Travaux Pratiques de Biochimie Structurale et d'Enzymologie

Wageningen Agricultural University

From the SelectedWorks of Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD

January, 2006

Travaux Pratiques de Biochimie Structurale etd'EnzymologiePr. Mamoudou H. DICKO, Université de Ouagadougou

Available at: https://works.bepress.com/dicko/17/

https://works.bepress.com/dicko/

https://works.bepress.com/dicko/17/

TP. Licence Biochimie, DUT-CQA-2ème Année, Pr. M. H. DICKO

1

TRAVAUX PRATIQUES

BIOCHIMIE STRUCTURALE & ENZYMOLOGIE

Licence de Biochimie DUT- Contrôle Qualité- IAA-2ème Année

Enseignant

Pr. Mamoudou H. DICKO, MSc, DSc, PhD Maître de Conférences en Biochimie et Biotechnologie

Moniteurs

- Obamé Luis Clément (Thèse Biochimie)

- Karim Koudougou (Thèse Biochimie)

- Bayili Romaric (DEA Biochimie)

- Abdoul-Latif Fatimatou (DEA Biochimie)

- Diabaté Wilfrid (DESS-IAA)

Techniciens Paul KAGANBEGA

Kaboré Dieudonné

Traoré Eugène

Année 2006-2007

UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU

-------------------

Unité de Formation et de Recherche

en Sciences de la Vie et de la Terre

(U.F.R.–S.V.T.) -----------------

Centre de Recherche en Sciences Biologiques

Alimentaires et Nutritionnelles

(CRSBAN) -----------------

Laboratoire de Biochimie Emails: [email protected]

[email protected]

Tel. +227 70272643


2

AVANT PROPOS

Inutile de rappeler ici les exigences en matière de comportement au laboratoire, la conduite à

tenir, les règles d’utilisation des appareils etc., car elles sont sensées être connues par un étudiant

de niveau Licence ou 2ème

Année DUT-Contôle de Qualité en Agroalimentaire.

Les objectifs globaux de ce TP sont de :

- connaître les propriétés chimiques et physiques des constituants de la matière vivante et les

méthodes de dosage;

- être capable d'utiliser les outils de base de la biochimie, de les manipuler correctement avec

exactitude et précision et de présenter des données sous forme de tableaux, de figures ou de

graphiques.

Le but de ce cours sera avant tout pratique. Il faut donner au futur biochimiste les moyens

théoriques de comprendre les techniques biochimiques utilisées en laboratoire et dans l'industrie.

Le plus souvent, plusieurs techniques s'offrent au Biochimiste qui est amené à faire un choix

selon les avantages et les inconvénients de chaque méthode et les propriétés du matériel à

étudier. Le gradué devra être capable de justifier et de proposer ce choix en situant le problème

dans un contexte plus général. Il devra également être capable de comprendre et de proposer

l'intégration de plusieurs techniques en une stratégie.

Enfin, la Biochimie et l'instrumentation étant en perpétuelle évolution, le futur gradué devra être

formé pour apprendre à apprendre.

Le plus souvent, le Biochimiste est amené à faire un choix selon les avantages et les

inconvénients de plusieurs techniques et les propriétés du matériel à étudier. Enfin, l'étudiant

devra être capable de faire un rapport concis sur le travail demandé et les résultats obtenus. Il

devra être capable de discuter ses résultats.

© copyright , Droit d’auteurs : aucune photocopie du document n’est autorisée sans l’accord

écrit des auteurs.

Pr. Mamoudou H. DICKO, PhD


3

S O M M A I R E

TP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE L’AMIDON TOTAL,

L’AMYLOSE ET L’AMYLOPECTINE .................................................................4

TP. 2. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES SUCRES TOTAUX ET DES

SUCRES REDUCTEURS.........................................................................................7

TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET

POLYSACCHARIDES : ETUDE DE LA MUTAROTATION DU

GLUCOSE ................................................................................................................9

TP. 3 COMPARAISON DES POUVOIRS ROTATOIRES DES MONO ET

POLYSACCHARIDES : ETUDE DE LA MUTAROTATION DU

GLUCOSE .............................................................................................................. 10

TP. 4. ETUDE CINETIQUE DE L’HYDROLYSE ENZYMATIQUE DE L’AMIDON..... 13

TP. 5. COMPARAISON DU DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES

PROTEINES PAR LA METHODE DE BRADFORD/SEDMAK ET PAR LA

METHODE DE KJELDAHL................................................................................. 17

TP. 6. EXTRACTION ET CARACTERISATION DES LIPIDES ...................................... 21

TP. 7. ETUDE CINETIQUE DE L’HYDROLYSE DES TRIGLYCERIDES PAR LA

LIPASE DE Pseudomonas Cepacia ........................................................................ 27

TP. 8. FRACTIONNEMENT D’UN HOMOGENAT DE PANCREAS ET

CARACTERISATION DES FRACTIONS OBTENUES ..................................... 33

TP. 9. ETUDE CINETIQUE DE LA LIBERATION DES ACIDES GRAS PAR LA

LIPASE PANCREATIQUE A PARTIR D’HUILE D’ARACHIDE .................... 31

TP 10. ELECTROPHORESE DES PROTEINES................................................................. 37


4

TP. 1. DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DE L’AMIDON TOTAL,

L’AMYLOSE ET L’AMYLOPECTINE

Principe

L’amidon (polysaccharides de réserve chez les végétaux) est une macromolécule

constituée de deux polymères de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). L’amylose est

constitué essentiellement d’unités de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type

α(1→4). L’amylopectine consiste essentiellement en unités α(1→4)-D-glucosidiques linéaires

mais branchée, par des liaisons de type α(1→6)-D-glucosidiques à tous les 24-30 unités de

glucose. L’amylopectine contient plus de 106

résidus de D-glucose , la rendant ainsi la

macromolécule biologique la plus volumineuse qui existe. La structure primaire de

l’amylopectine est semblable à celle du glycogène (polysaccharide de réserve chez les animaux)

mais le nombre de résidus de D-glucose dans les ramifications est de l’ordre de 8 à 12 dans le

glycogène. En d’autres termes le glycogène est plus ramifié que l’amylopectine.

L’iode (I2) interagit avec l’amylose et l’amylopectine pour donner une coloration

respectivement bleue et brune. Les spectres des complexes I2-amylose et I2-amylopectine sont

différents. De ce fait ces complexes ont des longueurs d’ondes maximales pour l’amylose (λmax

= 630 nm) et l’amylopectine (λmax = 548 nm) qui sont différentes. En plus l’amylose absorbe

dans le proche visible tan disque l’amylopectine n’y absorbe pas (Figure 2). On peut donc

utiliser cette différence spectrale pour doser simultanément l’amidon total, l’amylose et

l’amylopectine dans un matériel biologique. Dans cette manipulation on considérera que

l’absorbance à 580 nm est liée à la fois à l’amylose et à l’amylopectine, par contre l’absorbance à

720 nm est liée essentiellement à l’amylose.

Matériels et réactifs

- Bain –marie

- Spectrophotomètre UV-visible

- Tubes à essais

- Centrifugeuse

- Plaques chauffantes

- Réactif de l’iode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI à 2 % (w /v) dans 0.1 N HCl.

- Amidon de pomme de terre

- 1 N KOH

- 1 N HCl

Mode opératoire

- a. Courbe d’étalonnage de l’amidon standard

Disperser 0.5 g d’amidon dans 20 ml d’eau distillée. Y ajouter 80 ml d’eau distillée

bouillante. Agiter légèrement le mélange et continuer l’ébullition pendant 5 min sur une plaque

chauffante pour obtenir une solution d’amidon limpide. Refroidir le mélange et le compléter à un

volume de100 ml avec l’eau distillée. Ceci constitue une solution stocke d’amidon à 5 mg/ml. La

courbe d’étalonnage est établie selon le tableau ci-dessous :


5

Tableau 1. Etablissement de la courbe d’étalonnage. N.B. Les mesures sont faites en triplet

Réactif /tube T=0

(Blanc)

T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 T=8 T=9 T=10

Amidon (5

mg/ml) en ml

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0.10

H2O (ml) 4.9 4.89 4.88 4.87 4.86 4.85 4.84 4.83 4.82 4.81 4.8

Réactif I2/KI

(ml)

0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Calculer la conc

d’amidon

(mg/ml)

Durée

d’incubation

10 min avant les lectures des DOs

DO1 (580 nm)

DO2 (720 nm)

Moy DO1

Moy DO2

- Tracer la courbe f([amidon]) = DO1, amidon total

Tracer la courbe f([amidon]) = DO, amylose sachant que la proportion d’amylose et

d’amylopectine dans l’amidon de pomme de terre est respectivement de 20% et 80%.

- b. Préparation de l’échantillon à analyser

Prendre 0.1 g de farine de matériel biologique bien broyé (Φ = 0.5 mm) et y ajouter 5 ml

de 1 N KOH. Bien homogénéiser la solution à la température ambiante et la neutraliser

ensuite avec 5 ml de 1 N HCl. Bien s’assurer que la solution est neutre à l’aide d’un

papier pH. Mettre ensuite le mélange en ébullition au bain-marie pendant 15 min.

Réajuster le volume du mélange à 10 ml. Centrifuger le mélange et prendre le surnageant.

Filtrer au besoin le surnageant et l’utiliser pour le dosage de l’amidon.

- C. Dosage de l’amidon dans le matériel biologique. N.B. Les mesures sont faites en

triplet

Réactif /Echantillon Blanc Echantillon 1 Echantillon 2

Echantillon 0 0.05 ml 0.05 ml

H2O 4.90 ml 4.85 ml 4.85 ml

Réactif I2/KI 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

Durée d’incubation 10 min avant les lectures des DOs

Moy DO (580 nm)

Moy DO (720 nm)

A l’aide de ces mesures, calculer les proportions d’amidon total, d’amylose et d’amylopectine

dans les échantillons. Donner une conclusion.


6

Figure 2

Figure 1. A) structure linéaire de l’amylose ; B) Structure ramifiée de l’amylopectine

A M Y LO S E

A M Y L O PE C T IN

A M Y LO S E

Référence. Jarvis, C. E. and Walker, J. R. L. (1993) Simultaneous, rapid, spectrophotometric

determination of total starch, amylose and amylopectin. J. Sci. Food Agric. 63 , 53-57


7

TP2. Dosage spectrophotométrique des sucres totaux et des sucres réducteurs

Principe

En milieu acide et à chaux, les liaisons glycosidiques des carbohydrates sont hydrolysées. Les

oses simples ainsi libérés subissent une déshydrations intramoléculaires pour des dérivés

furfuraux (furfural ou hydroxymethyl furfural). La fonction aldéhyde des furfuraux se condense

ainsi en milieux acides avec l’hydroxyl d’un composé phénolique (Figure 1) pour donner des

acétals ou hémi-acétals de couleur rougeâtre qui absorbent dans le visible (450-500 nm). Cette

méthode permet ainsi de doser tous les glucides totaux d’un matériel biologique.

Les sucres réducteurs sont dosés par une méthode colorimétrique avec le réactif à l’Acide 3,5-

Dinitrosalycilique (DNS). C’est une réaction d’oxydo-réduction non stœchiométrique permettant

de quantifier les sucres réducteurs. Dans cette réaction, la fonction aldéhyde du sucre libre

(réducteur) est transformée en fonction carboxylique par le DNS (oxydant). L’absorbance du

DNS oxydé est lue à 546 nm.


