beta2-adrenergic receptors in the mechanism of anti-inflammatory action of nsaids. J Physiol Pharmacol 2008;59:661-672.

31. Cadirci E, Suleyman H, Aksoy H, Halici Z, Ozgen U, Koc A, Ozturk N: Effects of onosma armeniacum root extract on ethanol-induced oxidative stress in stomach tissue of rats. Chem Biol Interact 2007;170:40-48.

32. Dengiz GO, Odabasoglu F, Halici Z, Cadirci E, Suleyman H: Gastroprotective and antioxidant effects of montelukast on indomethacin-induced gastric ulcer in rats. J Pharmacol Sci 2007;105:94-102.

33. Dengiz GO, Odabasoglu F, Halici Z, Suleyman H, Cadirci E, Bayir Y: Gastroprotective and antioxidant effects of amiodarone on indomethacin-induced gastric ulcers in rats. Arch Pharm Res 2007;30:1426-1434.

34. Halici Z, Dengiz GO, Odabasoglu F, Suleyman H, Cadirci E, Halici M: Amiodarone has anti-inflammatory and anti-oxidative properties: An experimental study in rats with carrageenan-induced

paw edema. Eur J Pharmacol 2007;566:215-221.

35. Ozbakis-Dengiz G, Halici Z, Akpinar E, Cadirci E, Bilici D, Gursan N: Role of polymorphonuclear leukocyte infiltration in the mechanism of anti-inflammatory effect of amiodarone. Pharmacol Rep 2007;59:538-544.

36. Suleyman H, Halici Z, Cadirci E, Hacimuftuoglu A, Keles S, Gocer F: Indirect role of alpha2-adrenoreceptors in anti-ulcer effect mechanism of nimesulide in rats. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2007;375:189-198.

37. Suleyman H, Salamci E, Cadirci E, Halici Z: Beneficial interaction of nimesulide with nsaids. Medicinal Chemistry Research 2007;16:78-87.


1. H. Suleyman, A. Hacimuftuoglu, E. Cadirci, A. A. Albayrak, B. Polat, H.H. Alp, Z. Halici. Relation of proepileptic activity of indomethacin with adrenal gland hormones. 22nd Congress of the European College of Neuropsychopharmacology, European Neuropsychopharmacology,279-280 pp., Istanbul, Turkey, September 2009

2. A. Hacimuftuoglu; F. Saruhan; H. Suleyman, Z. Halici, E. Cadirci, D. Cetin, B. Polat. Paclitaxel induced pain and its character 22nd Congress of the European-College-of-Neuropsychopharmacology, European Neuropsychopharmacology, 281 pp., Istanbul, TURKEY, September 2009

3. D. Unal, B.Z. Altunkaynak, Z. Halici, O.N. Keles, E. Cadirci, M.E. Altunkaynak, B. Unal. Volumetric Evaluation of Brain In Diabetic and Overectomized Rats. Third International Congress of Molecular Medicine, IUBMB LIFE, 330 pp., Istanbul, Turkey, May 2009

4. F. Odabasoglu, H. Aygun, Z. Halici, Y. Bayir, A. Cakir, E. Cadirci, F. Atalay. Effect of alpha-lipoic acid on myeloperoxidase activity and lipid peroxidation level in carrageenan-injected rats. 32nd Congress of the Federation-of-

43

European-Biochemical-Societies (FEBS) FEBS JOURNAL, 269 pp., Vienna, Austria, JUL 2007

5. F. Odabasoglu, Z. Halici, H. Aygun, M. Halici, A. Cakir, H. Suleyman, E. Cadirci, Anti-inflammatory effect of the alpha-lipoic acid on carrageenan-induced paw edema in rats and its relation with some antioxidant enzymes. 6th AFMC International Medicinal Chemistry Symposium, Drugs of the Future, 137-138 pp., İstanbul, TURKEY, JUL 2007

6. F. Odabasoglu, H. Aygun, O.S. Yildirim, Z. Halici, A. Aslan, A. Cakir, M. Halici, E. Cadirci. Effect of usnic acid on tissue caspase activity and glutathione level in titanium-implanted subjects. 32nd Congress of the Federation-of-European-Biochemical-Societies (FEBS), FEBS Journal, 152 pp., Vienna, AUSTRIA, JUL 2007

7. M. Gulaboglu, Z. Halici, N. Aydin, E. Cadirci, M. Gul, H. Suleyman, E. Oral. The effects of risperidone, olanzapine and haloperidol on enzyme activities in kidney tissue of rats. 19th Congress of the European College o Neuropsychopharmacology, European Neuropsychopharmacology, 246-247 pp., Paris, FRANCE, Sep 2006

Uluslararası Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitabında (Proceedings) Basılan Bildiriler

1. E. Çadırcı, Z. Halıcı, F. Akçay. Erythropoietin as a prohibited doping agent Winter Universiade Conferance 2011, 136 pp., Erzurum, Turkey, Ocak 2011.

2. E. Çadırcı, Z. Halıcı, F. Akçay. The use of growth hormone as performance-enhancing drug Winter Universiade Conferance 2011, 136 pp., Erzurum, Turkey, Ocak, 2011

3. E. Çadırcı, H. Süleyman, P. Gurbuz, A. Kuruuzum-Uz, Z. Guvenalp, L.O. Demirezer. Antiinflammatory activity of Salvia Species. 9th International Symposium on Pharmaceutical Sciences, 297 pp., Ankara, Türkiye, June, 2009

4. A. Atila, Y. Kadıoğlu, E. Çadırcı, H. Süleyman. Determination of prilocaine in rat plasma with GC-FID method. 9th

International Symposium on Pharmaceutical Sciences, 131 pp., Ankara, Türkiye, June 2009

5. F. Odabasoglu, Z. Halici, A. Cakir, M. Halici, E. Cadirci, H. Suleyman. Gastroprotective effect of vegetable oils and alpha-tocopherol on indomethacine-induced gastric ulcer in rats and its relation with myeloperoxidase and glutathione s-transferase activities. 3rd International meeting on medicinal and pharmaceutical chemistry, 106 pp., Antalya, Turkey, October, 2007

6. F. Odabasoglu, Z. Halici, G. Ozbakis-Dengiz, E. Cadirci. Gastroprotective effect of montelukast (singulaire) on indomethacine-induced gastric ulcerin rats and its relation with myeloperoxidase and some antioxidant enzymes. 3rd International meeting on medicinal and pharmaceutical chemistry, 108 pp., Antalya, Turkey, October, 2007

7. F. Odabasoglu, Z. Halici, H. Aygun, M. Halici, Y. Bayir, A. Cakir, E. Cadirci, F. Atalay. Anti-inflammatory effects of the alpha-lipoic acid on carrageenan-induced acute and cotton pellet-induced chronic inflammation models in rats and its relation with nitric oxide synthase activity . International Symposium on Drug Research and Development, 74-74 pp., Antalya, Turkiye, Mayıs, 2007

8. G.O. Dengiz, Z. Halici, F. Odabasoglu, E. Cadirci, H. Suleyman. Gastroprotective effect of montelukast (singulaire) on indomethacine-induced gastric ulcer in rats and its relation with some glutathione metabolism parameters. International Symposium on Drug Research and Development, 74 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs, 2007

9. G.O. Dengiz, F. Odabasoglu, Z. Halici, E. Cadirci, M. Halici, H. Suleyman. Gastroprotective effect of amiodarone on indomethacin-induced gastric ulcer in rats and its relation with some antioxidant enzymes. International Symposium on Drug Research and Development, 75-76 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs 2007

10. Z. Halici, M. Karaca, O.N. Keles, B. Borekci, F. Odabasoglu, H. Suleyman, E. Cadirci, Y. Bayir, B. Unal. Protective effects of amlodipine on ischemia-reperfusion injury of rat ovary: Biochemical and Histopathologic

44

evaluation. VII. Türk-Alman Jinekoloji Derneği Kongresi, Arch Gynecol Obstet, , 73 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs 2007

11. Z. Halici, B. Borekci, Y. Ozdemir, E. Cadirci, H. Suleyman. Protective effects of amlodipine and lacidipine on oophorectomy-induced bone loss in rats. VII. Türk-Alman Jinekoloji Derneği Kongresi, Arch Gynecol Obstet, 163 pp., Antalya, Türkiye, Mayıs 2007

12. Z. Halici, F. Odabasoglu, D.G. Ozbakis, E. Cadirci, Y. Bayir, H. Suleyman. Gastroprotective effect of amiodarone on indomethacine-induced gastric ulcer in rats and its relation with some glutathione metabolism parameters. The 5th International Postgraduate Research Symposium on Pharmaceutics IPORSIP-2007, Acta Pharmaceutica Turcica, 27 pp., İstanbul, Türkiye, September 2007

13. F. Odabasoglu, D.G. Ozbakis, Z. Halici, M. Halici, E. Cadirci, H. Suleyman. Anti-inflammatory effect of amiodarone on carrageenan-induced paw edema in rats and its relation with some glutathione metabolism parameters. 5th International Symposium on Pharmaceutical Chemistry ISPC-2007, Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, 87 pp., İstanbul, Türkiye, September 2007

14. M. Halici, O.I. Kufrevioglu, F. Odabasoglu, Z. Halici, A. Cakir, A. Aslan, M. Koc, E. Cadirci, F. Atalay. Gastroprotective and anti-oxidative properties of the some extracts from Ramalina capitata. 5th International Symposium on Pharmaceutical Chemistry ISPC-2007, Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences, 78 pp., İstanbul, Türkiye, September 2007

15. K.O. Yerdelen, E. Cadirci, E. Bayramoglu, H.I. Gul, Toxicity of Some Azines of Acetophenone Derived mono-Mannich Bases by Brine Shrimp Bioassay. 1st International Meeting on Medicinal and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-1, 122 pp., Ankara, Turkey, September 2002

Ulusal Hakemli Dergilerde Yayımlanan Makaleler

1. M. Işık, E. Çadırcı. Solunum Yolu Enfeksiyonlarında Tamamlayıcı ve Alternatif Tedaviler, Turkiye Klinikleri J

Fam Med-Special Topics , 69-74 pp., 2011

2. E. Çadırcı, Z. Halıcı, B. Polat, I. Ferah. Olmesartan ve Pioglitazonun Sıçanlarda Karrageninle İndüklenen İnflamatuvar Pençe Ödemine Etkileri. Journal of Clinical and Analytical Medicine, 2011, DOI: 10.4328/JCAM.574 (Online makale).

3. M. Çetin, H. Süleyman, E. Çadırcı, E. T. Demir, A. Hacımüftüoglu, B. Polat. Preparation and In Vivo Evaluation Of Eudragit® L100/Eudragit® Nm 30d Enteric Granules Containing Diclofanac Sodium: Anti-Inflammatory And Ulcerogenic. Turkish Journal of Pharmaceutical Sciences , 237-248 pp., 2010

4. Y. Bayir, E. Cadirci, H. Suleyman, Z. Halici, M.S. Keles. Effects of Lacidipine, Ramipril and Valsartan on Serum BNP levels in Acute and Chronic Periods Following Isoproterenol-Induced Myocardial Infarction in Rats. The Euroasian Journal of Medicine, 44-48 pp., 2009

5. E. Çadırcı, Z. Halıcı. Kalsiyum Kanal Blokörleri ve Selektif L-Tiplerinin Gelecekteki Yeni Endikasyonları. Medical Network, Kardiyoloji Dergisi, 37-52 pp., 2007

6. Z. Halıcı, Y. Bayır, H. Süleyman, E. Çadırcı, M.S. Keleş, E. Bayram,. Amiodaron’un Sıçanlarda İsoproterenol ile Oluşturulan Akut ve Kronik Miyokard İnfarktüsü Modelinde Eritropoetin Seviyeleri Üzerine Etkilerinin İncelenmesi. Atatürk Üniversitesi Tıp Dergisi, 68-72 pp., 2006

Ulusal Bilimsel Toplantılarda Sunulan ve Bildiri Kitaplarında Basılan Bildiriler

1. G. Özbakış-Dengiz, E. Çadırcı, G. Yurdakan. Montelukastın antiülserojenik etkisinin indometazin ile oluşturulan deneysel ülser modelinde histopatolojik olarak değerlendirilmesi. Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 129 pp., Eskişehir, Türkiye, Ekim 2011.

2. E. Çadırcı, Z. Halıcı, F. Odabaşoğlu, A. Albayrak, E. Karakuş, D. Ünal, F. Atalay, I. Ferak, B. Ünal. Sıçanlarda oluşturulan sepsis modelinde oksidatif stresin neden

45

olduğu akciğer ve böbrek hasarının sildenafil tedavisi ile azaltılması: Biyokimyasal ve Histopatolojik bir çalışma. Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 299 pp., Eskişehir, Türkiye, Ekim 2011.

3. H. Suleyman, E. Çadırcı, A. Albayrak, Z. Halıcı, C. Gündogdu, A. Hacımüftüoğlu. Sıçanlarda prednizolonun antikanser aktivitesinin adrenalektomi ve adrenalin inhibisyonu ile oluşması. Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 167 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım, 2009.

4. A. Albayrak, B. Polat, E. Çadırcı, A. Hacımüftüoğlu, Z. Halıcı, M. Gülaboğlu, F. Albayrak, H. Süleyman. Metirozinin ratlardaki antiülser ve antiinflamatuvar aktivitesi. Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 189 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım, 2009.

5. E. Çadırcı, H. Süleyman, A. Hacımüftüoğlu, Z. Halıcı. Bazı-non steroidal antiinflamatuvar ilaçların analjezik etki mekanizmasında β-2 adrenerjik reseptörlerin indirekt rolü.Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 190 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım, 2009.

6. A. Hacımüftüoğlu, F. Saruhan, H. Süleyman, Z. Halıcı, E. Çadırcı, D. Çetin. Deksmedetomidin, klonidin ve meperidinin sıçanlarda paktitakselle oluşturulan ağrı eşiği değişikliğine etkileri. Türk Farmakoloji Derneği 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 314 pp., Manavgat, Türkiye, Kasım 2009.

7. H. Süleyman, E. Çadırcı, A. Albayrak, Z. Halıcı, B. Polat, A. Hacımüftüoğlu, H.H. Alp. Yağmurlu havalarda inflamasyonlu hastalıkların şiddetlenmesi ve NSAİİ’lerin antiinflamatuvar aktivitesinin azalmasının nedeni. Türk Fizyolojik Bilimler Derneği, 34 Ulusal Fizyoloji Kongresi, 145 pp., Erzurum, Türkiye, Ekim 2008.

8. B. Börekçi, Y. Kumtepe, M. Karaca, Z. Halıcı, E. Çadırcı, F. Albayrak, B. Polat, H. Süleyman. Sıçanlarda östrojen ve LH’nın antiülser etki mekanizmasında α-2 adrenerjik reseptörlerin rolü.Türk Fizyolojik Bilimler Derneği, 34 Ulusal Fizyoloji Kongresi, 162 pp., Erzurum, Türkiye, Ekim 2008.

9. F. Koç, E. Çadırcı, A. Albayrak, Z. Halıcı, A. Hacımüftüoğlu, H. Süleyman. 2,5-Dihydroxycyclohepta-2,4,6-trienone’un sıçanlarda anti-inflammatuar aktivitesi. Türk Fizyolojik Bilimler Derneği, 34 Ulusal Fizyoloji Kongresi, 125 pp., Erzurum, Türkiye, Ekim 2008.

10. L.Ö. Demirezer, A. Kuruüzüm-Uz, H. Süleyman, E. Çadırcı, Z. Güvenalp. Anchusa Azurea Miller Var Azurea’nın Antiülser Etkisi Üzerine Çalışmalar. 18. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, 58 pp., İstanbul, Türkiye, Ekim 2008.

11. A. Kuruüzüm-Uz, L.Ö. Demirezer, H. Süleyman, E. Çadırcı, Z. Güvenalp. Rozmarinik Asitin Antienflamatuvar Aktivitesi. 18. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı, 57 pp., İstanbul, Türkiye, Ekim 2008.

12. F. Odabaşoğlu, Z. Halıcı, H. Aygün, M. Halıcı, A. Çakır, E. Çadırcı, F. Atalay, S. Mutlu. Rat pençelerinde karragenin enjeksiyonu ile oluşturulan akut enflamasyon üzerine Alfa-lipoik asidin etkisi: Anti-enflamatuvar etkinin glutatyon düzeyi, glutatyon peroksidaz ve redüktaz enzim aktiviteleri ile ilişkisi. 19. Ulusal Biyoloji Kongresi, 508 pp., Trabzon, Türkiye, Haziran 2008.

13. Z. Halıcı , O.N. Keleş, D. Ünal, M. Albayrak, H. Süleyman, E. Çadırcı, B. Ünal, S. Kaplan. Kronik Olarak Verilen Risperidone Hepatosit Sayısını Değiştirmiyor: Stereolojik ve Histopatolojik Çalışma XVIII. Ulusal Elektron mikroskobisi Kongresi, 264 pp., Eskişehir, Türkiye, Ağustos 2007.

14. H. Süleyman, Z. Halıcı, E. Çadırcı, A. Hacımüftüoğlu, H. Bilen. NSAİ ilaçların antiinflamatuvar etki mekanizmasında β2 adrenerjik reseptörlerinin indirekt rolü. Türk Farmakoloji Derneği 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 427 pp., Trabzon, Türkiye, Ekim 2007.

15. G. Özbakış Dengiz, E. Çadırcı. Montelukastın ratlarda karragenin ile oluşturulan inflamasyona etkileri. Türk Farmakoloji Derneği 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 426 pp., Trabzon, Türkiye, Ekim 2007.

16. D.G. Özbakış, E. Akpınar, Z. Halıcı, D. Bilici, E. Çadırcı. Amiodaronun anti-inflamatuvar ve analjezik etkileri. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal

46

Farmakoloji, 312 pp., İzmir, Türkiye, Ekim 2005.

17. G. Özbakış, Z. Halıcı, E. Çadırcı. İndometazinle oluşturulan ülser modelinde amiodaronun etkisi. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi konferansı, 269 pp., İzmir, Türkiye, Ekim 2005.

Ulusal Kongre ve Kurslarda Konuşma

1. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı “Stereolojik Kesit Alma Kursu” konuşmacı olarak katılım, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 28 Ekim (2006).

2. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı “Elektron Mikroskobu Teknikleri Kursu” konuşmacı olarak katılım, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 29 Ekim (2006).

3. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı “Klinik ve Patolojik Uygulamalarda Stereoloji Kursu” Konuşmacı olarak katılım, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 4-5 Kasım (2006).

DİĞER BİLİMSEL AKTİVİTELER

Bilimsel Kongre, Kurs ve Seminerler

1. Laboratory Animal Management & Welfare Course Modules 1 – 4, Oxford University BMS (Veterinary Services), Oxford/UK, 19 May-03 June 2011.

2. Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi. Eskişehir, 19-22 Ekim 2011.

3. Türk Farmakoloji Derneği, 20. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof Dr. Gültekin Sunam Toplantısı Sarıkamış / Kars 09-11 Mart 2011.

4. 8. Türkiye Geneli Hasta Bilgilendirme Yarışması, Ankara, 25-27 Mart 2011.

5. Winter Universiade Conferance, Atatürk University, Erzurum,Turkey, 24-27 Ocak 2011.

6. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi “Araştırma Yöntemleri ve Biyoistatistik Kursu”, Erzurum, 04 Aralık 2010-16 Ocak 2011.

7. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Çekirdek Eğitici Eğitimi Kursu, Erzurum, 07-11 Haziran 2010.

8. Sağlık Bakanlığı Klinik Araştırmacı Eğitimi Programı, Erzurum, 15 Mayıs 2010.

9. Türk Farmakoloji Derneği, 19. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof Dr. Oğuz Güç Toplantısı Uludağ/Bursa 17-19 Mart 2010.

10. Türk Farmakoloji Derneği 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi. Antalya, 4-7 Kasım 2009.

11. Atatürk Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Voltametri Kursu, 17-18 Ekim 2009.

12. T.C. Sağlık Bakanlığı İlaç ve Eczacılık Genel Müdürlüğü “Klinik Araştırmalarda Etik Yaklaşım Kursu” Erzurum 25-26 Mayıs 2009.

13. Türk Farmakoloji Derneği, 15. Farmakoloji Eğitim Sempozyumu, “Farmakoloji’de kullanılan in vivo kayıt sistemleri” Atatürk Üniversitesi 30 Haziran 2008.

14. Türk Farmakoloji Derneği, 17. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof Dr. Firuz Baysal Toplantısı Kartalkaya/Bolu 05-07 Mart 2008.

15. Türk Farmakoloji Derneği 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi. Trabzon 24-27 Ekim 2007.

16. Türk Farmakoloji Derneği, 16. Farmakoloji Eğitiminde Kuşaklararası Bilimsel Etkileşme Seminerleri Prof. Dr. Kazım Türker Toplantısı, Aksu/Antalya 07-09 Mart 2007.

17. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı “Sinir Bilimde Temel Metodlar ve Stereoloji Kursu”, Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 30 Ekim-3 Kasım 2006.

18. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ve Stereoloji Derneği Uluslararası katılımlı “Mikroskobik Kesit

47

Alma” kursu. Atatürk Üniversitesi Tıp Fakültesi, 27 Ekim 2006.

19. XVI. Bitkisel İlaç Hammaddeleri Toplantısı. Atatürk Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Erzurum, 28-30 Haziran 2006.

20. Türk Farmakoloji Derneği, 13. Farmakoloji Eğitim Sempozyumu, “Genetik Araştırmalarda kullanılan Yöntemlerin Farmakoloji’de uygulamaları” Van 100. Yıl Üniversitesi 2 Haziran 2006.

21. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi. İzmir 28 Eylül-1 Ekim 2005.

22. 1st International Meeting on Medicinal and Pharmaceutical Chemistry IMMPC-1, Ankara, Turkey, September 25-28, 2002.

* * * * *

NOTLAR

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

………………………………………………………………………

48

Memeli Kardiyomiyositlerinde Na+/H+ Değiş-Tokuşcusunun Akut ve Uzun Süreli Hipoksiye Olan Duyarlılığı: ATP ve MikroRNA’ların Rolünün İncelenmesi

Hilmi Burak KANDİLCİ Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara

GİRİŞ VE AMAÇ

Hücre fonksiyonları metabolizma sonucu ortaya çıkan enerji ile sürdürülmektedir. Metabolizma hücre içinde asit oluşumunu (H

+ iyonlarının oluşması) artırır. H

+ iyonları

çok reaktif olduklarından hücreden hemen uzaklaştırılmaları gerekmektedir. Memeli kardiyomiyositlerinde asitin hücreden atılımdan sorumlu ana membran proteini Na

+/H

+ değiş-tokuşcusudur (NHE-1

izoformu). NHE fizyolojik koşullarda hücre dışı Na

+’un hücre içi H

+ ile elektronötral

değiş-tokuşunu gerçekleştirmektedir. NHE aracılı değiş-tokuş amilorid ve türevleri tarafından tamamen inhibe edilebilmektedir (Grinstein ve diğ., 1989; Wakabayashi ve diğ., 1992). NHE aktivitesinin hızı büyük ölçüde proteinin sitozolik kısmındaki allosterik modifiye edici bölgenin protonlanması ile belirlenir. Bu bölgenin protonlanması hücreyi asit yüklenmesinden korumak için NHE aktivitesini hızlandırır. Fizyolojik hücre içi pH (pHi)’da NHE’nin allosterik bölgesinden protonun uzaklaşması ise sitozolün alkaliye kaymasını önlemek için değiş-tokuşcuyu inaktive etmektedir (Aronson ve diğ., 1982; Grinstein ve diğ., 1984; Aronson 1985). İskemi veya iskeminin ana komponenti anoksi sırasında oluşan asidin dokudan uzaklaştırılması miyokardial pH regülasyonunun önemli bir parçasıdır (Steenbergen ve diğ, 1977; Garlick ve diğ 1979). İskemi ve özellikle reperfüzyon sırasında NHE aktivitesi sonucu artan hücre içi Na

+ Na

+/Ca

+2 değiş-tokuşcusu aracılığıyla

dışarı atılırken hücrenin Ca+2

yüklendiği öne sürülmüştür (Lazdunski ve diğ., 1985). Hücre içi Ca

+2 artışı hücrede nekroza kadar giden

birçok mekanizmayı tetiklemektedir (Tani ve Neely 1989; Haigney ve diğ., 1992). Ayrıca, hücre içi Na

+ miktarı ile anoksi-

reoksijenasyon hasarının geriye dönüşünün ters orantılı olduğu gözlenmiştir (Murphy ve Allen 2009). Kardiyomiyositlerde anoksi-reoksijenasyon sırasında NHE aktivite ve regülasyonunun aydınlatılması iskemik hasarın oluştuğu miyokardial iskemi ve by-

pass cerrahisi gibi durumlarda tedavi stratejileri geliştirmek için önemlidir. Kardiyomiyositlerde akut hipoksinin NHE-1 üzerindeki anlık etkileri yanında uzun süreli hipoksik koşulların da (koroner arter hastalığı gibi) NHE-1’in aktivite ve ekspresyonunu değiştirme potansiyeli bulunmaktadır (Anderson ve diğ., 2009). NHE-1 kronik inhibisyonunun maladaptif kardiyak hipertrofi ve sonrasında kalp yetmezliğini önlediği çeşitli hayvan modellerinde gösterilmiştir (Chen ve diğ., 2004). Dolayısı ile, uzun süreli hipoksik koşullarda NHE-1 protein seviyesinin kontrol edilmesi iskemik kalp hastalığı gibi patolojilerde önemli olabilir.

Mikro RNA’lar (miRNA) spesifik hedef genleri düzenleyen, tek zincirli, 20–23 nükleotid uzunluğunda ve protein kodlamayan RNA’lardır. Bu kısa nükleotid dizileri tüm canlılarda yüksek miktarlarda üretilirler ve gen ekspresyonlarını spesifik hedef mRNA’ları keserek veya translasyonel susturma (hedef mRNA’ların özel bölgeleri (3’ UTR) içindeki baz çiftleşme bölgeleri ile etkileşerek) yolu ile post-transkripsiyonel düzeyde kontrol ederler. miRNA’lar hedef mRNA’lara 5’ uçtan genelde ilk sekiz nükleotid sekansından (seed sekans) bağlanırlar (Gaidatsiz ve diğ., 2007) ve birçok biyolojik süreçte spesifik basamaklar-da gen ekspresyonlarının baskılanmasında önemli rol oynarlar (Bartel, 2004). Kardiyovasküler alanda da miRNA birçok fizyolojik ve patofizyolojik süreçte rol oynamaktadır (Barringhaus ve Zamore, 2009). Uzun süreli hipokside NHE-1 ekspresyonunu değiştirebilecek miRNA’ların aydınlatılması fizyopatolojik mekanizmaların anlaşılmasında yarar sağlayabilir.

GEREÇ VE YÖNTEM

Sıçan kardiyak miyositlerin izolasyonu: İzole edilen sıçan kalpleri modifiye Langendorff setup’ına aorttan ters perfüze edilecek şekilde asıldı. İlk olarak içeriği mM olarak 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.25 CaCl2, 1.2 MgSO4, 1.2 KH2PO4, 25 NaHCO3, 10

49

HEPES ve 10 glikoz, pH 7.4 olan ve %100 O2 ile gazlandırılan, Ca

+2’suz perfüzyon

çözeltisi ile 5 dakika yıkandıktan sonra, içine kollajenaz (Sigma Boehringer Colleganase A) (1.1 mg/ml) eklenmiş aynı içerikli çözelti ile 25–30 dakika daha perfüze edilerek hücre izolasyonu yapıldı. Enzimatik olarak parçala-nan kalpler daha sonra mekanik olarak küçük parçalara ayrıştırılıp filtre edilerek bir tübe aktarıldı. Tüpün içerisindeki hücreler Ca

+2’suz solüsyon ile iki kere yıkanarak

kollajenaz ve ölü doku parçalarından arındırıldı. İzole edilen hücrelerin bekletildiği solüsyonun Ca

+2 içeriği dereceli olarak

arttırılarak bu iyonun konsantrasyonu 1.5 mM yapıldı ve 37°C’de bir saat inkübe edildikten sonra deneye alındı.

Hücrelerden NHE aracılı H+

çıkışının ölçülmesi:

1- BCECF yüklenmesi ve kalibrasyonu: Hücre içi pH (pHi) görüntülenmesi BCECF boyasının asetometil esteri (AM) ile yapıldı. Bu boya iki ayrı dalga boyunda uyarılabilen H

+’e duyarlı bir boyadır. HL-1 hücreleri oda

sıcaklığında 10 dk 10 µM BCECF ile inkübe edildi. Hücreler epifloresan mikroskoba (Nikon Eclipse TE 2000 ve PTI D104 görüntüleme sistemi) yerleştirildikten sonra 2 ml/dk hızında perfüze edildi. Boya 440 ve 490 nm’de uyarıldı ve emisyon sinyali 535 nm’de eş zamanlı toplandı. Emisyon sinyalinin pH değerine çevrilebilmesi için HL-1 hücrelerinde in situ nigerisin (K

+/H

+

iyonoforu, 10 µM) kalibrasyonu yapıldı. Daha sonra dört parametreli lojistik denklem ile (Oran= Rmin + (Rmaks-Rmin)/1+ 10

-(pKa-pHo))

kalibrasyon değerlerine eğri fit edildi. Fit eğrisinden emisyon sinyal oranının pH değerine dönüştürülebilmesi için yukarıdaki formülün ters fonksiyonu kullanıldı.

2- Hücre içi doğal tamponlamanın (βi) hesaplanması: Na

+/H

+ aktivitesi ölçülürken

CO2/HCO3- içermeyen HEPES tamponlu

Tirod çözeltisi kullanıldı. Deney prensibi farklı konsantrasyonlarda amonyum çözeltilerinin (30 mM- 0 mM arasında) perfüzyonu ile pHi’de meydana gelen değişikliğin ölçülmesi esasına dayanmak-tadır. Hücre içinde oluşacak H

+ hücre dışı

amonyum konsantrasyonunun bir fonksiyonu olduğu için teorik olarak hesaplanabilmekte ve pratik olarak elde edilen sonuçla arasındaki fark doğal tamponlamayı vermektedir. Deney sırasında NHE değiş-

tokuşu spesifik NHE-1 inhibitörü zoniporid (30 µM) kullanılarak inhibe edildi. HL-1 hücrelerinin tamponlama kapasiteleri βi= Δ [NH4

+]i / Δ pHi ve [NH4

+]i= [NH4

+]o x 10

(pHo-

pHi) formüllerine göre hesaplandı.

Hesaplamada amonyum ayrışmasının pK’sı hücre içi ve dışı kompartmanlarda eşit kabül edildi. Hücre dışı ortamdan amonyum uzaklaştırılması sonucunda oluşacak hücre içi asit miktarındaki artış hücre içi amonyum konsantrasyonunda azalma ile aynı kabul edildi. Elde edilen bu veriler hücre içinde tek tip tampon modeli kullanılarak (βi=ln10[TA]X 10

(pHi-pKa)/(1+10

(pHi-pKa))2 ) ifade edildi.

3- Hücreden NHE aracılı H+ akısının

hesaplanması (JNHE): Amonyum ön-işlemi (20 mM NH4

- uzaklaştırılması) hücreye asit

yüklemekte ve NHE değiş-tokuşcusunu aktive etmektedir. Daha sonra zamana bağlı NHE aracılı pHi’nın normale dönüş eğrisi iki bileşenli bir üstsel azalım fonksiyonuna fit edildi. Fit fonksiyonunun nümerik olarak hesaplanan ters fonksiyonundan farklı pHi değerleri için türevler (dpHi/dt) elde edildi. Farklı pH’lar için (0.05 pH aralıkla) hesaplanan dpHi/dt değerleri aynı pH’daki tamponlama değerleri ile çarpılarak NHE aracılı akı miktarı (JNHE = dpHi/dt X βi) mM/dak cinsinden verildi.

Sıçan izole kardiyomiyositlerinden mitokondri membran potansiyeli, Mg

+2,

reaktif oksijen türevi (ROS) miktarının ölçülmesi: Anoksi ile değişen mitokondri membran potansiyeli JC-1 (Anaspec) (Ex: 490 nm, Em: 530/590) ve doğrudan olmayan (serbest Mg

2+ miktarı üzerinden) hücre içi

ATP miktarı ölçümü için Mag-Fluo-4 (Invitrogen) (Ex: 490 nm, Em: 510 nm) kullanıldı. DCFH-DA (Ex:495 nm, Em:535 nm) ise reaktif oksijen türevi miktarı ölçümü için kullanıldı. Boyalar oda sıcaklığında 20 dk yaklaşık 10 µM konsantrasyonda inkübe edildi.

Sıçan izole kardiyomiyositlerinde akut anoksi ve gerçek hipoksik koşulların oluşturulması: Deney koşullarında akut anoksi azot gazı ile sürekli gazlandırılan süperfüzyon ortamına 1 mM sodyum diatonit (Sigma) eklenmesi ile elde edildi. Sodyum diatonit bir O2 süpürücüsü olup ortamdaki O2 miktarını sıfıra düşürmektedir. Sodyum diatonit kullanılmadan gerçek hipoksik şartlarda (~1 mmHg PO2) yapılan deneylerde hücreler yer çekimi ile süperfüze

49

edildi. Solüsyonlar gaz geçirgen olmayan metal borular ve yarı-gaz geçirgen bağlantılar ile banyo ortamına iletildi. Banyo ortamı havadan oksijen kontaminasyonunu engellemek amacıyla koni biçimli bir adaptör ile üstten sürekli argon gazı ile süpürüldü. Deney sırasında süperfüzyonun oksijen miktarı banyodan sürekli olarak ölçüldü.

Kullanılan solüsyonlar ve maddeler: Hepes tamponlu tirod çözeltisi için (mM): 135 NaCl, 4.5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 11 glukoz, 20 Hepes (pKa: 7.5) kullanıldı. NH4Cl çözeltisi hazırlanırken eşdeğer Na

+ ile yer

değiştirilmiştir. Na+ içermeyen Tirod çözeltisi

için Na+ eşdeğer 145 mM N-metil-D-

glukamin (NMDG) ile yer değiştirildi. Alkali kalibrasyon solüsyonlarına miyozin inhibitörü 2,3-Butandion monoksim (BDM) eklendi. Solüsyonların pH’sı (NMDG solüsyonu derişik HCl ile) derişik NaOH ile 37°C 7.4’e ayarlandı. Deneylerde 2-deoksi-D-glukoz (DOG) kullanılırken 11 mM glukoz ile yer değistirildi.

HL-1 hücre hattının kültür edilmesi: HL-1 (tümör kökenli fare atrial kardiyomiyosit) hücreleri için özel üretilen Claycomb ortamı içerisine 2 mM L-glutamin, 0.1 mM norepinefrin, %10 FBS (fetal sığır serumu), 100 U/ml penisilin ve 100 μM streptomisin eklenerek hücrelerin içerisinde yaşayacağı ve çoğalacağı ortam hazırlandı. Hücreler bu ortam içerisinde, %5 CO2’in bulunduğu, %95 oranında neme sahip olan 37

oC’deki etüvde

kültür edildi. Bu ortam her gün düzenli olarak değiştirildi. Hücrelerin flasklara ekilmesinden önce flaskların içerisine jelatin/fibronektin koyularak bir gece 37

oC’lik etüvde inkübe

edildi ve hücrelerin yüzeye tutunacakları ortam sağlandı. Hücreler üç günde % 90 konfluent durumuna geldikten sonra pasajlandı (%0.05 tripsin/EDTA ile). Deneyde kullanılacak olan hücreler pasajlama işleminde camlara ekildi. Camlar, altı kuyulu plate’lere yerleştirildikten sonra kuyulara jelatin/fibronektin (1’er ml) koyularak bir gece etüvde 37

oC’de inkübe

edildi.

