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n° 2010-ISAL-0065 Année 2010

THÈSE

présentée devant

L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUÉES DE LYON

pour obtenir

LE GRADE DE DOCTEUR

École Doctorale Interdisciplinaire Science Santé (ED205)Champ disciplinaire : Biochimie

Rôle des hydroxy-alkénals, dérivés de peroxydation lipidique,dans la physiopathologie de l’insulino-résistance

Effets du 4-hydroxy-2-hexénal et du 4-hydroxy-2-nonénalsur les voies de signalisation et la fonction biologique de l’insuline

Soutenue publiquement le 20 septembre 2010 par

Nicolas PILLON

Sous la direction de :Pr. Michel LAGARDE et Dr. Christophe SOULAGE

Membres du Jury :Pr. Michel LAGARDE, Directeur de thèseDr. Anne NÈGRE-SALVAYRE, RapporteurPr. Anne-Marie ROUSSEL, ExaminateurDr. Christophe SOULAGE, Directeur de thèseDr. Jean-François TANTI, RapporteurDr. Hubert VIDAL, Président du jury

Thèse réalisée au sein de l’unité INSERM U870 / INSA de Lyon"Régulations Métaboliques, Nutrition et Diabète"

Préface

Ce travail a été réalisé au sein de l’unité dirigée par Hubert Vidal :

"Régulations métaboliques, Nutrition et Diabètes"INSERM U870 ; UCBL ; INSA ; INRA U1235 ; HCL

IMBL, 11 Av. Jean Capelle69621 Villeurbanne, France

Il a donné lieu à la rédaction des articles suivants :

NJ. Pillon, L. Soulere, RE. Vella, M. Croze, BR. Care, HA. Soula, A. Doutheau, M. Lagarde,CO. Soulage. «Quantitative structure-activity relationship for 4-hydroxy-2-alkenal induced cy-totoxicity in L6 muscle cells». Publié dans Chemico-biological Interactions, 2010.

NJ. Pillon, L. Soulere, RE. Vella, M. Lagarde, CO. Soulage. «Functional changes in humaninsulin induced by lipid peroxidation products 4-hydroxy-2-nonenal and 4-hydroxy-2-hexenal».Soumis.

NJ. Pillon, B. Zarrouki, L. Soulere, YH. Chionh, A. Makino, RE. Vella, A. Carravieri, R.Colas, M. Guichardant, M. Lagarde and CO. Soulage. «Omega-3 fatty acid peroxidation by-product 4-hydroxy-2-hexenal impairs insulin signaling in L6 muscle cells». Soumis.

Et à la présentation des communications suivantes :

N. Pillon, L. Soulère, M. Lagarde, C. Soulage. «Altération de la fonction biologique del’insuline par les produits de peroxydation lipidique 4-hydroxy-2-hexénal (4-HHE) et 4-hydroxy-2-nonénal (4-HNE)». Poster oral, congrès annuel de la SFD, mars 2010 (Lille)

N. Pillon, M. Lagarde, C. Soulage. «Role of lipid peroxidation by-products 4-hydroxy-2-nonenal and 4-hydroxy-2-hexenal in the pathophysiology of insulin resistance». Communicationorale, 1st Meeting of Inserm-Riken Lipidomics Unit, juin 2009 (Lyon)

N. Pillon, M. Lagarde, C. Soulage. «Advanced lipid peroxidation by-products 4-hydroxy-2-nonenal and 4-hydroxy-2-hexenal impair insulin signaling in L6 muscle cells». Communicationorale, séminaire doctorant de l’IFR62, mai 2009 (Lyon)

N. Pillon, M. Lagarde, C. Soulage. «Impact des produits électrophiles de peroxydation li-pidique 4-HHE et 4-HNE sur la voie de signalisation de l’insuline». Présentation orale invité,transversalité de l’INRA : réactivité des lipides insaturés, mars 2008 (Lyon)

N. Pillon, B. Zarrouki, M. Lagarde, C. Soulage. «Altération des voies intracellulaires designalisation de l’insuline dans les cellules adipeuses et musculaires par les produits de per-oxydation lipidique 4-hydroxy-2-hexénal (4-HHE) et 4-hydroxy-2-nonénal (4-HNE)». Poster,congrès annuel de l’ALFEDIAM, mars 2009 (Strasbourg)

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Je tiens à remercier toutes les personnes qui ont pris part à ces travaux, etparticulièrement :

Christophe Soulage, sans qui ce travail n’aurait jamais vu le jour. Je le remercie pourson encadrement, ses conseils, sa disponibilité et son soutien pendant ces 4 années passées aulaboratoire. Je le remercie également pour la confiance qu’il m’a toujours accordée, en ce quiconcerne mes travaux, mais aussi en me laissant encadrer des étudiants et en me permettant defaire mes premiers pas dans l’enseignement. Toute l’experience que j’ai acquise au cours de cesannées, c’est grâce à lui.

Michel Lagarde, pour son aide et son soutien tout au long de ces 4 ans. Pour son expertisebiochimique, souvent complémentaire de notre approche physiologique et son aide stimulantepour la rédaction des publications.

Bader Zarrouki, pour son soutien à mon arrivée au laboratoire, pour son expérience, sabonne humeur, et surtout son amitié.

Hédi Soula et Bertrand Caré, pour les discussions animées et fructueuses, et pour toutesles questions naives de biologie auxquelles on ne sait pas quoi répondre...

Asami Makino, pour son expertise en immunofluorescence.

Roxane, Alice, Emilie K., Yok-Hian, Emilie E., Virginie, Laetitia et Marine, pourleur aide et leur participation à l’ensemble du projet au cours de leurs séjours au laboratoire.

Tous les membres des deux équipes du laboratoire, pour leurs aides ponctuelles et leurparticipation au bon fonctionnement et à la bonne humeur du laboratoire !

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Résumé

Rôle des hydroxy-alkénals, dérivés de peroxydation lipidique,dans la physiopathologie de l’insulino-résistance

Le stress oxydant semble impliqué dans le développement de la résistance périphérique àl’insuline conduisant au diabète de type 2. Les membranes biologiques, par leur richesse enacides gras polyinsaturés, constituent des cibles privilégiées pour les espèces oxydantes. Laperoxydation des membranes biologiques est ainsi à l’origine de la production de nombreusesespèces réactives parmi lesquelles les aldéhydes 4-hydroxy-2-hexénal (HHE) et 4-hydroxy-2-nonénal (HNE), dérivant respectivement de la peroxydation des acides gras polyinsaturés desfamilles omega-3 et omega-6.

La présente étude démontre que la concentration plasmatique de HHE est augmentée chezl’homme et chez le rat au cours du diabète et qu’une injection intraveineuse de HHE conduitau développement d’une résistance à l’insuline chez le rat. Sur des lignées de cellules muscu-laires (L6C5) et d’adipocytes (3T3-L1) en culture, HHE et HNE provoquent une carbonylationmassive des protéines cellulaires et induisent une insulino-résistance en perturbant le transportde glucose ainsi que les voies de signalisation de l’insuline. Ces effets délétères peuvent êtrecontrecarrés par une augmentation du glutathion réduit ou par des traitements antioxydants.HHE et HNE peuvent également former des adduits covalents sur l’insuline, diminuant ainsison effet hypoglycémiant in vivo et la stimulation du transport de glucose in vitro.

HHE et HNE sont impliqués dans le développement de l’insulino-résistance en perturbant à lafois les voies intracellulaires de signalisation et la fonction biologique de l’insuline. Ils constituentdonc des cibles pharmacologiques potentielles pour la prévention du diabète de type 2.

Mots clés Stress Oxydant, 4-hydroxy-2-hexénal (HHE), 4-hydroxy-2-nonénal (HNE), insulino-résistance, diabète, peroxydation lipidique

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Summary

Role of hydroxy-alkenals, derived from lipid peroxidation,in the pathophysiology of insulin-resistance

Oxidative stress appears to be involved in the development of peripheral insulin resistanceleading to type 2 diabetes. Biological membranes, because of their high polyunsaturated fattyacids, are prime targets for oxidant species. Peroxidation of biological membranes is responsiblefor the production of many reactive species including aldehydes 4-hydroxy-2-hexenal (HHE)and 4-hydroxy-2-nonenal (HNE), respectively derived from the peroxidation of omega-3 andomega-6 polyunsaturated fatty acids.

This study demonstrates that plasma concentration of HHE is increased in humans andrats during diabetes, and that intravenous injection of HHE lead to the development of insulinresistance in rats. In muscle cells (L6C5) and adipocytes (3T3-L1), HHE and HNE cause massivecarbonylation of cellular proteins and induce insulin resistance by disrupting glucose transportand the signaling pathways of insulin. These disorders can be reversed by an increase of reducedglutathione or by antioxidant treatment. HHE and HNE can also form covalent adducts oninsulin, thereby reducing its hypoglycemic effect in vivo and stimulation of glucose transport invitro.

HHE and HNE are involved in the development of insulin resistance by disrupting both theintracellular signaling pathways and biological function of insulin. They are therefore potentialdrug targets for the prevention of type 2 diabetes.

Keywords Oxidative stress, 4-hydroxy-2-hexenal, 4-hydroxy-2-nonenal, insulin-resistance, dia-betes, lipid peroxidation

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Table des matières

Préface . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1Résumé . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4Table des matières . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5Abréviations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8Liste des figures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10Liste des tableaux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1 Rappels Bibliographiques 131.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131.2 Le stress oxydant . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.2.1 Les mécanismes pro-oxydants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.2.2 Les mécanismes anti-oxydants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181.2.3 Les 4-hydroxy-2-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.3 La régulation de la glycémie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281.3.1 L’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 281.3.2 Les voies intracellulaires de signalisation de l’insuline . . . . . . . . . . . . 341.3.3 Le diabète . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

1.4 Stress oxydant et insulino-résistance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 441.4.1 Rôle des radicaux libres dans la signalisation insuline . . . . . . . . . . . . 441.4.2 Rôle du stress oxydant dans l’insulino-résistance . . . . . . . . . . . . . . 451.4.3 Rôle du stress oxydant au cours du diabète . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Problématique 48

2 Matériel et Méthodes 492.1 Dosage plasmatique du 4-HHE et du 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492.2 Culture cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

2.2.1 Myoblastes L6C5 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502.2.2 Adipocytes 3T3-L1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512.2.3 Mesure de la viabilité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522.2.4 Mesure de la nécrose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522.2.5 Mesure de l’aptoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

2.3 Immunoprécipitation et Immunodétection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532.4 Transport de glucose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 552.5 Imagerie cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

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TABLE DES MATIÈRES

2.6 Dosage du Glutathion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 562.7 Production d’espèces radicalaires de l’oxygène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 562.8 Carbonylation des protéines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.9 Analyse de l’insuline en spectrométrie de masse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.10 Test de tolérance à l’insuline (ITT) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.11 Clamp hyperinsulinémique euglycémique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 572.12 Calcul des descripteurs moléculaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 582.13 Statistiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

3 4-HHE et 4-HNE in vivo 603.1 Concentrations chez le diabétique de type 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.2 Concentrations chez le rat diabétique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.3 Insulino-résistance in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4 Stress oxydant, carbonylation et toxicité 644.1 Viabilité et mortalité cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 644.2 Carbonylation des protéines cellulaires . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 654.3 Production d’espèces radicalaires de l’oxygène . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 674.4 Ultrastructure cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 694.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

5 Insulino-résistance in vitro 715.1 Transport de glucose induit par l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 715.2 Voies de signalisation de l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 745.3 Rôle du glutathion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 765.4 Rôle des antioxydants et des chélateurs d’aldéhydes . . . . . . . . . . . . . . . . . 795.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

6 Adduction de l’insuline 846.1 Analyse de la formation d’adduits . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 846.2 Modélisation de la structure de l’insuline modifiée . . . . . . . . . . . . . . . . . 876.3 Effet biologique des insulines modifiées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 906.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

7 Relation structure/activité 947.1 Cytotoxicité des hydroxy-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 947.2 Mécanisme de la toxicité des hydroxy-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 967.3 Analyse structure/activité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 997.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

8 Discussion générale 1058.1 Pertinence des concentrations utilisées et du modèle . . . . . . . . . . . . . . . . 1058.2 Toxicité des hydroxy-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1068.3 Rôle des hydroxy-alkénals dans l’insulino-résistance . . . . . . . . . . . . . . . . . 107

8.3.1 Insulino-résistance in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1078.3.2 Inhibition des voies de signalisation de l’insuline . . . . . . . . . . . . . . 107

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TABLE DES MATIÈRES

8.3.3 Altération de la fonction biologique de l’insuline . . . . . . . . . . . . . . 1088.4 Rôle du glutathion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1098.5 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

Bibliographie 112

Annexes 132

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Abréviations

– 4-HDDE, HDDE : 4-hydroxy-2-dodécadiénal– 4-HHE, HHE : 4-hydroxy-2-hexénal– 4-HNE, HNE : 4-hydroxy-2-nonénal– AGD : aminoguanidine– AGNE : acides gras non estérifiés, voir AGL– AGL : acides gras libres– AGPI : acides gras polyinsaturés– D3T : 3H-dithiol-3-thione– DCFDA : dichlorofluorescein diacetate, sonde fluorescente utilisée pour mesurer les ROS– DID : Diabète Insulino-Dépendant, diabète de type 1 (T1D)– DMSO : Dimethyl Sulfoxide– DNID : Diabète Non Insulino-Dépendant, diabète de type 2 (T2D)– DNPH : Dinitrophenyl hydrazine– ERK : Extracellular Regulated Kinase– GC : Gas Chromatography (Chromatographie en phase gazeuse)– GIR : Glucose Infusion Rate (Taux de perfusion de glucose lors des expériences de clamp

hyperinsulinémique euglycémique)– GLUT4 : Glucose Transporter 4– GPx : Glutathion Peroxydase– GSH : Glutathion réduit– GSK : Glycogen synthase kinase– GSSG : Glutathion oxydé– GST : Glutathion-S-Transferase– HOMA : HOmeostasis Model Assessment, index d’insulino-résistance périphérique– HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Chromatographie Liquide Haute Per-

formance)– IAP : Islet Amyloid Protein– IBMX : 3-isobutyl,1-méthylxanthine– IGF : Insulin-like growth factor– IGF-R : Insulin-like growth factor receptor– IMC : Indice de Masse Corporelle (Body Mass Index ou BMI en anglais)– IRβ : Insulin Receptor, sous-unité beta– IRS : Insulin Receptor Substrate– ITT : Insulin Tolerance Test, Test de Tolérance à l’Insuline– JNK : c-jun N-terminal Kinase– LDH : lactate deshydrogenase

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TABLE DES MATIÈRES

– LDL : Low Density Lipoprotein (Lipoprotéine de faible densité)– LogP : Coefficient de partage Octanol-Eau, index de solubilité/hydrophobicité– LUMO : Lowest Unoccupied Molecular Orbital, index d’électrophilie– MAPK : Mitogen Activated Protein Kinase– MDA : dialdéhyde malonique (malondialdehyde)– mTOR : Mammalian Target of Rapamycin– MTT : bromure de 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium– NAC : N-acétyl-cystéine– NAD/NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide (oxydé/réduit)– NADP/NADPH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide phosphate (oxydé/réduit)– NFκB : Nuclear Factor-kB– OGTT : Oral Glucose Tolerance Test (Test oral de tolérance au glucose)– PDK1 : Pyruvate Dehydrogenase Kinase isozyme 1– PEPCK : Phophoenol Pyruvate Carboxy Kinase– PGF2α : Prostaglandine F2α– PHG : Production Hépatique de Glucose– PI3K : Phosphadidyl-inositol-3-kinase– PIP2/PIP3 : Phosphatidyl Inositol bis-Phosphate/tris-Phosphate– PKB/Akt : Protéine Kinase B– PKC : Protéine Kinase C– PPAR : Peroxisome Proliferator-Activated Receptor– PTP : Phospho-Tyrosine-Phosphatase– RLIP : Ral Interacting Protein, effecteur des petites protéines G de la famille Ral– RNS : espèces radicalaires de l’azote (reactive nitrogen species)– ROS : espèces radicalaires de l’oxygène (reactive oxygen species)– RPE : Résonance Paramagnétique Électronique– RTK : Récepteur à activité Tyrosine Kinase– SAMe : S-adenosyl-methionine– SDS : Sodium Dodecyl Sulfate– SNARE : Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor Attachment protein Receptor– SOD : Superoxyde Dismutase– SSAO : Semicarbazide-Sensitive Amine Oxidase– SVF : Sérum de Veau Fœtal– TBARS : ThioBarbituric Acid Reactive Substances, substances réagissant avec l’acide

thiobarbiturique (essentiellement le MDA)– TGF : Transforming Growth Factor– TNFα : Tumor Necrosis Factor

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Table des figures

1.1 Balance pro-oxydants - antioxydants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141.2 Production des ROS et RNS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151.3 Mécanisme de la peroxydation lipidique non enzymatique . . . . . . . . . . . . . 181.4 Formule générale des tocophérols . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191.5 Mécanisme d’action du glutathion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 201.6 Dégradation schématique des acides gras en hydroxy-alkénals . . . . . . . . . . . 211.7 Structure chimique générale des 4-hydroxy-2-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . 221.8 Mécanisme d’adduction par les hydroxy-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . . . 231.9 Adduction en domino par le 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.10 Voies de signalisation activées par le 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 261.11 Détoxification du 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 271.12 Structure de l’insuline, chaînes A et B . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 291.13 Biosynthèse de l’insuline dans les cellules β pancréatiques . . . . . . . . . . . . . 301.14 Biosynthèse de l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 311.15 Sécrétion de l’insuline par les cellules β pancréatiques . . . . . . . . . . . . . . . . 321.16 Structure du récepteur de l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 341.17 Voies de signalisation activées par l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 371.18 Age des personnes diabétiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 381.19 Relation entre la glycémie et l’insulinémie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 391.20 Insulino-résistance du tissu adipeux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 411.21 Insulino-résistance musculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 421.22 Problématique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

2.1 Chromatogramme GC/MSMS typique du dosage 4-HHE et 4-HNE . . . . . . . . 502.2 Culture de myoblastes L6 et d’adipocytes 3T3-L1. . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.1 4-HHE et du 4-HNE plasmatiques chez les sujets diabétiques de type 2 . . . . . . 613.2 4-HHE et carbonyles plasmatiques chez le rat diabétique . . . . . . . . . . . . . . 623.3 Clamp hyperinsulinémique euglycémique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.1 Carbonylation des protéines dans les cellules L6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 664.2 Adduits de Michael dans les cellules L6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 674.3 Colocalisation des Adduits du 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 684.4 Production de ROS par le 4-HHE et le 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 684.5 Structure cellulaire en microscopie électronique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

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TABLE DES FIGURES

5.1 Transport du glucose basal dans les myoblastes L6 . . . . . . . . . . . . . . . . . 715.2 Transport du glucose dans les myoblastes L6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 725.3 Transport de glucose dans les adipocytes 3T3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 735.4 Phosphorylation de la protéine kinase B (PKB/Akt) . . . . . . . . . . . . . . . . 755.5 Phosphorylation de l’IRS-1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 765.6 Activation des voies de stress MAPK : ERK, JNK et p38 . . . . . . . . . . . . . 775.7 Diminution du glutathion par le 4-HHE et le 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . 785.8 Structure chimique du 3H-dithiole-3-thione (D3T) . . . . . . . . . . . . . . . . . 785.9 Rôle du glutathion dans la toxicité du 4-HHE et du 4-HNE . . . . . . . . . . . . 795.10 Restauration de la viabilité par le D3T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 805.11 S-adénosyl-méthionine et toxicité du 4-HHE et du 4-HNE . . . . . . . . . . . . . 815.12 Aminoguanidine et toxicité du 4-HHE et du 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . . 825.13 N-acétyl-cystéine et toxicité du 4-HHE et du 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . . 83

6.1 Carbonylation de l’insuline par le 4-HHE et le 4-HNE . . . . . . . . . . . . . . . 856.2 MALDI-TOF des insulines modifiées par 4-HHE et 4-HNE . . . . . . . . . . . . . 866.3 MALDI-TOF après trypsinisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 896.4 Localisation des sites d’adduction sur l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 906.5 Modélisation de l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 916.6 Modélisation de l’insuline modifiée par le 4-HHE . . . . . . . . . . . . . . . . . . 916.7 Activité biologique des insulines modifiées . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

7.1 Effets de la structure chimique sur la viabilité cellulaire . . . . . . . . . . . . . . 957.2 Effets de la structure chimique sur la mortalité cellulaire . . . . . . . . . . . . . . 967.3 Corrélations entre viabilité, nécrose et apoptose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 977.4 Carbonylation de la BSA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 987.5 Hydrolyse spontanée du HNEA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 997.6 Corrélations avec le PNSA3 et le WNSA3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1007.7 Corrélations après élimination des dérivés acétals . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

8.1 Schéma de synthèse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

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Liste des tableaux

1.1 Caractéristiques chimiques des hydroxy-alkénals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221.2 Concentration plasmatique de 4-HNE libre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241.3 Concentrations tissulaires de 4-HNE libre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2.1 Préparation des gels pour migration en SDS-PAGE . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

3.1 Caractéristiques des sujets témoins et diabétiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.1 Viabilité des myoblastes L6 après 30 minutes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 654.2 Viabilité des adipocytes 3T3-L1 après 30 minutes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

6.1 Calcul du nombre d’adduits sur l’insuline . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 876.2 LC/MSMS après trypsinisation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

7.1 Caractéristiques des molécules testées en relation structure/activité . . . . . . . . 1037.2 IC50 calculées à l’aide du test MTT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1047.3 Corrélations entre logIC50 et descripteurs moléculaires . . . . . . . . . . . . . . . 104

8.1 Références des anticorps utilisés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1328.2 Valeurs individuelles des descripteurs moléculaires . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

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Chapitre 1

Rappels Bibliographiques

1.1 Introduction

Obésité, diabètes et maladies cardio-vasculaires constituent à l’heure actuelle un problèmede santé publique majeur dans le monde. Même si ces maladies ont longtemps été associées auxpays dits industrialisés, le diabète et l’obésité touchent désormais des pays du Moyen-Orient,de l’Amérique du Sud et même de l’Afrique. En France en 2009, d’après l’étude ObePi 1, 31,9%des adultes sont en surpoids, 6,5 millions sont obèses (IMC ≥ 30 kg/m2), 5,4% sont traitéspour un diabète et environ 15% pour une dyslipidémie. Dans le monde, ce sont 171 millions depersonnes qui sont concernées par le seul diabète de type 2, et l’OMS prédit un doublement dece chiffre d’ici 2030. Comprendre les mécanismes aboutissant au développement du diabète estdonc un enjeu majeur de la recherche actuelle.

Obésité, diabètes et maladies cardio-vasculaires sont intimement liés. Un de leurs pointscommuns est la présence dans tous les cas d’un stress oxydant. Celui-ci résulte d’une productionexcessive d’éléments pro-oxydants (espèces radicalaires de l’oxygène par exemple) et/ou undéficit des défenses anti-oxydantes de l’organisme faisant pencher la balance en faveur d’unétat pro-oxydant. Lors de ce stress, tous les éléments cellulaires sont affectés, en particulier leslipides. Les acides gras poly-insaturés, tels que ceux des séries ω-3 et ω-6, sont très sensibles auxattaques oxydantes et aboutissent à la formation de dérivés toxiques, notamment des aldéhydes,capables de potentialiser et de transmettre les effets néfastes du stress oxydant.

1.2 Le stress oxydant

Exposition prolongée au soleil ou à l’ozone, tabagisme, consommation excessive d’alcool,contact avec des agents cancérigènes, consommation de médicaments, pollution, etc. sont autantde situations à l’origine d’un stress oxydant. Celui-ci résulte d’un déséquilibre entre la productiond’espèces oxydantes et leur élimination par les systèmes de défenses anti-oxydantes (fig.1.1).Des travaux récents ont mis en évidence que le stress oxydant est impliqué dans de nombreusespathologies telles que l’obésité [210, 193], le diabète de type 2 [226], l’athérosclérose [190, 236]et les maladies neurodégénératives [130, 237]. Le rôle du stress oxydant a également été évoquédans des processus physiologiques tel que le vieillissement [78].

1. Etude Obepi 2009, enquête épidémiologique permettant le suivi de l’évolution du surpoids et de l’obésitédans la population adulte française (18 ans et plus), réalisée tous les trois ans depuis 1997

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CHAPITRE 1. RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES

1.2.1 Les mécanismes pro-oxydants

Stress oxydant et stress nitrosylant

Le déséquilibre de la balance anti-oxydants/pro-oxydants (fig. 1.1) entraîne une accumula-tion excessive de radicaux libres pouvant engendrer des dommages importants sur la structureet le métabolisme cellulaire. Plusieurs espèces différentes d’oxydants radicalaires peuvent êtregénérées à partir de l’oxygène moléculaire par l’intervention de différentes enzymes et de mé-taux, en particulier les enzymes mitochondriales et le fer (fig. 1.2). On en distingue deux types :les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et les espèces réactives de l’azote (RNS). Du fait deleur structure chimique particulière, RNS et ROS sont des molécules extrêmement réactives,capables d’interagir aussi bien avec les protéines et les lipides qu’avec les acides nucléiques.Cette capacité est souvent liée, au niveau atomique, à la présence d’un électron célibataire (nonapparié) dans leur orbitale externe. Cette situation étant très instable, les radicaux ont unedurée de vie très courte : ils réagissent très rapidement avec les différentes molécules se trouvantdans leur entourage [71]. En principe, plus une espèce radicalaire est réactive, plus courte estsa demi-vie, puisqu’elle interagit plus rapidement avec d’autres molécules.

Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) ou le nitroperoxyde (ONOOH) ne sont pas des radicauxà proprement parler, mais demeurent très réactifs et sont susceptibles de servir de précurseurs.Ils sont appelés «espèces actives de l’oxygène». Par extension, l’ensemble des radicaux libreset de leurs précurseurs sont regroupés sous le terme «espèces réactives de l’oxygène» (ROS) et«espèces réactives de l’azote» (RNS).

Pro-oxydantstabac alcool médicaments

Anti-oxydantschélateurs des métaux de transition,

transferrine, ferritine, glutathion, vitaminesC et E, superoxyde dismutase, catalase

tabac, alcool, médicaments,radiations, agents cancérigènes,

pollution, ozone, agents infectieux

Figure 1.1 – Le stress oxydant résulte d’un déséquilibre entre la production deradicaux libres et leur élimination par les systèmes de défenses anti-oxydantes(déséquilibre REDOX)

Dans un système biologique, un radical peut voyager depuis son lieu de production versdifférents compartiments cellulaires et passer dans la circulation sanguine. Ainsi H2O2, peu

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1 e– 2H+ +2e– + 2H+1 e–

O2 O2•– H2O2 2 H2O

Oxydation mitochondrialeNADH/NADPH oxydaseP450 mono oxygénase

Superoxyde dismutase Catalase

Réactionde Fenton(Fe2+)

NO

P450 mono oxygénaseXanthine oxydaseCyclo oxygénaseLipoxygénase

ONOO• HO•

Figure 1.2 – La production des espèces radicalaires à partir de l’oxygène estcatalysée par différentes enzymes et aboutit à la formation des espèces radica-laires de l’oxygène (ROS).

réactif, a une demi-vie de quelques secondes et peut théoriquement parcourir des distances rela-tivement importantes, tandis que HO•, beaucoup plus réactif, possède une diffusion de l’ordred’une petite protéine. Ainsi l’anion radicalaire superoxyde (O•−2 ) et le monoxyde d’azote (NO•)sont peu réactifs comparativement aux radicaux peroxyles (ROO•) ou surtout au radical hy-droxyle (HO•), mais ils peuvent servir de précurseurs pour former des espèces plus réactives. Cesdeux radicaux O•−2 et NO• sont d’ailleurs utilisés par l’organisme comme médiateurs régulantnotamment la vasodilatation [232, 4].

Les radicaux libres

Étant très réactifs, ils ont une durée de vie extrêmement courte. Bien qu’il soit possible demesurer leur production et leur devenir par résonance paramagnétique électronique (RPE), celareste relativement difficile. Si bien que nos connaissances concernant leur production dans lesconditions physiologiques ou pathologiques sont encore limitées. Cependant, il est désormaisbien établi que la formation de radicaux libres peut s’effectuer au niveau de différents organitescellulaires :• Les mitochondries : elles constituent le principal site de production de ROS. La réduction

de l’oxygène moléculaire par les cytochromes respiratoires s’accompagne d’une formationparallèle d’ions superoxydes, d’eau oxygénée et éventuellement de radicaux HO•. Si cetteproduction de radicaux superoxydes reste faible en conditions physiologiques, elle peuts’amplifier lorsque la respiration devient plus intense (exercice physique) ou lorsqu’inter-viennent des désordres mitochondriaux génétiques, inflammatoires ou nutritionnels en-traînant un découplage mitochondrial.• Les microsomes : les cytochromes P450 utilisent l’oxygène moléculaire pour assurer les bio-

transformations, ce qui produit parallèlement des espèces réactives de l’oxygène. En pré-sence de cytochrome P450 réductase, de NADPH et d’oxygène, ces enzymes fonctionnentcomme des mono-oxygénases, scindant la molécule d’oxygène en espèces radicalaires.• Le cytosol : diverses réactions enzymatiques peuvent produire des radicaux superoxydes et

de l’eau oxygénée. Ainsi, la xanthine oxydase, l’aldéhyde oxydase et la galactose oxydasesont à l’origine de la formation de radicaux superoxydes O•−2 . La monoamine oxydaseproduit de l’eau oxygénée H2O2 qui peut réagir par exemple avec le fer pour donner leradical HO• (réaction de Fenton).

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• Les peroxysomes : ces vésicules contiennent des enzymes utilisant l’oxygène pour neutra-liser les substances nuisibles ou toxiques à la cellule. Par leur fonction, les peroxysomessont donc un site important de production de radicaux.

La génération de radicaux libres apparaît donc essentiellement intracellulaire, mais peutégalement s’effectuer dans les membranes plasmiques, où la SSAO et la NADPH oxydase peuventproduire à ce niveau H2O2 et O•−2 .

Dans le milieu extracellulaire, l’inflammation est une source importante de radicaux oxy-génés produits directement par les cellules phagocytaires activées. La NADPH oxydase, pré-sente dans les polynucléaires neutrophiles, utilise l’oxygène pour produire de grandes quantitésd’anions superoxydes, intervenant dans leur propriétés bactéricides [198]. De plus, les cellulesinflammatoires peuvent produire des cytokines comme le TNFα qui est un puissant inducteurde la production de radicaux libres mitochondriaux. Au niveau de l’endothélium vasculaire, lemonoxyde d’azote NO, radical produit à partir de l’arginine, est un puissant vasodilatateur. Enprésence de l’anion superoxyde O•−2 , il forme l’anion peroxynitrite ONOO• qui en milieu acideest à l’origine des radicaux HO• et NO•2. La production de radicaux dans le milieu extracellu-laire peut également provenir de phénomènes d’auto oxydation de l’hémoglobine, des flavinesréduites, des quinones réduites, des catécholamines...

