NICOLAS CARON

TRANSDUCTION DE PROTÉINES DANS LE DÉVELOPPEMENT D’UN TRAITEMENT POUR LA

DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l'Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en biologie cellulaire et moléculaire pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

FACULTÉ DE MÉDECINE UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

MAI 2004 © Nicolas Caron, 2004

Résumé

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie causée par l’absence de

dystrophine, qui se manifeste par une dégénérescence progressive des muscles

squelettiques et cardiaque. Les garçons atteints ont une espérance de vie d’environ 20 ans.

Même si la prise de certains médicaments peut ralentir la progression de la maladie, il

n’existe à ce jour aucune thérapie curative. La transplantation autologue de myoblastes

génétiquement corrigés peut restaurer l’expression de la dystrophine, mais les myoblastes

des patients DMD ont une capacité proliférative très limitée. Leur prolifération nécessite

l'immortalisation avec un oncogène viral, un processus augmentant les risques associés à la

transplantation de myoblastes.

Les protéines fusionnées au domaine de transduction de Tat peuvent transduire les cellules

en culture et plusieurs tissus in vivo. La transduction de protéines pourrait s’avérer utile

dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Nos objectifs étaient de

tester la capacité des protéines de fusion Tat à transduire les fibres musculaires, de mieux

comprendre le mécanisme de transduction, d’optimiser le ciblage efficace des cellules en

culture et de développer des outils permettant l’immortalisation transitoire des myoblastes

avant leur transplantation.

In vivo, nos travaux indiquent que les fibres musculaires résistent à l’internalisation des

protéines de fusion Tat, qui se retrouvent en périphérie associées à la matrice

extracellulaire. In vitro, la distribution intracellulaire ponctuée, la cinétique

d’internalisation, la sensibilité aux basses températures et l’augmentation fonctionnelle

exercée par les agents lysosomotropiques révèlent un mécanisme d’endocytose classique.

Ces données suggèrent que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale,

évitent les lysosomes, et sont ensuite séquestrées en périphérie du noyau. Un trafic

intracellulaire inadéquat serait le principal facteur limitant l’efficacité de l’internalisation

fonctionnelle des cargos fusionnés au domaine de transduction de Tat. Cette meilleure

compréhension du mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat, nous permit de

développer une méthode efficace pour immortaliser de façon réversible les myoblastes d'un

ii

patient DMD. En utilisant un protéine de fusion Tat-Cre, nous avons déimmortalisé des

myoblastes DMD transformés par l'AgT flanqué de sites LoxP. Cette technique permet de

proliférer extensivement les myoblastes DMD, tout en rendant plus sécuritaire la

déimmortalisation.

iii

Abstract

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by the absence of dystrophin and leads to

progressive weakness in heart and skeletal muscles. Affected boys can only hope to live for

20 years since there is still no effective therapy for DMD. Autologous transplantation of

genetically modified myoblasts can restore dystrophin expression, but the rapid death, the

specific immune response and limited cellular migration severely limit the efficiency of the

treatment. Immortalization, although a risky procedure, is necessary to proliferate

myoblasts isolated from dystrophic patients, since by age five; their myogenic cells are

practically senescent.

Proteins and cargos fused to the Tat protein (HIV) can be internalized in cells and living

tissue. The mechanism of Tat internalization is still misunderstood and controversial. Our

objectives were to test the susceptibility of muscle fibers to be transduced by Tat fusion

proteins, to better understand the mechanism of entry of Tat fusions, to optimize

intracellular delivery and to develop techniques allowing the immortalization reversal of

myoblasts using Tat-fusion proteins.

The low susceptibility of muscle fibers to be transduced and the strong interaction between

Tat-fusion proteins and the extracellular matrix surrounding muscle fibers resulted in poor

protein delivery. Our work shows that the nuclear localization signal comprised in Tat is

not sufficient to confer nuclear delivery to eGFP. The punctuate intracellular distribution,

the internalization kinetics, the inhibitory effect of low temperatures and the functional

increase exerted by lysosomotropic agents are coherent with a classical endocytosis

internalisation mechanism. Our data suggests that Tat-fusion proteins proceed through the

endosomal pathway, avoid lysosomes and are then sequestered in the periphery of the

nucleus. Hence, improper intracellular trafficking is the main factor limiting the efficiency

of Tat-mediated protein internalization. With a better understanding of this internalization

mechanism, we were able to optimize the delivery of a Tat-Cre fusion protein to mediate

the complete and efficient removal of an oncogene necessary for the proliferation of

myoblasts isolated from DMD patients. Therefore this technique should help in the design

iv

of a successful treatment based on the autologous transplantation genetically-modified

cells.

Avant-Propos

Malgré les avertissements de rigueur servis par “les anciens” au tout début des études

graduées, il est difficile d’imaginer que le cheminement vers la réalisation d’une thèse de

doctorat puisse être aussi complexe. L’exercice de la méthode scientifique, dans une

perspective thérapeutique, génère un ratio échec/réussite tellement élevé qu’on en vient

parfois à croire Homer J. Simpson lorsqu’il dit “You tried your best and you failed

miserably ...the lesson is never try”. Ceux qui croient que seuls les frappeurs au baseball

peuvent considérer comme une réussite le fait de sa faire retirer trois fois sur quatre n’ont

jamais entrepris des études graduées en sciences biologiques. Heureusement, il y a toujours

une solution. Mais pourquoi faut-il qu’elle soit si simple?....

Je tiens à remercier mon directeur de thèse, Jacques Tremblay, qui m’a laissé m’amuser

dans son laboratoire à tester des combinaisons de réactifs et d’assemblages moléculaires à

faire dresser les cheveux des plus extravagants écrivains de science-fiction. Jamais je

n’accepterai que soit mis en doute devant moi son désir sincère de réussite pour ses

étudiants. Travailler avec le Dr. Tremblay m’a fait comprendre une chose très importante.

C’est que ce sont souvent les gens les plus occupés qui ont le plus de temps à donner.

Je voudrais évidemment remercier mes collègues passés et présents pour leur chaleur, leur

humour, leur sérieux, leur compréhension, leur aide, leurs faux pas, mais surtout leurs rires.

Ils sont beaucoup trop nombreux pour que je puisse tenter de les nommer de peur d’en

oublier. J’ai partagé des moments inoubliables avec eux et plusieurs resteront à jamais mes

amis.

Et finalement, je voudrais remercier mes parents pour leur soutien et leur amour

inconditionnel qui n’ont jamais hésité à se sacrifier pour ma réussite et mon bonheur.

Si une expérience fonctionne au premier essai, c'est qu'on a fait une erreur. Mais

heureusement, la souris est un petit animal merveilleux. Si on la tue en assez grande

quantité et avec suffisamment d'originalité, elle engendrera un PhD. (anonyme)

Table des matières Liste des abréviations..............................................................................................................1 Chapitre 1 - Introduction.........................................................................................................3

1 ère partie : LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE .................................3

1.1 Historique et description de la maladie.....................................................................3 1.2 Clonage du gène de la dystrophine ...........................................................................4 1.3 Rôle et fonction de la dystrophine ............................................................................5

2 ième partie : STRUCTURE ET PHYSIOLOGIE DU MUSCLE SQUELETTIQUE........9

2.1 Structure du muscle squelettique ..............................................................................9 2.2 La régénération musculaire.....................................................................................12 2.3 Les cellules satellites et les myoblastes ..................................................................13

3 ième partie : LES TRAITEMENTS EN DÉVELOPPEMENT CONTRE LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE .........................................................15

3.1 Diagnostic prénatal .................................................................................................15 3.2 Traitements pharmacologiques ...............................................................................16 3.3 Thérapie génique.....................................................................................................17

3.3.1 Lentivirus .........................................................................................................18 3.3.2 Adénovirus.......................................................................................................18 3.3.3 Virus adéno-associé (Parvovirus) ....................................................................19 3.3.4 Herpès Simplex type 1.....................................................................................20 3.3.5 Les approches non virales................................................................................21

3.4 Transplantation de cellules souches pluripotentes..................................................22 3.5 La transplantation de myoblastes............................................................................23

3.5.1 Historique des expérimentations chez l'animal et évolution du modèle expérimental..............................................................................................................25 3.5.2 Essais cliniques de transplantation de myoblastes chez l'humain ...................26 3.5.3 Limites de la transplantation de myoblastes ....................................................27

3.5.3.1 La faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injections................29 3.5.3.2 La mort rapide des myoblastes suite à l’injection.....................................30 3.5.3.3 Le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique.........30

3.5.4 Immortalisation des cellules myogéniques ......................................................31 3.5.4.2 L’antigène T..............................................................................................32 3.5.4.3 Les télomères et la télomérase ..................................................................36

4 ième partie: TAT ET LES DOMAINES DE TRANSDUCTION PROTÉIQUES...........38

4.1 La protéine Tat du VIH-1 .......................................................................................38 4.2 Le domaine de transduction de Tat, un historique..................................................40

viii

4.3 Les domaines de transduction protéiques ...............................................................46 4.4 Mécanismes d’entrée ..............................................................................................48

4.4.1 La membrane plasmique et le transport transmembranaire .............................48 4.4.2 Mécanismes d’entrée des domaines de transduction .......................................53

5ième partie : Hypothèse de travail et objectifs ..................................................................60

5.1 Résumé de la problématique...................................................................................60 5.2 Hypothèse de travail ...............................................................................................60 5.3 Objectifs..................................................................................................................61

Chapitre 2:.............................................................................................................................63 Transport intracellulaire d’une protéine de fusion Tat-eGFP dans les cellules musculaires63

Résumé..............................................................................................................................64 Abstract.............................................................................................................................66 Introduction.......................................................................................................................67 Material and Methods .......................................................................................................70 Results...............................................................................................................................73 Discussion.........................................................................................................................77 Acknowledgments ............................................................................................................81 Figure legends...................................................................................................................82 Figures ..............................................................................................................................84

Chapitre 3:.............................................................................................................................89 La déstabilisation des endosomes augmente l'accès fonctionnel des protéines de fusion Tat au noyau................................................................................................................................89

Résumé..............................................................................................................................90 Abstract.............................................................................................................................92 Introduction.......................................................................................................................93 Materials and methods ......................................................................................................95 Results...............................................................................................................................98 Discussion.......................................................................................................................103 Acknowledgements.........................................................................................................106 Figure legends.................................................................................................................107 Figures ............................................................................................................................111

Chapitre 4:...........................................................................................................................119 Immortalisation réversible de myoblastes humains par la transduction d'une protéine de fusion Tat-Cre recombinase................................................................................................119

Résumé............................................................................................................................120 Abstract...........................................................................................................................122

ix

Introduction.....................................................................................................................123 Results.............................................................................................................................126 Discussion.......................................................................................................................132 Materials and methods ....................................................................................................135 Acknowledgments ..........................................................................................................140 Figure legends.................................................................................................................141 Figures ............................................................................................................................144

Conclusion générale............................................................................................................149 Annexe:...............................................................................................................................173 Transduction de protéines dans les cellules musculaires: Optimisation et applications.....173

Résumé............................................................................................................................174 Abstract:..........................................................................................................................176 Introduction.....................................................................................................................177

Muscular dystrophies and their treatment...................................................................177 Muscle tissue structure................................................................................................178 Extracellular matrix and proteoglycans ......................................................................180 In vivo delivery...........................................................................................................181 Application to cell-mediated therapies .......................................................................185

Perspectives ....................................................................................................................188 References.......................................................................................................................189

Liste des tableaux Tableau 1 Cargos internalisés par la domaine de transduction de Tat.................................45 Tableau 2 Principaux domaines de transduction et séquences référencées dans la littérature.

......................................................................................................................................47

Liste des figures Chapitre 1 Figure 1 Le complexe de la dystrophine.................................................................................6 Figure 2 Structures de la dystrophine et de la minidystrophine. ............................................8 Figure 3 Structure du muscle squelettique............................................................................11 Figure 4 Transplantation de myoblastes. ..............................................................................24 Figure 5 Trois facteurs limitants le succès clinique de la transplantation de myoblastes. ...28 Figure 6 Activation de la prolifération cellulaire par l’oncogène viral de SV-40. ...............33 Figure 7 Implication des télomères dans la sénescence cellulaire........................................37 Figure 8 Génome et transcription du VIH-1. ........................................................................39 Figure 9 Tat du VIH-1, Séquence et structure. .....................................................................42 Figure 10 Stratégies de purification de protéines de fusion Tat. ..........................................44 Figure 11 Représentation schématique de la bicouche phospholipidique qui constitue la

structure fondamentale des membranes biologiques. ...................................................50 Figure 12 Représentation schématique simplifiée des compartiments intracellulaires

impliqués dans l’endocytose et la sécrétion de macromolécules..................................52 Figure 13 Modèle du "Leading edge" de l’importation de peptides contenant un signal de

translocation membranaire hydrophobe........................................................................55 Figure 14 Modèle de la translocation transmembranaire de peptides hydrophobes via la

formation de micelles inversées....................................................................................56 Figure 15 Modèle de la translocation membranaire de protéines de fusion Tat dénaturées.57 Figure 16 Modèle de l’endocytose des protéines de fusion Tat. ..........................................58 Chapitre 2 Figure 1 Schematic representation of Tat-fusion protein constructs and purification

strategy..........................................................................................................................84 Figure 2 Intracellular delivery of Tat-eGFP in NIH/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts.

......................................................................................................................................85 Figure 3 Rapid uptake of rhodamine-labeled Tat-eGFP in C2C12 myoblasts. ....................86 Figure 4 Intracellular delivery of Tat-eGFP in cultured primary cells. ................................87 Figure 5 Intracellular localization of Tat-eGFP in myofibers and retention to the

extracellular matrix. ......................................................................................................88 Chapitre 3 Figure 1 Effects of incubation at 4°C and early intracellular distribution of Tat-fusion

proteins........................................................................................................................111 Figure 2 Subcellular localization of Tat-fusion proteins. ...................................................112 Figure 3 Functional nuclear Cre assay................................................................................113 Figure 4 Effects of lysosomotropic agents known to promote endosomal release on the

functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC)..................................114 Figure 5 Effects of lysosomotropic agents on the Tat-Cre fusion protein (HTNC) uptake

and binding to NIH SSR. ............................................................................................115

xii

Figure 6 Effects of vacuolar H+-ATPase inhibitors, BFLA and CCM, on the functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC) in NIH SSR...............................116

Figure 7 Tat-Cre fusion protein (HTNC) stability following internalization. ....................117 Figure 8 Effects of the proteasome inhibitor MG 132 on the functional nuclear delivery of

HTNC..........................................................................................................................118 Chapitre 4 Figure 1 Immortalization of myoblasts using the SSR 69 retroviral vector. ......................144 Figure 2 Optimization of Cre internalization in human myoblasts. ...................................145 Figure 3 Myoblasts immortalized with Tag and hTERT retain myogenic characteristics in

culture. ........................................................................................................................146 Figure 4 Reversal of Tag immortalization using HTNC in human myoblasts. ..................147 Figure 5 Expansion of proliferation capacity of human primary myoblasts clones. .........148 Annexe Figure 1 Structural model of the skeletal muscle including its connective tissue. .............179 Figure 2 Tat-fusion protein localization after in vivo delivery...........................................183

Liste des abréviations AAV : Adeno-associated virus

ANTP : Antennapedia

bFGF : basic fibroblast growth factor

CAR : Coxsakie and Adenovirus Receptor

CDK : Cycline dependant kinase

DMD : Duchenne muscular dystrophy

DTP : Domaine de transduction protéique

eGFP : enhanced green fluorescent protein

GST : glutathione serine transferase

HBGF : Heparin binding growth factor

HGF/SF : Hepatocyte growth factor/scatter factor

HSV : Herpes simplex virus

hTERT : human telomerase reverse transcriptase

IGF : Insulin-like growth factor

LTR : Long terminal repeats

Mdx : Muscular dystrophy X-linked

Ni-NTA : Nickel-Nitrilitriacetic acid

PCR : Polymerase chain reaction

2

PGSH : Protéoglycanes de sulfate d’héparane

RE : Reticulum endoplasmique

SIDA : Syndrome d’immunodéficience acquise

SLN : signal de localisation nucléaire

TAR : Transactivation responsive elements

TBP : TATA box binding protein

TGF-β : Transformaing growth factor β

uPA : urokinase plasminogen activator

VIH : Virus de l’immunodéficience humaine

3

Chapitre 1 - Introduction

1 ère partie : LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE

1.1 Historique et description de la maladie La myopathie connue sous le nom de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) a été

décrite pour la première fois par Edward Meryon en 1852. Le physiologiste français G.

Duchenne de Boulogne a ensuite mieux caractérisé la maladie qui porte son nom, en la

décrivant comme une hypertrophie musculaire provoquée par des problèmes cérébraux,

vers 1860 (Engel et al. 1994). La DMD est un désordre récessif liée au chromosome X. Son

incidence est d'environ un cas sur 3500 chez les nouveaux nés mâles partout à travers le

monde. C'est l'une des dystrophies les plus sévères et elle se caractérise par une perte

progressive de la force musculaire perceptible dès l'âge de 2 ou 3 ans. Vers l'âge 4 ans un

patient atteint de la dystrophie musculaire de Duchenne souffre d'un déficit de force

notoire. La détérioration des muscles atteint une telle amplitude que vers l'âge de 10 ans, les

patients, rendus invalides par la perte de force dans les bras et les jambes, sont confinés à la

chaise roulante. C'est à cet âge qu'apparaissent également des difficultés respiratoires qui

peuvent résulter en des infections pulmonaires parfois mortelles. La DMD se caractérise

par des taux sériques de créatine phosphokinase humorale très élevés dès la naissance, ce

qui met en évidence le dommage généralisé du tissu musculaire. En effet, le tissu

musculaire des patients Duchenne est constamment en régénération. Avec le temps, on

observe une augmentation progressive des tissus conjonctif (fibrose) et graisseux qui

finissent par remplir tout le muscle. Les patients meurent généralement d'une insuffisance

respiratoire, cardiaque ou d'infections pulmonaires. Aujourd'hui, l'espérance de vie des

patients atteints de la DMD ne dépasse guère 20 ans. Les femmes peuvent également être

affectées par des symptômes similaires à la DMD (Penn et al. 1970). Les symptômes

cliniques chez certaines femmes porteuses de la DMD se rapprochent beaucoup de ceux des

patients atteints de la dystrophie musculaire de Becker; la plupart des femmes porteuses

sont cependant asymptomatiques.

4

1.2 Clonage du gène de la dystrophine Plusieurs années se sont écoulées entre la caractérisation clinique finale de la maladie et la

localisation du gène impliqué dans le développement de la pathologie. C'est vers la fin des

années 1970 que les premières observations permettant de localiser le gène de la

dystrophine furent effectuées (Lindenbaum et al. 1979). C'est l'analyse de l'ADN d'un

patient présentant plusieurs pathologies associées à la DMD qui allait paver la voie à la

découverte du gène responsable de la maladie (Kunkel et al. 1985). C'est en 1985 que la

dystrophine fut localisée sur le bras cour du chromosome X par le groupe de Kunkel

(Monaco et al. 1985). Le gène est formé d'environ 2,6 millions de paires de bases (pb),

contient 79 exons séparés par des introns inhabituellement longs, et transcrit en un ARN

messager de 14 Kb (Hoffman et al. 1987).

La mutation du gène codant pour la dystrophine cause aussi des pathologies musculaires

chez les animaux. En 1984, une souris dystrophique fut décrite (mdx pour Muscular

Dystrophy X-linked), elle démontrait une concentration plasmatique élevée de créatine

kinase ainsi que des lésions caractéristiques de la DMD (Bulfield et al. 1984). La souris

mdx possède une substitution d'une seule base à l'intérieur d'un exon du gène de la

dystrophine causant une terminaison prématurée de la chaîne polypeptidique (Cavanna et

al. 1988). La souris mdx est un excellent modèle expérimental de la DMD au point de vue

biochimique, mais demeure un modèle médiocre pour le physiologie musculaire et comme

modèle phénotypique du patient DMD (Huard 1993). En effet, même si toutes les études

immunohistochimiques démontrent que les muscles de la mdx sont dépourvus de

dystrophine, à l'exception des fibres révertantes, elles ne présentent pas d'anomalies

musculaires ultrastructurales graves, de cardiomyopathies ou la dégénérescence musculaire

progressive observée chez les patients DMD (Cavanna et al. 1988; Huard 1993).

5

La DMD n'est pas la seule maladie ayant pour cause une mutation dans le gène de la

dystrophine. En effet, la dystrophie musculaire de Becker se caractérise par des symptômes

moins sévères, une progression plus lente et une nécrose musculaire moins importante que

la DMD (Mostacciuolo et al. 1987). Le phénotype Duchenne est causé par les mutations

introduisant un changement dans le cadre de lecture ou un codon stop de sorte que la

protéine entière est désorganisée (Monaco et al. 1987). Les patients Becker ont une protéine

conservant une certaine fonctionnalité, leurs mutations étant plutôt des délétions ou des

duplications n'affectant pas le cadre de lecture, dans une région n'étant pas impliquée dans

l'interaction avec les autres membres du complexe oligomérique de la dystrophine.

1.3 Rôle et fonction de la dystrophine La dystrophine est une protéine d’une masse moléculaire de 427 kDa. Elle est située sur la

partie interne de la membrane de la cellule musculaire, à laquelle elle est ancrée par un

complexe de nombreuses autres protéines (Fig. 1) (Michele et Campbell 2003). La présence

de la dystrophine et de son complexe est importante pour la stabilité mécanique de la

membrane cellulaire pendant la contraction musculaire et la résistance des fibres

musculaires à l’étirement. Quatre domaines majeurs composent la dystrophine. D'abord, les

240 premiers acides aminés de la portion N-Terminale de la dystrophine constituent le

domaine de liaison à l'actine (Hammonds 1987). Le second domaine se compose de 24

répétitions en tandem qui donnent sa forme de bâtonnet à la dystrophine. Cette structure est

similaire à celle de la spectrine, une autre protéine du cytosquelette. Le troisième domaine

est riche en cystéines et se lie à la β-dystroglycane, la pièce centrale du complexe

multimérique de la dystrophine. En effet c’est la β-dystroglycane qui fait le pont

transmembranaire entre les protéines intracellulaires et extracellulaires. Le quatrième

domaine, positionné en C-terminal, sert de domaine de liaison à d'autres membres du

complexe (Michele et Campbell 2003).

6

Figure 1 Le complexe de la dystrophine.

La région C-terminale de la dystrophine se lie aux autres protéines du complexe alors que la région N-terminale se lie à l’actine. La portion centrale forme une tige hélicoïdale élastique. Le complexe associé à la dystrophine agit comme une charnière trans-sarcolemmale liant le cytosquelette à la matrice extracellulaire (adaptée de Michele et Campbell 2003)

7

On retrouve la dystrophine dans tous les types de tissus musculaires. L'absence de la

dystrophine, et par conséquent du complexe protéique associé à la dystrophine, provoque

une instabilité membranaire des fibres musculaires. Ainsi, chez les patients Duchenne, le

stress physique occasionné par la contraction ou l’étirement musculaire occasionne des

ruptures membranaires (Zubrzycka-Gaarn et al. 1988). Celles-ci entraînent une succession

de cycles de dégénérescence/régénération des myofibres qui épuisent rapidement le

réservoir de cellules satellites, résultant en une dégénérescence musculaire progressive

caractéristique de la maladie.

Le gène de la dystrophine code pour plus d'un produit. On peut retrouver plusieures des

isoformes (de 70 à 260 kDa) dans d’autres tissus que le muscle (Luna et Hitt 1992). Le

gène de la dystrophine code en effet pour au moins six produits additionnels: deux

isoformes non musculaires sont transcrites par des promoteurs localisés dans la région-5' du

gène et quatre isoformes plus petites sont transcrites sous le contrôle de promoteurs internes

plus loin en aval du site d'initiation utilisé pour les isoformes longues (Wang et al. 1998).

La fonction précise des isoformes non musculaires de la dystrophine est encore mal

caractérisée, mais l'absence d'une isoforme neurale chez les DMD pourrait potentiellement

expliquer le retard mental parfois observé (Wang et al. 1998).

La dystrophine peut conserver une bonne part de sa fonctionnalité même lorsqu’elle perd

une portion importante de sa séquence (Fig. 2). Des patients Becker ayant une délétion

représentant 48% de la séquence codante ont pu conserver une capacité ambulatoire jusqu’à

plus de 60 ans (England et al. 1990). Ces observations ont amené le groupe de Chamberlain

à étudier la possibilité de diminuer la taille de la séquence codante pour générer des

versions fonctionnelles tronquées de la dystrophine (Harper et al. 2002). Certaines des ces

versions, même si elles conservent moins de 50% de la séquence codante de la dystrophine,

démontrent une fonctionnalité quasi similaire à la dystrophine pleine longueur (Harper et

al. 2002).

8

Figure 2 Structures de la dystrophine et de la minidystrophine.

Les patients souffrant de la dystrophie musculaire de Becker expriment une version tronquée de la dystrophine où plusieurs répétitions semblables à celles retrouvées dans la spectrine sont absentes (adaptée de Harper et al. 2002).

9

2 ième partie : STRUCTURE ET PHYSIOLOGIE DU MUSCLE SQUELETTIQUE

2.1 Structure du muscle squelettique Le muscle squelettique est constitué de très longues cellules (jusqu'à 30 cm chez l'humain)

multinucléées et cylindriques d'un diamètre de 10 à 100 µm. Les fibres musculaires

résultent de la fusion de cellules myogéniques mononucléées. Les fibres musculaires,

comme la plupart des autres cellules, sont enchâssées dans une matrice extracellulaire riche

en protéines et en hydrates de carbone. Chaque muscle est constitué de paquets de fibres

contenus à l’intérieur d’un réseau de tissu conjonctif (Sanes 1994). Le tissu conjonctif

entourant les fibres musculaires transmet la force mécanique sur toute la longueur du

muscle, confère de l’élasticité au muscle, permet d’accumuler de l’eau et sert également de

réservoir de facteurs de croissance impliqués dans la régénération et la croissance

musculaire. L’epimysium, le feuillet externe entourant le muscle entier, s’étend à l’intérieur

du muscle pour former le perimysium, qui sépare les paquets de fibres appelés fascicules

(Fig. 3). Les fibres musculaires individuelles sont entourées par l’endomysium qui contient

la lame basale, la lame réticulaire et des cellules comme les fibroblastes ou les

macrophages. La lame basale est constituée de deux couches, la lamina densa (de 10-15 nm

d'épaisseur) et la lamina rara (de 2-5 nm d'épaisseur). Le glycocalyx est formé par les

domaines extramembranaires des protéines intégrales de la membrane qui lient le

cytosquelette interne de la fibre à la matrice extracellulaire. Les fibres musculaires

squelettiques sont entourées d’une matrice extracellulaire composée de glycoprotéines, de

collagènes, et de protéoglycanes comme le sulfate d’héparane, le sulfate de chondroïtine et

l’acide hyaluronique. On a identifié à ce jour le perlecane, l’agrine, le syndécane, le

glypicane et le collagène de type XVIII comme étant des protéoglycanes de sulfate

d’héparane (PGSH) faisant partie de la lame basale (Jenniskens et al. 2000). Même s’ils

sont virtuellement ubiquitaires, les PGSH sont principalement localisés dans la couche

extérieure de la lamina densa adjacente au tissu conjonctif, mais beaucoup moins associés à

la lamina rara située près de la membrane plasmique (Kogaya et al. 1990). La plupart du

10

temps, les cellules musculaires ne s'étendent pas d'une extrémité à l'autre du muscle. Elles

ont donc besoin d'ancrage. Il est à noter que la matrice extracellulaire est fonctionnellement

et structurellement différente dans les régions où le muscle rencontre le tendon ou le nerf. À

la jonction myotendineuse, la surface du muscle forme des invaginations complexes et la

lame basale y est plus épaisse.

La membrane basale agit comme échafaudage pour la régénération. Lorsque le muscle

squelettique est soumis à un stress ischémique, pharmacologique, thermique ou mécanique,

les fragments de la fibre abîmée sont phagocytés mais les différentes couches de la lame

basale survivent (Grounds 1991). Comme nous le verrons, les cellules satellites résidentes,

qui sont situées sous la lame basale, viendront participer à la régénération des fibres

endommagées. Même si les macrophages font leur chemin à travers les couches du tissu

conjonctif pour phagocyter les débris laissés par les fibres endommagées, ce n'est pas le cas

pour les cellules satellites. En effet, celles-ci pénètrent difficilement la lame basale à moins

qu'elle soit brisée ou digérée par des protéases (Bischoff 1975). Les nouveaux myotubes se

forment à l'intérieur des anciennes couches de tissu conjonctif même si par la suite il peut y

avoir une synthèse additionnelle de protéines extracellulaires. Donc, en contraignant la

croissance et la migration des cellules satellites activées, la lame basale oriente la

régénération des nouvelles fibres musculaires (Sanes 1994).

11

Figure 3 Structure du muscle squelettique.

Représentation schématique d’une micrographie de la coupe transversale d’un muscle de souris. Dans un muscle squelettique, chaque fibre musculaire est revêtue d’une fine gaine de tissu conjonctif, l’endomysium, les faisceaux des fibres musculaires sont délimités par une gaine plus épaisse appelée périmysium. L’ensemble du muscle est renforcé et recouvert par une gaine grossière de tissu conjonctif, l’épimysium.

12

2.2 La régénération musculaire Contrairement au muscle cardiaque ou au muscle lisse qui ont un faible potentiel

régénérateur, le muscle squelettique peut se régénérer de façon extensive et autonome. La

régénération du muscle squelettique strié s'effectue toujours de la même façon, le type de

traumatisme important peu (Allbrook 1981). En effet, la régénération musculaire est

toujours précédée d'une réaction dégénérative se manifestant en deux étapes: une phase

initiale non inflammatoire et une phase de dégénérescence inflammatoire. La phase initiale,

qui se limite aux minutes sinon à l'heure suivant le traumatisme, se caractérise par l'entrée

de calcium extracellulaire et par la désintégration des organites comme les mitochondries,

les ribosomes et les myofibrilles (Hansen-Smith et Carlson 1979). Cette désintégration des

organites est causée par une nécrose et une autodigestion par des protéases intrinsèques à la

fibre (Carpenter et Karpati 1989).

L'envahissement par des cellules du système immunitaire caractérise la deuxième phase de

la dégénérescence musculaire. On retrouve des neutrophiles au site de dégénérescence de

deux à trois heures suivant le traumatisme et des macrophages entre huit et dix heures post-

trauma. La fonction principale des macrophages est de phagocyter les débris cellulaires à

l'intérieur du tube endomysial ou relargués par les fibres endommagées et aussi de produire

des facteurs chimioattractants qui viendront attirer les myoblastes, dérivés des cellules

satellites, nécessaires à la régénération du tissus. C'est alors que les cellules satellites sont

activées (Bischoff 1994). Environ trois jours après le début de la dégénérescence, les

myoblastes, dérivés des cellules satellites, entrent dans une phase de prolifération intensive.

À ce moment, l'ancienne lame basale se désintègre et il y a formation d'une nouvelle lame

basale par les myotubes nouvellement formés (Vracko et Benditt 1972). On peut distinguer

les fibres musculaires qui sont dans un processus de régénération par la centronucléation de

leurs noyaux. En effet, la dernière étape de la régénération musculaire est le retour des

noyaux vers la périphérie de la fibre.

13

2.3 Les cellules satellites et les myoblastes Les noyaux situés dans le syncytium des fibres musculaires sont incapables de progresser

vers la mitose. Ce sont donc les cellules satellites qui l'entourent qui forment un réservoir

de cellules régénératrices pour les myofibres. Les cellules satellites du muscle squelettique

sont normalement retrouvées dans un état quiescent chez l'adulte. Quand des dommages

mineurs ou des blessures surviennent, des signaux sont générés à l'intérieur du muscle

activant les cellules satellites et stimulant leur migration et leur entrée dans le cycle

cellulaire (Tatsumi et al. 1998). Les cellules satellites ont été décrites pour la première fois

suite à des observations faites chez la grenouille (Mauro 1961). Elles possèdent des

caractéristiques distinctives reliées à leur état de quiescence. En effet ce sont des cellules

avec peu d'organelles cellulaires et un noyau hétérochromatique, ce qui est caractéristique

des cellules inactives. On retrouve les cellules satellites enchâssées sous la lame basale

entourant chaque fibre musculaire. On peut maintenant identifier les cellules satellites par

la présence de c-met, le récepteur du HGF/SF ou la présence de Pax7 (Seale et al. 2000). Le

récepteur du HGF doit se retrouver à la surface de toutes cellules satellites puisque c'est lui

qui permet leur activation permettant de quitter la quiescence (Tatsumi et al. 1998).

