Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 : Anticorps monoclonaux Université Paris-Sud 11 Ophélie JOLY...
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Travaux dirigés Immunologie BIOL 360 :
Anticorps monoclonaux
Université Paris-Sud 11
Ophélie JOLY
Marie GUILBAUD
Guillaume LEGRAND
Clément GAND
Année 2013/2014L3S6 parcours Biologie Santé
PLAN
Introduction
Etape d’immunisation
Coopérations cellulaires mises en place après immunisation
Etape de fusion ou obtention des hybridomes
Etape de sélection
Etapes de criblage et de clonage des hybridomes
Comparaison anticorps monoclonaux et polyclonaux
Techniques développées à partir des anticorps
Anticorps = Protéine utilisée par le système immunitaire en réaction à l’introduction d’un pathogène dans l’organisme. Sont sécrétés par des cellules dérivées des lymphocytes B :
les plasmocytes.
Intr
oduc
tion Les anticorps
Ag
Paratope
Epitope
Epitope (déterminant antigénique) = Molécule pouvant être reconnue par un paratope, partie variable d'un anticorps
Paratope = Partie de l'anticorps qui assure la fonction de reconnaissance de l'antigène.
Anticorps avant immunisation Animal non immunisé
IgM IgG IgA
L’i
mm
unis
atio
n
produits lors de contacts avec d’autres Ag que la protéine purifiée
Tit
re A
c
Jours Semaines Mois
Question 1
Anticorps après immunisation
Animal immunisé par injection d’une protéine purifiée Après 1ère injection (réaction primaire) L
’im
mun
isat
ion
Sélection LB Prolifération LB Deviennent effecteurs ou LB mémoires
IgG
IgM
Présence d’IgM puis d’IgG
Production d’Ac anti-protéine
Question 1
Anticorps après immunisation Animal immunisé par injection d’une protéine purifiée
Après 2nde injection (réaction secondaire)
LB mémoire activé plus rapidement
Réponse + importante,
+ rapide,
+ spécifique
Après nème injection
L’i
mm
unis
atio
n
IgG
IgG
IgM
IgM
Production d’Ac anti-protéine: + grande quantité, de meilleure qualité
Question 1
Haptène et anticorps monoclonaux
Haptène = Antigène non immunogène, trop petite pour générer une réponse immunitaire seule
Exemple d’haptène :
DiNitroPhénol = DNP
Induction d’une réponse immunitaire par conjugaison
avec une molécule transporteuse (BSA, OVA, ..) :
Doit être soluble
Doit être un corps étranger à l’animal
Doit avoir un temps de ½ vie suffisamment long
L’i
mm
unis
atio
nQuestion 2
Réponse anticorps anti-DNP
Production d’anticorps anti-DNP
Question 5
Coo
péra
tions
ce
llula
ires
Association haptène-protéine porteuse rend immunogène le DNP
Anticorps monoclonaux
Immunisation de l’animal avec l’Ag contre lequel on veut un Ac monoclonal
Pour la production d’Ac spécifique de l’Ag utilisé
Réponse immunitaire adaptative
Production Ac en plus grande quantité
Production Ac de meilleure qualité et plus affin
L’i
mm
unis
atio
nQuestion 3
Système immunitaire et administration de l’antigène
Lieu d’administration de l’Ag important Quand administration dans la voie systémique (SC, ID, IM ..)
L’i
mm
unis
atio
n
Circulation vers les Organes Lymphoides Secondaires Contact rapide avec les cellules du Système Immunitaire
Question 4
Cellules B et réponse anticorps anti-DNP
Plasmocyte = LB différencié capable de produire des anticorps.
Myélome = Cancer hématologique (se développe à partir de cellules hématopoïétiques) de la moelle osseuse caractérisée par une prolifération des lymphocytes B.