Lorsque deux radicaux libres réagissent, ils mettent en commun leur électron célibatairepour former un doublet, ce qui entraîne leur disparition en tant qu’espèces radicalaires.

R• +R′• −→ R−R′

Mais lorsqu’un radical libre réagit avec une molécule ne comportant pas d’électron célibataire,il provoque la formation d’un nouveau radical :

R• +R′ −→ R+R′•

Ce nouveau radical va à son tour réagir avec une autre molécule. L’exemple le plus connu de cetype de propagation est celui de la peroxydation des lipides. Les réactions suivantes illustrentcette possibilité (L = lipide).

R• + LH −→ L• +RHL• +O2 −→ LOO•

LOO• + L′H −→ L′OOH + L′•

Ce type de réactions radicalaires est à l’origine de la peroxydation lipidique se traduisant auniveau macroscopique par le rancissement des huiles et des graisses.

Les espèces radicalaires étant très réactives, elles réagissent avec les premières moléculesrencontrées : lipides, acides nucléiques et acides aminés. Les dommages liés à un stress oxydantse traduisent par diverses altérations biochimiques intracellulaires telles que des modificationsoxydatives de l’ADN [231, 38, 126], des protéines [40, 160, 189] ou encore la peroxydation deslipides [70, 79] .

La peroxydation lipidique

Les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont des cibles privilégiées des espèces radicalaires del’oxygène. Leurs doubles liaisons facilitent l’arrachement d’un hydrogène (proton + électron) parun radical. L’atome de carbone qui a alors perdu son hydrogène se retrouve avec un électroncélibataire et devient donc un nouveau radical libre. Cet électron célibataire déclenche une

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réaction en chaîne. En se déplaçant dans la molécule, il va provoquer des réarrangements,notamment au niveau des doubles liaisons, puis se fixer à nouveau sur une autre molécule, cecijusqu’à ce qu’il soit piégé ou qu’il réagisse avec un autre radical. Plus l’acide gras est insaturé etplus il est peroxydable, c’est-à-dire dégradable par un processus oxydatif non enzymatique. Cetype de peroxydation lipidique est à l’origine de la formation d’aldéhydes comme le dialdéhydemalonique (malondialdehyde ou MDA en anglais), le 4-hydroxy-2-nonénal (4-HNE) issu de laperoxydation des AGPI de la série n-6 et le 4-hydroxy-2-hexénal (4-HHE) issu de la peroxydationdes AGPI de la série n-3. Le cycle d’autoxydation des AGPI comporte trois phases : une phased’initiation, une phase de propagation et une phase de terminaison.

Mécanisme de la peroxydation lipidique non enzymatique (fig. 1.3)• Phase d’initiation : Le mécanisme de peroxydation lipidique est initié lorsqu’une espèce

radicalaire arrache un atome d’hydrogène provenant d’un groupement −CH2− d’un acidegras polyinsaturé (RH). Cette phase d’initiation aboutit à la formation de radical d’acidegras (R•) (fig. 1.3). Le radical libre ainsi obtenu est stabilisé par un réarrangement élec-tronique conduisant à la formation de deux diènes conjugués, isomères de position. Laformation de ces diènes conjugués est elle-même un marqueur de la présence d’un stressoxydant et peut être suivie en spectrophotométrie UV.

• Phase de propagation : C’est une étape d’amplification où le radical libre se combine avecl’oxygène, dont la concentration dans les tissus (5-6 mmHg) et le sang est toujours trèssupérieure à la concentration nécessaire pour former un radical peroxyle (ROO•). Cedernier réagit avec une molécule lipidique voisine (R′H) entraînant la formation d’unhydroperoxyde (ROOH) et d’un nouveau radical alkyle (R•) qui assure la propagationde la réaction (fig. 1.3). Il est admis que chaque radical R• peut être à l’origine d’unecentaine de molécules d’hydroperoxydes. Ceux-ci étant instables, ils se décomposent enradicaux alkoxyles (RO•) ou peroxyles (ROO•) par clivage homolytique en présence demétaux de transition ou encore en alcanes, acides ou aldéhydes.

• Phase de terminaison : Cette étape permet la stabilisation des radicaux. Le radical (R•)réagit avec un autre radical libre (ROO•) ou (R•), ce qui permet la neutralisation desradicaux libres en associant entre eux deux électrons célibataires. La terminaison peutégalement avoir lieu en faisant intervenir des molécules antioxydantes qui jouent le rôlede piégeur de radicaux interrompant ainsi la réaction en chaîne.

Produits d’oxydation liés à la peroxydation lipidique : La peroxydation lipidique nonenzymatique est toxique du fait de la présence d’une part, d’espèces radicalaires générées etd’autre part d’aldéhydes issus des réactions de scission des hydroperoxydes.

Produits primaires : La présence sur un acide gras d’un groupement peroxyle entraîne desmodifications structurales des membranes. Le fonctionnement des enzymes et des récep-teurs membranaires peut ainsi être perturbé par la modification de la fluidité et de laperméabilité des membranes. Toutes ces altérations fragilisent l’intégrité des membraneset peuvent conduire à la lyse des organites et/ou des cellules.

Produits secondaires : Ce sont essentiellement des aldéhydes, acides et hydrocarbures, tousissus de la dégradation des hydroperoxydes.

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H

Radical d’acide grasAcide gras Diène conjugué

+O2

Radical d acide grasAcide gras Diène conjugué

O2

PropagationRadical d’acide grasH d d

OOH Radical peroxyle

OO•+ Hydroperoxyde

lk l

OOH

Alkoxyles,alcanes,

aldéhydes….

Hydroperoxyde

Figure 1.3 – Mécanisme de la peroxydation lipidique non enzymatique

1.2.2 Les mécanismes anti-oxydants

L’organisme limite l’extension des réactions radicalaires par trois mécanismes :• par des réactions enzymatiques• par piégeage des métaux• par des antioxydants susceptibles de piéger les radicaux libres sous une forme peu réactive

Antioxydants enzymatiques

Les superoxydes dismutases (SOD) sont des métalloprotéines possédant une activité en-zymatique antioxydante. Elles sont présentes dans le cytoplasme sous une forme associée aucuivre et au zinc (CuZn-SOD) et dans les mitochondries sous une forme associée au manga-nèse (Mn-SOD). Escherichia coli et d’autres bactéries possèdent quant à elles une SOD associéeau fer (Fe-SOD). Les SOD sont capables d’éliminer l’anion superoxyde par une réaction dedismutation, transformant les radicaux superoxydes en peroxydes d’hydrogène [1] .

O•−2 +O•−2 + 2H+ −→ H2O2 +O2

La transformation du radical superoxyde en H2O2 peut s’effectuer spontanément mais l’enzymeaccélère environ 10 000 fois cette réaction. Elle a un effet protecteur contre les réactions radi-calaires dans la mesure où la catalase et la glutathion peroxydase sont suffisantes pour détruirele H2O2 formé. Dans le cas contraire l’excès de H2O2, surtout en présence de métaux, conduità la formation des radicaux HO•, extrêmement toxiques (réaction de Fenton).

Les catalases sont présentes dans un grand nombre de tissus mais sont particulièrementabondantes dans le foie et les globules rouges [127]. Elles catabolisent les peroxydes d’hydrogèneen molécules d’eau pour prévenir la formation de radicaux hydroxyles.

2H2O2 −→ 2H2O +O2

Les glutathion peroxydases sont des protéines qui ont en commun une structure tétramè-rique, chaque tétramère possédant un atome de sélénium dans son site actif [127]. Elles sontprésentes à la fois dans le cytosol et dans les mitochondries de la plupart des tissus où elle

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réalisent la quasi-totalité de l’élimination de H2O2 et des hydroperoxydes ROOH. Le maintiende l’activité de la glutathion peroxydase nécessite la régénération du glutathion réduit GSH,assurée par la glutathion réductase à partir du NADPH, lui-même régénéré par la voie despentoses.

Antioxydants non-enzymatiques

Un certain nombre de substances s’opposent à la propagation des réactions radicalaires, ouparticipent à la terminaison des réactions en chaîne. Elles forment à partir d’un radical trèsréactif un autre radical beaucoup moins réactif ou servent d’accepteur terminal d’électrons. Cesantioxydants sont classés en liposolubles, protégeant essentiellement les membranes biologiquesou hydrosolubles.

Antioxydants liposolubles La vitamine E est le nom commun utilisé pour toutes les molé-cules possédant des activités biologiques identiques à celles de la famille des tocophérols [221].La forme naturelle de la vitamine E inclut quatre tocophérols isomères α, β, γ, δ, qui diffèrentseulement par quelques groupements chimiques (fig. 1.4) et qui présentent un potentiel anti-oxydant plus ou moins important. Lors de l’initiation de la peroxydation lipidique, suite à uneattaque radicalaire, l’α-tocophérol cède son hydrogène situé dans le noyau phénolique, réduisantainsi le radical RO•, et constitue par ce biais le seul antioxydant liposoluble assurant cetteprotection.

Figure 1.4 – Formule générale des tocophérols. Seuls les groupementsR1, R2 et R3 diffèrent entre les isoformes α (R1=CH3, R2=CH3,R3=CH3), β (R1=CH3, R2=H , R3=CH3), γ(R1=H , R2=CH3,R3=CH3) et δ (R1=H , R2=H , R3=CH3)

α-tocophérol-OH + LOO• −→ α-tocophérol-O• + LOOHα-tocophérol-O• + LOO• −→ LOO-α-tocophérol

L’α-tocophérol est la forme la plus abondante de la famille des tocophérols, mais il est admisque les radicaux tocophéryles sont régénérés par l’acide ascorbique et que, sans cette synergie,les tocophérols seraient inactifs.

Les caroténoïdes et la vitamine A, également liposolubles, ont un effet antioxydant et as-surent la protection des membranes cellulaires et des compartiments riches en graisses. C’est lecas également des quinones, en particulier en ce qui concerne le coenzyme Q ou ubiquinone.

Antioxydants hydrosolubles L’acide ascorbique (vitamine C) a un effet antioxydant enrégénérant le radical α-tocophérol [16]. Lors de son oxydation en acide déshydro-ascorbique, il

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passe par une forme radicalaire intermédiaire (radical ascorbyle) qui joue un rôle essentiel dansla régénération de la vitamine E oxydée.

Dans les milieux hydrosolubles, de nombreuses autres molécules ont un pouvoir antioxydant,notamment l’acide urique, la cystéine et la bilirubine. L’acide urique est capable de lier le fer etle cuivre et de piéger les radicaux O•−2 et HO•. La cystéine et l’homocystéine sont capables derégénérer le glutathion grâce à leurs groupements thiols réactifs. La bilirubine est quant à elleun co-antioxydant associé aux tocophérols [138].

Cas particulier du glutathion

Le glutathion est un tripeptide (L-γ-glutamyl-L-cystéinyl-glycine) dont la concentration in-tracellulaire est physiologiquement élevée : de 5 à 50 nmol/mg de protéines [111, 90, 45]. Ilagit comme coenzyme dans diverses réactions enzymatiques dans les cellules vivantes. Il inter-vient notamment dans les réactions d’oxydoréduction et dans le transport des acides aminés.Il exerce aussi un effet antioxydant en interagissant directement avec certains radicaux, maisil agit surtout en régénérant la vitamine E. Il est également nécessaire à l’activité d’enzymescomme la glutathion peroxydase et la glutathion S-transférase, cette dernière étant responsablede la conjugaison des composés électrophiles issus notamment de la peroxydation lipidique.

Le glutathion, présent dans tous les tissus de l’organisme, est synthétisé par une enzyme, laglutathion-synthétase, à partir de trois acides aminés, l’acide glutamique, la cystéine et la gly-cine. Il existe alors sous une forme oxydée (GSSG), sur laquelle une autre enzyme, la glutathion-réductase, peut fixer l’hydrogène, ce qui commue le glutathion en forme réduite (fig. 1.5).

Glutamyl cystéinyl glycine|S|

NADP+H2O2

|S|

Glutamyl cystéinyl glycine(GSSG)

GlutathionRéductase

NADPH

GlutathionPeroxydase

2 2

H2O SH

(GSSG)

NADPHH2O SH|

Glutamyl cystéinyl glycine(GSH)

Figure 1.5 – Mécanisme d’action du glutathion

1.2.3 Les 4-hydroxy-2-alkénals

Généralités

Les hydroperoxydes formés chimiquement ou enzymatiquement au cours de la peroxydationlipidique sont normalement réduits en acides gras monohydroxylés par les glutathion peroxy-dases. En situation de stress oxydant, l’activité de ces enzymes étant diminuée, la durée de viedes hydroperoxydes augmente. Ces molécules instables, en se dégradant, donnent de nombreuxcomposés, parmi lesquels des aldéhydes. Comparativement aux radicaux libres, les aldéhydes ontune durée de vie beaucoup plus longue. Ils peuvent franchir les membranes et gagner d’autrescompartiments, agissant comme des «seconds messagers toxiques» de la peroxydation lipidique

20


[51, 49, 206]. Dans les années 1960, l’un de ces aldéhydes, le 4-hydroxy-2-nonénal (4-HNE), a étéisolé parmi les différentes substances cytotoxiques trouvées dans les produits d’auto-oxydationde l’ester méthylique du linoléate [175]. Dans les années 1980, le 4-HNE a été décrit commeune des substances cytotoxiques majeures produites par des microsomes de foie de rat soumis àun stress oxydant [15]. De nombreux travaux ont montré sa formation dans différents systèmesbiologiques (foie, plasma, hépatocytes, microsomes) ainsi que ses effets délétères.

Formation

Acides gras n 3 Acides gras n 6 Acide arachidonique

(n(n 3)3) hydroperoxydeshydroperoxydes (n(n 6) hydroperoxydes6) hydroperoxydes 1212 HpETEHpETE

4 hydroxy 2 hexénal

(4 HHE)

4 hydroxy 2 nonénal

(4 HNE)4 hydroxy 2 dodécadiénal

(4 HDDE)

Figure 1.6 – Dégradation schématique des acides gras en hydroxy-alkénals

Le mécanisme de formation des hydroxy-alkénals est complexe. Globalement, la peroxyda-tion lipidique des acides gras conduit à la formation d’hydroperoxydes, molécules assez instablesqui sont ensuite dégradées en aldéhydes. Le 4-hydroxy-2-nonénal (4-HNE), dérive ainsi de l’oxy-dation des acides gras polyinsaturés de la série n-6 essentiellement (acides linoléique et arachido-nique) [155, 242]. Le 4-hydroxy-2-hexénal (4-HHE) provient quant à lui de la peroxydation desacides gras polyinsaturés de la série n-3 (acides docosahexaénoïque, linolénique et eicosapentaé-noique). La peroxydation particulière de l’acide arachidonique via la 12-lipoxygénase aboutit àla formation du 4-hydroxy-2-dodécadiénal (4-HDDE) [68, 242, 208].

Les premières preuves expérimentales de la formation du 4-HNE à partir des hydrope-roxydes lipidiques ont été apportées par les travaux de Gardner et Hamberg sur les fèves [61].Ils établissent que la réaction de l’acide 9-hydroperoxy-linoléique avec l’hydroperoxyde lyase Zforme principalement le 3Z-nonénal. Ce dernier peut être converti en 4-hydroperoxy-nonénal(4-HPNE). La réduction du 4-HPNE entraîne ensuite la formation du 4-HNE. Un mécanismesimilaire à celui du 4-HNE a été proposé pour expliquer la formation du 4-hydroxy-2-hexénal(4-HHE) à partir de la peroxydation des acides gras polyinsaturés de la série n-3 [197, 214].La formation du 4-HNE via l’intermédiaire 4-HPNE par des mécanismes non enzymatiques àpartir de deux hydroperoxydes a été confirmée en 2001 [179, 178].

21


Structure

Les 4-hydroxy-2-alkénals ont en commun une chaîne carbonée de longueur variable com-portant une double liaison entre les carbones 2 et 3. Ils sont caractérisés par la présence d’ungroupement aldéhydique porté par le carbone 1 et par un groupement hydroxyle présent sur lecarbone 4 (fig. 1.7).

Fonction hydroxyle(Carbone 4)

Double liaison(Carbones 2 3)

OHO

CnH2n+1

Fonction aldéhyde(Carbone 1)Chaîne carbonée

Figure 1.7 – Structure chimique générale des 4-hydroxy-2-alkénals

Ils diffèrent entre eux uniquement par la longueur de leur chaîne carbonée et par la présenced’une double liaison supplémentaire pour le 4-HDDE. Ainsi, le 4-HHE possède une chaîne car-bonée comportant 6 carbones tandis que le 4-HNE possède une chaîne à 9 carbones (table 1.1).Cette structure particulière confère aux hydroxy-alkénals une grande réactivité chimique enversde nombreuses molécules biologiques (ADN, protéines, glutathion, phospholipides).

Nom Masse molaire(g/mol)

Formulebrute Formule développée

4-hydroxy-2-hexénal 114,1 C6H10O2

4-hydroxy-2-nonénal 156,2 C9H16O2

4-hydroxy-2-dodécadiénal 196,0 C12H20O2

Table 1.1 – Caractéristiques chimiques des hydroxy-alkénals.

Réactivité

Les 4-hydroxy-2-alkénals sont très réactifs et capables de former des composés d’additionsur les molécules biologiques, exerçant de cette façon leurs effets biologiques [174, 149].

Interactions avec les groupements thiols. Le glutathion réduit (GSH) présente un grou-pement thiol et est présent en grandes quantités dans les tissus, dans les cellules ou dans les

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fractions cellulaires. Il est donc une cible privilégiée des aldéhydes comme le 4-HNE ou le 4-HHE[51, 117]. En conditions physiologiques, le 4-HNE et le 4-HHE réagissent spontanément avec leglutathion pour former majoritairement un adduit de Michael par attaque du groupement nu-cléophile du glutathion sur la double liaison des aldéhydes (fig.1.8 A). Cet adduit peut se cycliseren hémiacétal cyclique plus stable. Cette réaction d’addition contribue ainsi à la détoxificationdu 4-HNE et du 4-HHE lorsque les concentrations en GSH sont particulièrement importantes[104, 188, 117]. Le 4-HNE peut également réagir avec les groupements thiols présents sur lesrésidus cystéines de certaines protéines [220, 242].

OHO R—SH

+OH

OA

O(R—NH2)

+ O

S (HN)|R

OHN—R H OR NH

OHO

BN R + H2O+ R—NH2

O

Figure 1.8 – Mécanisme d’adduction par les hydroxy-alkénals,d’après Poli et al. 2008. A : addition de Michael entre la doubleliaison 2-3 du HNE et le groupement amine et/ou thiol d’unemolécule. B : formation d’une base de Schiff entre la fonctioncarbonyle du HNE et le groupement amine d’une molécule

Interactions avec les groupements amines primaires. Dans certaines conditions, à pHalcalin en particulier, les aldéhydes réagissent avec les groupements amines présents dans lesprotéines, les acides nucléiques et les aminophospholipides. Les attaques nucléophiles par ungroupement thiol sur la double liaison d’un hydroxy-alkénal conduisent à des produits d’additionappelé adduits de Michael (fig.1.8 A). La réaction entre un groupement amine primaire et legroupement carbonyle de l’aldéhyde aboutit à la formation de bases de Schiff (fig.1.8 B) [176].

– Protéines : les hydroxy-alkénals réagissent avec les résidus lysines et/ou histidines [195,80, 207, 242]. Ils forment également des adduits covalents avec des groupements aminesprésents dans d’autres enzymes notamment la glutathion-S-transférase [135] .

– Acides nucléiques : Les hydroxy-alkénals peuvent interagir avec les groupements aminesprimaires des acides nucléiques pour former des adduits de Michael entre le groupementNH de la désoxyguanosine et la double liaison de l’alkénal.

– Aminophospholipides : Les hydroxy-alkénals sont capables de se fixer de façon covalenteaux aminophospholipides par l’intermédiaire du groupement amine primaire. Cette inter-action concerne principalement les phospholipides à éthanolamine [11].

Une adduction particulière a pu être mise en évidence en traitant les LDL avec de fortesconcentrations de 4-HNE. Dans cette situation, il est possible de fixer plusieurs molécules de4-HNE sur un site d’adduction par un phénomène de domino, un 4-HNE pouvant former unadduit sur un 4-HNE déjà fixé (fig. 1.9).

23


Figure 1.9 – Adduction de multiples molécules de 4-HNE sur laN-acétyl-histidine par un mécanisme de «domino». D’après An-nangudi et al, 2008 [5].

Concentrations dans les fluides biologiques

La concentration plasmatique du 4-HNE est comprise entre 0,2 nM et 10 μM en conditionsphysiologiques (table 1.2). Cette importante différence de concentration en fonction des auteurspeut s’expliquer d’une part par la méthode de dosage utilisée (LCMS, GCMS...) et d’autre partpar la difficulté à mesurer ces dérivés très réactifs. Néanmoins, en conditions pathologiques,cette concentration est multipliée par 2 ou 3, c’est le cas dans la maladie d’Alzheimer, dans lesmaladies autoimmunes, et même dans la dépression (table 1.2).

Pathologie Concentration Concentration RéférenceNormale Pathologique

Volontaires sains 0,5 à 3 μM - [191]Syndrome de détresse respiratoire 0,2 nM 0,5 nM [156]Lupus érythémateux systémique 65 nM 162 nM [67]Dépression majeure 0,57 μM 0,86 μM [182]Maladie d’Alzheimer 7,8 μM 20,7 μM [130]Asbestoses/Silicoses 11 μM 13 μM [194]

Table 1.2 – Concentration plasmatique de 4-HNE libre

Dans d’autres systèmes biologiques soumis à la peroxydation, il est possible de mesurer uneproduction de 4-HNE et de 4-HHE (table 1.3). Ainsi, dans des LDL oxydées, la concentrationde 4-HNE est de l’ordre de 1,48 mM et celle de 4-HHE de 0,19 mM [50]. En revanche, iln’existe pas, à l’heure actuelle, de données dans la littérature concernant les concentrationsphysio-pathologiques de 4-HHE et de 4-HDDE.

Tissu / Pathologie Concentration Concentration RéférenceNormale Pathologique

Plaquettes oxydées in vitro 7 nM 10 nM [11]Fluide ventriculaire / Alzheimer 8,6 μM 15,2 μM [118]Foie de souris 1,07 nmol/g tissu - [223]LDL humaines auto-oxydées - 1,48 mM [50]

Table 1.3 – Concentrations tissulaires de 4-HNE libre

Toutes les méthodes de dosage actuelles (HPLC, GC) permettent de doser la fraction librede 4-HHE et de 4-HNE présente dans les échantillons. Cependant, les hydroxy-alkénals étanttrès réactifs, cette fraction n’est certainement pas représentative de la quantité de dérivés de

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peroxydation produits. D’autres méthodes moins quantitatives permettent d’estimer la quantitéde 4-HHE et de 4-HNE qui ont réagi en détectant la formation d’adduits sur les protéines. Ainsi,la quantité d’adduits détectée par immunohistochimie a permis de montrer une augmentationsignificative de la fixation de 4-HHE et de 4-HNE sur les protéines dans la maladie de Parkinson[237], dans la sclérose latérale amyotrophique [186] ou encore dans les maladies chroniques dufoie [145]. Une étude a également montré une augmentation de la formations d’adduits du 4-HNE sur l’albumine plasmatique chez les diabétiques de type 2 [202]. Malgré tout, ces méthodesne sont au mieux que semi-quantitatives.

Effets biologiques

Le 4-HNE et, dans une moindre mesure le 4-HHE, sont utilisés comme marqueurs du stressoxydant, car ils permettent de mettre en évidence une peroxydation lipidique spécifique desacides gras des séries n-6 ou n-3 [234]. Leurs rôles potentiels comme activateurs de voies designalisation ou second messagers n’ont cependant été étudiés qu’assez récemment.

Cytotoxicité Les hydroxy-alkénals, molécules extrêmement réactives, possèdent une fortecytotoxicité. Sur des neurones [83, 124, 116], sur des cellules épithéliales de cristallin [36] etsur des cellules Jurkat [113], les hydroxy-alkénals entraînent une diminution de la viabilitécellulaire dès 15 μM pour les cellules les plus sensibles. Cette diminution de viabilité est dueà une activation de voies des caspases entraînant l’entrée en apoptose des cellules [6]. Le 4-HHE affecte également la viabilité cellulaire et peut induire l’entrée en apoptose des cellulesendothéliales [105, 36] et des chondrocytes [212].

Signalisation cellulaire Durant les 10 dernières années, différents effets du 4-HNE et du4-HHE ont été décrits. Ceux-ci dépendent de la dose et du modèle utilisé, mais se regroupentessentiellement autour de quelques voies principales (fig. 1.10). Ainsi, l’activation des voies destress p38, JNK et ERK par le 4-HNE ont été décrites dès 1998 [146, 206, 241, 211], de même quel’activation de NF-κB [86, 169] et des cyclo-oxygénases [209]. Le 4-HNE a ainsi montré des effetsimportants sur les mécanismes de survie/apoptose/prolifération cellulaire mais également sur lesphénomènes inflammatoires, le transport vésiculaire et l’expression de certains gènes (collagènetype I , transforming growth factor β1 (TGFβ1), aldose reductase et gamma-glutamyl-cystéinesynthétase) [109, 153]. La plupart des équipes se sont intéressées aux effets toxiques du 4-HNEet ont donc ciblé, à juste titre, les voies de stress cellulaire. En conséquence, les effets du 4-HNEsur le métabolisme cellulaire, lipidique ou glucidique ont été très peu étudiés jusqu’à présent.

Si certains effets du 4-HNE ont été pris en compte, les autres hydroxy-alkénals l’ont peu été.En effet, quelques études montrent des effets du 4-HHE sur le pore de transition mitochondrial[99], sur la NO synthase endothéliale [105], sur l’activation des voies de stress [86, 199] maisactuellement, aucune étude n’a été faite sur les possibles effets métaboliques du 4-HHE.

Concernant le 4-HDDE, des travaux réalisés au laboratoire montrent qu’il est capable deformer des adduits sur les phospholipides membranaires [11]. Des données récentes montrentégalement que le 4-HDDE est un régulateur majeur du transport de glucose dans les cellulesendothéliales vasculaires soumises à une hyperglycémie et son action passe par les voies designalisation de PPARδ [163].

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Inflammation

IKKPKC

Apoptose

RTKsJNKs

Remodelage de la MatriceExtracellulaire

ERKsPKCJNKsp38

JNKsp38Akt/PKB

ERKsJNKsp38

4 HNE Transport et exocytose devésicules

Cycle cellulaire 4 HNE vésicules

PKC

RTKs

Prolifération

RTKsERKs

Expression de gènes

PKCsJNKsp38

PKCsJNKsp38

Figure 1.10 – Voies de signalisation activées par le 4-HNE, d’aprèsLeonarduzzi et al., 2000 [109].

Métabolisme et détoxification

Glutathion et Glutathion-S-transférases L’augmentation des pools intracellulaires englutathion réduit (GSH) protège les cellules en cultures des effets délétères du stress oxydant, eten particulier du 4-HNE [233, 88]. Ainsi, les glutathion-S-transférases (GSTs) peuvent régulerles concentrations de 4-HNE dans les cellules en le conjuguant au GSH (fig. 1.11 A). Bien quele 4-HNE soit suffisamment électrophile pour réagir spontanément avec le GSH, les GSTs amé-liorent la vitesse de réaction de plusieurs ordres de grandeur [3]. Quelques isoenzymes avec poursubstrat préférentiel le 4-HNE ont été caractérisées chez l’homme (hGSTA4-4 et hGST5.8), chezla souris (mGSTA4-4) et chez le rat (rGSTA4-4). Ces enzymes sont essentielles et possèdentune activité spécifique très importante envers le 4-HNE, d’environ 170 U/mg de protéine. Ellesconstituent donc l’une des premières réponses adaptatives au stress induit par le 4-HNE [10].Ainsi, dans les tissus des souris mGSTA4 -/-, les concentrations de 4-HNE sont environ 3 foisplus élevées que dans les tissus correspondant de souris sauvages [48]. Ce qui suggère forte-ment que le métabolisme du 4-HNE par les GSTs est un déterminant principal de régulationdes concentrations de 4-HNE in vivo. D’autres isoenzymes des GST, telles que hGSTA1-1, pré-sentent une activité faible envers le 4-HNE (0,5 U/mg de protéine) mais peuvent égalementcontribuer au métabolisme global du 4-HNE dans les cellules. En effet, hGSTA1-1 représenteenviron 90% des GST totales du foie, alors que hGST5.8 et hGSTA4-4 en constituent seulement2%. Ainsi, ces isoenzymes contribuent à la conjugaison du 4-HNE au GSH in vivo : 40% del’activité catalysant la conjugaison du 4-HNE au GSH est d’ailleurs maintenue dans les tissusdes souris knockout mGSTA4 [48].

Lorsque le 4-HNE est conjugué au GSH, environ les deux tiers du GS-HNE formé est trans-porté hors des cellules à travers un processus de transport ATP-dépendant catalysé par RLIP76[35]. Collectivement, ces études montrent que les GSTs, principalement celles appartenant à laclasse α, sont les principaux déterminants de la concentration de 4-HNE au sein des cellules parleur capacité à catalyser la formation des complexes GS-HNE.

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OH2N

SHO

OOH

S

OHO

AOH2N NH

NH

OHO

OHO

GSH

HNEpH 7.4, 37°C

O

O

O

S

H2N NHNH

OH

O

O

O

S

H2N NHNH

OHGSHOHO

O

OHO

OH

OHO NH2B

HN

O N

NH

N

HN

O N

NH

HNEpH 7.4, 37°C

HN

OHO

NH

N

OHO NOHO N

Carnosine

Figure 1.11 – Détoxification du 4-HNE par fixation covalente sur le glutathion (A)ou sur la carnosine (B), d’après Aldini et al., 2002 [2].

Carnosine La carnosine (b-alanyl-L-histidine) est un dipeptide dont la concentration tissu-laire peut atteindre 20 mM dans les muscles et les tissus nerveux chez l’homme. Cependant, safonction biologique n’a pas été complètement élucidée. Plusieurs théories ont été avancées : tam-pon intracellulaire, modulateur immunitaire, neurotransmetteur, chélateur d’ions métalliques,antioxydant et chélateur de radicaux libres [19]. Elle pourrait agir également comme chélateurnaturel d’aldéhydes issus de la voie de dégradation oxydative de composés endogènes, commeles sucres, les acides gras polyinsaturés (AGPI), et des protéines [76].