Les cellules satellites originent des cellules myogéniques embryonnaires. Les myocytes

prolifèrent durant le début du développement embryonnaire, et plus tard, ils se retirent du

cycle cellulaire pour devenir quiescents. On a longtemps cru que les cellules satellites

étaient emprisonnées sous la lame basale qui se forme durant le développement. Cela

impliquait que la lame basale soit liée aux cellules satellites à la surface de la myofibre. Il

en va tout autrement, puisque les cellules myogéniques se regroupent à la surface des

myotubes avant même la formation de la lame basale. Il a été démontré que les cellules

satellites ont une affinité adhésive pour les myotubes (Bischoff 1994) et qu'elles peuvent

migrer à travers la lame basale dans diverses conditions expérimentales (Bischoff 1986).

L'âge est un facteur important qui influence la quantité et la qualité des cellules satellites du

muscle. Celles-ci sont plus abondantes pendant les premières étapes du développement

musculaire, où elles contribuent à la croissance musculaire. Leur nombre dininue

graduellement dans la dernière partie de la vie (Bischoff 1994).

14

Puisque notre intérêt pour les myoblastes est motivé par la volonté de les utiliser dans le

contexte de la transplantation cellulaire, pour les définir nous utilisons des critères qui

peuvent différer de ceux utilisés dans le domaine fondamental du développement. Dans le

contexte de la transplantation de myoblastes, le terme myoblaste a été généralement utilisé

comme décrivant les cellules mononucléées, non terminalement différenciées qui ont le

potentiel d’initier un programme myogénique, de se soustraire au cycle cellulaire et de

différencier pour former du muscle squelettique (Beauchamp et al. 1999). Suite à la

découverte récente de l'existence de cellules souches pluripotentes dans une variété de

tissus adultes chez plusieurs espèces, nous modifions la définition de myoblaste pour y

ajouter le critère d'engagement vers la différenciation myogénique afin d'exclure les

cellules souches pluripotentes. Selon ces critères, les cellules satellites deviennent donc des

myoblastes lorsqu’elles entrent en prolifération pendant la régénération musculaire. À

cause du potentiel thérapeutique des cellules satellites humaines pour le traitement des

myopathies, la capacité proliférative in vitro de cellules humaines a été testée. Des clones

de cellules satellites humaines isolées de muscles adultes produisent une progéniture

capable de proliférer jusqu'à 25 à 30 passages, alors que des cellules isolées de foetus

peuvent proliférer de 60 à 70 fois in vitro (Ham et al. 1990). La capacité proliférative ainsi

que la longueur des télomères des cellules satellites diminuent de façon importante durant

les deux premières décennies de la vie d'un humain pour se stabiliser par la suite (Decary et

al. 1997). La capacité proliférative des cellules satellites n'est donc pas illimitée chez les

patients Duchenne dont les muscles subissent des cycles continuels de

dégénérescence/régénération.

15

3 ième partie : LES TRAITEMENTS EN DÉVELOPPEMENT CONTRE LA DYSTROPHIE MUSCULAIRE DE DUCHENNE

Plusieurs avenues sont actuellement explorées pour retarder la progression de la maladie,

augmenter la force musculaire ou suppléer au moins partiellement à l’absence de la

dystrophine. Il n’existe cependant encore aucune thérapie curative contre la DMD. Ce

chapitre a pour but de faire une revue des stratégies testées dans le passé ainsi que des

approches thérapeutiques actuellement en développement. Il est en effet nécessaire de

résumer le chemin parcouru, mais aussi d'être conscient des obstacles restants à franchir

pour mieux comprendre comment s’insère les expériences décrites plus loin ainsi que les

circonstances qui les justifient. Avant de discuter plus en détails de la transplantation de

cellules myogéniques nous allons récapituler les traitements principaux aujourd’hui en

développement.

3.1 Diagnostic prénatal Même s’il n’est pas à proprement parler un traitement contre la DMD, le diagnostic

prénatal doit être tout de même considéré comme une des méthodes permettant de diminuer

l’impact de la maladie sur la population en général et plus spécifiquement chez les familles

déjà affligées. L’état actuelle des technologies pour le diagnostic prénatal ne permet pas

encore de cribler la population dans son ensemble pour y détecter les porteurs de mutations

causant la DMD. Cependant l’avènement des technologies de microdétection moléculaire

pourrait bientôt changer cette donne. Pour l’instant, à cause des coûts, mais principalement

à cause des risques associés à l'amniocentèse, le diagnostic prénatal est encore réservé aux

familles où il y a déjà un patient ou un historique familial. Puisqu'environ 60% des patients

DMD ont une délétion, il est possible de diagnostiquer l’absence d’un ou plusieurs des 79

exons du gène de la dystrophine par PCR. La détection de mutations ponctuelles est

cependant beaucoup plus complexe, et nécessite le séquençage complet du gène. Malgré la

progression rapide des techniques de détection prénatale, la DMD ne pourra, à moins d’une

16

diminution drastique du taux de complications associées à l’amniocentèse, être éliminée

d'une population en utilisant l’avortement sélectif des embryons porteurs. En effet, 25% des

mutations ne sont pas héritées des parents mais apparaissent spontanément lors du

développement embryonnaire, ce qui génère constamment de nouvelles mutations.

3.2 Traitements pharmacologiques Tant que les efforts pour supplémenter de façon satisfaisante à l’absence de dystrophine

avec la thérapie génique ou le transfert cellulaire ne seront pas couronnés de succès, des

médicaments permettant de diminuer l’impact des symptômes de la DMD seront étudiés.

Les premiers essais pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant de la DMD

ont impliqué l'utilisation de médicaments visant à ralentir la progression de la maladie.

Bien qu’il n’existe aucune thérapie pharmacologique à ce jour contre la DMD, certains

médicaments comme la prednisone, la prednisolone et le deflasacort peuvent, pendant une

durée limitée, réduire la dégénérescence musculaire (Drachman et al. 1974; Mendell et al.

1989; Barton-Davis et al. 1999).

Certains antibiotiques comme les aminoglycosides ont pour cibles des composantes de la

machinerie traductionnelle et peuvent induire des modifications dans la reconnaissance des

codons. La gentamicine peut amener le complexe ribosomal à ne pas interpréter le codon

UAG comme un stop permettant ainsi d’outrepasser une mutation nonsense (Barton-Davis

et al. 1999). Certains patients souffrant de la DMD pourraient être susceptibles de répondre

à un tel traitement, mais les essais cliniques en cours n’ont pas encore démontré un effet

positif sur l’expression de la dystrophine (Wagner et al. 2001). D’autres stratégies, moins

conventionnelles, impliquant l’utilisation de protéines recombinantes ou d’anticorps sont

maintenant à l’étude. En effet, on a découvert qu’une délétion dans le gène de la myostatine

chez une race de bovins Belges résultait en une masse musculaire 20% plus importante

(Grobet et al. 1997; McPherron et Lee 1997). De plus les souris transgéniques sans le gène

de la myostatine sont jusqu’à 3 fois plus massive que les souris normales (Lee et

McPherron 2001). Puisque le produit du gène de la myostatine agit comme un régulateur

17

négatif de la croissance musculaire, on cherche maintenant à bloquer son activité. Certains

groupes sont actuellement en train de tester l’efficacité d’anticorps dirigés contre la

myostatine. L’injection hebdomadaire d’anticorps contre la myostatine a déjà permis

d’augmenter le poids d’environ 12% chez des souris mdx et d’augmenter leur force

musculaire (Bogdanovich et al. 2002).

Même si ce type de stratégies ne s’attaque pas à la source du problème, il pourrait quand

même permettre aux patients Duchenne de rester plus forts plus longtemps et pourrait

potentiellement augmenter leur espérance de vie. Il est cependant possible que

l’augmentation de la croissance musculaire obtenue en bloquant la myostatine ne soit que

transitoire et accélère éventuellement la faiblesse musculaire puisque dans ce contexte, les

myoblastes pourraient atteindre la sénescence plus rapidement.

3.3 Thérapie génique Il est raisonnable de croire que le transfert d’une quantité suffisante de copies

fonctionnelles du gène de la dystrophine dans les noyaux des fibres musculaires mènerait à

la synthèse de la dystrophine et subséquemment à sa localisation correcte pour restaurer à la

membrane le complexe glycoprotéique lui étant associé. Deux types d'approches ont été

utilisées pour transférer l'ADN aux cellules : les vecteurs viraux et les vecteurs non viraux

qui montrent différents avantages en ce qui concerne leur efficacité, leur facilité de

production et leur sécurité. Les virus sont très efficaces pour transfecter la cellule cible avec

leur propre ADN. En remplaçant les gènes qui ne sont pas nécessaires à la phase de

réplication du virus par des gènes d'intérêts d'origine étrangère, les recombinants viraux

peuvent infecter le type cellulaire ciblé. Le tropisme des virus peut aussi être modifié en

changeant les glycoprotéines de surface pour favoriser l’infection spécifique de cellules

cibles. Même si plusieurs virus ont été développés, quatre types se démarquent plus

spécialement: les lentivirus, les adénovirus, les virus adéno-associés, et l'herpès simplex de

type 1.

18

3.3.1 Lentivirus Les lentivirus forment une sous-classe de rétrovirus qui possèdent la capacité d'infecter les

cellules en prolifération et les cellules qui ne se divisent pas. Ils sont considérablement plus

complexes que les autres rétrovirus, leur génome codant pour six gènes additionnels

(Naldini et al. 1996). Les vecteurs pour produire des lentivirus sont maintenant constitués

d’un promoteur puissant en 5’ et d’un LTR 3’ muté qui s’auto-inactive lors de la première

ronde de réplication du virus; ceci génère des virions incapables de produire des ARNs

codant pour le génome viral. Un promoteur interne doit donc être inséré pour diriger

l’expression du transgène. En plus de pouvoir médier le transfert de gène dans les cellules

en prolifération, les lentivirus pseudotypés avec des glycoprotéines d’enveloppe provenant

des virus Mokola ou Ébola ont démontré la capacité d'infecter des fibres musculaires chez

les embryons de souris (MacKenzie et al. 2002). En effet, suite à l’injection

intramusculaire/intra-utérine de lentivirus codant pour la β-Galactosidase chez des

embryons, on a pu détecter des fibres musculaires exprimant ce transgène jusqu’à 6 mois

après l’injection. Bien que les lentivirus ne soient pas dotés d’une capacité d’encapsidation

suffisante pour transporter une version complète du gène de la dystrophine, ils pourraient

transduire des versions tronqués du gène. Des travaux récents montrent que des mini-gènes

de la dystrophine sont efficaces pour améliorer le phénotype des souris mdx (Harper et al.

2002; Watchko et al. 2002).

3.3.2 Adénovirus Les adénovirus ne causent chez l'humain que des infections bénignes des voies

respiratoires. Ils ne s'intègrent pas au génome de la cellule hôte mais se maintiennent plutôt

sous la forme d'un élément épisomal. La taille du génome des adénovirus sauvages est

d'environ 35 kb et peut ainsi contenir la séquence codante complète de la dystrophine

(Kremer et Perricaudet 1995a). Les adénovirus recombinants peuvent transduire les fibres

musculaires squelettiques ainsi que le muscle cardiaque (Acsadi et al. 1996). Par contre

l’infection des fibres musculaires par les adénovirus est tributaire de la présence du

récepteur CAR qui voit son expression fortement diminuée pendant la maturation des fibres

musculaires (Nalbantoglu et al. 1999). Ceci explique en partie pourquoi la plupart des

19

études avec ce vecteur ont été effectuées chez des nouveaux-nés. Suite à l’injection d'un

vecteur de troisième génération codant pour la dystrophine pleine longueur, jusqu’à 30%

des fibres musculaires des souris dystrophiques expriment la dystrophine (Acsadi et al.

1996). Les résultats les plus impressionnants obtenus jusqu’à maintenant chez la souris

proviennent de l’utilisation d’un vecteur contenant deux copies complètes de l’ADN

complémentaire de la dystrophine en aval du très puissant promoteur composite

cytomégalovirus/β-Actine (Gilbert et al. 2003). Malgré la nature épisomale de l’ADN

transféré, 42% des fibres musculaires des souris injectées dans les premiers jours de leur

vie exprimaient la dystrophine à 30 jours; ce pourcentage baisse à 24% à 6 mois. Il est

cependant important de mentionner que malgré l’absence de gènes viraux dans ce vecteur,

une réponse immunitaire humorale forte fut observée dans tous les groupes.

3.3.3 Virus adéno-associé (Parvovirus) Les virus adéno-associés (AAVs) ne sont pas pathogèniques et sont capables d'infecter les

cellules en division et les cellules quiescentes comme les fibres musculaires (Kremer et

Perricaudet 1995b). L’AAV-2 est le plus étudié, mais de nouveaux sérotypes comme le

AAV-6 ont démontré encore plus d’efficacité à infecter les fibres musculaires (Hauck et

Xiao 2003). Les virus sauvages s'intègrent dans le génome de la cellule hôte en un point

spécifique (19q 13.4) à une fréquence importante (Kotin et al. 1990). Quand les AAVs sont

utilisés comme vecteurs, les gènes viraux rep et cap sont remplacés par le transgène et ses

séquences régulatrices associées. Les virus recombinants perdent ainsi la capacité de

s’intégrer dans le génome des cellules infectées. La longueur totale de l'insert ne peut guère

dépasser 5,2 kb (Dong et al. 1996). Les méthodes actuelles pour produire des AAVs ne

permettent pas d'obtenir des titres aussi élevés qu'avec les adénovirus. Les vecteurs AAVs

peuvent exprimer un transgène jusqu'à 18 mois dans un tissu immunocompétent (Xiao et al.

1996). Les AAVs ne seraient d’aucune utilité dans le développement de traitements contre

la DMD sans des développements importants dans l’étude des domaines structuraux de la

dystrophine (Harper et al. 2002). Le groupe de Xiao-Xiao publia en 2000, les résultats de

leur étude sur l’administration de vecteurs AAVs contenant des mini-gènes de la

20

dystrophine de moins de 4,2 kb. Des vecteurs AAVs recombinants ayant en commun des

délétions des domaines R4 à R21 injectés en intramusculaire démontrèrent un taux

d’infection très élevé (50-88%) et une capacité à améliorer la pathologie de la maladie

jusqu’à 6 mois après l’administration (Wang et al. 2000). Il reste à confirmer que ces mini-

gènes permettront d’améliorer la condition d'un patient DMD pour le rendre similaire à un

patient Becker. Il faudra aussi démontrer que malgré l’absence d’intégration des vecteurs

recombinants, l’expression du transgène sera vraiment prolongée. Finalement, il faudra

développer de nouvelles méthodes pour rendre possible l’administration systémique et la

production d’AAVs en quantité suffisante pour la thérapie chez l’humain.

3.3.4 Herpès Simplex type 1 Le virus herpès simplex de type 1 (HSV-1) est un virus neurotropique humain, mais il peut

être utilisé pour infecter des tissus ou des cellules qui ne sont pas dérivés du système

nerveux (Efstathiou et Minson 1995). Le génome viral des virus HSV-1 est constitué d'un

ADN linéaire double brin d'une longueur de 152 kb. Ces virus sont donc doués d’une

grande capacité d’encapsidation. Un fois débarrassé de toute séquence virale, les vecteurs

basés sur le HSV sont peu toxiques et peuvent être utilisés soit pour infecter directement les

muscles ou pour infecter des cellules myogéniques in vitro. En effet, l’injection directe de

vecteurs HSV recombinants peut générer jusqu’à 50% de fibres positives pour le transgène

utilisé (Wang et al. 2002). L'équipe du Dr. Jacques Tremblay a démontré que les vecteurs

HSV pouvaient être utilisés dans le contexte de la thérapie génique indirecte basée sur

l’infection in vitro des myoblastes (Bujold et al. 2002). Suite à la transplantation de

myoblastes infectés avec un amplicon HSV contenant la dystrophine et l’eGFP chez des

souris dystrophiques immunosupprimées, jusqu’à 50% de fibres positives pour la

dystrophine ont pu être observées (Bujold et al. 2002). Les vecteurs HSV demeurent quand

même peu attirants à cause de leur faible capacité d’intégration. Cependant, des travaux

sont actuellement en cours pour générer des vecteurs hybrides HSV-AAVs qui exhiberaient

la propriété de s’intégrer comme des vecteurs AAVs tout en ayant la grande capacité de

stockage du HSV.

21

3.3.5 Les approches non virales Tous les vecteurs décrits précédemment peuvent potentiellement provoquer des réponses

immunes ou causer du tort à la cellule infectée (par leur toxicité ou par mutagenèse

d'insertion). Le thème général des approches non virales est d'imiter les avantages des

composantes des vecteurs viraux en les séparant de leurs fonctions limitantes. L'injection

d'ADN nu implique l'injection d'ADN circulaire plasmidique directement dans le tissu

musculaire. On a pu détecter l'expression du transgène provenant de l'injection

intramusculaire d'un plasmide pendant 60 jours (Wolff et al. 1990). La stimulation

électrique du muscle peut augmenter de façon très importante la perméabilisation du

sarcolemme pour l’ADN (Vilquin et al. 2001). L’occlusion momentanée de la vena cava

peut augmenter le transfert de plasmide dans le diaphragme chez les souris mdx (Liu et al.

2001). Toutes ces améliorations méthodologiques ne parviennent cependant pas à résoudre

le problème de persistance limitée de l’expression avec des plasmides. Il est aussi à prévoir

que l’adaptation de ces méthodes à de gros muscles sinon à tout le corps d’un patient

Duchenne sera difficile.

Plutôt que d’introduire un gène complet pour remplacer le gène muté, d’autres stratégies

impliquent l’utilisation de séquences nucléotidiques capables de moduler la transcription ou

de corriger les mutations dans un génome cible. Les ARNs antisens peuvent être utilisés

pour interférer avec l’épissage normal de divers transcrits. La transfection de séquences

ciblant l'exon muté peut permettre d'omettre ce dernier pour produire une dystrophine

tronquée mais encore fonctionnelle (van Deutekom et al. 2001). Les méthodes qui optent

pour la correction génétique sont l’utilisation de chimeraplastes (Yoon et al. 1996) et le

remplacement homologue avec de courts fragments d'ADN simple brin (Kapsa et al. 2001).

Ces méthodes sont en principe très attirantes puisqu’elles ont le potentiel de restaurer au

moins un phénotype intermédiaire sans déclencher une réponse immune. Leur efficacité est

encore réduite et des améliorations sont nécessaires avant d'en arriver à des essais cliniques.

22

3.4 Transplantation de cellules souches pluripotentes L’intérêt pour les cellules souches a littéralement explosé ces dernières années. L'équipe de

Caplan (Wakitani et al. 1995) a été la première à montrer que des cellules pluripotentes

mésenchymateuses isolées de la moëlle osseuse de rat pouvaient se différencier en cellules

myogéniques lorsqu'elles étaient exposées à un agent antimitotique. Les cellules extraites

de la moëlle osseuse d'une souris transgénique pouvaient, suite à une injection systémique,

migrer au site du dommage musculaire, se différencier et fusionner avec les fibres

endommagées pour participer à la régénération (Ferrari et al. 1998). Un peu plus tard, on a

découvert qu’une population de cellules isolées du muscle pouvait repopuler de façon

efficace la moëlle osseuse de souris exposées à une dose létale de radiation (Jackson et al.

1999). En même temps, il a été démontré qu’une sous-population cellulaire exhibant la

capacité de pomper en milieu extracellulaire un marqueur fluorescent (Hoechst 33342),

ressemblait beaucoup aux cellules souches retrouvées dans la moëlle osseuse. Tout comme

les cellules non purifiées du muscle, ces cellules négatives pour le Hoechst 33342 sont

aussi capables de repopuler non seulement la moëlle osseuse (Gussoni et al. 1999), mais

aussi le muscle dans une moindre mesure (McKinney-Freeman et al. 2002). C’est donc tout

autant pour leur capacité extensive de prolifération que pour leur potentiel de dispersion à

travers la circulation que les cellules souches pluripotentes suscitent tant d’intérêt. Un

exemple très impressionnant de dispersion des cellules souches fut publié récemment par le

groupe de Cossu (Sampaolesi et al. 2003). Ils ont démontré que l’injection intra-artérielle

de mésoangioblastes (une nouvelle classe de cellules souches associées aux vaisseaux

sanguins) dans l’artère fémorale de souris mdx pouvait mener à la correction

morphologique et fonctionnelle des muscles irrigués. Les récentes découvertes de

populations cellulaires multipotentes dans presque tous les tissus du corps ont provoqué

une révision radicale de notre conception de la stabilité de la différenciation cellulaire

(Partridge 2003). Les cellules souches offrent le potentiel de fournir une source continue de

cellules pouvant participer à la régénération à divers sites dans le corps. De l’aveu même

des initiateurs de la technique de transplantation de moëlle osseuse pour le traitement d'une

neuropathologie musculaire, le potentiel thérapeutique réel de cette technologie reste

23

questionnable (Ferrari et Mavilio 2002). En effet, moins de 0,5% des muscles des souris

transplantées avec de la moëlle osseuse montrèrent des fibres musculaires hybrides (Ferrari

et al. 1998).

3.5 La transplantation de myoblastes La transplantation de myoblastes normaux dans les muscles dystrophiques peut

potentiellement créer un réservoir de myoblastes normaux capables de fusionner et de

restaurer l'expression de dystrophine (Partridge 1991). Le principe de la thérapie par

transplantation de myoblastes repose sur les bases simples des propriétés observées chez les

cellules musculaires. Il s'agit de construire in vivo des hybrides fonctionnels entre des

cellules saines et des cellules musculaires squelettiques contenant le gène muté (Fig. 4). Les

fibres musculaires sont des syncytia plurinucléés formés à partir de la fusion de myoblastes.

Suite à un traumatisme, ces fibres musculaires sont régénérées par la fusion de cellules

myogéniques mononucléées. Cette propriété intrinsèque rend possible l'introduction de

noyaux normaux (ou modifiés génétiquement) à l'intérieur de fibres musculaires

dystrophiques par l'injection de myoblastes normaux (Huard et al. 1993).

24

Figure 4 Transplantation de myoblastes.

La cible du transfert de myoblastes (ou de cellules myogéniques) est le muscle squelettique. (1) Le tissu musculaire peut être prélevé d'un donneur. (2) Les cellules satellites, situées en périphérie des fibres musculaires (3), peuvent être cultivées et proliférées in vitro (4). Après avoir obtenu un nombre suffisant de cellules, elles peuvent être implantées dans le muscle (5) pour participer à la régénération induite au site d’injection par les dommages causés par les injections. Avant la transplantation, les cellules peuvent être modifiées génétiquement pour exprimer des gènes traceurs (comme la β-Galactosidase) ou des gènes candidats comme la dystrophine. (5) Le panneau (6) montre une coupe transversale des fibres multinucléées générées dans le biceps d'un singe greffé avec des cellules marquées à la β-Galactosidase (adapté (Skuk et Tremblay 2001).

25

3.5.1 Historique des expérimentations chez l'animal et évolution du modèle expérimental Même si la transplantation de muscles complets se pratiquait depuis plusieurs années,

l'équipe de Partridge a été la première à montrer que les myoblastes contenus dans le

muscle du donneur pouvaient participer à la régénération des muscles du receveur

(Partridge et al. 1978). En 1979, on a démontré que des cellules myogéniques issues de

cellules satellites, suivies à l’aide d’un marqueur radioactif, pouvaient participer à la

régénération musculaire suite à leur implantation dans un muscle normal (Lipton et Schultz

1979). Les premiers essais de transplantation de myoblastes dans un muscle de souris ayant

pour but de corriger une myopathie ont été publiés par le groupe de Peter Law (Law 1982).

Ces expériences ont été éxécutées chez des souris dystrophiques C57BL/6J dy/dy qui

présentent une atrophie musculaire importante et une dégénérescence musculaire

progressive, mais qui n’est pas un modèle de la DMD.

La confirmation de la validité, au niveau moléculaire du moins, de la souris mdx comme

modèle d'étude de la transplantation de myoblastes dans la thérapie de la DMD, allait paver

la voie à plusieurs expériences montrant la légitimité de cette technique. L’équipe de

Partridge fut la première à démontrer que l'on pouvait réintroduire la dystrophine dans les

muscles de souris mdx en transplantant des myoblastes normaux (Partridge et al. 1989).

Subséquemment, des travaux démontrèrent qu'en inactivant les cellules satellites de l'hôte

par irradiation on pouvait augmenter l’efficacité de la procédure jusqu’à obtenir 70% de

fibres positives pour la dystrophine (Morgan et al. 1990). Ces résultats laissaient présager

que la transplantation de myoblastes normaux chez les patients Duchenne pourrait restaurer

l'expression de dystrophine à long terme et ainsi constituerait un traitement prometteur. Ces

résultats donnèrent donc rapidement lieu à des essais cliniques.

26

3.5.2 Essais cliniques de transplantation de myoblastes chez l'humain La restauration de l'expression de dystrophine chez la souris mdx par l’équipe de Partridge

(Karpati et al. 1989; Partridge et al. 1989; Morgan et al. 1990) suggérait la faisabilité de la

transplantation de myoblastes chez l’humain. Cinq équipes ont débuté des essais cliniques

au début de années 90 chez des patients DMD (Law et al. 1990; Huard et al. 1991; Gussoni

et al. 1992; Karpati et al. 1993; Tremblay et al. 1993b; Mendell et al. 1995).

Le groupe de Karpati (Karpati et al. 1993) démontra un effet thérapeutique très pauvre

exercé par la transplantation de myoblastes chez des patients immunosupprimés avec de la

cyclophosphamide. L'analyse de l'expression de la dystrophine dans les muscles

transplantés n'a cependant pas montré d'augmentation significative. Le groupe de Miller a

démontré que l'on pouvait détecter le transcrit normal de la dystrophine provenant du

donneur suite à la transplantation de myoblastes chez des patients DMD (Gussoni et al.

1992). La quantité de messagers observés était cependant très faible, ne permettant pas de

conclure au succès de la greffe. Dans une seconde étude, le messager de la dystrophine fut

détecté dans trois des dix patients un mois après la transplantation et dans un patient six

mois après la transplantation (Miller et al. 1997). Aucun gain de force ne fut imputé à la

transplantation de myoblastes, mais cette étude montra que la cyclosporine pouvait

augmenter la force chez les patients Duchenne. La cyclosporine augmente le calcium

disponible pour la libération hors du reticulum sarcoplasmique des musles squelettiques

chez les patients DMD, ceci pourrait expliquer les gains de force observés (Miller et al.

1997).

L'équipe de Jacques Tremblay a aussi effectué des transplantations de myoblastes chez des

patients Duchenne (Huard et al. 1991; Tremblay et al. 1993b). Une restauration

significative de l'expression de la dystrophine a été observée dans les muscles greffés.

Certains patients ont aussi manifesté une augmentation de force volontaire dans les muscles

transplantés (Huard et al. 1992). Par contre, les augmentations au niveau de l'expression de

la dystrophine et les gains de force furent transitoires. Ces travaux ont révélé que les

27

myoblastes injectés étaient immunogéniques et pouvaient causer le rejet de la greffe, et ceci

même dans les cas de parfaite immunocompatibilité pour les antigènes majeurs (Huard et

al. 1992). Le groupe de Mendell apporta une variante aux essais cliniques précédents, i.e.

qu'ils multiplièrent le nombre d'injections de myoblastes. Ils injectèrent 110 millions de

myoblastes, provenant d'un membre de la famille du patient, une fois par mois pour une

durée de six mois à 12 garçons souffrant de la DMD (Mendell et al. 1995). La moitié des

patients furent immunosupprimés avec la cyclosporine A. Aucun gain de force ne fut

observé six mois après la dernière injection, mais une production significative de

dystrophine du donneur fut détectée chez un patient.

3.5.3 Limites de la transplantation de myoblastes Le succès limité des essais cliniques effectués par ces cinq groupes a confirmé qu'il était

nécessaire d'améliorer la méthode de transplantation de myoblastes pour augmenter

l'efficacité thérapeutique de cette technique. Le groupe de Tremblay a identifié trois types

de problèmes pouvant expliquer la faible efficacité de la transplantation de myoblastes (Fig.

5) (Skuk et al. 2002b; Skuk et Tremblay 2003b) :

1) la faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injections;

2) la mort rapide des myoblastes suite à l’injection;

3) le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique.

28

Figure 5 Trois facteurs limitants le succès clinique de la transplantation de myoblastes.

Représentation schématique de la transplantation de myoblaste dans le muscle squelettique. La faible dispersion des cellules transplantées, la mort rapide des myoblastes et la réponse immune spécifique sont les principaux obstacles freinant la transplantation de myoblastes. (1) Histochimie pour révéler le produit du transgène de la β-Galactosidase dans un muscle de singe illustrant la faible dispersion des myoblastes transplantés hors des sites d’injection. (2) Pochettes cellulaires démontrant une entrée rapide du calcium extracellulaire (Rouge Alizarine) quelques heures après l’injection. (3) Infiltration de lymphocytes en périphérie des myofibres exprimant le transgène un mois après une transplantation allogénique chez le singe (Adapté (Skuk et Tremblay 2001).

29

3.5.3.1 La faible dispersion des myoblastes hors des sites d'injections La migration limitée des myoblastes dans les muscles transplantés est considérée comme

un facteur responsable du faible succès des transplantations de myoblastes chez les patients

dystrophiques (Rando et al. 1995; Skuk et Tremblay 2000b). Pour obtenir des succès de

greffe chez les primates excédant 60% de fibres positives pour la β-Galactosidase, il est

nécessaire d'effectuer des trajectoires d’injections séparées par seulement 1 mm (Skuk et al.

2002a). Le tissu musculaire représente plus de 40% de la masse corporelle et est réparti

dans environ 600 muscles différents. On se doit donc d’augmenter la capacité de migration

des cellules transplantées avant qu’elles ne fusionnent avec les fibres endommagées. Deux

types de solutions s'offrent à nous pour augmenter la dispersion des myoblastes à travers les

muscles ciblés. Il est possible d’injecter les cellules dans la circulation sanguine en espérant

que celles-ci atteignent les muscles ou on peut tenter de stimuler la capacité migratoire des

cellules greffées intramusculairement. Certains groupes ont expérimenté l'injection

intrasystémique de cellules souches ou myogéniques, mais obtenant des succès moindre

que ceux obtenus en faisant des injections directement dans le muscle (Neumeyer et al.

1992; Robinson et al. 1996; Ferrari et al. 1998; Skuk et al. 1999). On a montré que l'on

pouvait augmenter la dispersion des cellules autour du site d'injection en traitant les

cultures de myoblastes avec une lectine, la concanavaline A, 24 heures avant leur injection

dans le muscle (Ito et al. 1998). La concanavaline A est connue comme une molécule

pouvant induire l'expression des métalloprotéases qui sont des enzymes impliquées dans

l'augmentation de la locomotion cellulaire, l'invasion tumorale, mais également dans la

migration des myoblastes (El Fahime et al. 2000). La surexpression d'une métalloprotéase

ciblant la matrice extracellulaire, comme la matrilysine ou l’uPA, permet aux myoblastes

de former davantage de fibres hybrides (Caron et al. 1999) et d'augmenter leur dispersion

(El Fahime et al. 2002) respectivement, suite à la transplantation. L’utilisation de facteurs

de croissance comme l’IGF-I et le bFGF pour stimuler la dispersion radiale des myoblastes,

a permis de faire progresser de 300 µm à 900 µm la migration maximale hors du site

d’injection.

30

3.5.3.2 La mort rapide des myoblastes suite à l’injection

Plusieurs expériences suggèrent qu'un pourcentage élevé des myoblastes injectés dans les

muscles de souris meurent peu de temps après leur transplantation suite à la réponse

inflammatoire (Fan et al. 1996; Guérette et al. 1997; Beauchamp et al. 1999; Skuk et al.

2003). L’importance réelle de la mort rapide des myoblastes suite à la transplantation reste

encore controversée (Skuk et al. 2003). Cette cytotoxicité pourrait être causée par les

leucocytes infiltrant le muscle (Guérette et al. 1997) ou par l'activation de la cascade du

complément (Skuk et Tremblay 1998). Les agents anti-inflammatoires administrés aux

souris avant la transplantation, n'ont pas permis de réduire la mort des myoblastes, mais les

modifications génétiques des cellules du donneur avec le TGF-β (Merly et al. 1998), le

récepteur de l'Interleukine-1 (Qu et al. 1998) ou l'administration d'un anticorps contre le

LFA-1 (Guérette et al. 1997) ont permis d’augmenter la survie des cellules transplantées.

Plus récemment, on a démontré que la co-injection de Tubulyzine, une molécule stimulant

la régénération tissulaire, pouvait réduire la mort cellulaire des myoblastes injectés dans le

muscle (El Fahime et al. 2003).