O
bten
tion
des
hybr
idom
esQuestion 6
Fusion et cellules spléniques
Cellules spléniques = Cellules de la rate
O
bten
tion
des
hybr
idom
es
Cellules myélomateuses = Cellules cancéreuses
Questions 7/8
Capacité de production des Ac spécifiques de l’Ag utilisé pour immuniser le donneur
Croissance illimitée
Technique des hybridomes
Obtention d’hybridomes : Clones immortels synthétisant l’Ac monoclonal recherché
O
bten
tion
des
hybr
idom
es
Clonage de l’hybridome sélectionné
Immunisation contre l’Ag
Fusion cellules spléniques/myélomateuses
Sélection sur milieu spécifique
Sélection des hybridomes fabriquant l’Ac anti-Ag
Question 6
HGPRT : Hypoxanthine-Guanine PhosphoRibosylTransférase Enzyme permettant synthèse de nucléotides par voie de récupération
Cellules spléniques : HGPRT+ Cellules myélomateuses : HGPRT-
HAT : Hypoxantine Aminopterine Thymidine Aminoptérine : Inhibe synthèse de novo de nucléotides
Sélection des hybridomes
Sél
ectio
n
Milieu de sélection d’hybridomes : HAT
Question 11
Fusion et tissus lymphoïdes
Tissu lymphoïde pouvant être utilisé pour la fusion :
Les ganglions lymphatiques Les MALT (Tissus Lymphoides Associés aux Muqueuses)
O
bten
tion
des
hybr
idom
es
Dans organes lymphoïdes secondaires :
Présence de LB
Lieu de rencontre LB/Ag
Lieu d’activation des LB
Lieu de production Ac anti-Ag
Question 8
Hyperimmunisation
Hyperimmunisation = Injection de doses croissantes d’Ag
But : Obtention d’une concentration importante de plasmocytes et donc d’Ac spécifique de l’Ag d’intérêt
O
bten
tion
des
hybr
idom
es
Tau
x d’
Ac
(UI/
mL
)
Evolution de la quantité d’Ac selon le nombre d’injections
Question 10
Caractéristiques des myélomes
Cellules myélomateuses utilisées:
Immortelles
Incapables de secréter Ac
HGPRT- : Incapables de synthétiser nucléotides par voie de récupération
Sél
ectio
nQuestion 12
Sélection des hybridomes/anticorps anti-DNP
But : Sélectionner les hybridomes produisant des Ac anti-DNP
C
ribl
age
et
cl
onag
e
Dosages de liaison Ac/Ag RIA/ELISA
Marquage fluorescent de l’Ac Immunofluorescence (Immunohistochimie/Immunocytochimie) Cytométrie de flux
Essai de cytotoxicité : Evaluation de la viabilité des Ag après mise en contact avec les lymphocytes.
Question 13
Clonage de l’hybridome
Clonage par dilution limite Principe
C
ribl
age
et
clo
nage
But : Sélection d’un clone produisant un seul type d’anticorps
Dilution du mélange d’hybridomes (1 cellule/puit)
1ère série de dilution : Sélection des cellules sécrétant l’Ac en quantité
2ème série : Vérification de la pureté de la lignée cellulaire
3ème série : 2ème Vérification du clonage
Obtention d’un sérum monoclonal
Question 14
Sérum polyclonal
Sérum = Liquide provenant du sang coagulé et centrifugé,
contient des Ac polyclonaux
Antisérum = Sérum prélevé chez un individu/animal immunisé.