Récemment, l’adduction de la carnosine par le 4-HNE a été démontrée (fig. 1.11 B), ainsique les différents produits de dégradation issus de cette réaction [2, 114]. Cette adduction seraitdonc, comme dans le cas du GSH, une voie de détoxification importante des aldéhydes issus dela peroxydation lipidique.

Autres mécanismes D’autres enzymes sont vraisemblablement responsables de la détoxifi-cation du 4-HNE et d’autres aldéhydes. C’est le cas par exemple de l’aldose réductase [188],de l’aldéhyde deshydrogènase, de l’alcool deshydrogènase [73] ou encore de la fatty aldehydedeshydrogènase [42]. Cependant ces enzymes participeraient pour une part plus faible à la mé-tabolisation des aldéhydes, comparativement aux GST.

Des données récentes indiquent que si le 4-HHE et le 4-HNE sont tous deux métabolisés viale glutathion, l’efficacité de la détoxification n’est pas la même pour les deux molécules. Ainsi,le 4-HHE est métabolisé beaucoup plus vite par le glutathion que le 4-HNE dans les cellules ducortex cérébral des rats [117]. Par extension, il est possible que le 4-HHE, le 4-HNE, le 4-HDDEet d’autres aldéhydes issus de la peroxydation lipidique soient métabolisés avec des affinités etdes efficacités différentes par les enzymes de détoxification.

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1.3 La régulation de la glycémie

1.3.1 L’insuline

La découverte de l’insuline, d’après Scheider, Madeb et Sander [120, 173, 180]

Depuis l’antiquité, les Grecs et les Égyptiens connaissent le diabète. Galien écrivait déjà : «Les reins et la vessie ne cessent d’émettre des urines. Il ne peut s’empêcher de boire et d’uriner». Mais ce n’est que beaucoup plus tard, en 1674, que Willis observe les manifestations cliniquesdu diabète telles que polyurie et polydipsie. Il faudra attendre un siècle pour qu’en 1776, lesucre des urines soit détecté par Dolse grâce à la liqueur de Fehling. En 1855, Claude Bernardmontre que la glycémie reste pratiquement constante, quelle que soit l’alimentation, et décritle stockage du glucose sous forme de glycogène dans le foie (fonction glycogénique). Il pressentégalement que la glycosurie n’est qu’un symptôme et non la maladie elle-même, mais la causedu diabète reste inconnue. En 1869, Paul Langerhans découvre que le pancréas contient deuxtypes de cellules :• les «acini» représentant 97% de la masse du pancréas, constituent le pancréas exocrine et

sécrètent le suc pancréatique• les «îlots» représentant 3% de la masse du pancréas, dont il ignore la fonction. Laguesse

les appelle «Ilots de Langerhans» en 1893.Parallèlement, en 1889, Minkowski et Von Merring, montrent qu’un chien dont on enlève le

pancréas est atteint de diabète grave.Au début du XIXème siècle, Starling et d’autres chercheurs découvrent que d’autres glandes

que le pancréas (ovaires, surrénales) libèrent des substances qui agissent à distance : les «hor-mones». Concernant le traitement du diabète, les recherches s’orientent alors vers la préparationd’un extrait pancréatique. En décembre 1921, Charles Gardin établit qu’un extrait pancréatiquede porc, administré par voie veineuse à six sujets humains, dont quatre diabétiques, diminue laglycémie. Banting, jeune chirurgien canadien de 29 ans, veut alors tenter d’extraire le principeactif des îlots du pancréas après ligature des canaux pancréatiques. Avec l’aide de Mac Leod,professeur de physiologie à Toronto, ils testent les extraits pancréatiques obtenus sur des chiensrendus diabétiques par pancréatectomie et obtiennent des extraits aux effets hypoglycémiants.En janvier 1922, les premières injections d’extraits pancréatiques sauvent Leonard Thompson,14 ans, atteint d’un diabète au stade du coma. La substance extraite des îlots est appelée insu-line (du latin insula = île) et en 1923, le prix Nobel de Physiologie et de Médecine est décerné àBanting et Mac Leod. C’est le début de l’utilisation de l’insuline dans le traitement du diabète.Elle devient très rapidement un médicament commercialisé.

L’insuline est au départ extraite de pancréas de bœuf ou de porc. Elle est présentée ensolution acide, imparfaitement purifiée et administrée en 3 ou 4 injections par jour. Ce n’estqu’en 1970 que la mise au point de la purification de l’insuline permet l’élimination de cesimpuretés et la diminution des réactions allergiques. En 1955, Frédéric Sanger (qui obtiendra leprix Nobel de chimie en 1958 pour ces travaux) décrit la structure chimique de l’insuline. Oncomprend alors que ce peptide est particulier à l’espèce : il existe des différences entre l’insulinehumaine et les insulines animales utilisées (bœuf et porc). La synthèse chimique de l’insulinehumaine est donc mise au point et réussie aux États-Unis, en Allemagne et en Chine en 1965.Trois ans plus tard, la production industrielle d’insuline humaine est rendue possible grâceà deux techniques : l’hémi-synthèse (modification chimique de l’insuline porcine qui diffère del’insuline humaine par un seul résidu acide aminé) et la biosynthèse (le gène codant la fabrication

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de l’insuline est inséré dans une bactérie ou une levure qui produisent alors de l’insuline). Cesprocédés permettent alors de produire des quantités importantes d’insuline pour le traitement dudiabète. Aujourd’hui, l’insuline recombinante humaine est produite majoritairement par géniegénétique chez Escherichia coli 2.

Structure

L’insuline est une hormone peptidique composée de deux chaînes. La chaîne A comporte 21résidus acides aminés, tandis que la chaîne B est constituée de 30 résidus. Ces deux fragmentspeptidiques sont liés entre eux par deux ponts disulfure. Il existe également un pont disulfureintra-chaine sur la chaine B. La séquence des acides aminés des chaînes A et B et la localisationdes ponts disulfure est présentée sur la figure 1.12. Bien que l’insuline circule dans le sang et se lieà son récepteur sous forme monomèrique, elle peut former des dimères pour des concentrationsmicromolaires, et des hexamères lorsqu’elle est en présence d’ions zinc.

phe

gln

asnval

valglu

NH+3Chaîne A

Chaîne B

sercys

glyleu

his

gln

his

leu

valala

leutyrleuvalcys

glygluarggly

phe

gly ile

gln cys thr

val

asntyrcysasn

NH+3

glu cysCOO

g yp

phe

tyr

th

S

S

SS

S

ilegln

ser

cysserleutyrleu

gluthr

prolys thr COO

S

S

Figure 1.12 – Structure de l’insuline, chaînes A et B

Biosynthèse

Le pancréas dit endocrine, responsable de la production de l’insuline et du glucagon entreautres, ne représente que 1 à 2% de la masse totale de l’organe. Les cellules endocrines sontdisposées dans des structures particulières : les ilôts de Langerhans. Au sein d’un ilôt, les cellulesde type β, productrices d’insuline, sont distribuées au centre et représentent environ 75% duvolume total de l’ilôt. L’ultrastructure révèle la présence dans le cytoplasme des granulationsqui constituent la réserve d’insuline de l’ilôt.

L’insuline est synthétisée dans les cellules β des îlots de Langerhans. Elles possèdent lescaractéristiques des cellules ayant pour but la production et la sécrétion de protéines notammentun réticulum endoplasmique rugueux développé et de nombreuses vésicules de stockage. Lasynthèse de l’insuline dépend des mécanismes normaux de production de protéines exportées.Elle s’amorce à partir de l’information génique correspondante située, chez l’homme, sur lechromosome 11. Son ARNm contient des séquences d’adressage responsables de la fixation du

2. Voir aussi : Michael Bliss «La découverte de l’insuline». Payot, 1988, collection Medecine et Santé

29


NT intron NT B C intron C A NT Gène

Séquence signalNT: Séquencesnon traduites

NT intron NT B C intron C A NT Gène

NT NT B C A NT ARNm

B C A Pré pro insuline

Pro insulinePro insuline

Insuline + peptide CInsuline + peptide C

Figure 1.13 – Biosynthèse de l’insuline dans les cellules β pancréatiques

ribosome sur le réticulum endoplasmique. Ce gène code une grosse molécule précurseur dequelque 110 acides aminés : la pré-pro-insuline [58, 44]. Dans le réticulum endoplasmique, lapré-pro-insuline se replie rapidement pour obtenir sa structure tridimensionnelle correcte touten restant ancrée à la membrane. Cette molécule est ensuite transformée en pro-insuline (86acides aminés) contenant la séquence qui donnera l’insuline finale (51 résidus acides aminés) etun segment, le peptide de connexion ou peptide-C (31 résidus acides aminés).

La pro-insuline est transférée vers l’appareil de Golgi à l’intérieur de petites vésicules conte-nant du zinc et du calcium. Ces conditions sont favorables à la formation d’hexamères depro-insuline coordonnés autour d’un atome de zinc grâce aux acides aminés histidine présentssur la surface des monomères. Cette organisation en cristaux insolubles favorise le transport depro-insuline concentrée dans l’appareil de Golgi et son stockage vésiculaire [44].

La conversion de la pro-insuline en insuline commence dès la formation des vésicules. La pro-insuline subit l’attaque des protéases qui clivent le peptide-C pour former l’insuline. Ce processuss’accompagne d’une acidification du contenu vésiculaire et du détachement du revêtement declathrine, aboutissant au deuxième type de vésicules sécrétoires. Ces vésicules «sécrétoires lisses»sont dépourvues de clathrine, plus nombreuses et dispersées dans tout le cytoplasme. Lors del’exocytose, le passage d’un pH de 5 à l’intérieur des vésicules à 7,4 dans le sang et la dilutiondu zinc déstabilisent les hexamères et les cristaux se désintègrent rapidement. L’insuline et lepeptide-C [58, 44] sont alors libérés en quantité équivalente dans la circulation sanguine, ce quifait du peptide-C un excellent marqueur clinique de la sécrétion d’insuline. Toutes les étapes decette biosynthèse sont résumées sur le schéma 1.14.

30


Figure 1.14 – Représentation schématique des évenements moléculaires et cellulaires ayantlieu lors de la biosynthèse de l’insuline. D’après G. Dodson et D. Steiner [44].

Sécrétion et métabolisation

La libération d’insuline par les cellules β-pancréatique a lieu en réponse à une élévation de laglycémie, par exemple lors des périodes post-prandiales. Les transporteurs de glucose GLUT2

31


présents sur la membrane des cellules β laissent passer librement le glucose du compartimentextracellulaire vers le cytoplasme. Une augmentation de la glycémie entraîne donc immédia-tement une élévation de la concentration de glucose dans le cytoplasme. Celle-ci entraîne uneaugmentation de la glycolyse et une activation du cycle de l’acide citrique, aboutissant à la for-mation d’ATP. La fermeture des canaux potassiques, conséquence de l’augmentation de l’ATP,déclenche une dépolarisation de la membrane plasmique permettant l’ouverture de canaux cal-ciques. Le second messager calcium entraîne alors l’exocytose des vésicules contenant l’insuline(fig. 1.15).

Fermeture desKcanaux KATP

Dépolarisation de la celluleOuverture des canaux calcium

Augmentation de laconcentration d’ATP

Ca2+Glucose

ATPEntrée de Ca2+

Le Ca2+ agit comme

Glycolyse etdu cycle de

l’acide citrique

Le Ca2+ agit commesecond messager

GLUT

Le Ca2+ déclenchel’exocytose

L’insuline est secrétéeL insuline est secrétée

Figure 1.15 – Mécanisme de sécrétion de l’insuline par les cellules β pancréatiques. L’aug-mentation parallèle de la concentration de glucose dans la circulation et dans le cytoplasmefait augmenter la production d’ATP par activation de la glycolyse. Ceci entraîne une dépola-risation de la membrane plasmique par fermeture des canaux potassiques ATP-dépendants.L’ouverture des canaux calcium voltage-dépendants et l’entrée massive de calcium dans lacellule qui en résulte déclenche l’exocytose des vésicules contenant l’insuline.

L’insuline et le peptide C, sont libérés dans la veine pancréatico-duodénale qui les conduitdirectement au foie, lequel conserve ou détruit près de 50% de l’insuline produite (effet depremier passage hépatique). Le reste de l’insuline se distribue dans l’ensemble de l’organismemajoritairement sous forme monomèrique. Dans le plasma, la demi-vie de l’insuline est d’environ4 minutes. Elle est inactivée par des biotransformations enzymatiques : hydrolyse par des mé-talloprotéinases (insulinases) et réduction des liaisons disulfures [58]. Les formes commercialesde l’insuline, ont en revanche des demi-vies variables, souvent plus longues.

Effets biologiques

L’insuline présente des effets pléiotropes. Elle agit sur le métabolisme (anabolisme) des troisfamilles de nutriments : glucides, lipides et protides en agissant principalement sur trois tissuscibles : le foie, le tissu adipeux et le muscle. L’insuline possède également des effets trophiques

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et peut agir comme facteur de croissance sur certains tissus. Il est à noter que l’insuline estla seule hormone hypoglycémiante dans l’organisme, alors que de nombreuses hormones ontdes actions hyperglycémiantes (glucagon, cortisol, catécholamines). Elle joue de plus, un rôleimportant dans les phénomènes de vieillissement ou de suspension du métabolisme chez lesorganismes inférieurs : il a ainsi été montré que chez le nématode Caenorhabditis elegans larégulation de l’activité métabolique globale est sous la dépendance de molécules présentant uneforte homologie avec l’insuline, ses facteurs de croissance et son récepteur [196, 59]. L’insulineest donc une molécule apparue et conservée depuis près de 800 millions d’années dans le mondeanimal.

Métabolisme glucidique. L’insuline agit principalement sur trois tissus insulino-sensibles :foie, muscle et tissu adipeux. Dans le muscle et le tissu adipeux, la principale action de l’insulineest de favoriser l’entrée du glucose. Elle facilite la pénétration du glucose dans le cytoplasmeen augmentant la perméabilité de leur membrane au moyen d’un recrutement de transporteursde glucose GLUT4. Dans les cellules musculaires, l’insuline favorise également le stockage deglucose sous forme de glycogène [171].

Dans les cellules hépatiques, l’insuline inhibe la production hépatique de glucose (PHG) partrois mécanismes :• Elle inhibe la glycogénolyse par inhibition de la glycogène phosphorylase et stimule la gly-

cogénogenèse par stimulation de l’activité glycogène synthase, favorisant ainsi le stockagedu glucose sous forme de glycogène.• Elle stimule l’utilisation du glucose par la glycolyse ou son oxydation par la voie des

pentoses-phosphate.• Elle s’oppose à la fabrication de glucose à partir d’acides aminés gluco-formateurs (néo-

glucogenèse) et à la libération de glucose par le foie.

Métabolisme lipidique. L’insuline exerce une action anti-lipolytique en diminuant la li-bération des acides gras libres et du glycérol par le tissu adipeux blanc. Ce tissu se révèleparticulièrement sensible à l’action de cette hormone, qui y exerce ses effets avec des concentra-tions plasmatiques de 7 à 10 fois inférieures à celles nécessaires à ses autres actions (capture deglucose par exemple). Dans les adipocytes, elle favorise la captation des acides gras à partir deslipoprotéines circulantes et accroît en parallèle la synthèse de ces derniers à partir du glucoseou de l’acétate. Cette hormone favorise, au niveau hépatique, la synthèse des acides gras libreset l’estérification des triglycérides. Enfin, elle agit comme régulateur de la concentration descorps cétoniques circulant. Elle diminue leur libération par le tissu adipeux et en augmente leurconsommation au niveau musculaire [171, 8].

Métabolisme protéique. L’insuline est responsable du maintien de la balance azotée. Elleexerce son action anabolique au niveau musculaire et hépatique selon deux voies [148] :• stimulation de la synthèse protéique à partir d’acides aminés plasmatiques (effets dépen-

dants de l’AMP cyclique)• inhibition du catabolisme protéique (diminution de la synthèse d’urée) et de la néogluco-

génèse à partir d’acides aminés glucoformateurs.

33


Effets trophiques. En plus de ces effets anaboliques, l’insuline joue un rôle de facteur decroissance : elle stimule la prolifération des cellules épithéliales de la bordure en brosse del’intestin humain (jéjunum et colon) au cours de l’embryogenèse [238]. Pendant la croissance,l’insuline agit en stimulant la formation de somatomédines. Ces polypeptides de faible poidsmoléculaire sont les médiateurs de l’effet de l’hormone de croissance [131]. Certaines de cessomatomédines stimulent la fixation de sulfate par le cartilage et possèdent, de plus, un effetinsulino-mimétique sur le tissu adipeux et le muscle. Elles ont été nommées IGF-1 et IGF-2(Insulin-Like Growth Factor). Ces hormones ont par ailleurs été suspectées de jouer un rôledans la carcinogenèse colique, argument en faveur de leurs effets trophiques [139].

1.3.2 Les voies intracellulaires de signalisation de l’insuline

Le récepteur à l’insuline

Structure Le récepteur à l’insuline (insulin receptor : IR) appartient à la famille des récep-teurs de facteurs de croissance à activité tyrosine kinase. Il est constitué de 4 chaînes polypep-tidiques reliées par des ponts disulfures, formant une glycoprotéine de 400 kDa (fig. 1.16). Ondistingue deux paires de sous-unités formant un hétérodimère α2β2 [18] : deux sous-unités trans-membranaires β (80 kDa) qui ont une activité protéine kinase, et deux sous-unités α (120 kDa)situées du côté extracellulaire qui assurent la fixation de l’hormone [96]. La fixation de l’insulinesur son récepteur membranaire s’effectue au niveau des 2 sous-unités α. Chaque sous-unité estpotentiellement capable de fixer une molécule d’insuline, même si une seule molécule d’insulineest suffisante pour activer complètement le récepteur. Le récepteur à l’IGF-1 (IGF-R) a unestructure similaire à celle du récepteur de l’insuline et un taux d’homologie de l’ordre de 50%.La liaison de l’IGF-1 sur l’IR, ou celle de l’insuline sur l’IGF-R, se fait avec une affinité 100 à1000 fois plus faible. Cependant, les concentrations circulantes en IGF-1, 100 fois supérieuresà celles de l’insuline, pourraient contribuer de façon significative à l’activation de l’IR [96]. Leshépatocytes et les adipocytes expriment l’IR en grande quantité mais peu d’IGF-R, tandis queles myocytes expriment les deux. La présence de récepteurs hybrides en quantité importante apar ailleurs été montrée dans ce tissu [13].

Site de liaison de l’insuline

S S

S S SS Domaine transmembranaireS SS SS S

Domaine kinase

Domaine C term

Domaine kinase

Figure 1.16 – Structure du récepteur de l’insuline

34


Synthèse Un gène unique code l’IR sous la forme d’un précurseur synthétisé par les cellulesdes tissus insulinosensibles (cellules musculaires striées, adipocytes, hépatocytes). Sa synthèseest sujette à un épissage alternatif qui aboutit à un récepteur possédant ou non une séquencede 12 résidus acides aminés à l’extrémité carboxy-terminale de la chaîne α. La séquence de cerécepteur est remarquablement conservée chez tous les vertébrés : il n’existe pas de différencenotable entre les mammifères et les poissons.

Transduction du signal En l’absence d’insuline, les sous-unités α exercent une contrainteinhibitrice et maintiennent le récepteur en configuration inactive. La liaison de l’hormone per-met un regroupement des deux sous-unités β dans une zone cellulaire délimitée, et l’activationdu récepteur par une levée de l’action inhibitrice des sous-unités α. Lors de son activation, laliaison de l’ATP permet le dépliement de la boucle inhibitrice et sa transphosphorylation (phos-phorylation d’une sous-unité β par l’autre) sur tyrosine (résidus tyrosine 1146, 1150 et 1151).Cette phosphorylation permet au récepteur de s’autophosphoryler et de phosphoryler d’autresprotéines substrats dont les 4 protéines de la famille des IRS (Insulin Receptor Substrate). Laphosphorylation de la tyrosine 960 de la chaîne β notamment, va jouer un rôle clé dans l’ancrageultérieur des protéines substrats sur le récepteur [96, 165].

Les insulin receptor substrate (IRS)

Les 4 isoformes des IRS (IRS1, IRS2, IRS3 et IRS4) sont à la base de la première voie designalisation intracellulaire de l’insuline [225]. Elles se placent au niveau de la face cytosolique dela membrane plasmique par leur domaine PH (Plecktrin Homology). Elles positionnent ainsi leurdomaine PTB (Phospho-Tyrosine Binding), adjacent au domaine PH, en face de la tyrosine 960du récepteur de l’insuline. La partie C-terminale des protéines IRS se trouve alors à proximitédu domaine tyrosine kinase du récepteur qui phosphoryle des résidus tyrosines spécifiques surles IRS, notamment les tyrosines 632 et 612. Ces sites permettent la fixation d’autres moléculesde type SH2 (Src Homology 2, domaine de fixation des résidus phospho-tyrosine), la principaleétant la sous-unité p85 (régulatrice) de la phosphatidyl-inositol 3 kinase [12, 170, 171].

La phosphatidyl-inositol 3 kinase (PI3K)

La PI3 kinase est activée par la phosphorylation des IRS. L’enzyme possède deux sous-unités : régulatrice (p85) et catalytique (p110). Son activation se réalise de deux manières ;

1. recrutement à la membrane où se trouve le substrat de l’enzyme (phosphatidyl inositolbisphosphate ou PIP2)

2. levée de la contrainte inhibitrice exercée par la sous-unité régulatrice.La sous-unité régulatrice p85 se fixe sur les phosphotyrosines des IRS et recrute ainsi la sous-unité catalytique à la membrane. L’effet inhibiteur de la sous-unité régulatrice est alors levé.Une fois proche de la membrane plasmique, la p110-PI3K phosphoryle alors en position 3 lephosphatidyl-4,5-inositol (PIP2) pour former le phosphatidyl inositol-3,4,5-phosphate (PIP3).Le PIP3 active ensuite les protéines kinases PDK1 (phosphatidyl inositol-dependent kinase) etPKB (protéine kinase B, aussi appelée Akt) par leur domaine PH [12, 56].

35


La protéine kinase B (PKB) ou Akt

L’action principale et immédiate de PKB en réponse à une stimulation à l’insuline est ledéclenchement de la translocation des vésicules intracellulaires contenant les transporteurs deglucose GLUT4 vers la membrane plasmique. Ceci permet un transport facilité du glucose à l’in-térieur des cellules. Activée par la PI3K, la PKB va à son tour phosphoryler et activer d’autresrelais intracellulaires impliqués dans les effets métaboliques de l’insuline. La phosphorylation dela glycogène synthase 3 kinase (GSK3) va ainsi favoriser la synthèse du glycogène. La phosphory-lation de la kinase p70rsk et du facteur 4E-BP1 (4E binding protein 1), via mTOR (mammaliantarget of rapamycin), va augmenter la biosynthèse protéique et médier les effets anaboliques del’insuline [97]. La voie PI3K/PKB agit également sur les facteurs de transcription de la familleForkhead en les empêchant d’activer leurs gènes cibles au niveau nucléaire, notamment la phos-phoénolpyruvate carboxy-kinase (PEPCK), enzyme clef de la néoglucogenèse. Toujours par lavoie PKB, l’insuline exerce un effet anti-apoptotique en phosphorylant et inhibant le facteurpro-apoptotique Bad [164].

Le transporteur de Glucose GLUT4

La fixation de l’insuline sur son récepteur déclenche principalement l’exocytose de vésiculesintracytoplasmiques contenant les transporteurs de glucose (GLUT4) [167, 82]. Le déroulementde cette exocytose met en jeu les molécules SNARE situées dans la paroi des vésicules (v-SNARE vamp2) qui se lient spécifiquement aux molécules t-SNARE syntaxine 4 de la membraneplasmique des cellules musculaires et adipeuses [22, 82]. Le transporteur GLUT4 permet alorsle transport facilité du glucose vers l’espace intracellulaire.

Les mitogen activated protein kinase MAPK

Une autre voie de signalisation implique la liaison de Shc (Sarc Homologous and Collagenprotein) au récepteur. Shc activé initie alors une cascade de phosphorylations stimulant une suitede kinases (Shc - Grb2 - Sos - Ras - MAPK) elles-même coordonnant les effets de l’insuline surl’expression génique [9, 12]. Deux voies peuvent aboutir à l’activation des MAP kinases :• L’activation des protéines IRS permet d’activer le facteur d’échange SOS (Son Of Seven-

less) qui active la protéine G Ras dans la membrane plasmique en stimulant l’échange duGDP contre le GTP.• L’activation du recepteur à l’insuline recrute, sur la tyrosine 960, les protéines adaptatrices

de la famille Shc elles-mêmes reconnues par la protéine Grb2 activant la voie Ras.Dans les deux cas, Ras recrute la kinase Raf, qui phosphoryle et active la MAP kinase kinase(MEK) responsable de l’activation par phosphorylation de ERK1 et ERK2 (extracellular signal-regulated kinase). Ces dernières vont recruter différentes kinases impliquées dans la synthèseprotéique et entrer dans le noyau afin de stimuler des facteurs de transcription impliqués dansla prolifération et la différentiation cellulaire [9, 46].

Inhibition et arrêt du signal insuline

La voie de signalisation de l’insuline peut être inhibée à plusieurs niveaux. Principalement,le signal insuline peut être stoppé au niveau des IRS1 par une phosphorylation sur sérine

36


Phosphorylationsur tyrosine des IRS

Recrutement de la sous unité p85 régulatrice etactivation de la sous unité catalytique de la PI3K

d l’ l

Phosphorylation duPIP2 en PIP3

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Fixation de l’insuline

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Activation desSNARESRas

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Translocation desvésicules GLUT4 versla membrane plasmique

,

Phosphorylationinhibitrice sur

ERK JNK

Entrée de glucose

sérine des IRS

Figure 1.17 – Voies de signalisation activées par l’insuline. La cascade de signalisationactivée par le récepteur à l’insuline (IR) déclenche la phosphorylation sur tyrosine desIRS (insulin receptor substrate). Ceci permet le recrutement de la PI3K (phosphatidyl-inositol-3-kinase) qui phosphoryle le PIP2 (phosphatidyl-inositol bisphosphate) en PIP3(phosphatidyl-inositol triphosphate). Ce dernier active à son tour PKB/Akt (protein kinaseB) et permet la translocation des vésicules contenant le transporteur de glucose GLUT4vers la membrane. Parallèlement, l’activation de l’IR déclenche l’activation des voies MAPK(Mitogen Activated Protein Kinase), JNK (c-jun N-terminal Kinase), ERK (ExtracellularRegulated Kinase) et p38. Ces kinases vont alors exercer un rétrocontrôle négatif sur la phos-phorylation des IRS par une phosphorylation sur sérine et médier les effets transcriptionnelsde l’insuline via l’activation de facteurs de transcription.

de ces protéines. Cette inhibition est réalisée notamment par les MAPK, ERK et JNK étantresponsables de la phosphorylation des résidus sérine 616 et 312 respectivement [225, 12].

Une fois la stimulation de la voie de signalisation effectuée, l’ensemble ligand-récepteur estinternalisé et les deux molécules sont dégradées, une partie des récepteurs étant recyclé. Parailleurs, la mise en route de phosphatases spécifiques permet de déphosphoryler les différentséléments de la voie de signalisation de l’insuline. Parmi celles-ci, la protéine phosphatase 1B(PTP1B) joue un rôle particulier. Activée par le recepteur à l’insuline, elle est capable dedéphosphoryler les résidus tyrosines de ce même recepteur ainsi que ceux des IRS [185, 47]conduisant à une inactivation progressive de ces derniers. Ce mécanisme permet un retour à lasituation «de repos», arrêtant par là même l’entrée de glucose dans les cellules [26, 158].

37


1.3.3 Le diabète

Selon l’OMS : «Le diabète est une maladie chronique qui survient lorsque le pancréas neproduit pas assez d’insuline ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser efficacementl’insuline qu’il produit. Il en résulte une concentration accrue de glucose dans le sang (hyper-glycémie). [...] Le diabète peut résulter de nombreux facteurs génétiques et environnementauxagissant souvent de concert». En clinique, le diagnostic de diabète est défini par une glycémieà 7 mmol/l à jeun ou à 2 g/l à n’importe quel moment de la journée. Une glycémie compriseentre 1,10 et 1,25 g/l est définie comme une intolérance au glucose. Classiquement, on distinguedeux types de diabète qui diffèrent entre autres en fonction de l’âge d’apparition de la maladie(étude ENTRED 3).

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45-54 ans

55-64 ans

65-74 ans

75-84 ans

85 ans

Figure 1.18 – Age des personnes diabétiques en France par type dediabète, d’après l’étude Entred

Le diabète de type 1 ou diabète insulino-dépendant (DID)

Le diabète de type 1 touche environ 10% de l’ensemble des diabétiques, soit 90 000 à 120 000personnes en France. Il peut se manifester à tout âge, mais apparaît le plus souvent durant l’en-fance ou au début de l’âge adulte, d’où son appellation ancienne de « diabète juvénile ». Dansla majorité des cas, le diabète de type 1 est la conséquence d’une destruction des cellules β pan-créatiques entraînant un défaut de sécrétion de l’insuline (insulinopénie). Depuis la découvertede l’insuline en 1922, les diabétiques ne meurent plus de leur diabète. La supplémentation eninsuline permet également de diminuer la fréquence des complications diabétiques, telles querétinopathie, néphropathie, neuropathie, micro et macro-angiopathies diabétiques.

Le diabète de type 2 ou diabète non-insulino-dépendant (DNID)

Le diabète de type II concerne environ 3% de la population française. Il correspond à environ80% des états diabétiques et concerne majoritairement les personnes de plus de 50 ans, c’estpourquoi on l’appelle parfois «diabète de l’adulte». Il est le plus souvent plurifactoriel, résultant

3. Échantillon national témoin représentatif des personnes diabétiques (ENTRED). Étude réalisée en Francede 2007 à 2010 ayant pour objectif d’approfondir les connaissances sur l’état de santé des personnes diabétiquesen France, leur prise en charge médicale, leur qualité de vie, les besoins en démarche éducative et le coût dudiabète. http ://www.invs.sante.fr/entred/

38


de l’association d’une prédisposition génétique et de facteurs environnementaux, en particulierle surpoids (obésité et diabète sont associés dans 80% des cas), la sédentarité et la naturede l’alimentation. Cette forme de diabète, par sa fréquence, est responsable de la très grandemajorité des complications liées à l’ensemble des diabètes : insuffisance rénale, infarctus dumyocarde, artériopathie des membres inférieurs, accidents vasculaires cérébraux et rétinopathies

Le diabète de type II résulte de l’association d’un déficit de production d’insuline : insulino-sécrétion et d’un déficit de l’action de l’insuline : insulino-résistance.