3.5.3.3 Le rejet à moyen et long terme dû à la réponse immune spécifique Pour que la transplantation de myoblastes soit efficace chez les patients Duchenne, on se

doit de contourner les défenses immunes spécifiques de l'hôte. Deux possibilités s'offrent à

nous dans la perspective d’une greffe allogénique de cellules issues d’un donneur sain. On

peut immunosupprimer le receveur ou induire chez lui une tolérance spécifique aux cellules

du donneur. Le FK 506 (Tacrolimus) est très efficace pour immunosupprimer et empêcher

le rejet des myoblastes greffés, tant chez la souris (Kinoshita et al. 1994b) que chez le singe

(Kinoshita et al. 1996). Le FK 506 est couramment utilisé pour divers types de

transplantations, mais il demeure quand même toxique. Un traitement prolongé avec des

immunosuppresseurs peut causer des effets secondaires de neurotoxicité et de

néphrotoxicité (McDiarmid et al. 1995). Des protocoles d’induction de tolérance sont

présentement à l’étude dans diverses unités de recherche pour permettre l’acceptation de

transplantations cellulaires excluant la prise d’agents immunosuppresseurs. On a

31

développé, chez la souris, plusieurs protocoles permettant de prolonger l’acceptation de la

greffe par l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre des récepteurs (comme

le LFA-1, le CD-45, le CD-154 ) impliqués dans la signalisation entre les lymphocytes

(Guerette et al. 1997; Camirand et al. 2002). Même si les résultats sont prometteurs,

l’efficacité de ces approches doit aussi être démontrée chez l’humain. En effet,

contrairement aux agents immunosuppresseurs, l’induction de tolérance n’est pas encore

couramment utilisée chez l’humain.

Il est aussi possible de minimiser la réponse immune de l'hôte en lui transplantant ses

propres cellules modifiées pour exprimer la dystrophine, donc de faire une autogreffe de

cellules génétiquement modifiées pour exprimer le gène manquant (Floyd et al. 1998;

Moisset et al. 1998). Même si la greffe autologue de myoblastes génétiquement transformés

pour exprimer la dystrophine normale peut permettre de diminuer l'immunogénicité des

greffes de myoblastes, elle fait face à un nouveau problème. Les cellules satellites obtenues

de biopsies de patients DMD ont une capacité proliférative limitée. En effet, la capacité

proliférative des myoblastes isolés de patients DMD est faible (Decary et al. 1997). Il a été

avancé, que cette faible capacité proliférative, comparée à celle des myoblastes isolés

d'individus normaux, serait causée par un raccourcissement hâtif des télomères des cellules

myogéniques qui sont soumises à des cycles dégénérescence/régénération dans les muscles

dénués de dystrophine (Decary et al. 1997). On peut concevoir que les cellules satellites

d'un patient DMD puissent voir leur potentiel prolifératif être augmenté par l'expression

transitoire d’oncogènes ou de la télomérase, l'enzyme normalement responsable de

l'allongement des télomères chez les cellules souches hématopoïétiques.

3.5.4 Immortalisation des cellules myogéniques Plusieurs virus contiennent des oncogènes venant perturber le fonctionnement normal de la

cellule hôte pour favoriser sa progression dans le cycle cellulaire. Ces oncogènes viraux

peuvent contribuer à l’apparition de tumeurs. Malgré leur participation au développement

32

de certains cancers, on les utilise également pour immortaliser des cellules ayant une

capacité de prolifération limitée. Les principaux oncogènes étudiés jusqu’à maintenant pour

l’immortalisation de cellules humaines sont c-myc, E6/E7 de papillomavirus, E1A de

l’adénovirus et l'antigène T de SV40.

3.5.4.2 L’antigène T Le génome du virus SV-40 code pour l’antigène grand T (AgT), une oncoprotéine

impliquée dans l’immortalisation cellulaire. L’AgT est une phosphoprotéine nucléaire

contenant 708 acides aminés. Elle interagit avec plusieurs protéines cellulaires soient p53,

pRb, p107, DNA polymérase II, le facteur de transcription AP-2, la protéine de choc

thermique p73 et le TBP (TATA box binding protein). Les deux principales cibles de l’AgT

sont pRb et p53. Les protéines p53 et pRb sont en quelque sorte des suppresseurs de

tumeur, c’est-à-dire qu’elles empêchent la prolifération illimitée des cellules. En réponse à

un dommage causé à l’ADN, p53 immobilise la cellule dans le cycle cellulaire en phase G1

pour permettre à la cellule d’effectuer les réparations nécessaires avant de poursuivre son

cycle de réplication ou d’entrer en sénescence. La protéine p53, qui a une durée de vie très

courte, s’accumule dans les cellules où il y a des dommages à l’ADN ou celles qui ont subit

un stress important (Sherr 1996). pRb agit également au niveau G1 du cycle cellulaire.

Lorsque pRb est hypophosphorylé, il bloque le cycle cellulaire en G1. En présence de

cyclins-CDKs, il devient phosphorylé et les cellules peuvent progresser dans la phase S

(Mittnacht 1998). Une fois liées à l’AgT, pRb et p53 sont séquestrées et incapables de

participer normalement à la régulation du cycle cellulaire (Fig. 6).

33

Figure 6 Activation de la prolifération cellulaire par l’oncogène viral de SV-40.

Le virus SV-40 utilise une protéine multi-usages (antigène T) qui vient séquestrer les deux suppresseurs de tumeurs p53 et Rb. Le taux de p53 augmente lorsque l'ADN est endommagé ou lorsque les télomères ont atteint une longueur critique. p53 peut alors conduire la cellule vers l'apoptose ou stimuler la réparation de l'ADN ou provoquer l'arrêt du cycle. L'arrêt en G1 est en effet induit par p53 qui active la transcription du gène Cip1 codant pour p21, inhibiteur de cdk/cyclines. Rb est une protéine qui inhibe l’entrée dans la cycle cellulaire en séquestrant le facteur de transcription E2F. L'inactivation, sa séquestration ou l'absence de Rb favorise la progression dans le cycle cellulaire (adapté de Alberts 2002).

34

L’AgT fut utilisé très tôt pour étudier la possibilité d’augmenter la capacité proliférative

des cellules myogéniques (Shay et al. 1993; Morgan et al. 1994). Afin de se débarrasser des

effets oncogéniques indésirables à long terme inhérent à l’utilisation d’une oncoprotéine,

ces groupes ont privilégié l’utilisation d’une version thermosensible de l’AgT (Jat et Sharp

1989). Même si plusieurs types cellulaires ont été immortalisés avec l’AgT, ce sont les

expérience exécutées sur les myoblastes qui attirent le plus notre attention. On a démontré

qu’il était possible de produire une culture à long terme de myoblastes issus de patients

DMD (Simon et al. 1996b). Comme pour les exemples précédents, c’est la version

thermosensible de l’AgT, ayant une activité optimale à 33°C et inactive à 39°C, qui fut

utilisée. D’autres équipes avaient également effectué les mêmes expériences mais sur des

myoblastes humains normaux (Iujvidin et al. 1990), sur des fibroblastes isolés de rat (Jat et

Sharp 1989) et sur des myoblastes de souris mdx (Yang et al. 1992).

Comme l’utilisation d’une version thermosensible de l’AgT ne semblait pas suffisante pour

que les cellules immortalisées puissent recouvrer leur capacité à se différencier de façon

aussi efficace que des cellules normales, plusieurs équipes ont remplacé le promoteur

constitutif par un promoteur vimentine afin d’arrêter l’expression dans les cellules

fusionnées (Pincon-Raymond et al. 1991; Vicart et al. 1994; Deschenes et al. 1997). Bien

que les cellules modifiées avec l’AgT puissent conserver la capacité de fusionner en

culture, les travaux exécutés dans notre laboratoire indiquent que la participation à la

régénération in vivo demeure encore problématique (Seigneurin-Venin et al. 2000b). En

effet, en plus d'être immunogénique et de faciliter la dédifférenciation, l’AgT réduit

considérablement le succès de greffe lorsqu'il est présent dans les cellules transplantées

(Skuk et al. 2003).

Puisque l’utilisation d’oncogènes mutants thermosensibles est limitée par des

considérations de sécurité et d’efficacité, plusieurs groupes ont expérimenté

35

l’immortalisation conditionnelle à l’aide de vecteurs permettant l’excision de l’oncogène

(Westerman et Leboulch 1996; Berghella et al. 1999; Salmon et al. 2000). Dans ce système

expérimental, l’AgT entouré de sites LoxP est excisé en présence de la recombinase Cre. Le

vecteur recombinant transportant l’AgT et les sites LoxP est transféré dans les cellules

cibles à l’aide d’un rétrovirus. Leurs travaux montrent qu’il est possible d’immortaliser de

façon réversible les cellules douées d’une capacité proliférative limitée. Leur système

nécessite cependant une étape tardive d’infection massive pour exprimer la recombinase

Cre dans toutes les cellules. Dans la perspective d’une transplantation de plusieurs

centaines de millions de cellules myogéniques, l’utilisation de vecteurs intégratifs

résulterait en une très grande quantité d’événements d'intégration pouvant causer de la

mutagenèse par insertion. L’utilisation de vecteurs non intégratifs comme les adénovirus

permet d’éviter ces risques. Cependant les vecteurs adénoviraux codent pour des protéines

hautement immunogéniques qui persistent plusieurs jours après l’infection. Dans le cadre

d’une transplantation massive chez des patients DMD, il serait donc préférable de limiter

l’utilisation de vecteurs viraux.

Les oncogènes comme l’AgT ne permettent pas l’immortalisation complète des cellules

humaines. En effet, ils n’amènent la cellule qu’à ignorer le raccourcissement excessif des

télomères pendant environ 15 à 25 passages supplémentaires. Pour les cellules

myogéniques isolées des muscles des patients DMD, cet effet est encore plus limité et une

véritable immortalisation nécessite l’allongement des télomères. Pour certaines

applications, comme la greffe autologue d’une centaine de millions de cellules, une telle

expansion de la capacité proliférative pourrait être suffisante. Mais la modification

génétique, la prolifération nécessaire pour générer assez de cellules pour injecter dans

plusieurs muscles du patient, ainsi que les contrôles nécessaires pour s’assurer de la

sécurité de la procédure imposent une immortalisation impliquant l’allongement des

télomères.

36

3.5.4.3 Les télomères et la télomérase Les cellules de mammifères cultivées à partir de tissus somatiques ont une capacité

proliférative limitée. Après 10 à 40 divisions, elles atteignent une première limite (M1),

décrite pour la première fois par Hayflick (Hayflick 1965). Cette limite peut être

outrepassée avec des oncogènes viraux, comme nous l’avons vu plus tôt. Les cellules

exprimant des oncogènes immortalisants sont amenées à ignorer le fait que la réduction des

télomères approche alors un seuil critique (Fig. 7). Après encore une trentaine de divisons,

les cellules entrent en sénescence, i.e. qu’elles refusent de continuer à proliférer et adoptent

une morphologie caractéristique.

La sénescence chez les mammifères est due en partie au raccourcissement des télomères

imposé à chaque division cellulaire (Johnson et al. 1998). Les télomères sont situés aux

extrémités des chromosomes et sont composés de répétitions de la séquence TTAGGG

(Morin 1989). Durant la phase S, ils ne sont pas répliqués en entier par les polymérases et

raccourcissent de façon graduelle à chaque division cellulaire à moins que leur longueur ne

soient maintenus (Prescott et Blackburn 1999). La télomérase est un complexe protéique

ayant une activité de transcriptase inverse qui est impliquée dans l’immortalisation

cellulaire via l’allongement des télomères (Colgin et Reddel 1999). La télomérase est active

dans les cellules cancéreuses et les cellules germinales mais elle est absente des cellules

somatiques chez l’humain. La sous-unité catalytique de la transcriptase inverse humaine

(hTERT) a été clonée et on a démontré que son expression transitoire pouvait résulter en

une extension significative des capacités prolifératives des cellules en culture (Bodnar et al.

1998). On considère donc que les télomères sont en quelque sorte l’horloge mitotique

contenant l’information sur le nombre de divisions qu’a vécu une cellule (Prescott et

Blackburn 1999). On a démontré que l’expression seule de hTERT ne suffisait pas pour

immortaliser des myoblastes isolés de patients DMD (Seigneurin-Venin et al. 2000a). En

effet pour les immortaliser, la présence d'un oncogène viral est également nécessaire. Une

fois immortalisés avec l’AgT, des myoblastes DMD-Tag-Telo ont démontré une capacité

de prolifération extensive ainsi qu’une capacité à fusionner (Seigneurin-Venin et al. 2000a).

37

Figure 7 Implication des télomères dans la sénescence cellulaire.

Pendant la prolifération en culture, les cellules humaines voient leurs télomères diminuer en longueur. Plusieurs cellules montrent un arrêt dans le cycle cellulaire dépendant de Rb/p16 (M0, non illustré ici). Les cellules n’ayant pas été impliquées dans un processus de différenciation terminale peuvent ensuite entreprendre entre 40 et 50 divisions avant d’entrer en sénescence (M1), un état de crise dépendant de p53. Les cellules immortalisées avec un oncogène, comme l’AgT, peuvent franchir cette limite et ajouter entre 30 et 40 divisions avant d'atteindre la limite M2. L’allongement des télomères, à l’aide de la sous-unité catalytique (TERT) de la télomérase, peut permettre de franchir cette limite proliférative en maintenant la longueur des télomères (adapté de Prescott et Blackburn 1999 et de Johnson et al. 1998).

38

4 ième partie: TAT ET LES DOMAINES DE TRANSDUCTION PROTÉIQUES

4.1 La protéine Tat du VIH-1 Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH-1) code pour la petite protéine activatrice de

la transcription Tat (Jeang et al. 1999). Tat est nécessaire pour la réplication et est

relativement conservée chez tous les lentivirus ciblant les primates (Ruben et al. 1989). La

fonction première de Tat est de réguler la transcription du promoteur LTR (Long Terminal

Repeat) du VIH-1. Tat se lie aux structures TAR (Transactivation Responsive Elements)

présentes en 5’ de l’ARN messager viral (Brigati et al. 2003). Par cette interaction, Tat

recrute une série de complexes de transcription qui modifient la conformation de la

chromatine au site d’intégration proviral et qui phosphorylent l’ARN polymérase II pour

promouvoir l’élongation de la transcription de l’ARN viral (Kao et al. 1987). NF-κB est

impliqué dans l’activation de plusieurs gènes qui viennent subséquemment augmenter

l’expression à partir du promoteur LTR (Brigati et al. 2003). Toutes ces fonctions cumulées

sont responsables de l’augmentation de plus de mille fois du taux de transcription de l’ARN

proviral en présence de Tat (Jeang et al. 1999). Deux isoformes de la protéine existent; une

de 101 acides aminés qui est générée par l’épissage complet de l’ARN messager et une

isoforme de 72 acides aminés qui résultent d'un épissage incomplet (Fig. 8). Puisque la

transcriptase inverse du VIH n'est pas très fiable et génère des mutations, il existe plusieurs

variantes de la protéine Tat dans la population infectée.

39

Figure 8 Génome et transcription du VIH-1.

Le transcrit primaire du VIH-1 contient de multiples sites accepteurs et donneurs qui peuvent générer plus de 30 ARNs messagers alternatifs dont plusieurs sont polycistroniques. L’ARN non épissé peut générer les protéines virales Gag et Gag-Pol ou l'ARN génomique destiné à l'empaquetage. Les transcrits épissés de façon incomplète codent pour Env, Vif, Vpu, Vpr et Tat (72 a.a.) alors que ceux dont les deux introns ont été épissés codent pour Rev, Nef et Tat (101 a.a.) (adaptée de Jeang et al. 1999).

40

En plus de ses fonctions transcriptionnelles, Tat exhibe plusieurs autres propriétés

inhabituelles pour un facteur de transcription. Tat peut être libéré de la cellule infectée par

le VIH-1 pour entrer dans les cellules voisines tout en conservant sa propriété de

transactivateur (Frankel et Pabo 1988). Tat peut se lier au récepteur flk-1/KDR et activer la

tyrosine kinase qui lui est associée (Albini et al. 1996). Tat se lie également à d’autres

récepteurs comme l’intégrine αvβ5 (Vogel et al. 1993; Weeks et al. 1993). Dans certaines

circonstances, Tat manifeste des activités comparables à un facteur de croissance et montre

des propriétés immunosuppressives. Elle est aussi impliquée dans la pathogenèse du

sarcome de Kaposi (Watson et Edwards 1999). Tat favorise la progression de cette

pathogenèse en induisant l’expression de molécules d’adhésion, en modulant l’apoptose des

cellules, en induisant l’angiogenèse, en stimulant la croissance et la prolifération des

cellules tumorales, en induisant la chémotaxie et en induisant la réplication du HSV-8

(Foreman et al. 2001).

4.2 Le domaine de transduction de Tat, un historique Tat possède une séquence peptidique, baptisée domaine de transduction protéique (DTP),

conférant à cette protéine la propriété d’être transportée à l’intérieur des cellules sans

l’intermédiaire d’un récepteur spécifique (Ezhevsky et al. 1997). Ce domaine peptidique

fusionné à d'autres protéines ou macromolécules permet leur internalisation leur donnent

ainsi accès au cytoplasme (Mann et Frankel 1991). La protéine Tat, synthétique ou purifiée,

peut après son internalisation dans le cytoplasme, se concentrer au noyau et transactiver la

transcription de gènes viraux (Frankel et Pabo 1988; Green et Loewenstein 1988). Suite à la

mort ou suite à un processus de transport encore mal caractérisé, Tat peut être relarguée de

la cellule infectée par le VIH pour ensuite être internalisée dans une cellule voisine non

infectée (Ensoli et al. 1993) et venir transactiver l'expression de gènes comme celui du

TNF-α (Buonaguro et al. 1992) et certaines interleukines (Scala et al. 1994). Mann et

Frankel furent les premiers à suggérer l’utilisation de Tat comme instrument pour faciliter

la transduction intracellulaire de protéines ou de macromolécules d'intérêts (Mann et

Frankel 1991).

41

Ce sont des chercheurs de la compagnie Biogen qui furent les premiers à exploiter Tat

comme un outil de transport de protéines comme la β-galactosidase à l’intérieur des

cellules (Fawell et al. 1994). Ils déterminèrent également que c’est le domaine situé entre

les acides aminés 37 et 72 qui était responsable de l’internalisation de cargos hétérogènes.

Suite à l’injection intraveineuse de Tat(37-72)-β-galactosidase, l’enzyme fut détectée dans

le foie, le cœur, la rate, et dans une moindre mesure les poumons et les muscles (Fawell et

al. 1994). Ce sont les groupes de Dowdy (Ezhevsky et al. 1997) et de Lebleu (Vives et al.

1997) qui ont identifié le domaine basique minimal (a.a. 49-57) responsable de la

transduction intracellulaire de la protéine Tat (Fig. 9). C’est en 1997 que Tat a cessé de

n’être qu’une curiosité scientifique pour être utilisée comme instrument d’étude de la

fonction de Rb dans le cycle cellulaire (Ezhevsky et al. 1997). En effet, la première

méthode pratique pour exploiter les propriétés de Tat fut développée par le groupe de

Dowdy. Dans ce système, des protéines d’intérêt fusionnées au DTP de Tat sont purifiées à

partir de lysats de bactéries par une série de chromatographies (Schwarze et al. 2000) (Fig.

10).

42

Figure 9 Tat du VIH-1, Séquence et structure.

(A) Séquence et structure secondaire de l’ARN reconnue par Tat (d’après Rana et Jeang, 1999). (B) Régions composant la protéine Tat de HIV-1 (d’après (Rana et Jeang 1999). (C) Séquence des acides aminés de Tat (#d’accès Genbank :AAL12703). En rouge, le domaine basique, composante minimale de tous les domaines de transduction protéiques basés sur Tat. (D) Structure du domaine de transduction de la protéine Tat (d’après (Ho et al. 2001). Le domaine de transduction de Tat forme une hélice amphipathique, i.e. ayant une distribution asymétrique des charges favorisant une de ses faces. Sur la représentation tridimensionnelle, les résidus chargés positivement sont illustrés en bleu. La vue à 90° montre un côté gauche très chargé (bleu), principalement constitué de résidus arginines, et un côté droit neutre.

43

Un protocole de purification de protéine recombinante polyhistidine-Tat (Fig. 10) a été

utilisé avec succès pour transduire une variété de types cellulaires résultant en des

phénotypes mesurables pour plusieurs protéines dont p16, p27, E1A, E7, caspase-3, Rho,

Rb et etc...(Tableau 1). C’est la publication des études effectuées in vivo chez la souris avec

la Tat-β-Galactosidase qui attira l'attention de la communauté scientifique sur le potentiel

du domaine basique de Tat pour la transduction protéique (Schwarze et al. 1999). On

démontra suite à l’injection intrapéritonéale de Tat-β-Galactosidase, que l’activité

enzymatique de la β-Galactosidase pouvait être détectée dans presque tous les tissus de la

souris, incluant le cerveau, ce que les auteurs interprétèrent comme la démonstration que

les protéines de fusion Tat pouvaient traverser la barrière hémato-encéphalique (Schwarze

et al. 1999). Dans les années qui suivirent, une multitude de nouvelles applications

technologiques émergèrent de plusieurs laboratoires (Chellaiah et al. 2000; Kwon et al.

2000; Wender et al. 2000; Caron et al. 2001; Embury et al. 2001; Kunieda et al. 2002).

Cependant, le mécanisme permettant la transduction intracellulaire des protéines de fusion

Tat resta nébuleux et incertain, sinon controversé.

L’observation que certaines protéines soient douées de la capacité d’être internalisées sans

utiliser des récepteurs spécifiques a attiré beaucoup d’intérêts pour le développement de

nouveaux outils de transduction cellulaire. Une grande variété de cargos ont été transportés

à l’intérieur de cellules à l’aide du DTP de Tat. En effet, les expériences de transduction

intracellulaire ne sont pas restreintes aux protéines (Fawell et al. 1994); des

oligonucléotides (Astriab-Fisher et al. 2000), des liposomes (Torchilin et al. 2001), des

phages (Eguchi et al. 2001) et de courts peptides (Dostmann et al. 2000) ont aussi été

internalisés avec le DTP de Tat.

44

Figure 10 Stratégies de purification de protéines de fusion Tat.

Le vecteur d’expression bactérien pTat produit une protéine de fusion avec une séquence de polyhistidine et le DTP de Tat attachés à l’extrémité N-terminale. Les bactéries (BL21) induites sont soumises à une sonication pour fragmenter l'ADN et extraire les protéines insolubles des corps d’inclusion. Les protéines sont purifiées sous une forme native ou dénaturée selon les besoins. En conditions dénaturantes, les lysats sont ensuite chargés successivement sur une colonne d'affinité (Ni-NTA), une colonne échangeuse d'ions (Sépharose Q) et une colonne de filtration sur gel (PD-10). En conditions natives, les protéines sont soniquées dans un tampon phosphate/NaCl avant d’être chargées sur la colonne Ni-NTA, éluées avec de l'imidazole et dialysées dans un tampon permettant une conservation efficace à -80°C.

45

Tableau 1 Cargos internalisés par la domaine de transduction de Tat

Protéine Type cellulaire Réponse observée Référence Anticorps Carcinome Immunospécificité (Anderson et al. 1993}

β-Galactosidase Hela, NIH 3T3, Cos....etc,

ainsi que plusieurs tissus

Cellules bleues (Fawell et al. 1994},

(Schwarze et al. 1999}

P27Kip1

inhibiteur de Cdk

Jurkat, carcinomes

hépatiques

Division cellulaire et

migration (Nagahara et al. 1998}

Caspase-3 Jurkat Apoptose (Vocero-Akbani et al.

1999}

eGFP fibroblastes, myoblastes Fluorescence (Caron et al. 2001}

Catalase PC12, peau de souris Augmentation de la viabilité

cell. suite à un stress oxydatif

(Jin et al. 2001}

RhoA éosinophiles humains Migration (Alblas et al. 2001}

H-Ras éosinophiles humains Activation de ERK-1/2 et

survie

(Hall et al. 2001}

Filamin-1 HEK-293 Activation de ERK-1/2 (Hjalm et al. 2001}

Bcl-Xl cellules pancréatiques Diminution de l’apoptose (Embury et al. 2001}

p16 fibroblastes humains Progression dans le cycle

cellulaire

(Ezhevsky et al. 1997}

HPC-1 PC12 Relarguage de noradrénaline

et de dopamine

(Fujiwara et al. 2001}

Cdc42 cellules endothéliales Augmentation de la motilité

cellulaire endothéliale

(Soga et al. 2001}

APO-BEC-1 hépatocytes Augmentation de la sécrétion

de VLDL

(Yang et al. 2002a}

Recombinase

CRE

fibroblastes CV-1,

splénocytes, cellules

souches embryonnaires

Recombinaison de sites LoxP (Peitz et al. 2002}

46

4.3 Les domaines de transduction protéiques Tat n’est pas la seule protéine qui puisse être internalisée de façon efficace par les cellules.

D’autres protéines exhibent des propriétés similaires, comme la protéine antennapedia

(ANTP) de Drosophila (Derossi et al. 1994) et VP-22 du virus de l’herpes (HSV-1) (Elliott

et O'Hare 1997) (Tableau 2). On a rapporté que VP-22 de HSV-1, une protéine structurale

de 38 kDa qui ne contient pas de séquence d’exportation, pouvait être sécrétée dans le

milieu de culture par la cellule infectée pour être ensuite internalisée par des cellules

voisines non infectées (Elliott et O'Hare 1997). De plus, les auteurs ont montré que VP-22

était dirigée et accumulée au noyau par les cellules receveuses. Des homéoprotéines comme

ANTP de Drosophila, HoxB4, Engrailed du poulet HoxA5 et Penetratin, une séquence

synthétique dérivée de ANTP seraient sécrétées et réinternalisées suivant des voies non

conventionnelles (Prochiantz 2000). Les séquences cationiques répétées comme les poly-

arginines ont également démontré la capacité de médier l’internalisation de cargos variés

comme des peptides, des molécules non polaires (Tanaka et al. 1998) ou des enzymes

comme la β-Galactosidase (Mai et al. 2002).

Il est à noter que plusieurs autres domaines de transduction synthétiques ont été dérivés de

Tat, ANTP, Transportan et FGF. La liste dépasse maintenant une centaine de variations

ayant des efficacités variables selon les conditions testées (Tableau 2). Les principaux types

de séquences caractérisées jusqu’à maintenant sont : les peptides fortement cationiques

(poly–arginines/lysines/histidines), les hélices amphipathiques (Tat, VP-22, Penetratin,

ANTP), les hélices hydrophobes (Peptide signal, Transportan) et finalement le peptide Pep-

1, un peptide de synthèse où un domaine hydrophobe à été lié à un domaine cationique.

47

Tableau 2 Principaux domaines de transduction et séquences référencées dans la littérature.

Domaine Séquence Références Tat (DTP) : YGRKKRRQRRR (Green et Loewenstein

1988}, (Frankel et Pabo

1988}

Peptide signal (NF-

κB)

AAVALLPAVLLALLAP (Lin et al. 1995}

SLN (FGF-1, aFGF

ou HBGF-1)

NYKKPKL (Imamura et al. 1990}

Antennapedia

(ANTP), Penetratin

RQIKIWFQNRRMKMKK (Derossi et al. 1994},

(Prochiantz 2000}

Transportan GWTLNSAGYLLGPHIDNHRSFHDKYGLA (Pooga et al. 1998}

SLN (AgT SV-40) PKKKRKV (Jo et al. 2001}

VP-22 (HSV-1) DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE (Elliott et O'Hare 1997}

Poly-arginines 5R - 12R (aussi poly-D-arginines) (Wender et al. 2000}, (Mai

et al. 2002}, (Mi et al.

2000}

Poly-lysines 5K - 12K (Murphy et al. 1998}

Poly-histidines 5H - 6H (Mai et al. 2004},(Kichler

et al. 2003}}

Pep-1 KETWWETWWETWSQPKKKRKKV (Morris et al. 2001}

48

4.4 Mécanismes d’entrée Depuis la découverte des propriétés étonnantes exhibées par les protéines contenant des

domaines de transduction comme Tat, VP-22, ANTP et les fibroblast growth factors

(FGFs), plusieurs études furent entreprises pour élucider leur mécanisme d’entrée. Tous les

modèles exposés ne sont pas mutuellement exclusifs et ils peuvent potentiellement

s’appliquer en partie à certains domaines, malgré leur homologie de séquence et/ou

seulement à certains types de cargos. Par exemple, il est possible que les séquences

peptidiques hydrophobes (Transportan, peptide signal du FGF-4) puissent s’infiltrer à

travers la bicouche lipidique de la membrane plasmique, alors que des cargos massifs

comme des phages recouverts à leur surface par des séquences cationiques ne soient

internalisés qu’à l’aide de l’endocytose classique. Mais, avant d’élaborer sur l’étude du

mécanisme d’entrée des domaines de transduction protéique, il serait préférable de réviser

les restrictions imposées par la membrane plasmique ainsi que les voies de transport

transmembranaire déjà bien caractérisées.

4.4.1 La membrane plasmique et le transport transmembranaire La membrane plasmique des cellules eucaryotes exerce de multiples fonctions dans la vie

cellulaire. Elle est constituée de phospholipides, de glycolipides, de cholestérol et de

protéines (Fig. 11). Une bicouche phospholipidique lui donne une structure fluide et la rend

relativement imperméable à la plupart des molécules et macromolécules solubles dans l’eau

(Darnell et al. 1993). La membrane plasmique constitue une barrière imperméable séparant

les milieux externes et internes de la cellule et elle permet des échanges contrôlés entre les

deux compartiments. En effet, la surface externe de la membrane plasmique est criblée de

protéines comportant des sites de reconnaissances spécifiques qui permettent la réception

de signaux moléculaires de différentes origines. Elles sont capables d'adapter leur forme

très rapidement pour, par exemple, résister à des cycles de contraction/relaxation des

cellules musculaires.

49

Les microdomaines nommés radeaux lipidiques “lipid rafts” sont des régions spécialisées

de la membrane où des composantes comme les glycosphingolipides, le cholestérol et

certaines protéines y sont concentrées (Brown et London 1997; Rietveld et Simons 1998).

Les radeaux lipidiques se forment dans le réseau trans-golgien et dans la membrane

plasmique quand les glycosphingolipides et le cholestérol s'associent en des microagrégats.

Les sphingolipides ont tendance à contenir des chaînes d'acides gras plus long (en parti

parce qu'ils sont saturés), formant ainsi une bicouche phospholipidique plus épaisse que

dans le restant de la membrane. Les protéines de membranes qui sont constituées de

domaines transmembranaires plus longs que la moyenne se regroupent ainsi dans ces

radeaux. De plus, les radeaux lipidiques contiennent préférentiellement des protéines

ancrées au GPI et quelques lectines qui peuvent aider à stabiliser cet assemblage (Alberts et

al. 2002).

À cause de son intérieur hydrophobe, la bicouche lipidique de la membrane cellulaire

constitue une barrière au passage des molécules chargées. Cette fonction est cruciale

puisqu’elle permet de conserver une concentration ionique interne différente de

l’environnement extérieur à la cellule (Alberts et al. 2002). Seules les petites molécules

hydrophobes ou chargées et non polaires comme les gaz (l’oxygène, l’azote, le CO2) ou des

molécules comme l’urée, le glycérol, le benzène, le glucose ou les stéroïdes peuvent

diffuser à travers la bicouche phospholipidique. La diffusion facilitée, les canaux ioniques

ainsi que le transport actif sont des voies qui permettent l’internalisation de molécules

chargées, mais ils ne permettent pas l'entrée de grosses molécules comme les protéines. Ces

voies ne sont donc pas des candidates pour expliquer l'internalisation de protéines

fusionnées à un DTP puisqu'elles sont réservées à des molécules de petites tailles.

50

Figure 11 Représentation schématique de la bicouche phospholipidique qui constitue la structure fondamentale des membranes biologiques.

La bicouche phospholipidique constitue la structure de base des membranes biologiques. Les queues d'acides gras hydrophobes constituants les phospholipides forment le milieu de la bicouche, les têtes hydrophiles des phospholipides s'enlignent aux surfaces internes et externes de la membrane. Les protéines intégrales ont une ou plusieurs régions transmembranaires enchâssées dans la membrane. Les protéines périphériques sont associés de façon préférentielle avec la membrane par des interactions protéine-protéine. Les oligosaccharides se lient principalement aux protéines de la membrane; cependant quelque uns se lient aux lipides pour former des glycolipides (adapté de Darnell et al. 1993).