- Bain –marie


- Tubes à essais

- Centrifugeuse


- Solution de phénol : 5% (p/v) dans l’eau

- Acide sulfurique à 75%

- Réactif au DNS

Solution A= 2g de DNS dispersé dans 40 ml d’eau distillée

Solution B. 3.2 g de NaOH dissout dans 30 ml d’eau

Les deux solutions A et B sont mélangées et on y ajoute 60 g de tartrate double de

sodium et de potassium. Dissolution du mélange peut nécessiter un léger

chauffage su une plaque chauffante. Après dissolution, le volume est ajusté à 100

ml avec l’eau.

- Solution standard de maltose à 0.05 mg /ml pour les sucres totaux

- Solution de maltose à 0.5 mg/ml pour les sucres réducteurs

Mode opératoire

- a. Etablissement des courbes d’étalonnage

Tableau 1. Courbe d’étalonnage pour les sucres totaux :

Réactif /tube T=0

(Blanc)

T=1 T=2 T=3 T=4 T=5

Maltose (0.05

mg/ml)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

H2O (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Phénol (5%) (ml) 0.5 0.50 00.5 0.5 0.5 0.5

H2SO4 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml 2ml

Incubation bain

marie bouillant

15 min

Incubation à

l’obscurité

15 min


8

Réactif /tube T=0

(Blanc)

T=1 T=2 T=3 T=4 T=5

Calcul conc.

maltose

Moy A492

- Tracer la courbe A492 = f([maltose]); et donner l’équation de la droite.

Tableau 2. Courbe d’étalonnage pour les sucres réducteurs

Réactif /tube T=0

(Blanc)

T=1 T=2 T=3 T=4 T=5

Maltose (0.5

mg/ml)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

H2O (ml) 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Réactif DNS

(ml)

1 1 1 1 1 1

Incubation bain

marie bouillant

8 min

Calcul conc.

maltose

Moy A546O

- Tracer la courbe f([maltose]) = A546 ; et donner l’équation de la droite.

- b. Préparation et dosage des échantillons à analyser

1 g de farine d’échantillon est dispersé dans 10 ml de DMSO à 25% (v/v) dans l’eau. Le

mélange est incubé au bain marie bouillant pendant 15 min. 0.1 ml de ce mélange est

dilué dans 9.9 ml d’eau.

- Dosages des sucres totaux. A 0.5 ml de ce dernier, on ajoute 0.5 ml de phénol (5%).

Après homogénéisation, on ajoute 2 ml de H2SO4 (75%). Ce mélange est ensuite traité

comme précédemment décrit pour le standard. Faire l’essai en triplicate.

- Dosage des sucres réducteurs. 0.1 ml de l’échantillon préalablement dispersé dans le

DMSO sont mélangés avec 0.4 ml d’eau distillée. La solution est ensuite mélangée avec 1

ml du réactif au DNS puis incubé au bain comme précédemment décrit pour le standard.

Faire l’essai en triplicate.

Calculer la proportion des sucres totaux et des sucres réducteurs dans l’échantillon

Discuter les résultats.


9

+

Figure 1. a) Exemple de réaction de déshydratation d’un pentose tel que le D-ribose pour donner le

furfural

b) exemple de réaction de déshydratation d’un hexose tel que le D-Glucose pour donner

le 5-Hydroxymethyl furfural

c) Réaction de condensation entre le furfural et une composé phénolique tel que le

phénol, l’orcinol, le resorcinol.

H2SO4

D-Ribose

Furfural

+ 3 H2O

H2SO4

D-Glucose 5-Hydroxymethyl Furfural

+ 3 H2O

Acétals

colorés

a)

b)

c)

Références.

Sucres totaux : Fox, J. D. and Robyt, J. F. (1991) Miniaturization of three carbohydrate

analyses using a microsample plate reader. Analytical Biochemistry., 195, 93-96.

Sucres réducteurs: Miller, G. L. (1958) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination

of reducing sugar. Analytical Chemistry. 31, 426-428.


10

TP. 3 Comparaison des pouvoirs rotatoires des mono et polysaccharides :

Etude de la mutarotation du glucose Principe

Les carbohydrates sont des composés optiquement actifs, c'est-à-dire qu’ils dévient la

lumière polarisée. Cette déviation est due à l’existence de plusieurs carbones asymétriques dans

les sucres. En solution, les sucres subissent la mutarotation liée à la variation lente de la

configuration stéréochimique de leurs carbones asymétriques. Cette mutarotation peut induire

une augmentation ou diminution de l’angle de déviation selon les pouvoirs rotatoires spécifiques

des différents anomères. Le pouvoir rotatoire spécifique d’une substance optiquement active se

calcule selon la formule :

LxC

∝=∝ ][

[∝] = pouvoir rotatoire spécifique du composé

∝ = angle de rotation observé au polarimètre

L = longueur du tube de polarimètre (dm)

C = concentration du composé en g/ml

Réactifs et appareils

- Polarimètre

- Solutions de sucres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose,

amidon, équilibrées dans l’eau.

- Poudre de glucose

Mode opératoire Le polarimètre utilisé dans ce TP est le Ceti polaris (Figure 1).

1. Oculaire

2. Bouton de magnification

3. Analyseur ou bouton de contrôle et de

focalisation

4. Bouton de focalisation de l’oculaire

5. Fenêtre de lecture des valeurs des angles

6. Compartiment contenant le tube du

polarimètre de longueur variable

7. Filtre de verre

8. Lampe de sodium (λ=589 nm)

9. Bouton de mise en marche

Figure 1. Description du polarimètre


11

Utilisation du polarimètre

Après avoir allumé la lampe de sodium, attendre 10 min de chauffage. Introduire le tube

contenant l’eau distillée et lire le blanc. Ajuster le bouton de focalisation d’observation pour

obtenir une image claire.

Mettre dans le tube du polarimètre une substance optiquement active (par exemple une solution

de sucre). Noter la longueur du tube.

Tourner le bouton de contrôle jusqu’à ce que la plaque indique presque zéro de tous les deux

côtés (gauche et droite). On observe un cercle jaune/orange divisé par une bande noire comme

suit :

Tourner l’analyseur à la main jusqu’à ce que les trois parties du cercle aient la même couleur

jaunâtre :

Lorsqu’on dépasse la valeur exacte de l’angle α, on observe l’image ci-dessous :

La valeur positive de l’angle α est lue à droite et la valeur négative à gauche. La valeur de

l’angle de rotation est lue comme suit :

- Lire la valeur obtenue à partir des grandes graduations.

- Pour obtenir une meilleure précision on divise un degré de rotation part 20 parties (petites

graduations). Maintenant on lit la valeur décimale au point où le trait intérieur coïncide

avec un trait du cercle extérieur comme indiqué dans l’image ci-dessous :

Comparer les angles de déviation des solutions de différents sucres préalablement préparés et

laissés en équilibres : glucose, mannose, arabinose, fructose, saccharose, raffinose, mélezitose,

amidon, etc. Calculer les concentrations des sucres en utilisant les valeurs de leurs pouvoirs

rotatoires spécifiques données dans la littérature.

Valeur de mesure = α

Valeur de mesure < α

Valeur de mesure > α


12

Etude de la mutarotation du glucose

Dissoudre fraîchement 25 g de glucose dans 100 ml d’eau distillée et l’introduire immédiatement

dans un tube de polarimètre de longueur de 2 dm. Lire la valeur de l’angle à t=0, et ensuite toutes

les 5 min jusqu’à l’état d’équilibre (si le temps impartit le permet !). On obtient le tableau

suivant :

Temps

(min)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 75 90 120

α observé

1. Calculer les pourcentages d’α et de ß-glucose présents après 15 et 30 min d’incubation.

2. Déterminer les constantes cinétiques de la mutarotation k1 et k2 ainsi que la constante de

la mutarotation km. Données : [α] glucose= +112.7, [ß] glucose = +18.7

3. A partir de cette étude pouvons-nous déterminer l’anomère le plus stable ?

Valeurs des pouvoirs rotatoires spécifiques de quelque carbohydrates

Carbohydrate Anomère α Mélange à l’équilibre Anomère ß

D-ribose -23.1 -23.7 -

L-arabinose +54.0 +104.5 +175.0

D-xylose +92 +19 -20.*

D-glucose +113.4 +52.2 +19

D-galactose +144.0 +80.5 +52.0

D-fructose -21.0* -92.0 -133.5

D-mannose +34.0 +14.6 -17.0

L-rhamonose -7.7 +8.9 +54.0*

L-sorbose - -4.4 -

Lactose +90.0 +55.3 +35

Maltose +168.0* +16 +118

Sucrose - +66.5 -

Raffinose - +105.2 -

Trehalose - +178.3 -

*Valeurs calculées.

Référence :

Rendina G. (1971) Experimental in modern biochemistry. Ed. Saundres W. B. Company, New

York (USA). pp.133-161.


13

TP. 4 Etude cinétique de l’hydrolyse enzymatique de l’amidon

Principe L’amidon (polysaccharides de réserve chez les végétaux) est une macromolécule

constituée de deux polymères de D-glucose : Amylose et amylopectine (Figure 1). L’amylose est

constitué essentiellement d’unités de D-glucoses unies entre elles par des liaisons de type

α(1→4). L’amylopectine consiste essentiellement en unités α(1→4)-D-glucosidiques linéaires

mais branchées, par des liaisons de type α(1→6)-D-glucosidiques à tous les 24-30 unités de

glucose. Ces deux polymères peuvent être hydrolysés par les amylases enzymes spécifiques des

liaisons α(1→4)), les glucosidases, l’amidon phosphorylases, la pullulanse, l’amyloglucidase

etc.

Les amylases sont des hydrolases ; enzymes de la classe III dans la classification

internationale des enzymes (International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC). L’α-

amylase ou α-(1→4)-D-glucane 4-glucanohydroase (EC. 3.2.1.1) est d’origine animale, végétale

et microbienne. Elle est surtout abondante dans les grains de céréales (blé, sorgho, mil, etc.) en

germination. La ß-amylase ou α-(1→4) glucane maltohydroase (EC. 3.2.1.2) est surtout

rencontrée dans les végétaux et les microbes. Ces deux enzymes ont pour principal substrat

l’amidon mais leur action est incomplète car elles ne peuvent pas hydrolyser les liaisons α-

(1→6) présentes dans l’amylopectine.

Cette étude consiste à extraire les amylases de la farine de sorgho germé (contenant à la

fois des amylases α et ß), et ensuite à étudier la cinétique de l’hydrolyse de cet amidon par ces

enzymes. L’étude cinétique en fonction de la concentration en substrat nous permettra d’estimer

les paramètres cinétiques (Km et Vm) des amylases du sorgho. En rappelle les amylases sont des

enzymes obéissant à la loi cinétique de Michaélis-Menten donnée par l’équation :

][

][

SKm

EoVmVi

+=

Où Vi= vitesse initiale de la réaction enzymatique (à t ≈ 0)

Vm, vitesses maximale de l’enzyme

Km, constante de Michaélis, correspondant à la concentration en substrat à laquelle

la vitesse atteint la moitié de la vitesse maximale

Le tracé en double inverse de Lineweaver et Burk (tracé en double inverse) nous permet

d’obtenir l’équation suivante :

VmS

xVm

Km

Vi

1

][

11+=

Le tracé 1/vi = f(1/[s]) donne une droite de pente Km/Vm et d’ordonnée à l’origine 1/Vm.