Insulino-sécrétion Chez les sujets dont la tolérance au glucose est normale ou peu altérée,jusqu’à une valeur de 1,30 g/l, l’insulinémie croît avec la glycémie (fig. 1.19). Au-delà de cettevaleur, l’insulino-sécrétion diminue, même si la glycémie augmente. Ce seuil de transition marquel’incapacité de la cellule β à s’adapter à l’hyperglycémie, ce qui est le cas dans le diabète [41].

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Figure 1.19 – Courbe de Starling de la sécrétion d’insuline.Réponse glycémique moyenne à une hyperglycémie orale (oralglucose tolerance test, OGTT) en fonction de la glycémie à jeundes sujets étudiés. D’après De Fronzo [41].

A un stade précoce du diabète de type II, il existe également une anomalie, non plus quanti-tative, mais qualitative de la sécrétion de l’insuline : lors de l’hyperglycémie provoquée par voieveineuse, la décharge d’insuline des 10 premières minutes est altérée. Le stimulus physiologiquede la libération de l’insuline n’est plus reconnu par la cellule β, ni par la cellule α, qui ne diminueplus sa production de glucagon quand la glycémie s’élève [154].

Indépendamment des ces anomalies précoces des cellules pancréatiques, le diabète lui-mêmeet ses conséquences métaboliques altèrent à la fois la fonction et le stock de cellules β. Depuisl’étude UKPDS 4, il est d’ailleurs couramment admis que la diminution de la masse des cellulesβ est de l’ordre de 50%, au moment du diagnostic du diabète.

Ainsi, la carence en insuline elle-même perturbe la fonction de la cellule β de l’îlot de Lan-gerhans. Cette carence entraîne une hyperglycémie responsable d’une «glucotoxicité» passantvraisemblablement par des phénomènes de souffrance cellulaire [121, 119]. Elle a été démon-trée sur des modèles animaux chez qui une élévation discrète de la glycémie (pancréatectomiepartielle ou perfusion de glucose) induit une perte des cellules β dans le pancréas et le déve-loppement d’un diabète franc. Les mécanismes proposés de la glucotoxicité sont de plusieurs

4. United Kingdom Prospective Diabetes Study, étude prospective à grande échelle menée sur 6 ans auRoyaume-Uni de 1992 à 1998 [66]

39


ordres [119].1. L’accumulation de métabolites intracellulaires conduirait à une altération du transport du

glucose. L’hyperglycémie s’accompagne d’une augmentation de la formation de glucose-6-phosphate, qui est métabolisé en glucosamine-6-phosphate et en UDP-N-acétylglucosaminepar la glutamine-fructose-6-phosphate-amidotransférase (GFAT). D’ailleurs, la surexpres-sion de cette enzyme chez la souris induit une insulino-résistance caractérisée par unediminution de GLUT4 [74].

2. L’augmentation de l’activité de la protéine kinase C conduirait à une phosphorylation desrésidus sérine/thréonine de la sous-unité β du récepteur et à une diminution de l’activitétyrosine kinase.

3. La sécrétion par les cellules β surstimulées de protéine amyloïde insulaire (hIAP, humanIslet Amyloid Protein) conduirait à des dépôts fibrillaires d’amylose au contact des îlots,points de départ de phénomènes fibrotiques.

Parallèlement, les taux élevés d’acides gras circulants sont responsables d’une «lipotoxicité»,mécanisme connu depuis peu. Il existe dans la cellule β soumise à un environnement diabétique,un détournement des acides gras de l’oxydation vers le stockage de triglycérides. L’accumulationd’acétyl-coA conduit à la production de céramides et de monoxyde d’azote (NO) qui entraînentla répression de certains gènes et des altérations de la mitochondrie provoquant un phénomèned’apoptose cellulaire secondaire [152, 119].

Insulino-résistance L’insulino-résistance se définit comme une moindre efficacité de l’insu-line sur ses tissus cibles, nécessitant donc une quantité plus importante d’insuline pour obtenirune réponse des tissus. L’insulino-résistance au cours du diabète de type II concerne le foie etles tissus périphériques insulino-dépendants : muscle squelettique et tissu adipeux. La capturede glucose dans le muscle et dans le tissu adipeux est donc diminuée, tandis que la productionhépatique de glucose est augmentée. Cette insulino-résistance est aggravée par l’excès d’acidesgras libres circulants ou de triglycérides stockés en excès dans le muscle.

Insulino-résistance du tissu adipeux Dans le tissu adipeux, la diminution de l’actionde l’insuline au cours du diabète aboutit principalement à 3 phénomènes [217] : intensification del’activité de la lipase adipocytaire, diminution de l’activité de la lipoprotéine-lipase et libérationdans le sang d’une grande quantité d’acides gras non estérifiés (AGNE) due à une perte del’action anti-lipolytique de l’insuline.

La moindre inhibition de la lipolyse adipocytaire chez le diabétique de type II est responsabled’une élévation du taux des AGL circulants au cours de la journée. Cette élévation est associéeà un accroissement du flux de ces acides gras qui sont captés par le muscle et par le foie, àl’origine d’une lipotoxicité [217, 159, 213].

Concernant les mécanismes cellulaires altérés lors de l’insulino-résistance du tissu adipeux, ila été rapporté un défaut de fixation de l’insuline et donc une mauvaise activation de l’IR. Dansla cascade de signalisation, l’association de la PI3K avec les IRS est perturbée, de même quel’activité PKB, la quantité de GLUT4 disponibles et le transport de glucose (fig. 1.20) [28, 184].

Insulino-résistance musculaire Le principal tissu siège de l’insulino-résistance périphé-rique au cours du diabète est le muscle squelettique qui présente un déficit de 50% par compa-raison à un sujet normal.

40


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ObèsesObèses morbides

Sujets DNIDNon obèsesNon obèsesObèsesObèses morbides

Inchangé vs contrôles Modifié vs contrôles Inchangé ou modifié vs contrôles

Figure 1.20 – Schéma des voies de signalisation altérées dans le tissu adipeuxhumain ex vivo chez des sujets intolérants au glucose, obèses, résistants à l’insulineou diabétiques de type 2. D’après Frojdo, Pirola et Vidal, 2009 [56].

Le transporteur du glucose responsable de l’entrée de glucose en réponse à l’insuline estGLUT4. Ce transporteur est transloqué sous l’effet de l’insuline à partir d’un pool intracyto-plasmique vers la membrane. Au cours du diabète, le transport de glucose induit par l’insulineest diminué d’environ 50%. Étonnamment, le nombre total de transporteurs GLUT4 dans lemuscle reste normal ou légèrement réduit. C’est donc vraisemblablement le phénomène de trans-location et les voies de signalisation de l’insuline qui sont altérés. Le transporteur n’étant plustransloqué vers la membrane plasmique lors d’une stimulation par l’insuline, la quantité de glu-cose pouvant rentrer dans les myocytes est donc limitée. Cette perturbation de la signalisationinsuline dans le muscle est liée à une augmentation de l’activité de la PTP1B, ainsi qu’à unehyperphosphorylation des résidus sérine de l’IRS1 (fig. 1.21) [28, 184, 150, 56].

Il existe également lors du diabète une altération de la phosphorylation du glucose due à undéfaut d’activité basale et en réponse à l’insuline de l’hexokinase II [147, 100].

En aval du transport-phosphorylation, il existe un déficit du métabolisme intracellulaire duglucose. Ainsi, une diminution de l’activité de la pyruvate déshydrogénase mitochondriale enprésence d’insuline [181, 137] conduit à un excès d’oxydation des acides gras libres, en particulierchez le diabétique de type II obèse. Cet excès d’oxydation résulte de deux mécanismes :

1. l’accroissement du flux des AGL circulants secondaire à une lipolyse adipocytaire accrue2. l’oxydation des AGL provenant de la libération in situ des stocks de triglycérides intra-

musculairesParallèlement, le stockage du glycogène au niveau musculaire est diminué à cause d’un déficitd’activation de la glycogène synthétase [77, 37].

Insulino-résistance hépatique L’insulino-résistance au niveau du foie se traduit par unemoindre capacité de l’insuline à inhiber la production hépatique de glucose (PHG). Il a ainsi

41


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GTr

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Sujets Obèses inulino-résistantsBiopsiesBandes musculairesCulture primaireCulture primaire

Sujets DNIDBiopsiesBandes musculairesBandes musculairesCulture primaire

Inchangé vs contrôles Modifié vs contrôles Inchangé ou modifié vs contrôles

Figure 1.21 – Schéma des voies de signalisation altérées dans le muscle humain-exvivo chez des sujets intolérants au glucose, obèses, résistants à l’insuline ou diabé-tiques de type 2. D’après Frojdo, Pirola et Vidal, 2009 [56].

été montré que les phosphorylations basales de NF-κB et de la protéine kinase B (Akt) sontaugmentées chez les rats Zucker diabétiques, indiquant une perturbation des voies de signalisa-tion dans le foie de ces animaux [85]. En période post-prandiale, en réponse à l’hyperglycémieet à l’hyperinsulinémie, la production endogène de glucose est moins inhibée chez le diabétiquede type II que chez le sujet sain. Ceci est dû à la fois à la moindre inhibition de la néoglucoge-nèse et à la moindre inhibition par l’insuline de l’activité glucose-6-phosphatase. Cette moindreinhibition de la PHG en réponse à un repas est responsable à elle seule de l’hyperglycémiepost-prandiale excessive chez les diabétiques.

L’accroissement de la néoglucogenèse hépatique est liée à trois paramètres :1. l’augmentation de la disponibilité des acides gras libres circulants résulte de la moindre

inhibition de la lipase adipocytaire (insulino-résistance du tissu adipeux). L’élévation desAGL circulants s’accompagne d’une augmentation de leur afflux au foie où ils sont oxydés.L’oxydation intra-hépatique des acides gras fournit l’acétyl-CoA, l’énergie (ATP) et leNADH nécessaires au fonctionnement de la néoglucogenèse.

2. l’afflux des précurseurs glucoformateurs résulte de la lipolyse (afflux de glycérol) accruedue à la moindre inhibition de la lipase hormonosensible du tissu adipeux, et au recyclageaccru du lactate au niveau musculaire.

3. l’hyperglucagonémie chronique stimule l’expression des gènes codant pour les enzymes dela néoglucogenèse, en particulier la phosphoénol pyruvate kinase (PEPCK).

L’élévation de la néoglucogenèse ne suffit pas, à elle seule, à expliquer l’augmentation de laPHG. Ainsi, il existe parallèlement une surexpression de la glucose-6-phosphatase et une sous-expression de la glucokinase. Ceci favorise l’orientation du glucose-6-phosphate produit en excès

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vers la formation de glucose qui est exporté dans la circulation, contribuant à l’hyperglycémie[28, 184].

Traitement La perte de poids améliore la sensibilité à l’insuline. Celle-ci doit s’accompa-gner de modifications de la qualité des nutriments et en particulier de la réduction les apportslipidiques à 30 à 35% de la ration. Ces lipides seront pour 1/3 monoinsaturés, 1/3 polyinsa-turés, 1/3 saturés. Les aliments à fort index glycémique sont à éviter, ainsi que l’alcool quireprésente un apport calorique important et une cause fréquente de déséquilibre glycémique.L’activité physique, même modérée constitue un élément clé. En effet, la sédentarité réduit laconsommation et le stockage de glucose par le muscle, accentuant l’insulino-résistance du tissumusculaire. Après échec ou effet insuffisant des mesures hygiéno-diététiques, un traitement pardes antidiabétiques oraux est possible : hypoglycémiants (sulfamides) et/ou insulinosensibili-sants (thiazolidinedione).

Un des plus gros facteurs de risque pour le diabète de type 2 est l’obésité. Chez les pa-tients obèses la chirurgie bariatrique permet de restreindre l’absorption des aliments en court-circuitant une partie de l’estomac et de l’intestin grêle. Cette chirurgie pratiquée à l’heureactuelle dans des cas d’obésité morbide a pour résultat une résolution ou une amélioration dudiabète dans plus de 86% des cas. Près de 90% des patients atteints d’un diabète de type 2étant en surpoids ou obèses, il est donc possible que la chirurgie bariatrique soit une option detraitement intéressante pour ces patients [205, 23].

L’hypothèse unificatrice du diabète, d’après Wilkin [229, 230, 228, 95] Classique-ment, diabète de type 1 et diabète de type 2 sont définis comme deux pathologies d’étiologiedifférente. Le premier est une maladie auto-immune induisant une destruction des cellules β dupancréas, intervenant principalement chez les enfants et dépendant de l’insuline. Le diabète detype 2 est une pathologie de l’adulte, désordre métabolique associé au mode de vie sédentaire età l’alimentation. Cependant, cette définition n’est pas tout à fait exacte. A l’heure actuelle, desenfants peuvent présenter un diabète de type 2 et des adultes présentant un diabète de type 1peuvent vivre sans insuline pendant de nombreuses années. Environ 10% des diabétiques non-insulinodépendants ne souffrent pas d’un diabète de type II, mais d’un diabète de type I dans saforme lentement progressive (LADA, Latent Autoimmune Diabetes in Adults) caractérisée parla présence d’anticorps anti-îlots. La seule différence vraiment visible entre ces deux pathologiesest alors la vitesse d’apparition.

A partir de ces observations, l’hypothèse d’une origine commune du diabète s’est développée.Les diabètes de type 1 et de type 2 seraient issus tous deux du même trouble : l’insulino-résistance, et ne se distingueraient que par leur cinétique reflétant un fond génétique plus oumoins sensible. Trois processus accélèreraient donc la destruction des cellules β :Insulino-résistance. Étroitement liée à l’augmentation du surpoids et de l’obésité, elle serait le

point de départ et au cœur de l’incidence croissante du diabète. Le gain de poids provoqueen effet une augmentation de la résistance à l’insuline, ce qui entraîne un affaiblissementdu contrôle du glucose et une hyperglycémie chronique.

Réponse immunitaire. L’hypothèse unificatrice ne nie pas le rôle de l’autoimmunité, maisseulement sa primauté dans le processus. L’augmentation du glucose sanguin liée à l’insuli-no-résistance accélèrerait l’apoptose des cellules β (glucotoxicité) ce qui augmenterait en-suite leur immunogénicité.

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Génétique. Le génotype déterminerait l’âge auquel la perte de cellules β devient critique.Finalement, l’hypothèse unificatrice définit le diabète de type 2 non pas comme une entité, maisplutôt comme un diabète se développant à l’âge adulte. De même, le diabète de type 1, seraitun diabète se développant rapidement dans l’enfance. L’incidence croissante des deux diabètesserait principalement le résultat du changement de style de vie : la hausse du poids du corpsayant contribué à augmenter l’incidence de l’insulino-résistance.

1.4 Stress oxydant et insulino-résistance

De plus en plus de données expérimentales et cliniques suggèrent que le stress oxydant,par l’intermédiaire des mécanismes précédemment décrits, joue un rôle physiologique sur laréponse à l’insuline et un rôle physiopathologique sur les étapes précoces du développement del’insulino-résistance [33, 12, 34, 52].

1.4.1 Rôle des radicaux libres dans la signalisation insuline

Bien qu’une production excessive de ROS soit associée au développement de diverses patho-logies, des concentrations physiologiques faibles de H2O2 sont nécessaires pour le fonctionnementcellulaire normal et la signalisation intracellulaire. Ces ROS «physiologiques» sont produits prin-cipalement à la membrane plasmique, consécutivement à l’activation des NADPH oxydases enréponse à une grande variété de stimuli [216]. Les facteurs de croissance et les hormones peuventainsi favoriser la génération transitoire de H2O2, ce qui est essentiel pour une phosphorylationoptimale sur résidu tyrosine des voies de signalisation. Les cibles principales de ces ROS sontles protéines tyrosine phosphatases (PTP) [162, 201], telles que la PTP1B qui déphosphoryleles IRS, et la PTEN qui déphosphoryle le PIP3. Ces enzymes qui régulent la sensibilité à l’in-suline et l’homéostasie du glucose in vivo, sont transitoirement oxydées par H2O2 en réponse àl’insuline ce qui favorise l’activation de l’IR et de la PI3K [101, 106, 122, 183].

Pour appuyer le rôle physiologique des ROS dans la régulation de la glycémie, la suppressionde la GPx1 (souris KO) augmente la sensibilité à l’insuline, comme le démontrent des expériencesde test de tolérance et de signalisation [115]. Ceci ne modifie cependant pas significativementla production d’insuline : l’insulinémie en réponse à une administration de glucose est similaireentre les GPx1−/− et les animaux sauvages. Ces études démontrent le rôle positif que jouent lesROS dans la réponse à l’insuline, renforçant plutôt que diminuant la sensibilité à l’insuline invivo. Paradoxalement, la seule surexpression de la GPx1 peut entraîner une résistance à l’insuline[129]. Des études ultérieures ont par ailleurs démontré que des souris surexprimant la GPx1présentent une hyperproduction d’insuline et que les ilots isolés de ces souris ont une sécrétionaccrue d’insuline en réponse au glucose [222]. Comme l’hyperinsulinémie est associée à unesensibilité à l’insuline diminuée, la résistance périphérique à l’insuline des souris transgéniquesGPx1 pourrait être attribuée à la surproduction d’insuline induite par les ROS dans les cellulesβ-pancréatiques [170, 224].

Ainsi, c’est vraisemblablement une dérégulation de la quantité de ROS produits qui estresponsable du développement de l’insulino-résistance et non pas les ROS eux mêmes.

44


1.4.2 Rôle du stress oxydant dans l’insulino-résistance

Différentes études sur des lignées cellulaires démontrent que le stress oxydant perturbe latransduction du signal insuline. Des concentrations micromolaires d’eau oxygénée inhibent l’au-tophosphorylation du récepteur de l’insuline, la phosphorylation de l’IRS-1, et les événementsen aval de la phosphorylation d’IRS-1 tels que l’activation de la phosphatidylinositol 3-kinase,le transport du glucose, et l’activation des MAPK [72]. La génération de radicaux libres estpar ailleurs un médiateur des effets du TNFα et peut donc influer sur la sensibilité des tissuspériphériques à l’insuline par cette voie [72].

Dans des modèles animaux de diabète et d’obésité, il existe une augmentation des marqueursde la peroxydation lipidique. C’est le cas chez le rat Zucker obèse et résistant à l’insuline qu’untraitement avec des pro-oxydants rend diabétique [103]. Chez l’animal, la consommation d’unrégime riche en saccharose ou en fructose induit un stress oxydant à court terme (2 semaines)[24], comme l’indiquent l’augmentation des concentrations urinaires en substances réactives àl’acide thiobarbiturique et la diminution de l’activité et de l’expression de la catalase, de laxanthine oxydase et de la superoxyde dismutase dans différents tissus [25, 31, 43]. Ces modifica-tions du statut redox sont associées à une insulino-résistance périphérique [94, 144] et une perteimportante de réactivité de la voie de signalisation de l’insuline, en réponse à une stimulationinsulinique [17].

Tissu adipeux La présence des produits d’oxydation des lipides et des protéines dans le tissuadipeux au cours de l’obésité et du diabète est révélatrice de la présence d’un stress oxydant à ceniveau. La perturbation de l’équilibre pro-oxydant/anti-oxydant se manifeste par des niveauxélevés de substances réagissant avec l’acide thiobarbiturique (TBARS), ou encore du MDA[60]. La carbonylation des protéines totales est d’ailleurs deux à trois fois plus élevée dans lestissus adipeux des souris en régime hypercalorique. De plus, les marqueurs du stress oxydantMDA et 8-épi-PGF2α sont directement correlés avec l’adiposité [57]. Les souris obèses, avantde développer un diabète, ne présentent pas de stress oxydant dans leurs tissus maigres maisuniquement dans le tissu adipeux, révélé par une génération accrue de H2O2, accompagnée d’unediminution du taux d’ARNm de la SOD, catalase, et glutathion peroxydase [57] à ce niveau.De façon concomitante, les niveaux d’ARNm de la glutathion-S-transférase 4, une enzyme cléresponsable de la détoxification des dérivés de la peroxydation lipidique, sont réduits de trois àquatre fois [65].

Le stress oxydant dans le tissu adipeux conduit à une production dérégulée d’adipocytokines.Ainsi, les niveaux plasmatiques d’adiponectine sont inversement corrélés aux marqueurs dustress oxydant systémique chez des sujets non diabétiques [57]. Dans des adipocytes en culture,le stress oxydant diminue l’expression de l’ARNm et la sécrétion de l’adiponectine et chez lessouris KKAy, le traitement par un inhibiteur de la NADPH oxydase diminue le stress oxydantdans le tissu adipeux et augmente les taux plasmatiques d’adiponectine. Ces résultats indiquentqu’une augmentation locale du stress oxydant dans le tissu adipeux abouti à une productiondérégulée d’adipocytokines, pouvant favoriser le développement de l’insulino-résistance.

Sur des cultures d’adipocytes 3T3-L1, le stress oxydant inhibe la translocation du transpor-teur de glucose GLUT4 et l’activation de la protéine kinase B stimulées par l’insuline et inhibe laproduction d’adiponectine. Le 4-HNE est également capable de diminuer la production d’adipo-nectine dans ces cellules [187]. Un traitement par des antioxydants permet de prévenir ces effets[187, 168, 200]. Cet effet bénéfique a été également montré avec l’acide lipoïque sur le transport

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de glucose, par l’intermédiaire de l’activation d’étapes en amont de la voie de signalisation del’insuline, sur des cellules musculaires et des adipocytes isolés [75, 84, 107]. Très récemment,l’équipe de E. Van Obberghen a pu mettre en évidence une inhibition des voies de signalisationde l’insuline par le 4-HNE dans des adipocytes 3T3-L1, montrant l’importance, certainementsous-estimée, des dérivés secondaires de la peroxydation lipidique dans le développement del’insulino-résistance [42].

Muscle squelettique L’implication du stress oxydant dans le muscle au cours du diabèten’est actuellement pas clairement définie. Une récente étude n’a signalé aucune augmentation du4-HNE dans les muscles de diabétiques obèses par rapport aux contrôles obèses non diabétiques[137]. Par contre, dans le diabète de type 1 expérimental, une diminution des thiols a étésignalée dans les muscles squelettiques et cardiaques, ainsi qu’une diminution des enzymes anti-oxydantes [69]. Par ailleurs, l’augmentation de la nitrosylation des protéines musculaires ainsique des protéines clés de la cascade de signalisation de l’insuline a été rapportée dans l’obésité,associée à une insulino-résistance [235, 30].

Dans le muscle squelettique des souris sous régime hypercalorique, la production de ROSinduit une dysfonction mitochondriale, conséquence de l’hyperglycémie et de l’hyperlipidémie[20]. Cette dysfonction n’est pas présente au stade d’intolérance au glucose, mais est secondaireau développement du diabète. La diminution de l’oxydation des acides gras résultant de la baissed’activité mitochondriale contribue au dépôt de lipides dans le muscle. Ceci entretient donc uncercle vicieux via la formation de peroxydes lipidiques pouvant à leur tour engendrer un stressoxydant.

Foie L’obésité et la résistance à l’insuline étant fréquemment associées à une accumulationaccrue de lipides (triglycérides) dans le foie, il demeure difficile de savoir si l’élévation de laperoxydation lipidique dans le foie reflète vraiment l’augmentation du stress oxydatif, ou seule-ment l’augmentation des substrats disponibles pour la peroxydation lipidique. En faveur de laprésence d’un stress oxydant hépatique, il est possible d’observer une diminution du glutathion(ratio GSH/GSSG) dans le foie d’animaux diabétiques de type 1, même si ce résultat n’estpas obtenu dans les modèles de diabète de type 2. De plus, le contenu hépatique en MDA estpositivement corrélé avec le poids corporel, la leptinémie et le HOMA chez des rats wistar sousrégime enrichi [134].

Amélioration de l’insulino-résistance par les antioxydants L’importance du stress oxy-dant dans l’étiologie de l’insulino-résistance est également suggérée par les études mettant enévidence l’effet bénéfique d’un apport supplémentaire en antioxydants sur l’insulino-sensibilité.Chez le rat Zucker obèse, un apport supplémentaire en vitamine E pendant 4 semaines réduitsignificativement le stress oxydant, évalué par les concentrations plasmatiques en 8-épi-PGF2α.L’amélioration du statut redox s’accompagne d’une diminution de la glycémie et de l’insuliné-mie à jeun et d’une réduction significative de l’hyperglycémie et de l’hyperinsulinémie induitespar une charge de glucose [102].

Un apport supplémentaire en acide α-lipoïque ou en vitamine E prévient la dégradation duratio GSH/GSSG, la diminution de l’activité des enzymes anti-oxydantes (glutathion peroxydaseet superoxyde dismutase) et l’insulino-résistance induite par la consommation d’un régime richeen saccharose ou en fructose [133, 53]. De même, chez le rat rendu insulino-résistant par un

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régime riche en fructose, l’administration de metformine améliore simultanément la sensibilitéà l’insuline et les défenses antioxydantes [54].

1.4.3 Rôle du stress oxydant au cours du diabète

Au cours du diabète de type 2, la présence d’un stress oxydant a été démontrée par ledosage de nombreux marqueurs tels que les concentrations urinaires de F2-isoprostane [172],la production de ROS et de produits d’oxydation de lipides ou encore la carbonylation desprotéines plasmatiques [63, 140, 203, 166]. Plusieurs études épidémiologiques ont observé dansdes cohortes de sujets non-diabétiques une corrélation entre la glycémie à jeun et différentsmarqueurs de stress oxydant. Ainsi, la glycémie à jeun est positivement corrélée aux concen-trations plasmatiques en 8-épi-PGF2α ou en substances réactives à l’acide thiobarbiturique(marqueurs de la peroxydation des lipides par les radicaux libres) et négativement corrélée auxconcentrations sanguines en glutathion [204, 132]. De plus, les concentrations plasmatiques en8-épi-PGF2α sont positivement corrélées à l’index HOMA d’insulino-résistance [64] et la concen-tration urinaire d’acroléine est corrélée avec l’hémoglobine glyquée (HbA1c) [39]. Parallèlementà l’élévation des marqueurs du stress oxydant, il existe une diminution des mécanismes de dé-fense antioxydants comme les thiols, l’acide urique et la vitamine A [141, 128]. Chez des sujetsintolérants au glucose, l’activité des enzymes antioxydantes (catalase et SOD) est plus faibleque chez des sujets sains [218].

La sensibilité à l’insuline des patients insulino-résistants et diabétiques peut être amélioréepar un traitement avec des antioxydants [219, 92]. Ainsi, chez des sujets diabétiques de type 2un apport supplémentaire en acide α-lipoïque augmente la tolérance au glucose, la sensibilité àl’insuline et le taux d’extraction métabolique du glucose [84]. De la même manière, un apportsupplémentaire en vitamine E chez des sujets obèses et insulino-résistants réduit significati-vement les concentrations sanguines en peroxydes ainsi que l’insulinémie, la glycémie à jeunet l’index HOMA [125]. Réciproquement, un traitement intensif du diabète améliore les tauxcirculants d’eau oxygénée et de MDA, montrant le lien étroit existant entre stress oxydant etinsulino-résistance [227].

Ainsi, de nombreux éléments suggèrent l’implication du stress oxydant dans le développe-ment du diabète systémique et tissu-spécifique, même si les mécanismes impliqués ne sont encorequ’imparfaitement élucidés [57, 52, 14, 161].

Le statut hyperglycémique est fortement suspecté d’être à l’origine de cette anomalie du sta-tut oxydatif dans le diabète de type 2. En faveur de cette hypothèse, une simple hyperglycémieà court terme, provoquée par voie orale, diminue les défenses antioxydantes de l’organisme chezdes sujets sains ou diabétiques non insulinodépendants [32]. De même, une situation hypergly-cémique augmente l’insulinorésistance musculaire et adipeuse en diminuant la translocation destransporteurs du glucose GLUT4 vers la membrane [91]. L’hyperglycémie entraine une diminu-tion de la quantité d’ATP intracellulaire, ce qui induit une réduction de l’autophosphorylationdu récepteur à insuline, de la phosphorylation de l’IRS1, de l’activité PI3 kinase et de la protéinekinase B. La déplétion en ATP reste modérée (moins de 20%) mais exerce des effets amplifiéspar les différentes étapes de la voie de signalisation de l’insuline. Ainsi, une diminution de 50%de la phosphorylation d’IRS1 provoque une inhibition totale de la translocation de GLUT4.Une faible diminution de l’ATP disponible induit donc une forte diminution de la sensibilité àl’insuline.

47

Problématique

La présence d’un stress oxydant a été démontrée dans de nombreuses pathologies et sonassociation avec l’insulino-résistance au cours du diabète est à l’heure actuelle bien définie.

Au cours du stress oxydant, la peroxydation des acides gras polyinsaturés, tels que ceuxdes séries omega-3 et omega-6, aboutit à la formation de nombreux dérivés toxiques capablesde potentialiser et de transmettre les effets néfastes du stress oxydant. Parmi ces dérivés, lesaldéhydes, tels que le 4-HHE et le 4-HNE, produits en quantité importante, notamment aucours du diabète, ont montré des effets délétères sur de nombreux systèmes cellulaires.

Insulino résistanceStress Oxydant

4 hydroxy 2 alkénals

Figure 1.22 – Problématique : le 4-HHE et le 4-HNE produits au cours de laperoxydation lipidique sont-ils des médiateurs important des effets délétères dustress oxydant sur le développement de la résistance à l’insuline et du diabète ?

L’objectif de cette étude est de déterminer l’implication du 4-HHE et du 4-HNE dans ledéveloppement de l’insulino-résistance. Pour cela, nous avons étudié :

1. Les concentrations plasmatiques du 4-HHE et du 4-HNE au cours du diabète2. La formation d’adduits covalents et la toxicité sur les cellules musculaires3. L’inhibition des voies de signalisation de l’insuline4. La formation d’adduits covalents sur l’insuline et la perturbation de son activité biologique5. La relation structure/toxicité des hydroxy-alkénals

48

Chapitre 2

Matériel et Méthodes

2.1 Dosage plasmatique du 4-HHE et du 4-HNE

Recrutement des sujets Le sang de quatre sujets diabétiques de type 2 et de quatre volon-taires sains a été prélevé lors d’une étude en cours à l’hôpital universitaire (Protocole ECLIPSE,Service d’endocrinologie du Pr. Philippe Moulin). Les sujets ont été appariés par leur âge etleur index de masse corporelle (IMC). L’étude a été approuvée par le comité d’éthique local etle consentement éclairé de tous les sujets a été obtenu. Après une nuit à jeûn, les échantillonsde sang ont été prélevés et centrifugés à 1500 g pendant 10 min. Les surnageants de plasma ontété immédiatement congelés et conservés à -80°C jusqu’à leur utilisation.