HL-1 hücrelerinde uzun süreli gerçek hipoksik şartların oluşturulması: Uzun süreli gerçek hipoksi şartları gaz geçirgen olmayan kapalı bir kabın (chamber) istenilen miktarda oksijen ile gazlandırılmasından sonra 37°’lik bir etüvde 48 saat bekletilmesi ile oluşturuldu. Chamber’in oksijen içeriği

sürekli olarak oksijene duyarlı bir prob ile kontrol altında tutuldu ve sıklıkla gaz karışımı tazelendi. Chamber’ın içinde elde edilen kısmi oksijen basıncı ortalama 4-5 mmHg (normoksi; 158 mmHg) ölçüldü. Kültür ortamının pH’sının kontrolü için ortamın renk değişimi izlendi.

Protein miktar tayini (Western blot): HL–1 hücreleri lizis tamponu (mM: 20 Tris-HCl (pH:7.4), 150mM NaCl, 2mM KCl, 2mM EDTA, 0.5mM DTT, 100mM proteaz inhibitör karışımı, 0.4mM PMSF, %2 NP-40 ve %1 deoksikolat) ile parçalandıktan sonra 1000 g’de 10 dk +4°C’da santrifüj edildi. Elde edilen süpernatant spektrofotometrede protein sayımı gerçekleştirildikten sonra ölçüm yapmak için kullanıldı. Protein miktar tayini için %8’lik SDS-PAGE jel hazırlandı ve denatürasyondan sonra jel kuyularına yüklenen örneklere elektroforez uygulandı (10 mA’ da 3 saat). Moleküler ağırlıklarına göre jel üzerinde ayrılan proteinler PVDF membrana transfer edildi (200 mA, 2 saat). Transfer işleminden sonra membranlar 1 saat oda sıcaklığında % 2.5 BSA ve TTBS (%20 Tween, 2M Tris (pH:7.6), 11.6 g NaCl 2ml’lik hacimde) ile inkübe edilerek bloklandı. TTBS tamponu ile yıkamadan sonra, membranlar TTBS tampon ve primer antikor (Abcam, 1 µg/ml) ile 1 gece +4 C° de inkübe edildi. Daha sonra yıkanan örnekler TTBS tampon ve sekonder antikor ile 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. İnkübasyon periyodunun sonunda membranlar son olarak tekrar yıkandı. Sekonder antikora bağlı olan peroksidaz enziminin substratı luminol membranın üzerine doğrudan uygulandı ve 5 dakika içerisinde görüntü filme aktarıldı. Β-aktin ve GADPH referans gen olarak kullanıldı.

Toplam RNA İzolasyonu: Kontrol ve hipoksik HL-1 hücrelerinden total RNA izolasyonu için toplam RNA izolasyon kiti (Trizol Reagent, Invitrogen) kullanıldı. Elde edilen RNA miktar tayini Qubit 2.0 (Invitrogen) ile yapıldı. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi: Kontrol ve hipoksik HL-1 hücrelerinden elde edilen 1 μg total RNA’dan, üretici firmanın (DyNAmo cDNA Synthesis Kit, Finnzymes) önerdiği protokol doğrultusunda cDNA sentezi gerçekleştirildi. miRNA’lardan cDNA sentezi için Qiagen miScript Reverse Transcription kiti kullanıldı.

49

Primer Tasarımı: PCR deneylerinde kullanılan spesifik primerler Vector NTI (Invitrogen) programı ile tasarlandı. miRNA ölçümlerinde kullanılan primerler doğrudan Qiagen firmasından temin edildi.

Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR): HL-1 hücrelerinde ilgili genlere ait (NHE-1, NHE-3, NHE-8 ve Na

+/HCO3

- ko-transportörü (NBC))

kontrol ve hipoksik mRNA ekspresyonlarını gösterebilmek için polimeraz zincir reaksiyonu ve analizi gerçekleştirildi. Deneylerde Finnzymes DyNAzyme II DNA Polymerase kiti üretici firma talimatları doğrultusunda kullanıldı.

Gerçek Zamanlı PCR (qPCR): Deneylerde Roche LightCycler 1.2 gerçek zamanlı PCR cihazı kullanıldı. miRNA ekspresyon deneyleri için Qiagen miScript SYBR Green qPCR kiti, diğer gen ekspresyon deneylerinde ise Finnzymes DyNAmo Capillary SYBR Green qPCR Kiti kullanıldı. qPCR deneylerinin sonunda erime eğrisi analizi yapıldı.

Analiz: Kontrol ve hipoksik örneklerden elde edilen hedef mRNA ve miRNA’ların miktarlarının karşılaştırılması ΔΔCt metoduna göre ekspresyon oranı olarak hesaplandı. Bu yöntemde Ct çoğaltılan mRNA ya da miRNA kopyalarının sabit bir şekilde artmaya başladığı (doğrusal faz) eşik siklustur. mRNA miktar tayininde β2-mikroglobulin ve GADPH, miRNA miktar tayininde ise RNU6B, SCA17 endojen referens gen primerleri kullanıldı. Gerçek zamanlı PCR ölçümlerinde hedef ve referans gen primerlerinin verim analizleri gerçekleştirildi (Pfaffl, 2001). Tüm sonuçların istatistiksel değerlendirmeleri için Student’s t-test (p<0.05) kullanıldı.

Biyoinformatik araçların kullanımı: NHE 3’ UTR bölgesini hedef alabilecek miRNA’ların belirlenmesinde veri bankaları ve hedef şeçme araçları miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk), TargetScan(http://www.targetscan.org) ve Vector NTI (Invitrogen) programı kullanıldı. Mikrodizin analizi: Kontrol ve hipoksik HL-1 hücrelerinden elde edilen 1 µg total RNA’ya poli A kuyruğu takılması işleminden sonra biotin ile işaretlenmiş sinyal molekülleri bağlandı. Daha sonra hibridizasyon işlemi (48°C, 60 rpm, 16 saat) hedef miRNA’lara

komplementer nükleotid segmentleri içeren mikroçipler üzerinde (Affymetrix) yapıldı. Elde edilen floresan resimler tarayıcı ile toplandıktan sonra ışıma şiddetleri hesaplandı. Data özeti, normalizasyon, kalite kontrol işlemleri MicroRNA QC tools (ver. 2.0, Affymetrics) yazılımı kullanılarak yapıldı. Aynı yazılım ile ham datadan arka plan düzeltme, medyan parlatma ve log2 dönüşümü gerçekleştirildi. Daha sonra istatistiksel analiz için Student’s t-test uygulandı.

BULGULAR

1. İzole sıçan kardiyomiyositlerinde akut anoksinin (5-9 dk) NHE-1 aracılı H

+

atılımına etkisi

İskeminin ana komponentlerinden birisi ortamdaki oksijen konsantrasyonunun azalması ya da olmamasıdır (anoksi). Anoksinin NHE-1 aktivitesi üzerindeki etkisi izole sıçan kardiyomiyositlerinde sabit hücre dışı pH’da (7.4) test edildi. Bunun için pH duyarlı problar SNARF-1AM ve BCECF-AM boyaları kullanıldı. Anoksik koşullar (1 mM Na+ diatonit ve %100 N2) SNARF-1 boyasında artefak oluştururken BCECF boyası ile bu durum gözlenmedi. Bu nedenle deneylerde BCECF boyası kullanıldı. 1 mM Na+ diatonit eklenmesi ve nitrogen gazı ile gazlandırma solüsyonların pH’sını değiştirmedi. Akut anoksi (5-9 dk), hücreden NHE-1 aracılı H+

çıkışının pH duyarlılığını sola kaydırdı (NHE-1 aktivitesinde azalma) (Şekil 1a, d). Anoksinin NHE-1 aktivitesini azaltması zamana bağlı olarak 5. dk’dan itibaren başlarken, ilk 2 dk süresince anoksi uygulanması NHE-1 aktivitesini değiştirmedi (Şekil 1b, d). Anoksi uygulanması ile bazı hücrelerde bazal durumda geçici bir alkalozis oluştu ancak hücre içi asidik iken bu durum gözlenmedi (Şekil 1c). Reoksijenasyondan ~15 sn sonra anoksinin oluşturduğu inhibisyon kontrol değerlerine geri döndü. Reoksijenasyon başlangıcında geçici bir asidozis gözlendi (Şekil 1a, e).

49

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

Kontrol (n:9)

Reoksijenasyon (n:5)

pHi 6.9

JN

HE (

mM

/dk)

a

c e

b d

Şekil 1. Aynı hücrede NH4Cl ile hücre içine asit

yüklenmesinden sonra anoksi (1 mM Na+ diatonit ve

%100 N2) varlığında ya da yokluğunda pHi’nin NHE-1 aracılı hücre içi asiti dışarı atışını gösteren trase (a). 2 dk süreli anoksinin NHE-1 aktivitesinde azalma yapmadığını gösteren örnek trase (b). Anoksi bazal durumda geçici alkalozis oluşturdu ancak hücre asidik iken (pHi~6) pHi’yı daha fazla düşürmedi (c). A’da ölçülen hücre içi asitin normale dönüş eğrilerinin kontrol ve anokside NHE-1 akısına (JNHE) dönüştürülmüş şekilleri (d). Reoksijenasyon-dan ~15 sonra NHE-1 aktivitesi (e).*,† p<0.05

kontrole göre karşılaştırıldığında.

6

6.5

7

7.5

8

8.5

6.5

7

6

8.5

7.5

8

pHi

6

6.5

7

7.5

8

8.5

6.5

7

6

8.5

7.5

8

pHi

1 mM Na diatonit + 100% N2

Hepes tamponlu tirod

20 mM NH4Cl

20 mM NH4Cl

20 mM NH4Cl

4 dk

Ora

n 4

40

/49

0

5 dk -0.1

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

0Na



20 mM NH4Cl

6.55 6.65 6.75 6.85 6.95 7.05 7.15 7.250

10

20

30

40Kontrol (n:9)

9 dk anoksi (n:7)

5 dk anoksi (n:5)

2 dk anoksi (n:5)*

*

*

*

*

*

* Kontrol vs 9 dk anoksi,

p<0.05

**

†

†

†

†

†† Kontrol vs 5 dk anoksi,

p<0.05

[pH]i

JN

HE (

mM

/min

)5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

pHi

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8

pHi


Kariporid (30 µM)


4 dk 20 mM NH4Cl

49

2. Akut anoksiye bağlı hücre içinde asit oluşması ve anoksinin hücre içi doğal tamponlama kapasitesine (βi) etkisi

Hücreden asit dışarı atılımının 30 µM selektif NHE-1 inhibitörü kariporid ile bloke edildiği durumda anoksinin hücre içinde asit oluşumuna yol açtığı görüldü (Şekil 2a, b). Ancak bu artış ihmal edilebilecek kadar az

olduğu için ( 0.5 mM/dk) NHE-1 aracılı H+

akısı eğrilerinden çıkartılmadı. Anoksik koşullarda hücrenin doğal tamponlama kapasitesinde oluşabilecek değişiklik NHE-1 aktivitesini değiştirebileceğinden anoksik koşullarda hücrenin doğal tamponlama kapasitesi ölçüldü ancak kontrole göre anlamlı bir fark bulunmadı (Şekil 2c). Benzer şekilde, anoksik koşullarda Cl

- bağımlı hücre

içine asit yükleyicilerin (Cl- -HCO3

- değiş-

tokuşcusu, Cl- -OH

- değiş-tokuşcusu)

aktivitelerinde olası bir artış da NHE-1 aktivitesini anoksinin etkisinden bağımsız olarak azaltacağından deneyler Hepes çözeltilerinden Cl

- iyonu çıkartılarak

tekrarlandı. Cl-

iyonunun uzaklaştırılması anoksi ile indüklenen NHE-1 inhibisyonunu değiştirmedi (Şekil 2d).

a

c

3. İzole sıçan kardiyomiyositlerinde gerçek hipoksinin (~1 mm Hg PO2) NHE-1 aracılı H

+ atılımına etkisi

Akut anokside gözlendiği gibi gerçek hipoksik şartlar da (Na

+ diatonit eklenmeden

sadece perfüzyon solüsyonlarının %100 N2 ile gazlandırılması ile) hücre içine asit yüklenmesinden sonra pHi’nin normale dönüş eğrisinin eğimini (dpHi/dt) ve dolayısı ile hücreden NHE-1 aracılı H

+ çıkışını

kontrole göre azalttı (pHi: 6.85) (Şekil 3a, b).

4. Oksidatif ve glikolitik inhibitörlerin NHE-1 aracılı H

+ atılımına etkisinin

karşılaştırılması

Anoksi yerine hücre solunumu 9 dk süresince iyodoasetat (0.5 mM, glikoliz ve oksidatif fosforilasyonu birlikte inhibe eder) ya da mitokondride solunum zincirini farklı yerlerde bloke eden oksidatif fosforilasyon inhibitörleri (miksotiazol, rotenon, 10

-6 M;

antimisin A, 5 µg/ml) ile inhibe edildiğinde anoksinin etkisinin taklit edildiği ve NHE-1 aktivitesinin azaldığı görüldü. Ancak diğer bir glikoliz inhibitörü DOG NHE-1 aktivitesini değiştirmedi (Şekil 4a,b)

b

d

6.55 6.65 6.75 6.85 6.95 7.05 7.15 7.250

10

20

30

40Kontrol (n:9)

9 dk anoksi (n:7)

9 dk anoksi 0Cl (n:5)

Kontrol 0Cl (n:7)*

* Kontrol vs 9 dk anoksi 0Cl, p<0.05

*

*

*

*

*

[pH]i

JN

HE (

mM

/min

)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8Kariporid (n:3)

Kariporid+anoksi(n:6)

*

JH+

(m

M/d

k)

y = -0.0001x + 7.2657

y = -0.0005x + 7.28997.05

7.1

7.15

7.2

7.25

7.3

7.35

Kariporid+Anoksi

Kariporid

y = -0.0001x + 7.2657

y = -0.0005x + 7.28997.05

7.1

7.15

7.2

7.25

7.3

7.35

Kariporid+Anoksi

Kariporid

pHi

6.0 6.5 7.0 7.5 8.00

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Kontrol

Anoksi

pHi

βi (m

M/p

H)

Şekil 2. Anoksinin H+ dışarı çıkışı kariporid ile bloke edildiğinde hücre içinde asit oluşturduğunu gösteren

örnek trase (a). Anoksi ile indüklenen hücre içi asit oluşumunun hesaplanmış şekli (b). Hepes tamponlu süperfüzyon solüsyonundan kademeli olarak amonyum uzaklaştırılarak hesaplanan doğal tamponlama kapasitesinin (βi) pHi’nin bir fonksiyonu olarak gösterilmesi (c). Hepes süperfüzyon solüsyonundan Cl

-

iyonunun uzaklaştırılması sonrasında tekrarlanan anoksi deneylerine ait grafik (d). *p<0.05 kendi kontrollerine göre karşılaştırıldıklarında.

49

6.55 6.65 6.75 6.85 6.95 7.05 7.15 7.250

10

20

30

40

Kontrol (n:9)

9 min anoksi (n:7)

DOG (n:6)

IAA (0.5 mM) (n:4)

*

* Kontrol vs IAA, p < 0.05

[pH]i

JN

HE (

mM

/min

)

a

b

Şekil 3. Gerçek hipoksinin (sadece %100 N2 ile

gazlandırılan süperfüzyon solüsyonları) amonyum ön işlemi sonrasında pHi‘nin normale dönme eğrisinin eğimi (dpHi/dt) (a) ve NHE-1 akısı (pHi 6.85) (b) üzerine etkisi. *p<0.05 kontrole göre karşılaştırıldığında.

5. Akut anoksinin (5-9 dk) mitokondri membran potansiyeli ve hücre içi ATP miktarına etkisi

Anoksi yavaş ve geri dönüşümlü olarak mitokondri membran potansiyelini depolarize etti (plato: 8.3 ± 0.98 dk, n=4) (Şekil 5a). Mitokondrial elektron transferi-fosforilasyon arasındaki kenetlenmeyi bozan karbonil siyanür-p-triflorometoksifenilhidrazon(FCCP; 5 µM) ise hızlı (plato: 32 ± 3.9 sn n=3) ve geri dönüşümsüz bir depolarizasyon oluşturdu (Şekil 5b). Daha sonra hücre içi ATP miktarının indirekt ölçüm metodu olan Mag-Fluo-4 boyası ile görüntüleme yapıldı. Bu yöntemde Mg

+2-ATP birlikte

bulunduğundan serbest Mg+2

miktarındaki artışın büyük kısmının ATP’nin tüketilmesine bağlı olduğu ön görülmektedir. FCCP (5 µM) ve 2,4-dinitrofenol (DNP; 1 mM) saniyeler içerisinde ATP’yi tüketirken, anoksi uygulanması 9 dk içerisinde ATP konsantrasyonunu daha az düşürdü (Şekil 5c). DNP bazal pHi’yı aside kaydırırken, NHE-1 aktivitesini tamamen inhibe etti (Şekil 5d, e).

a

b

Şekil 4. Anoksi için uygulanan protokoller

tekrarlanarak solunumun çeşitli glikoliz (a) ve oksidatif fosforilasyon inhibitörleri (b) ile bloke edilmesinin NHE-1 aktivitesi üzerine etkileri. *,† p<0.05 kendi kontrollerine göre karşılaştırıl-dıklarında.

6. Serbest radikal süpürücüsü 2-merkaptopropionil glisin (MPG) ve antimisin A’nın NHE-1 aracılı H

+ atılımına

etkisinin karşılaştırılması

Mitokondri oksidatif fosforilasyon inhibitörlerinin reaktif oksijen türevleri (ROS) oluşturma potansiyelleri ve NHE-1 fonksiyonunun hücre içi ROS miktarı ile değişebileceği göz önünde bulunduruldu ancak kontrol koşullarında (%21 O2) ROS süpürücüsü MPG (300 µM) varlığında NHE-1 aktivitesi değişmedi (Şekil 6a). Ayrıca, kontrol koşullarında NHE-1 aktivitesini azaltan antimisin A (5 µg/ml) ROS oluşturdu (Şekil 6b).

0.0

0.5

1.0Hipoksi(~1 mmHg PO2)

Eslesmis kontrol

*

pHi (ortalama 6.85)

Norm

alize e

gim

0

5

10

15

20

25Hipoksi (~1 mmHg PO2)

Eslesmis kontrol (n:4)

*

pHi (ortalama 6.85)

JN

HE

(mM

/dk)

6.55 6.65 6.75 6.85 6.95 7.05 7.15 7.250

10

20

30

40

9 min anoksi (n:7)

Miksotiazol (10-6

M) (n:7)

Rotenon (10-6

M) (n:3)

Kontrol (n:9)

*

* Myxothiazol, Antimisin A vs control, p < 0.05

*

*†

†

† Rotenone vs control, p < 0.05

Antimisin A (5 ug/ml) (n:3)

[pH]i

JN

HE (

mM

/min

)

p < 0.05

49

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

10

20

30

40

50

60

70

80

90

DT (1 mM) (n:3)

DNP (1 mM) (n:3)

FCCP (5 M) (n:3)

DOG ile sinyal artisi yok (n:4)

Dakika

% M

g-F

luo-4

flore

sanin

daki art

is

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

Ora

n 5

30/5

90

FCCP 5 µM

1 dk

a

b

c

d

e

Şekil 5. JC-1 boyası kullanılarak anoksi protokolü

sırasında (a) veya FCCP varlığında (b) mitokondri membran potansiyelinin değişimi. Mag-Fluo-4 boyası kullanılarak doğrudan olmayan hücre içi ATP ölçümleri (c). Bazal (d) ve amonyum ön işlemi sonrasında hücreye asit yüklendikten sonra (e) DNP’nin etkisini gösteren traseler.

a

b

Şekil 6. Normal koşullarda (%21 O2) MPG

varlığında NHE-1 aktivitesini gösteren örnek trase (a). DCFH-DA (Ex:495 nm, Em:535 nm) boyası ile antimisin A’nın ROS oluşumuna yol açtığını gösteren örnek trase (b). n:4-5.

7. HL-1 hücrelerinde NHE aracılı H+ atılımı

özelliklerinin belirlenmesi

HL-1 hücrelerinde süperfüzyon solüsyonun-dan sodyumun uzaklaştırılması (NHE aktivitesinin tamamen inhibe olduğu durum) ve spesifik NHE–1 inhibitörü zoniporid (30 µM) büyük ölçüde hücrenin asiti dışarı atmasını bloke etti (Şekil 7a, b). HL–1 hücrelerinde ekspresyonu olabileceği düşünülen NHE izoformlarının varlığı PCR reaksiyonu ile test edildi ve NHE-1, NHE-8 ve Na

+/HCO3

- ko-transportunun (NBC)

mRNA’ları bulundu (Şekil 7c, d). Bu sonuçlara göre HL–1 hücrelerinde H

+ dışarı

atılımından sorumlu ana izoform NHE–1’dir.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

Ora

n 5

30/5

90 Anoksi

Reoksijenasyon

4 dk

rigor

4

dk

6

6.2

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

0 50 100 150 200 250 300 350 400

6.2

6.4

6.6

6.8

7.6

7

7.2

7.4

7.8

6

6.2

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

0 50 100 150 200 250 300 350 400

6.2

6.4

6.6

6.8

7.6

7

7.2

7.4

7.8

6.2

6.4

6.6

6.8

7.6

7

7.2

7.4

7.8

DNP (1

mM)

pHi


rigor pHi

6.4

6.6

6.8

7

7.8

7.2

7.4

7.6

8

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

0 50 100 150 200 250 300 350

6.4

6.6

6.8

7

7.8

7.2

7.4

7.6

8

6.4

6.6

6.8

7

7.8

7.2

7.4

7.6

8

6.4

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8

8

0 50 100 150 200 250 300 350DNP (1 mM)

20 mM NH4Cl

1 dk


4 dk

MPG (300 µM)

Ora

n 4

40/4

90

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

0.65

0.7


6 dk

H2O2 (1 mM)

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

0 100 200 300 400 500 600 700 800

Antimisin A (5 µg/ml)

Em

: 535 n

m

49

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8 3 dk

5

5.5

6

6.5

7

7.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

8 3 dk

5

5.5

6

6.5

7

7.5

5

5.5

6

6.5

7

7.5

pHi


0Na

3 dk 20 mM NH4Cl

5 dk

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8 5 dk

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

7.8 5 dk

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6

6.6

6.8

7

7.2

7.4

7.6


Zoniporid (30 µM)

pHi

20 mM NH4Cl

20 mM NH4Cl

20 mM NH4Cl

0

5

10 20

[NH4+]0

(mM)

pHi

5.5

6

6.5

7

7.5

5.5

6

6.5

7

7.5

83 dk

5.5

6

6.5

7

7.5

5.5

6

6.5

7

7.5

5.5

6

6.5

7

7.5

83 dk


Zoniporid (30 µM )

3 dk

JN

HE

(m

M/d

k)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

6,55 6,65 6,75 6,85 6,95 7,05

pHi

48 s hipoksi

Kontrol

a

b

c

d

Şekil 7. Ortamdan Na+ uzaklaştırıldığında NHE

aracılı asit atılımı (a). Aynı hücreden arka arkaya alınan amonyum ön işlemi sonrasındaki NHE aktivitesi. 3’lü trasenin son kısmında ortamda zoniporid (30 µM) varken NHE büyük ölçüde inhibe olmaktadır (b). HL-1 Hücrelerinde NHE-1 (c), NHE-3, NHE-8 ve NBC (d) ekspresyonlarının %1.5 lik agaroz jelde gösterilmesi. Sonuçlarda NHE-3 ekspresyonu gözlenmemiştir. NK negatif kontrol.

8. HL-1 hücrelerinde uzun süreli gerçek hipoksinin (48 saat, PO2: 4-5 mmHg) hücre içi doğal tamponlama kapasitesi (βi) ve NHE-1 aracılı H

+ atılımına etkisi

48 saat hipoksi HL-1 hücrelerinin tampon-lama kapasitesini anlamlı olarak değiştirmedi (Şekil 8a, b) Elde edilen bu veriler hücre içinde tek tip bir tampon kullanılarak ifade edildi (hücre içi tampon=84.35 mM, pKa=6.58). Akut anoksideki duruma benzer şekilde uzun süreli hipoksi de NHE-1 aktivitesinde azalma oluşturdu (Şekil 8c). Bu etki deney yapıldığı süre boyunca (yaklaşık 30 dk) geriye dönmedi.

a

b

c

Şekil 8 HL-1 hücrelerinde hücre içi doğal

tamponlama deneyi (a). Kontrol ve 48 saat hipokside tutulmuş hücrelerde doğal tamponlama kapasitesinin (βi) pHi’nin bir fonksiyonu olarak gösterilmesi (b). Kontrol ve anokside NHE-1 akılarını (JNHE) gösteren grafik (c). p<0.05, n=7-10.

NHE-1NHE-1

200 bp

NK NHE-3 NHE-8 NBCNK NHE-3 NHE-8 NBC

0

10

20

30

40

50

60

6,5 6,7 6,9 7,1 7,3 7,5 7,7 7,9 8,1 8,3

Kontrol

48 s hipoksi

βi (m

M/p

H)

pHi

49

48 s hipoksi HL-1

Kontrol NHE-10.0

0.5

1.0

*

NH

E-1

pro

tein

mik

tari

-4 -3 -2 0-1 321 4 5

48 s hipoksi HL-1 miRNA mikrodizin analizi

0

1

2

3

4

5

6

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

log2(ekspresyon oranı)

-lo

g(p

de

ğe

ri)

miR-B

miR-C

1

2

3

4

5

6

-4 -3 -2 0-1 321 4 5-4 -3 -2 0-1 321 4 5

48 s hipoksi HL-1 miRNA mikrodizin analizi

0

1

2

3

4

5

6

-4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

log2(ekspresyon oranı)

-lo

g(p

de

ğe

ri)

miR-B

miR-C

1

2

3

4

5

6

1

2

3

4

5

6

-lo

g (

p d

eğ

eri

)

-log2 (ekspresyon

oranı)

9. HL-1 hücresinde 48 saatlik uzun süreli gerçek hipoksinin NHE-1 protein düzeyi ve miRNA ekspresyon profili üzerine etkisi

Uzun süreli hipoksi ile tamponlama kapasitesinde anlamlı bir değişiklik gözlenmedi. Dolayısı ile NHE-1 aktivitesinde gözlenen azalmadan protein miktar değişik-likleri sorumlu olabilir. 48 saatlik hipoksi NHE-1 protein seviyesinde kontrole göre ~%60’lık bir azalma oluşturdu (Şekil 9a).

a

b

c

d

5’...TCCCACAG – NHE-1 3’UTR

:|:|||||

3’...UGCGUGUC – miR-B

5’...AGGCACAC – NHE-1 3’UTR

|:|||||:

3’...UGCGUGUC – miR-B

Hedef seçme araçları ve literatür bilgisi kullanılarak NHE-1 3’UTR’sine bağlanabile-cek bazı potansiyel miRNA’lar belirlendi (Şekil 9b). Potansiyel eşleşme gösteren miRNA’ların uzun süreli hipoksi sonrası ekspresyon profillerini görmek ve hipoksi sonrası ekspresyonları artan, NHE-1 mRNA’sı ile eşleşme gösterebilecek diğer miRNA’ları saptamak için mikrodizin analizi gerçekleştirildi. Uzun süreli hipoksinin miRNA ekspresyonlarını değiştirdiği görüldü (Şekil 9c). Mikrodizin analizi sonrası miR-B’nin NHE-1 protein seviyesindeki azalmadan sorumlu olabilecek en uygun aday olduğuna karar verildi (Şekil 9d).

Şekil 9. Kontrol ve 48 saat hipoksi sonrasında NHE-1 protein seviyeleri *, p<0.05 kontrole göre, n=3-6. (a). Hedef seçme algoritmaları kullanılarak NHE-1 mRNA’sının 3’UTR bölgesine (translasyona uğramayan 3’ ucundaki bölge) ilk sekiz nükleotitden (seed sequence) bağlanması öngörülen miRNA’ların şematik gösterimi. Hatalı eşleşme sayıları (mm) parantez içerisinde verilmiştir. (b). 48 saat hipoksi sonrasında miRNA’ların kontrol grubuna göre karşılaştırılması. Grafikte x-ekseni kontrol ortalamasına göre hipoksi grubunda artan ya da azalan miRNA’ları, y-ekseni ise istatistiksel anlamlılığı göstermektedir. Kesikli çizgiler %50 kat değişiklik ve p<0.05 sınırını göstermektedir. Oklar şekil 9b’de NHE-1 3’UTR bölgesine bağlanma potansiyeli öngörülen miRNA’ları göstermektedir (miR B, C). miRNA probları insan, sıçan ya da fare nükleotid dizilerine komplementerdir (kontrol n=3; hipoksi n=4) (c). miR-B’nin seed sekansının NHE-1 3’ UTR bölgesindeki eşleşmelerine iki örnek. Gri bölgeler seed sekansı göstermektedir (d).

10. HL-1 hücrelerinde uzun süreli gerçek hipoksinin NHE-1 mRNA ve hedef miRNA düzeylerine etkisi

İlgilenilen miRNA’ların mikrodizin analizi sonuçları gerçek zamanlı PCR (qPCR) ile test edildi. Mikrodizin analizi ve qPCR datasının paralellik gösterdiği bulundu (Şekil 10a). Uzun süreli hipoksi NHE-1 ve 8 mRNA seviyelerini azalttı (Şekil 10b).

49

Kontrol miR-A miR-B miR-C0

1

2

3

48 s hipoksi HL-1

*

7.5

10.0

12.5

*

miR

NA

ekspre

syon

ora

nla

ri

Kontrol NHE-1 NHE-80.0

0.5

1.0

48 s hipoksi HL-1

*

*

NH

E-1

mR

NA

eksp

resyo

n o

ran

i

a

b

Şekil 10. 48 saatlik hipoksi sonrasında HL-1

hücrelerinde ΔΔCt metoduna göre hesaplanmış normalize hedef miRNA (a) ve NHE-1, 8 mRNA (b) ekspresyon oranları. *p<0.05 kontrole göre, n=4-6.

TARTIŞMA VE SONUÇ

Bulgularımıza göre kardiyomiyositlerde akut anoksi NHE-1 aktivitesinde azalmaya yol açmaktadır. NHE-1 aktivitesindeki azalma gerçek hipoksik koşullarda da görüldüğünden anoksi için kullanılan sodyum diatonitin artefakt oluşturmadığına karar verildi. Sonuçlarımızla paralel olarak, akut hipoksinin farklı dokularda (eklem kondrositleri) da NHE aktivitesinde azalmaya yol açtığı bildirilmiştir (Gibson ve diğ., 2009). NHE-1 aktivitesindeki azalma anoksinin hücre içi asit oluşturması, tamponlama kapasitesini artırması ya da Cl

- bağımlı asit

yükleyicilerin (Cl-/HCO3

-, Cl

-/OH

-)

hızlarındaki artış ile açıklanamamaktadır (Şekil 1 ve 2). Deneylerimizde gözlemlediğimiz NHE-1 aktivitesindeki azalma aynı zamanda mitokondri ATP üretim fonksiyonunu durduran farklı inhibitörlerle de (oksidatif ve glikolitik inhibitörler) taklit edildi. Ancak glikolitik ve oksidatif inhibitör olan DOG 10 dk içerisinde diğer solunum inhibitörleri gibi NHE-1 aktivitesinde azalmaya yol açmadı. Daha

önce doğrudan hücre içi ATP (ATPi) ölçümü bulgularımıza göre, ATPi miktarını rotenon ve antimisin A uygulaması hızla azaltmakta, DOG ise ancak 45 dk sonra ATPi miktarını düşürmektedir. Bu çalışmada da akut anoksi ATPi’yi hızla azaltmakta, DOG ATPi’de herhangi bir değişiklik oluşturmamaktadır (Şekil 5c). DOG’nin 10 dk içerisinde NHE-1 aktivitesini etkilememesi ATPi miktarını azaltmaması ile açıklanabilir. Bu bulgular ile korele olarak, fosforilasyon kenetini bozan DNP hücre içinde asit oluşturması ve kısa bir süre kullanılabilmesi gibi kısıtlamalara rağmen NHE-1 aktivitesini tamamen inhibe etti (Şekil 5d, e). Benzer şekilde anoksi protokolü mitokondri membranını depolarize ederken, reoksijenasyon ile hızlı repolarizas-yon oluştu (Şekil 5a). Mitokondri membran potansiyelinin repolarizasyonu NHE-1 reaktivasyonu datası ile korelasyon göster-mektedir. Bu sonuçlar ATPi’nin NHE-1 aktivitesindeki azalmadan sorumlu molekül olabileceğini akla getirmektedir. NHE aracılı değiş-tokuşun direkt enerji kullanılmadan Na

+ ve H

+’in elektrokimyasal gradientlerini

kullanarak pasif olarak gerçekleştiği bilinmektedir. NHE aracılı iyon transportunun ATPi’ye ihtiyaç duymadığı plazma membran veziküllerinde ATP’siz ortamda NHE’nin aktivitesini sürdürebilmesinden anlaşılmıştır (Murer ve diğ., 1976; Kinsella ve Aronson, 1980). Ancak canlı hücrelerde, bulgularımız-la paralel bir biçimde, ATPi’nin miktarının azaltılması hücre tipine bağlı olarak çeşitli oranlarda NHE inhibisyonuna yol açmaktadır (Kapus ve diğ., 1994; Levine ve diğ., 1993). ATPi’nin NHE’yi nasıl regüle ettiğinin mekanizması henüz aydınlatılamamış ve bu konuda farklı hipotezler ortaya atılmıştır (Aharonovitz ve diğ., 1999). Daha önceki çalışmaların deney koşullarında ATP etkisinin pHi’nın ve transmembran Na

+

gradientinin sabit tutulmasına rağmen devam ettiği görülmüştür (Demaurex ve diğ., 1997). Dolayısı ile ATPi’nin etkisinin Na

+ ve

H+

elektrokimyasal gradientlerinin değişme-sine bağlı olmadığı öne sürülmüştür. Diğer bir çalışmada bazal koşullarda hücrelerde NHE-1 izoformunun fosforile konumda olduğu bildirilmiştir (Sardet ve diğ., 1990, 1991). Bu bulguya dayanarak, ATP’nin boşaltılması ile gözlenen NHE inhibisyonu-nun yapısal fosfat gruplarının kaybından kaynaklandığı öne sürülmüştür. Ancak, ATPi kısa süreliğine boşaltıldığında NHE’nin fosforilasyon durumunda değişme olmadan

49

da inhibisyon gözlenmektedir (Goss ve diğ., 1994). Benzer şekilde, fosforilasyon bölgeleri olmayan NHE-1 mutantlarında ATPi’nin boşaltılması da NHE’yi inhibe etmektedir (Wakabayashi ve diğ., 1994). ATP’nin NHE üzerindeki direkt regüle edici etkisi ATPi miktarının doğrudan değiştirilebildiği bir deney metodu ile Demaurex ve diğ. (1997) tarafından gösterilmiştir. Ancak, izole memeli kardiyomiyositlerinde akut anoksi veya gerçek hipoksinin yaptığı NHE-1 inhibisyonunda ATP’nin katkısı için doğrudan kanıt bulunmamaktadır. Gibson ve ark. (2009) ise hipoksinin NHE aktivitesi üzerindeki yavaşlatıcı etkisinin ATPi’den bağımsız olduğunu ve hipoksi sırasında azalan reaktif oksijen türevlerinin NHE aktivitesindeki azalmadan sorumlu olduğunu öne sürmüşlerdir. Araştırmacılar, antimisin A’nın azalan oksijen seviyesi yüzünden düşen ROS miktarını artırdığını böylece hipoksi ile indüklenen NHE inhibisyonunu geri çevirdiğini bildirmişlerdir. ROS hipotezine göre, antimycin A mitokondrinin iki membranı arasındaki boşluğa doğru süperoksit anyonu oluşturarak NHE aktivitesini regüle etmektedir. Diğer oksidatif inhibitörler (rotenon ve miksotiazol) mitokondrinin matriks tarafına doğru süperoksit oluşturdukları için mitokondride bol bulunan antioksidanlar tarafından süperoksidin indirgendiği dolayısı ile bu inhibitörlerin NHE üzerinde regülasyonlarının bulunmadığı öne sürülmüştür. Antimisin A’nın ROS ürettiği bulgusu bu çalışmada da gözlenmiştir (Şekil 6b). Ancak antimisin A kondrositlerdeki etkisine ters bir şekilde kardiyomiyositlerde kontrol koşullarda (normoksik) NHE-1 aktivitesini azaltmaktadır (Şekil 4b). Ayrıca, normoksideki bazal ROS’un NHE-1 aktivitesi üzerindeki etkisini test etmek amacıyla ROS süpürücüsü MPG kullanıldı ancak NHE-1 aktivitesi değişmedi (Şekil 6a). Tüm bu sonuçlar, hipokside görülen NHE-1 aktivitesindeki yavaşlamanın ROS oluşumundaki değişikliklerden kaynaklanmadığını öne sürmektedir.