L’iode (I2) interagit avec l’amylose et l’amylopectine pour donner une coloration respectivement

bleue et brune. Dans cette manipulation on considérera que l’absorbance à 580 nm est liée à la

fois à l’amylose et à l’amylopectine. L’hydrolyse de l’amidon par les amylases donne du

glucose, du maltose et des dextrines limites (résidus d’oligosacchrides posssédant des

ramifications de type α(1→6). Cela résulte de ce fait de la décoloration du milieu réactionnel,

e.g. une baisse de l’absorbance à 580 nm. En suivant (monitoring) la variation de l’absorbance à

580 nm, on peut effectivement déterminer les constantes cinétiques apparentes globales des

amylases du sorgho.


- Bain –marie



14

- Tubes à essais

- Centrifugeuse


- Réactif de l’iode : 0.2 g de I2 dissous dans 100 ml de KI à 2 % (w /v).

- Amidon de pomme de terre

- Solution tampon McIlvaine (50 mM phosphate/citrate pH 2 à 9).

Préparer une solution d’acide citrique, 50 mM, pour un volume de 1 litre

Préparer une solution de Na2HPO4, 50 mM, pour un volume de 1 litre

Mode opératoire

- a. Extraction des amylases du sorgho

Peser 1 g de farine de sorgho germée et les disperser dans 20 ml de tampon McIlvaine pH 6

contenant du CaCl2 à 2 mM.. Laisser sous agitation pendant 5 min. Centrifuger la solution et

prendre le surnageant comme extrait enzymatique. Cet extrait doit être conservé au frais (4°C).

- b. Etude de la variation de vitesse initiale en fonction de la concentration en

substrat.

Disperser 0.1 g d’amidon dans 20 ml d’eau distillée. Y ajouter 80 ml d’eau distillée

bouillante. Agiter légèrement le mélange et continuer l’ébullition pendant 5 min sur une plaque

chauffante pour obtenir une solution d’amidon limpide. Refroidir le mélange et le compléter à un

volume de 100 ml avec l’eau distillée. Ceci constitue une solution stocke d’amidon à 1 mg/ml.

Tableau 1. Préparation

Réactif /tube T=0

(Blanc)

T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6

Amidon (1

mg/ml) en ml

0 0.02 0.04 0.08 0.12 0.16 0.20

Tampon Citrate

pH6 (ml)

2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Réactif I2/KI

(ml)

0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

Extrait

enzymatique

200 µl

200 µl

200 µl

200 µl

200 µl

200 µl

200 µl

Prendre les

DO580 nm

toutes les 10 s

t=0

t=10

t=20

t=30

t=---

----

t= 3 min

idem idem idem idem idem idem

N.B. La solution enzymatique est additionnée juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque concentration en amidon, déterminer les

vitesses initiales pour chaque concentration en amidon.

Tracer la courbe Vi = f([amidon)]. Déduire si cette cinétique est Michaélienne ou non

Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramètres cinétiques Km et Vm.

Garder le même blanc pour toutes mesures


15

- c. Etude de l’activité enzymatique en fonction du pH

L’étude de l’activité enzymatique en fonction du pH se fera dans des tampons standard de type

McIlvaine (Journal of Biological Chemistry). Cette préparation se fera sur la base de l’équation

d’Anderson Hasselbalch :

][

][log

Acide

BasepKpH +=

La préparation des solutions tampons se fera selon le tableau suivant :

Tableau 2. Préparation des tampons McIlvaine

Réactif T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9

50 mM

acide

citrique

100

ml

100 ml 100 ml 100 ml 100 ml 100 ml x x x

50 mM

Na2HPO4

0 x x x x x 100 ml 100 ml 100 ml

Volume x

pour obtenir

un désiré pH

2.3 3 4 5 5.5 6.5 7 8 9

Cette gamme de préparation nous permet d’obtenir des solutions tampons de pH variant de 2.5 à

9. Conserver les solutions tampons au frais avant leur utilisation.

Tableau 3. Etude de l’activité en fonction du pH

Réactif /tube T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 T=8 T=8

pH pH3 pH4 pH5 pH5.5 pH6 pH6.5 pH7.0 pH8 pH9

Tampon

McIlvaine

(ml)

2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45 2.45

Amidon (1

mg/ml) en ml

0 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Réactif I2/KI

(ml)

0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04

Durée

d’incubation

5DO580 nm

Extrait

enzymatique

200 µl

200

µl

200

µl

200 µl

200

µl

200 µl

200 µl

200

µl

200 µl

Prendre les

DO580 nm

toutes les 10 s

t=0

t=10

t=20

3 min

idem idem idem idem idem idem idem idem

Tracer la courbe f(A580) = f(t) pour chaque pH, et déterminer les vitesses initiales pour chaque

pH.

Tracer la courbe Vi = f(pH). Quel est le pH optimum des amylases du sorgho ? Tracer la

courbe d’activité relative (%) = f(pH), en considérant 100 % d’activité au pH optimum.

Incubation 5 min


16

Références :

Dicko , M. H. et al. (1999) Purification and characterization of ß-amylase from C. pilosa.

Applied Microbiology and Biotechnology (Germany-USA). . 52, 802-805.

Dicko, M. H. et al. (2000) Extraction, partial purification and characterisation of ß-amylase from

G. klattianus. Bioresource Technology (England). 73, 183-185.

Dicko, M. H. et al. (2001) Polysacharide hydrolases from leaves of B. senegalensis. Applied

Biochemistry and Biotechnology (USA). 94, 225-241.

Reducing

end

Figure 1. Mode d’action des principales enzymes impliquées dans l’hydrolyse de

l’amidon.


17

TP. 5. Comparaison du dosage spectrophotométrique des protéines par la

méthode de Bradford/Sedmak et par la méthode de Kjeldahl.

Principe Le dosage des protéines en solution par la méthode de Bradford est basé sur l’interaction

en milieu acide, entre les protéines et le Coomassie Brillant Bleu G250 (CBBG-250) dont la

structure est la suivante :

Tan disque le CBBG-250 seul a une longueur d’onde maximale à 450 nm ; on obtient en

présence des protéines un déplacement du spectre vers le rouge (effet bathochrome) avec une

longueur d’onde maximale à 620 nm. D’une manière générale le CBBG-250 réagit plus

spécifiquement avec les acides aminés basiques (K, R, H) mais il interagit avec les autres acides

aminés. De ce fait plus la concentration en protéine est élevée, plus l’absorbance à 450 nm

baisse, et l’absorbance à 620 nm augmente. Ainsi, le ratio de l’absorbance à 620 sur l’absorbance

à 450 est fonction de la concentration protéique.

Le tracé de cette courbe nous donne une droite de la forme y = ax (si on soustrait le blanc) ou

une droite de la forme y = ax + b (sans soustraction du blanc).

Le dosage des protéines par la méthode de Kjeldahl est basé sur la minéralisation totale

de la matière biologique en milieu acide, suivie de la distillation de l’azote sous forme

d’ammoniac. En effet, le matériel biologique est minéralisé dans l’acide sulfurique concentré

(H2SO4) à chaud (500-600°C) pendant 5-10 heures en présence du catalyseur de la digestion

(mélange de K2SO4, CuSO4 et sélénium ; ce dernier est de moins en moins utilisé à cause de sa

toxicité). Le dosage de l’azote s’effectue selon les étapes suivantes :

Matériel biologique NH4++ autres minéraux

NH4+

NH3 NH3B(OH)3

A la fin de la minéralisation l’azote se trouve sous la forme minérale [(NH4+)2,

SO4

2-]. Afin

de pouvoir distiller l’azote par entraînement à la vapeur d’eau, il faut d’abord neutraliser l’acide

sulfurique et transformer l’azote sous d’ammoniac gazeux (NH3). Au cours de la distillation

)]([450

620protéinef

A

A=

Neutralisation : NaOH Distillation : B(OH)3

Hydrolyse : H2SO4


18

l’azote de l’ammoniac (Base de Léwis possédant un doublet électronique) est entraîner à la

vapeur d’eau et piégé dans l’acide borique : �B(OH)3 qui est un acide de Léwis (possédant une

orbitale vacante). L’ammoniac est piégé dans l’acide borique à travers une liaison dative :

NH3→�B(OH)3, est ensuite titré avec une solution faible (0.1N) d’acide sulfurique. La

quantification de l’azote total permet d’extrapoler pour estimer la quantité de protéines. On

admet d’une manière générale que :

- la masse des protéines végétales = masse d’azote x 6.25

- la masse des protéines animales = masse d’azote x 5.75



- Tubes à essais , Centrifugeuse

- Bleu de Coomassie G250

- Acide sulfurique concentré

- NaOH 10 N

- Phénophtaléine (1% dans l’éthanol)

- Tablet de catalyse de minéralisation : K2SO4+CuSO4

- Acide perchlorique (HClO4)

- Sérum Albumine bovin

- Acide borique (1.6 g /litre d’eau distilée)

Modes Opératoires

a. Préparation du bleu de Coomassie.

La solution de CBBG-250 (Sigma nr. B-1131) est préparée à une concentration de 0.06%

(p/v) dans une solution d’acide perchlorique à 3 % (p/v). La solution est laissée sous

agitation pendant 24 h, puis filtrée. La solution est ajustée pour donner une DO de 1.3-1.5 à

450 nm, à l’aide d’une solution d’acide perchlorique à 3 % (p/v). Le réactif, stocké à l’abri de

la lumière, pourrait être conservé pendant plus de 10 ans.

b. Préparation de la courbe d’étalonnage pour le dosage des protéines

La protéine standard utilisée pour le dosage des protéines est le bovin serum albumin (BSA) à

une concentration de 50 ·µg/ml dans l’eau distillée).

Tableau 1. Préparation de l’étalon

Tube blanc 1 2 3 4 5 6

BSA (50 µg/ml) en

ml

0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Eau distillée 1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Réactif au Bleu de

Coomassie

1 1 1 1 1 1 1

A620

A450

Après avoir ajouté le réactif, les DOs sont lues dans les 2-5 min qui suivent.

Tracer la courbe :

)]([450

620protéinef

A

A=


19

c. Extraction des protéines de l’échantillon et dosage

- Solution d’extraction : 7.5 g de Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) sont mélangés à 225 µl de

ß-mercapto-éthanol, le tout compléter à 500 ml avec l’eau.

La solution d’échantillon est obtenue par dissolution de 5 g du matériel biologique dans 12.5 ml

de la solution d’extraction. Cette solution est ensuite centrifugée à 5 000 rpm pendant 5 min.

Après centrifugation, le surnageant recueilli. Filtrer le surnageant avec un papier filtre ou à

défaut un papier lotus, juste pou retenir les particules solides et diluer le surnageant 10 fois. Le

dosage s’effectue comme suit :

Tableau : dosage de l’échantillon :

Tube blanc 1 2 3

Echantillon (ml) 0 0.1 0.1 0.1

Solution d’extraction contenant

le DNS

0.01 0 0 0

Eau 0.990 0.9 0.9 0.9

Réactif au Bleu de Coomassie 1 1 1 1

A620

A450

- Calculer la concentration protéique de l’échantillon en vous basant sur la courbe

d’étalonnage déjà établie.