Induction du diabète chez le rat Le diabète a été induit chez des rats mâles Wistar (200-250 g, Harlan Gannat, France) par une injection intrapéritonéale (ip) unique de 50 mg/kg destreptozotocine (STZ, Sigma) dissoute dans une solution saline acidifiée (NaCl 0,9% w/v, pH4,5). Les animaux contrôle ont subi l’injection de solution saline seule. Après 15 jours, la glycémiea été mesurée à la queue avec un glucomètre (Accu Check réactif, Roche) et les animaux ontété sacrifiés. Les animaux ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique (60 mg/kg ip), lacavité abdominale a été ouverte et le sang a été rapidement ponctionné à partir de la veine cavedans une seringue héparinée. Après centrifugation (2 min, 8000g), les plasmas ont été prélevés,congelés immédiatement dans l’azote liquide et conservés à -80°C. Cinq cents microlitres ontété utilisés ultérieurement pour mesurer les concentrations plasmatiques de 4-HHE et de 4-HNEpar chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. Cinq cents autresmicrolitres ont été utilisés pour mesurer la carbonylation des protéines plasmatiques.

Dosage des hydroxy-alkénals Cinq cents microlitres de plasma ont été utilisés pour mesu-rer le 4-HHE et le 4-HNE. Vingt nanogrammes de 4-HNE-CD3 ont été ajoutés comme standardinterne, avant le traitement avec 1 ml de O-2,3,4,5,6-chlorhydrate d’hydroxylamine pentafluoro-benzyl (50 mM de 0,1 M de tampon PIPES, pH 6,5) pendant 30 min à température ambiante,selon la procédure décrite par Van Kuij et al. (1995) [215]. Les dérivés pentafluorobenzyloximeont été extraits avec 2,5 ml de méthanol et 5 ml d’hexane et le mélange a été acidifié avec 60 μlde H2SO4 98%. Après agitation douce et centrifugation pendant 5 minutes à 1200 g, les solvantsont été évaporés sous flux d’azote. Le groupe hydroxyle a été converti en éther triméthylsilylepar un traitement d’une nuit avec la N, O-bis (triméthylsilyl) trifluoroacétamide à température

49

CHAPITRE 2. MATÉRIEL ET MÉTHODES

2 200 000

2 000 000 4-HHE 4-HNE

11.1814.06

14.55

e re

lativ

e 1 800 000

1 600 000

1 400 000

10.90

Abo

ndan

c

1 200 000

1 000 000

800 000

600 000

400 000

200 000

Temps

9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0

Figure 2.1 – Chromatogramme GC/MSMS typique du dosage 4-HHE et 4-HNE.Les pics correspondent aux courants ioniques cumulés respectifs des 2 isomères du4-HHE et des 2 isomères du 4-HNE.

ambiante. Les dérivés oxime pentafluorobenzyl, trimethylsilylether-4-HHE (PFB-TMS) ont étéensuite analysés par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse.

La GC-MS a été réalisée sur un spectromètre de masse quadrupole interfacé avec un chroma-tographe en phase gazeuse (Les Ulis, France). Le chromatographe en phase gazeuse est équipéd’une colonne capillaire DB-17ms en silice fondue (60 m, 0,25 mm de diamètre, 0,25 m épaisseurdu film) (Agilent Technologies), maintenue à 57°C. Le programme suivant a été utilisé : 2 min à57°C, puis augmentation de 40°C par min jusqu’à 200°C, suivie d’une augmentation de 8°C parmin jusqu’à 280°C. Les échantillons ont été injectés avec un injecteur split / splitless avec unepression à la tête de 18 psi. L’interface, l’injecteur, et la source d’ions ont été maintenus à 280,280 et 150°C, respectivement. L’énergie d’électrons a été fixée à 70 eV. L’hélium a été utilisécomme support et le méthane comme gaz réactif. L’ionisation chimique en ions negatifs (NICI)a ensuite été effectuée. Le multiplicateur de tension a été fixé à 1400 V. Les ions m/z 241, 271,291, 361 ont été mesurés pour le 4-HHE et les ions m/z 244, 274, 294, 364 pour le 4-HHE-CD3.Un chromatogramme typique des courants ioniques cumulés est présenté en annexe (fig. 2.1).

2.2 Culture cellulaireToutes ces manipulations doivent être réalisées stérilement sous une hotte à flux laminaire

et les plaques doivent être conservées dans un incubateur à 37°C avec 5% de CO2.

2.2.1 Myoblastes L6C5

Les cellules utilisées sont des cellules myogéniques de rat L6C5 (type L6, clone C5) provenantd’une lignée cellulaire obtenue chez American Type Culture Collection (ATCC CRL-1458). Ellessont ensemencées à raison de 50 000 cellules /cm2 et forment un tapis cellulaire monocouchequi devient jointif à confluence (fig. 2.2.1). Elles sont cultivées dans un milieu nutritif liquide

50


DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Sigma D6546) de base riche en glucose (4,5 g/l)supplémenté avec 200 mM de L-Glutamine, 100 μg/mL de streptomycine et 100 U/mL depénicilline. Le milieu complet est obtenu par ajout de 10% de sérum de veau foetal (SVF,Invitrogen).

Figure 2.2 – Culture de myoblastes L6 (à gauche) et d’adi-pocytes 3T3-L1 (à droite). Les adipocytes ont été différenciéset marqués à l’huile rouge (red oil) pour visualiser les goute-lettes lipidiques. Les cellules ont ensuite été photographiées encontraste de phase.

2.2.2 Adipocytes 3T3-L1

Les cellules utilisées sont des fibroblastes issus d’embryons murins. Elles proviennent d’unelignée cellulaire : 3T3-L1 obtenue chez American Type Culture Collection (ATCC CL-173).Ces fibroblastes sont capables de se différencier spontanément en adipocytes, c’est pourquoi ilssont aussi appelés préadipocytes. Les fibroblastes sont des cellules polygonales qui adhèrent aufond des boites de culture et forment un tapis cellulaire monocouche et jointif à confluence.Les fibroblastes 3T3-L1 sont mis en culture dans un milieu constitué de DMEM (Dulbecco’sModified Eagle’s Medium Sigma D6546) complémenté par 10% de sérum de veau foetal, 200mM de L-Glutamine (Sigma), 100 μg/mL de streptomycine et 100 U/mL de pénicilline (Sigma-Aldrich) [240].

Lorsque les fibroblastes sont à confluence, leur différenciation en adipocytes (fig. 2.2.1) estinduite en les incubant pendant 48 heures dans du milieu de culture supplémenté en insuline(5 μg/mL), IBMX (0,5 mM), dexamethazone (25 nM) et rosiglitazone (10 μM) puis 48 heuresdans du milieu complet supplémenté en insuline (5 μg/mL) et rosiglitazone (10 μM). L’état dedifférenciation des adipocytes est contrôlé au microscope optique en vérifiant l’apparition degouttelettes lipidiques très réfringentes, dans le cytoplasme. Les adipocytes sont utilisés pourles expérimentations après 10 jours de différenciation.

Trypsinisation A confluence, l’inhibition de contact provoque l’arrêt de la division cellulaireet la différenciation spontanée des cellules. Pour éviter cela, à préconfluence, le milieu est aspiréet les cellules sont lavées avec du PBS, puis décollées par 2 mL de trypsine/EDTA (5 minà 37°C). La réaction est stoppée par ajout de 8 mL de milieu complet, le SVF permettantd’inactiver la trypsine. Les cellules sont alors resuspendues puis ré-ensemencées.

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Traitement Après trypsinisation les cellules sont comptées sur lame de Malassez puis ré-ensemencées dans des plaques, 6 ou 12 puits et stabilisées 24 heures dans l’incubateur. Ceci leurpermet d’adhérer et de reprendre leur prolifération. Avant traitement, les cellules sont rincéesavec du PBS puis mises en présence d’un milieu DMEM sans sérum pendant au moins 4 heures,ceci afin d’arrêter la prolifération cellulaire et de s’affranchir des effets non contrôlables du SVF.Pour les mêmes raisons, tous les traitements sont ensuite effectués dans du DMEM sans sérum.Lors du traitement des cellules, les concentrations de solvant (DMSO, ethanol) sont maintenuesà une concentration finale maximale de 0,5% v/v, ceci pour s’affranchir des effets potentiels deces produits.

2.2.3 Mesure de la viabilité

Le test MTT mesure la prolifération cellulaire, la viabilité cellulaire ou les capacités méta-boliques des cellules en culture (Cell Proliferation Kit I, Roche). Il est basé sur le clivage dusel MTT (3-[4-5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, de couleur jaune) enformazan (violet) par les cellules métaboliquement actives. Les cristaux de formazan forméssont insolubles et précipitent à l’intérieur des cellules. Leur solubilisation permet de quantifierpar une lecture colorimétrique le nombre de cellules ayant métabolisé le MTT. Les cellules sontensemencées en microplaques 96 puits à raison de 3000 cellules par puits dans un volume totalde 100 μL. Après stabilisation pendant 24H, les aldéhydes sont ajoutés sur les cellules pendantla durée indiquée. Puis 10 μL de MTT sont ajoutés dans chaque puits, suivis d’une incubationpendant 4 heures à 37°C. La solution de solubilisation (100 μL) est alors ajoutée dans tous lespuits et les plaques sont incubées pendant une nuit à 37°C. L’absorbance est lue à 550 nm, avecune longueur d’onde de référence à 690 nm. L’intensité de la coloration (absorbance à 550 nm)est proportionnelle à la quantité de cellules métaboliquement actives et est donc un reflet directde la viabilité et/ou de la prolifération cellulaire.

2.2.4 Mesure de la nécrose

Le test LDH permet une estimation de la cytotoxicité d’un traitement par le dosage del’activité lactate déshydrogénase (In Vitro Toxicology Assay Kit, Lactic Dehydrogenase based,Sigma Aldrich). La LDH (lactate déshydrogénase) est une enzyme cytoplasmique, sa présencedans le milieu extracellulaire est révélatrice d’un défaut de perméabilité membranaire dû à unenécrose et une lyse cellulaire. Le dosage de l’activité LDH dans le milieu extracellulaire estdonc un indicateur de la mortalité des cellules. Le test est basé sur la réduction du NAD+

par la LDH. Le NADH produit par la réaction est utilisé dans la conversion stoechiométriqued’un colorant (tetrazolium) par la LDH. Le produit coloré ainsi produit peut être dosé par unelecture d’absorbance à 490 nm avec une longueur d’onde de référence à 690 nm. Les cellulessont ensemencées en microplaques 96 puits à raison de 5000 cellules par puits et traitées dansun volume total de 100 μL. La solution de test est préparée en mélangeant en volumes égaux :«LDH assay substrate», «Cofactor» et «Dye solution». Après traitement des cellules, 50 μL demilieu de culture surnageant sont récupérés et transférés dans une plaque 96 puits propre, afinde doser l’activité LDH dans le milieu extracellulaire. Dans la plaque contenant les cellules sontajoutés 50 μL de tampon de lyse afin de déterminer l’activité LDH totale. Pour chaque puits,100 μL de solution de test sont ajoutés et les plaques sont incubées pendant 30 minutes sousagitation à l’abri de la lumière. L’absorbance à 490 nm est ensuite lue à l’aide d’un lecteur

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spectrophotométrique de plaques multipuits. Pour chaque puits, le rapport de l’activité LDHextracellulaire sur l’activité LDH totale est un indicateur de la perméabilité membranaire etdonc de la viabilité des cellules.

2.2.5 Mesure de l’aptoptose

Ce test permet une estimation de l’apotose par le dosage de l’activité caspase 3 dans lescellules (Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric, Sigma Aldrich). Les caspases (Cysteine requiringAspartate protease) sont une famille de protéases qui interviennent dans le processus d’apop-tose. La caspase 3 est un membre de la sous-famille CED-3 des caspases, et est l’une desenzymes critiques de l’apoptose. Le dosage colorimétrique caspase 3 est basé sur l’hydrolyse dupeptide acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-nitroanilide (Ac-DEVD-pNA), entraînant la libération de lap-nitroaniline (pNA), qui absorbe fortement à 405 nm. La concentration du substrat est calculéeà partir d’une courbe d’étalonnage préparée avec des solutions définies de pNA.

2.3 Immunoprécipitation et Immunodétection

Extraction des protéines totales Les cellules sont cultivées en plaques 6 puits, puis stimu-lées ou non par l’insuline, le 4-HNE ou le 4-HHE. Les cellules sont ensuite lavées deux fois avecdu PBS à 37°C puis lysées dans du tampon de lyse (Tris 20 mM, NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM,MgCl2 1 mM, glycérol 5% et NP40 1%) supplémenté en inhibiteurs de protéases. Les cellulessont reprises dans 150 μL de tampon par puits puis incubées pendant 15 min à 4°C en vortexantrégulièrement. Les homogénats cellulaires sont ensuite centrifugés à 14 000 g pendant 15 min etle surnageant est récupéré. Le dosage des protéines (par méthode de Bradford) est réalisé surune fraction aliquote de chaque échantillon.

Dosage des protéines et préparation des échantillons Ce dosage est basé sur le change-ment de coloration du bleu de Coomassie en présence de protéines selon la méthode de Bradford[21]. Pour le réaliser nous utilisons le kit «Bio-rad’s protein assay» adapté pour le dosage enmicroplaques. Une fraction aliquote de la solution à doser est prélevée, diluée si nécessaire etdéposée en duplicata dans une plaque 96 puits. Sont ajoutés enuite 200 μL de solution «BioRadprotein assay» diluée 5 fois dans de l’eau. Après agitation de la plaque pendant 15 minutes,l’absorbance à 595 nm est lue à l’aide d’un lecteur spectrophotométrique de plaques multipuits(powerWave X, BIOTEK INSTRUMENTS). La concentration est déterminée par comparaisonà une gamme étalon d’albumine sérique bovine (1-20 μg de protéines) réalisée dans les mêmesconditions.

Pour les immunomarquages, différentes quantités de protéine sont utilisées :• Pour un western blot standard, 20 μg de protéines sont repris dans du tampon de Laemmli

(Tris 125 mM, pH=6,8, saccharose 10%, SDS 2%, β-mercaptoéthanol 1%, bleu de bromo-phénol 0,05%) et portés à ébullition pendant 5 min.• Pour un dot blot, 50 μM de protéines sont déposés directement sur une membrane de

nitrocellulose à l’aide d’un système d’aspiration dédié (BioRad).• Pour une immunoprécipitation, 700 à 1000 μg de protéines totales sont incubés en présence

de l’anticorps contre la protéine à immunoprécipiter, pendant 30 minutes à 4°C. 20 μLde billes de protéine A-sépharose sont ensuite ajoutés et les échantillons sont incubéspendant une nuit à 4°C. Après 3 lavages dans du tampon de lyse, les billes sont portées à

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Gel de séparation à 10%H2O 7,9 mL

Acrylamide 30% 6,7 mLTris-HCl 1,5 M, pH 8,8 5 mL

SDS 10% 200 μLPuis ajoutés simultanément

PSA 10% 200 μLTemed 8 μL

Gel de concentrationH2O 6,8 mL

Acrylamide 30% 1,7 mLTris-HCl 1 M, pH 6,8 1,25 mL

SDS 10% 100 μLPuis ajoutés simultanément

PSA 10% 100 μLTemed 10 μL

Table 2.1 – Préparation des gels pour migration en SDS-PAGE

ébullition dans 20 μL de tampon de Laemmli. Le surnageant est récupéré et utilisé pourl’électrophorèse.

Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) Les électrophorèses sont réa-lisées sur un gel de polyacrylamide dont la concentration dépend de la taille des protéines àséparer grâce à un appareil d’électrophorèse pour minigels (Biorad). Par exemple, un gel à 10%est préparé en mélangeant dans un tube les solutions indiquées dans le tableau 2.1. Cette prépa-ration est coulée immédiatement dans le système et 500 μL de butanol sont déposés à la surfacepour enlever les bulles et uniformiser la surface. Une fois le gel de séparation polymérisé, le gelde concentration est préparé comme indiqué dans le tableau 2.1 et coulé de la même façon, endéposant à la surface les peignes permettant de mouler les puits.

Après polymérisation les gels sont placés dans la cuve de migration du système, elle-mêmeremplie avec du tampon de migration (Tris 25 mM, Glycine 190 mM, SDS 0,1%). Les échan-tillons préparés comme décrit précédemment sont ensuite déposés dans les puits. La migrationélectrophorétique s’effectue sous une tension de 120V à voltage constant. Son évolution peutêtre suivie grâce à la migration des marqueurs de poids moléculaire colorés (BioRad), déposésdans un puits de référence. Une fois la migration terminée, le transfert est préparé selon le prin-cipe du «sandwich», les gels étant déposés contre une membrane de nitrocellulose et l’ensembleplacé entre deux éponges.

Electro-transfert sur membrane de nitrocellulose L’électro-transfert se déroule pendant1 heure à 140 V à ampérage constant (300 mA), dans du tampon de transfert réfrigéré (Tris25mM, Glycine 190mM, 20% de méthanol). L’efficacité du transfert peut être contrôlée par laprésence des marqueurs de poids moléculaire sur la membrane. Les membranes sont ensuiterincées dans un tampon salin TBS-Tween (Tris 20mM, NaCl 137mM, pH=7,6, Tween20 0,1%v/v) puis saturées dans un bain TBS-T contenant 5% de BSA pendant 2 heures.

Immunodétection et révélation Après plusieurs rinçages dans du TBS-Tween, les mem-branes sont incubées avec l’anticorps primaire dilué, pendant une nuit à 4°C. La liste des anti-corps utilisés dans cette étude est détaillée en annexe (voir Annexes - tableau 8.1). Elles sontensuite rincées plusieurs fois par du TBS-Tween puis incubées avec l’anticorps secondaire anti-IgG couplé à la peroxydase (dilution 1/10 000, v/v) pendant 1 heure. La membrane est soumiseà une dernière série de lavages avant révélation spécifique des protéines par chimioluminescence(kit ECL Plus Amersham). La lecture se fait par caméra VDS et les bandes sont quantifiées parun densitomètre en utilisant les logiciels Quantity One (BioRad) et ImageJ (NIH).

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Il est parfois nécessaire d’incuber la membrane avec un autre anticorps, par exemple pourrévéler une deuxième forme de la protéine d’intérêt ou une deuxième protéine. Dans ce cas, lesmembranes sont incubées pendant 20 minutes dans un tampon de stripping (PIERCE) puisrincées dans du TBS-Tween. Elles peuvent alors être à nouveau saturées dans du TBS-Tweencontenant 5% de BSA puis incubées avec d’autres anticorps.

2.4 Transport de glucose

La réponse à l’insuline des cellules ou des tissus peut être mesurée par leur capacité à faireentrer un analogue non métabolisable du glucose marqué radioactivement dans le cytoplasme.Pour cela, les cellules L6 sont ensemencées en plaques 12 puits à raison de 200 000 cellules parpuits et laissées pendant 24 heures en stabilisation. Les 3T3 sont ensemencées et différenciéescomme décrit précédemment. Les cellules sont ensuite rincées au PBS puis incubées dans duDMEM sans sérum pendant au moins 4 heures. Le traitement par le 4-HHE ou le 4-HNE se faitdans un volume total de 1 mL de milieu sans sérum pour la durée désirée, suivi d’un lavage par1 mL de PBS avant la stimulation par l’insuline (100 nM, 20 minutes). Dans chaque plaque,un puits est traité par de la cytochalasine B (10 μM, 20 minutes), inhibiteur du transport deglucose. Ceci permet de déterminer l’entrée non-spécifique de glucose (indépendante de l’insu-line) qui sera soustraite aux mesures effectuées dans les autres puits. Une fois le traitement etla stimulation par l’insuline effectués, 0,5 μCi/mL de [3H]-2-désoxy-D-glucose, un analogue nonmétabolisable du glucose, sont ajoutés dans chaque puits pendant 5 minutes. La réaction estarrêtée par 3 lavages successifs avec 1 mL de PBS glacé (4°C) puis les cellules sont solubiliséespar 0,4 ml de SDS 1% à température ambiante pendant 10 minutes sous agitation. Le comptagede radioactivité se fait ensuite sur 300 μL de lysat cellulaire dilué dans 5 mL de liquide scin-tillant grâce à un compteur à scintillation β (Tri-Corb, Packard). La concentration de protéinesdans les lysats est mesurée par la méthode de Bradford adaptée pour les solutions contenantdes détergents (BioRad).

2.5 Imagerie cellulaire

Immunofluorescence Les cellules L6 sont ensemencées sur des lamelles de verre (diamètre1 cm) en plaques 12 puits à raison de 10 000 cellules par cm2, puis laissées 24 heures en sta-bilisation. Elles sont ensuite traitées 30 minutes par le 4-HHE ou le 4-HNE aux concentrationsindiquées. Après lavages au PBS, les cellules sont fixées pendant 30 minutes avec du paraformal-déhyde 3% dans du PBS. Les cellules sont de nouveau lavées avec du PBS et incubées pendant5 minutes dans du NH4Cl et de nouveau lavées au PBS. La perméabilisation des cellules estréalisée en traitant pendant 10 minutes par 50 μg/mL de digitonine ou par 0,1% de TritonX100. Après lavage au PBS, les cellules sont saturées par 0,1% de BSA dans du PBS pendant30 minutes puis incubées en présence de l’anticorps primaire pendant 1 heure. Après lavageau PBS, l’anticorps secondaire a été mis en présence des cellules pendant 1 heure également.Les cellules fixées ont été montées sur une lame de verre dans du Mowiol et les images ont étéanalysées avec un microscope confocal Zeiss LSM510 équipé avec un objectif à immersion de63X (Centre Technique des Microstructures, UCBL).

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Microscopie électronique Les cellules L6 cultivées en plaques 6 puits sont traitées pendant30 minutes par 100 μM de 4-HHE ou de 4-HNE. Du glutaraldéhyde 4% est ensuite ajouté v/vau milieu de culture pendant 15 minutes puis remplacé par un mélange de cacodylate (0,2M, pH7.4) et de glutaraldéhyde 4% (v/v). Après incubation pendant 30 minutes à 4°C, les cellules sontapportées au Centre Commun d’imagerie de Laennec 1 pour analyse en microscopie électroniqueà transmission. Brièvement, les échantillons sont rincés trois fois dans une solution v/v decacodylate (0,2 M pH 7.4) et saccharose (0,4 M). Les cellules sont alors incubées 45 minutesdans un mélange v/v d’osmium 2% et de cacodylate (0,3 M pH 7.4). Après un rinçage dansl’eau stérile, les cellules sont déshydratées par passages successifs dans des solutions d’éthanol(30°, 50°, 70°C et 95°C). Les cellules sont ensuite raclées et transférées dans un tube ou ellessubissent 3 bains de 15 minutes dans de l’éthanol 100°. Elles sont ensuite coupées au microtomeet analysées.

2.6 Dosage du Glutathion

Le glutathion est le principal thiol de faible poids moléculaire intracellulaire et il joue unrôle essentiel dans la défense contre le stress oxydant dans les tissus et cellules. Son dosageest réalisé à l’aide du kit Biovision « Glutathione assay kit » dont le principe est basé sur laréaction de l’o-phthalaldehyde (OPA) avec le glutathion réduit (GSH). Cette réaction produitde la fluorescence, ce qui permet de quantifier le GSH précisément. L’ajout d’un agent réducteurconvertit le glutathion oxydé (GSSG) en GSH et permet de déterminer la quantité de glutathiontotal (GSH + GSSG). Les cellules L6 sont ensemencées puis traitées dans des plaques 6 puits.Le glutathion est extrait comme décrit dans le kit et les échantillons sont congelés à -80°Cen attendant la mesure. Le dosage s’effectue en plaque 96 puits, les échantillons sont préparésuniquement pour la détection du glutathion réduit (GSH) et comparés à une gamme de GSH. Ledosage fluorimétrique est réalisé ensuite à l’aide d’un lecteur de plaque à fluorescence («Xenius»Safas, DTAMB) avec une longueur d’onde d’excitation Ex= 340 nm et une longueur d’onded’émission Em= 420 nm.

2.7 Production d’espèces radicalaires de l’oxygène

Les cellules sont cultivées dans des plaques 6 puits jusqu’à confluence puis stabilisées dansdu tampon Krebs-Ringer pendant 30 minutes afin d’éliminer le sérum et le rouge phénol. Lescellules sont pré-traitées 30 minutes avec 10 μM final de sonde H2-DCFDA, dissoute dans duDMSO. Après un rinçage dans du PBS, les cellules sont incubées en présence de 4-HHE ou de4-HNE dans du tampon Krebs. Un contrôle positif est réalisé à l’aide de peroxyde d’hydrogène(100 μM final). Après traitement, les cellules sont lysées dans 2 ml d’eau MiliQ et conservéesà 4°C dans l’obscurité. La production de ROS est mesurée par un spectrofluorimètre avecdes spectres excitation/émission à 492-495 / 517-529 nm respectivement. Les résultats sontnormalisés par la concentration de protéines déterminée par un dosage de Bradford.

1. Cecil, http ://ifr62.univ-lyon1.fr/plateaux.php ?id=4

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2.8 Carbonylation des protéines

Les acides nucléiques peuvent interférer avec le dosage. C’est pourquoi le ratio des absor-bances à 280 nm et 260 nm des échantillons doit être inférieur à 1. Dans le cas contraire, de lastreptomycine sulfate (1% final) est ajoutée pour précipiter les acides nucléiques. La méthodede dosage est basée sur celle de Levine et.al [110]. Les échantillons de protéines extraits à partirde cellules ou de tissus sont traités avec une solution à 10 mM de 2,4-dinitrophenylhyrazine(2,4-DNPH) dans 2,5 M de HCl. Après incubation, les protéines sont précipitées avec de l’acidetrichloracétique (20%, TCA), et rincées deux fois dans du TCA à 10%. Le 2,4-DNPH n’ayantpas réagit est éliminé par 3 lavages successifs du culot dans un mélange éthanol/éthyle acétate(1 :1 v/v). Les protéines sont ensuite resuspendues dans une solution de guanidine hydrochlo-ride (6M) et le contenu en carbonyle est déterminé par l’absorbance à 370 nm, mesurée parun lecteur de plaques. Pour cette longueur d’onde, le coefficient d’absorption molaire des pro-téines carbonylées est de 22 000 M-1.cm-1. Le contenu en carbonyles est ensuite normalisé parla concentration finale de protéines mesurée au spectrophotomètre par l’absorbance à 280 nm.

2.9 Analyse de l’insuline en spectrométrie de masse

Une solution d’insuline (1 mg/mL) est incubée en présence de 5 mM 4-HHE ou de 4-HNE à37°C pendant une nuit. Les échantillons sont ensuite apportés à la plateforme de microanalysedes protéines de l’Institut de Biologie et de Chimie des Protéines (IBCP) pour analyse enspectrométrie de masse avant et après digestion par la tryspine.

2.10 Test de tolérance à l’insuline (ITT)

Le test de tolérance à l’insuline permet de déterminer in vivo l’efficacité de l’insuline enmesurant la diminution de la glycémie induite par une injection unique de l’hormone. Dessouris CD1 (Charles River, France) à jeûn depuis la veille sont réparties aléatoirement dansles groupes et reçoivent une injection intrapéritonéale d’insuline (0,5 UI/kg). La glycémie estmesurée à l’aide d’un glucomètre (Accu Chek performa, Roche) après un prélevement de sangpar la veine caudale. Ces relevés sont effectués avant l’injection (t0) puis aux temps 20, 40, 60et 120 minutes.

2.11 Clamp hyperinsulinémique euglycémique

La technique du clamp hyperinsulinémique euglycémique permet l’estimation de l’efficacitéde l’insuline. Une perfusion intraveineuse continue d’insuline exogène permet d’augmenter laconcentration plasmatique à un nouvel état stable hyperinsulinémique, tandis que du glucoseexogène est infusé de façon à maintenir une euglycémie. L’hyperinsulinémie inhibant la produc-tion hépatique de glucose, la quantité de glucose perfusée est une mesure directe de la captationde glucose par les tissus périphériques, principalement le muscle squelettique et le tissu adipeux.

Au terme d’un jeûne de 12 heures, des rats Wistar de 450-500g (Harlan, Gannat, France),sont anesthésiés à l’aide de pentobarbital sodique (35 mg/kg ip, Ceva Santé Animale) et dechlorpromazine (5 mg/kg IP, Largactil, Sanofi Aventis). La trachée est exposée et un cathétertrachéal PE-240 (OD/ID : 2,41 mm/1,68 mm) est mis en place afin de faciliter la respiration

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du rat. Des cathéters (PE-10, Phymep) sont placés dans les veines jugulaires droite et gauchepour la perfusion de glucose et d’insuline et dans une artère carotide pour les prélèvementssanguins. Les animaux sont héparinés (5 mg/kg.h) par injection intraveineuse lente d’héparinesodique (Héparine Choay, 25.000 UI /5 ml. Trente minutes avant le début du clamp, les animauxreçoivent une injection de 4-HHE (10 mg/kg dilué dans 0,1 mL de DMSO) ou 0,1 mL de DMSOseul (contrôle) dans la veine jugulaire gauche.

L’hyperinsulinémie est imposée en perfusant en continu une solution d’insuline à l’aide d’unpousse seringue (6 mU/kg.min, Insuline Actrapid, Novo Nordisk). La glycémie est maintenue enajustant le débit de perfusion de glucose (25% v/v). Un prélèvement sanguin (10 μL) est réalisétoutes les 5 minutes à l’aide du cathéter carotidien et la glycémie est mesurée immédiatementà l’aide d’un glucomètre (Accu Chek performa, Roche). Le débit de perfusion de glucose estajusté en fonction de la valeur de la glycémie afin de la maintenir à une valeur proche de100 mg/dL. La première heure de clamp permet de stabiliser l’insulinémie et la glycémie. Ledébit de perfusion de glucose nécessaire pour maintenir l’euglycémie (Glucose Infusion Rate =GIR) est mesuré sur la deuxième heure de clamp. L’insulinémie est mesurée en début et en finde clamp (t=120 min) par dosage radioimmunologique (EIA insulin assay, SpiBio). Les résultatssont exprimés sous forme de quantité de glucose perfusé (GIR) pendant la deuxième heure duclamp (GIR, en mg/kg.min).

2.12 Calcul des descripteurs moléculaires

Tous les paramètres physico-chimiques et les descripteurs moléculaires 2D ont été calculésà partir de l’application Web PreADMET (http ://preadmet.bmdrc.org) et classés en quatrecatégories.

1. Descripteurs constitutionnels : Tous les descripteurs dans cette catégorie sont basés surle nombre d’atomes et de groupes chimiques de la molécule. Ils décrivent le nombre dedouble-liaisons C=C et C=O, le nombre de carbones et d’atomes d’oxygène, les groupesOH et le poids moléculaire.