Elde edilen sonuçlara göre, akut anoksi ve hipoksi, kardiyomiyositlerde hızlı olarak NHE-1 aktivitesini azaltmakta (10 dk) ve reoksijenasyon ile bu azalma hızlı bir şekilde

geriye dönmektedir (30 s). Bu bulgu HL-1 hücresinde yapılan ön deneylerde de gözlendi. Ayrıca, reoksijenasyon sırasında diğer çalışmalarda da gözlenen geçici asidozis oluştu (Bright ve diğ., 1992). Kronik

hipoksinin uygulandığı şartlarda ise, HL-1 hücrelerinde NHE-1 aktivitesi benzer şekilde azalırken, bu azalma reoksijenasyon ile hemen geriye dönmedi (yaklaşık 30 dk). Bu sonuçlar, akut ve kronik hipoksideki NHE-1 aktivitesindeki azalma ve reaktivasyon mekanizmalarının farklı olabileceğini düşündürmektedir. Anderson ve diğ. (2009) tarafından HL-1 hücre kültüründe 5 saatlik hipoksi sonucunda NHE-1 izoformunun mRNA ve protein seviyesinde azalma meydana geldiği bildirilmiş ancak mekanizması belirtilmemiştir. Diğer taraftan, pulmoner arter düz kas hücrelerinde 48 saatlik hipoksi NHE aktivitesinde artışa yol açmaktadır. Ayrıca bu çalışmada, NHE-1 protein ve mRNA seviyelerinin de yükseldiği bulunmuştur (Shimoda ve diğ., 2006). Bizim bulgularımızla paralel bir biçimde Milner ve diğ. (2006) kondrositlerde uzun süreli hipoksinin (3 saat) NHE aktivitesini inhibe ettiğini göstermişlerdir. Diğer bir çalışmada, miyokard enfarktüsü sonrası enfarkt oluşmayan alanda NHE-1 mRNA ve protein seviyelerinin azaldığı bildirilmiştir (Shimohama ve diğ., 2002). Bu çalışmadaki bulgular da uzun süreli hipokside NHE-1 mRNA ve protein seviyesinin azaldığını göstermektedir (Şekil 9a, 10b). Tüm bu sonuçlar uzun süreli hipoksi ile NHE-1 aktivitesinde gözlenen azalmanın protein seviyesinde azalmaya bağlı olabileceğini düşündürmektedir. Paralel bir şekilde NHE-1 ekspresyonunu değiştirebilecek hedef belirlediğimiz bazı miRNA’lar korele bir şekilde artış göstermektedir (Şekil 9b, d ve Şekil 10a). Artan hedef miRNA’lar NHE-1 mRNA’sı ile kompleks oluşturarak ekspres-yonunu baskılayabilirler. Ancak bu çalışmadaki fonksiyonel bulgularımız uzun süreli hipoksi ile antiporterin pH duyarlılığın-da azalma (sola kayma) olduğunu göster-mektedir. Amonyum ön işlemi hücre içine NHE değiş-tokuşcusunun maksimum hızının ölçülmesine imkan verecek kadar hücreye asit yükleyememekte ve NHE-1 akı eğrilerin-den protein miktar değişiklikleri hakkında fikir verebilecek maksimum transport hızı anlaşılamamaktadır. Dolayısı ile bulgularımı-zı, uzun süreli hipokside protein ekspres-yonunda azalma ya da NHE-1’in H

+’e olan

afinitesinde azalma ile açıklamak mümkün-dür. Ayrıca, akut anoksik koşulların aksine uzun süreli hipokside hipoksi ile indüklenen faktör-1α’nın (Hif-1α) NHE aktivitesindeki rolünün de aydınlatılması faydalı olacaktır.

49

Destek

Bu çalışma TÜBİTAK (2214-Yurt dışı araştırma burs programı), British Heart Foundation Programme Grant (Postdoctoral Research Scientist-Prof. R. D. Vaughan-Jones), TÜBİTAK BMBS COST TD0901 (B.Turan) ve A.Ü. BAP 11B3330004 (H.B. Kandilci) tarafından desteklenmiştir.

Teşekkür

Bu çalışmaların yürütülmesindeki katkı ve desteklerinden dolayı Prof. Dr. Belma Turan, Prof. Richard D. Vaughan Jones, Prof. Dr. Mehmet Uğur, Prof. Dr. Özlem Uğur, Doç. Dr. Hilal Özdağ, Dr. Pawel Swietach, Dr. Francisco C. Villafuerte, Dr. Figen A. Çiçek, Uzm. Biyolog Esma N. Okatan, Uzm. Biyolog Samet S. Yıldırım, Uzm. Biyolog Nilgün Tekin ve Mr. Philip Cobden’e teşekkür ederim.

KAYNAKLAR

Aharonovitz, O., Demaurex, N., Woodside, M., Grinstein, S. (1999) ATP dependence is not an intrinsic property of Na+/H+ exchanger NHE1: requirement for an ancillary factor. Am J Physiol 276(6 Pt 1): C1303-11.

Andersen, AD., Poulsen, KA., Lambert, IH., Pedersen, SF. (2009) HL-1 mouse cardiomyocyte injury and death after simulated ischemia and reperfusion: roles of pH, Ca2+-independent phospholipase A2, and Na+/H+ exchange. Am J Physiol Cell Physiol 296(5): C1227-42.

Aronson, PS., Nee, J., Suhm, MA. (1982) Modifier role of internal H+ in activating the Na+-H+ exchanger in renal microvillus membrane vesicles. Nature 299(5879):161-3.

Aronson, PS., (1985) Kinetic properties of the plasma membrane Na+-H+ exchanger. Annu Rev Physiol 47:545-60.

Barringhaus KG., Zamore PD. (2009) MicroRNAs: regulating a change of heart. Circulation 119:2217–2224.

Bartel DP. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function, Cell 116: 281–297.

Bright, CM., Ellis, D. (1992) Intracellular pH changes induced by hypoxia and anoxia in isolated sheet heart Purkinje fibres. Exp Physio 77: 165.

Chen, L., Chen, CX., Gan, XT., Beier, N., Scholz, W ., Karmazyn M. (2004) Inhibition and reversal of myocardial infarction induced hypertrophy and heart failure by NHE-1 inhibition. Am J Physiol Heart Circ Physiol 286: H381–H387.

Demaurex, N., Romanek, RR., Orlowski, J., Grinstein, S. (1997) ATP dependence of Na+/H+ exchange. Nucleotide specificity and assessment of the role of phospholipids. J Gen Physiol 109(2):117-28.

Gaidatzis, D., van Nimwegen, E., Hausser, J., Zavolan, M. (2007) Inference of miRNA targets using evolutionary conservation and pathway analysis. BMC Bioinformatics 1;8:69.

Garlick, P.B., Radda, G.K., Seeley, P.J., (1979 )Studies of acidosis in the ischaemic heart by phosphorus nuclear magnetic resonance. Biochem J 184(3):547-54.

Gibson, J.S., McCartney, D., Sumpter, J., Fairfax, T.P., Milner, P.I., Edwards, H.L., Wilkins, R.J. (2009) Rapid effects of hypoxia on H+ homeostasis in articular chondrocytes. Pflugers Arch 458(6):1085-92.

Goss, G.G., Woodside, M., Wakabayashi, S., Pouyssegur, J., Waddell, T., Downey, G.P., Grinstein, S. (1994) ATP dependence of NHE-1, the ubiquitous isoform of the Na+/H+ antiporter. Analysis of phosphorylation and subcellular localization. J Biol Chem 269(12):8741-8.

Grinstein, S., Rotin, D., Mason M.J. (1989) Na+/H+ exchange and growth factor-induced cytosolic pH changes. Role in cellular proliferation. Biochim Biophys Acta 988(1):73-97.

Grinstein, S., Cohen, S., Rothstein A. (1984) Cytoplasmic pH regulation in thymic lymphocytes by an amiloride-sensitive Na+/H+ antiport. J Gen Physiol 83(3):341-69.

Haigney M.C., Miyata H., Lakatta E.G., Stern M.D., Silverman H.S. (1992) Dependence of hypoxic cellular calcium loading on Na+-Ca2+ exchange. Circ Res 71: 547.

Kapus, A., Grinstein, S., Wasan, S., Kandasamy, R., Orlowski, J. (1994) Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchanger stably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence, osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269(38):23544-52.

49

Kinsella, J.L., Aronson P.S., (1980) Properties of the Na+-H+ exchanger in renal microvillus membrane vesicles. Am J Physiol 238(6):F461-9.

Lazdunski, M., Frelin, C., Vigne P. (1985) The sodium/hydrogen exchange system in cardiac cells: its biochemical and pharmacological properties and its role in regulating internal concentrations of sodium and internal pH. J Mol Cell Cardiol 17(11):1029-42.

Levine, S.A., Montrose, M.H., Tse, C.M., Donowitz, M. (1993) Kinetics and regulation of three cloned mammalian Na+/H+ exchangers stably expressed in a fibroblast cell line. J Biol Chem 268(34):25527-35.

Milner, P.I., Fairfax, T.P.A., Browning, J.A., Wilkins, R.J., Gibson, J.S. (2006) The Effect of O2 Tension on pH Homeostasis in Equine Articular Chondrocytes Arthritis & Rheumatism 54: 3523–3532.

Murer, H., Hopfer, U., Kinne, R. (1976) Sodium/proton antiport in brush-border-membrane vesicles isolated from rat small intestine and kidney. Biochem J 154(3):597-604.

Murphy, E., Allen, D.G. (2009) Why did the NHE inhibitor clinical trials fail? J Mol Cell Cardiol 46(2):137-41.

Pfaffl, M.W. (2001) A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research 29: 2002-2007.

Sardet, C., Counillon, L., Franchi, A., Pouyssegur, J. (1990) Growth factors induce phosphorylation of the Na+/H+ antiporter, glycoprotein of 110 kD. Science. 247(4943):723-6.

Sardet, C., Fafournoux, P., Pouyssegur, J. (1991) Alpha-thrombin, epidermal growth factor, and okadaic acid activate the Na+/H+ exchanger, NHE-1, by phosphorylating a set of common sites. J Biol Chem. 266(29):19166-71.

Shimoda, L.A., Fallon, M., Pisarcik, S., Wang, J., Semenza, G.L. (2006) HIF-1 regulates hypoxic induction of NHE1 expression and alkalinization of intracellular pH in pulmonary arterial myocytes. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 291(5):L941-9.

Shimohama, T., Suzuki, Y., Noda, C., Niwano, H., Sato, K., Masuda, T., Kawahara, K., Izumi, T. (2002) Decreased Expression of Na+/H+ Exchanger Isoform Jpn Heart J 43: 273-282.

Steenbergen, C., Deleeuw, G., Rich, T., Williamson, J.R. (1977) Effects of acidosis and

ischemia on contractility and intracellular pH of rat heart. Circ Res 41(6):849-58.

Tani M, Neely J.T. (1989) Role of intracellular Na+ in Ca2+ overload and depressed recovery of ventricular function of reperfused ischemic rat hearts. Possible involment of H+ -Na+ and Na+-Ca2+ exchange. Circ Res 65: 1045.

Wakabayashi, S., Bertrand, B., Shigekawa, M., Fafournoux, P., Pouyssegur, J. (1994) Growth factor activation and "H(+)-sensing" of the Na+/H+ exchanger isoform 1 (NHE1). Evidence for an additional mechanism not requiring direct phosphorylation. J Biol Chem 269(8):5583-8.

Wakabayashi, S., Sardet, C., Fafournoux, P., Counillon, L., Meloche, S., Pages, G., Pouyssegur, J. (1992) Structure function of the growth factor-activatable Na+/H+ exchanger (NHE1). Rev Physiol Biochem Pharmacol 119:157-86.

* * * * *

49

ÖZGEÇMİŞ

1. KİMLİĞİ:

Adı, soyadı: Hilmi Burak Kandilci

Doğum Yeri ve tarihi: Ankara, 1974 Ocak

Uyruğu: T.C.

Medeni Hali: Evli, 1 çocuk

İş adresi: Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Morfoloji Yerleşkesi, Biyofizik Anabilim Dalı,06100 Sıhhiye/Ankara

Telefon: 0 312 5958214

Fax: 0 312 3106370



İlk ve Ortaöğrenim: 1980-1991; TED

Ankara Koleji

Lisans: 1992-1997; Eczacı, Ankara Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Ankara

Yükseklisans: 1999-2002; Uzman Eczacı, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı, Ankara

Doktora: 2002-2008; Doktor Eczacı, Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı, Ankara

Doktora: 2009- ; Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Biyofizik Programı, Ankara


1999-2008 Araştırma Görevlisi, Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, Ankara

2005-2005 Doktora sırasında deneysel araştırmacı, Oxford Üniversitesi, Fizyoloji Departmanı, Prof. Richard Vaughan-Jones Lab., İngiltere (4 ay süre ile)

2006-2006 Doktora sırasında deneysel araştırmacı, Oxford Üniversitesi, Fizyoloji, Anatomi ve Genetik Departmanı, Prof. Richard Vaughan-Jones Lab., İngiltere (3 ay süre ile)

2008- 2010 Eczacı, Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara

2008-2009 Doktora sonrası deneysel araştırmacı, Oxford Üniversitesi,

Fizyoloji, Anatomi ve Genetik Departmanı, Prof. Richard Vaughan-Jones Lab., İngiltere (5 ay süre ile)

2010- Yardımcı Doçent, Ankara Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara

4. FARMAKOLOJİ BİLİM UZMANLIĞI TEZİ:

“Sıçan İzole Akciğerinde İskemi ile Oluşturulan Önkoşullamada Endojen Nitrik Oksit’in Rolü”, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara (2002).

5. FARMAKOLOJİ DOKTORA TEZİ:

“İntermedin’in Sıçan Pulmoner Vasküler Yatağa Etkilerinin İncelenmesi”, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara (2008).

6. PROJELER:

Yardımcı araştırmacı olduğu projeler

1. Sıçan izole akciğerinde iskemi ile oluşturulan önkoşullamada nitrik oksit ve potasyum kanallarının rolü: GÜMÜŞEL, Bülent (Doç.Dr.), Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, 01 01 301 002.

2. Siklooksijenaz-2 inhibitörü bazı yeni 1,5-diarilpirazol türevlerinin sentezi ve farmakolojik olarak değerlendirilmesi: DEMİRDAMAR, Rümeysa (Prof. Dr.), Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, 01 02 301 001.

3. Sıçan izole akciğerinde iskemi ile oluşturulan önkoşullamanın monoamin oksidaz (MAO) aktivitesi ve MAO-bağımlı hidroksil radikal oluşumuna etkisi: UÇAR Gülberk (Doç. Dr.) Tübitak SBAG-2670 (1035009), 2003.

4. Antidepresan ve antikonvülzan etkiye sahip yeni pirazolin türevlerinin sentezi: BİLGİN Altan (Prof. Dr.) Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, 03 02 301 003.

5. Osteoporotik Sıçanlarda İskelet Kasının İşlevsel Analizi ve Atrofiye ait Sinyal Mekanizmalarının İmmunohistoloji ve Moleküler Biyoloji Yöntemleriyle Araştırılması: ZEYBEK Dilara (Öğr.Gör.Dr.) Hacettepe Üniversitesi

49

Bilimsel Araştırmalar Birimi, 08.01.101.003.

6. Kardiyomiyositlerde hücreiçi Na+ ve H

+

homeostazında rol oynayan faktörlerin incelenmesi: TURAN Belma (Prof. Dr.) Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi, 09B3330011.

7. Hipoksinin normal ve hiperglisemik HL-1 kardiyomiyositlerrinde Na+/H+ değiş-tokuşcusu ve Na

+/HCO3

- ko-transportörü

aktivite ve ekspresyonu üzerine etkileri: Hücre içi sinyal yolaklarında miRNA ve S-nitrolizasyonun rolü: TURAN Belma (Prof. Dr.) TUBİTAK COST 109S267.

Yürütücü olduğu projeler

8. Hipoksinin fare HL-1 kardiyomiyositlerinde H

+ homeostazı üzerindeki hızlı ve uzun

süreli etkileri: KANDİLCİ H. Burak (Yrd. Doç. Dr.) Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırmalar Birimi 11B3330004.

7. ÖDÜLLER:

Poster ödülü (XVI. Türk Farmakoloji Derneği Ulusal Kongresi, 2001)

8. BURSLAR:

TÜBİTAK Yurt Dışı Araştırma Bursu (2005; 4 ay süreli)

Türk Farmakoloji Derneği Bilimsel Etkinlik Destekleme Bursu (2008)

İngiliz Farmakoloji Derneği Bilimsel Etkinlik Destekleme Bursu (2009)

9. ÜYELİKLER:

TED Ankara Koleji Mezunlar Derneği, 1991

Türk Farmakoloji Derneği (TFD), 1999

Amerikan Fizyoloji Derneği (APS), 2004

İngiliz Farmakoloji Derneği (BPS), 2008

10. YABANCI DİL:

İngilizce; Çok iyi (ÜDS 91,25)

YAYIN LİSTESİ


1. Ucar G, Topaloglu E, Kandilci HB, Gumusel B “Effect of ischemic

preconditioning on reactive oxygen species-mediated ischemia–reperfusion injury in the isolated perfused rat lung” Clin Biochem 38, 681-684, 2005.

2. Ucar G, Topaloglu E, Kandilci HB, Gumusel B “Elevated semicarbazide-sensitive amine oxidase (SSAO) activity in lung with ischemia–reperfusion injury: Protective effect of ischemic preconditioning plus SSAO inhibition” Life Sciences 78, 421-427, 2005.

3. Kandilci HB, Gumusel B, Wasserman A, Witriol N, Lippton H "Intermedin/ adrenomedullin-2 dilates the rat pulmonary vascular bed: Dependence on CGRP receptors and nitric oxide release" Peptides 27, 1390-6, 2006.

4. Kandilci HB, Gumusel B, Topaloglu E, Ucar G, Korkusuz P, Ugur Y, Asan E, Demiryurek AT “Effects of ischemic preconditioning on rat lung: role of nitric oxide.” Exp Lung Res 32, 287-303, 2006.

5. Kandilci HB, Gümüşel B, Demiryürek AT, Lippton H “Preconditioning modulates pulmonary endothelial dysfunction following ischemia-reperfusion injury in the rat lung: Role of potassium channels” Life Sci 79:2172-2178, 2006.

6. Özdemir Z, Kandilci HB, Gumusel B, Calis U, Bilgin AA “Synthesis and studies on antidepressant and anticonvulsant activities of some 3-(2-furyl)-pyrazoline derivatives” Eur J Med Chem 42: 373-379, 2007.

7. Turan-Zitouni G, Kaplancıklı ZA, Özdemir A, Chevallet P, Kandilci HB, Gumusel B “Studies on 1,2,4-triazole derivatives as potential anti-inflammatory agents” Arch Pharm (Weinheim) 340:586-590, 2007.

8. Kandilci HB, Gumusel B, Lippton H “Intermedin/adrenomedullin-2 (IMD/AM2) relaxes rat main pulmonary arterial rings via cGMP-dependent pathway: Role of nitric oxide and large conductance calcium- activated potassium channels (BKCa)” Peptides 29:1321-1328, 2008.

9. Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA “Synthesis and Studies on Antidepressant and Anticonvulsant Activities of Some 3-(2-Thienyl)-pyrazoline Derivatives” Arch Pharm (Weinheim) 341:701-707, 2008.

49

10. Basgut B, Kayki G, Bartosova L, Ozakca I, Seymen A, Kandilci

HB, Ugur M, Turan

B, Ozcelikay AT “Cardioprotective effects

of 44Bu, a newly synthesized compound, in rat heart subjected to ischemia/reperfusion injury” Eur J Pharmacol 640: 117-123, 2010.

11. Dagdeviren S, Kandilci HB, Uysal B, Zeybek ND, Korkusuz P, Gümüsel B, Korkusuz F “Tumor necrosis factor-alpha antagonist administration recovers skeletal muscle dysfunction in ovariectomized rats” J Orthop Res 29:275-280, 2011.

12. Kandilci HB, Tuncay E, Zeydanli EN, Sozmen NN, Turan B “Age-related regulation of excitation-contraction coupling in rat heart”. J Physiol Biochem. 2011;67(3):317-30.

13. Zeydanli EN, Kandilci HB, Turan B “Doxycycline ameliorates vascular endothelial and contractile dysfunction in the thoracic aorta of diabetic rats” Cardiovasc Toxicol. 2011;11(2):134-47.

TUBİTAK-ULAKBİM Ulusal Veri Tabanlarında Taranan Hakemli Dergilerde Yayınlanmış Makaleler

1. Ucar G, Topaloglu E, Kandilci HB, Gumusel B “Increased Monoamine Oxidase Activity of Lung with Ischemia-Reperfusion Injury: Effect of Preconditioning” FABAD J. Pharm. Sci., 29, 63-70, 2004.

2. Kandilci HB, Gümüşel B “Akciğerlerde İskemi-Reperfüzyon Hasarı ve İskemik Önkoşullama” Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Dergisi 25(1), 35-49, 2005.

3. Gumusel B, Kandilci HB "Androjenler, Anabolik Steroidler ve Antiandrojenik İlaçlar" Türkiye Klinikleri 1(35), 112-118, 2005.

4. Gümüşel B, Kandilci HB, Uçar G. “Protective effect of ischemic preconditioning plus monoamine oxidase (MAO) inhibition on ischemia-reperfusion injury in the rat pulmonary vascular bed” Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Dergisi 26 (1), 23-28, 2006.

Ulusal Dergilerde Yayınlanmış Makaleler

1. İyidoğan P, Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA "Synthesis of some new 1,3,5-Trisubstituted Pyrazolines with Antidepressant and Anticonvulsant Activities" J. Fac. Pharm. Istanbul 38(1), 47-56, 2006.

Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası/Ulusal Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri

1. Sapçı H, Bozkurt TE, Durlu NT, Kandilci HB, Özsögüt B, Demirdamar R, Akalın K, Mutlugil A. “Cost analysis of antihypertensive drug use in Turkey.” ISPOR 5

th Annual International Meeting,

Arlington, VA, USA, Abstr. No: PCD6, 2000. Value in Health, 3 (2), 69.

2. Sapçı H., Bozkurt TE, Durlu NT, Kandilci HB, Özsögüt B, Demirdamar R “A preliminary study: the pharmacoeconomic profile of antibiotic use in Turkey.” ISPOR 5

th Annual International Meeting,

Arlington, VA, USA, Abstr. No: PHV10, 2000. Value in Health, 3 (2), 120.

3. Sapçı H, Bozkurt TE, Durlu NT, Kandilci HB, Özsögüt B, Demirdamar R “Turkish physicians prescription patterns for hypertension management.” ISPOR 3

rd

Annual European Conference, Antwerp, Belgium, Abstr. No: PCV19, 2000. Value in Health, 3 (5), 117.

4. Kandilci HB, Yıldız G, Korkusuz P, Uğur Y, Aşan E, Demiryürek AT, Gümüşel B “Role of nitric oxide in ischemia-induced preconditioning in isolated rat lung” Experimental Biology, New Orleans, LA, ABD, 20-24 Nisan 2002. Faseb Journal, 16 (4), A76.

5. Kandilci HB, Yıldız G, Korkusuz P, Uğur Y, Aşan E, Demiryürek AT, Gümüşel B “Does chronic hypoxia mimic ischemic preconditioning in rat isolated lung” Experimental Biology, San Diego, ABD, 14 Mart 2003. Faseb Journal, 17 (4), A420.

6. Kandilci HB, Gümüşel B, Demiryürek AT “Sarcolemmal KATP channel mediated protection in ischemia-induced pre-conditioning in rat isolated lung” Experimental Biology, Washington D.C.,

49

ABD, 17-21 Nisan 2004. Faseb Journal 18 (4), A327.

7. Kandilci HB, Gümüşel B, Wasserman A, Witriol N, Lippton H “Intermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) dilates the rat pulmonary vascular bed: Dependence on CGRP receptors and nitric oxide release” 15. Dünya Farmakoloji Kongresi, Bejing-Çin, 2-7 Temmuz 2006. Acta Pharmacologica Sinica 27, 376, P340007.

8. Kandilci HB, Leem CH, Vaughan-Jones RD “Acute anoxia attenuates sodium-hydrogen exchange activity in isolated mammalian ventricular myocytes” Experimental Biology, Washington D.C., ABD, 27 Nisan-02 Mayıs 2007. FASEB Journal 21 (6), A1281-A1282.

9. Kandilci HB, Gumusel B, Lippton H “Intermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) relaxes rat pulmonary arterial rings in a nitric oxide and endothelial dependent manner” Experimental Biology, Washington D.C., ABD, 27 Nisan-02 Mayıs 2007. FASEB Journal 21 (6), A1440.

10. Kandilci HB, Gumusel B, Lippton H, Witriol N “Intermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) relaxes rat pulmonary arterial rings via protein kinase G (PKG) and BKCa channel dependent pathway: The effect of chronic hypoxia induced pulmonary hypertension” Experimental Biology, San Diego, CA, ABD, 5-9 Nisan 2008. FASEB Journal 22, 1150.11.

11. Kandilci HB, Gumusel B “L-NAME

augments -adrenoceptor desensitization in isolated rat main pulmonary artery” EPHAR, Manchester, İngiltere, 13-17 Temmuz 2008. Fundamental and Clinical Pharmacology 22(2), 77, Abstract No: P095.

12. Tuncay E, Kandilci HB, Zeydanlı EN, Sozmen NN, Akman D, Yıldırım S, Turan B “Phosphorylation of ryanodine receptors plays important role in rat heart function during maturation” Frontiers in CardioVascular Biology, Berlin, Almanya, 16-19 Temmuz 2010. Cardiovascular Research 87;S-62 Suppl 1.

13. Turan B, Bilginoglu A, Kandilci HB “Intracellular Na

+ homeostasis in diabetic

mammalian cardiomyocytes”

Experimental Biology 2011, Washington DC, ABD, 9-13 Nisan 2011 Faseb Journal March 17, 2011 25:644.14.

Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri

1. Yıldız G, Kandilci HB, Demiryürek AT, Gümüşel B ”Sıçan izole akciğerinde iskemik önkoşullamanın oluşturulması ve sodyum ortovanadat’ın iskemi üzerindeki etkisi” 16. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kuşadası, Türkiye, 1-5 Ekim 2001, Bildiri No: PY-34.

2. Kandilci HB, Yıldız G, Korkusuz P, Uğur Y, Aşan E, Demiryürek AT, Gümüşel B “Does chronic hypoxia mimic ischemic preconditioning in rat isolated lung” 17. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Belek-Antalya, Türkiye, 17-21 Ekim 2003, Bildiri No: P-169.

3. Yıldız G, Kandilci HB, Gümüşel B, Demiryürek AT “Ischemic preconditioning in isolated rat lung: Role of adenosine” 14. Dünya Farmakoloji Kongresi, San Francisco, CA, ABD, 7-12 Temmuz 2002, Bildiri No: LB 114.

4. Uçar G, Topaloğlu E, Kandilci HB, Gümüşel B “Elevated semicarbarbazide-sensitive amine oxidase activity in lung with ischemia-reperfusion injury: Protective effect of preconditioning” 19. European Workshop on Drug Metabolism, The European Society of Biochemical Pharmacology, Antalya-Türkiye, 03-08 Ekim 2004, Bildiri No:OP-13.

5. İyidoğan P, Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA “Synthesis and Pharmacological Studies on Novel Pyrazoline Derivatives with Antidepressant and Anticonvulsant Activities” International Symposium on Medicinal Chemistry Research and Development Kuşadası-Turkey, 2005, Bildiri No: P05.

6. Özdemir Z, Kandilci HB, Gümüşel B, Çalış Ü, Bilgin AA “Studies on 3-Heteroaryl Pyrazoline Derivatives with Antidepressant and Anticonvulsant Activities” International Symposium on Medicinal Chemistry Research and Development Kuşadası-Turkey, 2005, Bildiri No: P44.

49

7. Ucar G, Yabanoglu S, Kandilci HB, Gumusel B “Protective effect of ischemic preconditioning plus monoamine oxidase (MAO) inhibition on ischemia-reperfusion injury in the rat pulmonary vascular bed” 12th Amine Oxidase and Trace Amines Workshop,

8. Uçar G, Topaloğlu E, Kandilci HB, Gümüşel B “Altered monoamine oxidase activity of lung with ischemia-reperfusion injury: effect of preconditioning” 28. Avrupa Biyokimyasal Toplulukları Federasyonu Toplantısı İstanbul-Türkiye, 20-25 Ekim 2002. Rotterdam Hollanda, 30 Temmuz-3 Ağustos 2006, Bildiri No: P-12.

9. Turan-Zitouni G, Kaplancıklı ZA, Özdemir A, Chevallet P, Kandilci HB, Gumusel “Studies on 1,2,4-Triazole Derivatives as Potential Antiinflammatory Agents” ChemInform Abstract 13 Şubat 2008, DOI: 10.1002/chin.200810127.

10. Dağdeviren S, Kandilci HB, Çetinkaya A, Uysal B, Korkusuz P, Zeybek D, Kocaefe Ç, Gümüşel B, Korkusuz F “Functional Analysis of Skeletal Muscles in Postmenapausal Osteoporotic Rat Model and Role of TNF-alpha” International Symposium on Biotechnology: Developments and Trends, Ankara, Türkiye, 27-30 Eylül 2009.

11. Başgut B, Kaykı G, Bartosova L, Özakça I, Seymen A, Kandilci HB, Uğur M, Turan B, Özçelikay AT “Yeni bir sodyum kanal blokeri 44Bu’nun izole sıçan kalbinde iskemi reperfüzyon hasarına karşı koruyucu etkisi” 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Manavgat-Antalya, Türkiye, 4-7 Kasım 2009, Bildiri No: P-099.

12. Kandilci HB, Leem CH, Swietach P,Vaughan-Jones RD “Hypoxic sensitivity of the sodium-hydrogen exchanger in isolated mammalian ventricular myocytes. The role of intracellular ATP” BPS toplantısı, Londra, İngiltere, 15-17 Aralık 2009. pA2 online 2009; 7(4), Bildiri No: 48.

13. Bilginoglu A, Kandilci HB, Turan B ”Effect of insulin on intracellular Na

+

homeostasis in isolated cardiomyocytes from diabetic rats” 15

th World Congress

on Heart Disease, Vancouver BC,

Kanada, 24-27 Temmuz 2010. Bildiri No: P504.

14. Dağdeviren S, Zeybek ND, Korkusuz P, Akpulat U, Yıldız Y, Kandilci HB, Gümüşel B, Korkusuz F “Analysis of Skeletal Muscle in Postmenopausal Osteoporotic Animal Model: The role of TNF-alpha" 17. International Microscopy Congress, Rio de Janeiro, Brezilya, 19-24 Eylül 2010, Bildiri No: L17526.

15. Dagdeviren S, Korkusuz F, Zeybek ND, Korkusuz P, Kocaefe C, Akpulat U, Yildiz Y, Kandilci HB, Uysal B, Gumusel B,” TNF-alpha Antagonist Recovers Osteoporotic Skeletal Muscle Function ORS Annual Meeting, Long Beach, California, Ocak 13-16 2011, Bildiri No: 1647.

16. Yıldırım SS, Zeydanlı EN, Kandilci HB, Turan B “Diyabetik makrovasküler bozulmalarda Moleküler Mekanizmalar: Rho kinaz yolağının rolü” 23. Ulusal Biyofizik Kongresi, Edirne, Türkiye, 13 - 16 Eylül 2011. Bildiri No: P-18

Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Ulusal Toplantılarda Sunulan Sözel Bildiriler

1. Dağdeviren S, Kandilci HB, Çetinkaya A, Uysal B, Korkusuz P, Zeybek D, Kocaefe Ç, Gümüsel B, Korkusuz F. “Postmenapozal osteoporotik hayvan modelinde iskelet kasının fonksiyonel analizi ve TNF-alfanın rolü” XXI Ulusal Türk Ortopedi ve Travmatoloji Kongresi, İzmir, Türkiye, 3-7 Kasım 2009. Acta Orthopaedica et Traumatologica Turcica 2009;43 (Supp-I):40-41, Sözel Sunum No: S-120.

Ulusal/Uluslararası Toplantılarda Sunulan Sözel Bildiriler

1. Kandilci HB, Korkusuz P, Uğur Y, Gumusel B, Aşan E. “ Sıçan izole akciğerinde iskemi ile oluşturulan önkoşullamada endojen nitrik oksit’in rolü ”16. Ulusal Elektron Mikroskopi Kongresi, İzmir, 2-5 Eylül 2003, Sözel Sunum No:S-21.

2. Kandilci HB, Gumusel B. “İntermedin/ adrenomedullin-2 (IMD/AM2) sıçan ana

49

pulmoner arter halkalarında endotele bağımlı, protein kinaz G ve Ca

+2 ile aktive

olan büyük kondüktanslı K+ kanalı aracılı

gevşeme oluşturmakta” 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim 2007, Sözel Sunum No: S-22.

3. Dağdeviren S, Zeybek D, Korkusuz P, Kocaefe Ç, Akpulat U, Yıldız Y, Kandilci HB, Uysal B, Gümüşel B, Korkusuz F “Postmenopozal Osteoporptik Hayvan Modelinde İskelet Kasının Değerlendirilmesi: TNF-α’nın Rolü” X. Ulusal Histoloji-Embriyoloji Kongresi, İzmir, 17-20 Mayıs 2010, Sözel Sunum No: S-24.