- Pourquoi mettons dans le blanc le SDS dans les mêmes proportions que votre

échantillon ?

d. Dosage des protéines par la méthode de Kjeldahl

Dans un matras de Kjeldahl, sont introduits 0.2 g de farine, un tablet de catalyseur (1 g) et 10 ml

d’acide sulfurique concentré. Le tout est minéralisé pendant 5-10 heures jusqu’obtention d’une

solution limpide (verdâtre). Le minéralisât est dilué avec 50 ml d’eau distillée. A ce mélange, on

ajoute quelques gouttes de phénophtaléine et de la soude 10 N, jusqu’à l’obtention d’une

coloration rose. Après cela, le matras est placé dans l’appareil Kjeldahl pour la distillation. Le

distillat est recueilli dans 50 ml d’acide borique contenant quelques gouttes d’hélianthine et de

vert de bromocrésol. On effectue la distillation jusqu’à l’obtention d’un volume de distillat de

250-300 ml. Le distillat contenant l’ammoniac est titré en présence de phénophtaléine par l’acide

sulfurique 0.1 N. La teneur en protéine pour un matériel biologique végétal est donnée par

l’équation :

10025.6)001.0(14)1(

% xxPE

xNxVoVprotéines

−=

Vo = Volume de H2SO4, ayant servi pour titrer le blanc

V1 : volume de H2SO4 utilisé pour le titrage de l’échantillon

N= normalité de l’acide sulfurique

PE= masse de prise d’essai de l’échantillon

6.25= coefficient de conversion

14 = poids moléculaire de l’azote

Calculer la proportion de protéine dans votre échantillon et comparer les résultats avec la

méthode d’extraction en phase liquide suivie du dosage spectrophotométrique.

Commenter les résultats. Selon vous qu’elle est la meilleure méthode ?

Références.


20

Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantization of microgram quantities

of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry (USA). 72,

248-254.

Sedmak, J. J. and Grossbeg, S. E (1977) A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using

coomassie brilant blue G250. Analytical Biochemistry (USA). 79, 553-560.

Zor, T., and Selinger, Z. (1996) Linearization of the Bradford protein assay increases its

sensitivity: theoretical and experimental studies. Analytical Biochemistry. 236, 302-308.

Dicko et al. (2002) Zymography of monophenolase and diphenoloase activities of polyphenol

oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339.


21

TP. 6. Extraction et caractérisation des lipides

I. Généralités

Les lipides sont des substances naturelles, constituants des structures cellulaires tels que

les phospholipides, les glycolipides membranaires, éléments de revêtement (cires, cutines, etc. ),

les substances de réserve , sources d'énergie cellulaire. On les appelle couramment huiles,

graisses, beurres. La distinction entre graisses et huiles est purement arbitraire car basée sur l'état

physique à température ambiante :

- huiles pour les liquides

- graisses pour les solides et les pâtes.

Les huiles sont souvent liquides à 15°C, les beurres fondent à 25°C, les graisses fondent aux

températures comprises entre 35°C et 40°C et les suifs ou graisses animales fondent à des

températures supérieures à 40°C.

On distingue habituellement :

-les lipides simples (acides gras, glycérides, cérides)

- les lipides complexes (phospholipides, glycolipides).

La graisse: Substance lipidique onctueuse, fondant entre 25°C et 50°C,d’origine animale ou

végétale. On parle de :

- suif (graisse des ruminants)

- Lard (graisse des porcines: porc, sanglier, rhinocéros)

-saindoux (graisse fondue des porcins)

Elle est faite du tissu adipeux très développé chez certains animaux (porcins, ovins et

autres ruminants), oiseaux (dindes, oies, canards, autruches, etc.), carnassiers (lions, tigre,

panthère, léopards, etc,), homme (paume des mains, plante des pieds ), mammifères aquatiques

(baleines, phoques), poissons (morues., hélicoptères), reptiles (boas, pythons, etc.)

C'est la réserve lipidique mobilisable par l'intermédiaire du sang. C'est la source d'énergie

efficace, servant d'isolant dans les tissus sous-cutanés et autour de certains organes.

La graisse est constituée d'esters d'acides gras et de glycérol. Les acides gras sont souvent saturés

(tri-stéarines surtout).

Le beurre de lait de mammifères représente 3 à 10% des matières grasses du lait. Sa

composition varie selon son origine (ruminant, rongeur, félin, équidés, zébus, ovins caprins,

bovins etc.), Il est fait de 82 à 84% de triacyl-glycérols dont 1/3 d'oléine, 4% de butyrine qui se

transforme en acide butyrique d' odeur désagréable. Les teneurs en huile des laits de vache et de

la femme sont respectivement 3.7-5% et 3.7-10%. Les laits de brebis et chèvres renferment

respectivement 6.7% et 4.1%.

La margarine représentant 83% de lipides est faite de mélange de triacyl glycérols.

LES GRAISSES DE LA VIANDE

Le taux des lipides est variable selon les espèces.

-x < 5%. : poulet, cheval

5< x<100% : veau, lapin

-10 < x < 20% : mouton, bœuf

-20 < x< 30% porc, oie


22

Tableau. Composition en huile de quelques oléagineux

Graine ou noix Teneur en lipides (%) Graine ou noix Teneur en lipides

Pomme cajou 43-50 Blighia 54

Pomme cannelle 23 Mangue 3.5-12.5

Thevetia (noix) 57-60.6 Corossolier 25

Coco (noix) 50-60 Rônier 37

Huile de palmiste 49 Pulpe palme 44

Jatropha curcas 30-52 Baobad (grain) 10-30

Karité 40-50 Caïlcédrat 45-60

Orange (grain) 30 Sésame 45-60

Pastèque 20-40 Citron 30-60

Ricin 45-55 Courge 20-50

Gombo 17-20 Gmelina 11

Oseille 17-20 Melon 20-50

Classification des lipides

Les lipides se distinguent des autres composants de la matière vivante, tels les sucres

et les acides aminés, par une insolubilité totale ou partielle dans l’eau. Cette propriété physico-

chimique particulière fait que l’on parle de milieu hétérogène quand on décrit la présence de

lipides dans un milieu aqueux. Par opposition aux composés hydrophiles et solubles dans l’eau,

les lipides sont des composés de nature hydrophobe, solubles dans les solvants organiques

tels l’éther, le chloroforme ou le benzène.

Small [Small, 1968] a proposé une classification des lipides selon leur comportement en

présence d’eau (voir Figure 1) basée sur leurs propriétés physicochimiques en phase aqueuse

et aux interfaces air / eau ou huile / eau :

- Les lipides non polaires, totalement insolubles dans l’eau et qui ne forment pas de films

monomoléculaires. On trouve dans cette catégorie les hydrocarbures ramifiés ou insaturés ainsi

que les composés terpéniques (comme par exemple le carotène, le limonène, le géraniol ou

encore le squalène).

- Les lipides polaires partiellement ou totalement solubles qui se subdivisent en trois classes :

Classe I : les triacylglycérols, diacylglycérols et le cholestérol qui ne présentent pas le

phénomène de gonflement en présence d’eau. Ils forment des films monomoléculaires stables.

Ces lipides peuvent former une émulsion en milieu aqueux. Le processus d’émulsification

augmente considérablement la surface de contact lipide-eau. In vivo, cette émulsification est

stabilisée grâce par exemple à la présence de phospholipides alimentaires.

Classe II : les phospholipides, monoacylglycérols et acides gras ionisés qui gonflent dans un

système aqueux. Les phospholipides peuvent dans certaines conditions former les liposomes. Il

s’agit de bicouches lipidiques closes, sphériques et concentriques, séparées les unes des

autres par des couches d’eau (Figure 1). Ces structures sont également appelées vésicules et

sont visibles au microscope électronique [Bangham, 1964].


23

Classe III : les sels biliaires et lysophospholipides (phospholipides avec une seule chaîne acyl)

qui se présentent dans l’eau sous forme de micelles ou de monomères. Lorsque la

concentration en lipides polaires de classe III excède la concentration micellaire critique (CMC),

ces lipides s’organisent de manière à minimiser le contact entre leurs parties apolaires et le

milieu aqueux : ils forment alors des micelles (Figure 1). Les parties polaires s’orientent à la

périphérie, du côté de la phase aqueuse, et les parties hydrophobes s’agrègent vers l’intérieur.

Les micelles sont en équilibre dynamique, c’est-à-dire qu’il existe des échanges rapides des

molécules amphiphiles d’une micelle à l’autre ainsi qu’avec les monomères présents dans le

milieu aqueux.

Lipides

non

polaires

Lipides

polaires

Totalement insolubles dans l'eau

Ne forment pas de films monomoléculaires

Hydrocarbures paraffiniques et aromatiques,

carotène, cholestane, etc...

Classe I Classe II Classe III

Forment des films

monomoléculaires stables:

• Triglycérides

• Diglycérides

• Cholestérol

Ne présentent pas le

phénomène de gonflement

Forment des films

monomoléculaires stables:

• Phospholipides

• Monoglycérides

• Acides gras ionisés

Présentent le phénomène de

gonflement

Forment des films

monomoléculaires

instables:

• Sels biliaires

• Lysophospholipides

Présent sous forme de

micelles et de monomères

Figure 1. Représentation schématique du comportement des lipides en présence d’eau et à

l’interface air/eau. Classification selon Small [Small, 1968 #6].

II. Principe de l’extraction des lipides

Les lipides sont solubles à chaud ou à froid dans les solvants organiques tels que l’éther

de pétrole, l’éther-diéthylique, l’hexane, l’acétone, l’éthanol, le chloroforme, le méthanol, etc. En

pratique l’hexane et l’éther de pétrole à chaud sont les plus couramment utilisés. On utilise pour

cela un solvant à reflux dans extracteur de type SOXHLET. Les vapeurs chaudes du solvant

traversent la mouture dans une cartouche, se condensent plus haut dans un réfrigérant et

retombent dans la cartouche contenant la mouture. Il y a alors macération et extraction des huiles

de la mouture.

Lorsque le solvant remplit la cartouche, il y a siphonnage et le solvant retombe dans le ballon

d'ébullition. Le cycle continu jusqu'à l' extraction complète de la matière grasse. Le solvant

contenu dans le ballon est alors saturé des huiles extraites. Il suffit alors d'évaporer le solvant à


24

l’aide d’un appareil ROVAPOR pour recueillir les huiles et récupéré le solvant qui pourrait être

réutilisé plusieurs fois.

Matériels

- Extracteur Soxhlet (chauffe ballon et cartouche)

-Balance de précision

-Broyeur de type waring blendor

- Dessiccateur

- Hexane (500 ml)

- Sésame ou Arachide

III. Protocole d’extraction des lipides

La capacité de l’hexane à solubiliser est donc utilisée pour les extraire au solvant

organique. La détermination des matières grasses est faite dans cette manipe selon la méthode

d'extraction par le SOXHLET en utilisant l'hexane ou l’éther de pétrole comme solvant. Broyer

dans un waring blendor les graines de sésame jusqu'à l'obtention d'une mouture très fine et très

homogène (∅= 0.3-0.5 mm). Peser avec précision 50 g de la mouture en notant le poids exact

dans la cartouche qui suffira pour l'extraction. Placer alors la cartouche dans le Soxhlet en l'ayant

recouvert avec du coton ou avec un linge propre et sec. Peser le ballon qui servira à recouvrir le

solvant et y introduire 500 ml hexane. Réaliser alors le montage de l'apparei1 en suivant le

schéma décrit. Alimenter le réfrigérant avec le cryostat thermostaté à 0-4°C. Avant de

commencer la manipulation, faites vérifier le montage par l'assistant. Brancher alors la prise du

chauffe -ballon et régler la température à 60°C ( éviter les surchauffes). Effectuer 4-6

siphonages. Débrancher le chauffe-ballon. Arrêter le cryostat. Démonter l’appareil (en présence

de l'assistant). Chasser alors par distillation la majeure partie du solvant à l'aide de l'évaporateur

rotatif (ROTAVAPOR) pour éviter l'ébullition de l'huile qui à la longue pourrait modifier les

indices d'acidité. Le ballon contenant les lipides est placé à l'étuve pendant 30 min à 103°C, puis

au dessiccateur pendant 30 min. Une série de pesées sont réalisées, toujours après avoir séché le

ballon à l'étuve puis au dessiccateur jusqu'à l'obtention d'un poids constant. Le poids des lipides

est obtenu par la différence entre le poids final et le poids initial du ballon.