Contient des Ac polyclonaux spécifiques de l’Ag administré
A
c m
onoc
lona
ux
Ac
Pol
yclo
naux
Question 15
Avantages des anticorps polyclonaux/monoclonaux
Anticorps monoclonal
Spécificité : Ac dirigé vers un seul épitope de l’Ag Affinité : Ac très affin Production en grande quantité Constance de ces Ac Production longue et couteuse
Anticorps polyclonal
Diversité : Reconnaissance d’un Ag sur différents épitopes Différents Ac peuvent fixer un même Ag Fixation moins « critique »
A
c m
onoc
lona
ux
Ac
Pol
yclo
naux
Anticorps monoclonaux, liaison à un épitope spécifique
Anticorps polyclonaux, liaison à des épitopes différents
Question 16
Techniques utilisant des anticorps
En diagnostic : Tec
hniq
ues
En thérapeutique :
Question 17
Immunoblot Immunofluorescence Agglutination et hémagglutination Réaction de fixation du complément Immunochromatographie Immunoprécipitation
Cytométrie de flux Radio-Immuno-Assays (RIA) Enzym Linked Immuno Sorbent Assay
(ELISA)
Immunothérapie
Diagnostic Immunoblot (Cas du VIH)
Tec
hniq
ues
Question 17
Dissociation par un détergent du pathogène
Séparation des protéines constitutives du pathogène par SDS PAGE
Transfert sur membrane de nitrocellulose et incubation avec un antiserum (contenant Ac polyclonaux anti-VIH)
Détection des Ac fixés aux Ag par un Ac secondaire couplé à une enzyme
Mise en évidence des anticorps dirigés contre le pathogène dans le sérum des patients infectés
Diagnostic Immunofluorescence
Tec
hniq
ues
Question 17
1er marquage : Fixation de l’Ac monoclonal primaire sur l’Ag
2ème marquage : Fixation de l’Ac polyclonal secondaire sur l’Ac primaire.L’Ac secondaire est couplé à un fluorochrome
Détection du complexe Ac/Ag au microscope électronique à fluorescence
Recherche d’un pathogène
Hemagglutination (Détermination du groupe sanguin)
Tec
hniq
ues
Question 17
Diagnostic
Prélèvement sanguin d’un patient
Mise en contact Ac/GR
Agglutination : Ac reconnait la structure antigénique portée par le GR.
Pas agglutination : Ac ne reconnait pas la structure antigenique portée par le GR.
Réaction de fixation du complément
Question 17
Diagnostic
Tec
hniq
ues
Ajout dans le sérum de l’Ag et du complément
Si présence de l’Ac anti-Ag dans le sérum, fixation Ac/Ag/Complément
Ajout de GR et d’Ac anti-GR
Si le complément est fixé avec le complexe Ac/Ag, ne peut se fixer au complexe GR/Ac anti-GR : Absence d’hémolyse
Si le complément n’est pas fixé au complexe Ac/Ag (car absence d’Ac), se fixe au complexe GR/Ac anti-GR : Hémolyse
Test négatif
Test positif
Immunochromatographie (Cas du test de grossesse)Tec
hniq
ues
Question 17
Diagnostic
En cas de grossesse, il y a production d’hCG retrouvé dans le sang et l’urineFixation de l’hormone sur l’Ac anti-hCGMigration du complexe Ac/Ag jusqu’à reconnaissance de l’Ag par un 2ème Ac spécifique : Arrêt de la migration dans la zone test
Utilisations possibles pour la détection : VIH, Paludisme, Peste, Cholera, ..
Immunoprécipitation
Tec
hniq
ues
Marquage métabolique
Marquage protéines
Marquage des cellules Lyse Ajout d’Ac fixées Lavage Séparation sur des billes SDS-PAGE
Question 17
Diagnostic
Marquage des cellules par un acide aminé radioactif
Lyse des cellules par un détergent : Obtention Ag + Débris cellulaires
Ajout d’Ac monoclonaux fixées sur des billes
Lavage : Elimination des Ag non fixées pas un Ac et des débris cellulaires
Séparation des Ag par SDS PAGE : Migration des Ag selon la taille
Technique du phage display
Diagnostic
Tec
hniq
ues
Question 17
Immunothérapie But : Cibler spécifiquement les cellules tumorales en adressant un Ac
monoclonal modifié.
Thérapeutique
Tec
hniq
ues
Question 17
à un enzyme capable d’activer des prodrogues (3)
Utilisation d’Ac monoclonaux modifiés couplés:
à une toxine bactérienne ou végétale (1)
à un isotope radioactif (2)
Ac = Vecteur d’acheminement des substances vers les cellules tumorales
Différentes actions possibles : - Bloque signal de survie - Bloque signal de prolifération - Induit l’apoptose
(3)
(1) (2)
Les perspectives de demain …
Aujourd’hui : 28 anticorps monoclonaux à la disposition des patients
(le 1er a été mis sur le marché en 1986)
250 anticorps monoclonaux en développement
Quel avenir pour l’immunothérapie ?
Anticorps monoclonaux : vers traitement pour toutes les pathologies ?
IgA : un anticorps plus efficace et plus localisé que IgG ?
Per
spec
tives
Merci de votre attention !!