4. Yıldırım SS, Kandilci HB, Zeydanlı EN, Turan B. “Memeli kardiyomiyositlerinde sodyum-hidrojen değiş-tokuşcusunun hipoksiye olan duyarlılığı: Mikro RNA’ların rolünün incelenmesi” 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, 19-22 Ekim 2011, Sözel Sunum No:S-29.

5. Yıldırım SS, Kandilci HB, Turan B “MicroRNAs as Diagnostic and Therapeutic Tool in Cardiovascular Pathologies” XVIIth International Symposium on Biomedical Science and Technology, Ankara, Turkey, 23-25 November 2011. Bildiri No: O-18

Kitap Bölümü Çevirisi

1. Gümüşel B, Kandilci HB, Akın D. “Membran Taşıyıcıları ve İlaç Yanıtı”, Goodman and Gilman Tedavinin Farmakolojik Temeli, Editörler: L.L. Brunton, J.S. Lazo, K.L. Parker; Çeviri Editörü: Öner Süzer, 2009 Nobel Tıp Kitabevi

* * * * *

NOTLAR

…………………………………………….

……………………………………………

……….……………………………………

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

…………………………………………….

……………………………………………………………………….

……………………………………………………………………….

…………………………………………….

…………………………………………….

68

DOCA-Tuz ile Oluşturulan Hipertansiyona Sitokrom P450 1B1’in Katkısı

Seyhan ŞAHAN FIRAT Mersin Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin

GİRİŞ VE AMAÇ

Hipertansiyon, sistemik arteriyel kan basıncının devamlı olarak yüksek olması ile belirgin bir kalp-damar hastalığıdır. Zamanla, özellikle kalp, böbrek ve damarlar gibi yaşamsal önem taşıyan birçok doku ve organda komplikasyonlara yol açması ve toplumda oldukça sık görülmesi açısından önemli bir klinik sorun olarak kabul edilmektedir.

Deoksikortikosteronasetat (DOCA)-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modelinde, bir aldosteron analoğu olan DOCA ve içme suyuna %1 oranında NaCl eklenerek hipertansiyon oluşturulmaktadır. Anjiyotensin II’den bağımsız hipertansiyon olarak da adlandırılan bu hipertansiyon modeli, su ve tuz geri emiliminde artışa neden olmakta ve buna bağlı olarak plazma hacminde artış, renin salgılanmasında ve anjiyotensin II düzeylerinde azalmaya neden olmaktadır. Bununla birlikte, katekolaminler, vazopresin ve endotelin 1 (ET-1) gibi birçok vazoaktif madde DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonun gelişimine katkıda bulunmaktadır (Crofton ve ark., 1979; de Champlain ve ark., 1987; Drolet ve ark., 1989; Schiffrin ve ark., 1995). Bu maddeler arakidonik asit (AA) salıverilmesinde artışa neden olarak, sitokrom (CYP) P450 aracılıklı metabolitlerin oluşumuna ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon gelişimine katkıda bulunmaktadır (Muthalif ve ark., 2000).

AA metabolitleri, kalp-damar homeostazının sağlanması, nörotransmisyonun düzenlen-mesi, üreme, alerjik yanıtların oluşması, astım, enflamasyon, damar endotel hücreleri ve damar düz kas hücrelerinin göçü, çoğalması, anjiyojenez, kanser ve hipertansiyon gibi birçok fizyolojik ve patofizyolojik olayda önemli bir rol oynamaktadır (Malik ve ark., 2011).

Anjiyotensin II, norepinefrin (NE), vazopresin ve ET-1 gibi birçok vazoaktif etkili amaddejan sitozolik fosfolipaz A2 (sFLA2)’yi etkinleştirerek membranda bulunan fosfolipitlerden AA salıverilmesine neden olmaktadır. Hipertansiyona neden olan

(prohipertansif) ve hipertansiyonu önleyici (antihipertansif) etkileri olan AA metabolitleri arasındaki denge kan basıncının düzenlenmesinde önemli bir rol oynamak-tadır (Fatima ve ark., 2004). sFLA2’nin etkinleşmesi sonucunda, fosfolipitlerden salıverilen AA, siklooksijenaz (COX) enzimleri aracılığıyla prostaglandinler (PG) ve tromboksan A2 (TXA2); lipooksijenaz (LO) enzimleri aracılığıyla lökotrienler ve -5, -12 ve -15 hidroksieikozatetraenoik asit (HETE); CYP enzimleri aracılığıyla epoksieikoza-trienoik asitler (EET) ile 12-, 19- ve 20-HETE’ye dönüştürülmektedir. COX enzimleri aracılığıyla oluşan (PG)E2 ve I2 ile CYP450 enzimleri aracılığıyla oluşan EET’ler damarları genişletmekte, NE ve anjiyotensin II gibi maddelere karşı oluşan vasküler reaktiviteyi azaltmakta, diürez ve natriürezi artırmakta ve böylece antihipertansif mekanizmalara katkıda bulunmaktadır (Imig ve Hammock, 2009; McGiff, 1981; Roman, 2002). Tersine, COX’ler aracılığıyla oluşan PG endoperoksit (PGH2), LO’lar aracılığıyla oluşan 12-HETE ve CYP aracılığıyla oluşan 20-HETE damarları daraltmakta ve damar düz kas hücreleri (DDKH)’de hiperplazi ve/veya hipertrofiye neden olarak prohipertansif etki göstermektedir (Sasaki ve ark., 1997; Nasjletti, 1998; Sacerdoti ve ark., 1989; Omata ve ark., 1992; Roman ve ark., 1993). 12-HETE ve 20-HETE’nin, DDKH göçü, çoğalması ve hipertrofisini ekstra-selüler sinyal ile düzenlenen kinaz (ERK) 1/2 ve p38 mitojen ile etkinleştirilen protein kinaz (MAPK)’yi etkinleştirerek de artırdığı (Nakao ve ark., 1982; Reddy ve ark., 2002; Natarajan ve ark., 1994; Uddin ve ark., 1998; Stec ve ark., 2007) ve anjiyotensin II’nin damar daraltıcı etkisine katkıda bulunduğu gösterilmiştir (Alonso-Galicia ve ark., 2002).

AA metabolitlerinden CYP2C aracılığıyla oluşan EET’lerin kan damarlarını genişlettiği ve antihipertansif etki gösterdiği bilinmektedir (Capdevila ve ark., 2000). CYP4A1, CYP4A2, CYP4F enzimleri aracılığıyla oluşan AA metaboliti, 20-HETE kan damarlarını daraltıcı (Miyata ve Roman,

69

2005) etkisinin yanında, anjiyotensin II’nin böbrek damarlarını daraltıcı etkisine aracılık etmekte (Alonso-Galicia ve ark., 2002), kendiliğinden hipertansif olan sıçan (SHR)’de vasküler reaktiviteyi artırmakta (Zhang ve ark., 2001), SHR’de hipertansiyon gelişimine (Sacerdoti ve ark., 1989; Omata ve ark., 1992; Su ve ark., 1998) ve normotansif sıçanlarda anjiyotensin II ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkıda bulunmaktadır (Alonso-Galicia ve ark., 2002; Zhang ve ark., 2001; Sacerdoti ve ark., 1989).

AA metabolizmasının aynı zamanda reaktif oksijen türleri (ROT)’nin oluşumunu ve AA metaboliti 20-HETE’nin ROT üretimini uyardığı gösterilmiştir (Medhora ve ark., 2008; Smith ve Weidemann, 1980). ROT’nin DDKH’de p38 MAPK etkinleşmesinde rol oynadığı bildirilmiştir (Touyz ve ark., 2003; Viedt ve ark., 2000). Bununla birlikte, DOCA-tuz modelini de içeren birçok hipertansiyon modelinde üretimi artan ROT, endotel işlev bozukluğu ve hipertansiyon gelişimine katkıda bulunmaktadır (Bao ve ark., 2007; Hong ve ark., 2001; Landmesser ve ark., 2003; Sánchez ve ark., 2006).

AA metabolitlerinin oluşumunda COX, LO ve CYP4A enzimleri dışında diğer CYP enzimlerinin de rol oynadığı gösterilmiştir (Roman, 2002). Zenobiyotikleri metabolize eden CYP1 enzimleri aynı zamanda yağ asitlerini de metabolize edebilmektedir (Choudhary, 2004). CYP1A1 ve CYP1B1 enzimleri birçok kardiyovasküler dokuda eksprese edilmektedir (Korashy ve El-Kadi, 2006) CYP1B1 DDKH’de yüksek miktarda, endotel hücrelerinde ise düşük oranda eksprese olmaktadır (Zhao ve ark., 1998). CYP1B1, anjiyotensin II’nin ROT oluşumuna bağlı olarak neden olduğu DDKH göçü, çoğalması ve hipertrofisine de aracılık etmektedir (Yaghini ve ark., 2010). CYP1B1, AA’yı 5-, 12- ve 15-HETE’yi içeren orta zincire (mid-chain) ve 20-HETE gibi HETE moleküllerine metabolize etmektedir (Choudhary ve ark., 2004) ve CYP1B1 siRNA’sı DDKH’de 5- ve 12-HETE oluşumunu azaltmaktadır. Bu bilgiler ışığında CYP1B1 aracılığıyla oluşan AA metabolitlerinin ve/veya ROT’nin DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon gelişimine katkıda bulunabileceği olasıdır.

Bu metinde sunulan bilgiler, CYP1B1’in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona ve

ilişkili patofizyolojik olaylara katkıda bulunup bulunmadığı ve oluşan hipertansiyonun olası mekanizmasının aydınlatılmasına yönelik araştırma sonuçlarımızı kapsamaktadır.

GEREÇ VE YÖNTEM

Deney hayvanları ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modeli

Deneylerde 12 saat aydınlık 12 saat karanlık periyodunda senkronize edilen erkek Sprague-Dawley sıçanlar (250-350 g) kullanılmıştır. Sıçanlara uygulanan deneysel protokoller yerel etik komite tarafından onaylanmıştır.

Çalışmada dört deney grubu oluşturulmuş-tur. Tüm sıçanlara unilateral nefrektomi (UNX) yapılmıştır. Sıçanlar ketamin (60 mg/kg, i.p.) ve ksilazin (5 mg/kg, i.p.) ile anestezi edildikten sonra karnın sol bölgesinde 2 cm uzunluğunda ensizyon yapılmış, sol renal arter ve ven ligatüre edilerek sol böbrek uzaklaştırılmıştır. DOCA-tuz grubundaki sıçanlara hipertansiyon oluşturmak amacıyla 6 hafta boyunca DOCA’nın susam yağı ile hazırlanan süspansiyonu (30 mg/kg/hafta, 0.2 ml) deri altı yoluyla enjekte edilmiş ve %1 NaCl ile %0.1 KCl içme suyuna katılarak verilmiştir. CYP1B1’in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyondaki katkısını araştırmak amacıyla seçici CYP1B1 inhibitörü TMS (300 µg/kg, i.p.) sıçanların kan basınçlarında anlamlı bir değişikliğin izlenmeye başlandığı dördüncü haftadan başlayarak her üç günde bir uygulanmış ve sıçanların her hafta ortalama arter basınçları (OAB) tail-cuff yöntemi ile ölçülmüştür.

CYP1B1 etkinliğinin ölçülmesi

TMS’nin CYP1B1 üzerindeki etkisini göstermek amacıyla P450-Glo™ Assay Kit (Promega, Madison, WI, ABD) kullanılmıştır. Altı hafta boyunca uygulanan deney protokolünün ardından sıçanlar, ketamin (60 mg/kg, i.p.) ve ksilazin (5 mg/kg, i.p.) ile anestezi edildikten sonra, sol ventriküle kesi atılarak, dolaşımdaki kan soğuk NaCl ile 3 dakika perfüze edilmiştir. Kalp, böbrek ve torasik aort izole edilerek, çevre dokuların-dan uzaklaştırılmış, sıvı nitrojende hızla dondurularak etkinlik ölçümü yapılana kadar -80°C’de saklanmıştır. Dokular sıvı nitrojende toz haline getirilerek 0.1 mmol/L soğuk potasyum fosfat çüzeltisi (pH 7.4) ile

70

homojenize edilmiştir. Elde edilen süpernatantlarda Bradford yöntemi ile protein miktar tayini yapıldıktan sonra, 20 µmol/L lucipherin 6’-chloroethyl ether substratı ile 0.1 mmol/L potasyum fosfat çözeltisi (pH 7.4) içeren reaksiyon karışımı her biri 500 µg protein içeren örneklere katılarak 37°C’de 10 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından reaksiyon karışımına NADPH eklenerek, 37°C’de 45 dakika yeniden inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından örneklere 1:1 oranında luciferin detection reagent (LDR) eklenmiş, 10 saniye süre ile karıştırılmış oda ısısında 20 dakika lüminesans sinyalini stabilize etmek amacıyla inkübe edilmiştir. Elde edilen lüminesans luminometre ile ölçülmüştür.

Ekzojen TMS’nin CYP1B1 etkinliği üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla reaksiyon karışımı eklenmeden önce, örnekler 6 µM TMS ile oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilmiş ve reaksiyon karışımı eklenerek yukarıda anlatılan deney prosedürü aynı biçimde uygulanmıştır.

Kalp hipertrofisi: Kalp ağırlığı/vücut ağırlığı oranı ve beyin natriüretik peptit (BNP) mRNA ekpresyonunun ölçülmesi

Kalp ağırlığı/vücut ağırlığı oranı: Altı hafta sonunda deney protokolünün tamamlanma-sının ardından, sıçanlar anestezi edilmiş, sol ventriküle kesi atılarak soğuk NaCl ile kan 3 dakika perfüze edilmiştir. Kalp hızla uzaklaştırılarak ağırlığı ölçülmüş ve sol ventrikül hızla sıvı nitrojende dondurulmuştur. Kalp ağırlığı/vücut ağırlığı (heart weight/ body weight; HW/BW) oranı kalp hipertrofisinin göstergesi olarak ölçülmüştür.

BNP mRNA ekpresyonunun ölçülmesi: Sol ventrikül homojenatlarından total RNA RNeasy Mini Kit kullanılarak (QIAGEN, Valencia, CA, ABD) izole edilmiştir. İzole edilen RNA’dan ters transkripsiyon ile cDNA eldesi için Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN, ABD) kullanılmıştır. Kantitatif real-time PCR (Q-RT-PCR) LightCycler

® (LC) 480 (Roche)

cihazı kullanılarak aşağıdaki koşullarda gerçekleştirilmiştir:

95ºC’de 5 dakika etkinleştirme, 45 döngü: 95ºC’de 10 saniye, 60ºC’de 60 saniye ve 72ºC’de 10 saniye, +4ºC’de saklama. Altı faklı endojen kontrol geni (housekeeping

gene) test edilerek BNP için kontrol geni olarak β-tübülin seçilmiştir. BNP ve β-tübülin için UPL (universal probe library)’ye ait primer ve ilgili prob dizilimleri Tablo 1’de gösterilmiştir. Tüm örnekler üç kez analiz edilerek, BNP geninin göreceli mRNA düzeyi kontrol geninin mRNA düzeyine oranlanarak normalize edilmiştir. BNP mRNA ekpresyonu ölçümü ΔΔCt yöntemi kullanılarak yapılmıştır.

Tablo 1. Primer ve hibridizasyon prob dizileri.

BNP, beyin natriüretik peptit; UPL, universal probe library; bp, baz çifti.

Vasküler reaktivite, media/lümen oranı ve endotel işlevinin ölçülmesi

Vasküler reaktivite: Altı hafta sonunda, deneylerin tamamlanmasının ardından sıçanlardan izole edilen torasik aort ve süperiyor mezenterik arterler çevre dokularından temizlenerek ~2 mm uzunluğunda hazırlanan arter halkaları izometrik gerimdeki değişiklikleri ölçmek amacıyla ince tel miyograf cihazına yerleştirilmiştir. Miyograf sistemine yerleştirilen izole arterler %95 O2-%5 CO2

karışımı ile havalandırılmış Krebs çözeltisi içerisinde, 37°C’de 30 dakika süre ile dengelenmeye bırakılmıştır. Dengelenme süresi boyunca banyolardaki Krebs çözeltisi her 10 dakika da bir değiştirilmiştir. Dengelenmenin ardından, arterler KCl (60 mmol/l) ile önceden kastırılmış ve Krebs çözeltisi ile üç kez yıkanmıştır. fenilefrin (10

-9

mmol/l-10-5

mmol/l) ve ET-1 (10-12

-10-8

mmol/l) ile oluşturulan kümülatif derişim-yanıt eğrileri elde edilmiştir.

Media-lümen oranı: Anestezi sonrası izole edilen torasik aort ve süperiyor mezenterik arterler çevre dokularından temizlenerek elde edilen arter kesitleri %10’luk formalin içerisinde bir gece bekletilmiş, etanol ve ksilen (1 saat) ile dehidrate edilerek parafin içerisine gömülmüştür. Parafin içerisine

71

gömülen arter kesitleri mikrotom ile 5 µm’lik parçalara kesilerek hemotoksilen ve eozin ile boyanmıştır. Örnekler invert mikroskop kullanılarak görüntülenmiş ve dijital kamera kullanılarak fotoğraflandırılmıştır. Media kalınlığı ve lümen çapı ImageJ 1.42 (http://rsb.info.nih.gov/nih-image; National Institutes of Health) programı kullanılarak ölçülmüş ve media-lümen oranı belirlenmiştir.

Endotele bağımlı ve endotelden bağımsız damar gevşemesi: Sıçanlardan izole edilen torasik aort ve süperiyor mezenterik arterler fenilefrin (10

-5 mmol/l) ile kastırıldıktan sonra

asetilkolin (10-9

-10-5

mmol/l)’ye karşı oluşan gevşeme yanıtları incelenmiştir. Endotel kaynaklı hiperpolarizan faktörün (Endothelium derived hyperpolarizing factor; EDHF) gevşemedeki katkısı indometasin (10

-5 mmol/l) ve N(G)-nitro-L-arjinin metil

ester (L-NAME) (10-4

mmol/l) varlığında araştırılmıştır. İndometasin ve L-NAME, sırasıyla vazoaktif prostanoitler ve nitrik oksitin etkisini dışlamak amacıyla, arterlerin fenilefrin ile önkastırma yapılmadan 10 dakika önce banyolara eklenmiştir.

Böbrek hipertrofisi ve işlevlerindeki değişikliklerin belirlenmesi

Böbrek hipertrofisinin bir göstergesi olarak böbrek ağırlığı/vücut ağırlığı (kidney weight/body weight; KW/BW) göstergesi olarak ölçülmüştür. Böbrek işlevlerinin belirlenmesi amacıyla idrar çıkışı, ozmolitesi, protein içeriği, Na

+ ve K

+ derişimleri, kan üre

nitrojen (blood urea nitrogen; BUN) düzeyi, serum ve idrar kreatinin düzeyleri ve kreatinin klirensi ölçülmüştür. İdrar örneklerinin toplanması amacıyla, sıçanlar 24 saat boyunca metabolik kafeslerde barındırılmıştır. Deney sonunda 3 dakika süre ile kanın perfüzyonunun ardından böbrek izole edilmiş ve ağırlığı ölçülmüştür. İdrar hacmi ölçülmüş ve osmometre ile osmalaritesi belirlenmiş ve Bradford yöntemi ile protein miktar tayini yapılarak flame fotometer (Instrumentation Laboratory, Inc., Lexington, MA; model 443) kullanılarak Na

+

ve K+ derişimleri ölçülmüştür. Glomerüler

filtrasyon hızının (glomerular fitration rate; GFR) göstergesi olan kreatinin klirensinin belirlenmesi amacıyla serum ve idrar örneklerinde kreatinin ölçümü QuantiChrom™ Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems, Hayward, CA) ve BUN ölçümü QuantiChrom™ Urea Assay Kit

(BioAssay Systems, Hayward, CA) kullanılarak yapılmıştır.

12- ve 20-HETE metabolitlerinin plazma düzeylerinin ölçülmesi

12-HETE ve 20-HETE plazma düzeylerinin ölçülmesi amacıyla sırasıyla 12(S)-HETE ELISA Kit (Abnova Corporation, Taipei, Taiwan) ve 20-HETE ELISA Kit (Detroit R&D, Inc., Detroit, MI) kullanılmıştır.

Vasküler süperoksit oluşumunun ölçülmesi

Torasik aort kesitleri dihidroetidiyum (DHE) ile boyanarak süperoksit oluşumu gösterilmiştir. Taze hazırlanan aort örnekleri Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) çözeltisi içerisine gömülerek -80°C’de dondurulmuştur. Donmuş doku kesitleri kriyostat cihazı ile 30 µm kalınlığında kesitlere ayrılmıştır ve cam slayt üzerine yerleştirilmiştir. Kesitler 30 dakika süre ile 37°C’de fosfat tamponu in PBS solüsyonu içerisinde dengelenerek DHE (2 µM) doku kesitlerine uygulanmıştır. Daha sonra kesitler 30 dakika süre ile 37°C’de nemli ortamda inkübe edilmiş (light-protected humidified chamber) fosfat tamponu ile yıkanmış ve oluşan floresans invert mikroskop ile görüntülenmiştir. Görüntüler dijital kamera ile fotoğraflandırılmıştır ve floresans ölçümü ImageJ 1.42 programı kullanılarak yapılmıştır. Floresans ölçümleri üç farklı bölgenin ortalaması alınarak yapılmıştır ve UNX kontrol grubu değerlerine oranlanarak normalize edilmiştir.

Dihidroksietidyum ve 2-hidroksietidyum düzeylerinin yüksek performanslı sıvı kromotogtrafisi yöntemi ile ölçülmesi

Vasküler süperoksit oluşumunun ölçülmesi amacıyla dihidroksietidyum (DHE)’nin oksidasyonu sonucu oluşan 2-hidroksietidyum (2-OHE) düzeyi yüksek performanslı sıvı kromotogtrafisi yöntemi ile bir florasans dedektör kullanılarak ölçülmüştür. Dondurulmuş aort halkaları 50 µmol/l DHE ve 100 µmol/l NADPH içeren Krebs çözeltisi içerisinde 37ºC’de 15 dakika inkübe edilmiştir. Arterler yıkandıktan sonra Krebs çözeltisi içerisinde 1 saat daha inkübe edilerek 300 µl soğuk metanol içerisinde homojenize edilmiş, yüksek performanslı sıvı kromotografisi sistemi kullanılarak DHE’nin 2-OHE’ye ayrıştırılması sağlanmıştır. 2-OHE

http://www.sciencedirect.com/science?_ob=RedirectURL&_method=externObjLink&_locator=url&_cdi=6792&_plusSign=%2B&_targetURL=http%3A%2F%2Frsb.info.nih.gov%2Fnih-image

72

üretimi 580 ve 480 nm’de ölçülen florasans ışıma ile belirlenmiştir.

NADPH oksidaz etkinliğinin ölçülmesi

NADPH oksidaz etkinliği lusigenin ile artırılmış kemilüminesans ölçümü ile belirlenmiştir. Kalp, böbrek ve aort dokuları izole edildikten sonra çevre dokulardan temizlenerek sıvı nitrojende dondurulmuştur. Dondurulan dokular toz haline getirilerek lizis çözeltisinde homojenize edilmiş, sonikasyonun ardından, örneklerde Bradford yöntemi ile protein miktarı ölçülmüş ve örneklere 1:1 oranda 5 µmol/l lusigenin ile 100 µmol/l NADPH içeren reaksiyon çözeltisi eklenmiştir. Elde edilen lüminesans, luminometre cihazı kullanılarak ölçülmüştür. Yöntemi doğrulamak amacıyla reaksiyon NADPH oksidaz inhibitörü aposinin (100 µmol/l) varlığında da gerçekleştirilmiştir.

Western blot analizi

Kalp, böbrek ve torasik aort izole edilerek, çevre dokulardan uzaklaştırılıp, sıvı nitrojende dondurulduktan sonra toz haline getirilerek lizis çözeltisinde (%1 IGEPAL CA-630, 25 mmol/L HEPES (pH 7.5), 50 mmol/L NaCl, 50 mmol/L NaF,

1 mmol/l Na3VO4, 1

mmol/L fenilmetilsülfonil florit, 10 µg/mL

aprotinin ve 10 µg/mL löpeptin) homojenize edilmiş, Bradford yöntemi ile protein miktar tayinleri yapılmıştır. Her bir örnekten eşit miktarda protein (30-60 µg) SDS-poliakrilamit jele yüklenmiş ve elektroforezle jelde ayrılan proteinler nitroselüloz membrana transfer edilmiştir. Membranlar, %5’lik yağsız süt tozu içeren TBST çözeltisi içinde oda sıcaklığında 2 saat bloke edildikten sonra, 1:300-1:10,000 dilüsyonlarda kullanılan ilgili primer antikorlar ile +4°C’de inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından membranlar 1:1000-1:1500 dilüsyonlarda kullanılan primer antikorlara özgü sekonder antikorlar ile oda sıcaklığında 2 saat inkübe edilmiştir. Antikorlara bağlanma, kemilüminesans yöntemi ile tespit edilmiş ve bantların dansiteleri Image J 1.42 programı ile ölçülmüştür. Kontrol için anti-β-aktin antikoru kullanılmıştır.

İstatistiksel analiz

Veriler ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir. Kullanılan sıçan sayısı n ile ifade edilmiştir. Her bir değişken için gruplar arası karşılaştırmalarda tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ve post-hoc

Newman-Keuls çoklu karşılaştırmalar testi, iki grup olduğunda Student’s t-testi kullanılmıştır. İstatistiksel olarak 0.05’ten küçük değerler anlamlı kabul edilmiştir.

BULGULAR

TMS sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan kan basıncı artışını geri çevirmektedir.

UNX sıçanlara 6 hafta boyunca uygulanan DOCA-tuz ortalama arter basıncını (OAB) 95 ± 1 mmHg’dan 154 ± 1 mmHg’ya anlamlı olarak yükseltmiştir. TMS (300 µg/kg, i.p.) tek başına OAB’de herhangi bir etkiye neden olmazken (96 ± 1 mmHg), DOCA-tuz’un neden olduğu kan basıncı artışını (154 ± 1 mmHg) anlamlı olarak geri çevirmiştir (96 ± 1 mmHg) (Şekil 1).

Şekil 1. Sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan

hipertansiyon modelinde ortalama arter basıncı üzerine TMS’in etkisi. Sonuçlar ortalama ±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). * ve

† sırasıyla UNX ve DOCA-tuz tek başına

grubu değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05).

TMS aort, kalp ve böbrekte CYP1B1 etkinliğini azaltmakta, ekspresyonunu değiştirmemektedir.

TMS aort (Şekil 2A), kalp (Şekil 2B) ve böbrekte (Şekil 2C) CYP1B1 etkinliğinde anlamlı bir azalmaya neden olmuştur. DOCA-tuz uygulaması CYP1B1 etkinliğini değiştirmezken, DOCA-tuz ile TMS birlikte uygulanan grupta DOCA-tuz grubuna göre anlamlı bir azalmaya neden olmuştur (Şekil 2A, 2B ve 2C). TMS uygulaması aort, kalp ve böbrekte CYP1B1 ekspresyonunda herhangi bir değişikliğe neden olmamıştır (Şekil 2D, 2E ve 2F). Dokuların TMS ile eksojen olarak inkübasyonu tüm gruplarda CYP1B1 etkinliğini ileri düzeyde önlemiştir (Şekil 2A, 2B ve 2C).

73

Şekil 2. Sıçan (2A) aort, (2B) kalp ve (2C) böbrek

dokularında CYP1B1 etkinliği ve CYP1B1 ekspresyonu (2D, 2E ve 2F) üzerine DOCA-tuz ve TMS’nin etkisi. Sonuçlar ortalama ± ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=4).

‡UNX

kontrol grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P <

0.05), †DOCA-tuz tek başına grubu değerinden

anlamlı olarak farklı (P < 0.05) ve §E.T grubu kendi

kontrol grubundan anlamlı olarak farklı (P < 0.05)

TMS DOCA-tuz ile oluşturulan kalp hipertrofisini azaltmaktadır.

Kalp hipertrofisinin bir göstergesi olarak ölçülen HW/BW, DOCA-tuz uygulanmış sıçanlarda UNX kontrol grubuna göre anlamlı bir artış gözlenmiştir. Bu artış TMS uygulaması ile anlamlı olarak geri çevrilmiştir. Kalp hipertrofisinin bir başka göstergesi olan BNP (B-type natriuretic peptide) mRNA ekspresyonu da DOCA-tuz uygulanan grupta anlamlı bir artış göstermiş, bu artış TMS uygulaması ile anlamlı olarak geri çevrilmiştir. TMS tek başına grubunda herhangi bir etki gözlenmemiştir (Tablo 2).

74

Tablo 2. DOCA-tuz ile oluşturulan kalp hipertrofisi üzerinde TMS’nin etkisi.

Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). UNX, uninefrektomize kontrol grubu; BNP, brain natriüretik peptit. * ve

† sırasıyla

UNX ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05).

TMS sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda artan vasküler reaktiviteyi, damar düz kas hipertrofisini ve endotel işlev bozukluğunu önlemektedir.

DOCA-tuz uygulanmış sıçanların (Şekil 3A) aort ve (Şekil 3B) mezenter arterlerinde fenilefrin ve ET-1’e karşı oluşan kasılma yanıtları UNX kontrol grubuna göre anlamlı olarak artış göstermiştir. DOCA-tuz grubuna göre fenilefrin ve ET-1’e karşı oluşan vasküler reaktivitedeki bu artışlar TMS uygulaması ile geri çevrilmiştir. TMS tek başına grubunda bu maddelere karşı vasküler reaktivitede herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir (Şekil 3A ve 3B). Vasküler reaktivitede gözlenen artışa ilişkili olarak DOCA-tuz uygulanan sıçanlarda media-lümen oranında anlamlı bir artış gözlenmiş, bu artış TMS tarafından geri çevrilmiştir (Tablo 3).

Tablo 3. DOCA-tuz ile oluşturulan media/lümen oranındaki artış

üzerinde TMS’nin etkisi.

Sonuçlar ortalama ± ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). * ve

† sırasıyla UNX ve

DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05).

DOCA-tuz uygulanmış sıçanların fenilefrin ile ön kastırma yapılan (Şekil 4A) aort ve (Şekil 4B) mezenter arter dokularında asetilkoline karşı oluşan gevşeme yanıtlarında anlamlı

bir azalma gözlenmiştir. TMS, DOCA-tuz uygulanması sonucu oluşan torasik aort ve mezenterik arterdeki bu azalmayı anlamlı olarak önlemiştir (Şekil 4A ve 4B). DOCA-tuz grubuna ait mezenter arterlerde İndometasin ve L-NAME varlığında asetilkoline karşı oluşan gevşeme yanıtlarında, UNX kontrol grubundakilere göre anlamlı bir azalma gözlenmiştir (Şekil 4C). TMS uygulaması ile bu azalma anlamlı olarak geri çevrilmiştir. Damar düz kas hücrelerine bağlı gevşeme yanıtlarına neden olan sodyum nitroprusit (SNP) uygulamasının torasik aort (Şekil 3D) ya da mezenter arterlerdeki (Şekil 3E) hiçbir uygulama grubu üzerinde etkisi gözlenmemiştir. TMS tek başına herhangi etki göstermemiştir (4A, 4B ve 4C).

TMS DOCA-tuz ile oluşturulan böbrek hipertrofisini ve böbrek işlev bozukluğunu azaltmaktadır.

DOCA-tuz uygulanması sonucunda böbrek hipertrofisinin bir göstergesi olarak kabul edilen böbrek ağırlığı/vücut ağırlığı (kidney weight/body weight-KW/BW) oranında anlamlı bir artış gözlenmiştir. Bu artış TMS uygulaması sonucunda geri çevrilmiştir. DOCA-tuz uygulanan sıçanlarda idrar çıkışı, idrarda protein ve K

+ düzeyleri ile BUN ve

serum kreatinin derişimleri artarken, idrar osmolalitesi, NA

+ derişimi ve kreatinin

klirensi anlamlı olarak azalma göstermiştir. Bu parametrelerdeki değişiklikler TMS ile en aza indirilmiştir. TMS tek başına herhangi etki göstermemiştir (Tablo 4).

75

Şekil 3. Sıçan torasik aort (A) ve mezenter arterlerinde (B) fenilefrine (PE; 10-9

- 10-5

mmol/l); torasik aort (C) ve

mezenter arterlerinde (D) endoteline (ET-1; 10-12

- 10-8

mmol/l) karşı oluşan kasılma yanıtları üzerine DOCA-tuz ve TMS’in etkisi (n=5). * ve

† sırasıyla UNX kontrol ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak

farklı (P < 0.05 ).

TMS DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda 12- ve 20-HETE düzeylerini değiştirmemektedir.

Çalışmamızda, DOCA-tuz uygulanan sıçanların plazma 12- ve 20- HETE düzeylerinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir. TMS tek başına uygulandığı ya da DOCA-tuz uygulanan grupta bu eikozanoitler üzerinde bir etki oluştur-mamıştır (Tablo 5).

DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda, TMS vasküler süperoksit oluşumu, NADPH etkinliği ve NOX-1 protein ekspresyonlarındaki artışı önlemekte, NOX-4 ekspresyonunu değiştirmemektedir.

DHE floresan boyama yöntemi ile belirlenen ROT üretimi DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon grubunda artış göstermiştir. TMS DOCA-tuz grubunda gözlenen ROT üretimindeki bu artışı anlamlı olarak geri çevirmiştir. TMS tek başına uygulanan grupta herhangi bir etki gözlenmemiştir (Şekil 5A). DHE floresan boyama yöntemi ile belirlenen ROT üretimini doğrulamak amacı ile süperoksit oluşumunun spesifik bir göstergesi olan 2-OHE düzeyleri DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda anlamlı bir artış gösterirken, bu artış TMS uygulaması ile önlenmiştir (Şekil 5B).

76

Tablo 4. DOCA-tuz ile oluşturulan böbrek hipertrofisi ve böbrek işlevleri üzerinde TMS’nin etkisi.

Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). UNX, uninefrektomize kontrol grubu; BUN, kandaki üre düzeyi (blood urea nitrogen). * ve

† sırasıyla UNX ve DOCA-tuz tek

başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05).

Tablo 5. DOCA-tuz ya da TMS uygulamasının plazma 12- ve 20-HETE düzeyleri üzerindeki etkisi.

Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=5). UNX, uninefrektomize kontrol grubu; HETE, hidroksieikozatetraenoik asit.

77

Şekil 4. Sıçan (A) torasik aort ve (B) mezenterik arterlerinde fenilefrin (PE; 10-5

mmol/l) ile oluşturulan ön

kasılmanın ardından kümülatif asetilkolin (Ak; 10-9

mmol/l-10-5

mmol/l) uygulamaları ile oluşturulan gevşeme yanıtları üzerine; (C) mezenterik arterlerinde indometasin (10

-5 mmol/l) ve N(G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-

NAME) (10-4

mmol/l) varlığında kümülatif asetilkolin (10-9

-10-5

mmol/l) uygulamaları ile oluşturulan gevşeme yanıtları; (A) torasik aort ve (B) mezenterik arterlerinde, sodyum nitroprussid (SNP; 10

-9-10

5mmol/l)

uygulamasının gevşeme yanıtları üzerine ve bu yanıtlara DOCA-tuz ile TMS’in etkileri (n=5). * ve †

sırasıyla UNX kontrol ve DOCA-tuz tek başına grupları değerlerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05 ).