(P1-P0)

Teneur en matières grasses(%)= X100

Prise d'essai

P0: poids du ballon à vide

P1: poids du ballon contenant les lipides

IV. Détermination des indices des huiles

IV. 1. Indice de saponification

L’indice de saponification d’un corps gras est le poids de KOH exprimé en milligramme

pour neutraliser les acides gras provenant de l’hydrolyse de 1g de ce corps gras. A un poids

déterminé de ce corps graons on ajoute un volume connu et en excès de solution de titrée de

potasse. Il y a saponification et les acides gras libérés se combinent avec la potasse pour donner

un savon. En dosant la quantité de potasse non co,binée, on déduit celle qui a été absorbée par la

matière grasse.


25

Matériel : burette, elenmeyers

Réactifs : KOH 1N, Huile extraite lors de ce TP, huile d’arachide, phénolphtaléine à 1 % dans

l’éthanol, HCl 1 N.

Protocole

A :témoin y a ajouté 10 ml de KOH 1N

B : 1.5 g d’huile extraite + 10 ml KOH

C : 1.5 g d’huile extraite + 10 ml KOH

Mélanger les suspensions et les chauffer jusqu’à l’ébullition. A la fin de la saponification, ajouter

quelques gouttes de pp et doser avec HCl 1 N l’excès de potasse.

Indice de saponification (Is) = 56, 1 * t* (V0-Ve)

Prise d'essai (g)

Vo, volume versé pour le témoin, Ve, volume versé pour l’échantillon

IV. 2. Indice d’iode

Le principe est basé sur la fixation d’iode (I2) sur les doubles liaisons éthyléniques (>C=C<)

d’un corps gras insaturé. L’indice d’iode est défini comme le poids d’iode exprimé en gramme

qui est fixé par 100 g du corps gras considéré.

R – C = C – R’ + I2 R – C -C – R’

Réactifs Réactifs de WIJS : 5 g I2 dans 100 ml éthanol, + 5 g de HgCl2dans 100 ml éthanol ; on mélange

les deux solutions et les laisser reposer pdt 12 hrs

Chloroforme, éther ethylique ou CCl4, solution de Ki à 25 %, solution de thiosulfate de sodium (

N2S2O3) à 0.1 N, empois d’amidon à 1 %.

Protocole L’indice d’iode est déterminée comme suit : on ajoute un volume connu d’iode à un poids

déterminé de matière grasse et on dose l’exès d’iode par un dosage en retour à l’aide d’une

solution saturée de thiosulfats de sodium. On en déduit par différence la quantité d’iode fixée sur

les lipides.

A. erlen témoin : 2.5 ml de chloroforme (ou ether ou ClCl4) + 40 ml de réactif de Wijs agiter

B. 0.5 ml d’huile extraite durant le TP, 2.5 ml chloroforme, + 40 ml réactifs de Wijs, agite

C. 0.5 ml d’huile d’arachide, 2.5 ml chloroforme, + 40 ml réactifs de Wijs, agiter

Boucher les erlens et les mettre à l’obscurité pendant 1h30 min en agitant momentanément.

H H I I


26

Ajouter 6 ml de solution d’iodure de potassium dans les erlens et agiter. Titrer par le thiosulfate

0.1 N l’iode présent dans les erlens jusqu’à jaune claire. Ajouter quelques gouttes d’empois

d’amidon comme agent coloré et titrer jusqu’au virage à l’incolore.

IV. 2. Indice d’acide

L’indice d’acide est le nombre de milligrammes de KOH nécessaire pour neutraliser

l’acidité d’1 gramme de corps gras ; c’est la neutralisation des acides gras libres sans hydrolyser

les liaisons esters des glycérides.

Protocole :

Peser dans un erlen 5 g d’huile extraite lors du TP, dans l’autre 5 g d’huile d’arachide. Ajouter

dans chaque erlen 10 ml d’éthanol et quelques gouttes de φφ. Bien agiter et titrer la solution par

le KOH 0.1 N.

Question :

1. Calculer la teneur en huile de la matière végétale que vous avez utilisé.

2. Donner l’équation de détermination de l’indice d’iode

3. Comparer les indices de saponification, d’acidité et d’iode des corps gras.


27

TP. 7. Etude cinétique de l’hydrolyse des triglycérides par la lipase de

Pseudomonas Cepacia

Introduction Les lipases ou triacylglycérol hydrolases [EC 3-1-1-3] font partie de la classe des

hydrolases d’esters carboxyliques. Elles hydrolysent les fonctions ester des triacylglycérols à

longues chaînes hydrocarbonées, insolubles dans l’eau pour libérer des acides gras (Figure 2).

Les lipases sont également des catalyseurs très utilisés dans de nombreux procédés

biotechnologiques basés sur les réactions de synthèse d’esters, d’alcoolyse, d’acidolyse et de

trans- et inter-estérifications.

Les lipases ont des origines variées : on les trouve dans le monde animal (organes

digestifs, tissu adipeux, système vasculaire et lymphatique, lysosomes) aussi bien que dans le

monde végétal (graines oléagineuses) et microbien (bactéries et champignons).

Figure 1. La lipase peut hydrolyser les liaisons carboxyl-ester d’un triacylglycérol. On

représente l’alcool secondaire vers la gauche et le glycérol est dit sn-glycérol (i.e. numérotation

stéréospécifique du glycérol). On numérote ensuite les carbones de haut en bas. Cette

représentation est appliquée pour déterminer les formes stéréoisomères des

(phospho)glycérides.

Spécificité des lipases

La spécificité d’action des lipases par rapport aux triacylglycérols fait appel à trois

notions différentes [Jensen, 1990 #1970]:

• La typosélectivité ou spécificité par rapport à un type d’acide gras donné.

• La régiosélectivité ou spécificité de position qui représente le pouvoir d’hydrolyser

préférentiellement les esters primaires (en position externe sn-1 ou sn-3) ou secondaires (en

position interne sn-2) des triacylglycérols (voir Figure 2).

• L’énantiosélectivité c’est-à-dire la capacité d’hydrolyser préférentiellement un

énantiomère par rapport à l’autre dans le cas d’une molécule chirale (par exemple des

triacylglycérols comportant trois acides gras différents). Dans le cas de molécules prochirales

(triacylglycerols comportant trois acides gras identiques), la stéréosélectivité représente la


28

capacité de discriminer un groupement stéréohétérotopique mais homomorphique par rapport à

l’autre (positions sn-1 versus sn-3).

Ainsi la lipase pancréatique et la lipase de Rhizopus arrhizus sont régiosélectives pour

les fonctions esters primaires des triacylglycérols, alors que la lipase de Candida rugosa n’est

pas régiosélective [Verger, 1976]. La lipase de Geotrichum candidum est typosélective

puisqu’elle hydrolyse des liaisons ester avec un acide gras contenant une insaturation cis-∆9 et

cela, quelle que soit leur position sur le glycérol [Charton, 1992 #5364]. L’hydrolyse de

groupements esters en position sn-2 est catalysée par très peu d’enzymes et seule la lipase de

Candida antarctica a montré une préférence nette pour cette position [Rogalska, 1993].

Principe de du dosage de l’activité lipolytique L’activité lipolytique est mesurée quantitativement selon la méthode décrite par [Kordel,

1991]. Cette activité est dosée avec différents esters de p-nitrophényle, hydrolysés en présence

d’une lipase en p-nitrophénol et l’acide correspondant. La libération du p-nitrophénol se traduit

par l’apparition d’une coloration jaune détectée à 410 nm. Des mesures en cinétique ont été

menées à 40°C dans un spectrophotomètre aux cuves thermostatées (Shimadzu UV-1205). La

solution réactionnelle contient un volume d’une solution A et 9 volumes d’une solution B ; la

solution A correspondant au substrat à 1 mM dans l’iso-propanol et la solution B étant une

solution de Tris-HCl 100 mM, pH 8, contenant 0,25% (w/v) de polyvinyle alcool (PVA). Ce

dernier composé permet la mise en émulsion du substrat et le maintien de la stabilité de cette

émulsion. La vitesse de réaction est calculée à partir de la pente de l'absorbance en fonction du

temps en utilisant un coefficient d'extinction molaire de 12 750 M-1 cm-1 pour le p-nitrophénol.

Cette valeur est déterminée à partir de l'absorbance de solutions standard de p-nitrophénol

réalisées dans la solution réactionnelle. Une unité enzymatique est la quantité d'enzyme

capable de libérer une µmole de p-nitrophénol par minute dans les conditions décrites ci-

dessus. Pour chaque échantillon, l'activité donnée correspond à la moyenne de trois mesures

d'activité.

Mode opératoire: Préparer les solutions suivantes: Solution A. Tampon Tris-HCl pH 8, 50 mM contenant 0.44% (w/v) de Triton X-100, 0.073% de gomme arabique (w/v) Solution B. Dissoudre Paranitrophenyl palmitate (PNPC16) 5 mM dans de l’isopropanol; Solution A+B. Il faut journalière préparer la solution C du substrat en mélangeant 9 mL de la A avec 1 mL de la solution B. Toutes les olutions sont conservées au frais (4°C).

N+

O

O-

O-

p-nitrophénolate

N+

O

O-

O

ester de p-nitrophényle

O

R

lipase

Tris-HCl pH 8

R O

O-

410 nm

2H


29

Solution E. C’est la sulution enzymatique: Dissoudre la lipase Amano de Pseudomonas Cepacia dans 50 mM de tampon Tris-HCL pH 8, pour obtenir une concentration finale de 10 µg/mL. Adjuster la concentration de l’enzyme pour avoir une activité raisonnable. Essai enzymatique : Dans une cuve de spectro mettre 1 mL du substrat (solution A+B). Démarrer la réaction en y ajoutant 0.1 mL de l’enzyme et suivre l’hydrolyse enzymatique en monitorant la libération du paranitro-phénolate à 410 nm à 15 s d’intervalle jusqu’à 5 min. Le blank est obtenu en remplaçant la solution enzymatique par de l’eau distillée ou le tampon Tris-HCl. Tracer la courbe A410 = f(temps). Déterminer les vitesses initiales en calculant les pentes des courbes.

Etude de la vitesse de la réaction en fonction de la concentration enzyme.


Réactif /tube T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 T=8

Solution A+B 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL

Tampon

Tris_HCL pH8

90 µL 80 µL 70 µL 60 µL 50 µL 40 µL 20 µL 0 µL

Extrait

enzymatique

10 µL 20 µL 30 µL 40 µL 50 µL 60 µL 80 µL 100 µL

Prendre les

DO410 nm

toutes les 15 s

=0

t=10

t=20

t=30

t=---

t= 5

min

idem idem idem idem idem

N.B. La solution enzymatique est additionnée juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A410) = f(t) pour chaque concentration en enzyme, déterminer les

vitesses initiales pour chaque concentration en enzyme. Préparer un blanc pour chaque

concentration en substrat tout en remplaçant l’extrait enzymatique par le tampon

Tris_HCL.

Tracer la courbe Vi = f([enzyme)]. Déduire si l’activité est proportionnelle à la

concentration en enzyme. Cette préparation enzymatique est-elle pure ou non ?

Etude de la variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat.