51

Certaines cellules, comme les neutrophiles et les macrophages, exercent une forme

spécialisée d’endocytose que l’on appelle la phagocytose. Cette dernière est peu répandue

contrairement à l’endocytose. Virtuellement toutes les cellules eucaryotes ingèrent de façon

continuelle des petits morceaux de leur membrane plasmique en formant des petites

vésicules endocytiques qui seront plus tard retournées à la surface (Alberts et al. 2002)

(Fig. 12).

L’internalisation des vésicules formées à la membrane permet l’entrée de toutes les

substances extracellulaires dissoutes dans la phase fluide. Pour la plupart des cellules

animales, les puits tapissés de clathrines offrent une voie efficace pour internaliser des

molécules spécifiques présentes dans le milieu extracellulaire. Ce processus est nommé

l’endocytose médiée par des récepteurs (Alberts et al. 2002). L’endocytose commence par

la formation de puits recouverts de clathrines. Les vésicules formées se séparent rapidement

de la membrane et entrent dans le trafic intracellulaire qui les amènera vers les endosomes

tardifs. Les particules internalisées seront ensuite soumises à un mécanisme de triage

complexe pouvant les diriger vers l’appareil de Golgi, vers les lysosomes pour être

dégradées ou même vers le noyau. En plus de l’internalisation par des vésicules tapissées

de clathrines, il y a aussi un autre mécanisme par lequel les cellules peuvent former des

vésicules d’internalisation. L’endocytose cavéolaire se forme dans des régions riches en

radeaux lipidiques (Le et Nabi 2003). Les cavéoles sont des invaginations ayant la forme de

petits flasques lisses. La formation de ces structures est indépendante de la présence de

clathrines. L’internalisation des radeaux lipidiques est plutôt associée aux cavéolines

(cavéolines-1, 2 et 3), des protéines qui tirent évidemment leur nom de cette association (Le

et al. 2002). Ce sentier d’internalisation est aussi utilisé par certains rétrovirus, des AAVs et

des toxines comme celle du choléra (Le et al. 2002).

52

Figure 12 Représentation schématique simplifiée des compartiments intracellulaires impliqués dans l’endocytose et la sécrétion de macromolécules.

Les compartiments illustrés communiquent entre eux et avec l'extérieur de la cellule à l'aide des vésicules de transport. Dans la voie de sécrétion biosynthétique (en rouge), les protéines sont transportées du RE vers la membrane ou vers les lysosomes. Dans la voie endocytique (en vert), les molécules sont ingérées dans les vésicules dérivées de la membrane plasmique et dirigées vers les endosomes précoces et ensuite vers les lysosomes (via les endosomes tardifs). Plusieurs molécules endocytées sont redirigées des endosomes vers la surface de la cellule pour être réutilisées; de façon similaire, quelques molécules sont redirigées des endosomes tardifs vers le Golgi et quelques unes sont retournées au RE. Ces voies de transport rétrograde sont illustrées en bleu (adapté de Alberts et al. 2002).

53

4.4.2 Mécanismes d’entrée des domaines de transduction Les toutes premières études sur l'internalisation de la protéine Tat montrèrent une

distribution intracellulaire ponctuée, mais elles suggéraient aussi que cette internalisation

était due à une liaison non spécifique à la membrane (Mann et Frankel 1991). De plus,

Mann et Frankel démontrèrent que la co-incubation en présence d’héparine, de sulfate

d’héparane, d'un anticorps monoclonal dirigé contre Tat ou l’incubation à 4°C inhibait

l’internalisation (Mann et Frankel 1991). Toutes ces données, à l’exception de l’absence

d’un récepteur spécifique, pointaient vers un mécanisme classique d’internalisation par

endocytose. L’implication du domaine basique de Tat (a.a. 48-57) dans ces propriétés de

transduction furent établies par des études fonctionnelles et structurales (Fawell et al. 1994;

Vives et al. 1997). Ce sont les travaux des groupes de Prochiantz (Derossi et al. 1994),

O'Hare (Elliott et O'Hare 1997), Hawiger (Hawiger 1999) et Dowdy (Nagahara et al. 1998),

décrivant des modèles d’entrée cellulaire indépendants des récepteurs et efficaces à 4°C qui

sont venus suggérer un mécanisme de translocation non classique et indépendant de

l’endocytose.

Certaines séquences peptidiques hydrophobes comme celle contenue dans le peptide signal

permettent aux protéines de s'enchâsser dans la membrane plasmique. Une protéine

contenant une séquence hydrophobe à une de ses extrémités pourraient donc pénétrer les

membranes ou les vésicules phospholipidiques pour médier la translocation membranaire

du cargo protéique dans son entier (Hawiger 1999). On postule donc que ces séquences

puissent agir comme un front avancé “Leading Edge” permettant l’entrée de séquences ou

de cargos greffés (Lin et al. 1995) (Fig. 13). Une autre hypothèse, cette fois-ci impliquant la

présence de résidus cationiques dans la séquence d’importation, fut émise par le groupe de

Prochiantz. Utilisant l’ANTP comme séquence modèle, ils proposèrent que ce peptide

amphipatique provoque l’apparition de micromicelles pouvant déstabiliser la membrane et

résulter en une translocation du cargo (Derossi et al. 1996; Prochiantz 2000). La première

étape de ce processus consiste en une interaction entre la portion cationique du peptide et la

portion chargée négativement des lipides de la membrane plasmique (Fig. 14). La présence

de résidus hydrophobes comme le tryptophane sur la face opposée aux acides aminés

54

cationiques provoquerait la formation de micelles permettant l’entrée subséquente du cargo.

L’étude des caractéristiques majeures de l’internalisation des peptides issus de Tat et ANTP

a indiqué que leur entrée était très rapide (moins de 10 minutes) et qu’elle n’était pas

inhibée à basse température (Derossi et al. 1996; Vives et al. 1997; Schwarze et al. 1999).

Les travaux exécutés par le groupe de Dowdy ont révélé, par la suite, que la translocation

de protéines de fusion Tat à travers la membrane plasmique nécessitait la dénaturation

préalable de celles-ci pour qu'elles puissent s’infiltrer à travers le feuillet bilipidique et

outrepasser les restrictions de taille et de charge imposées par la membrane (Fig. 15)

(Nagahara et al. 1998; Schwarze et Dowdy 2000). Il existe cependant peu de preuves

expérimentales non-ambiguës qui puissent confirmer l’absence d’effets inhibiteurs de

l’incubation à 4°C sur l’internalisation de protéines complètes (Vives et al. 2003).

Le modèle de l’endocytose par adsorption (Fig. 16) proposé initialement par le groupe de

Frankel fut peu étoffé par la suite (Mann et Frankel 1991). Ceux-ci avaient montré que la

co-incubation de la protéine recombinante Tat avec la chloroquine, un agent

lysosomotropique inhibant l'acidification des endosomes, augmentait de façon significative

la transactivation du promoteur LTR du VIH contenu dans des cellules. Plus récemment,

des études ont démontré que les sulfates d’héparanes associées à la surface des cellules

agissaient comme récepteurs pour les protéines de fusion Tat ajoutées au milieu

extracellulaire (Tyagi et al. 2001). En effet, des cellules modifiées pour être déficientes

dans la biosynthèse des protéoglycanes constituées de sulfate d’héparane montrent une

capacité très limitée à internaliser des protéines de fusion GST-Tat-eGFP. Puisque

l’internalisation des peptides cationiques peut être restaurée en pré-traitant les cellules

déficientes dans la biosynthèse des protéoglycanes avec du dextran sulfate, on a émis

l’hypothèse que cette interaction est un événement précoce favorisant la forte concentration

de peptides cationiques à proximité de la membrane (Mai et al. 2002).

55

Figure 13 Modèle du "Leading edge" de l’importation de peptides contenant un signal de translocation membranaire hydrophobe.

Les peptides perméables aux cellules sont construits en utilisant la région h du peptide signal (représenté par une hélice dans la portion avancée de la protéine) lié de façon covalente au domaine amino-terminal ou au domaine carboxy-terminal d'une protéine intracellulaire d'intérêt (adapté de Hawiger 1999).

56

Figure 14 Modèle de la translocation transmembranaire de peptides hydrophobes via la formation de micelles inversées.

Suivant l’adhésion des peptides, le résidu W48 contenu dans la Penetratin déstabilise la membrane et induit la formation de micelles inversées. (A) Les peptides sont emprisonnés dans les micelles, qui s’ouvrent ensuite vers l’intérieur de la cellule. (B) Les micelles perturbent la structure de la bicouche lipidique, permettant la translocation du peptide (adapté de Prochiantz 2000).

57

Figure 15 Modèle de la translocation membranaire de protéines de fusion Tat dénaturées.

(a) Les charges positives du DTP de Tat permettent le contact avec les charges négatives de l’extérieur de la membrane plasmique. (b) La protéine transloque à travers la membrane sous une forme dénaturée. (c) Un fois internalisée dans le cellule, des membres de la famille des protéines de choc thermique renaturent la protéine sous sa forme active. (adapté de Schwarze et Dowdy 2000).

58

Figure 16 Modèle de l’endocytose des protéines de fusion Tat.

Le domaine de transduction cationique fortement chargé des protéines de fusion Tat est adsorbé à la surface des glycoprotéines contenant des sulfates d’héparanes. Ils sont ensuite internalisés dans la cellule par un processus d’endocytose classique.

L’hypothèse voulant que les protéoglycanes formées d’héparane sulfate agissent comme

récepteurs pour les protéines de fusion Tat est supportée par le fait que les protéines de

fusion Tat peuvent être internalisées dans virtuellement tous les types cellulaires. Aucun

récepteur spécifique à Tat n’a encore été identifié dans tous les types cellulaires transduits

(Tyagi et al. 2001). Cependant l’endocytose ne peut être responsable de l’internalisation

rapide des DTPs au noyau (en moins de 10 minutes) telle que décrite par plusieurs groupes

(Vives et al. 1997; Schwarze et al. 1999; Mai et al. 2002). Par contre, des observations

récentes soulèvent un doute sur la validité de plusieurs expériences démontrant cette rapide

localisation nucléaire. En effet, on a observé que la fixation au méthanol des cellules

traitées avec des peptides constitués de domaines de transduction issus de VP-22, un

polypeptide cationique comme le DTP de Tat, pouvait mener à une localisation nucléaire

artéfactuelle des protéines adsorbées à la surface cellulaire (Lundberg et Johansson 2001).

Ces auteurs en concluent que certaines des expériences démontrant une localisation rapide

au noyau ne pourraient être que le résultat d’une fixation inadéquate, résultant en une

perméabilisation nucléaire (Lundberg et Johansson 2001). Comme les peptides cationiques

sont très avides des acides nucléiques, la localisation nucléaire rapide souvent observée

pour Tat ou VP-22, ne serait qu’un artéfact post-fixation.

60

5ième partie : Hypothèse de travail et objectifs

5.1 Résumé de la problématique La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie causée par l’absence de

dystrophine, qui cause une dégénérescence progressive des muscles squelettiques et

cardiaque. Les garçons atteints ont une espérance de vie d’environ 20 ans. Même si la prise

de certains médicaments peut ralentir la progression de la maladie, il n’existe à ce jour

encore aucune thérapie curative. La transplantation cellulaire et la thérapie génique médiée

par des virus recombinants sont handicapées par la réponse immune spécifique qui réduit

l’efficacité des traitements et impose l'immunosuppression. Idéalement, la correction

génétique ex vivo des myoblastes du patient suivie par leur transplantation devrait réduire

l'incompatibilité. Cependant, la capacité proliférative limitée des myoblastes isolés de

patients DMD limite notre habilité à les modifier génétiquement et à les proliférer pour leur

utilisation dans le contexte de la transplantation de myoblastes. Les myoblastes de patients

DMD peuvent être proliférés seulement s'ils sont transformés par un oncogène

immortalisant. L'excision de cet oncogène juste avant la transplantation est possible, mais

nécessite une dernière modification génétique potentiellement risquée.

.

5.2 Hypothèse de travail La technologie de la transduction de protéines pourrait permettre de franchir certains des

obstacles ayant restreint le développement de la thérapie génique directe et de la

transplantation cellulaire. En effet, les protéines de fusion Tat ont démontré la capacité de

transduire plusieurs tissus in vivo. Puisque les muscles sont bien irrigués, des protéines de

fusion Tat injectées dans la circulation sanguine devraient pouvoir atteindre les cellules

musculaires pour y introduire leur cargo. Cette technologie pourrait ultimement servir à

transporter directement une protéine permettant de suppléer à l’absence de dystrophine

fonctionnelle.

61

La transduction de protéines pourrait également contribuer à la manipulation des cellules

myogéniques avant la greffe. On a montré qu'il est possible de faire proliférer des

myoblastes issus de patients DMD en utilisant un vecteur rétroviral codant pour l'AgT

flanqué de sites LoxP. Les protéines de fusion Tat peuvent efficacement transduire des

cargos protéiques actifs dans les cellules en culture pour modifier leur comportement. Une

protéine de fusion Tat-Cre pourrait servir de vecteur pour générer la recombinaison

nécessaire à la réversion de l'immortalisation, diminuant ainsi les risques de tumorigénicité

associés à l’utilisation d'oncogènes viraux et de vecteurs intégratifs juste avant la

transplantation.

Même si les domaines de transduction protéiques suscitent beaucoup d'intérêts, leur

efficacité demeure relativement limitée et controversée. En effet, même si les premières

études indiquèrent que les protéines de fusion Tat étaient internalisées dans virtuellement

tous les types cellulaires ainsi que dans une variété de tissus vivants, les publications

démontrant des applications fonctionnelles restent peu nombreuses. Pour expliquer cette

contradiction apparente, nous émettons l'hypothèse que l'entrée des protéines de fusion Tat

n'est pas médiée par une translocation membranaire, mais par un processus d'endocytose

classique. Ainsi, comme c'est le cas pour les vecteurs viraux et les méthodes de

transfection, le passage de la membrane plasmique ne garantirait pas nécessairement une

localisation intracellulaire correcte ou l'intégrité du cargo.

5.3 Objectifs Même si certains groupes ont déjà utilisé des protéines de fusion Tat pour cibler des

cellules en culture ou certains tissus in vivo, aucune étude du potentiel de cette technologie

ne s’est intéressée au muscle. De plus, le mécanisme impliqué dans l’internalisation des

protéines de fusion Tat reste encore mal compris, ce qui a limité leur efficacité comme outil

62

pour manipuler les culture cellulaires. Notre travail s’est concentré sur trois objectifs

principaux :

1- Tester le potentiel in vivo des protéines de fusion Tat à être internalisées dans les fibres

musculaires;

2- Mieux comprendre le mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat afin

d’optimiser le ciblage fonctionnel dans les cellules en culture;

3- Développer un protocole d’immortalisation conditionnelle et transitoire des myoblastes

de patients DMD en utilisant la transduction de protéines comme instrument.

63

Chapitre 2:

Transport intracellulaire d’une protéine de fusion Tat-eGFP dans les cellules musculaires

Nicolas J. Caron, Yvan Torrente, Geoffrey Camirand, Mathieu Bujold, Pierre Chapdelaine,

Karine Leriche, Nereo Bresolin et Jacques P. Tremblay

Contribution de chaque auteur:

J’ai effectué le travail dans son entier, à l'exception de la Fig.5H, et rédigé l’article. Yvan

Torrente a mis au point les techniques chirurgicales et a effectué les injections intra-

artérielles pour les expériences liées à la Fig.5H. Mes collègue Goeffrey Camirand et

Mathieu Bujold ont fourni une assistance technique pour les expériences animales et Karine

Leriche a effectué la culture des fibroblastes humains. Pierre Chapdelaine a été un guide

irremplacable à mes premières armes en purification de protéines. Jacques P. Tremblay et

Nereo Bresolin ont supervisé ces travaux.

(publié dans Molecular Therapy en mars 2001)

64

Résumé La protéine Tat du VIH-1, lorsque fusionnée à une protéine ou un peptide, peut traverser les

membranes biologiques en suivant un processus nommé la transduction protéique. Nous

avons purifié une protéine de fusion Tat-eGFP à partir de cultures bactériennes pour étudier

la cinétique d'internalisation dans les cellules myogéniques en culture et dans les fibres

musculaires in vivo. In vitro, Tat-eGFP atteint un niveau d’accumulation intracellulaire

maximal en 30 minutes, alors que la fluorescence de l'eGFP n'est détectée qu’après 14

heures. Le signal de localisation nucléaire de Tat ne semble pas suffisant pour conférer une

localisation nucléaire au cargo eGFP, suggérant que le mécanisme d’internalisation utilisé

pourrait être influencé par la conformation de la protéine de fusion. Chez la souris,

l’injection sous-cutanée ou intra-artérielle de la protéine Tat-eGFP mène à un petit nombre

de fibres positives en périphérie de l’injection ou près des vaisseaux sanguins.

L'administration intramusculaire produit un marquage intense au niveau de la matrice

extracellulaire locale, suggérant que certaines de ses composantes viennent interférer avec

le processus d’internalisation.

65

Intracellular Delivery of a Tat-eGFP Fusion Protein into Muscle Cells Nicolas J. Caron,* Yvan Torrente,*† Geoffrey Camirand,* Mathieu Bujold,* Pierre Chapdelaine,* Karine Leriche,* Nereo Bresolin†§ and Jacques P. Tremblay*1 *Unité de Recherche en Génétique Humaine, Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université Laval, Université Laval, Ste-Foy (Qc), Canada, G1V 4G2 †Centro Dino Ferrari, Institute of Clinical Neurology, University of Milan, Milan, Italy. §IRCCS Ospedale Maggiore Policinico and IRCCS Eugenio Medale, Bosisio Parini, Italy. Running title: Tat-eGFP transduction into muscle cells 1 To whom correspondence and reprint requests should be addressed Pr Jacques P. Tremblay Unité de Recherche en Génétique Humaine Centre de Recherche du CHUL 2705 boulevard Laurier Ste-Foy, (Qc), Canada, G1V 4G2 tel: (418) 654-2186 fax: (418) 654-2207 Jacques-P.Tremblay@crchul.ulaval.ca 2Abbreviations used: TA, Tibialis anterior; PTD, protein transduction domain; eGFP, enhanced Green Fluorescent Protein; ECM, extracellular matrix; NLS, nuclear localization signal; HS, heparan sulfate. Keywords: Tat; protein transduction domain; skeletal muscle; eGFP; internalization; extracellular matrix; cationinc peptides. (published in Molecular Therapy, March 2001)

66

Abstract

The Tat protein from HIV-1, when fused with heterologous proteins or peptides, can

traverse biological membranes in a process named “protein transduction”, delivering its

cargo into cells. A Tat-eGFP fusion protein was purified from bacteria to study the

transduction kinetics of Tat fusion proteins into cultured myoblasts and in the muscle

tissue. Correctly folded Tat-eGFP reaches a maximum intracellular level in nearly 30 min,

while its endogenous fluorescence is first detected only after 14 h. The nuclear localization

signal from the basic domain of Tat was not sufficient to confer nuclear localization to Tat-

eGFP, suggesting that the nuclear import pathway used by the exogenously added Tat-

eGFP might be sensitive to the folding state of eGFP. In mice, the direct delivery to the

muscle tissue using subcutaneous injections or the intra-arterial pathway led to few positive

fibers in the muscle periphery or surrounding the blood vessels. Muscles injected with Tat-

eGFP showed intense labeling of the extracellular matrix (ECM), suggesting that, although

Tat fusion proteins can transduce muscle fibers, their binding by components of the ECM

surrounding myofibers could interfere with the intracellular transduction process.

67

Introduction

Direct viral-mediated and ex vivo cell-mediated gene therapy have been studied for years

for the potential treatment of genetic diseases. The success of gene therapy protocols is

often limited by toxicity and immunological problems. Recent protocols for cell-mediated

gene therapy often require, in addition to a corrective therapeutic gene, the delivery of

several transgenes to immortalize, increase the life span of, or switch the differentiation

program of cells isolated from the patients, before they can be transplanted back into the

host. Previously, the potential for the therapeutic use of proteins to supplement for the

product of mutated genes was limited by the impermeable nature of the cell membrane to

such macromolecules. However, reports in the last decade showed that some proteins could

bypass the molecular cutoff imposed by the cell membrane, opening new possibilities in the

field of molecular therapy.

Small regions of proteins and synthetic peptides, called protein transduction

domains (PTDs), were recently identified in Drosophilia (ANTP), HSV-1 (VP22) and HIV-

1 (Tat) (Elliott et O'Hare 1997; Mi et al. 2000; Schwarze et Dowdy 2000; Wender et al.

2000). Even fused with heterologous proteins or peptides, PTDs can traverse biological

membranes efficiently in a process termed “protein transduction”, delivering their cargo

into the cell. Cellular uptake of the Tat protein was first reported by two groups who

showed that the exogenously added Tat protein from HIV-1 could enter cells and

subsequently trans-activate the HIV-1 LTR promoter (Frankel et Pabo 1988; Green et

Loewenstein 1988). In 1991, Frankel suggested that Tat might prove a useful vehicle to

deliver proteins or peptides into cells (Mann et Frankel 1991). Later, antibodies (Anderson

et al. 1993) and enzymes (HRP and β-Galactosidase) (Fawell et al. 1994) were shown to

transduce into cells when crosslinked to a Tat peptide. The study of several Tat-derived

peptides showed that residues 47 to 57 from the basic domain were responsible for the

functional internalization into cells (Jeang et al. 1999; Schwarze et Dowdy 2000; Schwarze

et al. 2000).

68

While studies aimed at better understanding the transducing capabilities exhibited

by the HIV-1 Tat protein, the first convenient method to apply the protein delivery potential

of Tat was developed by the group of Dowdy (Ezhevsky et al. 1997; Nagahara et al. 1998).

In this system, in-frame polyhistidine-Tat fusion proteins are purified from a bacterial

lysate in denaturing conditions through a series of affinity, ion-exchange and desalt

columns. Isolated denatured Tat-fusion proteins are made soluble in an aqueous buffer and

added directly to the cell culture medium. While this strategy was used before, the exact

transduction mechanism by which Tat fusion proteins cross lipid bilayers is still unknown.

Tat PTD fusion proteins can be transduced into cells simply by adding them to the cell

culture medium (Schwarze et al. 2000). After their exogenous application to cultured cells,

Tat-fusion proteins, purified under denaturing conditions, are internalized in a rapid,

concentration-dependent manner to achieve maximum intracellular concentration in a

matter of minutes and are also found in the nucleus (Nagahara et al. 1998; Schwarze et al.

1999). The internalized proteins are then correctly refolded in the cytoplasm, perhaps by

intracellular chaperones. The use of denaturing conditions for the purification of Tat fusion

proteins is necessary to solubilize proteins from bacterial inclusion bodies and is also

involved in increasing transduction efficiency and speed (Nagahara et al. 1998). Two

previous studies examined the possibility of direct delivery of Tat proteins in animals.

Results published by Fawell using a folded Tat-conjugated β-Galactosidase protein injected

intravenously showed strong activity in the spleen, heart and liver but low staining into

skeletal muscles and lungs (Fawell et al. 1994). Schwarze reported that the intraperitoneal

delivery of the denatured Tat-β-Galactosidase fusion protein allowed the uptake into many

tissues in mice, including the heart, the liver and the kidneys, while skeletal muscles and

the brain showed weaker signals (Schwarze et al. 1999).

In the present work, we have purified a Tat-eGFP fusion protein from bacteria to

study the transduction kinetics of Tat fusion proteins into cultured myoblasts and into the

muscle tissue. The aim of our study was to examine the potential of this new technology to

deliver proteins into cultured cells and into the muscle tissue, to better understand the

power and limits of Tat-mediated transduction. We report that correctly folded Tat-eGFP

labeled with rhodamine can transduce C2C12 myoblasts to reach a maximum intracellular

69

level in nearly 30 minutes, while its endogenous green fluorescence was first detected only

after 14 h. The Tat basic domain nuclear localization signal (NLS) was not sufficient to

confer nuclear localization to the Tat-eGFP fusion protein in the first 18 h of treatment,

suggesting that the nuclear import pathway used by the exogenously added Tat fusion

proteins might be impaired by the folded structure of Tat-eGFP. In mice, the direct delivery

into muscles using subdermal injections or the intra-arterial pathway led to a few positive

fibers in the muscle periphery or surrounding the blood vessels. Muscles injected with the

Tat-eGFP fusion protein showed intense labeling of the extracellular matrix (ECM)

suggesting that, although Tat fusion proteins can transduce muscle fibers, their binding by

components of the extracellular matrix surrounding myofibers could interfere with the

intracellular transduction process.

70

Material and Methods

Fusion protein purification. The pTat-eGFP expression vector was constructed by

inserting eGFP from pIRES-eGFP (Clontech) in pTAT-HA vector (gift from Dr. Steven F.

Dowdy) to produce an in frame fusion protein. The pTAT-HA vector has an N-terminal 6-

histidine leader followed by the 11-amino-acid TAT protein transduction domain flanked

by glycine residues (GYGRKKRRQRRRG), a hemaglutinin tag (GYPYDVPDYAG)

flanked by glycine residues and a polylinker (Nagahara et al. 1998). The peGFP control

vector was generated by BamHI digestion and religation of pTat-eGFP, resulting in the

deletion of 51 bp containing the Tat PTD. HIS-tagged fusion proteins were purified from

BL21(DE3)pLysS (Novagen) as previously described (Nagahara et al. 1998) with only

minor modifications. BL21 cells from overnight culture were spun down and then sonicated

in buffer Z (8 M urea, 100 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 8.0). Centrifugation cleared cell

lysates were adjusted to 10 mM imidazole, loaded into a 3 ml Ni-NTA agarose column

(Qiagen), washed with buffer Z + 10 mM imidazole and eluted with buffer Z + 250 mM

imidazole. Fluorescent fractions were then applied to a 3 ml Q Sepharose column (Bio Rad)

in 4 M urea, 50 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 9.5) and eluted in 1 M NaCl, 20 mM Hepes

pH 8.0. Eluted proteins were then desalted on PD-10 column in PBS, aliquoted, flash

frozen in 10 % glycerin and stored at -80°C. Tat-E7 was purified from BL21 cells

containing the pTat-E7 expression vector as previously published (Lissy et al. 1998).

Rhodamine-labeled fusion proteins were generated by NHS-Rhodamine labeling according

to the manufacturer's protocol (Pierce), followed by gel filtration on a PD-10 column.

Purified fusion protein concentrations were determined by Coomassie blue staining of

SDS-PAGE compared to BSA standards.

Cells and cell culture. C2C12 mouse myoblasts, NIH/3T3 mouse fibroblasts, mouse

primary myoblast cultures and human skin fibroblasts (graciously provided by Dr. François

Auger, Hopital St-Sacrement, Quebec, Canada) were grown in DMEM HG medium

supplemented with 10% FBS, 10 000 U/ml penicillin/streptomycin in 5% CO2 at 37°C.

71

Primary myoblast cultures were established from muscle biopsies of newborn BALB/C

mice as previously described (Kinoshita et al. 1994a). Mouse myotubes were obtained by

inducing differentiation of mouse primary myoblast cultures in DMEM with lowered 2%

Newborn Calf Serum for 4 days. Human myoblasts were obtained from the biopsy of a 15-

year-old patient suffering from Duchenne muscular dystrophy (DMD) as previously

described (Tremblay et al. 1993a) and grown in MCDB120 containing 15% FBS, 0.5

mg/ml BSA, 0.39 µg/ml dexamethazone, 5 µg/ml insulin and 10 ng/ml bFGF (Ham et al.

1990; Huard et al. 1994).

In vitro intracellular transduction assays. Intracellular transduction assays were

performed in 35 mm petri dishes (Fisher) and 24 well plates (Costar). Cells treated with

eGFP, Tat-eGFP, rhodamine labeled Tat-eGFP and Tat-E7 at various concentrations were

examined directly or were quickly rinsed once during approximately 5 s in PBS after

different time intervals and fixed in 4% paraformaldehyde for 5 min, rinsed twice in PBS

and mounted in PBS/glycerol (1 for 1) under coverslips before their observation. To study

the time course of TAT-eGFP transduction into muscle cells, rhodamine-labeled Tat-eGFP

(20 µg/ml) was added to the culture medium of C2C12 cells in 96 wells plate (Corning) for

various time intervals at 37°C. Following the cell fixation with 4% paraformaldehyde and

PBS rinsing, the fluorescence was read with a cytofluorometer (Cytofluor 2350; Perseptive

Biosystems; EX, 530 nm; EM, 590 nm).

Animal studies. Animals were deeply anesthetized with 0.15 ml of ketamine/xylazine (10

mg/ml) prior to all surgeries. Intramuscular injections of recombinant proteins were

performed in 12 C57BL/10J mdx/mdx mice. Fifty microliters of Tat-eGFP or control eGFP

in 10% glycerin/PBS (500 µg/ml) were injected slowly through the skin into the belly of

the Tibialis anterior (TA) muscle along the rostrocaudal axis. U-100 0.5 cc Insulin syringes

(Becton Dickinson) were used for these injections, applying low pressure as previously

described (Caron et al. 1999).

72

The subcutaneous delivery of Tat fusion proteins was performed in 10 BALB/C mice. In

short, a pouch of highly concentrated fusion proteins was created beneath the skin, in direct

contact with the leg muscles. To do this, a very small incision was performed through the

skin above the proximal region of the TA muscle, near the knee. The skin was carefully

detached from the leg muscles using fine-tip forceps, to create a void. In some cases, the

aponeuroses (the thin membrane recovering muscles and bones) from the lower leg, was

very carefully removed using fine-tip forceps. A 50-µl volume, of Tat-eGFP or control

eGFP (800 µg/ml), was injected under the skin using a Pipetman P200 (Gilson). Animals

exhibiting significant leakage were rejected. Mice were sacrificed 16 h after treatment.

Fusion proteins were also delivered in the muscle limbs of four female BALB/C mice

using the artery route as previously described (Torrente et al. 1999). Surgical exposure of

the right iliac artery was performed by opening the abdomen followed by the peritoneal

cavity and then displacing the bowels. Injections of 200 µl rhodamine-labeled fusion

proteins in 10% glycerin/PBS (250 µg/ml) were performed in mice with a 0.20-mm-gauge

needle (Becton Dickinson) caudally inserted into the iliac artery. There was no visible

damage to the vessel wall during or after the operation. The abdomen was then sutured.

Mice were sacrificed after 2 hours. All animals were housed in microisolator cages with

sterile water and food, and maintained in accordance with the guidelines set by the

Canadian Council of Animal Care.

Muscle biopsy and histology. Mice were sacrificed by cervical dislocation after being

deeply anesthetized with 0.3 ml of ketamine/xylazine (10 mg/ml). Muscle biopsies were

dissected out and transversally oriented in cryomatrix embedding medium (Shandon) to be

immediately frozen in liquid nitrogen. Thin frozen sections (14 µm) were cut with a

cryomicrotome at -24°C , placed on gelatin-coated slides and kept frozen at -80°C. Sections

were fixed for 5 min with 4% paraformaldehyde/PBS, rinsed twice with PBS and mounted

under coverslips. Hematoxylin-eosine and alizarin red staining were performed as

previously described (Dubowitz 1985).

73

Results

We selected eGFP as a study tool because its fluorescence can only be observed when it is

correctly folded. The use of rhodamine labeled eGFP as a cargo in a Tat fusion protein

made possible the live observation of the translocation and the refolding processes. GFP

and its variants like eGFP are very resistant to denaturation. GFP is not unfolded with 8 M

urea, its denaturation requires treatment with 6 M guanidium hydrochloride at 90°C or a pH

lower than 4 or greater then 12 (Yang et al. 1996). The eGFP protein has a newly

caracterized folding structure named β-can. On the outside, 11 antiparallel β strands form a

compact cylinder, surrounding an α helix and the chromofore. The β-can protein structure

of eGFP is responsible for its resiliency to denaturation, but the N-terminal portion of Tat-

eGFP, encompassing the 6-histidine leader and Tat PTD is free and therefore not protected.

The fusion proteins used in this work (Fig. 1A) kept their fluorescence during the entire

protein purification process (Fig. 1B), producing more than 95% pure yields (Fig. 1C)

ranging from 2.5 mg/L to 6 mg/L of LB bacterial growth medium at a final concentration of

0.5 mg/ml to 2 mg/ml.