78

Şekil 5. Sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon modelinde vasküler süperoksit oluşumu üzerine DOCA-

tuz ve TMS’in etkisi. (A) Dihidroetidyum bromür (DHE) boyama ile belirlenen representatif floresan fotomikrograf kesitleri, (B) kantitatif DHE floresan sonuçları, (C) süperoksit üretimini göstergesi olan 2-hidroksietidyum (2-OHE) düzeylerinin HPLC sonuçları. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=4). * ve

†


DHE floresan yönteminde gözlenen vasküler süperoksit oluşumundaki artışa paralel olarak, DOCA-tuz uygulanan grupta aort (Şekil 6A), kalp (Şekil 6B) ve böbrekte (Şekil 6C) NADPH oksidaz etkinliğinde anlamlı bir artış gözlenir ve TMS uygulanması sonucunda bu artış önlenmiştir (Şekil 6A, 6B ve 6C). Gerek bazal gerekse artış gösteren NADPH oksidaz etkinliği Apocynin ile inhibe edilmiştir (Şekil 6A, 6B ve 6C). DOCA-tuz uygulaması NOX-1 protein ekspresyonunda TMS ile geri çevrilen anlamlı bir artışa neden olurken, NOX-4 ekspresyonunu değiştirmemiştir (Şekil 6D, 6E ve 6F). TMS tek başına uygulandığında NADPH oksidaz etkinliği ya da NOX-1 ekspresyonu üzerinde herhangi bir etki oluşturmamıştır (Şekil 6).

TMS DOCA-tuz ile oluşturulan ERK1/2 ve p38 MAPK etkinliğindeki artışları önlemektedir.

TMS’nin (Şekil 7A) ERK1/2 ve (Şekil 7B) p38 MAPK etkinliği üzerindeki etkisini belirlemek amacı ile aort, kalp ve böbrekte ölçülen fosforilasyon düzeyleri, DOCA-tuz uygulanan grupta anlamlı bir artış gösterirken, bu artış TMS ile önlenmiştir (Şekil 7A ve 7B).

79

Şekil 6. Sıçan (6A) aort, (6B) kalp ve (6C) böbrek dokularında NADPH oksidaz etkinliği üzerine (n=5); sırasıyla

aynı dokularda (6D, 6E ve 6F) NOX-1 ve NOX-4 ekspresyonu üzerine (n=3) DOCA-tuz ve TMS’in etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=4). *UNX kontrol grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05),

†DOCA-tuz tek başına grubu değerinden anlamlı olarak farklı (P < 0.05),

§aposinin

grubu kendi kontrol grubundan anlamlı olarak farklı (P < 0.05).

80

Şekil 7. Sıçan aort, kalp ve böbrek dokularında (A) p-ERK1/2 ve (B) pP38 protein ekspresyonları üzerine DOCA-

tuz ve TMS’in etkisi. Sonuçlar ortalama±ortalamaların standart hatası olarak gösterilmiştir (n=3). * ve †


TARTIŞMA VE SONUÇ

Bu çalışma CYP1B1’in UNX sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon ile kalp, böbrek ve damar işlevlerindeki patofizyolojik değişikliklere katkısını gösteren ilk çalışmadır. Sıçanlarda DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda, CYP1B1’in seçici inhibitörü TMS (Sacerdoti ve ark., 1989)’nin, SBP’yi normalize ettiği dozunda; 1. Aort ve mezenterik arterde HW/BW oranı, BNP mRNA ekspresyonu ve media-lümen oranlarındaki artış ile ölçülen kardiyo-vasküler hipertrofiyi azalttığı,; 2. aort ve mezenterik arterde fenilefrin ve ET-1’e karşı oluşan vasküler reaktivitedeki artış ve endotel işlev bozukluğunu önlediği; 3. KW/BW oranı ile ölçülen böbrek hipertrofisini ve idrar çıkışı, K

+ atılımı, proteinürideki artışı;

Na+ atılımı, ozmololite ve kreatinin

kleransındeki azalmaları en aza indirdiği gösterilmiştir.

Çalışmamızda gözlenen, TMS’nin DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon ve ilişkili patofizyolojik değişiklikler, daha çok kardiyovasküler dokulardaki CYP1B1 etkinliğindeki azalmaya dayandırılmıştır. CYP1B1’in, sıçanların aort, kalp ve böbreklerinde yüksek oranda eksprese edildiği ve yapısal olarak aktif olduğu

bulunmuştur. DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon CYP1B1 ekspresyonu ya da etkinliğini artırmamıştır. Ancak, TMS uygulanması, CYP1B1 etkinliğini azaltmış, hem UNX hem de DOCA-tuz uygulanan sıçanlarda aorta, kalp ve böbreklerindeki ekspresyonunda herhangi bir değişikliğe neden olmamıştır. Her ne kadar TMS, OAB’yi normal değerlere indirememiş, kardiyovasküler hipertrofiyi önlemiş ve endotel işlev bozukluğu ile damar daraltıcı maddelerle elde edilen vasküler reaktivitedeki artışı önlemiş ise de, CYP1B1 etkinliğini tamamen engelleyememiştir. Kullandığımız yöntem ayrıca CYP1A1’i de ölçmekte ve kalan etkinlik daha yüksek TMS ile inhibe edilebilen CYP1A1’den kaynaklanabilmektedir. Bu görüşe karşıt olarak CYP1A1 protein ekspresyonu normal hayvanların aorta, kalp ve böbreklerinde anlamlı düzeylerde ölçülememiştir. Bunun yanı sıra, DOCA-tuz uygulanması CYP1A1 ekspresyonunu değiştirmemiştir (yayınlan-mamış veri). Eksojen TMS’nin reaksiyon karışımına eklenmesi, CYP1B1 etkinliğini aort, kalp ve böbrekte önlemiştir ve çalışmamızda görülmektedir ki; DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda OAB’yi normalize eden TMS dozları, bu dokularda tamamen CYP1B1 etkinliğini ortadan

81

kaldırmaya yeterlidir. TMS’nin plazma yarılanma ömrü ve metabolizması henüz bilinmemektedir. Ayrıca, TMS’nin etkilerini doğrudan ve/veya bir veya daha fazla metabolitleri aracılığıyla gerçekleştirip gerçekleştirmediği henüz ortaya konulmamıştır. CYP1B1 etkinliği böbreklerde aort ve kalbe oranla çok daha yüksek bulunmuştur ve TMS her ne kadar azaltmış olsa da DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda böbrek işlevleri ile ilgili parametrelerindeki değişiklikleri tamamen önleyememiştir. TMS’nin daha sık ve/veya daha yüksek dozda uygulanmasının CYP1B1 etkinliğini ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda böbrek işlevlerindeki bozulmayı tamamen önleyip önlemediğini belirlemek için ileride yapılacak çalışmalara gereksinim vardır. Ayrıca, TMS’nin böbrek ve kalpte vasküler hipertrofi ve ilişkili vasküler reaktivitedeki artışı azaltıcı etkisinin kan basıncını azaltıcı etkisinden kaynaklanabileceği olasılığı da göz önünde bulundurulmalıdır. Ancak, daha önce yapılan ön çalışmalarda (Jennings BL, Malik KU, yayınlanmamış veri), TMS’ye (10 µmol/l) 4 saatlik maruziyet normotansif sıçanlardan elde edilen izole aorta ve mezenterik halkalarında fenilefrin, ET-1 ve anjiyotensin II ile oluşturulan kasılmaları önlemiş ve bu da TMS’nin vasküler reaktiviteyi CYP1B1 etkinliğini öneyerek azaltabileceğini düşündürmüştür.

CYP1B1’in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkısının mekanizması, FLA2 etkinliğini uyararak AA salınımına neden oldukları bilinen katekolaminler, vazopresin ve/veya ET-1 düzeylerindeki artışlardan kaynaklanabilmektedir (Bonventre ve ark., 1988; Muthalif ve ark., 1996; Trevisi ve ark., 2002). AA’in in vitro CYP1B1 süperzomları tarafından DDKH büyümesini uyaran ve hipertansiyonda yer alan 12- ve 20-HETE (Choudhary ve ark., 2004) dahil orta zincirli ve terminal HETE’lere metabolize edildiği gösterilmiştir. Bunun yanı sıra, bu HETE’lerin plazma düzeyleri SHR’de ve böbrek vasküler hastalığı olan kişilerde artmıştır (Minuz ve ark., 2008). Ancak çalışmamızda TMS 12- veya 20-HETE’nin plazma düzeylerini değiştirmemiştir. Son zamanlarda, sıçan damar düz kaslarında, TMS veya adenovirüs CYP1B1 kısa hairpin (sh)RNA’nın AA’nın HETE’lere metabolize olmasını değiştirme-diğini gösterilmiştir (Yaghini ve ark., 2010).

Bunun yanı sıra, TMS uygulanması sıçanların femoral arterlerinde AA’nın 12- ve 20-HETE’ye dönüşümünü etkilememiştir (yayınlanmamış veri). Ancak, TMS’nin kan basıncını normalize edici ve DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyon ile ilişkili patofizyolojik değişiklikleri azaltıcı etkilerdeki rolünün netleşebilmesi için TMS’nin DOCA-tuz uygulanan sıçanların dokularında 12- ve 20-HETE’ düzeylerini belirleyecek ek çalışmalara gereksinim duyulmaktadır. AA metabolizmasının ayrıca ROT üretimi (Schiffrin ve ark., 1995) ve NADPH oksidaz etkinliği (Smith ve ark., 1980) ile ilişkili olduğu gösterilmiş ve ROT’nin DOCA- veya aldosteron-tuz ile oluşturulan hipertansiyon gibi çeşitli hipertansiyon modellerinde ve/veya ilişkili endotel işlev bozukluğunda yer aldığı gösterilmiştir (Malik ve ark., 2011). DDKH’den elde ettiğimiz son bulgularda, anjiyotensin II ile başlatılan ROT üretimi, AA salıverilmesi ve yapısal etkin CYP1B1 aracılığıyla gerçekleştirildiğinin gösterilmesi (Yaghini ve ark., 2010), ROT’un AA ve/veya diğer yağ asitlerinden vazoaktif maddelerin etkisiyle ve CYP1B1 aracılığıyla üretilmesi, DOCA-tuzun neden olduğu patofizyolojik değişikliklere katkısı olabileceği olasılığını artırmaktadır. Aort ROT üretimindeki artışın, SNP ile elde edilen endotel bağımlı gevşemede değil, ancak asetilkolin ile elde edilen endotele bağımlı gevşemedeki azalmanın ve aorta ile mezenterik arterdeki vasküler reaktivitedeki artışın TMS ile önlenmesi bu görüşü desteklemektedir. Bunun yanı sıra, DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonda, aort, kalp ve böbrekte NADPH oksidaz etkinliği ve NOX-1 ekspresyonu TMS ile önlenmiştir. CYP1B1 ve NADPH oksidaz ve diğer ROT üreten sistemler arasındaki ilişki bilinmemektedir. CYP1B1 süperzomlarının in vitro AA’den ROT üretebildiğini daha önce gösterilmiştir (Yaghini ve ark., 2010). Ayrıca, damar düz kas hücrelerinde anjiyotensin’nin neden olduğu NADPH oksidaz etkinliğinin sitozolik FLA2 ve CYP1B1 etkinliğine bağlı olduğu da gösterilmiştir (Song ve ark., 2010). CYP1B1 tarafından AA ve/veya diğer yağ asitlerinin metabolizması aracılığıyla oluşan ROT ve/veya diğer lipit peroksidasyon ürünlerinin NADPH oksidaz etkinliğine ve ROT üretimine katkısının olup olmadığının araştırılması gerekmektedir. ROT’un kendi üretimlerini, NADPH oksidazı veya ksantin oksidazı etkinleştirerek, demirin hücre içine

82

alımını ve/veya eNOS uncoupling’i artırarak (Cai, 2005), artırabileceği bildirilmiştir.

CYP1B1 tarafından oluşturulan ROT üretimindeki artışın DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyondaki kalp, böbrek ve vasküler hipertrofiyi ERK1/2 veya p38 gibi sinyal molekülleri aracılığıyla tetikleyebilmektedir (Malik ve ark., 2011). DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonun, aort, kalp ve böbrekte artmış ERK1/2 etkinliği ile ilişkili olduğu ve bunun TMS ile önlendiği gösterilmiştir. Son zamanlarda, anjiyotensin II ve AA ile oluşturulan ERK1/2 ve p38 MAPK etkinliğindeki artışlar ve DDKH büyümesinin TMS ile veya adenovirüs CYP1B1 short-hairpin RNA yerleştirilen hücrelerde önlendiği gösterilmiştir (Yaghini ve ark., 2010). TMS’nin idrar çıkışı, idrarda protein miktarı ve K

+ atılımındaki artışları ile

idrar ozmolalitesi, Na+

atılımı ve GFR’deki azalmaları minimize edici etkilerinin, CYP1B1 etkinliği sonucunda ROT üretimindeki ve/veya ERK1/2, p38 MAPK etkinliklerindeki azalmaya bağlı olup olmadığı ve altta yatan mekanizmaların ne olduğunun ortaya konması gerekmektedir.

UNX ve DOCA-tuz uygulanan sıçanlardan elde edilen böbreklerde bazal CYP1B1ve NADPH oksidaz etkinlikleri diğer dokularda daha yüksek bulunmuştur. Ancak, DOCA-tuz uygulanan hayvanların böbreklerinde UNX hayvanlara kıyasla CYP1B1’de değil, NADPH oksidaz etkinliğinde artış gözlenmiştir. Bununla birlikte, DOCA-tuz uygulanan sıçanlara TMS uygulanması; kısmen CYP1B1 etkinliğini önlemiş, kontrol UNX hayvanların böbreklerindeki etkinliği etkilemeden NADPH oksidaz etkinliğindeki artışı ortadan kaldırmıştır. Bundan dolayı, DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyondaki böbrek işlevlerindeki değişikliklerden TMS’ye duyarlı olmayanların diğer mekanizmalar aracılığıyla oluşan ROT tarafından veya ROT’den bağımsız olarak DOCA’nın minerelokortikoit reseptörler üzerindeki genomik veya genomik olmayan etkiler aracılığıyla oluşturuluyor gibi görünmektedir (Fuller ve ark., 2005).

Bulgularımız, TMS’nin DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyonu, CYP1B1 etkinliğini geri çevirmesi ve böbrek işlevlerindeki değişiklikleri tamamen önlemeden kan basıncını normalize edici etkisinin yalnızca kısmen böbrek işlevlerindeki değişikliklere bağlı olduğunu

düşündürmektedir. TMS’nin DOCA-tuz hipertansiyonunda rol alan katekolaminlerin, vazopresin ve/veya ET-1’in (Crofton ve ark., 1979; de Champlain ve ark., 1987; Schiffrin ve ark., 1995) düzeylerini etkileyip etkilemediği de araştırılmalıdır. Aldosteron ve/veya DOCA-tuz’un kan basıncını, santral sinir sistemi üzerindeki doğrudan etkileri ile veya renin anjiyotensin ve sempatik sinir sistemi etkinliği ile ROT üretimini artırarak yükselttiği bilinmektedir (Gómez-Sánchez, 1997). Bunun yanı sıra, son bir çalışmada süperoksit üretimi aracılığıyla T hücrelerinin (Th17) DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkıda bulundukları gösterilmiştir. Bu yüzden, beyin (Rieder ve ark., 1998) ve lenfositler (Spencer ve ark., 1999) eksprese edilen CYP1B1’in ROT üretimi aracılığıyla DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona katkıda bulunması olasıdır.

Sonuç olarak, bu çalışma, CYP1B1’in DOCA-tuz ile oluşturulan hipertansiyona ve ilişkili kalp, damar ve böbrek dokularında hipertrofiye, endotel işlev bozukluğuna, artmış vasküler reaktiviteye ve bozulmuş böbrek işlevlerine, daha çok NADPH oksidaz etkinliği, ROT üretimi ve ERK1/2 ve p38 MAPK etkinliğindeki artışa bağlı olarak katkıda bulunduğunu gösteren ilk çalışmadır. CYP1B1, tuz ve mineralokortikoit fazlalığı ile oluşan hipertansiyonun tedavisinde geliştirilebilecek ilaçlar için yeni bir hedef olarak görülmektedir.

Destek Bu çalışma, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Grant R01-HL19134-35 tarafından desteklenmiştir. Seyhan ŞAHAN FIRAT, TUBİTAK tarafından 2219-Doktora sonrası araştırma bursu desteklenmiştir. Teşekkür Bu çalışmanın yürütülmesinde katkı ve desteklerini benden esirgemeyen başta değerli hocalarım Prof. Dr. Bahar TUNÇTAN ve Prof. Dr. Kafait U. MALİK ve çalışma arkadaşım Yrd. Doç. Dr. C. Kemal BUHARALIOĞLU’na çok teşekkür ederim.

83

KAYNAKLAR

Alonso-Galicia, M., Maier, K.G., Greene, A.S., Cowley, Jr. A.W., Roman, R.J. (2002) Role of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid in the renal and vasoconstrictor actions of angiotensin II. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 283: R60–R68.

Bao, W., Behm, D.J., Nerurkar, S.S., Ao, Z., Bentley, R., Mirabile, R.C., Johns, D.G., Woods, T.N., Doe, C.P.A., Coatney, R.W., Ohlstein, J.F., Douglas, S.A., Willette, R.N., Yue, T.L., (2007) Effects of p38 MAPK inhibitor on angiotensin II-dependent hypertension, organ damage, and superoxide anion production. J Cardiovasc Pharmacol 49: 362–368.

Bonventre, J.V., Swidler, M. (1988) Calcium dependency of prostaglandin E2 production in rat glomerular mesangial cells. Evidence that protein kinase C modulates the Ca2_-dependent activation of phospholipase A2. J Clin Invest 82: 168–176.

Cai, H. (2005) NAD(P)H oxidase-dependent self-propagation of hydrogen peroxide and vascular disease. Circ Res 96: 818–822.

Capdevila, J.H., Falck, J.R. ve Harris, R.C. (2000). Cytochrome P450 and arachidonic acid bioactivation. Molecular and functional properties of the arachdonate monooxygenase. J Lipid Res 41:163-181.

Choudhary, D., Jansson, I., Stoilov, I., Sarfarazi, M. ve Schenkman, J.B. (2004) Metabolism of retinoids and arachdonic acid by human and mouse cytochrome p450 1B1. Drug Metabol Disp 32: 840-847.

Crofton, J.T., Share, L., Shade, R.E., Lee-Kwon, W.J., Manning, M., Sawyer W.H. (1979) The importance of vasopressin in the development and maintenance of DOC-salt hypertension in the rat. Hypertension 1: 31–38.

de Champlain, J., Bouvier, M., Drolet, G. (1987) Abnormal regulation of the sympathoadrenal system in deoxy-corticosterone acetate-salt hypertensive rats. Can J Physiol Pharmacol 65: 1605–1614.

Drolet, G., Bouvier, M., de Champlain, J. (1989) Enhanced sympathoadrenal reactivity to haemorrhagic stress in DOCA-salt hypertensive rats. J Hypertens 7: 237–242.

Fatima, S., Yaghini, F.A., Malik, K.U. (2004) Cytosolic phospholipase A2 translocation to the nuclearenvelope by neurohumoral agents in vascular endothelial and smooth muscle

cells. Biochemistry of Lipids in Vascular Function 47-61.

Fuller, P.J., Young, M.J. (2005) Mechanisms of mineralocorticoid action. Hypertension 46: 1227–1235.

Gómez-Sánchez, E.P. (1997) Central hypertensive effects of aldosterone. Front Neuroendocrinol 18: 440–462.

Hong, H.J., Hsiao, G., Cheng, T.H., Yen, M.H. (2001) Supplementation with tetra-hydrobiopterin suppresses the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats. Hypertension 38: 1044–1048.

Imig, J.D., Hammock, B.D. (2009) Soluble epoxide hydrolase as a therapeutic target for cardiovascular diseases. Nat Rev Drug Discov 8: 794–805.

Korashy, H.M., El-Kadi, A.O.S. (2006) The role of aryl hydrocarbon receptor in the pathogenesis of cardiovascular diseases. Drug Metab Rev 38: 411–450.

Landmesser, U., Dikalov, S., Price, S.R., McCann, L., Fukai, T., Holland, S.M., Mitch, W.E., Harrison, D.G. (2003) Oxidation of tetrahydrobiopterin leads to uncoupling of endothelial cell nitric oxide synthase in hypertension. J Clin Invest 111: 1201–1209.

McGiff, J.C. (1981) Prostaglandins, prostacyclin, thromboxanes. Annu Rev Pharmacol Toxicol 21: 479–509.

Medhora, M., Chen, Y., Gruenloh, S., Harland, D., Bodiga, S., Zielonka, J., Gebremedhin, D., Gao, Y., Falck, J.R., Anjaiah, S., Jacobs, E.R. (2008) 20-HETE increases superoxide production and activates NAPDH oxidase in pulmonary artery endothelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 294: L902–L911.

Minuz, P., Jiang, H., Fava, C., Turolo, L., Tacconelli, S., Ricci, M., Patrignani, P., Morganti, A., Lechi, A., McGiff, J.C. (2008) Altered release of cytochrome P450 metabolites of arachidonic acid in renovascular disease. Hypertension 51: 1379–1385.

Miyata, N., Roman, R.J. (2005) Role of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) in vascular system. J Smooth Muscle Res 41: 175–93.

Muthalif, M.M., Benter, I.F., Uddin, M.R., Malik, K.U. (1996) Calcium / calmodulin-dependent protein kinase II_ mediates activation of

84

mitogen-activated protein kinase and cytosolic phospholipase A2 in norepinephrine-induced arachidonic acid release in rabbit aortic smooth muscle cells. J Biol Chem 271: 30149–30157

Muthalif, M.M., Benter, I.F., Khandekar, Z., Gaber, L., Estes, A., Malik, S., Parmentier, J.H., Manne, V., Malik, K.U. (2000) Contribution of Ras GTPase/MAP kinase and cytochrome P450 metabolites to deoxycorticosterone-salt-induced hypertension, 35(1 Pt 2): 457-63.

Nakao, J., Ooyama, T., Ito, H., Chang, W-C., Murota, S. (1982) Comparative effect of lipoxygenase products of arachidonic acid on rat aortic smooth muscle cell migration. Atherosclerosis 44: 339 –342.

Nasjletti, A. (1998) The role of eicosanoids in angiotensin-dependent hypertension. Hypertension 31: 194-200.

Natarajan, R., Gonzales, N., Lanting, L., Nadler, J. (1994) Role of the lipoxygenase pathway in angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell hypertrophy. Hypertension 23: I142–I147.

Omata, K., Abraham, N.G. ve Schwartzman, M.L. (1992) Renal cytochrome P450 arachidonic acid metabolism: localization and hormonal regulation in spontaneously hypertensive rats. Am J Physiol 262: F591-F599.

Reddy, M.A., Thimmalapura, P-R., Lanting, L., Nadler, J.L., Fatima, S., Natarajan, R. (2002) The oxidized lipid and lipoxygenase product 12(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid induces hypertrophy and fibronectin transcription in vascular smooth muscle cells via p38 MAPK and cAMP response element-binding protein activation: mediation of angiotensin II effects. J Biol Chem 277: 9920 –9928.

Rieder, C.R.M., Ramsden, D.B., Williams, A.C. (1998) Cytochrome P450 1B1 mRNA in the human central nervous system. Mol Pathol

51: 138–142.

Roman, R.J. (2002) P-450 Metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev 82: 131–185.

Roman, R.J., Ma, Y.H., Frohlich, B. ve Markham, B. (1993) Clofibrate prevents the development of hypertension in Dahl salt-sensitive rats. Hypertension 21: 98-988.

Sacerdoti, D., Escalante, B., Abraham, N.G., McGiff, J.C., Levere, R.D. ve Schwartzman,

M.L. (1989) Treatment with tin prevents the development of hypertension in spontaneously hypertensive rats. Science 243: 388-390.

Sánchez, M., Galisteo, M., Vera, R., Villar, I.C., Zarzuelo, A., Tamargo, J., Pérez-Vizcaíno, F., Duarte, J. (2006). Quercetin downregulates NADPH oxidase, increases eNOS activity and prevents endothelial dysfunction in spontaneously hypertensive rats. J Hypertens 24: 75–84.

Sasaki, M., Hori, M.T., Hino, T., Golub, M.S., ve Tuck, M.L. (1997) Elevated 12-lipoxygenase activity in thespontaneously hypertensive rat. Am J Hypertens 10: 371-378.

Schiffrin, E.L., Sventek, P., Li, J.S., Turgeon, A., Reudelhuber, T. (1995) Antihypertensive effect of an endothelin receptor antagonist in DOCA-salt spontaneously hypertensive rats. Br J Pharmacol 115: 1377–1381.

Smith, R.L., Weidemann, M.J. (1980) Reactive oxygen production associated with arachidonic acid metabolism by peritoneal macrophages. Biochem Biophys Res Commun 97: 973–980.

Song, C.Y., Ghafoor, H.U.B., Yaghini, F.A., Fang, X.R., Malik, K.U. (2010) Angiotensin II-induced reactive oxygen radical production by NAD(P)H oxidase is mediated by arachidonic acid metabolism via cytochrome P4501B1 in vascular smooth muscle cells (Abstract). FASEB J 24: 962.6.

Spencer, D.L., Masten, S.A., Lanier, K.M., Yang, X., Grassman, J.A., Miller, C.R., Sutter, T.R., Lucier, G.W., Walker, N.J. (1999) Quantitative analysis of constitutive and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced cytochrome P450 1B1 expression in human lymphocytes. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 8: 139–146.

Stec, D.E., Gannon, K.P., Beaird, J.S., Drummond, H.A. (2007) 20-Hydroxyeicosatetraenoic acid (20-HETE) stimulates migration of vascular smooth muscle cells. Cell Physiol Biochem 19: 121–128.

Su, P., Kaushal, K.M. ve Kroetz, D.L. (1998). Inhibition of renal arachidonic acid omega-hydroxylase activity with ABT reduces blood pressure in the SHR. Am J Physiol 275:, R426-438.

Trevisi, L., Bova, S., Cargnelli, G., Ceolotto, G., Luciani, S. (2002) Endothelin-1-induced

85

arachidonic acid release by cytosolic phospholipase A2 activation in rat vascular smooth muscle via extracellular signal-regulated kinases pathway. Biochem Pharmacol 64: 425–431.

Touyz, R.M., Cruzado, M., Tabet, F., Yao, G., Salomon, S., Schiffrin, E.L. (2003) Redox-dependent MAP kinase signaling by Ang II in vascular smooth muscle cells: role of receptor tyrosine kinase transactivation. Can J Physiol Pharmacol 81: 159–167.

Uddin, M.R., Muthalif, M.M., Karzoun, N.A., Benter, I.F., Malik, K.U. (1998) Cytochrome P-450 metabolites mediate norepinephrine-induced mitogenic signaling. Hypertension

31: 242–247.

Viedt, C., Soto, U., Krieger-Brauer, H.I., Fei, J., Elsing, C., Kübler, W., Kreuzer, J. (2000) Differential activation of mitogen-activated protein kinases in smooth muscle cells by angiotensin II. Involvement of p22phox and reactive oxygen species. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20: 940–948.

Wang, J.S., Zhang, F., Jiang, M., Wang, M.H., Zand, B.A., Abraham, N.G., Nasjletti, A. ve Laniado-Schwartzman, M. (2004) Transfection and functional expression of CYP4A1 and CYP4A2 using bicistronic vectors in vascular cells and tissues. J

Pharmacol Exp Ther 311: 913-920.

Yaghini, F.A., Song, C.Y., Lavrentyev, E.N., Ghafoor, H.U.B., Fang, X.R., Estes, A.M., Campbell, W.B., Malik, K.U. (2010) Angiotensin II-induced vascular smooth muscle cell migration and growth are mediated by cytochrome P450 1B1-dependent superoxide generation. Hypertension 55: 1461–1467.

Zhang, F., Wang, M-H., Krishna, M., Falck, J.R., Schwartzman, M.L. ve Nasjletti, A. (2001) Modulation by 20-HETE of phenylephrine-induced mesenteric artery contraction in spontaneously hypertensive and wistarkyoto rats. Hypertension 38: 1311-

1315.

Zhao, W., Parrish, A.R., Ramos, K.S. (1998) Constitutive and inducible expression of cytochrome P450IA1 and P450IB1 in human vascular endothelial and smooth muscle cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim 34: 671– 673.

* * * * *

ÖZGEÇMİŞ

1. KİMLİĞİ:

Adı, soyadı: Seyhan ŞAHAN-FIRAT

Doğum yeri ve tarihi: Kastamonu, 1976 Haziran

Medeni hali: Evli, 2 çocuklu

İş adresi: Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmakoloji Anabilim Dalı, 33169, Mezitli, Mersin

Telefon: + (324) 341 28 15 - 2613

Fax: + (324) 341 30 22

e-posta: [email protected]; [email protected]


Ortaöğrenim: 1987-1994; Gazi Anadolu Lisesi, Ankara

Lisans: 1994-1999; Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Ankara

Doktora: 2000-2005; Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı, Ankara


2000-2005; Farmakoloji ve Toksikoloji Doktoru; Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Farmakoloji ve Toksikoloji Anabilim Dalı, Ankara

2006- ; Yardımcı Doçent; Mersin Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı, Mersin

2009 Şubat-2010; Haziran Doktora Sonrası Araştırıcı, Department of Pharmacology, College of Medicine, Health Science Center, University of Tennessee, Memphis, Tennessee, USA

4. DOKTORA TEZİ:

“Hidrate Sodyum Kalsiyum Aluminosilikatla Beslenen Etlik Piliçlerde Enrofloksasinin Farmakokinetiği”, Ankara Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Ankara (2005).


86

5. PROJELER:

1. Şahan Fırat, S., Gilik, D., Kaçan, M., Sarı, A.N., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Korkmaz, R.B., Sıçanlarda Zimosan ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje no: BAP-SBE (DG) 2011-5 YL, Yürütücü, (Eylül 2011; devam ediyor).

2. Buharalıoğlu, C.K., Kaçan, M., Gilik, D., Sarı, A.N., Tunçtan, B., Şahan Fırat, S., Korkmaz, R.B., Sıçanlarda Endotoksin ile Oluşan Hipotansiyona Dalak Tirozin Kinazının Katkısının Araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-SBE (MK) 2011-5 YL, Araştırıcı, (Eylül 2011; devam ediyor).

3. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Cüez, T., Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerinde azalmanın eşlik ettiği hipotansiyona COX-2 ürünlerinin katkısının araştırılması. Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Mersin, Araştırıcı, (1 Temmuz 2010-1 Ocak 2012; devam ediyor).

4. Tunçtan, B., Serin, M.S., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Sarı, A.N., Endotoksemik sıçanlarda dayanıklı 20-HETE analoğu 5,14-HEDGE'nin CYP2C23'e bağımlı renal epoksijenaz ile çözünebilir epoksit hidrolaz ekspresyon ve etkinliği üzerindeki etkisinin proinflamatuvar

sitokin oluşumu ve MEK1/ERK1/2/NF-B yoluyla ilişkilendirilerek araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-ECZ F FB (BT) 2010-5 B, Araştırıcı, (9 Kasım 2010-9 Kasım 2012; devam ediyor).

5. Tunçtan, B., Buharalıoğlu, C.K., Serin, M.S., Şahan Fırat, S., Korkmaz, B., Cüez, T., Sari, A.N., Endotoksemik sıçanların kardiyak, renal ve vasküler dokularında nitrik oksit sentaz, siklooksijenaz ve sitokrom P450 4A enzimleri arasındaki etkileşmelerin mekanizmasının moleküler düzeyde araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje No: 109S121, Araştırıcı, (1 Kasım 2009-1 Kasım 2012;, devam ediyor).

6. Sucu, N., Urhan Küçük, M., Şahan Fırat, S., Aytaçoğlu, B.N., Canacankatan, N., Tunçtan, B., ADE inhibisyonunun kardiyopulmoner bypass sırasında ortaya çıkan miyokardiyal hasar üzerindeki etkisinin ADE gen polimorfizmi ile ilişkilendirilmesi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP-TF CTB (NS) 2009-3, Araştırıcı, (11 Mayıs 2009-11 Mayıs 2012; devam ediyor).

7. Urhan Küçük, M., Şahan Fırat, S., Sucu, N., Aytaçoğlu, B.N., Tunçtan, B., Vezir, O., Canacankatan, N., ACE inhibitörü alan hastalarda, kardiopulmoner bypass sırasında oluşan miyokardiyal hasarın IL-6, IL-8 ve TNF alfa gen polimorfizmleri ile ilişkilendirilmesi. Adıyaman Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Adıyaman, Proje No: FEFBAP 2009-2, Araştırıcı, (2009-2011; devam ediyor).

8. Şahan Fırat, S., CYP1B1’nın sıçanlarda hipertansiyon gelişimi ve sürdürülmesindeki rolü. TÜBİTAK 2008 yılı 2219-Yurtdışı Doktora Sonrası Araştırma Burs Programı 1. Dönem Projesi, Memphis, Tennessee, ABD, Araştırıcı, (Şubat 2009-Haziran 2010) (Malik, K.U., Principal Investigator).

9. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., 20-HETE agonisti N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil] glisinin endotoksin ile oluşan hipotansiyonu önleyici etkisinin mekanizmasının araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Doktora Tez Projesi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (TC) 2008-6 DR, Araştırıcı, (8 Eylül 2008-8 Eylül 2010).

10. Tunçtan, B., Sarı, A.N., Korkmaz, B., Cüez, T., Canacankatan, N., Vezir, Ö., Sucu, N., Ayaz, L., Tamer, L., Yılmaz, N., Şahan Fırat, S., Seçici Rho-kinaz inhibitörü Y-27632'nin periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef organ iskelet kası ve uzak organ böbrek hasarı üzerine etkisi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (ANS) 2008-9 YL, Araştırıcı, (22 Aralık 2008-22 Aralık 2009).

11. Canacankatan, N., Görür, A., Doran, F., Algül, Ö., Tunçtan, B., Şahan Fırat, S., Hepatosellüler karsinomda apoptozis

87

mekanizması ve bazı benzimidazol türevlerinin hepatosellüler karsinom üzerine etkisi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Yüksek Lisans Tez Projesi, Proje No: BAP-SBE BA (AG) 2008-9 YL (12 ay), Araştırıcı, (27 Kasım 2008-27 Kasım 2009).

12. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Selektif 20-HETE agonisti N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyon ve vasküler hiporeaktiviteyi önleyici etkisinin mekanizmasının araştırılması. Novartis Sağlık, Gıda ve Tarım Ürünleri Sanayi ve Ticaret A.Ş., Mersin, Araştırıcı, (Ağustos 2008-Haziran 2009).

13. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Endotoksemik sıçanlarda ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. TÜBİTAK Projesi, SBAG, Mersin, Proje No: 106S299 (SBAG-3508), Araştırıcı, (1 Şubat 2007-1 Şubat 2009).

14. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Demiryürek, A.T., Endotoksemik sıçanlarda mitojen ile aktive edilen protein kinaz kinaz 1/ekstraselüler sinyal ile düzenlenen kinaz 1/2 yolu aracılıklı vasküler hiporeaktivitenin mekanizmalarının araştırılması. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Doktora Tez Projesi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (RBK) 2006-3 DR, Araştırıcı, (24 Kasım 2006-24 Kasım 2008).