Réactif /tube T=1 T=2 T=3 T=4 T=5 T=6 T=7 T=8

Solution A 990 µL 980 µL 970 µL 960 µL 950 µL 940 µL 920 µL 900 µL

Solution B 10 µL 20 µL 30 µL 40 µL 50 µL 60 µL 80 µL 100 µL

Extrait

enzymatique

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

100 µL

Prendre les

DO410 nm

toutes les 15 s

=0

t=10

t=20

t=30

t=---

t= 5

min

idem idem idem idem idem


30

N.B. La solution enzymatique est additionnée juste avant la lecture de la DO Tracer la courbe f(A410) = f(t) pour chaque concentration en substrat, déterminer les

vitesses initiales pour chaque concentration en substrat.

Tracer la courbe Vi = f([PNP16)]. Déduire si cette cinétique est Michaélienne ou non

Tracer la courbe 1/Vi = f(1/S) et calculer les paramètres cinétiques Km et Vm.

Prépare un blan pour chaque concentration en substrat tout en remplaçant l’extrait

enzymatique par le tampon Tris_HCL. Déterminer la constante catalytique (Kcat) de

l’enzyme sachant que son PM est de 32 kDa tout en tenant compte de la concentration

protéique de la solution enzymatique.


31

TP. 8. Etude cinétique de la libération des acides gras par la lipase

pancréatique à partir d’huile d’arachide

Introduction

L'extrait pancréatique contient plusieurs enzymes digestives, parmi lesquelles on note la présence de la lipase. La lipase est synthétisée au niveau du pancréas et déversée avec le suc pancréatique dans le duodénum où elle participe à l'hydrolyse des glycérides alimentaires.

La lipase catalyse l'hydrolyse des esters du glycérol et d'acides gras à chaîne longue. La lipase

est une exoenzyme attaquant les liaisons esters situées en position externe des triglycérides sans

toucher la position interne (ce sont les 2- mono glycérides qui sont absorbés par la paroi

intestinale et transformés en chylomicrons lymphatiques). Le substrat de la lipase n'est pas une

seule molécule, mais plutôt un agrégat de molécules de lipides. Tandis que pour les enzymes

agissant sur des substrats en solution aqueuse, la vitesse enzymatique dépend de la concentration

du substrat, la vitesse de la lipase est liée directement à la concentration de molécules de substrat

dans l'interface. La lipase pancréatique est une glycoprotéine à poids moléculaire de 45000 -

50000, contenant deux isoenzymes presque identiques. Dans la présente manipe, vous étudierez

l'action de la lipase de porc ou de bœuf sur une émulsion huileuse. Les acides gras libérés sont

ensuite dosés par titrimétrie avec une base.

* Matériel

Etuve à 40°C, Bain marie bouillant, pH mètre, Eprouvette graduée de 50 ml, pipette de 10 ml par binôme, 1 erlen de 250 ml, 2 tubes à essai, 1 petit bécher, 1biurette, 1 pipette de 10 ml, Agitateur magnétique, l erlen de 100 ml Entonnoir, Papier filtre

* Réactif

Poudre à l'acétone de pancréas de porc ou de bœuf : prendre 50g de pancréas d'un porc ou d'un bœuf fraîchement tué découper en petits morceaux. Homogénéiser les morceaux dans un mixer ou dans un broyeur en utilisant de l'acétone froid (-20°C) dont le volume représente le double du poids du pancréas ; ex: pour 5g de pancréas 10 ml d'acétone ). Filtrer la suspension à l'aide d'un papier filtre et laver le dépôt retenu sur le filtre, avec successivement les solvants frais suivants:

-100 ml d'acétone -50 ml d'acétone + 50 ml d'éther éthylique -100 ml d'éther éthylique. Sécher le dépôt du lavage avec du papier filtre, puis laisser sécher à l'air libre. Cette poudre à l'acétone peut être stockée à basse température pendant longtemps (des mois) sans perte d'activité lipasique. CaCL25 mM CaCL2 0,07 M (1,1 g /1 00 ml ) NaCL 3 M ( 34,8 g/200 ml) Na-taurocholate 0,027 M ( 2,9 g/ 200 ml) Na-déoxycholate Huile d'arachide, Na OH 10 mM HCL 10 mM Phénolphtaléine à 1% dans l'alcool. * Manipulation

Peser en collaboration avec un autre binôme, 1,5 g de poudre à l'acétone de pancréas dans un petit bécher. Y ajouter 40 ml de CaCL2 5 mM. Agiter pendant 15 min à 4°C, à l'aide d'un agitateur magnétique et filtrer ensuite la solution. Doser les protéines de cette solution avec la méthode de Bradford/Sedmak comme décrit au TP 6. Le filtrat alors obtenu est susceptible de contenir la lipase pancréatiqne, l'amylase pancréatique le trypsinogène et la trypsine. Pour l'obtention d'une émulsion huileuse, peser dans un erlen 2,5 g de Na-desoxycholate, y ajouter 50 ml d'eau permutée. Après la dissolution du desoxycholate, ajouter: 5 ml d 'huile d'arachide, 10 ml NaCl 3 M, 5 ml CaCL2 0,075 M , 10 ml Na-taurocholate 0,027 M


32

Bien agiter et vérifier que le pH soit entre 7,5 et 8,0. Si ce n'est pas le cas, ajouter de l'HCL

10mM pour l'amener dans ce trajet. Placer l'erlen dans une étuve préalablement amenée à 38° C.

Laisser votre solution enzymatique incuber pendant 5 min à 38° C avant de commencer la

réaction. Pendant ce temps, numérotez 7 tubes à essai.

A t = 0 ajouter 10 ml de la solution enzymatique dans l'erlen contenant l'émulsion huileuse. Bien

agiter, et prélever à t = 5 min 10 ml de l'émulsion dans le tube à essai n° 1. Porter le tube au bain- marie immédiatement pendant 5 minutes. Refroidissez-le ensuite sous le robinet, transvaser le

contenu dans petit bécher, ajouter 1- 2 gouttes de phénolphtaléine et titrer jusqu' au virage rouge

avec la soude 10 mM. A t = 10 minutes prendre le deuxième échantillon, à t = 25 mn le troisième et, ainsi de suite de dix à dix jusqu'à 60 minutes. Le témoin est à t=0 est la solution huileuse + 10 ml CaCL2 5 mM.

* Questions

1. Calculer la quantité d'acides gras libérés dans chaque tube en millimoles. Construire la courbe

représentative de la quantité d'acide libéré en fonction du temps.

2. En déduire la vitesse de production d'acide, exprimé en millimoles par minute par ml de

solution enzymatique

3. Calculer l’activité spécifique ( µmol d’acide gras libérés/min/mg de protéine) de l’enzyme en

tenant compte de la concentration protéique de l’extrait acétonique.


33

TP. 9. Fractionnement d’un homogénat de pancréas et caractérisation des

fractions obtenues

Introduction et principe

Une cellule contient plusieurs structures complexes, comme le noyau, les mitochondries,

les appareils de Golgi, les peroxysomes, lysosomes, ribosomes, etc. etc... Tous ces organites sont

constitués de lipides, de protéines et des polysaccharides; les acides nucléiques ne sont

rencontrés que dans quelques organites seulement (noyau, ribosomes, mitochondries) . Il existe

plusieurs méthodes de fractionnement du matériel cellulaire. En suivant des procédés différents,

on peut isoler soit des noyaux, soit des mitochondries, soit un autre organite. Un tel

fractionnement permet par exemple la localisation d'une certaine activité enzymatique ou la

détermination de la composition de l'organite isolé.

En appliquant des méthodes et techniques différentes, on peut purifier des enzymes, des lipides, des saccharides ou des fragments d'acide nucléiques, dans le but d'étudier leurs propriétés in

vitro. De telles investigations ont beaucoup contribué à la compréhension du fonctionnement des

cellules et des organismes vivants. Dans ce TP on utilisera la technique de fractionnement assez

générale pour séparer les constituants cellulaires, à savoir la méthode de Schneider. Le tissu est homogénéisé par la destruction des cellules qui libèrent leur contenu. L’homogénat est ensuite

traité par l'acide trichloroacétique, qui permet de séparer deux fractions, une soluble et l'autre

insoluble. La fraction TCA soluble contient des petites molécules contenues dans le cytoplasme,

comme les mono- et oligosaccharides, les acides aminés, les peptides etc . La fraction TCA-

insoluble contient essentiellement les protéines, les acides nucléiques, et les lipides. Les lipides

sont ensuite éliminés par une extraction à l'alcool. On sépare les acides nucléiques des protéines

par un traitement à chaud avec le TCA, qui les solubilise en les dénaturant. Le culot resté

insoluble, est considéré comme renfermant les « protéines totales » de l'homogénat .

Matériel

Balance, Broyeur , Une paire de ciseaux, Chronomètre, Centrifugeuse, Glacière, Bain marie

bouillant, Spectrophotomètre, étuve à 70- 80°C, Agitateur vortex par binôme, 3 petits béchers, 1

erlen de 50 ou 100 ml, Entonnoir, Pièce de tissu propre, Baguette de verre, Pipettes pasteur de 5

ml, Eprouvettes graduées de 50 ml et 25 ml, tubes de centrifugation , 13 tubes à essai .

Réactifs

Pancréas de porc ou de boeuf , Glace , Acide trichloroacétique ( TCA) 5 % , Acide

trichloroacétique (TCA) 10 %, Ethanol 96 % ou alcool 96 % / éther éthylique I : I ( v/v) Na OH

IN, Réactif de Sedmak, Réactif à la dyphénylamine (A préparer juste avant utilisation, ne se

conserve pas ) : Diphénylamilne 250 mg + Acide acétique 25 mg + H2SO4 concentré 0,7 ml

(ajouté après la dissolution complète des cristaux)

Sérum albumine bovin, 25 µg/ml pour utilisation comme protéine standard.


34

Schémas du fractionnement

Culot N°2

Surnageant S3 contenant

des acides nucléiques

Culot N°3 contenant les

protéines

Protéines en solution à doser par le

réactif au Bleu de Coomassie G250

10 g de pancréas + 90 ml H2O

Homogénat de volume X

10 ml + 10 ml TCA 10% à froid

(repeter)

Surnageant S1 contenant des petits

peptides et des sucres

Culot N°1

Culot 1+ 16 ml alcool

96° (repeter)

Surnageant S2 contenant des lipides

Culot 2 + 10 ml TCA

5%, incuber 15 min à

90°C

Dissolution

dans du

NaOH 1 N


35

Manipulation

Fractionnement du pancréas.

Mettre préalablement à refroidir dans le réfrigérateur ou dans de la glace, 500 ml d'eau distillée

ou permutée, le TAC 5%, le TAC, 10%, erlens de 50 ou 100 ml et un entonnoir.

1. Homogénéisation

L 'homogénéisation du pancréas du porc ou du bœuf sera réalisée avec un broyeur de cuisine. Peser en collaboration avec un autre binôme dans un petit bêcher, 10 g de pancréas congelé et découper le tissu en petits morceaux dans le récipient du broyeur en y ajoutant 90 ml d'eau distillée froide. Broyer le pancréas sans le surchauffer le mélange. Compléter ainsi 4 broyages d'une minute. Filtrer 1’homogénat à laide d'une pièce de tissu propre en utilisant un entonnoir et un erlen frais. Mesurer le volume obtenu après filtration. Garder l'homogénat au froid.

2 .Précipitation au TCA froid

Après agitation à l'aide d'une baguette de verre, prélever 10 ml d'homogénat avec une

pipette à écoulement rapide et les mettre dans un tube de centrifugation refroidi dans de la glace.