Intracellular localization and time course of Tat-eGFP transduction in cultured cell lines

Samples of the Tat-eGFP fusion protein and eGFP control were applied to C2C12

and NIH/3T3 cells at concentrations ranging from 15 to 300 µg/ml to assess their

intracellular transduction capacity on cultured mouse myoblasts and fibroblasts. When cells

were treated with Tat-eGFP at a concentration of 150 µg/ml (Fig. 2A and 2B), intracellular

green fluorescence from the refolded protein was detected in the cytoplasm starting at 14

hr, increasing progressively until approximately 24 h. C2C12 and NIH/3T3 cells treated

with Tat-eGFP concentrations in excess of 25 µg/ml consistently revealed cytoplasmic

green fluorescence, without nuclear localization. Even at the highest concentration tested

(300 µg/ml), no fluorescence was detected in cells treated with control eGFP (Fig. 2C and

2D). The rhodamine-labeled Tat-eGFP fusion protein was rapidly taken up by 100% of

74

cells (Fig. 2E and 2F), reaching a maximum intracellular concentration in nearly 30 min

(Fig. 3) in C2C12 myoblasts. Cells treated with rhodamine-labeled Tat-eGFP mainly

showed perinuclear cytoplasmic fluorescence after 24 h, without nuclear localization in the

majority of cells (Fig. 2G). Less than 1% of cells exhibited a low level nuclear rhodamine

fluorescence after 24 h. Rhodamine-labeled Tat-E7 (Lissy et al. 1998), a fusion protein that

does not resist to denaturing conditions, was applied to cells to compare with Tat-eGFP. In

contrast with Tat-eGFP, Tat-E7 localized in less than 1 h to the nucleus (Fig. 2H to 2J). No

significant toxicity was observed in all cell types studied, even when using concentrations

of Tat fusion proteins in excess of 300 µg/ml.

Intracellular transduction of Tat-eGFP cultured primary cells

To determine if Tat-eGFP could be internalized in primary cells, mouse primary

myoblast cultures, human DMD myoblasts and human skin fibroblasts were treated with

rhodamine-labeled Tat-eGFP (75 µg/ml). Cells isolated from the muscle tissue of newborn

mice were grown in conditions permitting fusion for 3 days to give rise to multinucleated

myotubes. As it was the case with C2C12 and NIH/3T3 cells, primary cells internalized

rhodamine-labeled Tat-eGFP rapidly in less than 30 min before leveling off in

approximately 4 h. Rhodamine-labeled Tat-eGFP was internalized less efficiently into

myotubes than in undifferentiated mononucleated cells (Fig. 4A and 4B). Highly

contrasted, round cells consistently showed the most intense fluorescent labeling. Cultured

human muscle cells and human skin fibroblasts can also be very efficiently transduced by a

Tat-eGFP fusion protein. Nearly 100% of DMD human myoblasts (Fig. 4C) and human

skin fibroblasts (Fig. 4D), showed internalization of rhodamine-labeled Tat-eGFP.

Tat-eGFP is found associated to the ECM following intramuscular injection

To examine the intramuscular distribution and the potential for Tat fusion protein to

be delivered to the muscle tissue, we first performed intramuscular 25 µg injections of Tat-

75

eGFP and control eGFP in TA muscles of C57BL/10J mdx/mdx mice (the mouse model of

Duchenne muscular dystrophy). Intense eGFP fluorescence inside myofibers was rapidly (5

min) detected, for both Tat-eGFP and control eGFP (results not shown). Further

investigation revealed massive extracellular calcium entry into myofibers found in the

vicinity of the injection sites as indicated by alizarin red staining, indicating that the

fluorescent myofibers at the injection sites were mechanically damaged or pressure

perfused (results not shown). After 4 h, eGFP fluorescence was partially washed out of

these mechanically damaged fibers and was mainly associated with the ECM surrounding

muscle fibers in the case of Tat-eGFP (Fig. 5A). After 18 h, myofibers in the vicinity of the

Tat-eGFP injection site still showed strong ECM associated fluorescence, while there was

total clearance from inside myofibers at the site of injection (Fig. 5B). Also, the ECM

associated fluorescence was significantly stronger in C57BL/10J mdx/mdx muscles

injected with Tat-eGFP (Fig. 5B) than in muscles injected with control eGFP (Fig. 5C).

Some muscle fibers outside damaged areas (as indicated by the lack of alizarin red staining)

in Tat-eGFP injected muscles exhibited weak intracellular fluorescence, indicating that

some muscle fibers might have been transduced by the Tat fusion protein. After two days,

eGFP fluorescence could still be observed in muscles injected with Tat-eGFP while no

fluorescence remained attached to the to ECM in control muscles injected with eGFP.

Subcutaneous and intra-arterial delivery to the muscle fibers

Light injuries, not leading to fiber necrosis, could explain the intracellular

fluorescence in some muscle fibers outside damaged areas in Tat-eGFP injected muscles.

We, thus, proceeded to deliver fusion proteins to the muscles without creating trauma.

Subcutaneous injections were performed, leading to the accumulation of liquid pockets

between the skin and the lower leg muscles (gastrocnemius, soleus and TA). Such

interventions led only to the labeling of mononucleated cells embedded into the conjunctive

tissue surrounding the leg muscles (Fig. 5D). The removal of the aponeuroses before the

subcutaneous injection was necessary to obtain fluorescently labeled muscle fibers in the

superficial layers of the TA (Fig. 5E), while myofibers from muscles treated with eGFP

showed no significant fluorescence (Fig. 5F). In some cases, several external muscle fiber

76

layers showed intracellular fluorescence (gradually decreasing toward the inside of the

muscle) after the subdermal injection of Tat-eGFP, as revealed by longitudinal cryosections

from a gastrocnemius muscle (Fig. 5G). To exclude the possibility that the microsurgery

consisting in cutting the aponeuroses could produce muscle fiber injury, leading to

mechanical perfusion, we then proceeded to inject Tat-eGFP through the right iliac artery.

Such direct delivery to the leg completely eliminated the possibility of undesired injuries to

muscle fibers of the lower leg, since the injection and the surgery took place several

centimeters away from the muscles of interest. The delivery of rhodamine-labeled Tat-

eGFP (50 µg) through the iliac artery led to a few red fluorescent myofibers locally

surrounding blood vessels (Fig. 5H) in the quadriceps and gastrocnemius.

77

Discussion

Several proteins can traverse biological membranes by protein transduction. Small regions

of proteins, 10 to 16 residues long are responsible for this phenomenon (Schwarze et al.

2000). It was previously showed that fusion proteins containing the protein transduction

domain from the HIV-1 Tat protein could transduce through the cell membrane to deliver

their cargo into the cell body (Schwarze et Dowdy 2000). After their exogenous application

to cultured cells, Tat fusion proteins purified in denaturing conditions are rapidly

internalized in a matter of minutes and are also located in the nucleus. In addition, their

refolding into the host cell makes possible the observation of in vivo biological effects

resulting from their interactions with nuclear proteins (Nagahara et al. 1998; Schwarze et

al. 2000). While previous studies were conducted using cargo proteins sensitive to

denaturation in 8 M urea, the eGFP beta-can structure of our Tat-eGFP fusion protein

resisted to the denaturing steps of our purification protocol. Intracellular transduction

assays conducted with this folded fluorescent cargo resulted in a delay in reaching

maximum intracellular levels (approximately 30 min) when compared with previous

studies using chemically synthesized Tat peptides and denatured Tat fusion proteins that all

attained their peek in less than 15 minutes (Vives et al. 1997; Nagahara et al. 1998;

Schwarze et al. 1999; Truant et Cullen 1999).

Our data, showing intracellular transduction of native Tat-eGFP in several cell

types, illustrate that a folded Tat fusion protein can decrease the efficiency and speed of the

internalization process when compared with completely denatured fusion proteins

(Nagahara et al. 1998; Schwarze et al. 1999; Truant et Cullen 1999), but that unfolding

prior to the application to cells is not necessary. The fluorescent Tat-eGFP fusion protein is

unfolded, at least partially to loose its fluorescence, during the translocation process and is

then slowly renatured in a matter of hours to reach detectable levels of fluorescence after 14

h. The apparent discrepancy between our results and those obtained by the group of

Dowdy, stating that mammalian cells appear to be unable to refold GFP into a fluorescent

conformation (Schwarze et al. 2000), might be explained by the fact that the eGFP variant

78

used in our study is 35 times more fluorescent than its parental counterpart, wild type GFP

(Cormack et al. 1996). To analyze the ability of the Tat-eGFP fusion protein to transduce

into cells prior to its intracellular refolding, it was conjugated with rhodamine and added to

C2C12, NIH/3T3 or human fibroblasts. Our experiments revealed that contrarily to PTD-5

(RRQRRTSKLMKR) (Mi et al. 2000), the NLS (RKKRRQRRR), part of Tat PTD, was not

sufficient to confer nuclear localization to eGFP following its intracellular transduction.

The absence of a nuclear localization is not entirely surprising since previous work showed

that the exogenous application of folded Tat protein did not result in nuclear localization

(Ensoli et al. 1993; Elliott et O'Hare 1997). In addition, the nuclear localization pathway

taken by the Tat protein was shown to be sensitive to the folding state of Tat. Indeed,

Bonifaci et al. showed that the pre-treatment of cells with MTX, an analogue of

methotrexate that stabilizes the three-dimensional structure of DHFR, blocked the nuclear

localization of the Tat-DHFR fusion protein (Bonifaci et al. 1995). This last case shares

striking similarities with our denaturation resistant Tat-eGFP fusion protein which is

internalized more slowly than many other proteins. Recent reports also suggested that the

Tat NLS might be part of a novel class of basic NLS that functions independently from

Importin α by binding directly to Importin β (Efthymiadis et al. 1998; Truant et Cullen

1999). The nuclear import pathway used by the exogenously added Tat protein might be

more sensitive to the folding state of the proteins to be imported than the classical Importin

α-dependent pathway.

As discussed in the introduction, previous attempts at the in vivo delivery of Tat

fusion proteins into skeletal muscle cells gave poor staining results when compared with

other well vascularized organs and mostly when compared with the intense staining

observed throughout the heart muscle (Fawell et al. 1994; Schwarze et al. 1999). Our

attempts to deliver Tat-eGFP to muscle fibers through intra-arterial and subdermal

injections were successful, but gave rise to a limited number of fibers of low level

fluorescence intensity located only in the periphery of blood vessels or at the surface of the

muscle. The number of fluorescent muscle fibers was very small (less than 1%), indicating

that the transduction of muscle fibers using intra-arterial injection of concentrated Tat

fusion proteins is possible, but not very efficient in the case of Tat-eGFP. Twenty-four

79

hours after intramuscular injections in C57BL/10J mdx/mdx mice, most of the Tat-eGFP

fluorescence was found associated to the ECM. In agreement with these results, myotubes

obtained from primary mouse myoblast cultures, ensheathed by an ECM-rich basement

membrane, failed to be transduced by Tat-eGFP as efficiently as some adjacent

mononuclear cells not imbedded beneath a basal lamina. Our data suggests that Tat PTD

shows an affinity for components of the ECM. Previous studies demonstrated that Tat

shared many characteristics with growth factors (Jeang et al. 1999) and that it is, in fact, a

heparin binding protein that interacts with heparan sulfate (HS), proteoglycans of the cell

surface and ECM (Rusnati et al. 1998). Heparin was found to bind specifically to

recombinant HIV-1 GST-Tat fusion protein, and like HS, can inhibit HIV-LTR trans-

activation induced by extracellular GST-Tat (Rusnati et al. 1997). Residues 49 to 57 of Tat,

part of our fusion protein, are responsible for its affinity to heparin/HS (Rusnati et al.

1998). Interestingly, HS-proteoglycans are abundant in the muscle tissue. The basal lamina

surrounding muscle fibers is composed of laminin, fibronectin, collagen and HS containing

proteoglycan (Sanes 1994). Clonal mouse myoblasts were shown to synthesize and secrete

collagen and other extracellular proteins and incorporate these macromolecules in an

insoluble and organized matrix (Beach et al. 1985; Rao et al. 1985). Yet, we showed that

C2C12 cells rapidly internalized Tat-eGFP. We thus hypothesize, that the association

between Tat PTD and the ECM surrounding myofibers interferes with the intracellular

transduction process in the case of Tat-eGFP or that this retention to the conjunctive tissue

diminishes its local bioavailability to the cell membrane of myofibers.

In conclusion, we have focused our efforts on the use of Tat-fusion proteins for

protein replacement therapy in muscle cells and muscle tissue. If the poor efficiency of Tat

mediated transduction in muscle fibers is due to its retention to the ECM, it would be

important to determine whether, recently designed PTDs derived from known sequences

such as, poly-arginine (Wender et al. 2000) or PTD-5 (Mi et al. 2000) also interact so

strongly with components of the ECM. Although we could not deliver Tat fusion proteins

in a high percentage of muscle fibers using none invasive techniques, our experiments

showed that Tat fusion proteins could be used to deliver proteins in human primary

cultured DMD myoblasts. This could prove to be very interesting since primary myoblasts

demonstrate a poor efficiency of transfection and infection in culture, where the goal is to

80

maximize delivery of therapeutic molecules. In addition, several ex vivo gene therapy

protocols require genetic engineering to correct a particular defect, increase the life span of

the targeted cells or overexpress a therapeutically significant gene, thus necessitating the

use of several different vectors at high dosage. Among the proteins that could be delivered

to cells, there are proteins to transiently immortalize, increase the life span or switch the

differentiation program of cells. Such tools could significantly help cell-mediated based

gene therapies.

81

Acknowledgments

We thank Dr. Steven F. Dowdy and his team for pTAT-HA, pTAT-E7 and their helpful

comments. We also thank Dr. El Bachir Affar for helpful comments on cytofluorometry

and Philippe Girard, Marlyne Goulet and Brigitte Roy for their technical assistance. This

work was supported in part by l'Association Française contre les Myopathies (AFM), the

Muscular Dystrophy Association (MDA) and a graduate research scholarship from La

Fondation de l'Université Laval (N.J.C.).

82

Figure legends

Figure 1 Schematic representation of Tat-fusion protein constructs and purification

strategy.

(A) Diagram of Tat-eGFP recombinant protein and control used for protein transduction

assays and (B) HIS-tagged recombinant protein purification procedures. Overnight bacterial

cultures of pTat-eGFP and peGFP were sonicated in 8 M urea and spun, before their

purification over a Ni-NTA column, followed by a Q Sepharose column and a gel filtration

step. (C) Yield from protein purification steps. Fluorescent fractions were analyzed by

SDS-PAGE stained with Coomassie blue. Lane 1, eGFP (34 kDa); lane 2, Tat-eGFP (35

kDa); M, molecular weight markers.

Figure 2 Intracellular delivery of Tat-eGFP in NIH/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts.

Fluorescence micrographs of NIH/3T3 treated with (A) Tat-eGFP (150 µg/ml) or (C) eGFP

(150 µg/ml) for 18 h and corresponding phase contrast images (B and D). (E and G) C2C12

treated for 4 h with rhodamine-labeled Tat-eGFP (40 µg/ml) and corresponding phase

contrast image (F). (I) NIH/3T3 treated with rhodamine-labeled Tat-E7 (15 µg/ml),

corresponding phase contast (H) and DAPI staining (J). After the treatment, cells were

rinsed quickly in PBS and fixed for 10 min in 4% paraformaldehyde before they were

mounted and examined. Bars, 50 µm.

Figure 3 Rapid uptake of rhodamine-labeled Tat-eGFP in C2C12 myoblasts.

To study the time course of TAT-eGFP transduction into cells, rhodamine-labeled Tat-

eGFP (20 µg/ml) was added to the culture medium of C2C12 cells in 96 wells plate for

83

various time intervals at 37 °C. The cells were rinsed quickly in PBS and fixed for 10

minutes in 4% paraformaldehyde and read with a cytofluorometer. The intensity is

expressed as arbitrary units, dots correspond to means and bars to standard errors of five

duplicate wells.

Figure 4 Intracellular delivery of Tat-eGFP in cultured primary cells.

Fluorescent micrographs of cells treated with 75 µg/ml rhodamine-labeled Tat-eGFP. After

4 h, cells were rinsed quickly in PBS and fixed for 10 min in 4% paraformaldehyde before

they were mounted and examined. Rhodamine fluorescence in (A) differentiated myogenic

cells isolated from newborn BALB/C mice and (B) corresponding phase contrast, (C)

proliferating DMD myoblasts isolated from a 15-year-old patient and (D) proliferating

human skin fibroblasts. Arrowheads point toward myotubes. Bars, 100 µm.

Figure 5 Intracellular localization of Tat-eGFP in myofibers and retention to the

extracellular matrix.

Fluorescence micrograph sections of TA muscles. (A) The injection site of a TA muscle of

a C57BL/10J mdx/mdx mouse injected with Tat-eGFP (25 µg) after 4 h. ECM surrounding

myofibers near the Tat-eGFP (B) injection site or control eGFP (C) after 18 h. Fluorescence

micrograph sections of whole leg muscles of BALB/C mice 18 h following the subdermal

delivery of Tat-eGFP (D, E and G) or control eGFP (F). (D) Mononuclear cells inside the

conjunctive tissue surrounding a TA muscle with intact aponeuroses. (E and F) Myofibers

from the periphery of a TA muscle (on the left) with injured aponeuroses. (G) Longitudinal

myofibers from the soleus muscle. (H) TA muscle fibers 2 h following the intra-arterial

delivery of rhodamine-labeled Tat-eGFP (50 µg). The star shows a blood vessel. Bars, 50

µm.

84

Figures

Figure 1 Schematic representation of Tat-fusion protein constructs and purification strategy.

85

Figure 2 Intracellular delivery of Tat-eGFP in NIH/3T3 fibroblasts and C2C12 myoblasts.

86

Figure 3 Rapid uptake of rhodamine-labeled Tat-eGFP in C2C12 myoblasts.

87

Figure 4

Figure 4 Intracellular delivery of Tat-eGFP in cultured primary cells.

88

Figure 5 Intracellular localization of Tat-eGFP in myofibers and retention to the extracellular matrix.

89

Chapitre 3:

La déstabilisation des endosomes augmente l'accès fonctionnel des protéines de fusion Tat au noyau

Nicolas J. Caron, Simon P. Quenneville and Jacques P. Tremblay*

Contribution de chaque auteur:

J’ai effectué le travail dans son entier et j’ai rédigé l’article. Simon Quenneville m’a assisté

dans les manipulations liées à la Fig.2. Jacques P. Tremblay a supervisé mes travaux.

(publié dans Biochemical and Biophysical Research Communications en Juin 2004)

90

Résumé La protéine Tat de VIH-1 peut transporter des cargos protéiques biologiquement actifs in

vivo et suscite beaucoup d’intérêts pour les thérapies protéiques. Le mécanisme

responsable de l’internalisation des protéines de fusion Tat est mal connu et controversé. La

distribution intracellulaire ponctuée, la cinétique d’internalisation et la sensibilité aux

basses températures, que nous avons observées, sont cohérentes avec un mécanisme

d’endocytose. Après quelques heures, les protéines de fusion Tat s’accumulent autour du

noyau, sans qu’on les retrouve à l’intérieur. En utilisant un essai fonctionnel basé sur le

système CRE/Lox, des agents lysosomotropiques connus pour déstabiliser les endosomes,

ont augmenté jusqu’à 23 fois l’efficacité du transport au noyau des protéines de fusion Tat-

CRE recombinase sans augmenter leur entrée dans les cellules. Ceci démontre que la

déstabilisation des endosomes peut augmenter de façon significative l’accès des cargos au

cytosol et au noyau. De plus, nous avons observé que les protéines de fusion Tat, pouvaient

persister pendant plusieurs heures dans les cellules ciblées, et que des inhibiteurs de

l’acidification des lysosomes n’avaient aucun effet sur l’efficacité du transport jusqu’au

noyau. Ceci suggère que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale, pour

ensuite contourner la dégradation dans les lysosomes, mais qu’elles sont ensuite

séquestrées en périphérie du noyau. Nos travaux indiquent qu’un trafic intracellulaire

inadéquat est le principal facteur limitant l’efficacité de l’internalisation fonctionnelle des

cargos fusionnés au domaine de transduction de Tat.

91

Endosome disruption enhances the functional nuclear delivery of Tat-fusion proteins

Nicolas J. Caron, Simon P. Quenneville and Jacques P. Tremblay*

Human Genetic Research Unit, Laval University Hospital Center, Quebec City, Canada

*corresponding author:

Jacques P. Tremblay, Ph.D Laboratoire de Génétique humaine (RC-9300) Centre de recherche du CHUL 2705, boul. Laurier Ste-Foy, (Qc), Canada, G1V 4G2 Phone: (418) 654-2186 Fax: (418) 654-2207 E-mail: jacques-p.tremblay@crchul.ulaval.ca

(published in Biochemical and Biophysical Research Communications, June 2004)

92

Abstract

Tat protein from human immunodeficiency virus (HIV-1) can deliver biologically

active proteins in vivo and is of considerable interest for protein therapeutics. The

mechanism responsible for Tat-fusion protein internalization is still poorly understood and

controversial. The punctuate distribution, timing and temperature sensitivity observed in

our experiments with Tat-fusion-proteins are consistent with endocytosis. After a few

hours, Tat-fusion proteins accumulated around the nucleus without any significant visible

nuclear targeting. Using a Cre/Lox based functional assay, lysosomotropic agents known to

disrupt endosome integrity, increased by up to 23-fold the nuclear delivery of functional

Tat-Cre recombinase without increasing cell uptake in a similar fashion. This shows that

endosome disruption can significantly increase Tat-fusion protein access to the cytosol and

nucleus. In addition, we found that internalized Tat-fusion proteins persisted several hours

and that inhibitors of lysosome acidification did not increase functional nuclear delivery of

Tat-Cre. This suggests that Tat-fusion proteins enter via the endosomal pathway,

circumvent lysosomal degradation and are then sequestered in the periphery of the nucleus.

Most importantly, our work indicates that an inadequate intracellular trafficking is the main

factor limiting the efficiency of protein cargo delivery using Tat.

Keywords: Tat, Endocytosis, Uptake, Transduction, Cre recombinase, Lysosomotropic

agents, Perinuclear accumulation, Chloroquine

93

Introduction

The Tat protein from HIV-1 was shown to be taken up by cells when added

exogenously and to trans-activate the HIV-1 LTR promoter in the nucleus. Full-length

proteins can also be delivered inside cells or tissues when conjugated or expressed in fusion

with the basic domain of Tat (Fawell et al. 1994; Schwarze et al. 1999). The basic domain

(RKKRRQRRR) extending from residues 49 to 57 is generally considered to be the

minimal sequence responsible for the internalization. Since the early 90s, other small

regions of proteins such VP-22 (Elliott et O'Hare 1997), ANTP (Joliot et al. 1991) and

Kaposi FGF (Hawiger 1999) or arginine/lysine-rich peptides (Mai et al. 2002) were shown

to enter cells to carry diverse bio-molecules in the cytoplasm and the nucleus. The

underlying mechanism of cellular internalization and intracellular trafficking of cell-

penetrating-peptides (CPPs) remains misunderstood (Silhol et al. 2002).

An early study concluded that the full-length Tat protein entered cells via adsorptive

endocytosis (Mann et Frankel 1991). Since the observed uptake of CPPs is relatively cell-

type independent and not completely inhibited at 4°C, these CPPs were first called "protein

transduction domains" (PTDs) and assumed to be internalized using a novel and unknown

mechanism involving translocation through the cell membrane (Hawiger 1999; Schwarze et

al. 2000). Recently, controversy has spurred when groups showed that fixation could lead

to artifactual uptake and nuclear localization of Tat, arginine-rich peptides (Richard et al.

2003) or VP-22 fusion proteins (Lundberg et Johansson 2001). Interestingly, the

exogenously added Tat-eGFP fusion protein accumulated outside the nucleus, whereas the

same fusion protein expressed using a transfection system had a nucleolar localization

(Caron et al. 2001; Yang et al. 2002b). Tat peptide internalization was not abolished at 4°C,

while the uptake of Tat-GST-eGFP was totally inhibited (Silhol et al. 2002).

94

Although several full-length Tat-fusion proteins (TFPs) can be internalized in

cultured cells following their addition in the culture medium, it is often assumed that they

are internalized in the same manner as short CPPs using an unknown

receptor/endosome/energy-independent mechanism. However more recently, TFPs were

shown to be internalized by the cells through a temperature-dependent endocytic pathway

that follows caveolar endocytosis (Fittipaldi et al. 2003). In this study, we sought to

reexamine the contribution of the endocytic pathway in Tat-fusion protein internalization

and to better understand the events implicated in the intracellular trafficking. To do so, we

monitored the subcellular localization of a variety of TFPs using fluorescence microscopy

against markers relevant to targeted cell compartments. Also, using a novel reporter system

based on the in vivo quantification of functional nuclear Cre recombinase, we tested the

effects of compounds known to destabilize endosome integrity and acidification or block

protein degradation, to better assess the factors influencing the fate of internalized proteins.

95

Materials and methods

Constructs and protein purification The pTat-eGFP.4 expression vector was

constructed by inserting eGFP from pIRES-eGFP (Clontech) in pTat vector (from Dr. S. F.

Dowdy) to produce an in frame fusion protein (Caron et al. 2001). The pTat vector contains

a 6-histidine leader followed by the PTD of Tat and a polylinker (Schwarze et al. 1999).

The plasmid pTat-Myc was obtained by PCR amplification from pcDNA-Myc (from Dr. D.

Jung). The pTat-βGal plasmid was obtained through cohesive (KpnI-BstBI) ligation of the

LacZ gene from pEF6/V5-His-Topo/LacZ (Invitrogen) in pTat. Negative control pβGal.1

was generated by BamHI digestion excising the Tat peptide from pTat-βGal. SSR 69 is a

polycistronic retroviral vector that contains the hygro-tk fusion and the SV40T antigen

flanked by LoxP sites and followed by neo (Westerman et Leboulch 1996). The pTriEx-

HTNC plasmid coding for a 6xHis-Tat/PTD-SV40/NLS-Cre (HTNC) fusion protein (from

Dr. F. Edenhofer) (Peitz et al. 2002). The HTNC, Tat-Myc Tat-β-Gal and β-Gal (Peitz et al.

2002) and Tat-eGFP (Caron et al. 2001) fusion proteins were purified as previously

described. In short, BL21 Plus RL (Stratagene) bacteria transformed with proper construct

were inoculated in LB medium, grown at 37°C to reach 0.8 OD595nm and induced using 0.5

mM IPTG for 3 h. Cells were spun down and sonicated in buffer A (100 mM Hepes pH 8.0,

300 mM NaCl, 10 mM imidazole) and centrifugation cleared cell lysates were loaded on a

Ni-NTA agarose (Qiagen). Afterwards, the resin was washed twice in buffer A +20 mM

imidazole and eluted in buffer A +250 mM imidazole. The eluate was dialyzed against 50

mM NaH2PO4, 5 mM TRIS, 450 mM NaCl, 5% glycerol overnight at 4°C. Rhodamine

labeling and gel filtration were conducted as previously described (Caron et al. 2001).

Purified fusion protein concentrations were determined by Coomassie Blue staining of

SDS-PAGE compared to BSA standards.

Cell culture NIH 3T3, NIH SSR and Psi2 (ecotropic retrovirus producing cell line)

were grown in DMEM HG medium supplemented with 10% Newborn Calf Serum, 10 000

96

U/ml penicillin/streptomycin in 5% CO2 at 37°C. Psi2 SSR 69 are Psi2 cells stably

transfected with the SSR 69 construct using Metafectene lipofectant (Wisent) and selected

for 21 days in a culture medium containing 400 µg/ml hygromycin B (Roche). The NIH

SSR cell line was established by infecting NIH 3T3 cells with Psi2 SSR 69 supernatant

with 8 µg/ml polybrene and selecting with 400 µg/ml hygromycin for 21 days. DTT

(DMD-TAg-hTERT) were derived from the myoblasts of a Duchenne Muscular Dystrophy

(DMD) patient and were proliferated in MCDB120 as previously described (Seigneurin-

Venin et al. 2000b).

Functional nuclear Cre recombinase assay Prior to treatment, NIH SSR were

seeded at 10 000 cells per well in 24-well plates (Corning). After 24 h, cells were washed

twice in HBSS before they were co-incubated in serum-free DMEM HG containing HTNC

for 1 h. Cells were co-incubated with chloroquine (Sigma), sucrose (Lab Mat), bafilomycin

A1 (Sigma), concanamycin A (Sigma) or MG 132 (Calbiochem) in some experiments. The

incubation mix was removed and cells were then proliferated overnight in complete

medium. 24 h later, treated NIH SSR cells were trypsinized and plated 1:2 or 1:4 in T-25

flasks in complete medium containing 800 µg/ml G418. Cells were grown until distinct

colonies appeared (9 days). Cells were rinsed twice in HBSS, then colored with Coomassie

blue and colonies were counted.

Immunoblotting After rinsing 3 times with PBS, cells were recovered directly from

culture dishes by adding sample buffer (50 mM TRIS pH 6.8, 2% SDS, 0,1% Bromophenol

Blue, 10% Glycerol) and were then frozen at –20°C immediately until analysis. Sample

protein concentration was established using protein dot densitometry stained with amido

black 10B curved fitted against a BSA standard curve (Chapdelaine et al. 2001). Samples

were subjected to 10% SDS-PAGE electrophoresis and transferred on Trans-blot

nitrocellulose membrane (Bio-Rad). Membranes were washed once in water and then

blocked in PBS containing 10% dried milk for 1 h at room temperature. Membranes were

blotted with an anti-polyhistidine mouse antibody (Amersham Biosciences) or an anti-Cre

97

rabbit antibody (Novagen) according to the manufacturer’s protocol in PBS containing 10%

dried skim milk. Membranes were washed 3 times in PBS containing 0.05% Tween 20

between each step. Afterward, they were blotted with an appropriate secondary HRP-

conjugated antibody (Dako Diagnostics) and later visualized with Western Lightning

Chemoluminescent Plus (Perkin Elmer) and Hyperfilm ECL films (Amersham Biosciences)

according to the manufacturer’s protocol. Images were digitized with a Nikon CoolPix

4500 camera. Spot densitometry of the 45 kDa HTNC band was performed using NIH

Image 1.62.

In vitro intracellular internalization assays Intracellular delivery assays were

performed in 8-well Lab-Tek chamber slides (Nalge Nunc Int.) or with cells adhered on a

glass coverslip in a 35 mm dish. For fluorescence microscopy analysis, cells were treated

with rhodamine-labeled proteins for 2 h (unless stated otherwise) at indicated

concentrations. Cells were then kept in complete medium for the remainder of the

experiment, washed three times in HBSS before they were fixed in 4% paraformaldehyde

in PBS for 10 min, rinsed once in PBS, stained with 100 ng/ml DAPI for 2 min, rinsed

twice in PBS and mounted under PBS/glycerol (1:1) for observation. Phase contrast and

fluorescence images were digitized with a Nikon CoolPix 4500 camera mounted on a Zeiss

Axiophot microscope at 100X and 200 X magnifications.

Statistical methodology Statistical analysis of the data was performed using

analysis of variance (ANOVA) test and P<0.05 was selected as significant threshold. Data

was drawn as mean ± SD for each time point or concentration.

98

Results

Tat-fusion protein uptake is temperature sensitive and does not lead to rapid nuclear

accumulation.

Recently, it was shown that incubation at 4°C strongly inhibited uptake of Tat-

fusion proteins (TFPs), suggesting that unlike short cationic peptides, full-length protein

internalization requires energy (Silhol et al. 2002). In order to assess the participation of the

endosomal pathway in TFP internalization, we first evaluated the effects of low

temperatures on protein uptake in NIH SSR mouse fibroblasts. As shown previously by our

group and others, uptake occurs in nearly 100% of cells treated with TFPs even at relatively

low concentrations (Schwarze et al. 1999; Caron et al. 2001). When applied on cells at 4°C,

the detection of Tat-β-Gal is reduced to a level comparable to the β-Gal control (Fig 1A).

Because mild fixation procedures, such as glutaraldehyde fixation, can lead to artifactual

cellular uptake of highly charged peptides (Lundberg et Johansson 2001; Richard et al.

2003), we examined TFP internalization using fluorescence microscopy. Incubation at 4°C

also resulted in a strong inhibition when the uptake was examined using rhodamine-labeled

Tat-β-Gal, illustrating even more clearly that the uptake of TFPs is reduced at low

temperatures. In contrast to enzymatic detection, when the uptake of TFPs was followed by

fluorescence microscopy, there was no detectable binding of the fluorescently labeled

proteins to the external cell surface at 4°C (Fig. 1B).

To examine the kinetics of TFP internalization, cells were incubated with

rhodamine-labeled Tat-eGFP for times varying from 10 to 60 min (Fig 1C). Fluorescence

microscopy clearly indicated that in contrast to short Tat peptides that rapidly accumulated

in the nucleus (Vives et al. 1997), full-length TFPs were not rapidly internalized in the

cytosol and nucleus. After 10 min, Tat-eGFP generally localized to the cell surface. After

30 min, Tat-eGFP further proceeded inside the cell clearly demonstrating a punctuate

appearance, indicative of localization in transport vesicles like endosomes or lysosomes.

99

After 60 min, Tat-eGFP started accumulating around the nucleus. Interestingly, even if the

TFPs used in this study contained the strong nuclear localization signal of Tat; none were

detected in the nucleus using fluorescence microscopy.