15. Tunçtan, B., Özbaşoğlu, O., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Yalçın, A., Buharalıoğlu, C.K., Endotoksin ile oluşturulan inflamatuvar hiperaljezide talidomidin etkilerinin incelenmesi. Mersin Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP SBE EMB (OÖ) 2006-3 YL, Araştırıcı, (24 Kasım 2006-24 Mayıs 2008).

16. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Endotoksin ile oluşan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyona sitokrom P450 ve siklooksijenaz-2 ürünlerinin katkısı. Mersin Üniversitesi

Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi, Mersin, Proje No: BAP ECZF EMB (BT) 2006-3, Araştırıcı, (22 Kasım 2006-22 Mayıs 2008).

6. BURSLAR:

TÜBİTAK 2008 yılı 2219-Yurtdışı Doktora Sonrası Araştırma Bursu (Şubat 2009-Haziran 2010); “CYP1B1’nın sıçanlarda hipertansiyon gelişimi ve sürdürülmesindeki rolü.”; Department of Pharmacology, College of Medicine, Health Science Center, The University of Tennessee, Memphis, Tennessee, USA.

7. ÜYELİKLER:

Türk Farmakoloji Derneği

Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Derneği

Mersin Veteriner Hekimleri Odası

8. YABANCI DİL:

İngilizce (KPDS: 72; ÜDS: 76)

YAYIN LİSTESİ


1. Canacankatan, N., Sucu, N., Aytacoglu, B., Gul, O.E., Gorur, A., Korkmaz, B., Sahan-Firat, S., Antmen, E.S., Tamer, L., Ayaz, L., Vezir, O., Kanik, A., Tunctan, B. Affirmative effects of Iloprost on apoptosis during ischemia-reperfusion injury in kidney as a distant organ. Renal Failure 34,111-118 (2012).

2. Malik, K.U., Jennings, B.L., Yaghini, F.A., Sahan-Firat, S., Song, C.Y., Estes, A.M., Fang, X.R. Contribution of cytochrome P4501B1 to hypertension and associated pathophysiology: A novel target for hypertensive agents. Prostaglandins & Other Lipid Mediators Dec 20 [Epub ahead of print] (2011).

3. Buharalioglu, C.K., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Sari, A.N., Malik, K.U., Tunctan, B., Piroxicam reverses endotoxin-induced hypotension in rats: contribution of vasoactive eicosanoids

88

and nitric oxide. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 109, 186-194 (2011).

4. Korkmaz, B., Buharalioglu, K., Sahan-Firat, S., Cuez, T., Tunctan, B., Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC /PKG pathway associated with peroxinitrite formation contributes to hypotension and vascular hyporeactivity in endotoxemic rats. Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 24(3), 160-172 (2011).

5. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, K.U., Contribution of vasoactive eicosanoids and nitric oxide production to the effect of selective cyclooxygenase-2 inhibitor, NS-398, on endotoxin-induced hypotension in rats. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 107(5), 877-882 (2010).

6. Cuez, T., Korkmaz, B., Buharalioglu,

C.K., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunctan, B., A synthetic analog of 20-HETE, 5,14-HEDGE, reverses endotoxin-induced hypotension via increased 20-HETE levels associated with decreased iNOS protein expression and vasodilator prostanoid production in rats. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology, 106(5), 378-388 (2010).

7. Jennings, B.L., Sahan-Firat, S., Estes,

A.M., Das, K., Farjana, N., Fang, X.R., Gonzalez, F.J., Malik, K.U., Cytochrome P450B1 contributes to angiotensin II-induced hypertension and associated pathophysiology. Hypertension, 56(4), 667-674 (2010).

8. Sahan-Firat, S., Jennings, B.L., Yaghini, F.A., Song, C.Y., Estes, A.M., Fang, X.R., Farjana, N., Khan, A.I., Malik, K.U., 2,3’,4,5’-Tetramethoxystilbene prevents deoxycorticosterone-salt-induced hypertension: contribution of cytochrome P-450 1B1. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology, 299 (6), H1891-1901 (2010).

9. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., A 20-HETE agonist, N-[20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienoyl]glycine, opposes the fall in blood

pressure and vascular reactivity in endotoxin-treated rats. Shock, 30(3), 329-335 (2008).

10. Büyükafşar, K., Yalçın, İ., Kurt, H., Tiftik, R.N., Şahan-Fırat, S., Aksu, F., Rho kinase inhibitor, Y-27632 has an antinociceptive effect in mice. European Journal of Pharmacology, 541, 49-52 (2006).

11. Büyükafşar, K., Akça, T., Tiftik, R.N., Şahan-Fırat, S., Aydın S., Contribution of Rho-kinase in human gallbladder contractions. European Journal of Pharmacology 540, 162-167 (2006).

12. Şahan-Fırat, S., Tiftik, R.N., Nacak, M., Büyükafşar, K., Rho kinase expression and its central role in ovine gallbladder contractions elicited by a variety of excitatory stimuli. European Journal of Pharmacology, 528, 169-175 (2005).


1. Buharalioglu, C.K., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Sari, A.N., Malik, K.U., Tunctan, B., A selective cyclooxygenase-1 inhibitor, piroxicam, reverses endotoxin-induced hypotension in rats: contribution of vasoactive eicosanoids and nitric oxide. 10

th World

Congress on Inflammation, Paris, France, June 25-29, Inflammation Research 60 (Suppl. 1), P-203 (2011).

2. Jennings, B.L., Sahan-Firat, S., Estes, A.M., Malik, K.U., Contribution of cytochrome (CYP) P450 1B1 in various models of hypertension in rats and mice: a novel target for the development of anti-hypertensive agents. Experimental Biology 2010, Anaheim, CA, USA, April 24-28, Program/Abstract No:786.21/3473, FASEB J 24, (2010).

3. Sahan Firat, S., Jennings, B.L., Estes, A.M., Farjana, N., Khan, A.H., Fang, X.R., Malik K.U., DOCA/Salt-induced hypertension and associated increase in vascular reactivity and cardiac and vascular hypertrophy are mediated by cytochrome P450 1B1. Experimental Biology 2010, Anaheim, CA, USA, April

89

24-28,Program/Abstract No: 786.16 / 2765, FASEB J 24, (2010).

4. Sahan-Fırat, S., Korkmaz, B., Cuez, T., Ayaz, L., Tamer, L., Buharalioglu, C.K., Sarı, A.N., Tunctan, B. Prostaglandins contribute to endotoxin-induced increase in lipid peroxidation via nitric oxide production during endotoxemia in rats. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: LB368/656, FASEB J 23, LB368 (2009).

5. Korkmaz, B., Buharalioglu, K., Demiryürek, T.A., Sahan-Firat, S., Cuez, T., Tunctan, B., Activation of MEK1/ERK1/2/iNOS/sGC/PKG pathway contributes to the fall in blood pressure and vascular reactivity in endotoxemic rats. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 932.5/1009, FASEB J 23, 932.5 (2009).

6. Buharalioglu, K., Ozbasoglu, O., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yalcin, A., Tunctan, B., Thalidomide potentiates analgesic effect of COX inhibitors on endotoxin-induced hyperalgesia by modulating TNF-a, PGE and NO synthesis in mice. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 742.4/1561, FASEB J 23, 742.4 (2009).

7. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sahan-Firat, S., Yildirim, H., Tamer, L., Buharalioglu, K., Falck, J.R., Malik, K.U., Increased production of 20-HETE contributes to the effects of COX inhibitors to prevent the decrease in lipid peroxidation and increase in catalase activity during endotoxemia. Experimental Biology 2009, New Orleans, LA, USA, April 18-22, Program/Abstract No: 937.13/658, FASEB J 23, (2009).

8. Tunctan, B., Korkmaz, B., Buharalioglu, CK., Sahan-Firat, S., Anjaiah, S., Falck, JR., Yildirim, H., Tamer, L., Roman, RJ., Malik, KU., 20-HETE agonist, N-[20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienoyl]glycine, opposes the endotoxin-induced fall in blood pressure and the decrease in vascular reactivity and lipid peroxidation and increased catalase activity via inhibition of NO production in rats. Experimental Biology 2008, San Diego,

CA, USA, April 5-9, Abstract No: 6051, FASEB J 22, (2008).

9. Sahan-Fırat, S., Canacankatan, N, Korkmaz B, Yıldırım, H., Tamer, L., Buharalioglu CK., Sarı, AN., Tunctan, B., Differential regulation of oxidative stress by NO in vascular and nonvascular tissues of endotoxemic rats. Experimental Biology 2008, San Diego, CA, USA, April 5-9, Abstract No: 5981, FASEB J 22, (2008).

Science Citation Index-Expanded Kapsamındaki Dergilerde Yer Alan ve Uluslararası Toplantılarda Yapılan Sözlü Sunumlar

1. Tunctan, B., Korkmaz, B., Cuez, T., Sarı, A.N., Kacan, M., Gilik, D., Buharalioglu, C.K., Sahan-Firat, S., Schunck, W.H, Serin, M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., Contribution of iNOS, COX-2 and CYP4A1 to the protective effect of a synthetic analog of 20-HETE, 5,14-HEDGE, against endotoxin-induced hypotension and mortality in experimental model of septic shock in rats and mice. 10

th World Congress on Inflammation,

Paris, France, June 25-29, OC-059, Inflammation Research 60 (Suppl. 1), S55 (2011).

2. Jennings, BL., Das K., Sahan-Firat, S., Estes, AM., Malik, KU., Contribution of cytochrome P450 1B1 to angiotensin II-induced hypertension. 63rd High Blood Pressure Research Conference 2009, Chicago, IL, USA, September 23-26, Abstract No: O87, Hypertension, (2009).

Ulusal/ Uluslararası Toplantılarda Sunulan Poster Özetleri

1. Görür, A., Canacankatan, N., Gül, O.E., Algül, Ö., Erdoğan, S., Korkmaz, B., Şahan-Fırat, S., Tunçtan, B., Doran, F. Hepatoselüler karsinom gelişim sürecinde bazı benzimidazol türevlerinin antioksidan kapasite üzerine etkisi. XXIII. Ulusal Biyokimya Kongresi, Hilton Hotel, Adana, 29 Kasım-2 Aralık, Program ve Bildiri Özetleri Kitabı, s. 278, Bildiri No: P-09, Türk Biyokimya Dergisi (2011).

2. Buharalıoğlu, C.K., Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Korkmaz, B., Cüez, T., Şahan Fırat, S., Malik, K.U., Tunctan, B.,

90

Endotoksemik sıçanlarda piroksikamın hipotansiyonu önleyici etkisine MEK1/ERK1/2/iNOS/NADPH oksidaz yolunun katkısı. 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, 19-22 Ekim, Bildiri Kayıt No: 159, Sunum Kodu: P-9 (2011).

3. Canacankatan, N., Sucu, N., Sahan-Firat, S., Gorur, A., Antmen, S.E., Korkmaz, B., Tunctan, B., Gul, O.E., Tamer, L., Ayaz, L., Vezir, Ö., Kanik, A., Attenuation of ischemia-reperfusion injury by Iloprost on apoptosis and antioxidant capacity in kidney as a distant organ. 3

rd

International Congress on Cell Membranbes and Oxidative Stress: Focus on Calcium Signalling and TRP Channels, Poster No 54, Isparta, June 22-27, Turkey (2010).

4. Sarı, A.N., Şahan Fırat, S., Vezir, Ö., Yılmaz, Ş.N., Korkmaz, B., Cüez, T., Canacankatan, N., Sucu, N., Ayaz, L., Tamer, L., Görür, A., Tunçtan, B., Seçici Rho-kinaz inhibitörü Y-27632'nin sıçanlarda oluşturulan periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef organ gastroknemius kası ve uzak organ böbrek zedelenmesi üzerindeki etkisi. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 278, Bildiri No: P-097 (2009).

5. Cüez, T., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Falck, J., Malik, K.U., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanlarda N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin eNOS, iNOS ve hsp90 protein ekspresyonu ile prostanoit ve 20-HETE düzeyleri üzerindeki etkisi. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 262, Bildiri No: P-082 (2009).

6. Şahan-Fırat, S., Canacankatan, N., Korkmaz, B., Yıldırım, H., Tamer, L., Buharalıoğlu, C.K., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanların karaciğerinde artan oksidatif stres üzerinde indüklenebilir nitrik oksit sentaz inhibisyonunun etkisi. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim, Özet Kitabı, s. 378, Bildiri No: P104 (2007).

7. Şahan-Fırat, S., Tiftik, R.N., Nacak, M., Büyükafşar, K., Central role of Rho/Rho-kinase pathway in the neurogenic

contractile activity of the sheep gallbladder smooth muscle. 4th National Congress of Neuroscience, Mersin, Turkey, March 29-April 2, Abstract Book, p. 35-36, Abstract No: P-75, (2005).

8. Şahan, S., Kaya, S., The Pharmacokinetics of Enrofloxacin in broiler chickens fed with feed containing hydrate sodium calcium aluminosilicate. Birinci Ulusal Veteriner Farmakoloji ve Toksikoloji Kongresi (Uluslararası katılımlı), Ankara, 22-24 Eylül, Kongre Kitabı, s. 318-319, (2005).

Ulusal / Uluslararası Toplantılarda Yapılan Sözlü Sunumlar

1. Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Şahan Fırat, S., Buharalıoğlu, C.K., Vezir, Ö., Korkmaz, B., Cüez, T., Sucu, N., Tunctan, B., Sıçanlarda oluşturulan periferik iskemi/reperfüzyona bağlı hedef organ gastroknemius kası ve uzak organ böbrek zedelenmesine RhoA/Rho-Kinaz/ERK1/2/iNOS/NADPH oksidaz yolunun katkısı. 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, 19-22 Ekim, Bildiri Kayıt No: 158, Sunum Kodu: S-3 (2011).

2. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Cüez, T., Sarı, A.N., Kaçan, M., Gilik, D., Buharalıoğlu, C.K., Şahan Fırat, S., Schunk, W.H., Serin, M.S., Falck, J.R., Malik, K.U., Sıçan ve farelerde oluşturulan deneysel septik şok modelinde 20-HETE analoğu 5,14-HEDGE’nin hipotansiyonu ve mortaliteyi önleyici etkisine iNOS, COX-2, CYP4A1 ve NADPH oksidazın katkısı. 21. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Eskişehir, 19-22 Ekim, Bildiri Kayıt No: 163, Sunum Kodu: S-4 (2011).

3. Tunçtan, B., Cüez, T., Korkmaz, B., Şahan Fırat, S., Buharalıoğlu, C.K., Yıldırım, H., Sarı, A.N., Tamer, L., Falck, J., Malik, K.U., Endotoksemik sıçanlarda NO oluşumundaki artmaya 20-HETE düzeylerindeki azalmanın eşlik ettiği oksidatif stres ve inflamasyon üzerinde yapay bir 20-HETE analoğu olan N-[20-hidroksieikoza-5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin etkisi. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 129, Bildiri No: SS-01 (2009).

91

4. Korkmaz, B., Cüez, T., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek, A.T., Şahan Fırat, S., Sarı, A.N., Tunçtan, B. Endotoksemik sıçanlarda gelişen kaspaz-3 aracılıklı apoptoza ve oksidatif strese MEK1/ERK1/2/iNOS yolunun katkısı. 20. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Kızılağaç, Manavgat, Antalya, 4-7 Kasım, Özet Kitabı, s. 141, Bildiri No: S-01 (2009).

5. Tunctan, B., Korkmaz B, Cuez, T., Buharalioglu, CK., Sahan-Firat, S., Falck, J., Malik, KU., Interactions between cytochrome P450A, cyclooxygenase and nitric oxide synthase during endotoxemia: therapeutic implications for inflammatory diseases. EHRLICH II, 2nd World Conference on Magic Bullets, Nurnberg, Germany, October 3-5, Program/Abstract No: 829 (2008).

6. Tunçtan, B., Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Şahan-Fırat S., Anjaiah, S., Falck, J., Roman, R.J., Malik, K.U., Endotoksin ile olusan nitrik oksit aracılıklı hipotansiyon ve vasküler hiporeaktivite üzerinde selektif 20-hidroksieikoza tetraenoik asit agonisti N-[20-hidroksi eikoza-5(Z),14(Z)-dienoil]glisinin etkileri. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim, Özet Kitabı, s. 212, Bildiri No: S-02 (2007).

7. Korkmaz, B., Buharalıoğlu, C.K., Demiryürek A.T., Şahan-Fırat S., Tunçtan, B., Endotoksemik sıçanların torasik aortasında gelişen vasküler hiporeaktiviteye indüklenebilir nitrik oksit sentaz/çözünebilir guanilil siklaz/protein kinaz G yolunun katkısı. 19. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Trabzon, 24-27 Ekim, Özet Kitabı, s. 211, Bildiri No: S-01 (2007).

8. Büyükafşar, K., Akça, T., Tiftik, R.N., Şahan-Fırat, S., Aydın, S. İnsan safra kesesinde Rho-kinaz enzim ekspresyonu ve kontraktil aktivitedeki esaslı rolü. Türk Farmakoloji Derneği 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi, Desem, İzmir, 28 Eylül-1 Ekim, Bildiri Özetleri Kitabı, s. 220, Bildiri No: S-11 (2005).

* * * * *

NOTLAR

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

……………………………………………

92

Serin/Treonin Kinaz Geni Transfekte Edilmiş Kardiyak Projenitor Hücrelerin Elektrofizyolojik Özellikleri ve Ko-kültür Ortamında Kardiyak Miyozitler ile İnteraksiyonu Hale TUFAN

GİRİȘ VE AMAÇ

Embriyonik kök hücreler (embryonic stem cells, ESC), indüklenebilir pluripotent kök hücreler (induced pluripotent stem cells, iPSC), fetal miyozitler, endoteliyal projenitör hücreler, kemik iliği kök hücreleri gibi birçok hücre tipi hasarlanmıș kalp kasının rejenerasyonu için denenmektedir (Dimmeler, 2001). Son yıllarda fare, köpek ve insan erișkin kardiyak kök hücreleri (cardiac stem cells, CSC) üzerinde gerçekleștirilen araștırmalar kalpte, multipotent, c-kit

+ ve/veya Sca-1

+ özellik

gösteren, kendini yenileyebilen, koloni olușturabilen kardiyak projenitör hücrelerden (cardiac progenitor cells, CPC) olușan bir CSC rezervuarının varlığını göstermiștir. Bu özellikleri ile kardiyak projenitör hücreler, hasarlanmıș ya da yetmezlik gelișmiș kalbin onarılmasında önemli bir potansiyale sahip gibi görünmektedir (Beltrami, 2003; Torella, 2005; Dawn, 2005; Han, 2010; Barile, 2007). CSC’ler uzun süreli kültür ortamında tek hücreden köken alan klon formasyonu olușturma, kardiyak miyozit, damar düz kası ve endotel hücrelere diferansiye olabilme gibi kök hücre benzeri özellikler göstermiș, bunun yanı sıra in-vitro șartlarda kardiyak miyozitlerin hayatta kalma süresini de uzatmıștır (Miyamoto, 2010). Ancak, CPC’lerin kalp dokusuna transplantasyonu sonrasında dokunun kendi miyozitleri ile elektrofizyolojik ve mekanik bağlantısı netlik kazanmamıștır (Murry, 2005, Anversa, 2007). Doku içerisine nakledilen kök hücrelerin sağ kalım süresinin kısalığı ve dokunun kendi miyozitleri ile fonksiyonel bir integrasyonunun gösterilememiș olması, CPC kullanılan kök hücre tedavilerinin önünde önemli bir engel olmaya devam etmektedir.

Son yıllarda, serin/treonin kinaz (Pim-1) ekspresyonunu artıracak șekilde genetik olarak modifiye edilen CPCeP (Engineering of CPC with the serine/threonine kinase Pim-1)’ler ile kalbin rejenerasyon ve remodeling kapasitesinin arttığı, infark olușmuș miyokardiyumda hemodinamik parametrelerin iyileștiği ve nakledildiği fare kalbinde dokunun kendi miyozitlerinin

sağkalım süresinin 32 haftaya kadar uzadığı rapor edilmiștir (Fischer, 2009). Yine de, CPCeP’lerin rejenerasyon sürecinde esansiyel olan kardiyak miyozitlerle elektromekanik bağlantıları ve elektro-fizyolojik özellikleri henüz tanımlanmamıștır.

Kardiyak gelișim, riyanodin reseptörleri (RyR), sarkoplazmik retikülum Ca

2+ pompası

(SERCA), fosfolamban (PLB) ve L-tipi Ca2+

kanallarını (DHPR) da kapsayan Ca

2+

ișleme proteinlerinin programlanmıș bir dizinde gerçekleșmesini içermektedir. Bu süreçte Na

+-Ca

2+ değiș-tokuș sistemi (NCX)

seviyeleri ise aynı kalmakta ya da hafifçe bir azalma göstermektedir (Liu, 2002). Kalsiyum akım yoğunluğu fetal gelișimden doğuma kadar giderek artmakta, sarkoplazmik retikülum maturasyonu ise biraz daha geride kalmaktadır (Tohse, 2004). 1-2 günlük yenidoğan kardiyak miyozitlerinde tam olarak gelișmiș, kalsiyumla indüklenen kalsiyum salınım (Ca

2+-induced Ca

2+ release, CICR)

depolarının varlığı gösterilmiștir (Janowski, 2006). DHPR’lerden Ca

2+ giriși ile

RyR’lerden Ca2+

salınımı kardiyak miyozit gelișiminin erken evrelerinde ortaya çıkmakta ve yetișkin miyozitlerde CICR için primer tetikleyici haline gelmektedir (Janowski, 2010).

Farklı kök hücre tiplerinde Ca2+

sinyalleme ve elektrofizyolojik olaylar da farklılık göstermektedir. Örneğin, diferansiye olmamıș insan ESC’lerinde ve insan ESC’lerinden köken alan kardiyak miyozitlerde potasyum (IKr), hiperpolarize edici (If) ve L-tipi Ca

2+ (ICa) akımlarının

varlığı gösterilmiștir (Sartiani, 2007). Yine diferansiye olmamıș fare kemik iliği mezenșimal kök hücrelerinde (Mesenchimal stem cells, MSC) (Tao, 2007) ve farelerden elde edilen diferansiye olmamıș kardiyak c-kit

+ projenitör hücrelerde fonksiyonel IKDR, IKir

ve IClvol varlığını göstermiștir (Han, 2010). Diğer bir grup çalıșmacı da diferansiye olmamıș fare kemik iliği c-kit

+ kök

hücrelerinde yalnızca dıșa yönelik akımların bulunduğunu, bu kök hücrelerin yenidoğan

93

kardiyak miyozitleri ile birlikte kültür yapıldığında ise voltaj-bağımlı Na

+ ve Ca

2+

kanalları eksprese ettiklerini ancak, bu kanalların elektrofizyolojik anlamda fonksiyonel olmadıklarını bildirmiștir. Bunun yanı sıra, yine bu hücreler arasında fonksiyonel gap bağlantılarının varlığı gösterilememiștir (Lagostena, 2005). Fischer ve ark. CPC ve CPCeP’lerin miyokard içine transplantasyonundan 12 hafta sonra bir gap bağlantı proteini olan Connexin (Cx43) bulundurduğunu rapor etmișlerdir (Fischer, 2009). Miyamoto ve ark. CPC’nin kardiyomiyozitler ve miyokardiyal yapılanma üzerindeki yararlı etkilerinin direkt hücreler arası elektro-mekanik bağlantıdan, parakrin etkilerden veya her ikisinden birden kaynaklana-bileceği bildirilmiștir (Miyamoto, 2010).

Güney Karolina Üniversitesi, Güney Karolina Tıp Üniversitesi ve Clemson Üniversitesi bünyesinde hizmet veren Kardiyak Sinyalleme Merkezi’nde gerçekleștirilen bu çalıșmada, CPCeP’lerde fonksiyonel Ca

2+ kanallarının varlığı, Ca

2+

ișleme özellikleri ve hücreler arası elektro-fizyolojik integrayon, tek bașlarına kültür ortamında ve yenidoğan sıçan kardiyo-miyozitleri ile birlikte kültür edilerek araștırılmıștır.

GEREÇ VE YÖNTEM

Hücre Kültürü

Güney Karolina Tıp Üniversitesi yerel etik kurulunun onay ve takibi altında, 4-6 günlük yenidoğan sıçanlar dekapite edildikten sonra toraks açıldı, kalp eksize edildi, ana damarlar ve atriumlar ayrıldı. Ventriküller jilet kullanılarak kıyıldı ve 50 µg/ml tripsin içeren HBSS ile 14-16 saat boyunca +4°C’de bekletildi. Ardından 20 dk boyunca tripsin inhibitörü (200 µg/ml)’ne maruz bırakıldı. Tek tek hücreler halinde yenidoğan sıçan kardiyak miyozitleri (NRCM) elde etmek amacıyla kollajenaz (100 U/ml) 30 dk boyunca uygulandı, filtrelendikten ve ardından 1000 rpm de 3 dk santrifüj edildikten sonra %10 FBS, %1 penisilin-streptomisin ve %1 non-esansiyel amino asit içeren DMEM solüsyonunda yeniden süspanse edildi. Fibroblastları elimine etmek amacıyla petr kutularında 60 dakika inkübatörde bekletildi. Izole edilen hücrelerin yaklașık %80 oranında sağlıklı oldukları gözlendi. Cam lameller üzerinde elektro-

fizyolojik deneylerde kullanılmak üzere hazırlandı. Bir grup NRCM (10

5 hücre/ml)

ise koșullu medyum (conditioned medium) elde etmek üzere 37°C’de 7 gün boyunca inkübe edildi, süpernatantı toplandı, santrifüj edildi ve %10 FBS ilave edilerek -20°C’de depolandı, CPCeP’ler için kültür solüsyonu olarak kullanıldı.

San Diego Devlet Üniversitesi, Kalp Enstitüsü, Moleküler Biyoloji Laboratuvarı’nda geliștirilen kontrol CPC’ler, yeșil flosesan protein (Green Fluorescent Protein, GFP) (+) CPC’ler ve GFP (+) CPCeP’ler %10 FBS, %2 ITS, 0.4 μg/ml EGF, 0.2 ng/ml bFGF ve 0.01 μg/ml LIF içeren DMEM-F12 solüsyonunda pasajlandı. Pasajlanan hücrelerin %70-80’inde belirgin GFP sinyalinin varlığı saptandı. Hücreler tripsin kullanılarak yeniden süspanse edildi, elektrofizyolojik çalıșmaya uygun cam lameller üzerine konuldu. Bir grup CPCeP ise NRCM ve/veya koșullu medyum (1/4 koșullu medyum + 3/4 DMEM-F12 solüsyonu içerisinde 1-3 gün ya da 4-7 gün kültüre edildi.

CPCePlerin 10-15 μm çaplı, bașlangıçta yuvarlak șekilli, daha sonra proliferasyonla birlikte sivri uzantılara sahip oldukları gözlendi. 7 günlük kültürden sonra hücrelerin yuvarlak șeklini kaybettiği, 100-150 μm çapında, yassı, multilateral șekilli ve dendrit benzeri uzantılara sahip oldukları saptandı. Elektrofizyolojik çalıșmalar için, yeni büyümekte olan, yuvarlak șekilli ve sivri uzantılarla homojen sitoplazmaya sahip, yumușak ve elastik hücre membranı olan, tek bașına yerleșim gösteren, sağlıklı hücreler seçildi. Gözlemsel olarak NRCM ile bitișik olarak yerleșmiș CPCePler, NRCM’nin her kontraksiyonu ile senkronize șekilde çekiliyorlarsa fiziksel olarak birbirlerine bağlı oldukları düșünüldü ve elektriksel bağlantı için test edilmeye uygun olduklarına karar verildi.

Elektrofizyolojik Ölçümler

Hücreler banyo ortamında Tyrode solüsyonu (mM; NaCl 137, KCl 5.4, CaCl2 2, HEPES 10, MgCl2 1, Glukoz 10 (pH 7.4, NaOH ile) ile perfüze edildi. Whole-cell patch-clamp ölçümleri DAGAN voltaj-klamp amplifikatör ve pClamp 10.2 yazılım (Molecular Devices Corporation, CA) kullanılarak kaydedildi, Clampfit 10.2 (Molecular Devices Corporation, CA) ve Origin v8.0 (OriginLab, Northampton, MA) programları ile

94

değerlendirildi. 3-5 MΩ dirence sahip borosilikat pipetler ise P-87 model (Sutter Instruments, CA) horizontal pipet çekici kullanılarak hazırlandı ve pipetler, hazırlanan zayıf Ca

2+ tamponlu (Sol-1: mM;

NaCl 15, CsCl 100, TEACl 20, MgCl2 0.5, Ca2Cl 0.1, EGTA 0.2, HEPES 10, Glukoz 10, MgATP 5 and cAMP 0.1, 290 mosmol, pH 7.15, CsOH ile) ya da güçlü Ca

2+

tamponlu (Sol-2: mM; NaCl 15, CsCl 94, TEACl 10, Ca2Cl 6.2, EGTA 14, HEPES 10, Glukoz 10, MgATP 5 and cAMP 0.1, 300 mosmol, pH 7.2, CsOH ile) solüsyon ile dolduruldu. Hücre içi serbest Ca

2+

konsantrasyonu ([Ca2+

]i) Sol-1 için 173 nM, Sol-2 için ise 100 nM olarak hesaplandı. İlaç ve kimyasalların yaklașık 20 ms içerisinde hücreye ulașmasını sağlamak üzere elektronik kontrollü mikroperfüzyon sistemi kullanıldı. Bütün deneyler 22-25°C de gerçekleștirildi.

Hücreler Arası Floresan Boya Transferi

CPCeP ve NRCM arasındaki gap bağlantılarının varlığı, pipet solüsyonuna floresan boya (Lucifer yellow, 150 μM) ilave edilerek patch’lenmiș CPCeP’ler aracılığıyla değerlendirildi. Boya transferi sırasında membran kapasitansı ile kalsiyum (ICa) ve sodyum (INa) akımları da simultane olarak kaydedildi. CPCeP ve NRCM arasında güçlü fiziksel bağlantı gözlenen deneylerin çoğunda CPCeP’den NRCM’ye boya transferi, hücrenin 5 dk’lik diyalizi sonra-sında görüntülenmeye bașlandı. Veri analizi için Con2 yazılımı ve Origin v8.0 programı kullanıldı.

İmmünhistokimya

Ko-kültür ortamındaki CPCeP ve NRCM’lerde bir gap bağlantı protein olan Cx43’ün varlığı immünhistokimyasal yöntemle araștırıldı. Kültür medyumu alındı, hücreler PBS ile yıkandı ve %4 paraformaldehit içerisinde oda sıcaklığında 10 dk boyunca fikse olması beklendi. Ardından hücreler 3 kez PBS ile yıkandı, %1 BSA, %0.1 Triton içeren PBS ile +4°C’de gece boyunca bloklandı. Bloklama solüsyonunun dıșarı alınmasının ardından primer antikor (1:2,000 anti Cx43, Sigma) oda sıcaklığında 2 saat boyunca uygulandı, sonrasında %0.05 Triton içeren PBS’de 2 saat daha +4°C’de tutuldu. Hücreler 3 kez PBS ile yıkandı, sekonder antikor anti-rabbit Alexa Fluor 555 (1:2,000) PBS içerisinde 2 saat boyunca oda sıcaklığında uygulandı.

Sekonder antikorun dıșarı alınmasından sonra ProLong Gold ile DAPI hücrelerin bulunduğu lamel üzerine uygulanarak oda sıcaklığında 24 saat boyunca bekletildi ve -20°C’de deney zamanına kadar muhafaza edildi. Görüntüleme için Leica TCS SPS AOBS konfokal mikroskop sistemi kullanıldı. GFP ekspresyonunu 488 nm dalga boyu Argon Lazer ile görüntülendi. 555 nm dalga boyu Helium Neon Lazer ise Cx43 ekspresyonunu görüntülemek için kullanıldı. Cx43 veri değerlendirmesi için adobe photoshop ve imageJ v1.45 kullanıldı.

Membran Kapasitansı

Tek bașına veya NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’nin membran kapasitans ölçümleri için, membran potansiyeli -60 mV’da tutuldu, membran kapasitansı 10 mV’luk bir depolarizasyonla olușan kapasitatif akımın bir fonksiyonu (V (mV) x Cm (pF) = I (pA) x Δt (ms)) olarak gösterildi. Ayrıca evrensel bir dönüșüm faktörü (Cm (pF) = 1μF / 1cm2) kullanılarak hücrelerin yüzey alanlarından da membran kapasitansı hesaplandı.

CPCeP’de INa ve ICa Ölçümü

CPCeP, NRCM, NRCM’lere tutunmuș CPCeP ve CPCeP’lere tutunmuș NRCM’lerde INa ve ICa aktivasyonu için Sol-1 veya Sol-2 kullanıldı. Membran potansiyeli sırasıyla -80 veya -40 mV’da tutularak hücrelere yine sırasıyla 50 ya da 70 ms süresince 10 mV intervallerle depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulandı, voltaj-akım ilișkisi büyüklük (pA), yoğunluk (pA/pF) ve maksimum akıma ulașma süresi (pik zamanı, ms) açısından değerlendirildi. CPCeP’lerde INa ve ICa saptanamaması üzerine, bu hücrelerde uygulanan protokol değiștirildi ve fonksiyonel Na

+ ve Ca

2+

kanallarının olup olmadığı 30-60 ms süreli -80 den +80 mV artan voltaj uygulamaları ile testedildi. Ölçümler sırasında hücrelere 2-5 mM Ca

2+ ya da 10 mM Ba

2+ uygulandı.

Deneyler 10 μM nifedipin varlığında tekrarlandı. Ca

2+ akımları hem tek bașına,

hem koșullu medyum ortamında hem de NRCM ile birlikte kültüre edilen CPCeP’lerde araștırıldı.

CPCeP’de INCX ve IATP Ölçümü

NCX akımlarını (INCX) ölçmek için patchlenmiș ve membran potansiyeli -60 mV da tutulan hücreye 200 ms boyunca +80 mV depolarizan, hemen ardından 200-400 ms boyunca -120 mV’a kadar giderek azalan

95

voltaj klamp uygulanarak olușan akımlar kaydedildi. Deney 5 mM Ni

2+ varlığında

tekrarlandı ve Ni2+

’e duyarlı INCX değerlendirildi.

ATP ile indüklenen akımların (IATP) araștırılması için ise patchlenmiș hücrenin membran potansiyeli -80 mV’da tutuldu, hücreler bu süre içerisinde 1s boyunca 100 μM ATP’ye maruz bırakıldı.

İki Boyutlu Konfokal Görüntüleme

CPCeP ve NRCM’ye ait hücre içi Ca2+

salınımları 20 μM Fluo-4 AM kullanılarak Noran Odyssey XL iki boyutlu hızlı lazer tarayıcılı konfokal mikroskobi sistemi (Noran Instruments, Madison, WI) tutturulmuș su-immersiyonlu objektif lensi bulunan Zeiss Axiovert TV135 inverted mikroskop ile ölçüldü. Argon iyon lazerin eksitasyon dalga boyu 488 nm ye ayarlandı ve 515 nm ve daha büyük dalga boyunda floresan emisyonu ölçüldü. Deney protokolüne göre 4-120 kare/s görüntü alındı. Ca

2+’a ait

floresan sinyalleri 2 s süresince uygulanan 100 µM ATP, 10 mM kaffeine ya da 100 mM KCl ile aktive edildi. Görüntüler ortalama 3 x 3 piksel ile filtrelendi ve hesaplanan floresan yoğunluğu F/F0-1 (F; pik değer, F0 ortalama dinlenim floresan yoğunluğu) olarak ifade edildi. Veri analizi için Con2 yazılımı ve Origin v8.0 (OriginLab, Northampton, MA) programı kullanıldı.