2. Descripteurs physico-chimiques : le LogP, défini comme la coefficient de partition octanol-eau, est une mesure de l’hydrophobicité moléculaire. Le LUMO se réfère à la plus basseorbitale moléculaire inoccupée, selon la théorie orbitale frontière et est utilisé pour quan-tifier la réactivité électrophile. La polarisabilité caractérise la capacité de la distributionde la charge atomique à se déformer sous l’effet d’un champ électromagnétique.

3. Descripteurs géométriques : la surface hydrophobe est définie comme la surface hydro-phobe totale divisée par la superficie totale accessible au solvant de la molécule, calculéepour les groupements saturés et insaturés. La surface polaire et la surface de liaison Hsont des calculs de surface topologique polaire.

4. Descripteurs électrostatiques : la surface partielle négative (PNSA3) et la zone de surfacepartielle positive (PPSA3) sont définis comme la somme de la surface accessible au solvantde tous les atomes chargés négativement et positivement respectivement. La surface pondé-rée à la surface des charges partielles (WNSA3), est définie comme (PNSA3*TMSA/1000)où TMSA est la surface moléculaire totale. La différence de charge atomique pondérée àla surface DPSA3) est définie comme (PPSA3-PNSA3).

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2.13 Statistiques

Les données sont analysées à l’aide des logiciels StatView (Abacus COncept, Berkeley) etPrism (GraphPad, La Jolla). Les types de test utilisés sont : ANOVA, dans le cas de compa-raisons multiples et test T de Student pour des comparaisons entre deux échantillons avec unecorrection de Welsh lorsque les variances ne sont pas égales. Une régression ou un modèle non li-néaire sont utilisés pour l’analyse des doses réponses. Dans tous les cas, le seuil de significativitéchoisi est de 5%.

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Chapitre 3

4-HHE et 4-HNE in vivo au coursdu diabète

Le diabète et l’hyperglycémie sont associés à un stress oxydant important et donc cer-tainement à une peroxydation lipidique importante. En conséquence, nous avons mesuré lesconcentrations de 4-HNE et de 4-HHE dans le plasma de patients diabétiques de type 2 et dansle plasma de rats rendus diabétiques par la streptozotocine, modèle animal de diabète de type 1.

3.1 Concentrations chez le diabétique de type 2

Caractéristiques Nondiabétiques

Diabétiques detype 2 p

Age (ans) 50,3 ± 7,0 62,3 ± 2,5 0,157Taille (m) 1,78 ± 0,03 1,79 ± 0,03 0,936Poids (kg) 76,5 ± 5,30 102,0 ± 10,8 0,079IMC (kg/m2) 23,99 ± 0,99 31,72 ± 2,35 0,023*Durée de la maladie (ans) - 5,0 ± 2,3 -Glycémie à jeûn (mM) 5,49 ± 0,17 9,050 ± 1,61 0,042*HbA1c (%) 5,3 ± 0,71 11,33 ± 1,54 0,008*Pression artérielle systolique (mmHg) 121,7 ± 6,0 136,5 ± 9,6 0,286Pression artérielle diastolique (mmHg) 71,7 ± 6,0 80,3 ± 4,3 0,283Cholestérol total (mM) 6,53 ± 1,03 4,39 ± 0,97 0,205HDL cholestérol (mM) 1,10 ± 0,19 0,83 ± 0,11 0,275Triglycérides (mM) 1,11 ± 0,19 2,64 ± 0,34 0,008*

Table 3.1 – Caractéristiques des sujets témoins et diabétiques. Les résultats sont desmoyennes ± SE, la significativité a été déterminée à l’aide d’un test t de Student aveccorrection de Welsh si nécessaire, *P<0.05

Les sujets sélectionnés pour l’étude sont appariés pour l’âge et l’index de masse corporelle(IMC) et leurs caractéristiques sont présentées dans le tableau 3.1. Ces sujets ne présentent pasde différence significative sur l’âge, la taille, le poids, la pression artérielle et le cholesterol. Enrevanche, les patients diabétiques ont un IMC et une triglycéridémie plus importants. Ils pré-sentent également une glycémie à jeûn et une hémoglobine glyquée augmentée, comparativementaux volontaires sains.

60

CHAPITRE 3. 4-HHE ET 4-HNE IN VIVO

Chez les sujets non diabétiques, les concentrations plasmatiques de 4-HHE et de 4-HNE sontrespectivement de 20,8 et 47,1 nM (fig. 3.1 A). Chez les sujets diabétiques, la concentration de4-HHE moyenne est de 37,3 nM, soit 80% plus importante que chez les sujets contrôles. Laconcentration de 4-HNE n’est cependant pas modifiée. Il n’existe pas de différence significativeentre les concentrations en acides gras polyinsaturés des contrôles et des diabétiques, ce quinous a permis de normaliser la concentration plasmatique d’hydroxy-alkénal par la concen-tration d’AGPI correspondante pour chaque patient (fig. 3.1 B). Ainsi, le ratio 4-HHE/n-3est significativement augmenté chez les patients diabétiques, mais le ratio 4-HNE/n-6 n’estpas modifié. De plus, la concentration de 4-HHE est corrélée à celle des AGPI de la série n-3(fig. 3.1 C), mais ceci ne se vérifie pas pour les AGPI de la série n-6 et le 4-HNE (fig. 3.1 D).Ceci montre que la différence de concentration de 4-HHE et de 4-HNE n’est pas simplementdue à une différence du contenu plasmatique en acides gras des séries n-3 et n-6.

A Contrôles Diabétiques

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B Contrôles Diabétiques

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cent r2 = 0,26

P value = 0,19

AGPI n-3 (μM) AGPI n-6 (μM)

Figure 3.1 – Dosage du 4-HHE et du 4-HNE plasmatiques chez les sujets diabétiques detype 2. Les plasmas de patients diabétiques ont été prélevés et analysés par GC-MS. Le4-HHE, le 4-HNE et les acides gras polyinsaturés des séries n-3 et n-6 ont été dosés parGC-MSMS. Les résultats sont exprimés en moyenne ±SEM, n=4 dans chaque groupe,*p<0,05, **p<0,01, ns : non significatif

3.2 Concentrations chez le rat diabétique

L’hyperglycémie chronique est également responsable d’un stress oxydant important. Pourconfirmer les résultats obtenus chez l’homme diabétique, nous avons dosé le 4-HHE et le 4-HNEdans le plasma de rats atteints d’un diabète de type 1 induit par la streptozotocine. Chez les ratscontrôles non diabétiques, la concentration de 4-HHE libre dans le plasma est de 6,6 nM et celle

61


80

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Glycémie (mM) Glycémie (mM)

Figure 3.2 – Dosage du 4-HHE et des carbonyles plasmatiques chez le rat diabétique.Le diabète a été induit par une injection intrapéritonéale unique de streptozotocine(45 mg/kg). Après une semaine de récupération, le sang a été prélevé par la veinecave et les concentrations en 4-HHE et en 4-HNE ont été dosées par GC-MSMS. Lescarbonyles ont été mesurés comme décrit précédemment par la méthode de marquageau DNPH. Les résultats sont exprimés en moyenne ±SEM, n=4 dans chaque groupe

de 4-HNE de 57,5 nM. Chez les animaux diabétiques, la concentration de 4-HHE est deux foisplus importante que chez les rats contrôles, atteignant 13,0 nM (fig. 3.2 A). La concentrationde 4-HNE, quant à elle, n’augmente pas significativement.

Le dosage des carbonyles dans le plasma de ces animaux confirme ce résultat. La quantitéde carbonyles dans le plasma des animaux diabétiques est 60% plus élevée que chez les animauxcontrôles et est positivement correlée avec les concentrations de 4-HHE et de 4-HNE (fig. 3.2 B).Par ailleurs, une autre corrélation positive existe entre la concentration de 4-HHE et la glycémieà jeûn des animaux (fig. 3.2 C). Concernant le 4-HNE, cette corrélation avec la glycémie n’estpas significative (fig. 3.2 D).

3.3 Insulino-résistance in vivoPour démontrer le rôle causal des hydroxy-alkénals dans l’insulino-résistance in vivo, du

4-HHE (10 mg/kg) a été injecté par voie intraveineuse à des rats et leur sensibilité à l’insulinea été déterminée à l’aide d’un clamp hyperinsulinémique euglycémique. La glycémie a été sta-bilisée à environ 100 mg/dL (fig. 3.3 A,B) et la perfusion de glucose nécessaire pour maintenirl’euglycémie (GIR) a été mesurée sur la deuxième heure de clamp (fig. 3.3 C). Le GIR étaitsignificativement réduit chez les animaux traités au 4-HHE, indiquant une insulino-résistance

62


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Temps, minp ,

Figure 3.3 – Mesure de la sensibilité à l’insuline lors d’un clamp hyperinsulinémiqueeuglycémique. Après injection de 4-HHE (10 mg/kg) par la veine jugulaire, le clamp aété réalisé comme décrit dans le chapitre matériels et méthodes. Les GIR (glucose infusionrate) ont été mesurés sur la deuxième heure de clamp. Les résultats sont exprimés enmoyenne ±SEM, n=4 dans chaque groupe, *p<0.05

importante dans l’ensemble de l’organisme (fig. 3.3 D).

3.4 Conclusion

Ces résultats mettent en exergue une élévation spécifique du 4-HHE par rapport au 4-HNE chez les patients DNID et chez des rats DID. En effet, chez les volontaires sains, unemolécule d’acide gras oméga-3 sur 20.000 est oxydée sous la forme de 4-HHE alors qu’unemolécule d’acides gras oméga-6 sur 80.000 est oxydée sous la forme de 4-HNE. Parallèlement,un doublement de la concentration de 4-HHE a été observé dans le plasma des sujets diabétiquesde type 2, alors qu’aucune différence n’a été notée pour le 4-HNE.

Nous démontrons ainsi pour la première fois que l’accumulation de 4-HHE est accrue au coursdu diabète de type 2 chez l’homme et au cours du diabète de type 1 sans contrôle glycémiquechez le rat. De plus, la simple injection de 4-HHE à des animaux sains induit une diminutiondrastique de leur sensibilité à l’insuline, comme nous l’avons démontré par la méthode de ré-férence qu’est le clamp hyperinsulinémique euglycémique. Il existe donc un rôle potentiel desdérivés de peroxydation lipidique, particulièrement du 4-HHE, dans le développement et/oul’entretien de l’insulino-résistance.

63

Chapitre 4

Stress oxydant, carbonylation ettoxicité cellulaire induits par le4-HHE et le 4-HNE

Les hydroxy-alkénals sont des molécules très réactives capables de former des adduits cova-lents avec de nombreuses biomolécules. Cette formation d’adduits aboutit à une perturbationdes fonctions biologiques et est majoritairement responsable des effets délétères des hydroxy-alkénals. Nous avons testé dans notre modèle de cellules L6 en culture, les effets d’un traitementpar le 4-HHE et le 4-HNE sur la viabilité cellulaire et sur l’induction d’un stress carbonyle.

4.1 Viabilité et mortalité cellulaire

La fixation sur les protéines, acides nucléiques ou lipides de nombreuses molécules de 4-HHE ou de 4-HNE est délétère pour les cellules. Nous avons donc mesuré dans les myoblastesL6 différents paramètres révélateurs d’une mortalité cellulaire (table 4.1). La métabolisation duMTT est un signe de la capacité métabolique des cellules et donc de leur viabilité. Lors de lanécrose ou lors d’un défaut de perméabilité membranaire, la lactate déshydrogénase (LDH) estlibérée dans le milieu extracellulaire. Le dosage de l’activité LDH dans le milieu de culture estdonc un reflet de la perte d’intégrité membranaire (nécrose). Enfin, la caspase 3 est une enzymespécifiquement impliquée dans les mécanismes de l’apoptose, son activation traduit donc unemort cellulaire programmée.

Pour un traitement de 30 minutes avec des concentrations de 4-HHE jusqu’à 100 μM, laviabilité cellulaire mesurée par le MTT, la nécrose (activité LDH extracellulaire) et l’apoptose(activité caspase 3) ne sont pas affectées (table 4.1). Le 4-HNE ne modifie pas la viabilitécellulaire (MTT) mais il est responsable d’une légère augmentation des activités LDH et caspase3, qui reste cependant non-significative. Ces résultats indiquent que dans nos conditions (30minutes, 100 μM), les hydroxy-alkénals n’induisent pas de mort cellulaire. L’étude de viabilitédes adipocytes 3T3-L1 en réponse au 4-HHE et au 4-HNE dans les mêmes conditions (table 4.2)confirme ces résultats : la métabolisation du MTT n’est pas altérée par les hydroxy-alkénals. Enrevanche, la perméabilité membranaire augmente significativement (30% pour 100 μM), commele montre l’activité LDH extracellulaire, mais reste à des niveaux très faibles comparativementà ce qui peut être observé dans d’autres conditions de stress.

64

CHAPITRE 4. STRESS OXYDANT, CARBONYLATION ET TOXICITÉ

4-HHE (30min, μM) 10 25 50 75 100Viabilité (% du contrôle) 108 ± 2 101 ± 3 107 ± 4 120 ± 5* 125 ± 1*Activité LDH (% du contrôle) 93 ± 3 98 ± 6 99 ± 3 104 ± 4 105 ± 5Activité caspase 3 (% du contrôle) 116 ± 2 117 ± 6 116 ± 12 119 ± 14 121 ± 12

4-HNE (30min, μM) 10 25 50 75 100Viabilité (% du contrôle) 105 ± 5 105 ± 3 108 ± 5 109 ± 3 106 ± 2Activité LDH (% du contrôle) 113 ± 9 112 ± 5 115 ± 8 111 ± 7 121 ± 6Activité caspase 3 (% du contrôle) 115 ± 16 122 ± 15 116 ± 13 119 ± 19 140 ± 20

Table 4.1 – Viabilité des myoblastes L6 après 30 minutes. La viabilité est mesurée par la métabo-lisation du MTT, la mortalité par l’activité lactate déshydrogénase dans le milieu extracellulaireet l’apoptose par l’activité caspase 3. n=4 pour chaque expérience, *P<0,05

En résumé, ces tests de viabilité nous montrent qu’après un traitement de 30 minutes parle 4-HHE ou le 4-HNE, de 10 à 100 μM, la métabolisation du MTT, l’activité LDH et l’activitécaspase 3 ne sont pas modifiées. Il n’y a donc dans ces conditions, ni perturbation de la viabilité,ni modification de la perméabilité membranaire, ni activation des voies de l’apoptose dansles myoblastes L6. Dans les adipocytes 3T3-L1, il n’y a pas de modification de la viabilitécellulaire mais l’integrité membranaire est cependant légèrement altérée. Dans ces conditions,des modifications du transport de glucose ou des voies de signalisation cellulaire ne résultentdonc pas de phénomènes de mortalité cellulaire.

4-HHE (30min, μM) 10 25 50 75 100Viabilité (% du contrôle) 95 ± 6 84 ± 8 81 ± 10 99 ± 7 102 ± 8Activité LDH (% du contrôle) 114 ± 8 127 ± 1* 131 ± 3* 133 ± 1* 134 ± 2*

4-HNE (30min, μM) 10 25 50 75 100Viabilité (% du contrôle) 83 ± 8 102 ± 3 96 ± 9 114 ± 4 103 ± 4Activité LDH (% du contrôle) 103 ± 3 113 ± 6 117 ± 7* 125 ± 8* 132 ± 5*

Table 4.2 – Viabilité des adipocytes 3T3-L1 après 30 minutes. La viabilité est mesuréepar la métabolisation du MTT et la mortalité par l’activité lactate déshydrogénase dans lemilieu. n=4 pour chaque expérience, *P<0,05

4.2 Carbonylation des protéines cellulaires

Pour mettre en évidence la carbonylation des protéines cellulaires, reflet de la formationd’adduits du 4-HHE et du 4-HNE, nous avons utilisé une méthode biochimique basée sur laréaction du DNPH avec les groupements carbonyles (cf. chapitre 2, matériel et méthodes).Lorsque les myoblastes sont incubés en présence de doses croissantes de 4-HHE (fig.4.1 A) oude 4-HNE (fig.4.1 B), la concentration de protéines carbonylées augmente. Pour 100 μM, il y aainsi 3 fois plus de carbonyles dans les cellules par rapport à la situation contrôle. De plus, lacarbonylation des protéines pour 10 μM de 4-HHE est plus importante que celle obtenue pourla même concentration de 4-HNE (respectivement 75 et 60 nmol/mg de protéines).

Pour confirmer la présence d’adduits sur les protéines, une analyse en dot blot a été réaliséedans les mêmes conditions. Les adduits du 4-HHE ont été mesurés à l’aide d’un anticorps

65


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Figure 4.1 – Carbonylation des protéines par 4-HHE et 4-HNE. Après 30 minutes detraitement par le 4-HHE (A) et le 4-HNE (B), les carbonyles sont détectés par réactionavec le DNPH et les adduits sur les protéines par dot blotting à l’aide d’anticorpsspécifiques du 4-HHE (C) et du 4-HNE (D) ou par Western Blotting (E). Les résultatssont exprimés en moyenne ± Sd, n=3, ***p<0,001

spécifique des adduits de Michael sur Histidine. Les adduits du 4-HNE ont été mesurés dansles mêmes conditions à l’aide d’un anticorps détectant les adduits de Michael sur tous lesrésidus acides aminés. Après 30 minutes de traitement, la formation d’adduits de Michael estpositivement correlée à la concentration d’aldéhydes mise en présence des cellules. Ainsi, pourune concentration de 100 μM, la quantité d’adduits augmente de 280% pour le 4-HHE (fig.4.1C) et de 300% pour le 4-HNE (fig.4.1 D). Par western blot (fig.4.1 E), il est possible de montrerque le 4-HHE et le 4-HNE forment des adduits sur des protéines de toutes tailles, de 30 à 150 kD.

Pour mettre en évidence la localisation cellulaire des adduits, nous avons analysé par immu-nofluorescence leur formation dans les myoblastes L6. Les cellules ont été traitées avec des dosescroissantes de 4-HHE (fig. 4.2 A) ou de 4-HNE (fig. 4.2 B) et les adduits ont été détectés à l’aided’anticorps spécifiques. Après analyse en microscopie confocale, la fluorescence a été quantifiéeà l’aide du logiciel ImageJ (fig. 4.1 C,D). Par cette méthode, nous avons montré que que le 4-HHE et le 4-HNE forment des adduits de Michael dans les cellules de façon dose-dépendante. Laformation d’adduits est limitée au cytoplasme des cellules, et nous n’avons pas été capables demettre en évidence de colocalisation particulière avec d’autres éléments cellulaires. Nous avonsainsi testé sans succès la colocalisation avec le réseau d’actine en utilisant la phalloïdine et avecl’appareil de Golgi en utilisant un anticorps anti-GM130 (fig. 4.3).

66


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Figure 4.2 – 4-HHE et 4-HNE forment des Adduits de Michael dans les cellules L6en culture. Les adduits sont détectés par immunofluorescence à l’aide d’anticorpsspécifiques après 30 minutes de traitement par le 4-HHE (A) et le 4-HNE (B). Lafluorescence est quantifiée sur au moins 5 champs différents pour le 4-HHE (C) etle 4-HNE (D), les photos présentées sont représentatives de ces champs. Moyenne± Sd, n=3, ***p<0,01.

4.3 Production d’espèces radicalaires de l’oxygène

Le 4-HHE et le 4-HNE sont issus de la peroxydation des lipides par des espèces radicalaires,et sont donc des produits secondaires du stress oxydant. Cependant, nous avons pu montrerqu’un traitement des cellules L6, pendant 30 minutes avec les hydroxy-alkénals, induit uneproduction intracellulaire significative de ROS (fig. 4.4). Le traitement des cellules par 50 μMde 4-HHE ou de 4-HNE entraine ainsi une augmentation de 150% et 130% respectivement.Par comparaison, le traitement des cellules par 100 μM de peroxyde d’hydrogène induit uneaugmentation comparable de 200%.

La formation d’adduits covalents sur les biomolécules cellulaires est certainement responsablede la majorité des effets toxiques des hydroxy-alkénals. Cependant, ces résultats démontrentqu’ils sont aussi capables d’induire un stress oxydant par la production d’espèces radicalaires.Ceci pourrait jouer un rôle important dans l’entretien et dans l’amplification des effets délétèresdu stress oxydant.

67


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Figure 4.3 – Colocalisation des Adduits du 4-HNE avec le réseau d’actine (A) et l’appa-reil de Golgi (B). Les adduits et le GM130 sont détectés par immunofluorescence à l’aided’anticorps spécifiques, l’actine est détectée par la phalloïdine. Les cellules marquées sontanalysées au microscope confocal.

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Figure 4.4 – Production d’espèces radicalaires de l’oxygène(ROS) par le 4-HHE et le 4-HNE. Après 30 minutes de traite-ment par 50 μM de 4-HHE ou de 4-HNE, la production de ROSa été mesurée à l’aide du DCFDA (cf. chapitre 2, matériel et mé-thodes). Un contrôle positif a été réalisé en incubant les cellulesavec 100 μM de peroxyde d’hydrogène pendant 30 minutes. Lesrésultats sont des moyennes ± SEM, n=4, *p<0,05, **p<0,01.

68


4.4 Ultrastructure cellulaire

Comme nous l’avons montré précédement, après 30 minutes de traitement par les hydroxy-alkénals, la viabilité et la mortalité des cellules L6 ne sont pas affectées. Toutefois, il existeune augmentation importante de la formation d’adduits covalents, notamment sur les protéines,laissant supposer une forte perturbation du fonctionnement cellulaire. Nous avons donc analysé,par microscopie électronique à transmission, la structure des cellules après une exposition de 30minutes à 100 μM de 4-HHE ou de 4-HNE (fig. 4.5).

Réticulumendoplasmique

Accumulationde ribosomes

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Figure 4.5 – Structure des myoblates L6 en microscopie électronique. Après un traitement par100 μM de 4-HHE ou de 4-HNE pendant 30 minutes, les cellules ont été fixées puis analyséesen microscopie électronique à transmission. Les photos sont représentatives des modificationsobservées sur les cellules après le traitement

De façon générale, les cellules subissent des modifications structurales majeures après uneexposition aux hydroxy-alkénals. Nous avons pu mettre en évidence une dilatation du réticu-lum endoplasmique granuleux (REG) associée à une formation accrue d’amas de ribosomes nonassociés au réticulum. Parallèlement, il y a dans le cytoplasme une accumulation d’endosomes,de lysosomes et de nombreuses structures multilamellaires. L’ensemble de ces perturbations res-

69


semble fortement à la mise en places de phénomènes d’autophagie, nécessitant un remaniementcomplet de la machinerie cellulaire, particulièrement les organites responsables de la productionet de la dégradation des protéines (REG, lysosomes).

De plus, nous avons pu observer après un traitement par le 4-HHE et le 4-HNE la présencede cellules en apoptose et/ou en nécrose. Ces cellules restent peu nombreuses par rapport aunombre total de cellules, ce qui explique sans doute l’absence de détection par les tests MTT,LDH et caspase-3 décrits précédemment.

4.5 Conclusion

4-HHE et 4-HNE, appliqués pendant 30 minutes à des concentrations de 10 à 100 μM sur desmyoblastes L6 ou des adipocytes 3T3-L1 ne modifient pas la viabilité cellulaire. Ils n’induisentpas non plus de perturbations de l’intégrité membranaire, ni d’activation détectable de l’apotose.Cependant, ce traitement induit une modification importante des organites intracellulaires,notamment une augmentation des lysosomes et des endosomes et une dilatation du réticulumendoplasmique. Ainsi, un traitement par le 4-HHE et le 4-HNE entraîne des perturbationsfonctionnelles importantes dans les cellules.

Dans ces conditions, les hydroxy-alkénals induisent un stress carbonyle important, révélépar la présence de nombreux adduits, notamment sur les protéines cellulaires. Par immunofluo-rescence, nous avons pu observer que ces adduits n’ont pas de cible privilégiée dans les celluleset se forment de façon diffuse sur tous les éléments du cytoplasme, le noyau étant relativementépargné. Ce stress carbonyle est parallèlement associé à une augmentation de la production deradicaux libres, pouvant contribuer ou amplifier les perturbations décrites précédemment.

70

Chapitre 5

Insulino-résistance musculaire etadipeuse in vitro induite par lesproduits de peroxydation 4-HHE et4-HNE

5.1 Transport de glucose induit par l’insulineLe transport de glucose en réponse à une stimulation par l’insuline passe par la translocation

du transporteur de glucose GLUT4, depuis des vésicules intracytoplasmiques vers la membraneplasmique. Lorsque la signalisation insuline est perturbée, le transport de glucose via GLUT4est diminué. La capacité des cellules à faire passer le glucose du milieu extracellulaire vers lecytoplasme est donc un reflet de l’activité biologique de l’insuline à ce niveau.

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4-HHE4-HNE

Temps (heures)20 431

Figure 5.1 – 4-HHE et 4-HNE augmentent le transport basal de glu-cose dans les myoblastes L6. Les myoblastes sont incubés en présencede 10 μM de 4-HHE ou de 50 μM de 4-HNE pour une durée de 0,5à 4 heures. La capture de glucose est mesurée par l’incorporation de[3H]-2-désoxy-glucose. n=4 pour chaque expérience, *p<0,05

71

CHAPITRE 5. INSULINO-RÉSISTANCE IN VITRO

En l’absence d’insuline, le 4-HHE et le 4-HNE appliqués pendant 30 minutes ne modifientpas le transport basal de glucose. A partir de 2 heures, il existe une augmentation significativedu transport de glucose basal induit par le 4-HHE et le 4-HNE. Cet effet est encore plus marquéaprès 4 heures de traitement (fig.5.1). Ceci est en accord avec de précédents résultats obtenus parl’équipe de A. Rudich, montrant qu’un stress oxydant peut augmenter le transport de glucosedans les cellules L6 [98].

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Temps d’exposition au 4-HNE (heures)

0 0.5 2 4

Figure 5.2 – 4-HHE et 4-HNE inhibent le transport du glucose induit par l’insuline dans lesmyoblastes L6. A, B : Les myoblastes sont incubés en présence de doses croissantes de 4-HHEou de 4-HNE pendant 30 minutes. C,D : Les myoblastes sont incubés en présence de 10 μMde 4-HHE ou de 50 μM de 4-HNE pour une durée de 0,5 à 4 heures. La capture de glucoseest mesurée par l’incorporation de [3H]-2-désoxy-glucose. n=4 pour chaque expérience, deslettres différentes indiquent une différence significative (p<0,05)

Dans les myoblastes L6, en conditions contrôles, une stimulation par l’insuline déclencheune augmentation du transport de glucose d’environ 70% (fig. 5.2). Un traitement des cellulespendant 30 minutes par le 4-HHE ou le 4-HNE inhibe le transport de glucose induit par l’insuline.L’effet maximal est obtenu pour 10 μM de 4-HHE (fig. 5.2 A) et 50 μM de 4-HNE (fig. 5.2 B). Lacinétique d’inhibition de la capture de glucose par les hydroxy-alkénals est très rapide. L’effetmaximal est obtenu dès 30 minutes de traitement et reste stable pendant 4 heures, ceci avec10 μM de 4-HHE (fig. 5.2 C) ou 50 μM de 4-HNE (fig. 5.2 D).

Pour confirmer ces résultats, nous nous sommes interessés à l’effet que peuvent avoir les

72


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Concentration de 4-HNE (μM) Exposition au 4-HNE (heures)

Figure 5.3 – 4-HHE et 4-HNE inhibent le transport de glucose induit par l’insuline dans lesadipocytes 3T3. A,C : Les adipocytes sont incubés en présence de concentrations croissantesde 4-HHE ou de 4-HNE pendant 30 minutes. B,D : Les adipocytes sont incubés en présencede 50μM de 4-HHE ou de 4-HNE pendant les durées indiquées. La capture de glucoseest mesurée par l’incorporation de [3H]-2-désoxy-glucose. n=4 pour chaque expérience, deslettres différentes indiquent une différence significative (p<0,05)

hydroxy-alkénals sur un autre tissu fortement impliqué dans l’insulino-résistance : le tissu adi-peux. Pour cela, nous avons testé dans les mêmes conditions, le transport de glucose induit parl’insuline dans des adipocytes 3T3-L1 (fig. 5.3). Dans ces cellules, une stimulation par l’insuline(100 nM, 20 minutes) induit une augmentation d’environ 250% du transport de glucose. Commedans les myoblastes L6, le 4-HHE et le 4-HNE provoquent dans les adipocytes 3T3-L1 une inhi-bition du transport de glucose induit par l’insuline. L’effet maximal est obtenu pour 50 μM de4-HHE (fig. 5.3 A) ou de 4-HNE (fig. 5.3 B). L’inhibition induite par les hydroxy-alkénals n’estcependant pas totale : elle décroît d’environ 50% la capture de glucose. La cinétique d’actiondu 4-HHE et du 4-HNE (fig. 5.3 C,D) est rapide, significative dès 30 minutes et maximale à 4heures.

Ces résultats, à la fois sur myoblastes L6 et adipocytes 3T3, montrent que les hydroxy-alkénals 4-HHE et 4-HNE, à des concentrations non cytotoxiques, sont capables d’inhiber letransport de glucose induit par l’insuline. Pour analyser plus en détails les mécanismes cellulairesà l’origine de cette insulino-résistance, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation

73


intracellulaires de l’insuline en réponse au 4-HHE et au 4-HNE.

5.2 Voies de signalisation de l’insuline

La protéine kinase B (PKB/Akt) est indispensable aux dernières étapes de transduction dusignal insuline, notamment à la translocation des vésicules contenant le transporteur de glucoseGLUT4 vers la membrane plasmique. Cette kinase est activée par phosphorylation sur certainsrésidus particuliers, parmi lesquels la sérine 473. Dans les myoblastes L6, cette phosphorylationsur sérine est activée de façon dose-dépendante par l’insuline (fig. 5.4 A). Ainsi, pour unestimulation de 20 minutes avec 100 nM d’insuline, le rapport Phospho-Akt/Total augmente de500%.

Sur les myoblastes L6, l’insuline augmente de façon dose-dépendante la phosphorylation dela protéine kinase B (fig. 5.4 A). La dose efficace 50 calculée à partir de la figure 5.4A est de60 nM sur les myoblastes L6 et l’effet maximal est obtenu pour environ 100 nM, dose que nousutilisons pour toutes nos expériences. Le 4-HHE (10 μM) et le 4-HNE (50 μM) n’ont aucuneffet sur la phosphorylation basale de PKB/Akt, ni sur la quantité totale de protéine présente(fig. 5.4 B) après 30 minutes de traitement. En revanche, l’augmentation significative de laphosphorylation de la sérine 473 induite par l’insuline est inhibée d’environ 50% par le 4-HHEet le 4-HNE. Le transport de glucose étant totalement inhibé par le 4-HHE et le 4-HNE maisl’activation de la kinase Akt ne l’étant que partiellement, nous avons testé la phosphorylationde cette dernière en dose-réponse (fig. 5.4 C et D). Nous avons ainsi pu observer que l’inhibitionmaximale de la phosphorylation de la sérine 473 de la kinase Akt est obtenue pour 10 μM de4-HHE et 50 μM de 4-HNE. Les concentrations plus élevées n’entraînent pas de diminution plusimportante de la phosphorylation. Dans nos conditions expérimentales, la quantité totale deprotéine Akt n’est pas modifiée.