TAT-fusion proteins accumulate in the perinuclear region

To better characterize the final subcellular localization of TFPs, NIH SSR

fibroblasts were pulse treated for 2 h with rhodamine-labeled Tat-β-Gal or Tat-eGFP,

rinsed and then proliferated for 4 h in regular culture medium. Rhodamine-labeled Tat-β-

Gal and Tat-eGFP accumulated in the periphery of the nucleus (Fig.2A). Since some

endocytic pathways are known to target the ER and Golgi (Le et Nabi 2003), we sought to

establish if TFPs co-localized with these compartments. The cell region where TFPs

accumulated was stained by concanavalin A (con A), a lectin that recognizes sugars

commonly found in the ER and Golgi. While conA and TFPs were detected in the same

general intracellular region, they did not co-localize. Perinuclear accumulation was not

restricted to Tat-eGFP and Tat-β-Gal (Fig. 2A). Tat-Myc and Tat-Cre, a fusion protein

further investigated below, also accumulated around the nucleus (Fig. 2B). This was also

the case for Tat-eGFP in human myoblasts (Fig 2B). In our hands, all TFPs showed

perinuclear accumulation, without any significant visible nuclear targeting in all

investigated cell types, showing that this phenomenon is not restricted to mouse fibroblasts.

These results confirm previous work with Tat-eGFP indicating that internalized TFPs

demonstrate an intracellular distribution different from what is observed with similar

constructs expressed through transfection (Yang et al. 2002b).

Functional nuclear Cre recombinase assay

If TFPs proceed through the endosomal pathway to be later directed to a

compartment where they are degraded or sequestered, promoting endosomal release and

access to the cytosol should theoretically increase functional nuclear delivery. To exclude

potential artifacts in our study, we have designed an assay based on the detection of the

100

biological activity of the Cre recombinase in the nucleus. When added exogenously to

cultured cells, the native Cre protein from Bacteriophage P1 is internalized and performs

site specific recombination of DNA between LoxP sites (Will et al. 2002). Fusion of Cre to

PTDs such as the leader sequence from Kaposi FGF-4 (Jo et al. 2001) or the Tat peptide

(Peitz et al. 2002) can greatly enhance its cellular uptake and subsequent recombination. A

target cell line (NIH SSR) was generated by infection with SSR 69 (Westerman et

Leboulch 1996), a retroviral vector yielding G418 resistance following LoxP recombination

in the presence of Cre recombinase (Fig. 3A). When treated with a Tat-Cre fusion protein

(HTNC), NIH SSR cells undergo LoxP specific recombination. After selection with G418,

resistant colonies are generated and can be counted to evaluate the efficacy of the treatment

(Fig. 3A). NIH SSR cells were exposed to increasing concentrations of HTNC and

subjected to functional nuclear Cre assay. The quantification of neomycin resistant colonies

shows concentration-dependant increase relative to the HTNC added in the culture medium

(Fig.3B). This shows that our method can detect relatively small variations in the amounts

of biologically active HTNC delivered into the nucleus of the targeted cells.

Endosome-disrupting compounds dramatically increase functional nuclear delivery

We tested compounds known to increase the delivery of macromolecules, like

DNA, that enter cells via the endosomes. Chloroquine is a lysosomotropic agent thought to

have a buffering capacity preventing endosomal acidification. In addition, it can lead to

swelling and bursting of the endosomes and was shown to enhance DNA transfection

(Mellman et al. 1986; Erbacher et al. 1996; Ciftci et Levy 2001). When target cells were

co-incubated with 500 nM HTNC and 200 µM chloroquine, genomic recombination was

increased up to 23-fold in NIH SSR fibroblasts (Fig. 4A). Sucrose was also tested because

mammalian cells, in general, lack the intracellular dissaccharidase enzyme for metabolizing

sucrose. Adding sucrose to the cell culture medium has thus been noted to cause

intracellular cytoplasmic swelling within endosomes (Kato et al. 1984) and was used

previously to enhance plasmid DNA transfection efficiency in fibroblasts (Ciftci et Levy

2001). Indeed, sucrose co-incubation with HTNC resulted in up to 18-fold increased

101

recombination efficiency in NIH SSR (Fig. 4B) submitted to functional nuclear Cre

recombinase assay.

Increased functional nuclear delivery induced by lysosomotropic agents is not the result of

increased uptake

Membrane permeation or glycoprotein over-expression resulting in increased uptake

could have been responsible for the increased LoxP recombination measured when co-

incubating HTNC respectively with chloroquine or sucrose. To demonstrate that the

increased functional nuclear delivery of HTNC was caused by endosome disruption and

subsequent intracellular trafficking modifications and not by an increased cell uptake, we

examined the internalization of HTNC in cells co-incubated with a lysosomotropic agent.

We quantified the effects of chloroquine and sucrose on cell uptake, using an antibody

directed against the poly-His Tag, part of the HTNC fusion protein. Chloroquine treatment

did not significantly increase HTNC internalization as measured in total proteins recovered

from treated cells (Fig. 5A and 5C). Far from increasing HTNC uptake, sucrose co-

treatment resulted in significant decreases in HTNC immunodetection (Fig. 5B and 5D).

Most strikingly, co-treatment with 500 mM sucrose that increased 18-fold the functional

nuclear delivery of HTNC, decreased by 9-fold the levels of HTNC uptake. These results

clearly show that treatment with chloroquine or sucrose led to strong increases in LoxP

recombination due to a modification in intracellular trafficking and not increased cell

uptake.

Once internalized, the HTNC fusion protein is not rapidly degraded in lysosomes

The perinuclear accumulation observed in fluorescence microscopy 4 h post-

incubation could possibly have resulted from the recycling of labeled-amino acids in the

ER for neosynthesis following the rapid degradation by lysosomal enzymes or the

proteasome complex. The effects of chloroquine are not restricted to its buffering capacity

and thus interfere with intracellular transport beyond lysosomal enzyme degradation. To

102

evaluate more specifically the influence of lysosomal enzymes on internalized proteins, we

tested the effects of inhibitors of vacuolar H+-ATPases, bafilomycin A1 (BFLA) and

concanamycin A (CCM) (Ouar et al. 2003) on the functional delivery of HTNC to the

nucleus in NIH SSR cells. These inhibitors of lysosomal acidification, which do not result

in transport vesicle swelling, did not increase the functional HTNC delivery to the nucleus

(Fig. 6A and 6B).

While lysosomal enzymes did not seem to be significantly involved in HTNC

degradation, we wanted to confirm that internalized proteins persisted inside cells long

enough to be shipped to a proper compartment. We evaluated the apparent degradation of

the internalized HTNC using immunodetection. Immunoblotting against an epitope of the

Cre protein shows a slow decrease in intracellular Cre (Fig. 7). Nonetheless, more than 50

% of the internalized HTNC still remains intact after 8 h.

Proteasome inhibitor MG 132 increases HTNC functional nuclear delivery

The degradation of internalized TFPs by the proteasome complex could be

responsible for limited access to the nucleus and the decrease in the intracellular content of

HTNC and Tat-β-GAL after the uptake. To examine whether TFPs were degraded by the

proteasome, NIH SSR cells were co-treated with HTNC and increasing amounts of MG

132 and then subjected to functional Cre nuclear delivery. MG 132 is a potent, reversible,

and cell-permeable proteasome inhibitor targeting the chemotrypsin-like activity of the

proteasome (Tsubuki et al. 1996). As shown in figure 8, HTNC functional nuclear delivery

was increased respectively by 48% and 56% using MG 132 concentrations of 5 µM and 10

µM. At a higher dose, MG 132 showed some toxicity resulting in decreased recombination

efficiency.

103

Discussion

In this study, we have investigated the events implicated in the intracellular

transport of Tat-fusion proteins (TFPs) using a novel reporter system based on the detection

of the functional nuclear delivery of a Tat-Cre fusion protein. Our results showed that the

endosomal pathway plays a major role in the process of TFP internalization. TFPs

demonstrated a punctuate and temperature sensitive internalization. TFPs slowly

accumulated around the nucleus, not inside. Mild fixation procedure (0.25%

glutaraldehyde) imposed by β-Gal enzymatic detection led to a higher background in β-Gal

controls and to an apparently faint nuclear localization, which was never detected using

fluorescent detection. We attribute this discrepancy to the mild fixation procedure used in

this experiment that can lead to artifactual nuclear uptake of highly charged peptides

(Lundberg et Johansson 2001; Richard et al. 2003). Co-treatment with molecules known to

disrupt endosomal integrity (chloroquine or sucrose) caused large increases in functional

delivery of HTNC to the nucleus. Chloroquine treatment was previously reported to inhibit

endosomal acidification leading to a reduction in endosome delivery to lysosomes

(Mellman et al. 1986) and to cause membrane disruption (Erbacher et al. 1996). However,

the co-treatment with inhibitors of endosome/lysosome acidification did not increase LoxP

recombination efficiency, suggesting that vesicles containing TFPs did not fuse with

lysosomes or that the neutralization of endocytic vesicles is not sufficient. When cells were

co-incubated with rhodamine-labeled TFPs and lysosomotropic agents, there was no

apparent increase in the fluorescent labeling of the nuclei (results not shown). This

indicates that only a small proportion of delivered proteins can escape endosomes, even in

cells treated with lysosomotropic agents. This small amount of proteins is nevertheless

sufficient to produce a detectable recombinase activity. This capacity to evade endocytic

vesicles could be the result of the amphipathic helix structure found in the basic domain of

Tat.

104

These observations bring us to reconsider the main factors limiting direct protein

delivery using cationic peptides such as the basic domain from Tat. While most groups

have been developing means to increase the intracellular uptake (Ho et al. 2001; Mai et al.

2002), our data suggests that an inadequate intracellular trafficking of TFPs, resulting in

perinuclear sequestration, is the major factor limiting functional delivery. We can not

exclude the possibility that proteolysis played a role in the limited access of Tat fusion

proteins to the nucleus, since inhibitors of the proteasome did produce small increases in

LoxP recombination efficiency. As shown in figure 8 using anti-Cre immunoblotting,

internalized HTNC is degraded slowly by the cell, more than 50 % remaining after 8 h.

Therefore, perinuclear accumulation could not result exclusively from the recycling of

labeled amino acids through neosynthesis in the ER. Inhibitors of vacuolar H+-ATPases

produced no effect on functional nuclear delivery of HTNC, while proteasome inhibitor

MG 132 resulted in limited increases compared to endosome disrupting agents. We cannot,

however, exclude the possibility that the perinuclear accumulation is also responsible for

the absence of a rapid degradation. The small proportion TFPs that escape endocytic

vesicles, with or without help from disrupting molecules, could be more accessible to the

proteolytic machinery. In consequence, it would be interesting to test the synergistic effects

of chloroquine in combination with MG 132.

TFPs can bind to many cell types by associating non-specifically to sulfated-

membrane-bound glycoproteins (Tyagi et al. 2001). Our results confirm that TFPs purified

from bacteria, unlike small cationic peptides, enter cells via the endosomal pathway.

Endocytic vesicles containing TFPs mainly follow the caveolar endocytosis pathway

(Fittipaldi et al. 2003) or the lipid raft macropinocytosis pathway (Wadia et al. 2004). They

are then mainly segregated in the surroundings of the nucleus, where they are non-

functional. Only a very small proportion of internalized TFPs can reach the nucleus. While

the general localization of internalized TFPs is consistent with the ER or Golgi, and would

be a logical outcome for proteins entering using the caveolar endocytic pathway (Le et Nabi

2003) the exact compartmentalization is still uncertain. Indeed in accordance with recent

observations (Fittipaldi et al. 2003), and although TFPs generally accumulate in structures

105

resembling the ER/Golgi, we can not rigorously co-localize TFPs with markers of those

compartments. Interestingly, the cholera toxin (CTX) and ricin localize to the ER/Golgi and

are internalized via the clathrin-independent/caveolae-mediated endocytic pathway (Le et

Nabi 2003). In fact, CTX which possesses the ability to be internalized in cells is directed

to the Golgi through caveolae/raft-dependent endocytosis. It is still unclear whether this

perinuclear sequestration of TFPs is due to their internalization pathway or if this

phenomenon is restricted to proteins produced in bacteria being recognized as misfolded.

Internalized TFPs might be sorted back to follow a path that is analogous to the

retrotranslocation process imposed by the quality control mechanism to aggregated or

misfolded proteins directed to the ER or TGN for degradation or refolding (Chapman et

Munro 1994). Perinuclear accumulation is not uncommon with fusion proteins. It is often

observed in the case of over-expressed or misfolded recombinant proteins (Cudna et

Dickson 2003).

The punctuate fluorescence observed following the application of TFPs and the

stimulating effects of lysosomotropic agents on their efficient nuclear delivery

unquestionably point toward endocytosis. It was previously demonstrated that the basic

domain of the Tat protein could not bind to negatively charged membrane glycoproteins as

efficiently as polylysines or polyarginines (Mai et al. 2002). The properties exhibited by the

basic domain of Tat could extend beyond binding to sulfated proteoglycans. While TFPs

can not translocate across the cell membrane like small peptides, the Tat peptide may

confer some endosomolysis capacities resulting from the charge distribution found in its

helix (Ho et al. 2001). We therefore postulate that the unexpected efficiency reported in the

literature in recent years, with which the basic domain from Tat can internalized large

active cargos inside cells, does not result from a new membrane-translocating mechanism.

It is most probably the result of the multitasking nature of the Tat basic domain (strongly

cationic, amphipathic helix and nuclear localization signal). Our hypothesis, far from

disqualifying the basic domain of Tat as an instrument to perform the internalization of

active cargos in cells, suggests that its properties could be enhanced to optimize active

intracellular delivery.

106

Acknowledgements

We thank Dr. S.F. Dowdy for pTat, Dr. D. Jung for pcDNA-Myc, Dr. F. Edenhofer

pTriEx-HTNC, Dr. K Westerman for SSR 69, Dr R. Faure, P. Chapdelaine for helpful

discussions. This work was supported by the Canadian Institutes of Health Research. N.J.

Caron received a graduate scholarship from the CIHR.

107

Figure legends

Figure 1. Effects of incubation at 4°C and early intracellular distribution of Tat-fusion

proteins.

(A) Phase contrast microscopy analysis of Tat-β-Gal uptake and influence of low

temperature on the internalization process. NIH SSR fibroblasts were treated with Tat-β-

Gal or β-Gal (250 nM) for 2 h in complete medium, rinsed 3 times, fixed in glutaraldehyde

and stained with X-Gal. (B) Fluorescence microscopy analysis of NIH SSR treated with

rhodamine-labeled Tat-β-Gal or rhodamine-labeled β-Gal (500 nM) for 2 h in complete

medium, rinsed 3 times, fixed in 4% paraformaldehyde and stained with DAPI. (C)

Fluorescence microscopy analysis of the early subcellular localization of Tat-eGFP in NIH

SSR. NIH SSR treated with rhodamine-labeled Tat-eGFP (150 µg/ml) at 37°C for 10, 30

and 60 min, paraformaldehyde fixed and stained with DAPI.

Figure 2. Subcellular localization of Tat-fusion proteins.

(A) Fluorescence microscopy analysis of NIH SSR fibroblasts pulse treated with

rhodamine-labeled proteins Tat-β-Gal or Tat-eGFP (50 µg/ml) for 2 h. After a 4 h

incubation in complete medium, they were fixed, labeled with concanavalin A-FITC (50

µg/ml) and stained with DAPI. The lectin conA recognizes glycoproteins and core

oligosaccharides commonly found in the endoplasmic reticulum and Golgi. (B) Perinuclear

accumulation of Tat-Myc and TAT-Cre in fibroblasts and Tat-eGFP in myoblasts. Same

experiment as in A, using rhodamine-labeled Tat-Myc, Tat-Cre in NIH SSR fibroblasts and

rhodamine-labeled Tat-eGFP in DTT myoblasts.

108

Figure 3. Functional nuclear Cre assay.

(A) Schematic representation of functional nuclear Cre assay and dose dependent increase

in G418 resistant CFU generated by exogenously added HTNC to NIH SSR cells. (B)

Concentration-dependant HTNC functional delivery in NIH SSR fibroblasts. Cells were

treated with increasing concentrations of HTNC for 1 h in serum-free conditions and then

subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay. Resistant colonies were stained

and then counted. Fold increase was measured using the mean CFU of each group against

the control (0.25 µM HTNC). Each column represents the mean ± SD of duplicates.

Figure 4. Effects of lysosomotropic agents known to promote endosomal release on the

functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC).

Dose dependence of the increase of genomic DNA recombination mediated by exogenously

added HTNC in cells by lysosomotropic agents: chloroquine (A) or sucrose (B). NIH SSR

fibroblasts were rinsed in HBSS once and then co-treated with 0.5 µΜ HTNC and one of

the lysosomotropic agents, chloroquine (0-400 µM) or sucrose (0-500 mM), in serum free

culture medium for 45 min and subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay.

Fold increase was measured using the mean CFU of each group against the control

(concentration = 0). Each column represents the mean ± SD of duplicates.

Figure 5. Effects of lysosomotropic agents on the Tat-Cre fusion protein (HTNC) uptake

and binding to NIH SSR.

NIH SSR fibroblasts were co-incubated for 1 h with 0.5 µM HTNC and concentrations of 0

to 500 µM chloroquine (A, B) or 0 to 500 mM sucrose (C, D) in serum-free DMEM. Cells

were proliferated for 1 h and then rinsed three times in HBSS before recuperation in Protein

sample buffer. In (A, C) immunoblot analysis cell lysates using an anti-polyhistidine

antibody. Results of band densitometry are illustrated in (B, D). Each measurement is

expressed as a percentage of relative densitometry compared to the untreated control

109

(defined as 100%). Each column represents the mean ± SD of two readings per sample

from duplicates. Asterisks indicate significance level (P-value < 0.05) attained in

comparison to the control group (concentration = 0).

Figure 6. Effects of vacuolar H+-ATPase inhibitors, BFLA and CCM, on the functional

nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC) in NIH SSR.

Cells were pre-treated for 2 h with increasing concentrations of BFLA or CCM (0-200 nM)

in complete DMEM. Cells were then co-incubated in 1 µM HTNC with BFLA or with

CCM (0-200 nM) in serum-free medium and then subjected to the functional nuclear Cre

recombinase assay. Fold increase was measured using the mean CFU of each group against

the control (concentration = 0). Each column represents the mean ± SD of duplicates.

Figure 7. Tat-Cre fusion protein (HTNC) stability following internalization.

(A) Immunoblot analysis of the intracellular stability of the HTNC internalized by NIH

SSR cells. Cells were pulse-treated with 1 µM HTNC in serum-free DMEM for 1 h before

cells were rinsed and proliferated in HTNC-free culture medium for different amounts of

time. After proliferation, cells were directly harvested in protein sample buffer. Cell lysates

were analyzed by immunoblotting using an anti-Cre antibody. (B) Results of band

densitometry are expressed as percentage of the relative densitometry compared to the time

0 control (defined as 100%). Each column represents the mean ± SD of duplicates from

three separate experiments. Asterisks indicate significance level (P-value < 0.05) attained in

comparison to the control group (Time = 0).

110

Figure 8. Effects of the proteasome inhibitor MG 132 on the functional nuclear delivery of

HTNC.

NIH SSR cells were submitted to functional nuclear Cre recombinase assay in the presence

of MG 132. Cells were pulse treated with 1 µM Tat-Cre (HTNC) and increasing amounts

of MG 132 (0 to 100 µM) in serum-free DMEM HG for 1 h. Cells were then washed in

HBSS, submitted to an additional treatment of MG 132 (0 to 100 µM) in complete medium

for 3 h and then submitted to functional nuclear Cre recombinase assay. Fold increase was

measured using the mean CFU of each group against the control (concentration = 0). Each

column represents the mean ± SD of triplicates.

111

Figures

Figure 1 Effects of incubation at 4°C and early intracellular distribution of Tat-fusion proteins.

112

Figure 2 Subcellular localization of Tat-fusion proteins.

113

Figure 3 Functional nuclear Cre assay.

114

Figure 4 Effects of lysosomotropic agents known to promote endosomal release on the

functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC).

115

Figure 5 Effects of lysosomotropic agents on the Tat-Cre fusion protein (HTNC) uptake and binding to NIH SSR.

116

Figure 6 Effects of vacuolar H+-ATPase inhibitors, BFLA and CCM, on the functional nuclear delivery of Tat-Cre fusion protein (HTNC) in NIH SSR.

117

Figure 7 Tat-Cre fusion protein (HTNC) stability following internalization.

118

Figure 8 Effects of the proteasome inhibitor MG 132 on the functional nuclear delivery of HTNC.

119

Chapitre 4:

Immortalisation réversible de myoblastes humains par la transduction d'une protéine de fusion Tat-Cre recombinase

Nicolas J. Caron, Marie-Eve Ducharme, Philippe Mills, Simon P. Quenneville and Jacques

P. Tremblay

Contribution de chaque auteur:

J’ai effectué le travail dans son entier à l'exception de la culture cellulaire humaine menant

à la lignée cellulaire HPM 45 par Marie-Ève Ducharme. J’ai rédigé l’article, Simon

Quenneville et Philippe Mills m’ont assisté dans la culture cellulaire. Jacques P. Tremblay

a supervisé mes travaux.

(à soumettre à Molecular Therapy en mai 2004)

120

Résumé

La capacité proliférative limitée des myoblastes isolés de patients DMD limite notre

habilité à les modifier génétiquement et les produire en quantité suffisante pour leur

utilisation dans le contexte thérapeutique de la transplantation de myoblastes. Notre groupe

de recherche a précédemment immortalisé et proliféré des myoblastes issus de patients

DMD en utilisant l'Antigène T de SV40 (AgT) et hTERT. En utilisant un vecteur rétroviral

codant pour l'AgT flanqué de sites LoxP, la réversion de l'immortalisation peut être

effectuée avec la recombinase Cre. Pour contourner la nécessité d'effectuer une infection

additionnelle avec un vecteur codant pour la Cre, nous avons utilisé une protéine de fusion

Tat-Cre pour générer la recombinaison nécessaire à la réversion de l'immortalisation. Nos

travaux démontrent qu'en optimisant le ciblage nucléaire en utilisant des concentrations

élevées de Tat-Cre, en co-incubant avec de la chloroquine et en sélectionnant les cellules ne

contenant plus de vecteur non recombiné, l'excision complète de l'AgT a pu être réussie à

l'aide d'un seul traitement de 1 h. En plus de données moléculaires démontrant l'excision de

la cassette immortalisante, le traitement Tat-Cre/chloroquine produit un arrêt de la

prolifération cellulaire en moins de 2 jours. La culture cellulaire résultante peut être

maintenue pendant plus de 2 semaines. Ces résultats indiquent que le ciblage nucléaire avec

une protéine Tat-Cre recombinante pourrait être utile dans plusieurs applications

thérapeutiques nécessitant la manipulation génétique de cellules en culture.

121

Tat-mediated Cre recombinase delivery for the reversal of

human myoblast immortalization

Nicolas J. Caron*, Marie-Eve Ducharme*, Philippe Mills*, Simon P. Quenneville*and Jacques P. Tremblay*,1 *Unité de Recherche en Génétique humaine, Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université Laval, Québec, Québec, Canada 1corresponding author: Jacques P. Tremblay, Ph.D Laboratoire de Génétique humaine (RC-9300) Centre de recherche du CHUL 2705, boul. Laurier Ste-Foy, (Qc), Canada, G1V 4G2 Phone: (418) 654-2186 Fax: (418) 654-2207 E-mail: jacques-p.tremblay@crchul.ulaval.ca 2Abbreviations used: CFU, colony forming units; CPP cell-penetrating peptide; DMD, Duchenne muscular dystrophy; DTT, DMD-Tag-Telo; GCV, Gancyclovir; hTERT, human telomerase reverse transcriptase; IRES, internal ribosomal entry site; HPM, human primary myoblast; MPD, mean population doublings; MTS, membrane translocating sequence; PTD, protein transduction domain; TAg, SV40 T-Antigen. Running title: Tat-Cre mediated reversal of myoblast immortalization

(To submit to Molecular Therapy in Mai 2004)

122

Abstract

The reduced proliferating capacity of DMD myoblasts limits their ability to be genetically

modified and proliferated in vitro for their use in autologous transplantation. Previously,

our research group has successfully immortalized and extensively proliferated DMD

myoblasts using the SV-40 Large T antigen (Tag) and hTERT. Using a retroviral vector

coding for TAg flanked by LoxP sites, immortalization reversal can be performed by Cre

delivery. To circumvent the requirement for an additional infection, we used a Tat-Cre

recombinase fusion protein to exert the recombination necessary for immortalization

reversal. Here, we demonstrate that by optimizing the delivery using a high concentration

Tat-Cre protein, by co-incubating with chloroquine and by selecting against cells

containing copies of the unrecombined vector, complete TAg removal could be achieved

with a single 1 h treatment. In addition to the molecular evidence demonstrating

immortalizing cassette removal, Tat-Cre/chloroquine treatment also resulted in growth

arrest within 2 days. The resulting cell culture could be maintained for at least 2 weeks.

These results indicate that the intracellular delivery of a recombinant Tat-Cre protein could

be a useful tool for a variety of applications that necessitate the manipulation of cells in

culture.

123

Introduction

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary disease caused by the absence of

functional dystrophin in muscle fibers (Hoffman et al. 1987). To this day, there is still no

efficient therapy available for DMD patients. The transplantation of myoblasts, proliferated

from muscle biopsies, is a potential treatment for DMD and other hereditary diseases

(Partridge et al. 1978). The poor results obtained in clinical trials of myoblast transfer

performed in the early 90s indicated that serious problems were limiting the efficiency of

the procedure (Skuk et Tremblay 2000a). The limited migration outside the injection site,

the early death of injected cells and the host specific immune response against hybrid fibers

were identified as major factors limiting the efficacy of myoblast transplantation (Skuk et

Tremblay 2003a). We have shown that by controlling the immune response with

immunosuppressive drugs such as FK 506 could lead to very efficient myoblast

allotransplantation (Kinoshita et al. 1994c; Skuk et al. 2002a). However, prolonged

treatment with FK 506 is known to cause adverse affects such as neuro- and nephrotoxicity

(McDiarmid et al. 1995).

Ultimately, to minimize the presence of foreign antigens, myoblasts isolated from the

patient should be genetically corrected to express functional dystrophin and serve as a

vehicle for the therapeutic gene. For a significant correction of the dystrophic defect, a

large quantity of cells would need to be transplanted in DMD patients. This would require a

large expansion of myoblasts before transplantation. Unfortunately, the proliferation of

myoblasts isolated from patients suffering from DMD is hampered by a major challenge

due to the limited life span of these cells in culture (Webster et Blau 1990). Myoblasts

isolated from young DMD patients (5 to 6-year old) have already undergone an extensive

number of cell doublings in response to constant muscle fiber regeneration (Decary et al.

1997). Their replicative life span being almost completely exhausted, they rapidly become

senescent and cannot be expanded in culture to reach therapeutically significant numbers.

The SV-40 large T antigen (Tag) can extend the proliferation capacity of DMD myoblasts

124

by about 20 divisions (Simon et al. 1996a). We have successfully immortalized and

extensively proliferated DMD myoblasts using the SV-40 large T antigen (Tag) and

hTERT, the catalytic subunit of human telomerase (Seigneurin-Venin et al. 2000b).

Although oncogenes can confer a partial yet functional immortalization to human

myoblasts, reversing their immortalized phenotype before transplantation would be highly

desirable. TAg can interact with muscle regulatory factors and can interfere with the normal

differentiation process leading to the formation of myofibers (Mouly et al. 1996). When we

compared the transplantation efficiency of Tag immortalized myoblasts against primary-

cultured myoblasts, we found that they died faster, more massively and they triggered a

more rapid CD8+ cell infiltration (Skuk et al. 2003). To circumvent the undesirable effects

exerted by long-term expression of a viral oncogene several strategies were utilizied: a heat

inactivated mutant Tag (Jat et Sharp 1989), the expression of Tag under the control of a

promoter down-regulated during differentiation (Mouly et al. 1996) and a Cre removable

expression cassette located between LoxP sites (Westerman et Leboulch 1996). To be

effective, the immortalization reversal must be performed shortly before transplantation.

Cell manipulation using viral vectors to carry cDNA of interest can be very effective, but

the infection of millions of cells prior to their transplantation raises safety issues. The use

of high titers of recombinant viruses to infect cells in culture can create some difficulties

such as broad cell-to-cell intracellular concentration ranges, cytotoxicity, insertional

mutagenesis and immune response against viral structural proteins (Kunieda et al. 2002).

The intracellular delivery of exogenously added active proteins has recently been improved

by their fusion to short peptides known as protein transduction domains (PTDs) or cell-

penetrating peptides (CPPs) (Vives et al. 2003). These highly cationic peptides include Tat

(Frankel et Pabo 1988; Mann et Frankel 1991), Antennapedia (Joliot et al. 1991) and

arginine-rich peptides (Wender et al. 2000). Recent and mounting evidence shows, that in

contrast with amphipathic short peptides, full-length protein, fused to basic sequences such

as Tat, do not translocate through the membrane but rather enter cells through caveolar

125

endocytosis (Fittipaldi et al. 2003; Richard et al. 2003; Caron et al. 2004). Recombinant

fusion proteins bearing the PTD from the Kaposi fibroblast growth factor (FGF-4) (Jo et al.

2001) and the PTD from Tat (Peitz et al. 2002) have already been used to transduce

enzymatically active Cre proteins directly into mammalian cells. We have previously

demonstrated that the proliferative capacity of DMD myoblasts can be significantly

increased by their infection with a retrovirus containing the SV40 TAg inserted between

LoxP sites (Seigneurin-Venin et al. 2000b). In addition, myogenic cells can be transduced

at high efficiency by Tat-fusion proteins (Caron et al. 2001).

The purpose of our study was to examine whether the Cre recombinase fused to the PTD of

the Tat protein could be efficiently delivered in immortalized human myoblasts to exert

complete removal of the TAg flanked by LoxP sites. In the present work, we demonstrated

the ability of an exogenously added Tat-Cre fusion protein to induce the recombination

between LoxP sites previously inserted in myogenic cells lines through retroviral infection.

We showed that by optimizing the delivery using a high concentration Tat-Cre protein, by

co-incubating with chloroquine and by selecting against cells containing copies of the

unrecombined vector, complete removal could be achieved with a single 1 h treatment. In

addition to the molecular evidence demonstrating immortalizing cassette removal, the

treatment also resulted in growth arrest within 2 days.

126

Results

Vector design for the reversible immortalization of myoblasts

We have previously demonstrated that primary myoblasts isolated from DMD patients

could be immortalized and extensively proliferated in culture following their infection with

constructs coding for TAg and hTERT (Seigneurin-Venin et al. 2000b). The DMD-TAg-

Telomerase myogenic cell line (DTT) was generated by transfection with the SSR 69

retroviral vector and subsequent infection with the polycistronic retroviral vector pBabe-

hTERT-puro as previously described (Seigneurin-Venin et al. 2000a).The pBabe-hTERT-

puro vector does not contain recombination target and is not affected by the presence of Cre

recombinase. SSR 69 is a polycistronic vector that contains an TAg expression cassette

surrounded by two LoxP sites and thus can be excised by the Cre recombinase. The

polycistronic expression cassette contains an initiation codon followed by a LoxP

recombination target, the hygromycin resistance/tk(HSV-1)-fusion gene, the

encephalomyocarditis virus internal ribosomal entry site, that allows the initiation of

translation of the TAg from SV40 (Westerman et Leboulch 1996). Following the second

LoxP site, the vector also encodes for the neomycin resistance gene (neo) missing the ATG

initiation codon, which can thus be translated only when the integrated construct is

subjected to CRE mediated site-specific recombination (Fig. 1A). Cells containing the

unrecombined vector are immortalized by TAg, resistant to hygromycin and are sensitive to

Gancyclovir (GCV) treatment. After recombination, cells loose the previous characteristics

and become resistant to G418.

Tat-Cre intracellular transduction produces site-specific recombination of SSR 69

Tat/PTD promotes the cellular uptake of recombinant Cre recombinase and delivers its

biologically active cargo to living cells (Peitz et al. 2002). To assess the potential of a Tat-

Cre fusion protein (polyhistidine-Tat/PTD-NLS-Cre fusion protein, HTNC) to excise the

Tag oncogene from immortalized cells, we first tested the principle on the packaging cell

127

line PA317 SSR 69. We have designed a PCR diagnosis strategy for rapidly detecting site

specific recombination in targeted cells. In short, DNA purified from cells of interest are

submitted to multiplex competitive PCR using three primers (Pp, Ph and Pn) designed to

generate a 870 bp product in presence of the unrecombined vector and a 550 bp product

following recombination (Fig 1A). As shown by figure 1B, treatment of PA317 SSR 69

cells with 500 nM HTNC for 45 min generated site specific recombination as demonstrated

by the presence of a 500 bp band in treated samples.