ATP (100 µM), kafein (10 mM) ve KCl (100 mM) Tyrode solüsyonu içerisinde uygulandı, KCl eșit ekimolar konsantrasyonlarda Tyrode içerisindeki Na

+ ile değiștirildi.

Lucifer Yellow (150 µM) pipet solüsyonu içerisinde hazırlandı. Nifedipin (10 µM) DMSO içerisinde hazırlanıp stoklandı ve K

+’suz Tyrode solüsyonunda seyreltilerek

kullanıldı. Fluo-4 AM (20 µM) DMSO içerisinde çözüldü ve Tyrode solüsyonunda dilüe edildi. Deneylerde kullanılan bütün ilaç ve kimyasallar günlük olarak hazırlandı.

Veri Analizi

Sonuçlar Ortalama ± Standart hata olarak verildi. Deneye alınan hücre sayısı n ile ifade edildi. İstatistiksel değerlendirme için eșleștirilmemiș Student’s t-testi, ikiden fazla grup karșılaștırmalarında ise tek yönlü varyans analizi post hoc Neuman Keuls kullanıldı. P <0.05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. İstatistiksel anlamlılıklar, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 ve **** p <0.0001 ile gösterildi.

BULGULAR 1. Membran Kapasitansı Ve Gap Bağlantılar NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP patchlenip 10 mV depolarizan voltaj uygulandığında, geniș, bi-eksponansiyel bir kapasitatif akım izlendi (Șekil 1, siyah trase). Sonrasında NRCM’ler CPCeP’den ayırıldı, ortadan kaldırıldı ve voltaj uygulaması tekrarlandı. CPCeP’nin tek bașına kaldığı durumda ise daha dar, mono-eksponansiyel bir kapasitatif akım oluștuğu tesbit edildi (Șekil 1, kırmızı trase). Hücrelerin membran kapasitansları hem yüzey alanına göre hem de kapasitatif akımın bir fonksiyonu olarak așağıdaki gibi hesaplanarak karșılaștırıldı. Yüzey alanına göre;

Cm (pF) = 1μF / 1cm2

CPCeP Cm = 10 μm x 110 μm x 2 = 22 pF Üç adet NRCM Cm = 80 μm x 80 μm x 2 = 128 pF Akımın bir fonksiyonu olarak;

Cm (pF) = I(pA) x Δt (ms) / ΔV (mV) CPCeP Cm = 500 pA x 0.5 ms / 10 mV = 25 pF Üç adet NRCM Cm = 500 pA x 2.5 ms / 10 mV = 125 pF CPCeP’nin NRCM ile elektriksel olarak bağlantı kurduğu, bu nedenle de NRCM’ye tutunmuș halde iken CPCeP üzerinde daha fazla bir membran kapasitansı ölçüldüğü sonucuna varıldı ve daha detaylı incelemelere geçildi.

96

Șekil 1. Membran kapasitans ölçümleri. A; evrensel dönüșüm faktörü (Cm=1μF/1cm

2)’ne göre hücre yüzey alanı

üzerinden ve B; membran potansiyeli -60 mV’da tutulmuș iken 10 mV’luk depolarizyona cevap olarak olușan

akımın bir fonksiyonu olarak membran kapasitansları hesaplandı. Kırmızı çizgi bașlangıç noktasını, mavi çizgi tek bașına CPCeP’nin, yeșil çizgi ise CPCeP ve NRCM’nin depolarizasyon uygulamasından sonra istirahat potansiyeline dönüș süresini göstermektedir.

NRCM’ye tutunmuș veya tek bașına olan CPCeP ve NRCM’lerin membran kapasitansları ölçüldü, CPCeP’lerde ortalama membran kapasitansı 52.7 ± 2.3 pF (n= 219), NRCM’lerde ise 45.5 ± 7.7 (n=15) olarak hesaplandı, NRCM’ye

tutunmuș haldeki CPCeP’lerde ise ortalama membran kapasitansının (110.6 ± 14.5 pF, n= 25) tek CPCeP de ölçülene göre anlamlı derecede (p <0.001) yüksek olduğu görüldü (Șekil 2.A).

Șekil 2. A; NRCM ve CPCeP’lerin tek bașına veya birbirine tutunmuș halde ölçülen membran kapasitansları. B;

NRCM’e elektromekanik olarak tutunmuș olduğu Floresan boya transferi ile saptanmıș CPCeP’lere ait ortalama membran kapasitansı ayrı olarak gösterildi.

CPCeP ile NRCM arasındaki elektromekanik bağlantının varlığı bir grup patchlenmiș hücrede (n=6) membran kapasitans ölçümü ile simultane olarak gerçekleștirilen hücreler arası floresan boya transferi ile doğrulandı (Șekil 3.). Floresan

boya transferi yapılan ve yapılmayan NRCM’ye tutunmuș CPCeP’lerin membran kapasitansları arasında anlamlı bir fark

olmadığı görüldü.

97

Șekil 3. CPCeP ve NRCM arasındaki gap bağlantılarının floresan boya transferi ile görüntülenmesi. A: CPCeP floresan boya (Lucifer Yellow, 150 μM) içeren pipet solüsyonu ile patchlendi ve diyaliz edildi. B: Floresan

yoğunluğundaki değișiklik zaman bağımlı olarak gösterildi. Floresan boyanın transferi, CPCeP membranının rüptüründen 5 dk sonra görüntülenmeye bașladı ve 15 dk’da neticelendi. Floresan yoğunluğu F/Fmax (Fmax pik değeri, F ise bazal floresan yoğunluğunu) olarak ifade edildi.

Gap bağlantı proteini Cx43’ün varlığıni göstermek için ise immünhistokimya yöntemi kullanıldı. Cx43 partiküllerinin hücre yüzeyinde dağınık halde yerleștiği izlendi. Hücre bașına düșen Cx43 partikül sayısı CPCeP’lerde 28 ± 6 (n=12) iken, NRCM’ye bağlandığı durumda (67 ± 5, n=15) anlamlı (p <0.0001) bir yükselme gösterdi. Partikül büyüklükleri açısından CPCeP’nin tek bașına ya da NRCM’ye tutunmuș hali arasında bir fark görülmedi. (Șekil 4)

2. CPCeP’lerdeki İyon Akımları

NRCM, CPCeP ve NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP ile CPCeP’ye tutunmuș haldeki NRCM’de membran potansiyeli -40 ve -80 mV’da tutulup, 70 ve 50 ms süresince depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulaması ile sırasıyla ICa ve INa akımları test edildi. Yukarıda belirtilen protokol kullanılarak, toplamda 68 adet CPCeP üzerinde çalıșıldı ancak, hiçbirinde fonksiyonel Na

+ ve Ca

2+ akımları

saptanamadı (Șekil 5). Buna karșılık, NRCM, CPCeP’ye tutunmus haldeki NRCM ve NRCM’ye tutunmuș haldeki

CPCeP’lerden hem ICa hem de INa akımları elde edildi (Șekil 6.A ve Șekil 7.A). Ca

2+

akımının -40 mV’da aktive olduğu, pik değerinin 0 mV’da, reversal potansiyali ise +40 mV civarında oluștuğu görüldü (Șekil 6.C). NRCM’ye tutunmuș olan CPCeP’de maksimum Ca

2+ akım büyüklüğü ortalaması

150.91 ± 21.88 pA, NRCM’de ve CPCeP’ye tutunmuș halde ise sırasıyla 128.48 ± 25.58 pA ve 250. 96 ± 65.84 pA olarak kaydedildi. Maksimum akım görülen voltaj basamağındaki pik zamanı, NRCM’ye tutunmuș olan CPCeP’lerde (22.7 ± 5.1 ms), NRCM’nin tek bașına (5.6 ± 0.7 ms) veya CPCeP ile tutunmuș haldekinden (4.9 ± 0.4 ms) anlamlı olarak daha uzundu (Șekil 6.B). Akım yoğunlukları değerlendirildiğinde en düșük değere sahip grubun NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’ler (1.13 ± 0.20 pA/pF) olduğu görüldü. NRCM’lerde Ca

2+

akım yoğunluğu 3.36 ± 0.70 pA/pF, CPCeP’ye tutunmuș NRCM’de ise 4.02 ± 0.18 pA/pF olarak hesaplandı (Șekil 6.C ve D).

98

Șekil 4. CPCeP tek bașına (A) ve NRCM ile bağlanmıș durumda iken (B) Cx43 ekspresyonunun

immünhistokimyasal yöntemle görüntülenmesi. CPCeP ve NRCM beyaz oklarla, Cx43’e ait partiküller ise turuncu oklarla gösterildi. C; Cx43 partikül boyutu (μm) ve hücre bașına düșen ortalama partikül sayısı tablo halinde

verildi.

Șekil 5. CPCeP’lerde ICa ve INa’na ait trase örnekleri. A; Ca

2+ akımlarını test etmek için hücre membran

potansiyeli -40 mV’da tutuldu. 70 ms süreli depolarizan basamaklı voltaj klamp 10 mV artıșlarla uygulandı. B; Na+

akımları için ise membran potansiyeli -80 mV’da tutuldu ve 50 ms süreli basamaklı depolarizan voltaj klamp yine 10 mV artıșlarla uygulandı. Uygulamalarda her iki pipet solüsyonu (Sol-1 ve Sol-2) da denendi.

99

Șekil 6. Tek bașına ya da CPCeP’ye tutunmuș NRCM’de ve NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’de ICa ölçümü.

Hücre membran potansiyeli -40 mV’da tutuldu ve 70 ms süreli depolarizan basamaklı voltaj klamp 10 mV aralıklarla uygulandı. Her grup için; elde edilen ICa’a ait örnek traseler (A), pik zamanı (ms) ortalamaları (B), Akım – Voltaj ilișkisi (C) ve 0 mV voltaj klamp ile elde edilen Ca

2+ akım yoğunluklarının ortalamaları (D) görülmektedir.

Na+ akımlarının aktivasyonu için membran

potansiyeli -80 mV’da tutuldu ve akımın pik değerine -40 mV’da ulaștığı görüldü. Reversal potansiyeli ise +30 mV civarındaydı (Șekil 7.C). NRCM’ye tutunmuș olan CPCeP’lerde büyüklüğü 2661.34 ± 509.22 pA olan INa da kaydedildi. Na

+ akım

büyüklüğünün NRCM’lerde 5199.41 ± 605.89 pA, CPCeP’ye tutunmuș NRCM’lerde ise 4978.54 ± 1845.43 pA olduğu saptandı. -40 mV’da görülen pik zamanı ise NRCM’ye tutunmuș CPCeP’lerde (5.08 ± 0.93 ms), NRCM’de (3.1 ± 0.17 ms) ve CPCeP’ye tutunmuș olan NRCM’de (2.43 ± 0.17 ms) ölçülene göre anlamlı derecede daha uzundu (Șekil 7.B). NRCM’ye tutunmuș CPCeP’lerde Na

+ akım

yoğunluğu 28.56 ± 5.61 pA/pF iken, NRCM’lerde 151.07 ± 24.09 pA/pF ve CPCeP’ye tutunmuș NRCM’lerde ise 63.76 ± 22.57 pA/pF olarak hesaplandı (Șekil 7.C ve D). Elde edilen sonuçlar, CPCeP’lere uygulanan elektriksel pulse’ın NRCM’ye

iletildiğini ve NRCM’lerde voltaj bağımlı kanalları tetiklediğini, Na

+ ve Ca

2+

akımlarının da bu yolla CPCeP’ler üzerinden ölçülebildiğini, bir bașka değișle CPCeP ve NRCM arasında elektriksel bir bağlantı bulunduğunu gösterdi. Depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulaması ile CPCeP’lerde Na

+ ve Ca

2+

akımları saptanamaması üzerine, akımların çok küçük olabileceği ve/veya hızla inaktive edildikleri düșünülerek farklı bir protokol denendi. -80 ile +80 mV arasında 30-60 ms süreli giderek artan voltaj klamp uygulandı. Bu uygulama ile CPCeP’lerde (n=58) Na

+

akımını yine kaydedilemedi. Ancak belirgin Ca

2+ akımı izlendi. Elde edilen akımın hızla

inaktive olmasını engellemek için perfüzyon solüsyonundaki Ca

2+, 10 mM Ba

2+ ile

değiștirildi ve 10 μM nifedipine duyarlı Ca2+

akımları elde edilerek değerlendirildi (Șekil 8).

100

Șekil 7. Tek bașına ya da CPCeP’ye tutunmuș NRCM’de ve NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’de INa ölçümü.

Hücre membran potansiyeli -80 mV’da tutuldu ve 50 ms süreli depolarizan basamaklı voltaj klamp 10 mV aralıklarla uygulandı. Her grup için; elde edilen INa’a ait örnek traseler (A), pik zamanı (ms) ortalamaları (B), Akım – Voltaj ilișkisi (C) ve -40 mV voltaj klamp ile elde edilen Na

+ akım yoğunluklarının ortalamaları (D) görülmektedir.

Șekil 8. CPCeP’lerde Ca

2+ akımının ölçülmesi. A; 30-60 ms süreli, -80 ile +80 mV arasında giderek artan

depolarizan voltaj klamp uygulamasına ait protokol ve örnek trase görülmektedir. Uygulamada Ca2+

yerine 10 mM Ba

2+ kullanıldı ve deney 10 μM nifedipin varlığında tekrar edildi. Yeni büyümekte olan (1-2 günlük, B) ve yașlı

(5-7 günlük, C) CPCeP’lere ait fotoğraflar alt panelde izlenmektedir.

101

Ca2+

akımı kontrol CPC ve GFP(+) CPC’lerde de araștırıldı. 34 adet kontrol CPC’nin sadece 4’ünde değerlendirmeye alınamayacak kadar küçük, sporadik ICa görüldü (Șekil 9). Her iki grup hücre NRCM ile birlikte kültür edildiğinde ise testedilen 24 hücrenin hiçbirinde Ca

2+ akımına

rastlanmadı.

Șekil 9. CPC’lerden elde edilen Ca

2+ akımı. -80 ile

+80 mV arasında 30 ms süreli giderek artan voltaj klamp uygulaması 10 μM nifedipin varlığında tekrar edildi. Perfüzyon solüsyonu içerisindeki Ca

2+, 10

mM Ba2+

ile değiștirildi.

CPCeP’lerden elde edilen Ca2+ akımı üzerinde zamana bağlı değișiklikler ve NRCM’lerin muhtemel parakrin etkisinin olup olmadığını incelenmek için, birlikte kültür edilen ancak NRCM’ye tutunmamıș ya da NRCM’lerden elde edilen koșullu medyum içerisinde kültür edilmiș CPCeP’ler, 1-3 ve 4-7 günlük gruplar halinde çalıșmaya alındı. Yukarıda da değinildiği gibi çalıșma için yeni yetișen yuvarlak șekilli ve sivri çıkıntılara sahip, homojen sitoplazmalı, sağlıklı CPCeP’ler seçildi.

4-7 gün normal kültür medyumunda tutulan CPCeP’lerden edilen edilen ICa yoğunluğunun 1-3 gün süreyle kültür edilenlere oranla arttığı görüldü. Yine 4-7 gün NRCM ile birlikte kültür edilen CPCeP’lerdeki ICa yoğunluğu da, 1-3 gün ko-kültür edilenlere oranla daha büyük olarak saptandı. Koșullu medyum ile kültür edilen CPCeP’lerin ICa yoğunluklarının kültür süresinin 4-7 güne çıkmasıyla birlikte arttığı görüldü. Bunun yanı sıra, 4-7 gün koșullu medyum ile kültür edilen

CPCeP’lerin, aynı süre normal kültür medyumunda tutulanlara oranla daha büyük ICa yoğunluğuna sahip oldukları tesbit edildi. Değișik kültür ortamları (normal medyum, ko-kültür veya koșullu medyum) ve kültür sürelerine (1-3 veya 4-7 gün) göre dağılımlarına bakıldığında; normal medyum ve koșullu medyumda 4-7 gün süre ile tutulan CPCeP’lerden elde edilen ICa yoğunluk-larının 1-3 günden elde edilenlere oranla arttığı gözlendi (Șekil 10). Bulgular değerlendirildiğinde, CPCeP’lerin uzun süre kültüre edildiklerinde daha fazla Ca2+ kanalı eksprese ettikleri, bu durumun ise NRCM ile birlikte veya NRCM’lerden elde edilen koșullu medyum ile kültüre edildiklerinde amplifiye olduğu sonucuna varıldı.

CPCeP’lerde fonksiyonel NCX akımının varlığı araștırıldı ve Ni2+’e duyarlı INCX bulunduğu saptandı. Elde edilen bulgular NRCM ve NRCM’ye tutunmuș halde bulunan CPCeP’ler ile karșılaștırıldığında, INCX yoğunlukları açısından bir fark bulunmadığı görüldü (Șekil 11).

Membran potansiyeli 8 s boyunca -80 mV’da tutulmakta iken, 1 s süresince 100 µM ATP uygulandı ve NRCM, CPCeP ve NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’lerde ATP’ye duyarlı akımlar (IATP) kaydedildi. Her üç grup hücrede de ATP uygulanmasının hemen ardından elde edilen içe dönük akım zamanla inaktive olarak ortadan kalktı. NRCM’den kaydedilen akımın, CPCeP ve NRCM’ye tutunmuș CPCeP’den elde edilenlere oranla daha hızlı ortaya çıktığı ve daha kısa sürede inaktive olduğu, akım yoğunluğunun da yine NRCM’lerde anlamlı oranda fazla bulunduğu gözlendi (Șekil 12).

102

Șekil 10. NRCM’nin CPCeP üzerindeki parakrin etkisi. CPCeP’den elde edilen Ca

2+ akım yoğunluklarının değișik

kültür ortamları (normal medyum, ko-kültür veya koșullu medyum) ve kültür sürelerine (1-3 veya 4-7 gün) göre dağılımları (%) bar grafikler halinde gösterilmiștir. Gruplara ait ortalama ICa yoğunlukları (pA/pF) tablo halinde verilmiștir.

Șekil 11. CPCeP, NRCM ve NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’de Ni

2+’e duyarlı NCX akımları. A; Örnek

trasede kontrol (siyah) ve 5 mM Ni2+

varlığında (kırmızı) voltaj klamp ile elde edilen NCX akımı, B; Sol panelde uygulanan voltaj klamp protokolü, C; bar grafiklerde ise her üç grup için +80 ve -120 mV değerlerinde elde edilen

Ni2+

’e duyarlı NCX akım yoğunluklarının (pA/pF) ortalamaları gösterilmiștir.

103

Șekil 12. ATP ile aktive olan akımlar. A; CPCeP ve NRCM’den elde edilen IATP’ye ait örnek traseler

görülmektedir. Hücrelerin membran potansiyeli 8 s boyunca -80 mV’da tutuldu, 1 s süresince 100 μM ATP uygulandı. B; CPCeP, NRCM ve NRCM’ye tutunmuș haldeki CPCeP’den kaydedilen maksimum ATP yanıtları

bar grafikler halinde görülmektedir.

3. CPCeP ve NRCM ko-kültüründe Hücre içi Ca

2+ sinyalleme yolakları

CPCeP ve NRCM’nin birlikte kültür edildiği ortamda, Ca

2+ kanalları / RyR sinyal yolağını

aktive etmek için 10 mM kafein ve 100 mM KCl, IP3 sinyal yolağını aktive etmek için ise 100 μM ATP kullanıldı. CPCeP’nin hücre içi fonksiyonel Ca

2+ salınım yolakları konfokal

görüntüleme yöntemi ile testedildi ve NRCM’den elde edilen bulgularla karșılaștırıldı. Her iki grup hücrenin de KCl, ATP ve kafeine farklı yanıtlar verdiği görüldü. Kafein ve KCl ile aktive edilen hücre içi Ca

2+ salınımları NRCM’de daha

fazla iken ATP uygulaması ile CPCeP’lerde olușan Ca

2+ salınımının NRCM’dekinden

daha fazla olduğu saptandı.

CPCeP’deki kafein ile aktive edilen hücre içi Ca

2+ salınım trendinin NRCM’den farklı

olduğu gözlendi. NRCM’de kafein uygulaması ardından Ca

2+ salınımı hızla

olușurken, CPCeP’lerde kısa bir gecikmenin ardından ortaya çıkan hücre içi Ca

2+ salınımı

daha yavaș bir artıș gösterdi. CPCeP’deki

bu cevabın NRCM’den yansıyabileceği düșünülerek görüntülenme frekansı artırıldı (120 kare/s) ve hücreler arasında olușabilecek muhtemel bir bağlantıyı gösteren Ca

2+ dalgası spesifik olarak

araștırıldı. Ancak bu yönde herhangi bir bulguya rastlanamadı. Edle edilen bulgularla, kafein ile olușan ve yavaș gelișen cevabın CPCeP’nin kendisinden kaynaklandığı sonucuna varıldı. CPCeP’de ATP ile indüklenen Ca

2+ salınımı da

NRCM’den farklı bir profil gösterdi. Ca2+

salınımının CPCeP’de NRCM’den daha yavaș olduğu ve tekrarlanan ATP ugulamaları ile giderek azaldığı gözlendi. KCl ile aktive olan Ca

2+ salınımları ise her iki

hücrede de eș zamanlı bașladı, ancak salınım CPCeP’de daha azdı ve NRCM’ye oranla daha uzun süre azalmadan kaldı. Elektrofizyolojik ve konfokal görüntüleme deneyleri CPCeP ve erișkin kedi ventriküler kardiyomiyozitleri kullanılarak da tekrarlandı ancak, sonuçlar arasında belirgin bir farklılık gözlenmedi.

104

Șekil 13. CPCeP ve NRCM’de hücre içi Ca

2+ salınımları. Çalıșma ko-kültür ortamında, konfokal mikroskop

altında saniyede 4-120 kare görüntü alınarak gerçekleștirildi. A; kafein (10 mM), ATP (100 μM) ve KCl (100 mM) ile aktive edilen maksimun Ca

2+ salınımlarının ortalamaları grafik olarak gösterildi. Her iki hücrede kafein (B),

ATP (C) ve KCl (D) ile aktive edilen hücre içi Ca2+

salınım örnekleri görülmektedir. Hesaplanan floresan

yoğunlukları F/F0-1 (F; pik değeri, F0; ortalama dinlenim floresan yoğunluğunu) ile ifade edildi. Sol paneldeki örnek trase üzerinde belirtilen a, b ve c noktalarında elde edilen konfokal görüntüler ise her trase altında yer almaktadır. Sağ panelde, elde edilen floresan yoğunluklarına göre hücre sayısı bazında dağılımlar görülmektedir.

105

4. INa , ICa, INCX ve IATP Görülme Sıklıgı

Deneye alınan hücrelerde akım görülme sıklığı Șekil 14.’de gösterildi. Buna göre, ölçülebilen ICa, INCX ve IATP, deneye alınan hücrelerin sırasıyla %36, %41 ve %33’ünde tesbit edildi. NRCM’den yansıyan, CPCeP

üzerinden ölçülebilen Ca2+

ve Na+

akımlarının görülme sıklığı ise sırasıyla %12 ve %10 olarak hesaplandı. Bu bulgular, hücre kültürünün ilk 7 gününde CPCeP’lerin ancak küçük bir bölümünün NRCM ile elektrofizyolojik olarak bağlantı kurduğunu gösterdi.

Șekil 14. Elektrofizyolojik yöntemle tek bașına ya da NRCM’ye tutunmuș olan CPCeP’lerde ölçülebilen iyon kanal

ve tașıyıcı akımlarının görülme sıklığı.

TARTIȘMA ve SONUҪ

Nükleer Akt sinyalinin, serin / treonin kinaz enzim ekspresyonunu artırdığı ve bu yolla da hücrede apoptozisi engellediği, proliferatif proteinleri stabilize ettiği ve hücre sağ kalımını artırdığı bilinmektedir. Fischer ve ark. Akt gen transfeksiyonu ile serin /treonin kinaz (Pim-1) ekspresyonu arttırılan CPC’lerde (CPCeP) hücre proliferasyonunun ve metabolik hızın arttığını göstermișlerdir (Fischer, 2009). Çalıșmamızda, in-vivo șartlarda hasarlanmıș miyokardın onarımını ve rejenerasyon kapasitesini artırdığı saptanan CPCeP’lerin elektrofizyolojik özellikleri araștırılmıștır. Bu tipte bir araștırmanın in-vivo șartlarda gerçekleștirilmesi mümkün olmadığından, in-vitro olarak CPCeP ve NRCM arasındaki olası bağlantı simüle edilmiștir. Çalıșmanın en önemli bulgusu, CPCeP’lerin, özellikle de NRCM ile birlikte kültür edildiklerinde, fonksiyonel ICa, INCX, IATP eksprese ettiklerinin, IP3R ve RyR’ler aracılığıyla güçlü Ca

2+ sinyalleme sistemine sahip olduklarının

gösterilmesidir. CPCeP ve NRCM arasında elektrofizyolojik bir iletișim olduğu floresan

boya transferi ve Cx43 varlığının immünhistokimyasal yöntemlerle gösteril-mesi ile ortaya konulmuștur. CPCeP’lerde 7 günlük kültür süreci boyunca Ca

2+ akımları

kaydedilmiș ve kültür süresine bağlı olarak akımların arttığı görülmüștür. Benzer bulgular, CPCeP’lerin koșullu medyum ile kültüre edilmesi ile de elde edilmiștir. CPCeP’lerde güçlü Ca

2+ ișleme sisteminin

varlığı, kardiyak miyozitlere fonksiyonel olarak entegrasyonu ve aralarındaki elektriksel iletișim, bu kök hücrelerin miyokardiyal rejenerasyondaki etki mekanizmasını açıklamaktadır.

Sunulan çalıșmada CPCeP’lerin yapısal özellikleri de önem tașımaktadır. CPCeP’lerin ortalama membran kapasitans-ları (52.7 ± 2.3 pF), farelerden elde edilen kardiyak c-kit+ hücrelerin membran kapasitansları (50.4 ± 14.9 pF) ile örtüșmektedir (Han, 2010). Ko-kültür șartlarında CPCeP’lerde daha yüksek membran kapasitansı ölçülmesinin nedeninin NRCM’ye tutunmasından kaynaklandığı düșünülmüș, bu düșünce; elektrofizyolojik deneyler, hücreler arası

107

floresan boya transferi ve Cx43 varlığının ile doğrulanmıștır. Ortalama membran kapasitanslarına bakıldığında NRCM’ye tutunmuș durumdaki CPCeP’ye ait kapasitansın, CPCeP ve NRCM’nin tek bașlarına olduğu durumdaki membran kapasitanslarının toplamına eșdeğer olduğu görülmektedir. Connexin’lerden olușan gap bağlantıları kardiyak miyozitlerin birbirleri ile bağlanmaları ve elektriksel entegrayonunda vazgeçilmez bir komponentdir. ESC’den köken alan kardiyomyozitler ile kedi kardiyo-miyozitleri arasında gap bağlantılarının bulunduğu ve elektriksel iletișimi sağladıkları gösterilmiș (Halbach, 2007) ancak, floresan boya transferi ile fare kemik iliğinden elde edilen c-kit+ hücreler ve yenidoğan kardiyak miyozitler arasında gap bağlantılarının varlığına rastlamamıșlardır (Lagostena, 2005). Diğer taraftan, Ferreira-Martins ve ark. insan CPC’lerinin Cx43 eksprese ettiğini bildirmiștir (Ferreira-Martins, 2009). Yetișkin ventriküler miyozitlerinde longitüdinal bağlantıyı sağlamak üzere gap bağlantıların interkalad diskler üzerinde yerleștiği (Saffits, 1994), yenidoğan ventriküler miyozitlerinde ise tüm yüzeye yayılmıș noktalar șeklinde bulunduğu (Peters, 1994) rapor edilmiștir. Çalıșmamızda Cx43, CPCeP ve NRCM arasında da yerleșim göstermekle birlikte, yenidoğan ventrikülleri ile uyumlu olarak hücre yüzeyi üzerinde de dağılmıș halde bulunmuștur.

Uygun Ca2+

ve Na+ akımlarının bulunması

kardiyojenik bir hücre için karakteristiktir. Bașlangıçta, depolarizan basamaklı voltaj klamp uygulaması ile CPCeP’lerde ICa ve INa ölçümlerinde bașarılı olunamamıș ve kısa süreli giderek artan voltaj uygulaması denenmiștir. Yeni protokol ile de fonksiyonel Na

+ kanalı varlığı saptanamamıș ancak Ca

2+

akımı tesbit edilmiștir. Tespit edilen Ca2+

akımı, Ca

2+’un Ba

2+ ile yer değiștirilmesi

sonucunda daha da artmıș ve nifedipin ile bloke olmuștur. 7 gün boyunca kültüre edilen fare kemik iliği c-kit+ hücrelerinde Na

+

ve Ca2+

kanallarının eksprese edildiği gösterilmiș fakat, -70 - +50 mV arası depolarizan basamaklı voltaj uygulaması ile INa ve ICa varlığı saptanamamıștır (Han, 2010; Lagostena, 2005). Bu çalıșmalara ait sonuçlar, bizim çalıșmamızda kullandığımız basamaklı depolarizan voltaj uygulaması ile uyum göstermektedir. Giderek artan voltaj uygulaması patchlenen hücreleri, pozitif değerlere doğru çoklu voltaj uygulama-larından kaynaklanan akımın azalmasından

(run-down effect) koruyor gibi görünmek-tedir. Bunun yanı sıra Ba

2+ kullanımı ile Ca

2+

bağımlı inaktivasyon ortadan kaldırılarak, akımın tam olarak ölçülebilmesi sağlan-mıștır. Diğer taraftan, insan MSC’lerinden köken alan kemik iliği hücrelerinin çok küçük bir kısmında Ca

2+ akımlarının bulunduğu

(Kawano, 2003), tavșan ve fare haricinde, insan ve sıçan Sca-1+ MSC’lerinde ve diferansiye olmamıș hESC’lerinde fonksiyonel L-tipi ICa ve TTX’e duyarlı INa varlığı rapor edilmiștir (Sartiani, 2007; Tao, 2007). ICa’ın testedilmesi konusundaki çalıșmalardan değișik sonuçlar elde edilmesine neden olarak, uygulanan voltaj klamp protokollerinin farklılığı düșünülebilir. Bununla birlikte, kardiyak miyozitler ve diferansiye olmamıș kök hücrelerin birlikte kültür edildikleri durumda, her iki hücrenin de diğeri üzerindeki parakrin etkileri, ICa ölçümlerinde yüksek değerlerin kaydedilmesine neden olabilir. Miyozitler ile CSC’lerin birlikte kültüre edilmesinden 96 saat sonra ko-kültür medyumunda IGF-1 ve VEGF konsantrasyonlarında artıș izlenmiș (Miyamoto, 2010), çalıșmacılar c-kit+ CSC’lerin parakrin etkisi nedeniyle ko-kültür ortamında kardiyak miyozit sağkalımının arttığını ileri sürmüșlerdir. Bu önerme ile uyumlu olarak, çalıșmamızda da CPCeP’lerde ölçülen Ca

2+ akımların koșullu

medyum içerisinde ya da NRCM ile birlikte kültür edildiklerinde arttığı tesbit edilmiș ve bu sonuç bize, asıl parakrin etkinin CPCeP’den değil, NRCM’den kaynaklana-bileceğini düșündürmüștür. Yine de, miyozitlerin çevrelerindeki CPCeP’ler ile fonksiyonel gap bağlantılar geliștirmelerinin mi yoksa parakrin etkilerin mi kritik öneme sahip olduğu henüz netlik kazanmamıștır.

Fonksiyonel kardiyak miyozitlerin integral parçalarından birisi de Ca

2+ ișleme

karakteristikleridir. CPCeP ve NRCM’nin ikisi de yüksek doz KCl ile olușturulan depolarizasyona hızla artan hücre içi [Ca

2+]i

ile cevap vermișlerdir. Ancak CPCeP’ler NRCM’lerden daha az bir hücre içi Ca

2+

salınım göstermișlerdir. Bu sonucun, elektrofizyoljik testlerle elde ettiğimiz düșük Ca

2+ akım yoğunluğu ile uyumlu olduğu

görülmüștür. CPCeP’lerin küçük bir bölümünde kafein ile aktive olan hücre içi Ca

2+ saınımı izlenmiștir. Elde edilen salınım

cevabı NRCM’lerle karșılaștırıldığında, daha yavaș ve gecikmiș olarak ortaya çıktığı saptanmıș, bunun CPCeP’lerde yavaș gelișim gösteren, Ca

2+ ile indüklenen Ca

2+

108

salınım mekanizmasından kaynaklandığı düșünülmüștür. Daha önceki çalıșmalarda, diferansiye olmamıș CSC’lerde kafein ile indüklenen Ca

2+ salınımı bulunmadığı, bu

hücrelerin RyR eksprese etmedikleri (Lagostena, 2005), buna karșılık güçlü IP3 reseptörleri ve SERCA’ya sahip oldukları rapor edilmiști (Ferreira-Martins, 2009). Çalıșmamızda, sadece birkaç CPCeP’de görülen kafein ile indüklenen hücre içi Ca

2+

salınımının, kültüre edilen hücrelerin farklı maturasyon düzeylerinde bulunmasından kaynaklanabileceği veya konfokal görüntü-leme ile saptanamayan hücreler arası elektrofizyolojik iletișim sonucu NRCM deki Ca

2+ dalgalarının CPCeP’ye geçmesi netice-

sinde ortaya çıkmıș olabileceği düşünül-müștür.

NRCM ve CPCeP’nin ikisinde de ATP uygulaması ile hücre içi Ca

2+ salınımında

artıș kaydedilmiștir. Ortaya çıkan yanıtın, NRCM’lerde daha hızlı geliștiği ancak, CPCeP’lerde NRCM’lere oranla daha yavaș ve daha büyük bir salınıma neden olduğu görülmüștür. Bulgularımıza benzer șekilde, insan CPC’lerinde (Ferreira-Martins, 2009), insan mezenșimal hücrelerinde (Torella, 2004) ve fare embriyonik kök hücrelerinde (Rota, 2003; Gonzales, 2008) IP3’ün aracılık ettiği güçlü Ca

2+ salınım mekanizması

bulunduğu bildirilmiștir.

Çalıșmamızda ATP akımları da incelenmiștir. Patchlenen hücrelerin membran potansiyeli -80 mV’da tutulmuș durumdayken 1 s süresince ATP uygulan-mıș ve içe doğru akımlar gözlenmiștir. ATP uygulamasının hücrelerde Cl

- akımlarını da

aktive ettiği gözlenmiș ancak, hem membran potansiyelinin -80 mV’da tutuluyor olması hem de kalsiyumsuz ortamda ATP uygulaması ile hücre içi Ca

2+ konsantras-

yonundaki artıșın devam etmesi, ATP’nin bu etkisinin membran depolarizasyonu olușturma özelliğinden bağımsız olduğunu düșündürmüștür. IP3’nin erișkin, embriyonik ve yenidoğan membranı çıkarılmıș veya kimyasal olarak geçirgenliği artırılmıș kardiyak miyozitlerinde SR’dan Ca

2+

salınımına neden olduğu bilinmektedir (Janowski, 2006; Vassort, 2001). Coppi ve ark. insan MSC’lerinde ATP ile aktive olan voltaj bağımlı içe ve dıșa doğru akımların varlığını göstermișler, ancak potasyumsuz solüsyon kullanıldığında akımın ortadan kalması nedeniyle dıșa dönük akımların K+ tașıdığını düșünmüșlerdir (Coppi, 2007).