Les IRS (insulin receptor substrate) sont des sites de régulation très importants de la signa-lisation insulinique. Leur phosphorylation sur tyrosine permet la transduction du signal fournidirectement par le récepteur lors de la stimulation par l’insuline. Lorsque les IRS sont phos-phorylés sur différents résidus tyrosine, ils permettent la fixation de la sous-unité p85 de laphosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) et l’activation de cette dernière. D’autres sites de régu-lation sont présents sur les IRS, notamment des résidus sérine. La phosphorylation sur sérinedes IRS inhibe la phosphorylation sur tyrosine par le récepteur et diminue donc la transduc-tion du signal insulinique. Ces résidus sont phosphorylés en particulier par les voies de stressMAPK (ERK et JNK), exercant un rétrocontrole inhibiteur sur la phosphorylation des IRS parle récepteur en condition physiologique.

Dans les myoblastes L6, après une stimulation par 100 nM d’insuline pendant 20 minutes, laphosphorylation sur tyrosine de l’IRS1 augmente de 300% (fig. 5.5 A). Le 4-HHE et le 4-HNEseuls n’ont pas d’effet sur la phosphorylation de l’IRS1. Ils sont cependant responsables d’uneinhibition significative de la phosphorylation sur tyrosine induite par la stimulation insulinique.Ainsi, 10 μM de 4-HHE ou 50 μM de 4-HNE inhibent respectivement de 20 et 30% la phospho-rylation induite par l’insuline. Cet effet ne s’accompagne pas d’une diminution de la quantitétotale d’IRS1 (fig. 5.5 B).

La co-immunoprécipitation de la p85, induite par la phosphorylation sur tyrosine de l’IRS1est également augmentée d’environ 300% après stimulation par l’insuline (fig. 5.5 C). De façonsimilaire aux résultats obtenus sur la phosphorylation de l’IRS1, le 4-HHE et le 4-HNE ne

74


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Figure 5.4 – Inhibition de la protéine kinase B (PKB/Akt) par le 4-HHE et le 4-HNE.A : Les cellules sont stimulées par des doses croissantes d’insuline de 1 à 1000 nM pendant20 minutes. B : Les myoblastes L6 sont incubés en présence de 10 μM de 4-HHE ou de 50μM de 4-HNE pendant 30 minutes puis stimulés par 100nM d’insuline pendant 20 minutes.C,D : Les cellules sont incubées en présence de doses croissantes de 4-HHE ou de 4-HNEpendant 30 minutes puis stimulées par 100 nM d’insuline pendant 20 minutes. Dans tousles cas, les protéines cellulaires sont extraites et analysées par western blot en utilisant unanticorps spécifique phospho-sérine 473. Les résultats sont normalisés par la quantité totalede PKB/Akt dans les échantillons et exprimés en % du contrôle. n=4, des lettres différentesindiquent une différence significative (p<0,05).

modifient pas l’association p85-IRS en absence d’insuline. Ils sont néanmoins responsables d’uneinhibition de cette association induite par l’insuline. Ainsi, 10 μM de 4-HHE ou 50 μM de 4-HNEinhibent respectivement de 20 et 35% l’association p85-IRS1 induite par l’insuline, résultatsparfaitement parallèles à ceux obtenus sur la phosphorylation sur tyrosine.

L’activation des voies de stress MAPK par le 4-HNE et le 4-HHE a été précédemmentdécrite par plusieurs équipes. Ces kinases sont capables d’interférer avec la voie de signalisationde l’insuline, notamment par des phosphorylations inhibitrices des IRS. Elles peuvent donc être

75


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Figure 5.5 – 4-HHE et 4-HNE inhibent laphosphorylation de l’IRS-1 induite par l’insu-line. Les myoblastes L6 sont incubés en pré-sence de 10 μM de 4-HHE ou de 50 μM de4-HNE pendant 30 minutes puis stimulés par100 nM d’insuline pendant 20 minutes. Les pro-téines extraites sont analysées par Western Blotà l’aide d’anticorps spécifiques pour détecterla phosphorylation sur tyrosine de l’IRS1 (A),l’IRS1 total (B) et la co-immunoprécipitationde la sous-unité p85 de la PI3K (C). n=4 pourchaque experience, *p<0,05

responsables d’une interruption de la transduction du signal. Il a été démontré que ERK etJNK peuvent phosphoryler l’IRS1 sur les Sérines 312 et 616 respectivement, inhibant ainsi laphosphorylation sur tyrosine induite par le récepteur.

Dans les myoblates L6 en l’absence de stimulation par l’insuline, 30 minutes de traitementpar 10 μM de 4-HHE ou 50 μM de 4-HNE entraîne une augmentation significative de la phos-phorylation des MAPK. L’activation de JNK et de ERK croît de 20% (fig. 5.6 A,B), et cellede p38 d’environ 35% (fig. 5.6 C). L’insuline seule est également capable d’activer ces voies designalisation et augmente de 20% l’activation de p38 et de 40% celle de ERK et JNK. Lorsqueles myoblastes sont mis en présence des aldéhydes avant la stimulation par l’insuline, l’activationdes MAPK s’apparente à une activation par l’insuline seule. Dans nos conditions, il n’y a doncni inhibition ni potentialisation de l’activation induite par l’insuline et donc pas de rôle dansl’insulino-résistance induite par les hydroxy-alkénals.

5.3 Rôle du glutathion

La détoxification des aldéhydes dans l’organisme est réalisée entre autres par le glutathionet les glutathion-S-transférases. Ainsi, une voie spécifique de détoxification du 4-HNE passe

76


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Figure 5.6 – 4-HHE et 4-HNE activent lesvoies de stress MAPK. Les myoblastes L6 sonttraités par 10 μM de 4-HHE ou 50 μM de 4-HNE pendant 30 minutes puis stimulés par 100nM d’insuline pendant 20 minutes. Les pro-téines cellulaires extraites sont analysées parwestern blot à l’aide d’anticorps spécifiques dela phosphorylation de JNK, ERK et p38. Lesrésultats sont normalisés par la quantité totalede kinase ou par la tubuline. n=4 pour chaqueexpérience, *p<0,05

par la formation d’adduits de Michael sur le GSH, entraînant une diminution de la quantitéde cet antioxydant dans les cellules (cf. chapitre 1.2.3 page 26). Dans un premier temps, pourtester à la fois l’adduction du GSH par le 4-HHE et le 4-HNE et la capacité du kit à mesurerle GSH après adduction, nous avons incubé dans un système acellulaire 1 mM de GSH avecdes concentrations croissantes de 4-HHE et de 4-HNE pendant une nuit (fig. 5.7 A). Dansces conditions, nous avons observé une diminution dose-dépendante du GSH, légèrement plusimportante pour le 4-HHE que pour le 4-HNE. Ainsi, la concentration de GSH obtenue aprèsun traitement de 50 μM était de 0,72 mM pour le 4-HHE et 0,79 mM pour le 4-HNE, soit unediminution de 17% et 9% respectivement (fig. 5.7 A).

Dans notre modèle de myoblastes L6 en culture, un traitement par 4-HHE ou 4-HNE pendant30 minutes diminue les réserves intracellulaires de GSH (fig. 5.7 B). Le GSH diminue propor-tionnellement à l’augmentation de la concentration d’aldéhyde ajoutée aux cellules. Ainsi, pourune concentration de 50 μM, la quantité de GSH est diminuée de 30% par le 4-HHE et de 20%par le 4-HNE. Ceci confirme le rôle important joué par le glutathion dans la détoxification deshydroxy-alkénals.

Le 3H-dithiole-3-thione (D3T, fig. 5.8) est une molécule naturellement présente dans lesplantes de la famille des brassicacées (anciennement appelées crucifères) telles que le choux, lecresson, les radis, etc. Le D3T est capable d’augmenter significativement les concentrations deglutathion réduit ainsi que l’activité des glutathion-S-transférases, enzymes impliquées dans ladétoxification des aldéhydes [89]. Dans nos conditions expérimentales, un pré-traitement des

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Figure 5.7 – 4-HHE et 4-HNE réagissent avec le GSH. A : 1 mM de GSH a été incubéen présence de 4-HHE et 4-HNE pendant une nuit à 4°C. B : Les myoblastes L6 ontété traités pendant 30 minutes par 4-HHE ou 4-HNE en dose-réponse. Le glutathionréduit a été dosé à l’aide d’un kit commercial. n=3 pour chaque expérience, ***p<0,01

Figure 5.8 – Structure chimique du3H-dithiole-3-thione (D3T)

cellules musculaires L6 par 100 μM de D3T pendant 24H permet de doubler la quantité deglutathion réduit dans les cellules (fig. 5.9 A). Ainsi, même après un traitement par le 4-HHEou le 4-HNE, la quantité de GSH dans les cellules reste très supérieure à la situation contrôle.

Dans les conditions où le GSH est augmenté par un pré-traitement au D3T, nous avonspu montrer que la formation d’adduits du 4-HHE ou du 4-HNE mesurée par Dot Blot estsignificativement diminuée (fig. 5.9 B,C). Ainsi, le stress carbonyle induit par le 4-HHE et le4-HNE sur les protéines cellulaires diminue, ce qui est confirmé par la mesure des carbonylesà l’aide du DNPH. Dans ces conditions, les niveaux de carbonyles reviennent aux niveaux descontrôles non traités (fig. 5.9 D). Cette suppression des effets délétères des aldéhydes sur lestress carbonyle s’accompagne au niveau fonctionnel d’une restauration complète du transportde glucose induit par l’insuline (fig. 5.9 E).

Le 4-HHE et le 4-HNE, lorsqu’il sont appliqués pendant des temps longs, altèrent la viabilitécellulaire. Ainsi, après un traitement de 16 heures, la viabilité est complètement inhibée pourune concentration d’environ 50 μM de 4-HHE et de 75 μM de 4-HNE (fig. 5.10). Le calcul desdoses inhibant 50% de la viabilité (IC50) donne respectivement 35 μM pour le 4-HHE et 55 μMpour le 4-HNE. Le prétraitement des cellules par le D3T permet de protéger les cellules deseffet délétères des hydroxy-alkénals : les IC50 calculées dans ces conditions sont de 100 μMpour le 4-HHE et 95 μM pour le 4-HNE. Ceci est donc particulièrement vrai pour le 4-HHE :en présence de D3T, la viabilité n’est pas affectée jusqu’à 75 μM, alors qu’elle commençait àdiminuer dès 25 μM en conditions contrôles.

Le D3T, en augmentant les niveaux de GSH intracellulaire, prévient les effets délétères du4-HHE et du 4-HNE. Ceci permet de diminuer la cabonylation des protéines cellulaires et derestaurer complètement la capture de glucose induite par l’insuline. Ces résultats mettent doncen exergue le rôle spécifique du glutathion dans la détoxification des hydroxy-akénals.

78


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4-HNED3T

0Contrôle Insuline Insuline+D3T

Figure 5.9 – Rôle du glutathion dans la toxicité du 4-HHE et du 4-HNE. Après un traitementpar 100 μM de D3T pendant 24H suivi de 50 μM de 4-HHE ou de 4-HNE pendant 30 minutes, leglutathion réduit a été dosé à l’aide d’un kit commercial (BioVision) et normalisé à la quantité deprotéines (A). La formation d’adduits sur les protéines a été mesurée par Dot-Blot (B,C), le contenuen carbonyles dans les cellules a été mesuré à l’aide du DNPH (D) et le transport de glucose a étémesuré à l’aide du 2-désoxy-glucose tritié (E). n=3 minimum pour chaque expérience, ***p<0,01,des lettres différentes indiquent une différence significative (p<0,05)

5.4 Rôle des antioxydants et des chélateurs d’aldéhydes

S-adénosyl-méthionine (SAMe) La S-adénosyl méthionine ou SAMe est un co-substrat denombreuses enzymes catalysant des réactions de transfert de méthyle : les méthylases SAMe-dépendantes. La SAMe est utilisée par exemple comme substrat par les ADN méthyltransférasesou les histones méthyltransférases. Ces réactions de transfert de méthyle transforment la SAMeen S-adénosyl-homocystéine. Cette dernière peut aboutir à la formation de cystéine et servirde précurseur pour la synthèse du glutathion. Ceci est un des mécanismes proposés pour l’effetantioxydant de la SAMe [142, 123]. Un autre mécanisme antioxydant amorçé par la SAMe estune chélation des ions Fe2+ et une inhibition de l’auto-oxydation du fer [29].

Dans les cellules L6 en culture, un prétraitement de 24 heures avec 5 mM de SAMe permetde protéger les cellules des effets néfastes du 4-HHE et du 4-HNE. Le prétraitement par la SAMe

79


150 4-HHE 4-HHE + D3T

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0 50 100Concentration (μM)

0 50 100Concentration (μM)

Figure 5.10 – Une augmentation des pools intracellulaires enGSH contrebalance la diminution de viabilité induite par le 4-HHE (A) et le 4-HNE (B). Après un traitement par 100μM deD3T pendant 24H, les cellules ont été traitées en dose réponsepar le 4-HHE ou le 4-HNE pendant 16 heures et la viabilité a étémesurée à l’aide du test MTT. n=5 pour chaque expérience

permet de limiter la formation des adduits qui n’augmentent alors plus que de 120% (fig. 5.11A). Un effet similaire est observable pour le 4-HHE. L’augmentation de 210% induite par le4-HHE est significativement réduite et atteint seulement 40% après traitement par la SAMe(fig. 5.11 B). La diminution de la formation d’adduits s’accompagne, au niveau fonctionnel,d’une restauration complète du transport de glucose induit par l’insuline (fig. 5.11 C). Dans lecas de la SAMe, il existe une insulino-sensibilisation des cellules qui répondent de façon plusimportante au stimulus insuline que les cellules contrôle. Même après traitement par le 4-HHEet le 4-HNE, les cellules qui ont été prétraitées par la SAMe conservent un transport de glucoseplus important.

Aminoguanidine (AGD) L’aminoguanidine est une hydrazine possédant des propriétés nu-cléophiles lui permettant de se lier aux produits précoces de glycation. Elle empêche ainsi laformation des produits de glycation avancés (AGE). L’aminoguanidine est également un piégeurde radicaux hydroxyle et peroxyle et peut se combiner aux composés aldéhydiques formés aucours de la peroxydation lipidique pour empêcher ces derniers de réagir avec d’autres biomolé-cules [151, 62]. De façon similaire aux résultats obtenus pour la SAMe, un prétraitement de 24heures avec 1 mM d’AGD permet de protéger les cellules des effets néfastes du 4-HHE et du4-HNE. Ainsi, le prétraitement par l’AGD limite la formation d’adduits du 4-HHE et du 4-HNE(fig. 5.12 A,B). Cette diminution de la formation d’adduits s’accompagne au niveau fonctionneld’une restauration du transport de glucose induit par l’insuline (fig. 5.12 C). Dans le cas del’AGD, il existe également une insulino-sensibilisation des cellules qui répondent de façon plusimportante au stimulus insuline que les cellules contrôle. Même après traitement par le 4-HHEet le 4-HNE, les cellules prétraitées par la SAMe conservent un transport de glucose comparableau contrôle.

N-acétyl-cystéine (NAC) La N-acétylcystéine est un dérivé de la cystéine. Elle agit entant que puissant antioxydant en fournissant des groupes thiols favorisant la production deglutathion [7, 239]. De façon également similaire aux résultats obtenus pour la SAMe et l’AGD,

80


300

350

Non traité 4-HHE 10μM 4-HNE 50μM

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Figure 5.11 – La S-adénosyl-méthionine (SAMe)prévient les effets néfastes du 4-HHE et du4-HNE. Après un prétraitement par la SAMe(5mM) pendant 24 heures suivi de 30 minutesde traitement par le 4-HHE ou le 4-HNE, la for-mation d’adduits sur les protéines a été mesu-rée par dot-blot (A,B) et le transport de glucosemesuré à l’aide du 2-désoxy-glucose marqué (C).n=4 minimum pour chaque expérience, des lettresdifférentes indiquent une différence significative(p<0,05)

un prétraitement de 24 heures avec 1 mM de NAC permet de protéger les cellules des effetsnéfastes du 4-HHE et du 4-HNE. Ainsi, le prétraitement par la NAC permet de limiter laformation des adduits du 4-HHE et du 4-HNE (fig. 5.13 A,B). Cette diminution de la formationd’adduits s’accompagne au niveau fonctionnel d’une restauration du transport de glucose induitpar l’insuline (fig. 5.13 C). Dans le cas de la NAC, il n’existe pas d’effet insulino-sensibilisateursur les cellules. Le prétraitement à la NAC ne modifie pas la réponse basale des cellules austimulus insuline. Néanmoins, après traitement par le 4-HHE et le 4-HNE, les cellules prétraitéespar la NAC conservent un transport de glucose comparable aux cellules non traitées.

5.5 ConclusionA des concentrations n’affectant pas la viabilité cellulaire, le 4-HHE et le 4-HNE perturbent

la réponse à l’insuline des myoblastes L6 en inhibant le transport de glucose dans les cellulesmusculaires et les adipocytes. Cette perturbation est associée à une moindre phosphorylationd’Akt et de l’IRS1 et à une diminution de l’association IRS/PI3K.

Le 4-HHE et 4-HNE exercent leur toxicité via une diminution des réserves intracellulairesde GSH. La restauration des concentrations de GSH protège les cellules des effets toxiques deshydroxy-alkénals et restaure le transport de glucose induit par l’insuline. Le traitement par desantioxydants, connus entre autres pour augmenter les réserves de thiols intracellulaires (AGD,

81


A b

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Figure 5.12 – L’aminoguanidine (AGD) pré-vient les effets néfastes du 4-HHE et du 4-HNE.Après un prétraitement par l’AGD (1mM) pen-dant 24 heures suivi de 30 minutes de traitementpar le 4-HHE ou le 4-HNE, la formation d’ad-duits sur les protéines a été mesurée par dot-blot(A,B) et le transport de glucose mesuré à l’aidedu 2-désoxy-glucose marqué (C). n=4 minimumpour chaque expérience, des lettres différentes in-diquent une différence significative (p<0,05)

NAC et SAMe) protège également les cellules contre le 4-HHE et le 4-HNE.Le 4-HNE et le 4-HHE peuvent participer au développement de l’insulino-résistance. Nous

sommes capables de démontrer que le 4-HHE, via une diminution du GSH peut induire uneperturbation de la transduction du signal insuline dans les cellules musculaires, induisant ainsiune diminution de la capacité des cellules à capter le glucose dans le milieu extracellulaire.

82


A b

4-H

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400Non traité 4-HHE 10μM 4-HNE 50μM

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Figure 5.13 – La N-acétyl-cystéine (NAC) pré-vient les effets néfastes du 4-HHE et du 4-HNE.Après un prétraitement par la NAC (1 mM) pen-dant 24 heures suivi de 30 minutes de traitementpar le 4-HHE ou le 4-HNE, la formation d’ad-duits sur les protéines a été mesurée par dot-blot(A,B) et le transport de glucose mesuré à l’aidedu 2-désoxy-glucose marqué (C). n=4 minimumpour chaque expérience, des lettres différentes in-diquent une différence significative (p<0,05)

83

Chapitre 6

Altération de la fonction biologiquede l’insuline par formation d’adduitscovalents du 4-HHE et du 4-HNE

Le 4-HHE et le 4-HNE ont pour propriété principale de former des adduits covalents sur lesbiomolécules. Leur fixation sur les protéines peut aboutir à des changements conformationnelset à une diminution ou une perte de leur fonction biologique. Parmi les cibles préférentielles deshydroxy-alkénals, on compte les résidus acides aminés basiques tels que l’Histidine, la Lysine ouencore l’Arginine et les acides aminés soufrés comme la Cystéine. L’insuline est une hormone quipossède deux chaînes peptidiques A et B reliées par des ponts disulfures (cf. fig. 1.12 page 29).Elle possède plusieurs sites possibles d’adduction par des aldéhydes, notamment deux histidines,une arginine et une lysine présentes sur la chaine B et les deux parties N-terminales.

Lors des expériences sur les myoblastes L6 et les adipocytes 3T3-L1 en culture, le milieude culture contenant les aldéhydes était retiré et les cellules rincées avant la stimulation parl’insuline. L’insulino-résistance induite par le 4-HHE et le 4-HNE était donc due à un effet directdes hydroxy-alkénals sur les voies de signalisation et non pas à une adduction de la moléculed’insuline elle même. Nous nous intéressons donc ici à un autre mécanisme d’induction d’uneinsulino-résistance par les hydroxy-alkénals qui passerait par la fixation d’une ou plusieursmolécules de 4-HHE ou de 4-HNE sur l’insuline, perturbant ainsi sa fontion biologique.

6.1 Analyse de la formation d’adduits

Carbonylation de l’insuline

De l’insuline recombinante humaine a été incubée en présence de 4-HHE ou de 4-HNEpendant une nuit à 37°C et la présence d’adduits a été analysée par différentes méthodes.L’analyse de la carbonylation de l’insuline après un traitement par le 4-HHE ou le 4-HNE aété tout d’abord mesurée par la méthode du DNPH. L’incubation de 2,5 mg/mL (0,43 mM)d’insuline avec 5 mM de HHE ou HNE induit une formation progressive d’adduits au cours dutemps (fig. 6.1A). En 2 heures, la concentration de carbonyles atteint 50 et 100 nmol/mg deprotéines pour le 4-HHE et le 4-HNE respectivement. Le maximum a été obtenu après 16 heuresd’incubation, mais le contenu en carbonyles restait deux fois plus faible après l’adduction par

84

CHAPITRE 6. ADDUCTION DE L’INSULINE

le 4-HHE comparativement au 4-HNE.Ce résultat a été confirmé par Dot Blot. L’insuline incubée en présence de 4-HHE et de

4-HNE toute une nuit a été déposée sur une membrane de nitrocellulose et les adduits ontété détectés à l’aide d’anticorps spécifiques des adduits de Michael du 4-HNE (fig. 6.1B) etdu 4-HHE (fig. 6.1C). Nous avons pu mettre en évidence une augmentation très significativede la présence d’adduits après traitement par les hydroxy-alkénals : +900% et +400% pour le4-HNE et le 4-HHE, respectivement. L’anticorps utilisé pour détecter les adduits du 4-HHE estspécifique des adduits de Michael sur histidine. Nous pouvons donc affirmer que parmi les sitesde fixation des aldéhydes, il y a une ou plusieurs histidines.

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Heures

Figure 6.1 – Carbonylation de l’insuline après traitement par le 4-HHE et le 4-HNE. De l’insulinerecombinante humaine (2,5 mg/mL) a été incubée en présence de 5 mM de 4-HHE ou de 4-HNEpendant différentes durées. A : La formation d’adduits sur l’insuline a été mesurée à l’aide duDNPH (cf. chapitre 2, matériel et méthodes), n=3. B,C : la formation d’adduits a été détectée parDot Blot à l’aide d’anticorps spécifiques des adduits de Michael, n=4, ***p<0,001.

Analyse de l’adduction par MALDI-TOF

Une analyse par la technique MALDI-TOF a permis de constater la différence de masseentre une molécule d’insuline native et une molécule adduite. Cette analyse a révélé la présencede 5 molécules de masses différentes que ce soit pour le 4-HHE ou pour le 4-HNE (fig. 6.2). Cesmolécules correspondent respectivement à la masse de l’insuline à laquelle s’ajoute la masse de1 à 5 adduits du 4-HHE ou du 4-HNE (table 6.1). Cet ajout de masse s’effectuant sans perte dela masse d’une molécule d’eau (18 g/mol), les 5 adduits possibles sur l’insuline sont forcémentdes adduits de Michael et non des bases de Schiff. L’absence de bases de Schiff peut par ailleurss’expliquer par le fait que ces liaisons sont réversibles et donc perdues au cours de la dialyseréalisée pour purifier l’insuline. Majoritairement, le 4-HHE et le 4-HNE forment donc 3 adduitsde Michael sur l’insuline.

Analyse par MALDI-TOF et LC-MSMS après trypsinisation

Pour aller plus loin dans cette étude, nous avons effectué une digestion à la trypsine suivied’une analyse en MALDI-TOF (fig. 6.3) et en LC/MS-MS (table 6.2). La chaîne A de l’insulinene présente pas de sites de clivage par la trypsine, mais la chaîne B en présente 2, ce qui permet

85


5806,6Insuline+DMSO

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0 1 2 3 4 5Nombre d’adduits

Figure 6.2 – Analyse de la formation d’adduits du 4-HHE et du 4-HNE sur l’insuline parMALDI-TOF. L’insuline (2,5 mg/mL) a été incubée en présence de 5 mM de 4-HHE ou de4-HNE pendant une nuit puis analysée par MALDI-TOF. Les spectres représentatifs de chaqueexpérience sont présentés pour l’insuline native incubée en présence de DMSO (A), l’insulinetraitée par le 4-HHE (B) ou par le 4-HNE (C). La quantité relative de chaque forme d’insulineadduite a été estimée par la surface des pics et exprimée en % du total (D).

d’obtenir trois fragments correspondant aux acides aminés 1 à 22, 23 à 29 et 30. L’analyse enLCMS/MS porte donc sur 4 fragments : A, B[1-22], B[23-29] et B[30]. Deux peptides seulementont pu être détectés en MALDI-TOF : B[1-22] et B[23-29] (fig. 6.2). Leur analyse après digestionpar la trypsine permet de mettre en évidence la présence de 1 à 4 adduits sur le fragment B[1-22] tandis que les fragments B[23-29] et B[30] ne sont pas adduits (fig. 6.3 et table 6.2). Lachaîne A n’a pas pu être détéctée en MALDI-TOF mais l’analyse en LCMSMS permet quantà elle de montrer la présence d’un seul adduit du HHE ou du HNE sur cette partie du peptide(table 6.2)).

L’analyse en MALDI-TOF permet de mettre en évidence la présence de 1 à 5 adduits du4-HHE ou du 4-HNE sur l’insuline. La digestion par la trypsine suivie de l’analyse en MALDI-TOF (fig. 6.3) et en LC/MSMS (table 6.2) permet de cibler plus précisement la localisation deces 5 adduits. Tout d’abord, nous pouvons affirmer qu’il y a 1 adduit sur la chaîne A et 4 sur

86


Masse (m/z) Nombre d’adduitsNative 5806,6 -4-HNE, pic 1 5964,9 1,0014-HNE, pic 2 6120,8 1,9984-HNE, pic 3 6277,3 3,0004-HNE, pic 4 6433,8 4,0024-HNE, pic 5 6590,3 5,0044-HHE, pic 1 5921,1 0,9864-HHE, pic 2 6035,1 1,9844-HHE, pic 3 6149,1 2,9834-HHE, pic 4 6263,3 3,9844-HHE, pic 5 6376,4 4,974

Table 6.1 – Calcul du nombre d’adduits sur l’insuline. La masse (m/z) de l’insulinenative est de 5806,6 Da, celle du 4-HHE de 114,141 g/mol et celle du 4-HNE de156,222 g/mol. Le nombre d’adduits s’obtient par le calcul :Nombre d’adduits = (masse mesurée - 5806,6) /masse HHE/HNE

la chaîne B, et que les extrémités N-terminales ne sont pas adduites (fig. 6.4).Sur la chaîne B, les acides aminés 23 à 30, correspondant aux peptides B[23-29] et B[30], ne

sont pas adduits. Ceci exclue les résidus Lys29 et Arg22 présents à ce niveau. Les acides aminéshistidine sont connus pour avoir une forte réactivité vis à vis des aldéhydes tels que le MDA,l’acroléine et le 4-HNE [160, 207, 87, 81] et nous avons montré par Dot Blot que le 4-HHE sefixe sur une ou plusieurs histidines. Sur le peptide B[1-22], les acides aminés His5 et His10 sontdonc certainement adduits. Pour expliquer la présence de 2 adduits supplémentaires sur cetteséquence d’acides aminées, deux hypothèses sont possibles :

1. fixation sur les acides aminés Ser11 et Tyr16 qui peuvent potentiellement réagir avec desaldéhydes, bien que cela soit peu probable en conditions physiologiques.

2. fixation sur les histidines par le phénomène de domino décrit précédement (cf. fig. 1.9page 24).

Sur la chaîne A, les sites pouvant réagir chimiquement avec le 4-HHE et le 4-HNE sontSer9, Ser12, Tyr14 ou Tyr19. L’analyse par la trypsine ne nous permet pas de déterminer avecprécision la localisation des adduits, mais il est clair que ces sites ne sont vraisemblablementpas adduits en conditions physiologiques étant donné leur faible réactivité chimique vis à visdes aldéhydes.

6.2 Modélisation de la structure de l’insuline modifiée

Afin d’obtenir un aperçu des modifications moléculaires de l’insuline après adduction par les4-hydroxy-2-alkénals, une étude de modélisation moléculaire a été réalisée à partir de monomèresd’insuline en utilisant l’adduction par le 4-HHE comme référence. Les résidus histidine peuventréagir avec les hydroxy-alkénals dans des conditions physiologiques conduisant à des adduits deMichael. En conséquence, cette modélisation a été centrée sur les résidus histidine B5 et B10.

Lors de sa synthèse dans le pancréas, l’insuline est présente sous une forme hexamérique.Les résidus histidine des monomères d’insuline participent à la coordination autour d’un atomede Zinc central. Les monomères d’insuline sont quant à eux sous deux conformations différentes

87


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88


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70

80

90

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Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 2602.3, 7929]

[M+H]+ 859 42

[M+H]+ 2601.27 B[1-22]

A

30

40

50

60

% In

tens

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[M+H] 859.42B[23-29]

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00

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*

3225.0

70

80

90

100

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC=>MC[BP = 2830.4, 3225]

[M+H]+ 859.42B[23-29]

[M+H]+ 2829.40B[1-22] + 2 HHE [M+H]+ 2943.52

B[1-22] + 3 HHE

B

30

40

50

60

% In

tens

ity

[M+H]+ 2715.32 B[1-22] + 1 HHE

699.0 1259.2 1819.4 2379.6 2939.8 3500.0Mass (m/z)

00

10

20 ***

2056.7

80

90

100

Voyager Spec #1=>AdvBC(32,0.5,0.1)=>NR(2.00)=>MC[BP = 859.4, 2057]

[M+H]+ 859.42B[23-29]

[M+H]+ 2913 51

C

40

50

60

70

% In

tens

ity

[M+H]+ 2757.43B[1-22] + 1 HNE

[M+H] 2913.51 B[1-22] + 2 HNE

[M+H]+ 3069.64 B[1-22] + 3 HNE

*

699.0 1259.2 1819.4 2379.6 2939.8 3500.0Mass (m/z)

00

10

20

30

[ ]

* *

Figure 6.3 – Analyse de la localisation des adduits du 4-HHE et du 4-HNE sur l’insuline. L’insuline (2,5 mg/mL) a été incubée en présence de5 mM de 4-HHE ou de 4-HNE pendant une nuit. Après digestion par latrypsine, les fragments ont été analysés par MALDI-TOF. Les spectresreprésentatifs de chaque expérience sont présentés pour l’insuline nativeincubée en présence de DMSO (A), l’insuline traitée par le 4-HHE (B) oupar le 4-HNE (C).