We then proceeded to test the immortalization reversal of DTT cells using Tat-mediated

delivery of the Cre recombinase. DTT cells were treated with 1 µM HTNC, selected with

1.2 mg/ml G418 and 20 µM Gancyclovir (GCV). Cells selected using G418 did not exhibit

growth arrest typical of immortalization reversal (Westerman et Leboulch 1996; Noguchi et

al. 2002). Their subsequent selection in GCV resulted in rapid death within 5 days. This

apparent contradiction was elucidated when clones derived from G418 resistant HTNC

treated DTT cells were subjected to SSR 69 multiplex PCR diagnosis. Eight clones isolated

from G418-resistant HTNC-treated cells tested positive for both the intact SSR 69 vector

and the recombined version. This indicates that the DTT immortalized cell line contained

multiple copies of the vector in their genome (Fig. 1C).

Optimization of Cre functional delivery in human myoblasts

In order to optimize the functional delivery of active Cre in targeted cells, we tested various

conditions that had previously been shown to affect Cre PTD-mediated internalization.

First, we compared the efficiency of different Cre-fusion proteins used previously (Jo et al.

2001; Peitz et al. 2002). We tested the efficiency of those constructs with a functional

nuclear Cre recombinase assay that we recently introduced (Caron et al. 2004). In short,

this assay is based on the properties of the SSR 69 vector. It contains only one initiation

codon selectively permitting translation of the hygro/tk-IRES-Tag cassette in the

unrecombined vector or the neo gene following recombination. Thus, neo can be translated

128

only when the integrated plasmid is subjected to Cre mediated site-specific recombination

of the two LoxP sites (Fig. 1A). After selection with G418, resistant colonies are generated

and can be counted. The quantification of neomycin resistant colonies shows increases

which are proportional to the amount of active Cre recombinase reaching the nucleus

(Caron et al. 2004). We compared HTNC against a Cre-fusion protein comprising the 12

amino acid membrane translocation sequence (MTS) from the Kaposi fibroblast growth

factor (HNCM) and a Cre-polyhistidine control (CH) to transduce enzymatically active Cre

proteins directly into mammalian cells. HTNC was respectively 4 times more efficient than

HNCM and 3.4 times more efficient than CH to mediate the recombination of the LoxP

sites contained in the DTT human myoblast cell line (Fig. 2A).

Successful myoblast transplantation would require a large quantity of cells to be

transplanted in DMD patients. Cre-fusion proteins delivery is optimized in serum-free

medium. Therefore, we had to establish conditions in which intracellular delivery was

maximized without affecting cell viability. When incubating DTT cells in presence of 500

nM HTNC in serum-free DMEM, the maximum efficiency as expressed in G418 resistant

colony forming units (CFU) was obtained after 60 min (Fig. 2B). While incubation for

more than 60 min could increase intracellular delivery, the increased cytotoxicity resulting

from serum deprivation led to a decrease in CFU counts. Because electrostatic interactions

with glycoproteins play an important role in the process by which PTDs enter cells, dextran

sulfate (DS) pre-treatment can enhance the transduction efficiency (Mai et al. 2002). In

addition, we have recently demonstrated that since Tat-fusion proteins enter cells through

endocytic transport, co-incubation with endosomolytic agents such as chloroquine or

sucrose can increase by up to 24-fold the efficiency of HTNC functional nuclear delivery in

human myoblasts (Caron et al. 2004). Moreover, because polyhistidine purification tags

can be further protonated in subphysiologic pH conditions, their interaction with negatively

charged glycoproteins at the cell surface can be increased in acidified medium (Mai et al.

2004). We tested several variations to determine which condition would result in the most

efficient delivery of HTNC in DTT myoblasts as followed by functional nuclear Cre

recombinase assay. DTT were incubated with 500 nM HTNC in serum-free conditions for

129

60 min and then subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay. In addition to

HTNC treatment, DTT were incubated in DS (pre-incubation for 2 h in 500 µg/ml dextran

sulfate), chloroquine (co-incubation with 200 µM chloroquine), acidified medium

(incubation in acidic pH 5.6) or combinations of the three treatments. Overall, the

maximum floxing was obtained using chloroquine co-incubation (Fig. 2C). Chloroquine

co-incubation led to 24-fold increase in the generation of G418 resistant CFUs while DS

pre-treatment resulted in a 4.3-fold increase and acidification of the culture medium to a

more modest 70% increase. The combinations of those treatment led to very important

increases, but never exceeding the results obtained using incubation with 200 µM

chloroquine alone.

Immortalization and characterization of myogenic cell lines

We hypothesized that the presence of multiple SSR 69 insertions in DTT cells explains

why we could not efficiently remove all copies of the TAg oncogene, even after using

selective agents. Our goal was to perform complete immortalization reversal of myoblasts,

but also to diminish the risks associated with the procedure as much as possible. To

facilitate the process, we established immortalized myogenic cell clones that would contain

only one SSR 69 integrative event. Thus, new immortalized cell lines were derived from

muscle necropsy of a 45-year-old man. Primary cultured satellite cells were obtained from

the necropsy of abdominal muscles. Human primary myoblasts (HPM) were first infected

using serial dilutions of the supernatant from PA317 SSR 69 amphotropic packaging cells.

Infected cells were then proliferated in medium containing 800 µg/ml G418 until distinct

colonies appeared (12 days). To minimize the possibility of multiple integrative events, the

lowest retroviral titer used still yielding G418 resistant colonies was used to isolate clones.

Twelve clones were further studied and two clones (HPM A3 and HPM B1), that

demonstrated the most obvious myogenic characteristics (such as shape and desmin

positivity), were used for further experiments. Both G418 resistant clones were then

infected with supernatant from PA317 pBabe-hTERT-puro and proliferated in complete

medium with 1 mg/ml puromycin for 15 days. As it was the case for DTT myoblasts, HPM

130

TAg-hTERT (HPM TT) A3 and B1 were all positive for desmin, a marker of the myogenic

lineage (Fig. 3A). In addition, when cultured in differentiation conditions for 4 days, both

cell lines demonstrated extensive fusion leading to the formation of polynucleated

myofibers (Fig. 3B). While HPM TT clones could readily form multinucleated myotubes

without having to proceed to immortalization reversal, DTT myoblasts did not fuse very

well (Fig.3C). In striking contrast, when DTT cells were treated with HTNC/chloroquine

and selected in 1.2 mg/ml G418 for 10 days before they were cultured in differentiation

medium, they formed multinucleated myotubes (Fig.3C). This extensive fusion capacity

was maintained even after 100 mean population doublings (MPDs).

Complete excision of the TAg oncogene from immortalized HPM cell lines

We tested TAg removal efficiency from the two HPM TT clones in comparison to DTT

cells (Fig. 4A). The 3 clones were treated with a low concentration of HTNC (400 nM) and

subsequently selected with 1.2 mg/ml G418 for 12 days. As shown by immunoblot analysis

of total proteins recovered from treated cells, both HPM TT clones showed a complete

removal of TAg production while DTT cells only demonstrated a decrease (Fig 4B). Figure

4C shows the time course of TAg removal from HPM TT B1 clone treated 2 successive

days with HTNC/chloroquine (2 µM/200µM) followed by selection in 800 µg/ml G418.

After 3 days of selection, only traces of TAg could be detected in HPM TT B1 cells. After

10 days, G418 selection resulted in complete TAg removal. Then we examined the

percentage of TAg-positive cells using immunofluorescence staining (Fig. 4D): TAg

nucleus labeling gradualy decreased, going from nearly 100% prior to HTNC treatment, to

51% after the first day, 11% after two treatments, and 4% after 3 days in selection (Fig.

4E). It is still unclear whether the weak TAg signal that is observed after 3 days of selection

is truly the result of cells still containing an unrecombined version of the SSR 69 vector

(Fig 4D). Fluorescence microscopy cytology shows that the few cells still demonstrating

TAg in their nucleus have a very weak signal in comparison to controls (Fig. 4E). In

addition, virtually no cell death occurred after 3 days during these experiments. These weak

Tag positive cells could be the result of some TAg protein left behind after the removal of

131

the TAg gene due to slower degradation or delayed action of the recombinase in these few

cells.

TAg excision leads to growth arrest

As we have previously reported that myoblasts isolated from DMD patients overexpressing

TAg and hTERT were efficiently immortalized and that they could be proliferated well

beyond 100 MPDs (Seigneurin-Venin et al. 2000b). HPM TT clones also saw their life

span dramatically increased by the double infection procedure (Fig. 5). Primary cultured

cells (HPM 45) from which we derived both HPM TT clones could only be proliferated for

approximately 40 days in culture. Between 15 to 17 MPDs, their growth rate decreased

significantly and they could not reach confluency. On the other hand, both HPM TT A3 and

B1 proliferated beyond 60 MPDs, outpacing their non-infected primary cultured parents by

more than 40 population doublings, and are still proliferating without any signs of a

senescence. When subjected to HTNC/chloroquine treatment and G418 selection, as

described earlier and illustrated in figure 4, HPM TT clones A3 and B1 underwent

complete growth arrest. Hence, HTNC/chloroquine treatment does not only lead to TAg

removal using molecular detection tools, but HPM TT A3 and B1 also shows phenotypical

signs of immortalization reversal (see grey arrows and growth curves on figure 5).

132

Discussion

One major concern, related to the use of immortalizing oncogenes to increase the

proliferation capacity of cells prior to their transplantation, is the generation of transformed

cells unfit for their safe implantation into a human host. Previous strategies to conditionally

immortalize cell lines using the Cre/Lox system relied on the sustained expression of the

Cre recombinase with high titer retrovirus (Westerman et Leboulch 1996), adenovirus

(Berghella et al. 1999) or lentivirus (Salmon et al. 2000) vectors for the removal of the TAg

oncogene. The large scale application of myoblast transplantation into a DMD patient

designed to reach therapeutically significant results would require the transplantation of at

least several hundreds millions of cells. The use of a reversible immortalization strategy to

assist myoblast transfer dictates that the reversal procedure would have to be performed in

the days preceeding the transplantation. The great number of integrating events imposed by

the infection of hundreds of millions of cells using integrating retroviruses could potentially

lead to insertional mutagenesis. On the other hand, the use of high titers of non-integrating

viruses such as the adenovirus can be cytotoxic and can leave viral proteins that could be

immunogenic once the cells are transplanted inside the host. In itself, the long-term

expression of the Cre recombinase in transplanted cells may also be risky. First, the

overexpression of a foreign Cre protein inside the transplanted cells is in contradiction with

our goal of minimizing the presence of foreign antigens through an autotransplantation

strategy. Secondly, it was shown that the continuous expression of the Cre recombinase in

cultured cells lacking LoxP sites could cause decreased growth, cytopathic effects, and

chromosomal aberrations (Silver et Livingston 2001). These safety concerns led us to

examine the potential of a Cre recombinase fused to the Tat PTD to produce an efficient

and complete removal of the TAg flanked by LoxP sites in immortalized human myoblasts.

Our work to optimize the delivery of HTNC in DTT myoblasts led us to the conclusion that

multiple integration of the immortalizing vector could be problematic. While the pulse

treatment of cultured cells using a Tat-fusion protein has advantages in terms of safety, it

133

also has its limitations. Groups that worked on similar strategies, using viral vectors instead

of PTD-mediated delivery, did not describe such limitations related to the multiplicity of

immortalizing vector copies contained in the target cells. The pulse treatment using a Tat-

Cre fusion protein is probably not as powerful as the long-term expression inherent to

recombinant DNA delivery using viral vectors. But the generation of immortalized cell

lines in conditions that favored the integration of a single copy of the TAg carrying vector

made our more subtle approach as effective. Ironically, the presence of multiple copies of

the SSR 69 vector in DTT cells was very useful for the optimization of Cre delivery to

myoblasts. Since myoblasts such as HPM TT clones underwent growth arrest even when

using low HTNC concentrations followed by selection in G418, they could not have been

used in our functional nuclear Cre assay because proliferation is necessary to form colonies.

We observed that DTT cells could not undergo extensive terminal differentiation in vitro

unless TAg was removed at least partially from its genome. In contrast, HPM TT clones

could differentiate efficiently even without being submitted to HTNC/chloroquine

treatment and selection. As we have previously discussed, the DTT cell line has most

probably incorporated several copies of TAg and should therefore express larger amounts

of the gene product. These observations are in agreement with previously published data

showing that high level expression of TAg could interfere with the formation of myotubes

(Mouly et al. 1996) while constructs designed to be down-regulated during myogenic

differentiation were more favorable to the process (Deschenes et al. 1997). Although TAg

removal was incomplete, as shown by the absence of growth arrest, the HTNC/chloroquine

treatment of DTTs dramatically increased their fusion capacity.

In conclusion, this work provides the proof of principle that Tat/PTD-mediated delivery of

the Cre recombinase can exert the efficient removal of the TAg to result in immortalization

reversal of myoblasts previously immortalized using a retroviral vector. Using such a

strategy should increase the proliferation capacity of myoblasts isolated from DMD patients

to the extent of permitting their genetic correction as well as their extensive proliferation.

134

Most importantly, using Tat-mediated Cre recombinase delivery, we have circumvented the

use of recombinant viruses in the de-immortalization process, which could represent

significant risks to the patient. In addition, this type of system could be adapted for the

manipulation of a variety of human cells that would suffer from prolonged Cre expression

or that can not be easily infected with recombinant viruses.

135

Materials and methods

Constructs and purification of fusion protein purification. SSR 69 is a polycistronic

retroviral vector that contains the hygro-tk fusion gene and the SV40 T-antigen gene

flanked by LoxP sites and followed by neo gene (Westerman et Leboulch 1996). The

pTriEx-HTNC plasmid coding for a 6xHIS-TAT/PTD-SV40/NLS-Cre fusion protein

(HTNC) and pTriEx-CH plasmid coding for a Cre-8xHIS fusion protein were provided by

Dr. F. Edenhofer (Peitz et al. 2002). The pHNCM plasmid codes for a 6xHIS-SV40/NLS-

Cre-FGF4/MTS and was graciously provided by Dr. E. Ruley (Jo et al. 2001). The pBabe-

hTERT-puro plasmid is a polycistronic vector coding for the human telomerase catalytical

subunit and the puromycin resistance gene constitutively expressed via the LTR promoter.

It does not contain any LoxP recombination targets and was constructed as previously

described (Seigneurin-Venin et al. 2000b). Cre-fusion proteins were overexpressed in

bacteria and were purified under native condition by affinity chromatography on a Ni-NTA

column followed by dialysis in PBS. by In short, BL21 Plus RL (Stratagene, La Jolla, CA)

colonies freshly transformed with pTriEx-HTNC were inoculated in LB medium containing

34 µg/ml chloramphenicol, and 50 µg/ml ampicilin overnight in 200 ml. On day 2, bacteria

were inoculated 1:10 (2L) and grown at 37°C until they reached 0.8 OD595nm. They were

then induced using 0.5 mM IPTG for 3 h at 37°C. Cells were harvested and spun down to

be stored at –80°C. β-Gal fusion proteins were produced in the same manner, except that no

induction was performed and cells were grown at 32°C during their final stage. Bacteria

were sonicated 5 min in two stages in buffer A (Hepes 100 mM pH 8.0, NaCl 300 mM,

Imidazole 10 mM) and centrifugation (2500g, 10 min) cleared cell lysates (50 ml total)

were loaded on 5 ml Ni-NTA agarose (Qiagen, Mississauga, ON) column. Afterwards, the

resin was washed twice with buffer A (50 ml), twice in buffer A adjusted at 20 mM

imidazole and eluted twice in 5 ml buffer A adjusted to 250 mM Imidazole. The eluate was

dialyzed against 50 mM NaH2PO4, 5 mM TRIS, 450 mM NaCl, 5% glycerol overnight at

4°C. Purified fusion protein concentrations were determined by Coomassie Blue staining of

SDS-PAGE compared to BSA standards.

136

PCR diagnosis. Total genomic DNA of cell samples was extracted using QIAmp DNA

mini kit (Qiagen, Hilden, Germany) according to the manufacturer's protocol. Primers were

designed to generate two distinct bands specifically at 870 bp for the unrecombined vector

and 550 bp for the recombined vector. The forward primer was based on the ψ packaging

signal (Pp: 5'-CAGGTTAAGATCAAGGTCTT-3') while the reverse primers (Ph: 5'-

GTGTCGTCCATCACAGTT-3' and Pn: 5'-GTGAGATGACAGGAGATC-3') and were

based respectively on the hygro and neo resistance genes. Fifty microliters of PCR mixture

contained 1 mM dNTPs, 30 pmol of each of the three primers, 500 ng of sample DNA, and

1.25 units of Taq DNA polymerase (Qiagen, Hilden, Germany). Thirty-four cycles were

carried out at 95°C for 45 s, 61 °C and 72 °C. PCR products were separated on a 1.5%

agarose gel in 0.5X TBE buffer. Gels were stained with ethidium bromide and images were

digitized using an AlphaImager imaging system (Alpha Innotech, San Leonado, CA)

Cell culture and cell lines. The PA317 cell line (amphotropic retrovirus packaging cell

line) was grown in DMEM HG medium supplemented with 10% Newborn Calf Serum, 10

000 U/ml penicillin/streptomycin in 5% CO2 at 37°C. PA317 SSR 69 and PA317 pBabe-

hTERT-puro are PA317 cells stably transfected respectively with the SSR 69 and pBabe-

hTERT-puro construct. Retroviral packaging cell lines were transfected with Metafectene

lipofectant (Wisent, Montreal, Qc) and selected for 21 days with the appropriate selective

agent 400 µg/ml hygromycin B (Roche, Laval, Qc) or 2 µg/ml puromycin (Invitrogen,

Carlsbad, CA). DTT (DMD-TAg-hTERT) were derived from the myoblasts of a Duchenne

Muscular Dystrophy (DMD) patient as previously described (Seigneurin-Venin et al.

2000b). These myoblasts were immortalized with the SSR 69 vector and pBabe-hTERT-

puro and were proliferated in MCDB 120 medium (BioMedia) supplemented with 10%

FBS (BioMedia), 10 ng/mL of Epidermal Growth Factor (EGF); 0,5 mg/mL of Bovine

Serum Albumine (BSA); 0,4 µg/mL of dexamethasone; 5 µg/mL of insulin; 100-units/mL

of penicillin and 100 µg/mL of streptomycin. Retroviral infections were carried out by spin

137

infection of target cells with PA317 supernatant with 8 µg/ml polybrene. SSR 69

immortalized clones were established using cloning rings.

Human primary myoblast culture. Human donor skeletal muscle tissues were obtained

through the “Quebec transplant” network, according to the guidelines of the Comité

d’Éthique de la Recherche Clinique du CHUL. Skeletal muscles necropsy was performed

under sterile conditions from the abdomen of a 45-year-old man and collected in HBSS

(Invitrogen). After collection, tissues were dissected out to eliminate conjunctive tissues

and fatty tissues. Minced tissues were digested in HBSS solution containing 2,5 mg/ml

dispase II (Roche) and 2 mg/ml collagenase (Sigma) at 37oC with a gentle agitation for 1

hour. Digested tissues were separated from undigested tissues (fibers) by a weak and quick

spinning (75G) and the pellet was digested with 0,25% trypsin (BioMedia) at 37oC with a

gentle agitation for another 30 minutes. After digestion, was added to inhibit the activity of

enzymes. The fibers were separated again by a weak and quick spinning of digested tissues.

The pellet were washed once with HBSS and resuspended in complete MCDB 120 media.

Roughly 2 to 3 ml was placed for each T-25 flask to permit satellite cells to detach from

fibers and adhere on bottom flask after 3 days of culture. Fibers were then eliminated and

media was changed every 3 days. For the analysis of proliferation, the mean number of

population doublings at every passage was calculated as logN/log2, where N is the number

of cells initially seeded on the dish as previously described (Seigneurin-Venin et al. 2000b).

Functional nuclear Cre recombinase assay. Prior to treatment, DTT cells were seeded at

10 000 cells per well in 24-well plates (Corning, Cambridge, MA). Two days later, cells

were washed twice in HBSS before they were co-incubated in serum-free DMEM HG

containing 0.5 µM or 1 µM HTNC for 1 h. Cells were co-incubated with 200 µM

chloroquine (Sigma) or pre-incubated with 500 µg/ml dextran sulfate. Unless stated

otherwise, the incubation mix was removed and cells were then proliferated overnight in

complete medium. 24 h later, cells were trypsinized and plated (1:1 for DTT and 1:2

dilution for NIH SSR) in T-25 flasks containing complete medium and 1200 µg/ml G418

138

(Invitrogen, Carlsbad, CA). Cells were passaged until distinct colonies appeared (12 days

for DTT). Cells were rinsed twice in HBSS, then colored with Coomassie blue and rinsed

in an acetic acid/ethanol/water (1/1/3) solution. Colony forming units were counted. Each

point corresponds to mean of duplicate or triplicate wells with standard deviation.

Immunoblotting. After rinsing 3 times with PBS, cells were recovered directly from

culture dishes by adding sample buffer (50 mM TRIS pH 6.8, 2% SDS, 0,1% Bromophenol

Blue, 10% Glycerol) and were then frozen at –20°C immediately until analysis. Sample

protein concentration was established using protein dot densitometry stained with amido

black 10B curved fitted against a BSA standard curve (Chapdelaine et al. 2001). 10% β-

mercaptoethanol was added to samples before they were boiled. 10 µg of total proteins

were loaded per well for each sample. They were then subjected to 10% SDS-PAGE

electrophoresis and transferred on Trans-blot nitrocellulose membrane (Bio-Rad,

Mississauga, ON). Membranes were washed once in water and then blocked in PBS

containing 10% dried milk for 1 h at room temperature. Membranes were blotted with 2

µg/ml anti-SV40-T-Antigen mouse antibody (Oncogene Research Products, Boston, MA)

in PBS containing 10% dried skim milk. Membranes were washed 3 times in PBS

containing 0.05% Tween 20 between each step. Afterward, they were blotted with an

appropriate secondary HRP-conjugated antibody (Dako Diagnostics Canada, Mississauga,

ON) and later visualized with Western Lightning Chemoluminescent Plus (Perkin Elmer,

Boston, MA) and Hyperfilm ECL films (Amersham Biosciences, Baie d’Urfé, Qc)

according to the manufacturer’s protocol. Images were digitized with a Nikon CoolPix

4500 camera.

Cytology. For fluorescence microscopy analysis, cells were plated in 8-well Lab-Tek

chamber slides (Nalge Nunc Int., Rochester, NY). For desmin and TAg staining,

subconfluent cells were rinsed in HBSS and then fixed in 95% ethanol for 5 min. Cells

were blocked in 10% FBS for 1h and then stained with 3.5 µg/ml anti-Desmin mouse

antibody (Dako Diagnostics Canada, Mississauga, ON) or 2.5 µg/ml anti-T-Antigen mouse

139

antibody (Oncogene Research Products, Boston, MA). Between each steps, cells were

rinsed in 3 times in PBS. Afterward, cells were stained with 4 µg/ml Alexa Fluor 546-

conjugated goat anti-mouse antibody (Dako Diagnostics Canada, Mississauga, ON) for 1 h.

Finally, cells were rinsed once in PBS, stained with 100 ng/ml DAPI for 2 min, rinsed

twice in PBS and mounted under PBS/glycerol (1:1) for observation. To monitor terminal

myoblast differentiation, cells were stained with eosin and DAPI. In short, cells were fixed

for 5 min in 4% paraformaldehyde and then stained in eosin for 1 min, rinsed 2 min under

tap water, then stained for 2 min in 100 ng/ml DAPI before they were rinsed twice.

Fluorescent micrographs were digitized with a Nikon CoolPix 4500 camera mounted on a

Zeiss Axiophot microscope at 100X and 200X magnification.

140

Acknowledgments

We thank Dr. K. Westerman for graciously providing the SSR 69 vector, Dr. F. Edenhofer

for sharing pTriExHTNC and pTriExCH vectors and Dr.E. Ruley for pHNCM. This work

was supported by l'Association française contre les myopathies (AFM) and the Canadian

Institute of Health Research. N.J. Caron is a scholar from the Canadian Institute of Health

Research. M.-E. Ducharme and S.P. Quenneville are both scholars from the Canadian Stem

Cell Network.

141

Figure legends

Figure 1 Immortalization of myoblasts using the SSR 69 retroviral vector.

(A) Schematic representation of the SSR 69 immortalizing vector and PCR diagnosis

strategy. Using multiplex PCR with Psi, hygro and neo primers the unrecombined vector

generates a 870 bp product while a 550 bp product can be observed following

recombination. (B) A single treatment of HTNC can induce recombination the SSR 69

vector in treated cell line. PA317 SSR69 retroviral producing cell line were treated with

500 nM HTNC. Genomic DNA was isolated and submitted to PCR diagnosis for SSR69

recombination. Lane 1: Untreated cells and 3 primers. Lane 2: Untreated cells and primers

Pp and Pn. Lane 3: TAT-Cre treated cells and 3 primers. Lane 4: TAT-Cre treated cells and

primers Pp and Pn. (C) DTT myoblasts contain several SSR69 integrative events. PCR

diagnosis of the recombination efficiency of DTT myoblasts treated with 1 µM HTNC for 1

hour and selected for 12 days in proliferating medium containing G418. Eight clones were

isolated after selection and were then submitted to PCR disgnosis.

Figure 2 Optimization of Cre internalization in human myoblasts.

(A) HTNC is more efficient than HNCM and CH fusion proteins to carry the Cre

recombinase activity to the nucleus of myoblasts. DTT myoblasts were treated with various

concentrations of HTNC HNCM and CH control protein for 1h in serum free conditions

and then subjected to the functional nuclear Cre recombinase assay. Resistant colonies were

then counted. (B) HTNC rapidly associates to the cell membrane. HTNC was applied to

DTT myoblasts at a concentration of 500 nM for different amounts of time in serum-free

culture medium. DTT myoblasts were then subjected to the functional nuclear Cre

recombinase assay. (C) Comparison of different treatments and combinations of treatments

on functional HTNC delivery to DTT myoblasts. DTT myoblasts were incubated with 500

nM HTNC in serum-free conditions for 60 min and then subjected to the functional nuclear

142

Cre recombinase assay. DS: DTT were pre-incubated for 2 h in 500 µg/ml dextran sulfate

prior to HTNC treatment. C: DTT were co-incubated with 200 µM chloroquine in addition

to HTNC. 5.6: Cells were incubated in HTNC in acidic pH (5.6). Each data point or column

represents the mean of duplicate (A and B) or triplicate (C) wells, and standard deviations

are shown as error bars.

Figure 3 Myoblasts immortalized with Tag and hTERT retain myogenic characteristics in

culture.

(A) Fluorescence microscopy analysis of immortalized DMD myoblasts (DTT) and normal

myoblast clones (HPM TT) immunostained for Desmin and counterstained with DAPI. (B)

Fusion of immortalized myoblasts cultured in differentiation conditions. DTT myoblasts

could form myotubes after TAg removal, while HPM TT clones could form myotubes with

or without TAg removal. (C) Fusion capacity comparison between HTNC-treated DTT

myoblasts and untreated DTT myoblasts. DTT myoblasts treated once with 400 nM HTNC

and proliferated for 10 days in 1.2 mg/ml G418 and their fusion was compared to untreated

controls. For B and C, cells were grown to confluency and left to differentiate in 2% serum

for 4 days before they were stained with eosin and DAPI.

Figure 4 Reversal of Tag immortalization using HTNC in human myoblasts.

Immunobloting for the detection of TAg in myoblasts in untreated cells (A) and

HTNC/chloroquine treated cells selected for 12 days in 1.2 mg/ml G418 (B). (C) Kinetics

of immortalization reversal in HPM TT B1 clone using HTNC/chloroquine massive

treatment. HPM TT B1 cells were treated with 3 µM HTNC and 200 µM in serum-free

DMEM HG for 45 min once (1x), twice (2x) and selected for 3 days (S(3d) or 10 days

(S(10d)) in 800 mg/ml G418 and 100 ng/ml GCV in proliferation medium. (D)

Immunofluorescence study for TAg in cells described in C and counterstained with DAPI.

(E) Percentage of Tag positive cells following treatment with HTNC and selection listed in

143

C. Each column represents the mean of cells counted in 3 random fields, and standard

deviations are shown as error bars.

Figure 5 Expansion of proliferation capacity of human primary myoblasts clones.

Growth curves of human primary myoblasts (HPM 45) and clones of HPM 45 (A3 and B1)

immortalized with Tag and hTERT. Human primary myoblasts were isolated from a 45-

year-old man and infected with the SSR 69 retrovirus (see black arrow). Tag immortalized

clones were infected with a hTERT expressing retrovirus and proliferated. Grey arrows

indicate immortalization reversals exerted on HPM TT clones by massive

HTNC/chloroquine treatment followed by culture under G418 selective pressure. The

number of MPDs was determined as indicated under Materials and method.

144

Figures

Figure 1 Immortalization of myoblasts using the SSR 69 retroviral vector.

145

Figure 2 Optimization of Cre internalization in human myoblasts.

146

Figure 3 Myoblasts immortalized with Tag and hTERT retain myogenic characteristics in

culture.

147

Figure 4 Reversal of Tag immortalization using HTNC in human myoblasts.

148

Figure 5 Expansion of proliferation capacity of human primary myoblasts clones.

149

Conclusion générale

Les travaux présentés dans cette thèse consacrée à l'étude des domaines de transduction

protéiques peuvent être divisés en trois axes: l'application de protéines de fusion Tat au

tissu musculaire, l'élucidation du mécanisme d'internalisation des protéines de fusion Tat et

le développement d'une stratégie d'immortalisation réversible des myoblastes impliquant

l'utilisation de la transduction de protéines pour exciser l'oncogène immortalisant.

La capacité des domaines de transduction protéiques (DTPs) à être internalisés fut

démontrée dans plusieurs types cellulaires in vitro ainsi que dans plusieurs tissus in vivo

(Fawell et al. 1994; Schwarze et al. 1999). L'entrée des protéines de fusion Tat fut décrite

comme un processus non endocytique ne passant pas par l'intermédiaire d'un récepteur

spécifique (Vives et al. 1997; Schwarze et Dowdy 2000). Nous avons donc entrepris de

tester la capacité des protéines de fusion Tat à transduire directement les fibres musculaires

dans le but de tester la possibilité de les utiliser pour transporter directement des cargos

avec un potentiel thérapeutique pour la DMD. Nos travaux furent les premiers, avec ceux

du groupe de Giacca (Tyagi et al. 2001), à démontrer que le DTP de Tat pouvait médier

l'internalisation de l'eGFP dans toutes les cellules mononucléées en culture. Par contre, les

myotubes semblaient internaliser la Tat-eGFP beaucoup moins efficacement. Même si elles

contiennent un signal de localisation nucléaire (SLN) efficace, les protéines de fusion Tat

internalisées ne se retrouvaient que dans le cytoplasme. Des études, comparant la

localisation intracellulaire d'une protéine Tat-eGFP ajoutée au milieu de culture avec celle

résultant de l'expression endogène de la même construction, révèlent que c'est le mode

d'entrée de la protéine Tat-eGFP, et non l'efficacité du SLN, qui prévient la nucléarisation

du cargo (Yang et al. 2002b). Nos premières observations effectuées avec la protéine de

fusion Tat-eGFP nous avaient amené à théoriser que le mécanisme d'internalisation et de

localisation au noyau des protéines de fusion Tat pouvait être sensible à la conformation du

cargo. En effet, nous avions attribué à la très résistante structure du cargo eGFP l'absence

de localisation nucléaire observé in vitro. Notre étude du mécanisme d'entrée des protéines

150

de fusion Tat montra que cette absence de localisation nucléaire était plutôt le résultat d'une

séquestration périnucléaire suite à l'endocytose des protéines de fusion (Chapitre 3).

Le ciblage des fibres musculaires via l'injection directe de protéines de fusion Tat chez la

souris mdx ne produit que très peu de fibres transduites. Même si le matériel injecté est

retrouvé hors du site d'injection, les fibres marquées sont principalement situées au site où

les fibres musculaires ont été endommagées par l'injection. Nos tentatives pour transduire

les fibres en utilisant des techniques d'injection subdermique ou intra-artérielle eurent du

succès mais n'ont marqué que des fibres directement en contact avec la solution injectée ou

en périphérie des vaisseaux sanguins visés. Ces expériences ont également démontré la très

forte affinité du DTP de Tat pour la matrice extracellulaire entourant le muscle. Des

expériences subséquentes, exécutées chez des souris normales avec le DTP de Tat marqué à

la rhodamine ou avec une protéine de fusion Tat-β-Galactosidase, n'ont pu générer plus de

fibres positives (voir annexe). Le cumul de ces données vient infirmer nos hypothèses de

travails concernant le ciblage in vivo des fibres musculaires. Les fibres musculaires

résistent à l'entrée des protéines de fusion Tat et sont peu susceptibles d'être transduites à

l'aide de protéines de fusion Tat.