Kardiyak miyozitlerin gelișimi sırasında RyR2, SERCA ve L-tipi Ca

2+ kanallarının

ekspresyonu artarken NCX düzeyleri aynı kalmakta ya da çok az miktarda azalmaktadır (Liu, 2002). Gerçekleștir-diğimiz çalıșmada da, CPCeP’lerde Ni’e duyarlı NCX akımları saptanmıș ve akım miktarının NRCM’ler ve NRCM’lere tutunmuș CPCeP’ler ile eșdğer olduğu görülmüștür. Bu durumda CSC’lerin Ca

2+

homeostazisi bașlıca NCX ile düzenleniyor gibi görünmektedir

Özet olarak, elektrofizyolojik veriler göstermiștir ki; CPCeP’ler fonksiyonel DHP’e duyarlı L-tipi Ca

2+ kanalı ve Na

+-Ca

2+

değiș-tokuș sistemini de içeren bir dizi kanal ve tașıyıcı eksprese etmekte ve iyon akımları geliștirmektedir. Bu karakteristik bulgular, özellikle pace maker özelliğe sahip kalpte kendiliğinden Ca

2+ salınım

aktivitesinin bașlatılması açısından son derece kritiktir. Hücre içi Ca

2+ hareketlerinin

ko-kültür ortamında veya koșullu medyum ile kültüre edildiğinde artıș göstermesi, NRCM’lerin CPCeP üzerindeki parakrin etkisine ișaret etmektedir.

Bu sonuçlar ile, CPCeP’lerin transplante edildiği hasarlı miyokardın rejenerasyonunu ve kardiyak performansı artırıcı etkilerinin, in-vitro șartlarda CPCeP için tanımlanan özellikler ve CPCeP ile NRCM arasındaki elektrofizyolojik etkileșimden kaynaklandığı öngörülebilir.

DESTEK

Bu çalıșma, National Institute of Health (RO 1 16152), BlueCross/BlueShield, National Heart, Lung, and Blood Institute (1R21HL102714-01, 2RO1HL067245, 1R37HL091102-01, P01HL085577-05, RC1HL100891-02, R21HL102613-01 ve 1R21HL104544-01) tarafından desteklenmiștir.

TEŞEKKÜR

Çalıșmanın gerçekleșmesindeki katkı ve desteklerinden dolayı Prof. Dr. Martin MORAD bașta olmak üzere, üzerinde çalıștığım hücreleri sağlayan Prof. Dr. Mark A. SUSSMAN’a, teknik anlamda beni bilgilendiren Doç. Dr. Lars CLEEMANN’a, immünhistokimya çalıșmasını gerçekleștiren Bio. Nicole HAGHSHENAS’a ve asistanlığı ile çalıșmamı kolaylaștıran Dr. Xiaohua ZHANG’a teșekkür ederim.

109

KAYNAKLAR

Anversa, P., Leri, A., Rota, M., Hosoda, T., Bearzi, C., Urbanek, K., Kajstura, J., Bolli, R. (2007) Concise review: Stem cells, myocardial regeneration, and methodological artifacts. Stem Cells 25: 589-601.

Barile, L., Messina, E., Giacomello, A., Marbán, E. (2007). Endogenous cardiac stem cells. Prog Cardiovasc Dis 50(1): 31-48.

Beltrami, A.P., Barlucchi, L., Torella, D., Baker, M., Limana, F., Chimenti, S., Kasahara, H., Rota, M., Musso, E., Urbanek, K., Leri, A., Kajstura, J., Nadal-Ginard, S., Anversa, P. (2003) Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration. Cell 114: 763-76.

Chen, H-S.V., Kim, C., Mercola, M. (2009) Electrophysiological challenges of cell-based myocardial repair. Circulation 120: 2496-508.

Coppi, E., Pugliese, A.M., Urbani, S., Melani, A., Cerbal, E., Mazzanti, B., Bosi, A., Saccardi, R., Pedata, F. (2007) ATP modulates cell proliferation and elicits two different electrophysiological responses in human mesenchymal stem cells. Stem Cells 25: 1840-9.

Dawn, B., Stein, A.B., Urbanek, K., Rota, M., Whang, B., Rastaldo, R., Torella, D., Tang, X-L., Rezazadeh, A., Kajstura, J., Leri, A., Hunt, G., Varma, J., Prabhu, S.D., Anversa, P., Bolli, R. (2005) Cardiac stem cells delivered intravascularly myocardium, and improve cardiac function. PNAS 102(10): 3766-71.

Dimmeler, S., Zeiher, A.M., Schneider, M.D. (2001) Unchain My Heart: The scientific foundations of cardiac repair. J Clin Invest 115(3): 572-83.

Ferreira-Martins, J., Rondon-Clavo, C., Tugan, D., Korn, J.A., Rizzi, R., Padin-Iruegas, M.E., Ottolenghi, S., De Angelis, A., Urbanek, K., Ide-Iwata, N., D’Amario, D., Hosoda, T., Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P., Rota, M. (2009) Spontaneous calcium oscillations regulate human cardiac progenitor cell growth. Circ Res 105: 764-74.

Fischer, K.M., Cottage, C.T., Wu, W., Din, S., Gude, N.A., Avitabile, D., Quijada, P., Collins, B.L., Fransioli, J., Sussman, M.A. (2009) Enhancement of myocardial regeneration through genetic engineering of

cardiac progenitor cells expressing pim-1 kinase. Circulation 120: 2077-87.

Gonzalez, A., Rota, M., Nurzynska, D., Misao, Y., Tillmanns, J., Ojaimi, C., Padin-Iruegas, M.E., Muller, P., Esposito, G., Bearzi, C., Vitale, S., Dawn, B., Sanganalmath, S.K., Baker, M.. Hintze, T.H., Bolli, R., Urbanek, K., Hosoda, T., Anversa, P., Kajstura, J., Leri, A. (2008) Activation of cardiac progenitor cell reverses the failing heart senescent phenotype and prolongs lifespan. Circ Res 102: 597-606.

Halbach, M., Pfannkuche, K., Pillekamp, F., Ziomka, A., Hannes, T., Reppel, M., Hescheler, J., Muller-Ehmsen. (2007) Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ Res 101: 484-92.

Han, Y., Chen, J-D., Liu, Z-M., Zhou, Y., Xia, J-H., Du, X-L., Jin, M-W. (2010) Functional ion channels in mouse cardiac c-kit

+ cells.

Am J Physiol Cell Physiol 298: C1109-17.

Janowski, E., Cleemann, L., Sasse, P., Morad, M. (2006) Diversity of Ca

2+ signaling in

developing cardiac cells. Ann NY Acad Sci 1080: 154-64.

Janowski, E., Berríos, M., Cleemann, L., Morad, M. (2010) Interplay between ryr- and IP3R-gated Ca

2+ stores. Am J Physiol Heart

Circ Physiol 298: H1939-50.

Kawano, S., Otsu, K., Shoji, S., Yamagata, K., Hiraoka, M. (2003) Ca

2+ oscillations

regulated by Na+-Ca

2+ exchanger and

plasma membrane Ca2+

pump induce fluctuations of membrane currents and potentials in human mesenchymal stem cells. Cell Calcium 34: 145-56.

Lagostena, L., Avitabile, D., De Falco, E., Orlandi, A., Grassi, F., Iachininoto, M.G., Ragone, G., Fucile, S., Pompilio, G., Eusebi, F., Pesce, M., Capogrossi, M.C. (2005) Electrophysiological properties of mouse bone marrow c-kit

+ cells co-cultures onto

neonatal cardiac myocytes. Cardiovasc Res 66: 482-92.

Liu, W., Yasui, K., Opthof, T., Ishiki, R., Lee, J-K., Kamiya, K., Yokota, M., Kodama, I. (2002) Developmental changes of Ca

2+

handling in mouse ventricular cells from early embryo to adulthood. Life Sci 71: 1279-92.

Miyamoto, S., Kawaguchi, N., Ellison, G.M., Matsuoka, R., Shin’oka, T., Kurosawa, H. (2010) Characterization of long-term cultured c-kit

+ cardiac stem cells derived

110

from adult rat hearts. Stem Cells and Dev

19(1): 105-16.

Murry, C.E., Field, L.J., Menasché, P. (2005) Cell-based cardiac repair: reflections at the 10-year point. Circulation 112: 3174-83.

Peters, N.S., Severs, N.J., Rothery, S.M., Lincoln, C., Yacoub, M.H., Green, C.R. (1994) Spatiotemporal relation between gap junctions and fascia adherens junctions during postnatal development of human ventricular myocardium. Circ 90: 713-25.

Rota, M., Vasella, M. (2003) Patch-clamp analysis in canine cardiac purkinje cells of a novel sodium component in the pacemaker range. J Physiol 548(1): 147-65.

Saffitz, J.E., Kanter, H.L., Green, K.G., Tolley, T.K., Beyer, E.C. (1994) Tissue-specific determinants of anisotropic conduction velocity in canine atrial and ventricular myocardium. Circ Res 74: 1065-70.

Sartiani, L., Bettiol, E., Stillitano, F., Mugelli, A., Cerbal, E., Jaconi, M.E. (2007) Developmental changes in cardiomyocytes differentiated from human embryonic stem cells: A molecular and electrophysiological approach. Stem Cells 25: 1136-44.

Tao, R., Lau, C-P., Tse, H-F., Li, G-R. (2007) Functional ion channels in mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Am J Physiol Cell Physiol 293: C1561-7.

Tohse, N., Seki, S., Kobayashi, T., Tsutsuura, M., Nagashima, M., Yamada, Y. (2004) Development of excitation-contraction coupling in cardiomyocytes. Jpn J Physiol 54: 1-6.

Torella, D., Rota, M., Nurzynska, D., Musso, E., Monsen, A., Shirarishi, I., Zias, E., Walsh, K., Rosenweig, A., Sussman, M.A., Urbanek, K., Nadal-Ginard, B., Kajstura, J., Anversa, P., Leri, A. (2004) Cardiac stem cell and myocyte aging, heart failure, and insulin-like growth factor-1 overexpression. Circ Res 94: 514-24.

Torella, D., Ellison, G.M., Nadal Ginard, B., Indolfi, C. (2005) Cardiac stem and progenitor cell biology for regenerative medicine. Trends Cardiovasc Med 15: 229-36.

Vassort, G. (2001) Adenosine 5’-Triphosphate: A P2-purinergic agonist in the myocardium. Physiol Rev 81(2): 767-806.

* * * * *

ÖZGEҪMİȘ

1. KİMLİĞİ

Adı, soyadı: Hale TUFAN

Doğum yeri: Kastamonu

Doğum tarihi: 20.08.1967

Medeni durumu: Bekar

Adres: Konutkent II, A9/2 06810 Çayyolu / ANKARA

Telefon: 0 533 361 7081


2. EĞİTİM – ÖĞRETİM

Lisans: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, 1991

Doktora: Gazi Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Farmakoloji Programı, 1997

3. YURTDIȘI ARAȘTIRMA DENEYİMİ

Doktora Sonrası Araştırmacı: Cardiac Signaling Center (of USC, MUSC and Clemson University), Charleston SC, USA, 2008 – 2011.

4. ALDIĞI GÖREVLER VE MESLEKİ DENEYİMLERİ

2005 – 2009 Mezuniyet Öncesi Tıp Eğitimi Grubu Üyeliği, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

2003 – 2009 Hayvan Deneyleri Etik Kurul Üyeliği, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

2003 – 2009 Farmakoloji Anabilim Dalı Başkan Yardımcılığı, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

2001 – 2009 Farmakoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyeliği (Yrd. Doç. Dr.), Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

2000 – 2001 Dönem III Koordinatör Yardımcılığı, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

2000 – 2009 Klinik Araştırmalar Etik Kurul Üyeliği, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

2000 – 2009 Bilimsel Araştırmalar Kurulu Üyeliği, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi


111

1999 – 2001 Farmakoloji Anabilim Dalı Öğretim Görevliliği, Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi

1999 – 2009 Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Merkezi, Araştırma Ünitesi Sorumluluğu, Başkent Üniversitesi

1991 – 1999 Pratisyen Hekim, Ankara Numune Hastanesi, Acil Servis

5. ÜYESİ OLDUĞU DERNEKLER

- Türk Tabipleri Birliği

- Türk Farmakoloji Derneği

- Biophysical Society

- Cardiac Muscle Society

- Middle East Society for Organ Transplantation

YAYIN LİSTESİ


1. Cardiac Progenitor Cells Engineered with PIM-1 Possess Electrophysiological Properties Consistent with Cardiomyocyte Lineage. H. Tufan, X-H. Zhang, N Haghshenas, L. Cleemann, M. Sussman, M. Morad. JMCC, 2012 (basımda)

2. An alternative method of using an interpositional silicone sheet in tissue expansion. H. Borman, M. Deniz, T. Bahar, B. Bilezikci, H. Tufan, M. Haberal. J. Craniofac. Surg. 20; 905-8, 2009.

3. Comparison of the protective effects of melatonin and amifostine on radiation-induced epiphyseal injury. E. Topkan, H. Tufan, A.A. Yavuz, D. Bacanli, C. Onal, S. Kosdak, MN Yavuz. Int. J. Radiat. Biol. 84; 796-802, 2008.

4. Effect of manual bowel decompression (milking) in the obstructed small bowel. N. Törer, T. Z. Nursal, H. Tufan, F. Can, N. Bal, A. Tarim, G. Moray, M. Haberal. Am J Surg. 195(6); 807-13, 2008.

5. Fluid Resuscitation of Acute Hemorrhage in Uninephrectomized Rabbits: Effects on the Early Function of the Remnant Kidney. E. A. Akpek, H. Tufan, P. Korkusuz, S. Candan, E. Aşan, S. Arda,

A. Haberal, G. Arslan. M.E.J. Anesth 19(4); 869 -84, 2008.

6. The Bactericidal and Morphological Effects of Peroxynitrite on Helicobacter pylori. M. Tecder-Unal, F. Can, M. Demirbilek, G. Karabay, H. Tufan, H. Arslan. Helicobacter, 13(1); 42-8, Feb 2008.

7. Evaluation of Neointimal Hyperplasia on Tranilast-Coated Synthetic Vascular Grafts: An Experimental Study. F. Karakayalı, N. Haberal, H. Tufan, N. Hasırcı, Ö. Başaran, Ş. Sevmiş, A. Akdur, A. Kızıltay, M. Haberal. Journal of Investigative Surgery, 20:167-73, 2007.

8. Vasorelaxant effect of levcromakalim on isolated umbilical arteries of preeclamptic women. B. Polat, H. Tufan, N. Danışman. European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology, 134; 169-73, 2007.

9. Angiotensin II – Captopril Co-treatment Augments Angiogenesis in Abdominal Skin Flap in Rats. H. Tufan, B. M. Zaki, M. Tecder-Ünal, Ş. R. Erdem, G. Take. Annals of Plastic Surgery, 58(4); 441-8, April 2007.

10. The effects of systemic alpha-1 adrenergic antagonists on pupil diameter in rats. R. Altan-Yaycıoğlu, Ö. Yaycıoğlu, H. Tufan, Y. A. Akova, H. Özkardeş. Current Eye Research, 32; 217-21, 2007.

11. Propofol inhibits potassium chloride induced contractions of isolated human umbilical vessels. E. Calıskan, Z. Kayhan, H. Tufan. European Journal of Anaesthesiology, 23(5); 411-7, May 2006.

12. In-vivo and in-vitro effects of stellate ganglion blockade on radial and internal mammary arteries. A.Dönmez, H. Tufan, N. Tutar, C. Araz, A. Sezgin, E. Karadeli, A. Torgay. Journal of Cardiothoracic and Vascular Anesthesia, 19(6); 729-33, 2005.

13. Age-related alternations of oxidative stress and arginase activity as a response to intestinal ischemia-reperfusion in kidney and liver. D. Aldemir, H. Tufan, M. Tecder-Ünal, S. Türkoğlu, E. Öğüş, Z. Kayhan, M. Haberal. Transplantation Proceedings, 35(7); 2811-2815, 2003.

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Sussman,+M&fullauthor=Sussman,%20Mark&charset=UTF-8&db_key=PHY

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Morad,+M&fullauthor=Morad,%20Martin&charset=UTF-8&db_key=PHY

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19461331?itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_RVDocSum&ordinalpos=2



112

14. Contractile responses of the human umbilical artery to KCl and serotonin in Ca-free medium and the effects of levcromakalim. H. Tufan, B. Ayan-Polat, M. Tecder-Ünal, G. Polat, Z. Kayhan, E. Öğüş. Life Sciences, 72; 1321-9, 2003.

15. Effect of intestinal ischemia–reperfusion on rat kidney. D. Aldemir, M. Tecder-Ünal, H. Tufan, E. Öğüş, S. Türkoğlu, Z. Kayhan. Transplantation Proceedings, 34; 2023-6, 2002.

16. The comparison of the responsiveness of human isolated internal mammary artery and gastroepiploic arteries to levcromakalim: An alternative approach to the management of graft spasm. F. Akar, B.S. Uydeş-Doğan, H. Tufan, S. Aşlamacı, C. Köksoy, İ. Kanzık. British Journal of Clinical Pharmacology, 44; 49-56, 1997.

Yurtiçi Yayınlar:

1. Pretreatment with cypress cones’ water extract enhances survival of ischemically challenged skin flaps a preliminary study. B.G.Ulusal, H. Tufan, A.E. Ulusal, C. Haberal, T. Seyhan, H. Borman, M. Haberal. Türk Plastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Dergisi, 17(1); 25-29, 2009.

2. Hipotansif sıçan modelinde düşük doz dopamin infüzyonunun böbrek koruyucu etkisi: Deneysel Çalışma (The protective effect of low-dose dopamine on renal functions in hypotensive rats: an experimental study). H. Kaya, H. Tufan, M. Özdoğan, G. Arslan. Ulusal Travma ve Acil Cerrahi Dergisi (Turkish Journal of Trauma & Emergency Surgery), 12(3); 189-94, 2006.

3. Peroksinitritin biyolojik sistemlerdeki rolü. M. Tecder-Unal, H. Tufan. Türkiye Klinikleri Kardiyoloji, 16; 110-8, 2003.

Yurt Dışı Kongre Bildirileri:

1. Ca2+

Transients in Pim-1 Transfected Cardiac Stem Cells Co-Cultured With Rat Neonatal Cardiomyocytes. H. Tufan, L. Cleemann, M. Sussman, M. Morad. Biophysical Society 54th Annual Meeting, February 2010, San Francisco, California. Biophysical Journal, vol. 98, issue 3, pp. 134a-134a

2. Use of a silicon sheet to improve the reliability of tissue expansion. H. Borman, H. Tufan, B. Bilezikci, T. Bahar, M. Deniz. XIII. ISBI Congress, VII. FELAQ Congress, V. SBQ Congress, September 2006, Fortaleza/BRAZIL. BURNS, 33 Supplements 1: S53, 2007.

3. Effects of high dose triamcinolone acetonide on proliferation of retinal endothelial cells in ROP-mouse-model. I. Akkoyun, G. Yılmaz, S. Oto, N. Haberal, D. Bacanlı, H. Tufan, Y. Akova. European Vision and Eye Research (EVER), October 2006, Vilamoura/PORTUGAL. Acta Ophtalmologica Scandinavica, 84(s239), 4242, 2006.

4. Plasma endostatin levels after partial or salvage liver resection in mice. D.Aldemir, M. Tecder-Ünal, A. Ekrem, H. Tufan, S. Türkoğlu. The 15

th World

Congress of Pharmacology, July 2006, Beijing/CHINA. Acta Pharmacologica Sinica, 27 Supplement 1: P-294, 2006.

5. Discrepancy in the effect of adrenomedullary tyrosine hydroxylase increase on contractile responses to phenylephrine in rat aorta: A stress study. S.R. Erdem, M. Tecder-Ünal, H. Tufan, S. Sarışık, F. Belgin Ataç. The 15

th World Congress of Pharmacology,

July 2006, Beijing/CHINA. Acta Pharmacologica Sinica, 27 Supplement 1: P-176, 2006.

6. Bacterial effect of peroxynitrite on Helicobacter pylori: A morphological study. M. Tecder-Ünal, F.Can, M. Demirbilek, G. Karabay, S.R. Erdem, H.Tufan, H. Arslan. The 15

th World

Congress of Pharmacology, July 2006, Beijing/CHINA. Acta Pharmacologica Sinica, 27 Supplement 1: P-56, 2006.

7. Baskent University – Center for experimental research on animal. H. Tufan, D. Bacanlı, Z. Kayhan, M. Haberal. 1

st East Mediterranean Regional

ICLAS Symposium on Laboratory Animal Science, May 2005, Athens/GREECE.

8. Baskent University – Breeding center for experimental animals. D. Bacanlı, S. Türkmen, H. Tufan, Z. Kayhan, M. Haberal. 1

st East Mediterranean Regional

ICLAS Symposium on Laboratory Animal Science, May 2005, Athens/GREECE.

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Cleemann,+L&fullauthor=Cleemann,%20Lars&charset=UTF-8&db_key=PHY

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Sussman,+M&fullauthor=Sussman,%20Mark&charset=UTF-8&db_key=PHY

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Morad,+M&fullauthor=Morad,%20Martin&charset=UTF-8&db_key=PHY

113

9. The principles of study and ethical approach to the animal welfare and research at Baskent University. D. Bacanlı, H. Tufan, S. Türkmen, K. Tokel, H. Özkardeş, Z. Kayhan, M. Haberal. 1

st

East Mediterranean Regional ICLAS Symposium on Laboratory Animal Science, May 2005, Athens/GREECE.

10. The effects of endothelium on vascular responses to authentic peroxynitrite and SIN-1. M. Tecder-Ünal, H. Tufan ve S. R. Erdem. XII

th Meeting of the Society for

Free Radical Research International, Buenos Aires/ARGENTINA, 2004. Free Radical Biology & Medicine, 36 (Supp 1), P9-288, 2004.

11. Effects of stellate ganglion blockade on the diameters of radial and internal mammarian arteries Doppler ultrasonographic and in-vitro results. A. Dönmez, H. Tufan, N. Uslu, C. Araz, A. Sezgin, E. Karadeli, A. Torgay. Society of Cardiovascular Anesthesiologists, 26

th

Annual Meeting & Workshops, April 2004, Honolulu/HAWAII. Anesthesia And Analgesia, 98 (4): 47-47 Suppl. S, 2004.

12. Intestinal ischemia/reperfusion induced renal oxidative stress increase with age in rats. D. Aldemir, H. Tufan, M. Tecder-Ünal, S. Türkoğlu, E. Öğüş, Z. Kayhan, M. Haberal. The VIII. International Congress of the Middle East Society for Organ Transplantation, October 2002, Muscat/SULTANATE OF OMAN.

13. The early effects of oxaliplatin and 5-fluorouracil on wound healing in experimental colon anastomosis. E. Ersoy, S. Yıldırım, S. Arda, T.Z. Nursal, H. Tufan, M. Ünal, A. Pamir. 12

th World

Congress of the International Association of Surgeons and Gastroenterologist, Oct-Nov 2002, İstanbul/TURKEY. Hepatogastroenterology, 49 (Supp 2), 2002.

14. Effect of propofol on vascular reactivity in isolated human umbilical vessels. E. Erol, H. Tufan, Z. Kayhan. European Society of Anaesthesiologist, 10

th ESA

Anniversary Meeting and 24th EAA

Annual Meeting, Euroanaesthesia 2002, April 2002, Nice/FRANCE. European Journal of Anaesthesiology, 19 (Supp 24), 2002.

15. Influence of thipenthal sodium in edema and inflammation induced by adult respiratory distress syndrome. H. Tufan, M. Tecder-Ünal, B. Bilezikci, P. Zeyneloğlu, Z. Kayhan. XI

th Meeting of

the Society for Free Radical Research International, july 2002, René Descartes University, Paris/FRANCE. Free Radical Biology & Medicine, 33 (Supp 1), 2002.

16. KCl-induced contractions of human umbilical artery in the absence of intracellular calcium. H. Tufan, M. Tecder-Ünal, B. Ayan-Polat. XI

th Meeting

of the Society for Free Radical Research International, july 2002, René Descartes University, Paris/FRANCE. Free Radical Biology & Medicine, 33 (Supp 1), 2002.

17. The hemodynamic effects of some radical scavengers on exogenously infused peroxynitrite in ischemia/reperfusion applied anesthetized rats. M. Tecder-Ünal, H. Tufan. XI


Free Radical Research International, july 2002, René Descartes University, Paris/FRANCE. Free Radical Biology & Medicine, 33 (Supp 1), 2002.

18. The vasoactive responses of peroxynitrite in coronary ischemia/reperfusion applied anesthetized rats. M. Tecder-Ünal, H. Tufan. XI


Free Radical Research International, july 2002, René Descartes University, Paris/FRANCE. Free Radical Biology & Medicine, 33 (Supp 1), 2002.

19. Vascular reactivities of authentic peroxynitrite and SIN-1 in endothelium denudated rat thoracic aorta rings. M. Tecder-Ünal, H. Tufan. XI

th Meeting of

the Society for Free Radical Research International, july 2002, René Descartes University, Paris/FRANCE. Free Radical Biology & Medicine, 33 (Supp 1), 2002.

20. The effect of ketamine and thiopenthal in ischemia/reperfusion induced adult respiratory distress syndrome in rats. M. Tecder-Ünal, H. Tufan, B. Bilezikci, Z.Kayhan. XIV

th World Congress of

Pharmacology, July 2002, Moscon Convention Center, San Francisco, California/USA. The Pharmaologist, 44(2) Supp 1, 2002.

114

21. Comparison the vascular effects of authentic peroxynitrite and SIN-1 in rat thoracic aorta. M. Tecder-Ünal, H. Tufan. XIV

th World Congress of Pharmacology,

July 2002, Moscon Convention Center, San Francisco, California/USA. The Pharmaologist, 44(2) Supp 1, 2002.

22. Renal arginase activity as a response to intestinal ischemia – reperfusion. D. Akaydın-Aldemir, H. Tufan, S. Türkoğlu, E. Öğüş, M. Tecder-Ünal, Z. Kayhan. 27

th

Meeting of the Federation of European Biochemical Society, 2001, Lisbon/PORTUGAL. The FEBS Journal, 268 (Supp 1); 197, 2001.

23. The effect of intestinal ischemia – reperfusion on hepatic arginase activities. H. Tufan, D. Akaydın-Aldemir, S. Türkoğlu, E. Öğüş, M. Tecder-Ünal. XXXIII. International Congress of Physiological Sciences, August – September 2001, Christchurch/NEW ZEALAND.

24. In-vitro effects of propofol on human umbilical vessels. E. Erol, H. Tufan, Z. Kayhan, E. Öğüş. XXXIII. International Congress of Physiological Sciences, August – September 2001, Christchurch/NEW ZEALAND.

25. The effects of levcromakalim on KCl and 5-HT induce contractions of the human umbilical artery in calcium-free medium. H. Tufan, E. Erol, E. Öğüş. XXXIII. International Congress of Physiological Sciences, August – September 2001, Christchurch/NEW ZEALAND.

26. Effect of intestinal ischemia/reperfusion on rat kidney. D. Aldemir, M. Tecder-Ünal, H. Tufan, E. Öğüş, S. Türkoğlu, Z. Kayhan. Böbrek Transplantasyonunda 25. Yıl, Kasım 2001, Ankara/TURKEY.

27. The effects of vasodilator agents on normal and preeclamptic umbilical arteries. H. Tufan, F. Akar, B. Ayan-Polat, N. Danışman, İ. Kanzık. XXXIII. International Congress of Physiological Sciences, 1997, St. Petersburg/RUSSIA.

28. Do prostaglandins and nitric oxide play a role in the relaxant responses of levcromakalim (BRL 38227) in arterial grafts? B.S. Uydeş-Doğan, H. Tufan, S. Aşlamacı, C. Köksoy, İ. Kanzık, F. Akar. X. International Conference of Prostaglandins and Related Compounds,

1996, Vienna/AUSTRIA. Prostaglandins Leukotriens and Essential Fatty Acids, 55 Supp. P218, 1996.

29. Tromboxane analogue U46619 – induced contractions of arterial grafts: its prevention and reversal by levcromakalim (BRL 38227). F. Akar, B.S. Uydeş-Doğan, H. Tufan, S. Aşlamacı, C. Köksoy, İ. Kanzık. X. International Conference of Prostaglandins and Related Compounds, 1996, Vienna/AUSTRIA. Prostaglandins Leukotriens and Essential Fatty Acids, 55 Supp. P217, 1996.

30. K+ channel active agents play a role in indomethacin – induced gastric mucosal injury in rats. H. Tufan, K. Buharalıoğlu, B.S. Uydeş-Doğan, İ. Kanzık, F. Akar. X. International Conference of Prostaglandins and Related Compounds, 1996, Vienna/AUSTRIA. Prostaglandins Leukotriens and Essential Fatty Acids, 55 Supp. P260, 1996.

31. Potassium channel activators in the management of graft spasm. H. Tufan, B.S. Uydeş-Doğan, S. Aşlamacı, C. Köksoy, İ. Kanzık, F. Akar. First European Congress of Pharmacology, 1995, Milan/ITALY. Pharmacological Research, 31 Supp. P183, 1995.

Yurt İçi Kongre Bildirileri:

1. Prematüre retinopati in vivo fare modelinde triamsinolon asetonid’in retinal endotelyal hücre proliferasyonuna etkisi. İ. Akkoyun, G. Yılmaz, S. Oto, N. Haberal, B. Kahraman, D. Bacanlı, H. Tufan, Y. Aydın Akova. Türk Oftalmoloji Derneği 40. Ulusal Kongresi, S-TR-2-1, 28 Ekim – 1 Kasım 2006, ANTALYA.

2. Tranilast emdirilmiş sentetik vasküler greftlerde neointimal hiperplazinin değerlendirilmesi: Deneysel çalışma. F. Karakayalı, N. Hasırcı, N. Haberal, H. Tufan, Ö. Başaran, A. Akdur, A. Kızıltay, M.Haberal. Ulusal Cerrahi Kongresi, Mayıs 2006, ANTALYA.

3. Peroksinitritin Helicobacter pylori üzerine etkilerinin incelenmesi. M. Tecder-Ünal, F. Can, M. Demirbilek, G. Karabay, Ş.R. Erdem, H. Tufan, H. Arslan. XII.Türk Klinik Mikrobiyoloji ve İnfeksiyon Hastalıkları Kongresi, Kasım 2005, ANTALYA.

115

4. Sınavlardan sonra öğrencilere geri-bildirim verilmesi Başkent Üniversitesi Tıp Fakültesi Dönem III öğencilerinin farmakoloji dersindeki başarılarını artırıyor. Ş.R. Erdem, M. Tecder Ünal, H. Tufan, B. Demirhan. 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi, P81, Eylül 2005, İZMİR.

5. Adrenomedüller tirozin hidroksilaz düzey değişikliği damarsal adrenerjik kasılma yanıtlarını nasıl etkiler?: Sıçanlarda yapılan bir stres çalışması. Ş.R. Erdem, M. Tecder Ünal, H. Tufan, S. Sarışık, F.B. Ataç. 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi, P71, Eylül 2005, İZMİR.

6. Anjiotensin-II-Kaptopril kombinasyonu sıçan deri flebinde anjiojenezi artırıyor. H. Tufan, B.M. Zaki, M. Tecder Ünal, Ş.R. Erdem, G. Take. 18. Ulusal Farmakoloji Kongresi, S7, Eylül 2005, İZMİR.

7. Prefabrike flablerde genişletici ve silikon yaprak kullanımının flab anjiyojenezine etkisinin immünohistokimyasal olarak incelenmesi. B.Z. Salem, G. Take, H. Tufan. VII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi, P-35, 2004, MERSİN.

8. Prefabrike flablerde genişletici ve silikon yaprak kullanımının damar ultrastrüktürüne etkisi. B.Z. Salem, G. Take, H. Tufan. VII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi, P-91, 2004, MERSİN.

9. Prefabrike flablerde genişletici ve silikon yaprak kullanımının flab cascade 3 immünoreaktivitesine etkisi. B.Z. Salem, G. Take, H. Tufan. VII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi, P-36, 2004, MERSİN.

10. Stellat gangliyon bloğunun internal meme arteri ve radiyal arter kontraksiyonlarına etkisi: İnvitro kontrollü çalışma. A. Dönmez, H. Tufan, Ç. Araz, A. Sezgin. Türk Anesteziyoloji ve Reanimasyon Derneği XXXVII. Kongresi, Kasım 2003, ANKARA.

11. Başkent Üniversitesi, Deney Hayvanları Üretim ve Araştırma Merkezi, Araştırma Ünitesi. H. Tufan, D. Bacanlı, Z. Kayhan, N. Bilgin, M. Haberal. 2. Ulusal Deneysel Cerrahi Kongresi, 20-21 Eylül 2003, ANKARA.

12. Solunum arresti sonrası oluşan kardiyak arrestte diltiazemin etkisi. A. Torgay, H.

Tufan, A. Kızılkan, G. Arslan. Türk Anesteziyoloji ve Reanimasyon Derneği XXXVI. Kongresi, Ekim 2002, ANTALYA.

13. Umbilikal arter ve ven üzerine propofolün etkisi. E. Erol, Z. Kayhan, H. Tufan. Türk Anesteziyoloji ve Reanimasyon Derneği XXXV. Kongresi, Ekim 2001, ANTALYA.

14. Preeklampsi tedavisinde yeni bir seçenek: Levkromakalim ve nifedipinin invitro vazodilasyon etkilerinin karşılaştırılması. B. Polat, H. Tufan, G. Polat, A. Sargın, R. Karayalçın, N. Danışman. Türk–Avrupa Jinekoloji Derneği 4. Kongresi, Mayıs-Haziran 2001, ANTALYA. Artemis, 2(1), 2001.

15. Hipotansif sıçanlarda düşük doz dopaminin böbrek fonksiyonları üzerine etkisi. H. Kaya Özdoğan, H. Tufan, G. Arslan. XXXIV. Türk Anesteziyoloji ve Reanimasyon Kongresi (Uluslararası katılımlı), 2000, Kuşadası/AYDIN.

16. Tek böbrekli tavşanlarda hemodilüsyonun böbrek fonksiyonları üzerine etkisi. E.A Akpek, H. Tufan, S. Candan, E. Ersoy, S. Arda, G. Arslan. XXXIV. Türk Anesteziyoloji ve Reanimasyon Kongresi (Uluslararası katılımlı), 2000, Kuşadası/AYDIN.

17. Normal ve preeklamptik umbilikal arterlerin damar düz kas cevaplılığının karşılaştırılması. H. Tufan, B.S. Uydeş-Doğan, N. Danışman, B. Ayan-Polat, İ. Kanzık, F. Akar. XIII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 1996, ANTALYA.

18. Potasyum kanal açıcısı levcromakalimin internal meme arteri ve gastroepiploik arter üzerindeki etkisi. B.S. Uydeş-Doğan, H. Tufan, F. Akar, S. Aşlamacı, A. Arat, C. Köksoy, İ. Kanzık. XII. Ulusal Farmakoloji Kongresi, 1994, ANTALYA.

* * * * *

Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuaklararası...

Documents

Transcript of Türk Farmakoloji Derneği Farmakoloji Eğitiminde Kuaklararası...