Ajouter, sous agitation 10 ml de TCA 10%; Laisser 10 min dans la glace en agitant de temps en

temps. Equilibrer votre tube contre celui d'un autre binôme en y ajoutant quelques gouttes de

TCA 5%. Centrifuger les mélanges pendant 10 min à 8000 rpm. Décanter très doucement les

surnageants dans un tube à essai portant votre nom et ce qu'il contient et le conserver dans de la

glace. Si le culot n'est pas bien formé, il faut enlever le surnageant par la pipette pasteur, en ayant

soin de ne pas perturber le culot. A l'aide d'une baguette de verre, remettre le culot en suspension

dans 8 ml de TCA 10% froid et effectuer une deuxième centrifugation pendant 8 min à 8000 rpm

Ajouter les nouveaux surnageants aux précédents. Cette fraction TCA soluble à froid contient les

composantes cellulaires hydrosolubles tels que les amino-acides, petits peptides, oses simples et

oligosacchalides. Vous pourrez le vérifier par des tests caractéristiques.

3. Extraction des lipides

Ajouter dans un tube contenant le culot 16 ml d'alcool 96% ou d'un mélange d'alcool 96%/éther éthylique 1/1 (v/v). Remettre le culot en suspension et maintenir 10 minutes à température ambiante en agitant fréquemment. Centrifuger 5 min à 8000 tours / minute

Décanter le surnageant qui a une coloration jaune dans un petit bécher préalablement taré.

Remettre le culot en suspension dans 16 ml d’alcool ou alcool éther éthylique, puis centrifuger

pendant 5 min à 8000 rpm. Réunir les surnageants. Après évaporation de l'alcool (ou alcool/éther

éthylique) par chauffage dans l'étuve à 70° C, vous vérifiez la présence d'un résidu lipidique au

fond du bécher. En admettant que tous les composés lipidiques sont extraits par cette technique, donner la quantité de lipides par gramme de pancréas.

4. Solubilisation des acides nucléigues par TCA à chaud

Reprendre le culot (protéines + acide nucléiques) par 6 ml de TCA 5% et le remettre en suspension à l'aide d'un agitateur. Verser le liquide dans un tube à essai et rincer le tube de centrifugation 2 fois avec 1 ml de TCA 5%. Portez cette suspension dans un bain-marie thermostaté à 90°C pendant 15 min en agitant fréquemment. Refroidir sous courant d'eau froide, transvasez dans le tube de centrifugation, et, ayant rincé le tube à essai avec 1 ml de TCA 5%, centrifuger pendant 8 min à 8000 rpm. N'oubliez pas d'équilibrer les tubes de centrifugation !


36

Décanter soigneusement le surnageant dans une éprouvette de 20 ml et conservez-le. Remettre le culot en suspension dans 10 ml de TAC 5% et centrifuger à nouveau. Ajouter le surnageant à celui dans l'éprouvette et noter le volume obtenu. Cette solution contient les acides nucléiques.

5. Solubilisation et dosage des protéines

Les culots, essentiellement protéiques, sont remis en suspension dans 2 ml NaOH 1 N. Ajouter 18 ml d’eau. Agiter assez longtemps pour obtenir une bonne solubilisation, puis verser dans un tube à essai et le placer dans de la glace. Cette solution est dite contenir les « protéines totales ». Centrifuger la solution pour recueillir le surnageant et doser les protéines par la méthode de Bradford comme précédemment fait au TP 6 en utilisant le sérum albumine bovin comme standard. Mélanger en duplicate 1 ml de la solution protéique avec 1 ml du réactifs de Sekmak (Bleu de Coomassie G250) et lire les DO à 450 et 650 nm.

6. Mise en évidence des acides nucléiques

Verser 10 ml de la solution contenant les acides nucléiques dans un petit bécher et y ajouter l5 ml d'alcool froid. Ensuite enrouler les fils de l' ADN sur une baguette de verre, les transvaser dans un tube à essai contenant l ml d'eau, et y ajouter 4 ml de réactif à la diphénylamine. Placer le tube au bain-marie bouillant pendant 10 min et observer la coloration.

Question 1. Calculer la quantité de lipides par gramme de pancréas. 2. Déterminer la concentration initiale de la solution inconnue de protéine en l'exprimant en mg/ml. Donner le poids des protéines (%) dans le pancréas. 3. Admettons que vous avez fait un dosage de l'ADN isolé du pancréas et vous avez trouvé une concentration de 0,05 mg/ml, Calculer la quantité d'ADN par gramme de pancréas.


37

TP 10. Electrophorèse des protéines

I. Introduction

L'électrophorèse est une technique biochimique de séparation fondée sur le fait que des molécules portant

des charges électriques migrent à des vitesses différentes lorsqu'elles sont placées dans un champ électrique. L’idée

d’utiliser cette caractéristique pour séparer des molécules remonte à la fin du dix-neuvième siècle grâce aux travaux

du biochimiste suédois Arne Tiselius (1902-1971), prix Nobel de chimie en 1948. Il a réussit le premier à séparer

par cette technique les protéines contenues dans des liquides biologiques complexes comme le sérum sanguin et le

lait. Aujourd’hui, l’électrophorèse est devenue une technique de routine dans les laboratoires où on l’utilise pour

séparer notamment les protéines et les acides nucléiques. L’électrophorèse des protéines peut être réalisée sur des

supports variés, notamment sur gel de polyacrylamide ou sur gel d’agarose selon les informations recherchées.

Principe de l’électrophorèse

Selon le principe de l’électrostatique lorsqu’un ion de quantité de charge q est placé dans un champs électrique E ,

une force F s’exerce sur cet ion avec une intensité donnée par l’équation :

Félectrique = qE

L’ion peut être assimilé à une sphère de rayon r en mouvement dans un fluide de viscosité η. De ce fait une force de

friction Ffriction s’oppose à la force électrique F. Par définition

Ffriction= 6πηrv

Où v = vitesse de migration de l’ion, r = rayon de l’ion, η= viscosité du milieu.

A l’équilibre l’ion migre avec une vitesse constante de sorte que Félectrique = Ffriction

d’où

La mobilité électrophorétique µ est donnée par l’équation :

Cette équation nous montre que la mobilité électrophorétique est principalement fonction de la charge et de la taille

de l’ion. Cela est valable pour toutes les techniques d’électrophorèse.

Les principales variantes de l’électrophorèse des protéines sont les suivantes :

SDS-PAGE L'une des variantes les plus répandue de l'éléctrophorèse est la SDS-PAGE, utilisée pour séparer les protéines en

fonction de leur poids moléculaire. Les protéines sont dénaturées par du S-dodecyl sulfate, molécule très fortement

chargée négativement. Les charges négatives du SDS noient complétement les charges propres de la protéines qui

n'interviennent alors plus. La charge de l'ensemble molécule dénaturée/SDS (et donc sa vitesse de migration) dépend

alors uniquement de la longueur de la chaîne protéique. S'il n'y avait pas le gel, toutes les protéines ainsi traitées

migreraient à la même vitesse. Mais la présence du gel ralentit les grosses protéines, elles se répartiront le long du

trajet de migration en fonction de leur poids moléculaire. C'est cette technique qui est mise en œuvre dans les

automates d'analyse médicale.

Séparation par le pH ou Electrophorèse d’Isoélectrofocalisation (IEF) Cette variante consiste à imposer un pH précis au gel de migration. Les molécules dont le pKa est égal au pH,

neutres, ne migreront pas, les molécules avec un pKa inférieur, chargé négativement migreront vers l'anode, les

autres vers la cathode. Une telle technique présente l'inconvénient d'obliger de déposer l'échantillon au milieu du

gel, ce qui pose divers problème. Toutefois, un perfectionnement consiste à utiliser un gel dont le pH varie d'une

extrémité à l'autre. La molécule migrera alors le long du gel jusqu'à ce que le pH local soit égal à son pKa. Elle

deviendra alors neutre et arrêtera de migrer. Les protéines se répartiront alors le long du gel en fonction de leur pKa.

Il est ici possible d'utiliser un gel vertical comme décrit dans le principe. L’une des applications de cette technique

est son utilisation pour la technique de ZYMOGRAPHY qui consiste à la détection in-gel des enzymes. La

technique de zymography repose sur la réaction spécifique in-gel de l’enzyme avec son substrat. L’emplacement de

l’enzyme sur le gel est détecté grâce à la révélation des spots colorés du produit.

r

qEv

πη6=

r

q

E

vµ

πη6==


38

Electrophorèse bidimensionnelle Le gel est un milieu solide qui peut être manipulé. Il est alors possible d'appliquer dessus successivement plusieurs

techniques d'électrophorèse pour obtenir des électrophorèses bidimensionnelles. L'échantillon est déposé dans un

seul puit et une première variante est appliquée. Puis la migration achevée on bascule le gel d'un quart de tour et on

effectue une migration perpendiculaire à la première en utilisant une deuxième technique. Les molécules, séparées

selon deux critères, se répartissent donc dans un système a deux coordonnées ce qui permet une meilleure résolution

: si beaucoup de molécules ont un poids moléculaire ou un pKa proche, les molécules ayant les deux paramètres en

commun sont rares. Avec cette variante, il est possible de travailler sur des extraits cellulaires complets.

II. Electrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence du sodium dodécyl sulfate (SDS-PAGE)

Ce type d'électrophorèse peut être réalisé en utilisant des systèmes tampons dissociant ou non dissociant, continus

ou non continus. L'agent dissociant le plus utilisé est le détergent anionique; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS). Le

SDS de formule CH3-(CH2)11-S03-Na+, est le détergent le plus utilisé en électrophorèse. Il a trois fonctions: 1°)

dissocier les protéines agrégées peu solubles ou hydrophobes 2°), conférer une charge négative à toutes protéines et

enfin 3°) permettre une séparation des protéines en fonction de leur géométrie, masse molaire et forme. Il se fixe sur

les protéines selon un rapport de masse relativement constant (1 ,4 g de SDS par g de polypeptide) et les transforme

en polyanions. La dissociation dénaturation intervient sous l'action combinée des réducteurs des liaisons S-S tels que

le ß-mercaptoéthanol ou le dithiothreitol. La protéine prend ainsi une forme allongée ("random coil"), dont la

longueur est proportionnelle à la masse moléculaire. La charge négative permet la migration des protéines vers

l'anode, mais les molécules sont séparées uniquement par effet de tamis moléculaire. Les marqueurs protéiques de

faible poids moléculaires suivants sont souvent utilisés pour estimer la masse moléculaire des enzymes: a-

actalbumine (14,4 kDa), inhibiteur de la trypsine (20, 1 kDa), anhydrase carbonique (30 kDa), ovalbumine (43 kDa),

sérum albumine bovin (67 kDa) et la phosphorylase b (94 kDa). La droite de calibration a été construite selon le

modèle de Fergusson (Log(Mr) = a + b.Rf). La séparation se fait sur deux gels :

- Un gel de concentration (stacking gel) et un gel de séparation (resolving gel).

L'utilisation en électrophorèse de gels de concentration et de séparation de concentrations en

polyacrylamide non convenable peut aboutir à 2 situations différentes :

- Elimination des protéines incapables de pénétrer dans le gel, dans le cas des gels très concentrés.-

Absence de séparation des protéines de petite taille, migrant avec le front.Entre ces 2 extrêmes, les

protéines peuvent être résolues différemment selon la concentration en polyacrylamide du gel de

séparation: En faisant varier la concentration d'acrylamide et methylène (bis acrylamide), on obtient des

mailles très différentes par polymérisation.