Même si la dystrophine est une protéine énorme (427 kDa), des versions tronquées

fonctionnelles ont pu être isolées de patients souffrant de dystrophies musculaires moins

sévères. Des mini gènes se sont montrés efficaces pour remplacer de façon fonctionnelle la

dystrophine manquante chez des souris mdx (Harper et al. 2002). Potentiellement, des

protéines de fusion Tat-microdystrophine pourraient être produites par des bactéries ou des

levures pour être ensuite administrées aux patients DMD et suppléer à la perte de la

dystrophine. Même si les fibres musculaires ne pourraient être ciblées de façon efficace

avec une telle stratégie, les cellules cardiaques, par contre, ont démontré une susceptibilité

accrue à être transduites par des peptides cationique et des protéines de fusion Tat (Fawell

et al. 1994; Schwarze et al. 1999). Cette approche pourrait être complémentaire au

traitement des muscles squelettiques par la transplantation de myoblastes. Cibler plus

151

efficacement les muscles squelettiques ou le diaphragme, nécessiterait des modifications

substantielles aux domaines de transduction utilisés afin de modifier leur affinité à la

matrice extracellulaire. Malheureusement, comme l'internalisation des protéines de fusion

Tat est d'abord médiée par une adsorption au sulfate d'héparane constituant les

glycoprotéines de la membrane, de telles modifications risquent d'abroger les propriétés

transductrices de ces protéines.

Plusieurs de nos observations entraient en contradiction avec le modèle de translocation

membranaire suggéré par le groupe de Dowdy. Celui-ci décrivait l'entrée des protéines de

fusion Tat comme une infiltration à travers les membrane plasmique, indépendante des

récepteurs membranaires et ne nécessitant aucun processus énergétique (Schwarze et al.

2000). De plus, plusieurs de nos tentatives destinées à utiliser le DTP de Tat en fusion avec

des protéines comme l'AgT, E7 de HPV, l'ubiquitine et MyoD n'ont démontré aucune

fonctionnalité du cargo transduit (résultats non décrits dans cette thèse). Nous avons donc

essayé de mieux comprendre le mécanisme d’internalisation des protéines de fusion Tat. Le

troisième chapitre de cette thèse était donc consacré à l'élucidation du mécanisme d'entrée

afin d’optimiser le ciblage efficace des cellules en culture.

Comme le groupe de Giacca avait démontré que l'entrée des protéines de fusion Tat

nécessitait la présence de glycoprotéines constituées de sulfate d'héparane à leur surface

(Tyagi et al. 2001), nous avons décidé de tester l'hypothèse que l'entrée de celles-ci ne soit

qu'un processus d'endocytose hautement efficace et non spécifique. Notre hypothèse a été

confirmée par des études plus approfondies. En effet, nos observations montrant une

distribution intracellulaire ponctuée, une cinétique d’internalisation classique et une

sensibilité aux basses températures sont tout à fait cohérentes avec un mécanisme

d’endocytose. Après quelques heures, les protéines de fusion Tat s’accumulent autour du

noyau, sans y entrer. La co-incubation avec des agents lysosomotropiques démontre que la

déstabilisation des endosomes peut augmenter de façon significative l’accès au cytosol et

au noyau. De plus, nous avons observé que les protéines de fusion Tat, pouvaient persister

152

pendant plusieurs heures dans les cellules ciblées, et que des inhibiteurs de l’acidification

des lysosomes n’avaient aucun effet sur l’efficacité du transport jusqu’au noyau. Ceci

suggère que les protéines de fusion Tat, entrent par la voie endosomale, pour ensuite éviter

la dégradation dans les lysosomes, mais qu’elles sont ensuite séquestrées en périphérie du

noyau. Nos travaux indiquent donc qu’un trafic intracellulaire inadéquat est le principal

facteur limitant l’efficacité de la nucléarisation fonctionnelle des cargos fusionnés au DTP

de Tat.

Des publications récentes confirment nos observations. D'abord, on a montré que la fixation

au méthanol des cellules traitées avec VP-22, un polypeptide cationique similaire au DTP

de Tat, pouvait mener à une localisation nucléaire artéfactuelle des protéines adsorbées à la

surface des cellules (Lundberg et Johansson 2001). Cette observation fut étendue aux autres

DTPs comme Tat et les poly-arginines (Richard et al. 2003). Ces derniers auteurs ont

également montré que les basses températures inhibaient l'internalisation des protéines de

fusion Tat. Ces travaux ont provoqué une réévaluation des données publiées plus tôt,

décrivant une translocation membranaire et une localisation nucléaire rapide des peptides

cationiques (Elliott et O'Hare 1997; Vives 2003). Plus récemment, le groupe de Giacca a

démontré que les protéines de fusion contenant le domaine de transduction de Tat étaient

internalisées via l’endocytose cavéolaire (Fittipaldi et al. 2003). En effet, leurs travaux ont

montré la co-localisation intracellulaire de protéines de fusion Tat-eGFP avec des

marqueurs caractéristiques du transport via les radeaux lipidiques que sont la cavéoline et la

toxine du choléra (Fittipaldi et al. 2003). De plus, leurs travaux ont également mis en

évidence une cinétique d’entrée des protéines de fusion très différente de celle prévue dans

le cadre d’une translocation membranaire (Fittipaldi et al. 2003).

Nos travaux furent les premiers à montrer à l'aide d'un essai fonctionnel que les protéines

de fusion Tat doivent transiter par des vésicules endocytiques avant d'accéder au noyau.

L'absence de localisation nucléaire visible montre également que leur entrée dans les

cellules visées ne signifie pas nécessairement qu'elles seront par la suite localisées dans le

153

bon compartiment cellulaire. La plupart des approches pour augmenter l'efficacité de la

transduction de protéines ont été dirigées vers la génération de nouvelles séquences

permettant d'augmenter l'adhésion aux glycoprotéines membranaires. Il est de notre avis

que la recherche d'un meilleur ciblage au niveau des compartiments intracellulaires

représente la prochaine étape importante. Certains liposomes sont modifiés pour s'évader

des endosomes, certaines séquences peptidiques provenant de toxines d'origine naturelle

peuvent déstabiliser les vésicules endocytiques pour accéder au cytosol (Rozema et al.

2003). Des séquences composites comprenant à la fois un DTP et une séquence dérivée

d'une toxine comme celle du venin d'abeilles, par exemple, pourraient augmenter

grandement la fonctionnalité de la transduction protéique. Par contre, ces protéines

pourraient s'avérer toxiques, non seulement pour les cellules ciblées, mais aussi pour les

bactéries utilisées pour les produire.

Malgré leur efficacité plus limitée qu'initialement escomptée, les protéines produites en

fusion avec des DTPs restent quand même des instruments intéressants. Le quatrième

chapitre de cette thèse montre que les protéines de fusion Tat peuvent être utilisées pour

suppléer à l'utilisation de virus recombinants et intervenir sur des cultures cellulaires. Nous

avons réussi à optimiser le ciblage fonctionnel des myoblastes en utilisant des

concentrations élevées de Tat-Cre, en co-incubant avec la chloroquine et en sélectionnant

contre les cellules contenant encore des copies du vecteur non recombiné. L'excision

complète de l'AgT n'a pu être atteinte qu'en sélectionnant les cellules floxées avec la G418.

Malgré un arrêt de la croissance en moins de 2 jours, les cellules sélectionnées restent

parfaitement viables et pourraient ainsi être transplantées. L'efficacité de l'internalisation de

la Cre recombinase en fusion avec Tat reste encore sous optimale. Il sera nécessaire

d'optimiser le processus avant d'envisager l'utilisation sécuritaire de cette méthode. Le cycle

cellulaire semble influencer l'efficacité de la transduction de la Cre recombinase (Jo et al.

2003). Il est donc possible que l'excision complète des copies de la casette immortalisante

sans sélection ne soit possible qu'en proliférant les cellules en continu dans un milieu

contenant la Tat-Cre. Pour ce faire, il faudra contourner les principaux obstacles à son

154

optimisation accrue qui proviennent de la toxicité des composés endosomolytiques utilisés

en concomitance au traitement.

L'immortalisation des myoblastes isolés d'un patient DMD s'insert dans une stratégie de

transplantation autologue. L'infection des myoblastes isolés de patients DMD à l'aide de

vecteurs intégratifs pour les corriger génétiquement et les immortaliser peut favoriser

l'émergence de transformants. Ainsi, les deux étapes de transductions rétrovirales

nécessaires à l'immortalisation des cellules de patients DMD pourraient également résulter

en des mutations par insertions. Par contre, l'immortalisation rend possible le clonage des

cellules ainsi générées et leur caractérisation subséquente pour s'assurer de la sécurité de la

procédure. Sans que l'on puisse totalement éliminer la possibilité que des transformants

soient générés, la caractérisation du transcriptome ainsi que des tests in vitro et in vivo dans

des souris SCIDS pourraient être effectués sur chacun des clones. On pourrait ainsi

éliminer des clones surexprimant des gènes communément retrouvés dans les cellules

cancéreuses, des clones ne démontrant pas les caractéristiques moléculaires et

phénotypiques des cellules déimmortalisées ainsi que les clones formant des tumeurs ou

manifestant une capacité de fusion limitée in vivo. Cette caractérisation est impossible après

la déimmortalisation, ce qui rend risquée l'utilisation de vecteurs viraux pour cette dernière

étape. La transduction de protéines devrait donc être plus sécuritaire puisqu'elle ne génère

pas de nouvel évènement intégratif.

Il reste cependant à démontrer que ces cellules déimmortalisées maintiennent toujours une

capacité à participer à la régénération musculaire suite à leur transplantation et générer des

résultats comparables à ceux obtenues avec des cellules de mammifères normaux (Skuk et

al. 2002a). En effet, pendant la régénération musculaire, une phase de prolifération des

myoblastes précède habituellement la fusion avec les fibres endommagées. On pense que

cette prolifération puisse être importante pour contrecarrer les effets négatifs de la mort

rapide observée suite à la transplantation de myoblastes (Skuk et al. 2003). Par contre, la

transplantation de myoblastes proliférés avec l'AgT et ensuite déimmortalisés avec un

155

adénovirus codant pour la Cre recombinase a déjà montré de bons succès de greffe

(Berghella et al. 1999). Il est nécessaire de procéder vers la prochaine étape qui consiste à

greffer des cellules humaines déimmortalisées pour analyser leur comportement in vivo et

valider la pertinence de ce protocole de déimmortalisation dans le contexte de la

transplantation de myoblastes. Si les myoblastes peuvent participer à la régénération des

fibres endommagées, il serait important de confirmer que ceux-ci peuvent aussi persister

sous la forme de cellules satellites mononucléées suite à la greffe. Si l'arrêt de croissance

observé chez les myoblastes déimmortalisés est permanent, ils seront incapables de

participer à la régénération musculaire à long terme. Même des muscles protégés par la

présence de dystrophine entrent en régénération suivant un processus normal. L'addition

d'une réserve de cellules satellites pourrait s'avérer cruciale pour l'amélioration à long terme

du phénotype de la maladie.

L'amélioration de la qualité de vie de jeunes patients DMD requiert la transplantation de

plusieurs groupes musculaires. Chez le singe, l'obtention de plus de 50% de fibres hybrides

dans un biceps complet nécessite l'injection de 30 millions de myoblastes par cm3. On

estime donc que pour traiter tous les muscles (environ 25 kg ou 25 000 cm3) d'un patient

Duchenne, il faudrait 600 milliards de myoblastes. L'immortalisation devrait permettre de

proliférer de façon extensive les cellules myogéniques du patient pour atteindre les

quantités nécessaires à une greffe massive. En effet, à partir d'un seul clone, on génère plus

d'un milliard de cellules après 30 divisions et on atteint 600 milliards de cellules avant 40

divisions. Les clones étudiés au chapitre 3 ont tous dépassés 70 divisions et ne montrent

aucun signe de sénescence. Un culture clonale peu dépasser ce nombre en 40 divisions.

Même après avoir obtenu une quantité suffisante de cellules, le principal obstacle au succès

thérapeutique de la transplantation de myoblastes demeure leur faible dispersion hors du

site d'injection. On devra améliorer de façon significative le potentiel migratoire des

myoblastes transplantés pour diminuer le nombre de sites d'injections nécessaires à la

réussite d'une telle intervention. L'expérimentation chez la souris illustre bien la

156

problématique de la transplantation cellulaire massive. La transplantation massive chez la

souris peut générer plus de 90% de fibres hybrides, mais l'application de ce protocole

résulte en une diminution de force du muscle greffé. Avant de passer à des essais cliniques

visant des greffes massives dans plusieurs muscles, il serait souhaitable de s'assurer que des

gains de force peuvent être obtenus et pas seulement une démonstration moléculaire du

succès.

Globalement nos travaux ont permis de mieux comprendre les limites et les avantages

associés à l'utilisation de la transduction de protéines dans le cadre du développement d'un

traitement pour la DMD. Nos observations indiquent que le ciblage intracellulaire avec des

protéines de fusion Tat recombinantes est une technique prometteuse dans plusieurs

applications nécessaires à la manipulation de cellules en culture.

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173

Annexe:

Transduction de protéines dans les cellules musculaires: Optimisation et applications.

Nicolas J. Caron and Jacques P. Tremblay

Contribution de chaque auteur:

J’ai effectué le travail dans son entier et j’ai rédigé ce chapitre de livre. Jacques P.

Tremblay a supervisé mes travaux.

soumis à Dr. Paul Robbins (éditeur de Peptide-Mediated Transduction : Characterization,

Optimization and Application) en janvier 2003 comme chapitre de livre

174

Résumé La grande dispersion corporelle des muscles squelettiques gène de façon significative la

réussite des protocoles visant le traitement des dystrophies musculaires. Des protéines

d’intérêts thérapeutiques fusionnées à des domaines de transduction protéiques (DTPs)

pourraient potentiellement substituer l’absence de protéines fonctionnelles. Le tissu

conjonctif entourant chaque fibre musculaire est riche en collagènes et en glycoprotéines.

L’injection intramusculaire de domaines de transduction protéiques, résulte principalement

en leur association avec la matrice extracellulaire, mais très peu de fibres sont efficacement

transduites. Ceci suggère que l’affinité des DTPs pour les composantes de la matrice

extracellulaire entourant les myofibres pourrait interférer avec le processus de transduction

intracellulaire. Par contre, les cellules en culture peuvent être ciblées beaucoup plus

facilement, suggérant ainsi que les DTPs pourraient aider de façon significative la thérapie

génique cellulaire ex-vivo en la rendant plus sécuritaire.

175

Protein Transduction of Muscle Cells: Optimization and Application

Nicolas J. Caron and Jacques P. Tremblay

Laval University, Quebec City, Quebec, Canada.

submitted to Paul Robbins in January 2003 as a book chapter (editor for Peptide-Mediated

Transduction : Characterization, Optimization and Application)

176

Abstract:

The widespread distribution of skeletal muscles significantly hampers gene therapy

protocols for the treatment of muscular dystrophies. Therapeutic proteins fused to protein

transduction domains (PTDs) could potentially substitute for the non-functional gene

products. The connective tissue surrounding each muscle fiber is rich in collagens and

glycoproteins. Injection of PTDs in muscles results in localization to the extracellular

matrix but very few transduced muscle fibers. This suggests that the affinity of PTDs for

components of the ECM surrounding myofibers could interfere with the intracellular

transduction process. On the other hand, cultured cells can be targeted more easily;

suggesting that PTDs could significantly help cell-mediated based gene therapies by

permitting safer interventions on cultured cells prior to their transplantation.

Key Words: muscle, protein transduction domain, Tat

177

Introduction

The driving force behind the engineering efforts aimed at producing proteins capable to

transduce through the cell membrane of muscle cells was, to no one’s surprise, the design

of a therapy against muscular dystrophies. Several potential treatments for these diseases

were designed and tested in the last twenty years. Unfortunately, they all suffered major

drawbacks. While pharmacologists are still searching for the magic bullet, gene therapists,

using viral vectors or cells as vehicles for their therapeutic genes, always faced with an

immense challenge. They have to reach quiescent skeletal muscle cells distributed all over

the body, representing more than 40% of total bodyweight and this, without raising an

immune response. To make matters worst, the heart muscle and diaphragm are also

affected. In the last decade, increasing evidence showed that a group of cationic peptide

sequences could render cell membrane permeable to their cargo 1-4. The lure of cell and

vector-free protein replacement therapy using transducing protein technology had found a

niche.

Muscular dystrophies and their treatment

The term muscular dystrophy covers a group of genetically determined disorders, which

cause progressive weakness, wasting of skeletal muscle and which are assumed to affect the

muscle cell directly 5. Some forms cause death after 15 to 20 years, while in others, the life

expectancy may be normal but the patient becomes progressively disabled. Duchenne

muscular dystrophy (DMD), one of the most severe and frequent form of dystrophy,

became the prime target and the case study for the treatment of all muscular dystrophies.

DMD is caused by the absence of dystrophin, a fibrilar protein that serves as connection

between the internal actin cytoskeleton network and the extracellular basal lamina. The

lack of dystrophin produces progressive muscle degeneration, expressed clinically by the

loss of muscle strength early in childhood, severe weakness by the age of 10, and death by

178

the age of 20. Patients often die from respiratory or heart failure. To this day, there is still

no treatment for DMD.

Direct viral-mediated and ex vivo cell-mediated gene therapies have been studied for years

for the treatment of muscular dystrophies. Unfortunately, the success of gene therapy

protocols is often limited by toxicity concerns, large-scale production restrictions and

immunological problems. Skeletal muscle fibers are long syncitial elements composed of

many nuclei and formed by the fusion of mononucleated cells called myoblasts, the result

of the activation and proliferation of satellite cells. Satellite cells are committed stem cells

that could be transplanted as a treatment for muscular dystrophies 6. Myogenic cell

transplantation is mostly affected by a poor spread of the implanted cells and

immunological problems 7,8. In the present chapter, we not only address the direct delivery

of protein transduction domains (PTDs) to muscle fibers, but also examine their potential in

assisting cell-mediated therapy for the treatment of muscular dystrophies.

Muscle tissue structure

Muscle fibers, like most other cells, are embedded in an extracellular matrix rich in proteins

and carbohydrates. The skeletal muscle is composed of elongated multinucleated units.

Each individual skeletal muscle consists of bundles of fibers within a connective tissue

framework 9. The connective tissue surrounding fibers transmits mechanical force along

the entire length of the muscle, confers elasticity, holds water and also serves as a reservoir

for growth factors influencing growth and regeneration. The external sheath surrounding an

entire muscle is called the epimysium. It extends inward to form the perimysium, which

separates bundles of muscle fibers known as fascicles. Individual muscle fibers are

ensheathed by the endomysium that contains the basal lamina, the reticular lamina, cells

179

like fibroblast or macrophages. The basal lamina consists of two layers, the lamina densa

and lamina rara (Fig.1).

Figure 1 Structural model of the skeletal muscle including its connective tissue.

180

Extracellular matrix and proteoglycans

Arginine-rich peptides such as Tat/PTD are known to bind to sulfated compounds such as

heparan sulfate (HS) or heparin, which can inhibit the transactivating properties of

extracellular Tat 10. By contrast, dextran sulfate pre-incubation can restore cationic peptide

intracellular delivery to wild-type levels in cell lines deficient for HS or glycosaminoglycan

(GAG) synthesis 11. In addition, we have observed that Tat/PTD-fusion proteins are tightly

bound to the extracellular matrix surrounding muscle fibers following their injection in the

muscle 12. This suggests that the interactions between cationic peptides and GAGs in

muscle could be a key issue.

Skeletal muscle fibers are surrounded by extracellular matrix composed of glycoproteins,

collagens and proteoglycans like HS, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid. Perlecan,

agrin, syndecan, glypican and type XVIII collagen have been identified so far as heparan

sulfate proteoglycans (HSPGs) components of muscle basal lamina 13,14. While they are

virtually ubiquitous, HDPGs are localized at the external side of the lamina densa adjacent

to the underlying connective tissue, but not found associated to the lumina rara close to the

cell membrane 15.

Following systemic delivery, PTDs incoming from the bloodstream must interact with

sulfated proteoglycans from four different zones in the muscle before they can reach the

cell membrane of a muscle fiber. In contrast with what is observed in cell cultures, where

extracellular matrix proteins are scarcer, GAGs found in muscle are not prominently

associated with proteins located at the cell surface of fibers. A circulating PTD has to cross

the matrix surrounding blood vessel irrigating the muscle before reaching the fibers. It is

then put directly in contact with the proteoglycans of the endomysium. Then, the thick

181

basal lamina still separates the positively charged molecule from HSPG at the fiber

surface. The tissue organization of the muscle, consisting of several layers of sulfated

glycoproteins, probably plays an important role in limiting the direct delivery of cationic

peptides in muscle.

In vivo delivery

Very few groups actually studied the efficiency of in vivo delivery of full-length proteins

using PTDs. Most of the work was done using the protein transduction domain from Tat

2,4,12,16,17. The first report of the internalization of a protein coupled to Tat in muscle

cells was published by Fawell et al. in 1994 4. The intra-venous injection of a Tat(37-72)-

β-Galactosidase conjugate led to the transduction of a significant percentage of heart

muscle cells. The authors also reported low but still detectable staining in skeletal muscles.

Schwarze et al. also examined a variety of tissues following intraperitoneal delivery of a

Tat/PTD-β-Galactosidase purified under denaturing conditions 2. They reported strong

staining of heart muscle cells for β-Galactosidase and low but significant levels of

fluorescence in the quadriceps following IP injection of a FITC-labeled Tat/PTD peptide.

Both studies examined several organs and understandably did not study every tissue in

detail 2,4.

To evaluate the potential of cationic peptides in delivering proteins for the treatment of

neuromuscular disorders such as DMD, we examined with more scrutiny the in vivo

delivery to muscle cells. We first proceeded by injecting Tat-eGFP fusion protein to assess

in vivo distribution and muscle fiber susceptibility to be transduced using C57 BL10

mdx/mdx (mdx), the mouse model for DMD. It was important in our case to test protein

transduction on mdx mice to reproduce more faithfully conditions that would be

182

encountered in a DMD patient. Among other things, both the mdx mouse and the DMD

patient muscles have more abundant connective tissue than normal. Following the

intravenous injection of Tat-eGFP, fluorescence was found mainly in the liver, spleen and

kidney, superficially in the heart and diaphragm, only punctually in the brain, while no

fluorescence was detected in skeletal muscles (unpublished results). Muscles injected with

Tat-eGFP showed intense labeling localized to the extracellular matrix. This suggests that,

although Tat-eGFP proteins were found inside some muscle fibers, their binding by

components of the ECM surrounding myofibers could strongly interfere with the

intracellular transduction process (Fig. 2a). Delivery to the muscle tissue using the intra-

arterial pathway led to few positive fibers in the muscle periphery or surrounding the blood

vessels once damaged fibers were excluded (Fig.2b). Unfortunately, we were unable to

determine if the positive fibers resulting from the intra-arterial delivery were correlated

with an apposition between blood vessels and the cell membrane, thus avoiding the

sequestration by the extracellular matrix observed in intra-muscular injections.

183

Figure 2 Tat-fusion protein localization after in vivo delivery.

Mouse skeletal muscle were treated with TAT-fusion proteins or labeled peptides. A. Fluorescence microscopy examination of a muscle cryosection after the intra-muscular injection of Tat-eGFP in the Tibialis anterior of a C57 BL10 mdx/mdx. B. Fluorescence microscopy examination of a muscle cryosection after the intra-arterial delivery of rhodamine-labeled Tat-eGFP in the quadriceps of a C57 BL10 mdx/mdx. C. X-Gal histochemistry of a muscle cryosection intra-muscular injection of Tat-β-Galactosidase in the Tibialis anterior of a 10J after treatment with dextran sulfate. D. Intra-muscular injection of rhodamine-labeled TAT/PTD peptide in a Balb/C Tibialis anterior. Necropsies were all performed after 18 hours.

184

Recently, it was shown that pretreatment with dextran sulfate could enhance intracellular

delivery in cell lines deficient in HS or GAG synthesis 11 similarly to what was

demonstrated with the infection of mature muscle fiber with the HSV-1 vector 18. This

suggests that electrostatic interactions with sulfated proteoglycans could play an important

role in initiating cell contact between cationic peptides and the cell membrane. To

determine if the overdeveloped extracellular matrix observed in dystrophic mice was

responsible for the poor transduction efficiency observed with Tat-eGFP, we repeated the

experiment with wild-type C57 BL 10J mice. The intra-muscular injection of Tat-β-

Galactosidase in the skeletal muscle following pretreatment with dextran sulfate did not

lead to any improvement. β-Galactosidase was still mainly located in the endomysium and

perimysium extracellular matrix of the injected muscles (Fig.2c). The pre-treatment of

muscles with dextran sulfate only increased β-galactosidase retention to the conjunctive

tissue surrounding muscle fibers, and this fused or not with a PTD. The use of a rhodamine-

labelled Tat/PTD peptide, without a cargo, further illustrates the resiliency of skeletal

muscle fibers to be transduced by a PTDs (Fig.2d). Even without carrying a protein cargo,

the fluorescent peptide could not be found in a significant number of undamaged fibers.

Although HSPGs are ubiquitously distributed in mammals 19, syndecan (transmembrane),

part of the most studied HSPG family, is down regulated in adult muscle while glypican

(membrane-associated) is up-regulated 14. It was suggested that syndecan may function as

a bFGF presenter during myoblast proliferation and glypican as FGF sequester after

differentiation to prevent to prevent the inhibitory effect of bFGF on myogenic

differentiation on adult muscle 20. Interestingly, bFGF is not the only member of the FGF

family that interacts with membrane bound HSPGs, FGF-4 (Kaposi FGF, another cell-

permeable peptide) also depends on interaction with cellular HS 21. If the interaction

between membrane bound GAGs and cationic peptides like Tat is essential, Tat-fusion

185

proteins might be sequestered away from the plasma membrane of skeletal muscles such as

it is the case for proliferative growth factors.

While dystrophin is a huge protein (427 kDa), truncated versions of it were isolated from

patients with less severe forms of muscular dystrophy 22. Artificial minigenes were also

experimented with success in the replacement of the missing naturally occurring form in

mice 23,24. Tat-microdystrophin versions could potentially be produced in bacteria or yeast

to be delivered in circulation to supplement for the missing protein in DMD patients.

Although skeletal muscle fibers could not be reached by such a strategy, heart cells,

however, have shown a therapeutically significant susceptibility to be transduced by

cationic peptides or PTD-fusion proteins. This approach could thus be complementary to

the treatment of skeletal muscles by cell transplantation. The design of a strategy aiming at

skeletal muscle fibers or the diaphragm would necessitate further improvements. If the high

concentration of sulfated proteoglycans in the periphery of muscle fibers is responsible for

their limited permeability to cationic peptides, two solutions can be proposed. The first one

consists in the development of a cell-permeable peptide sequence with low affinity to

sulfated proteoglycans. The second one is the digestion of extracellular matrix components

part of the basal lamina and connective tissue with proteases. The feasibility of the second

potential solution is unfortunately restricted since it could severely damaged muscles.

Application to cell-mediated therapies

Aiming directly at the diseased muscle tissue is not the only potential application of PTDs

in the treatment of muscular dystrophies. Several protocols, now in development, rely on

the capacity of stem cells or myogenic cells to carry a normal genome (or added therapeutic

genes) to treat those severe diseases. Several ex vivo gene therapy protocols require genetic

engineering to correct a particular genetic defect, increase the life span of the targeted cells

186

or overexpress a therapeutically significant gene, thus necessitating the use of several

different vectors at high dosage. Among the proteins that could be delivered into cells,

there are proteins to transiently immortalize, increase the life span, switch the

differentiation program of cells, integrate DNA to specific sites in the genome or decrease

cell death. Integrating recombinant viruses (retrovirus, lentivirus, AAV) can very well

perform these tasks, but not without leaving random integrative events potentially resulting

in armful insertional mutagenesis. On the other hand, non-integrating recombinant viruses

(Adenovirus, HSV) using the "latent episome strategy" not only result in a decreased long-

term transgene expression, they also contain highly immunogenic proteins preventing re-

administration and can be toxic. Cell-penetrating proteins could significantly help cell-

mediated based gene therapies by permitting safer interventions on cultured cells prior to

their transplantation.

Cell transplantation protocols incorporating ex vivo gene correction of cells isolated for

patients were designed to minimize immunological incompatibility. Unfortunately, when

cultured in vitro, myoblasts isolated from muscle biopsies of DMD patients generally

exhibit a limited proliferative life span and enter rapidly in senescence 25. This limited

proliferative capacity severely limits their ability to be genetically modified and used for

myoblast transplantation 26,27. Three avenues are currently tested to draw from the

regenerating potential of cells isolated from patients. These solutions include the use of

pluripotent non-differentiated stem cells, the immortalization of myogenic cells or the

switching of the differentiation program of differentiated non-myogenic cells with

extensive proliferation capacity.

Pluripotent stem cells isolated from embryos or adults have a very long life span in culture,

but they do not always participate efficiently to tissue regeneration. In fact, mouse

embryonic stem cells form teratomas when transplanted, suggesting that interfering with

the differentiation process of stem cells prior to their transplantation could be beneficial.

187

Pluripotent stem cells isolated from the bone marrow or skeletal muscle of adult mice often

yield inferior intra-muscular transplantation efficiency when compared with differentiated

myoblasts (unpublished results). We are currently investigating the potential of delivering

transcription factors implicated in muscle differentiation fused with Tat/PTD to enhance

myogenic conversion of pluripotent stem cells. Other groups have already undertaken

similar efforts. For example, Cdk inhibitor p21 has already been used in fusion with Tat to

enhance immortalized hepatocyte differentiation 28.

Cell transplantation has been hampered by the inability of committed primary cultured cells

to actively divide while maintaining their stage of differentiation and regeneration potential

29. Although oncogenes can confer a partial yet functional immortalization to human

myoblasts 27, reversing the immortalized phenotype would be highly desirable. Ideally,

Tat-oncoprotein fusions could be added to the cell culture medium to confer reversible

immortalization. A Tat-E7 fusion protein has already been experimented with by Lissy et

al. 30. While this approach is feasible, the large quantities of recombinant proteins

necessary to provide daily doses of oncoproteins to proliferating cells in a large-scale

human trial could be forbidding. A very attractive development was published recently.

PTDs such as Tat can efficiently deliver the functional Cre recombinase protein from

bacteriophage P1 into cultured cells or living tissue 31,32. A cell-penetrating Cre

recombinase could be used to remove an oncogene flanked by LoxP sites previously

inserted with an integrating virus. Immortalized myoblast clones could be screened for

unfortunate integrative events before their proliferation, immortalization reversal and

subsequent transplantation. The timely and restricted delivery of a simple protein offers

potentially more control and lesser immunogenecity in contrast with non-integrating

viruses and decreased insertional mutagenesis risks compared with integrating viruses.

Early cell death due to the transplantation procedure, mechanical stress, inflammation or

localized ischemic shock plagues myoblast transplantation like most cell transplantation

188

techniques 33-35. Decreasing early cell death by any means could reduce the amount of

cells to be proliferated in culture, the cost of cell transplantation therapies and the severity

of the surgical procedure. A team working on pancreatic islet transplantation as design a

fusion protein composed of the anti-apoptotic protein Bcl-Xl fused to the PTD of Tat 34.

Although the magnitude of the contribution of apoptosis in myoblast transplantation is still

unclear, increasing cell viability could prove to be an attractive strategy. Another approach

relies on the use of the superoxide dismutase fused to Tat/PTD. The cell viability of Hela

cells treated with paraquat, an intracellular superoxide anion generator, was increased by

transduced Tat-SOD 36. This technique could be adapted to protect myoblasts against the

oxidative burst of neutrophils present in the muscle tissue in the 24 hours following

transplantation 37.

Perspectives

With the increasing evidence showing that PTDs interact with GAGs before they cross cell

membranes 10,11,38, a more profound understanding of the role played by this interaction

and of the entry mechanism of PTD-fusion proteins is needed before we can optimize their

delivery to muscle fibers. In contrast, the use of PTDs to deliver proteins in cultured cells

of interest, for DMD treatment with cell transplantation, is progressing more rapidly. While

the purification and the transduction efficiency remain problematic in some instances, the

relative safety and the potential advantages of timely and controlled delivery using PTDs

outweigh their limitations. These issues should motivate investigators involved in the cell

transplantation field to incorporate more cell-penetrating protein strategies to their

protocols to replace integrating viruses.

189

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