Figure 1. Description de l’effet de SDS et agents réducteurs tels que le ß-mercapto-éthanol sur les

protéines


39

Exemple de préparation des gels en fonction du poids moléculaire des proétines à séparer

(Polyacrylamide) (%) Poids moléculaire (Kd)

15-20 10-40

10-15 40-100

5-10 100-300

5 -300-500

2-5 PM>500

acrylamide CH2=CH-CO-NH2 + méthylène bis acrylamide (CH2=CH-CONH)2CH

Mécanisme de la

formation du réseau

(Network) par

polymérisation de

l’acrylamide en

présence du

biscrylamide qui crée

les ponts.


40

Figure 2. Description du dispositif de la cuve d’électrophorèse

Figure 2. Description du mécanisme de la mobilité des protéines. Les petites molécules migrent plus

rapidement que les grosses molécules


41

Figure 3. Exemple d’un gel d’une électrophorèse verticale

III. Préparation d’un gel SDS-PAGE

III.1. Matériel :

- Separating gel : gel de séparation

- Stacking gel : gel de concentration

- Butanol saturé en H2O

- Running buffer 1X : tampon de migration

- Laemmli loading buffer : tampon d’application

- ß-Mercaptoethanol

- Bleu de Coomassie R250

- Solution décolorante

II.2 Solutions à préparer:

Separating gel buffer (pour 100ml, garder à température pièce) : 18.17 g Tris-base, 2 ml SDS 20 % ; ajuster le pH à 8.8 avec du HCl 12 N, compléter le volume à

100ml

Stacking gel buffer (pour 100ml, garder à température pièce) : 6.06 g Tris-base, 2 ml SDS 20%, ajuster le pH à 6.8 avec du HCl 12 N, compléter le volume à

100 ml

Acrylamide (30%) bisacrylamide (0.8%) (pour 250ml, garder à 4°C) : 75 g acrylamide, 2 g bisacrylamide, compléter le volume à 250 ml

filtrer et garder à 4°C dans une bouteille brune ou papier d’aluminium

Eletrodes buffer : tampon des électrodes 10X 25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0.1% (w/v) SDS, pH 8.3. Ne pas adjuster le pH.

Stock 10X -10 g SDS, 30 g Tris + 144 g Glycine, adjuster le volume à 1000 ml.

Pour usage diluer 10 fois cette solution, c.a.d : 900 ml H2O + 100 ml stock

Stock sample buffer : Tampon de l’échantillon


42

60 mM Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 0.025 % bromophenol blue

H20………………………………………..…4.8 ml

0.5 M Tris-HCl, pH 6.8…………………….1.2 ml

10% SDS…………………………………….2 ml

Glycerol……………………………………..1 ml

0.5% Bromophenol blue (w/v)…………..0.5 ml

La solution SDS-reducing buffer est préparée journalièrement en mélangeant 50 µl de ß-

mercaptoethanol (SH-CH2-CH2OH) à 950 µl du stock samplebuffer. Eventuellement conserver

cette solution à –30°C.

*L’acrylamide et le bisacrylamide sont de puissants agents neurotoxiques, il

faut les peser avec un masque.

II.3. Montage d’un gel SDS-PAGE

Separating gel

10% 12.5¨% 15%

H2O 62 ml 50 ml 36 ml

Acrylamide 30¨%/bis 0.8% 48 ml 60 ml 74 ml

Separating gel buffer 38 ml 38 ml 38 ml

APS 10 % 2.24 ml 2.24 ml 2.24 ml

TEMED 100 µl 100 µl 100 µl

Volume total* 150.34 ml 150.34 ml 150.34 ml

*Effectuer les mélanges selon le volume désiré en tenant compte du volume total.

Pour sealer le bas : 1ml + 14µl APS 10% + 6µl TEMED

Stacking gel

H2O 1 ml 20 ml

Acrylamide 30%/bis 0.8% : 3ml

Stacking gel buffer 4.44 mll

APS 10% 280 µl

TEMED 50 µl

Running buffer 10X (pour 1L) : à diluer 10 fois dans l’eau distillée avant utilisation.

10 g SDS

30 g Tris

144 g Glycine

ne pas ajuster le pH et filtrer.

Préparation de l’échantillon

Prendre 100 µl de la solution de l’échantillon convenablement dilué et l’ajouter à 100 µl de

solution tampon de l’échantillon « sample buffer » contenant du ß-mercaptoéthanol, dans un tube

Eppendorf. Si la solution l’échantillon est très concentrée, dissoudre l’échantillon à l’aide du

« sample buffer ». Chauffer le tube au bain marie pendant 5 min. Centrifuger le tube et utiliser le

surnageant pour l’électrophorèse. Certains échantillons, notamment les extraits bruts contiennent

beaucoup de sels ou d’autres petites molécules qui interfèrent avec la migration. Pour cela, il est


43

nécessaire d’effectuer une dialyse (Figure 3) afin de « desalter » l’échantillon avant

l’électrophorèse.

Figure 3. Principe de la dialyse

Montage d’un gel SDS-PAGE

Méthode: 1. Monter les vitres du gel à l’aide du montage.

2. Préparer la solution de « separating gel ».

3. Sealer le bas du gel.

4. Couler le separating gel selon la concentration du gel désiré et garder le

restant de la solution dans le contenant pour voir quand la polymérisation

sera complète.

5. Rajouter un peu de butanol (saturé en H2O) pour égaliser le gel.

6. Laisser polymériser environ 45 min.

7. Enlever complètement le butanol.

8. Placer le peigne et couler le stacking gel.

9. Laisser polymériser au moins 10 min.

10. Enlever le peigne et monter les gels sur la cuve d’électrophorèse pour la migration.

11.Ajouter du running buffer 1X entre le gel et le montage jusqu’à ce qu’il soit

rempli et en mettre dans le montage environ 2 cm.

NB. Si on utilise un seul gel, il faut mettre une vitre de l’autre côté et le

remplir également de running buffer.

12.Laver les puits avec le running buffer à l’aide d’une seringue.

13.Pour loader les échantillons, rajouter du Laemmli loading buffer (contenant 10% SDS et du 2-

ß-mercaptoéthanol) dans les échantillons pour avoir une concentration finale de loading buffer

de 1X.

14.Chauffer les échantillons à 100 °C pendant 5 min puis centrifuger les échantillons 30 sec à

pleine vitesse.

15.Remettre les échantillons dans le bloc chauffant pour loader les échantillons.

Nota bene: Il faut loader la même quantité d’échantillon dans chaque puits.

Avant

équilibre

A l’équilibre


44

16.Faire migrer le gel à 200V, 150 mA et 100W pendant environ 45 min ou jusqu’à ce que le

bleu se rende au bas du gel.

17.Arrêter la migration et défaire le montage

18.Coloration du gel au Bleu de Coomassie: Mettre le gel dans un contenant avec du bleu de

Coomassie et laisser agiter pendant au moins 1h, le temps que le bleu pénètre dans le gel.

19.Décoloration du gel: Remettre la solution colorante dans le contenant initial, puis ajouter du

vieux

destaining et agiter un peu pour enlever l’excès de colorant.

Le jeter dans l’évier puis remettre du destaining et laisser agiter jusqu’à ce que

les bandes apparaissent.

20. scanner les gels

IV. Différentes techniques de coloration et décolorations :

IV. 1. Coloration au Bleu de Coomassie :

Après la migration électrophorétique, les gels sont trempés successivement dans les

solutions suivantes

a) Fixation des protéines: acide trichloroacétique à 20 % (20 min, 20°C). Etape non

nécessaire pour I'SDS-PAGE.

b) Lavage 1: mélange méthanol-acide acétique-eau 30/10/60 ( 2 min, 20°C) ou à défaut éthanol-

acide acétique-eau 30/10/60

c) Coloration: Bleu de Coomassie Brillant R250 0,1 % (p/v) dans un mélange méthanol- acide

acétique-eau 40/10/50 (10 min, 50°C). Du CUSO4 à 0,1 % (p/v) est additionné pour l'IEF.

d) Lavage 2: solution b. Trois fois pour I'SDS-PAGE et Native-PAGE, une fois pour l'IEF . e)

Préservation: glycérol 5% (5 min, 50°C)

Coloration au nitrate d'argent (AgNO3)

Après la migration électrophorétique, les gels sont trempés successivement dans les solutions

suivantes:

a) Fixation des protéines: acide trichloroacétique à 20 % (20 min, 20°C). Pas nécessaire pour

I'SDS-PAGE.

b) Lavage 1. Mélange d'éthanol-acide acétique-eau millipore 50/10/40 (2 min, 50°C)

c) Lavage 2. Mélange d'éthanol-acide acétique-eau millipore 10/10/80 (2-4 min, 50°C). 2

trempages successifs. Etape non nécessaire pour I'SDS-PAGE

d) Sensibilisateur: glutardiadéhyde 8,3 % dans l'eau millipore (6 min, 50°C)

e) Lavage 3.2 trempages successifs de la solution b (3-5 min, 50°C). Etape non nécessaire pour

I'SDS-PAGE

f) Lavage 4: eau millipore (2 min, 50°C). 2 trempages successifs.

g) Coloration au nitrate d'argent: AgNO3 0,5% (p/v) pour l'IEF et Native-PAGE, 0,25% (p/v)

pour I'SDS-PAGE (10-13 min, 40°C).

h) Lavage 5: eau millipore (0,5 min, 30°C). 2 trempages successifs.

i) Développement: formaldéhyde 0,015 % (v/v) dans du carbonate de sodium à 2,5 % (p/v),

pendant 0,5 à 4 min, à 30°C.

ii) j) Lavage 6: acide acétique 5 % (2 min, 50°C)

k) Préservation: mélange acide acétique-glycérol-eau 10/5/85 ou 10/10/80 (3 min, 50°C). Etape

non nécessaire pour l'IEF. Après révélation, les gels sont photographiés ou scannés, puis


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conservés à 4°C au réfrigérateur dans des boites de pétris, contenant un mélange de glycérol-

acide acétique-eau millipore 5/10/85.

Références :

Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685

Garfing, D.E. ( 1990) One dimensional gel electrophoresis. Methods Enzymol. 182, 425-441.

Schaggerard, Hermann, and Gebhard von Jagow (1987) Tricine sodium dodecyl sulfate

polyacrylamide gel electrophoresis for the séparation of proteins in range from 1 to 100 kDa.

Anal Biochem. 166, 368-379.

DICKO, M. H., HILHORST

, R., GRUPPEN, H., TRAORE, A. S., LAANE, C., van BERKEL, W. J.

H. and VORAGEN, A. G. J. (2002) Comparison of content in Phenolic compounds, polyphenol

oxidases and Peroxidases in grains of fifty sorghum varieties from Burkina Faso. Journal of

Agricultural and Food Chemistry (USA). 50, 3780-3788.

DICKO,

M. H., HILHORST,

R., GRUPPEN, H., LAANE, C., van BERKEL, W. J. H. and

VORAGEN, A. G. J. (2002) Zymography of momophenolase and o-diphenolase activities of

Polyphenol oxidase. Analytical Biochemistry (USA). 360, 336-339. DICKO, M. H., GRUPPEN, H.; TRAORE, A. S.; van BERKEL, W. J. H. and VORAGEN, A. G. J. (2006). Effects of

germination on amylases and phenolics related enzymes in fifty sorghum varieties grouped according to food-end

use properties. J. Sci. Food Agric. (Sci, England). Vol. 86, 1-11. In press

Travaux Pratiques de Biochimie Structurale et d'Enzymologie

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