à l’équilibre : R et T. Ces conformations sont associées à des hélices alpha (R) ou à des confor-mations étendues (T) adoptées par les neuf premiers résidus de la chaîne B. L’hexamère peutdonc se présenter sous trois conformations : R6, R3T3 ou T6 (fig. 6.5).

La modélisation moléculaire des monomères d’insuline nous a permis de montrer que leshistidines sont des acides aminés particulièrement exposés à la surface de la molécule et doncfacilement accessibles pour une adduction (fig. 6.6), ce qui est en accord avec l’analyse enLC/MSMS montrant la présence d’adduits dans cette région du peptide.

Le modèle moléculaire des deux monomères d’insuline sur lesquels se fixent deux adduitsde Michael du 4-HHE ont été construits sur l’azote le plus accessible des cycles imidazole.Après minimisation de l’énergie, les monomères d’insuline modifiée ont été superposés avec desmonomères natifs afin de comparer leur forme et leur conformation. La figure 6.6 montre que le

89


PHEVAL

GLYILE

ASNGLNHIS5

LEUCYS

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SSS

GLYASPHIS10

LEUVAL

B[1 22]

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SS

GLYPHEPHETYRTHR

B[23 29]

PROLYS29

THRB[30]

Figure 6.4 – Localisation des sites d’adduction sur l’in-suline à partir des analyses en MALDI-TOF et LC-MSMSavant et après digestion par la trypsine

repliement général des monomères d’insuline modifiée est préservé. Toutefois, la forme globaledes monomères est modifiée en raison de la présence «d’adduits de Michael protubérants» sur lasurface de l’insuline. Ceci pourrait affecter l’activité biologique des monomères d’insuline ainsique sa biodisponibilité, notamment sous la forme hexamérique.

Cette modélisation met en évidence une modification structurale de l’insuline, liée à la pré-sence des «protubérances» formées par les adduits de Michael du 4-HHE sur les histidines. Enrevanche, il n’y a pas de modification profonde de l’organisation tridimentionnelle des mono-mères d’insuline.

6.3 Effet biologique des insulines modifiées

Transport de glucose in vitro

L’activité biologique des insulines modifiées a été mesurée in vitro sur des lignées de cellulesmusculaires L6 et d’adipocytes 3T3-L1. L’incorporation du [3H]-2-désoxy-glucose a été mesu-rée afin d’estimer la capacité des insulines modifiées à induire une réponse biologique in vitro(fig. 6.7).

Sur les adipocytes 3T3-L1 (fig. 6.7 A), l’insuline native induit une augmentation d’environ250% de la capture de glucose. L’insuline modifiée par le 4-HHE déclenche une stimulationdu transport de glucose 30% moins importante que l’insuline native. L’insuline modifiée par le

90


A BA B

C

Figure 6.5 – Modélisation des formes monomèriques T (A)et R (B) et de la forme hexamérique (C) de l’insuline.

A B

Figure 6.6 – Superposition des molécules d’insuline native et modifiée sur les deux résidus histidinepar le 4-HHE. Les insulines natives sont présentées en bleu, et les insulines modifiées en vert, pourles formes monomériques T (A) et R(B).

91


4-HNE a le même effet, une stimulation de 30% moins importante que l’insuline native. Surles myoblastes L6 (fig. 6.7 B), l’insuline native induit une augmentation d’environ 90% de lacapture de glucose. L’insuline modifiée par le 4-HHE déclenche une stimulation du transportde glucose 25% moins importante que l’insuline native. L’insuline modifiée par le 4-HNE n’aquant à elle quasiment plus d’effet, ne modifiant pas significativement la capture de glucose.in vitro, sur des lignées cellulaires en culture, les insulines modifiées par le 4-HHE ou le 4-HNEprésentent une activité biologique diminuée globalement de 30% par rapport à l’insuline native.

Adipocytes 3T3-L1A Cellules musculaires L6BAdipocytes 3T3-L1

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Contrôle Insuline Insuline+HHE

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Temps (min)

Figure 6.7 – Diminution de l’activité biolo-gique des insulines modifiées. Le transport deglucose par les adipocytes 3T3-L1 (A) et lesmyoblastes L6 (B) à été mesuré par l’incorpora-tion de [3H]-2-désoxy-glucose après stimulationpendant 20 minutes par les insulines modifiéespar le 4-HHE ou le 4-HNE. L’activité hypogly-cémiante des insulines modifiées a été évaluée invivo à l’aide d’un test de tolérance à l’insuline(C). Les résultats sont des moyennes ±SEM,n=4 pour chaque expérience, des lettres alpha-bétiques différentes indiquent une différence si-gnificative (p<0,05).

Action hypoglycémiante in vivo

L’activité biologique des insulines modifiées a été mesurée in vivo par un test de toléranceà l’insuline réalisé chez des souris. L’injection de 0,5 UI/kg d’insuline native entraîne une di-minution rapide de la glycémie, maximale après 60 minutes (fig. 6.7 C). Après 30 minutes, laglycémie est diminuée de 50% par l’insuline native, alors qu’elle n’est diminuée que de 25 et30% par les insulines modifiées par le 4-HHE et le 4-HNE respectivement.

6.4 Conclusion

L’insuline est la seule hormone hypoglycémiante des organismes supérieurs et joue donc unrôle crucial dans la régulation de la glycémie. Nous avons montré par cette étude que l’insuline estsuceptible d’être modifiée de façon covalente par les dérivés de peroxydation lipidique 4-HHE et4-HNE. La formation de 1 à 5 adduits covalents sur l’insuline modifie peu sa structure ternairemais perturbe significativement sa fonction biologique. Nous avons montré que les insulines

92


modifiées par le 4-HHE ou le 4-HNE présentent une activité en moyenne 30% inférieure à uneinsuline native. Les 5 sites d’adductions ne sont pas clairement définis, mais il est certain que lesrésidus histidine de la chaine B consituent des cibles préferentielles de fixation. Ces résidus sontimpliqués in vivo dans la cristallisation de 6 monomères d’insuline autour d’un atome de Zinccentral. Cette structure est retrouvée dans la cellule β-pancréatique et permet une stabilisationde l’insuline pour son stockage à forte concentration dans les vésicules sécrétoires denses. Dansla circulation sanguine, l’insuline se trouve principalement sous forme monomèrique et c’estcette dernière qui interagit avec le récepteur IR.

En conditions physiologiques, l’insulinémie est d’environ 50 pM et les concentrations circu-lantes de 4-HHE et de 4-HNE sont de 20 et 50 nM respectivement, comme nous l’avons montréprécédemment. Il exite donc environ 1000 molécules de 4-HHE ou de 4-HNE pour une moléculed’insuline. Le ratio serait très favorable pour une adduction de l’insuline par ces molécules, maisle nombre de cibles potentielles d’adduction (albumine notamment) et la demi-vie de l’insulinedans la circulation (quelques minutes) rendent peu probable une adduction de cette dernièrein vivo. Néanmoins, les insulines à longue durée utilisées pour le traitement des diabétiquesprésentent une durée de vie de plusieures heures et sont donc potentiellement beaucoup plussensibles aux attaques nucléophiles.

Dans le pancréas, il existe au cours du diabète un stress oxydant important pouvant êtreresponsable de la formation d’aldéhydes et il a été montré que le 4-HNE est capable d’inhiberla sécrétion d’insuline induite par le glucose dans des cellules β en culture [136]. De plus, lesrésidus histidine de l’insuline sont impliqués dans la formation d’hexamères indispensables pourle stockage et la sécretion d’insuline. Le mécanisme d’adduction par le 4-HHE et le 4-HNEque nous avons décrit pourrait donc contribuer à perturber à la fois le stockage et la sécrétiond’insuline dans des conditions associées à un stress oxydant pancréatique.

Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme associant le stress oxydant, viala production d’aldéhydes à une insulino-résistance et montrent le rôle délétère certainementsous-estimé des dérivés secondaires du stress oxydant tels que le 4-HHE ou le 4-HNE.

93

Chapitre 7

Déterminants chimiques de latoxicité des hydroxy-alkénals :relation Structure/Activité

Les effets nocifs du 4-HHE et du 4-HNE sont liés à leur forte réactivité chimique, elle-même liée au niveau moléculaire à leur structure particulière. Ils sont composés d’une fonctionaldéhyde sur le carbone 1 conjuguée à une double liaison située entre les carbones 2 et 3 (cf.fig. 1.7 page 22). La présence d’une fonction hydroxyle sur le carbone 4 renforce quant à ellel’électrophilie de l’ensemble. Comme cette structure chimique particulière est sans doute undéterminant majeur de leur toxicité, le but de cette étude est de comparer l’effet des 4-hydroxy-2-alkénals à ceux de plusieurs dérivés chimiques apparentés, afin d’établir une relation structure-toxicité.

Les groupes chimiques impliqués dans la formation d’adduits ont été modifiés pour testerl’implication de chacun d’eux dans la toxicité des 4-hydroxy-2-alkénals. Les 4-HHE, 4-HNE et 4-HDE comportent respectivement une chaîne carbonée à 6, 9 et 12 carbones, ce qui nous permetde comparer l’effet de la longueur de la chaine carbonée. Leurs dérivés acétals ne présententplus de fonction aldéhyde, les trans-2-alkénals ne présentent plus de fonction hydroxyle sur lecarbone 4 et les alkanals ne présentent plus ni fonction hydroxyle sur le carbone 4 ni doubleliaison entre les carbones 2 et 3. Toutes ces molécules sont présentées dans le tableau 7.1.

7.1 Cytotoxicité des hydroxy-alkénals

L’estimation de la toxicité des différents dérivés à été effectuée à l’aide du test MTT (cf.chapitre 2, matériel et méthodes). Toutes les molécules ont été testées en dose-réponse (de 1μM à 5 mM) après 16 heures de traitement, et les concentrations diminuant de 50% la viabilitécellulaire (IC50) ont été calculées grâce à un modèle non-linéaire appliqué à chaque courbe. Unediminution de la viabilité cellulaire a été observée pour toutes les molécules testées, même siles 4-hydroxy-2-alkénals restent de loin les plus toxiques. Ainsi, le HDE, possèdant la chaînecarbonée la plus longue est le dérivé le plus toxique, avec une IC50 de 8,7 μM (fig. 7.1 A). LeHHE présente une IC50 intermédiaire de 28,9 μM, tandis que le HNE est le dérivé qui affecte lemoins la viabilité cellulaire avec une IC50 de 53 μM. Les dérivés acétals présentent une toxicitéplus faible que les hydroxy-alkénals (fig. 7.1 B). Ainsi le HDEA est le plus toxique avec une

94

CHAPITRE 7. RELATION STRUCTURE/ACTIVITÉ

HHEHNEHDE

150

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AHHEAHNEAHDEA

150

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e)

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Viab

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Concentration, log[μM]0 1 2 3 4


Figure 7.1 – Diminution de la viabilité cellulaire par les hydroxy-alkénals et les composés appa-rentés. Des myoblastes L6 ont été traités pendant 16 heures par les différentes molécules décritesprécédemment. A : 4-hydroxy-2-alkénals, B : dérivés acétals, C : trans-2-alkénals, D : alkanals.La viabilité a ensuite été mesurée à l’aide du test MTT. Les résultats sont des moyennes ±SEM,exprimées en % du contrôle non traité, n>5. La modèle non linéaire des dose-réponses est tracé àl’aide du logiciel GraphPad.

IC50 de 120,7 μM, à peu près équivalente à celle du HHEA qui présente une IC50 de 128,6 μM.Le HNEA est de loin le moins toxique de ces dérivés avec une IC50 de 665,1 μM. Les trans-2-alkénals, présentent une toxicité plus faible que les hydroxy-alkénals mais plus forte que lesdérivés acétals pour les dérivés en C9 et C12 (fig. 7.1 C). Ainsi le DE est le dérivé le plus toxiqueavec une IC50 de 50,7 μM. Le HE présente une IC50 intermédiaire de 191,1 μM et le NE est lemoins toxique avec une IC50 de 339,7 μM. Les alkanals possèdent les IC50 les plus hautes etsont donc les moins toxiques de toutes les molécules testées (fig. 7.1 D). Le plus toxique est leDA avec une IC50 de 552,5 μM suivi par le HA avec une IC50 de 816,1 μM. Le dérivé le moinstoxique est ici encore le dérivé à 9 carbones NA avec une IC50 de 1175,0 μM.

En résumé, le dérivé le plus toxique au sein de chaque classe de dérivés est toujours le C12,suivi par C6. Le moins toxique des trois étant toujours le dérivé en C9. Les IC50 calculées sontprésentées dans le tableau 7.2.

95


7.2 Mécanisme de la toxicité des hydroxy-alkénals

Nécrose

La diminution de la viabilité des cellules mesurée par le MTT peut être due à de nombreuxfacteurs, notamment à une détériotation des membranes plasmiques. Pour vérifier cela, nousavons mesuré la libération de LDH par les cellules après un traitement pendant 16 heures.Après un traitement par les IC50 mesurées précédement (fig. 7.2 A), les hydroxy-alkénals n’in-duisent pas de libération de LDH, mais certains de leurs dérivés respectifs l’augmentent de façonsignificative. A l’exception du HNE et du HDE, tous les dérivés en C9 et C12 induisent uneaugmentation significative de la libération de LDH. Les dérivés HDEA, DE et DA induisentrespectivement une augmentation de 40%, 20% et 75%. Le traitement par les IC50 des dérivésC9, sauf pour le HNE, induit une augmentation équivalente de 40% de la libération de LDH.Pour résumer, ni les dérivés C6, ni les hydroxy-alkénals n’induisent d’augmentation de la per-méabilité membranaire lorsque les cellules sont traitées avec leurs IC50. Les autres dérivés testésinduisent une augmentation significative de la libération de LDH qui pourrait expliquer certainsde leurs effets toxiques par induction de nécrose.

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Figure 7.2 – Apoptose et nécrose induites par les hydroxy-alkénals et leurs dérivés chi-miques. Des myoblastes L6 ont été traités pendant 16 heures avec les différents dérivés chi-miques soit avec leurs IC50 calculées précédemment(A,C), soit avec 100 μM (B,D). L’apop-tose et la nécrose ont été mesurées respectivement par l’activité caspase-3 et la libération deLDH dans le milieu extracellulaire. Les résultats sont des moyennes ±SEM, exprimées en %du contrôle non traité, n>3.

Pour confirmer ces résultats, nous avons traité les cellules L6 avec une concentration unique

96


(100 μM) de chaque dérivé et mesuré la libération de la LDH dans ces conditions (fig. 7.2 B). Lalibération de LDH est considérablement augmentée pour tous les hydroxy-alkénals : 288, 202 et213% pour HHE, HNE et HDE respectivement. Les dérivés C12 induisent également une aug-mentation significative de la nécrose : 154, 154 et 176% pour HDEA, DE et DA respectivement.Mis à part le HHE et le HNE, tous les autres dérivés C6 et C9 ne modifient pas la nécrose.

Parallèlement, la diminution de viabilité pourrait être expliquée par une induction de l’apop-tose. Nous avons donc mesuré l’activité caspase-3 dans nos cellules. Après un traitement de 16heures par les IC50 mesurées précédement, aucun dérivé chimique n’induit d’augmentation del’apoptose (fig. 7.2 C). Par contre, un traitement par 100 μM déclenche une augmentation im-portante de l’activité caspase pour le HHE, HDE et DE de respectivement 300, 120 et 80%(fig. 7.2 D).

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A t ( ti ité 3 % d t ôl )

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Nécrose (test LDH, % du contrôle) Apoptose (activité casp-3, % du contrôle)

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Nécrose(test LDH, % du contrôle)

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150100

Figure 7.3 – Corrélations entre viabilité, nécrose et apoptose. Après un traitementpar 100 μM, la viabilité des cellules a été mesurée par le test MTT, la nécrose par le testLDH et l’apoptose par l’activité caspase-3. A) Corrélation entre viabilité et nécrose.B) Corrélation entre viabilité et apoptose. C) Régression multilinéaire comparantviabilité, nécrose et apoptose.

Après un traitement avec 100 μM de dérivés chimiques, il existe une corrélation positiveentre la viabilité et la nécrose (r2=0,696, p<0,001, fig. 7.3 A) mais pas entre la viabilité etl’apoptose (r2=0,323, p=0,043, fig. 7.3 B). Le modèle multilinéaire (fig. 7.3 C) montre bien que

97


la viabilité est beaucoup plus dépendante de la nécrose que de l’apoptose dans nos conditions.Ensemble, ces résultats montrent que la diminution de la viabilité peut être globalement mieuxexpliquée par une nécrose cellulaire que par une induction de l’apoptose.

Carbonylation

La toxicité des hydroxy-alkénals semble dépendre de la formation d’adduits covalents. Pourvérifier cela, nous avons mesuré la carbonylation de l’albumine sérique bovine (BSA) comme unindice de la capacité des molécules à former des liaisons covalentes sur les protéines. La BSA(4 g/L) a été incubée pendant 16 heures avec 1 mM de chacun des produits chimiques. Lescarbonyles ont ensuite été analysés en utilisant le DNPH (cf. chapitre 2, matériel et méthodes).La plus grande quantité d’adduits sur BSA a été obtenue après un traitement par les hydroxy-alkénals (fig. 7.4 A). La quantité d’adduits après traitement par HHE, HNE et HDE étaitrespectivement de 100, 142 et 155 nmol / mg de protéines. Les trans-2-alkénals présentaientune capacité intermédiaire d’adduction : 57, 53 et 80 nmol / mg de protéines pour HE, NE et DErespectivement. Inversement, aucune adduction de la BSA n’a été détectée après un traitementpar les alkanals.

De façon étonnante, aucune adduction n’a été détéctée pour le HHEA mais les dérivés acétalsHNEA et HDEA ont respectivement formé 38 et 105 nmol de carbonyles par mg de protéines.Nous avons émis l’hypothèse que cette formation d’adduits était due à une hydrolyse spontanéedes dérivés acétals en hydroxy-alkénals. Pour cela, nous avons utilisé l’absorbance à 234 nm,longueur d’onde à laquelle les hydroxy-alkénals absorbent fortement, mais pas les dérivés acétals.Nous avons montré ainsi que le HNEA s’hydrolyse rapidement et de façon spontanée dans l’eaupour former du HNE (fig. 7.5). Ceci explique la toxicité et la formation d’adduits sur les protéinesinduite par les dérivés acétals.

A BA

150

200

urla

BSA

roté

ines

)

***

******

***

B

3

4r²=0.7681p=0.0002

C50

0

50

100

Car

bony

les

su(n

mol

/mg

de p

*** ***

ns**

***

ns ns ns0

1

2

logI

C

0(

0 50 100 150 2000

Carbonyles sur la BSA(nmol/mg de protéines)

Figure 7.4 – Formation de carbonyles sur l’albumine. De la BSA (4 g/L) à été incubéeen présence de 5 mM de dérivés chimiques pendant 16 heures à 37°C. La carbonylationa été mesurée à l’aide du DNPH. Les résultats sont des moyennes ±SD, n=3.

Résultat particulièrement intéressant, une forte corrélation négative (r2=0,769, p<0,001) aété trouvée entre le logIC50 calculé à partir de la figure 7.1 et la carbonylation de la BSA(fig. 7.4 B). Ceci indique que la capacité des molécules à former des liaisons covalentes est undéterminant majeur de leur toxicité.

98


2.0

EA

A B 2.0

nm

0 5

1.0

1.5 0 min10 min30 min60 min120 min240 minor

banc

e du

HN

0 5

1.0

1.5

HNEAHNE

rban

ce à

234

n

220 240 260 280 3000.0

0.5 240 min

Longueur d’onde (nm)

Abs

o

0 30 60 90 120 150 180 210 2400.0

0.5

Temps (min)

Abs

o

Figure 7.5 – Hydrolyse spontanée du HNEA dans l’eau. L’absorbance à 234 nm,caractéristique des hydroxy-alkénals, à été mesurée par spectrophotométrie UV.Les spectres d’absorbance ont été mesurés après 0, 10, 30, 60, 120 et 240 minutes(A) et l’absorbance à 240nm a été mesurée toutes les 5 minutes pour réaliser unecinétique (B)

7.3 Analyse structure/activité

Plusieurs descripteurs moléculaires ont été calculés pour tous les dérivés chimiques à l’aidedu logiciel preAdmet (cf. annexe, table 8.2). Pour préciser le rôle de la structure chimique surles différences de toxicité observées, nous avons établi des corrélations entre ces descripteursmoléculaires et le logIC50 obtenu à partir de la figure 7.1. Les descripteurs constitutionnelschoisis étaient : le nombre de doubles liaisons C=C et C=O, le nombre de groupes OH, lenombres d’atomes de carbone (longueur de la chaîne hydrocarbonée), le poids moléculaire, etle nombre d’accepteurs de Michael. Les seuls descripteurs corrélés positivement avec le logIC50sont le nombre de doubles liaisons C=C et d’accepteurs de Michael. Ceci indique que la toxicitéde ces dérivés est sans doute liée à leur capacité à former des liaisons covalentes, notammentdes adduits de Michael. Parmi les descripteurs physico-chimiques, nous n’avons pas pu mettreen évidence une corrélation positive entre le logIC50 et la polarisabilité ou le coefficient departage octanol-eau (LogP) ce qui signifie que la toxicité de ces différents dérivés n’est pas dueà une sensibilité différente à la déformation électromagnétique ou à une différence de solubilitédans le milieu. Tous les composés testés sont des électrophiles faibles (LUMO <2.5 eV), maisles 4-hydroxy-2-alkénals et les trans-2-alkénals sont les plus électrophiles, comme défini parune LUMO plus faible que celles des autres membres du groupe. Sur la base de ce paramètre,les dérivés acétal et les aldéhydes sont sensiblement de plus faibles électrophiles. Néanmoins,aucune corrélation n’a pu étre trouvée entre l’énergie LUMO et la toxicité (logIC50). Le PNSA3(partial negative surface area) et le WNSA3 (surface weighted charged partial negative surfacearea) sont fortement corrélés avec le logIC50. Ces descripteurs électrostatiques montrent que lesmolécules les plus cytotoxiques sont celles qui ont la surface électronégative (liée aux atomesd’oxygène) la plus grande.

Sur la base de leur structure chimique, les dérivés acétal ne sont pas capables de former desliaisons covalentes sur les protéines. Néanmoins, nous avons montré une adduction importantede BSA par ces dérivés, ce qui suggère que leur toxicité est due à leur hydrolyse spontanéeconduisant à la formation des hydroxy-alkénals parents. Nous avons donc par la suite considéréles dérivés acétal comme étant des valeurs aberrantes et recalculé toutes les corrélations entrelogIC50 et descripteurs chimiques après exclusion des HHEA, HNEA et HDEA (table 7.3). Dansces conditions, le nombre de doubles liaisons C=C est resté corrélé avec le logIC50 (r2=0,604,

99


A B

2

3

4

C50

A

2

3

4

C50

B

0

1

2

logI

r²=0.7693p=0.0002

0

1

2

r²=0.4252p=0.0216

logI

-16 -14 -12 -10 -8 -60

PNSA3-4 -3 -2 -1 0

0

WNSA3

Figure 7.6 – Corrélations entre le logIC50 et les descripteurs moléculaires PNSA3et WNSA3. Les logIC50 ont été calculés à partir de la figure 1 et les descripteursà partir de l’application PreAdmet. La droite de corrélation (trait plein) et l’inter-valle de confiance à 95% (trait pointillé) ont été tracés à l’aide du logiciel GraphPadPrism

p=0,014) et de nouvelles corrélations ont été trouvées entre logIC50 et le nombre d’atomesd’oxygène et de groupes OH (r2=0,640, p=0,010). Le LUMO est également corrélé avec lelogIC50 (r2=0,657, p=0,008) en utilisant seulement les 4-hydroxy-2-alkénals, trans-2-alkénals etalkanals. Certains descripteurs géométriques sont également corrélés avec le logIC50 : surfacedes liaisons -H (H-bond surface area, r2=0,6406, p=0,0096) et surface hydrophobe des groupesinsaturés (hydrophobic surface area, unsaturated, r2=0,6041, p=0,0137). A l’opposé, la surfacehydrophobe des groupes saturés (hydrophobic surface area, saturated) n’est pas significative-ment correlée avec la toxicité.

La surface partielle négative (PNSA3, r2=0,855, p=4.10−4), la surface partielle positive(PPSA3, r2=0,852, p=4.10−4) et la différence entre le PPSA et PNSA (DPSA3, r2=0,880,p=4.10−4) sont toutes en étroite corrélation avec le logIC50 (fig. 7.7). Ces trois descripteursélectrostatiques montrent que plus il y a de groupes électronégatifs (principalement des atomesd’oxygène) dans la molécule, plus elle est cytotoxique. Ceci peut être expliqué chimiquementpar une augmentation du déficit en électrons de la liaison C=C induite par les groupes OH etC=O, ce qui augmente sa réactivité vis à vis des attaques nucléophiles.

7.4 Conclusion

Cette étude, centrée sur les 4-hydroxy-2-alkénals, vise à expliquer les déterminants molécu-laires de leur toxicité par rapport à des composés chimiquement apparentés. Pour celà, nousavons évalué la capacité des différents composés à induire une toxicité cellulaire. Nous avonsainsi montré que les aldéhydes induisent préférentiellement une nécrose cellulaire, plutôt qu’uneapoptose. Nous avons utilisé une dérivation acétal pour masquer le groupe aldéhyde et prévenirainsi la formation de base de Schiff et d’adduits de Michael. Une toxicité faible comparati-vement aux autres dérivés était donc attendue pour ces composés. Étonnamment, les dérivésdiméthyl-acétals ont une toxicité seulement 10 fois plus faible que les hydroxy-alkénals apparen-tés. Cette toxicité inattendue s’explique par une hydrolyse des dérivés conduisant à la libérationde 4-hydroxy-2-alkénals. La suppression de la double liaison conjuguée avec le groupe aldéhydedans les dérivés alkanals affaibli considérablement la toxicité, ce qui indique que la formationd’adduits de Michael est un facteur déterminant de la toxicité de ces dérivés. De plus, l’ab-

100


A

2

3

4

C50

A

0

1

2

logI

r²=0.8518p=0.0004

0 2 4 6 8 100

PPSA3

B

2

3

4

C50

B

0

1

2

r²=0.8545p=0.0004

logI

-16 -14 -12 -10 -8 -60

PNSA3

4C

2

3

4

gIC

50

0 10 20 300

1

log

r²=0.8801p=0.0002

0 10 20 30DPSA3 (PPSA3 – PNSA3)

Figure 7.7 – Corrélations entre lelogIC50 et les descripteurs moléculairesPNSA3, PPSA3 et DPSA3 après élimi-nation des valeurs des dérivés acétals.Les logIC50 ont été calculés à partir dela figure 7.1 et les descripteurs à partirde l’application PreAdmet. La droite decorrélation (trait plein) et l’intervalle deconfiance à 95% (trait pointillé) ont ététracés à l’aide du logiciel GraphPad Prism

sence du groupe α-hydroxy conduit à une diminution de la toxicité équivalente à celle obtenuepour les dérivés acétal. Dans les hydroxy-alkénals, la présence d’un groupe hydroxyle prochede la double liaison renforce la toxicité. Cet effet pourrait être lié à une solubilité accrue deces aldéhydes. Même si le logIC50 n’est pas corrélé avec le LogP, on peut cependant penserque les cibles de l’adduction de ces molécules pourraient être différentes : membrane plasmiqueou compartiments intracellulaires. Cela serait cohérent avec les résultats obtenus sur l’activitéLDH qui montrent que les dérivés chimiques ne modifient pas la viabilité de la même manière.Différents sites d’adduction pourraient avoir des effets différents sur la viabilité et pourraientdonc expliquer en partie les différences observées. Plus probablement, la présence de groupesOH renforce l’électropositivité de la double liaison et donc accroit sa réactivité vis à vis d’at-taques nucléophiles. En faveur de cette dernière hypothèse, les descripteurs PNSA3, PPSA3 etDPSA3 sont fortement corrélés avec le logIC50 et nous avons montré qu’ils pouvaient être debons prédicteurs de toxicité pour les aldéhydes.

Fait intéressant, au sein de chaque groupe de composés chimiquement apparentés, le plustoxique est toujours le C12 et le moins toxique est toujours le C9. Par conséquent, aucune corréla-tion n’a pu être trouvée avec le poids moléculaire ou le nombre de carbones mais cette différencedémontre clairement que la longueur de la chaîne carbonée est un paramètre important dans lacytotoxicité des aldéhydes lipidiques. Ceci pourrait affecter la balance hydrophobe/hydrophileet ainsi modifier les effets ou les cibles des aldéhydes. La longueur de la chaîne hydrocarbonéepourrait également affecter la détoxification par des enzymes ou des systèmes antioxydants. Enfaveur de cette seconde hypothèse, plusieurs enzymes comme la glutathion S-transférase, oul’aldéhyde déshydrogénase sont en charge de la détoxification des aldéhydes, mais l’acroléine,l’hexénal ou le décadiènal ne sont pas métabolisés avec la même affinité par ces enzymes. Enoutre, il a été montré récemment que le 4-HHE est métabolisé par le glutathion réduit à untaux supérieur au 4-HNE dans le cortex cérébral et l’hippocampe [117].

Les hydroxy-alkénals sont composés d’un alcène lié à un groupe carbonyle. Cette combinaison

101


crée un domaine de carence en électrons au niveau de la double liaison. Par conséquent, leshydroxy-alkénals sont des électrophiles (espèces déficientes en électrons), ce qui est le cas denombreuses substances toxiques in vivo, capables d’interagir de manière covalente avec des ciblesbiologiques nucléophiles tels que les acides aminés. Dans la présente étude, tous les composéstestés sont des électrophiles faibles (LUMO <2,5 eV), et il est possible de les classer en fonctionde ce paramètre :

4-hydroxy-2-alkénals > 2-alkénals > > alkanals > dérivés acétal

Généralement, l’électrophilie est étroitement corrélée aux potentialités toxiques in vitro, cequi est le cas dans nos conditions, après exclusion des valeurs aberrantes liées aux dérivés acétal.En outre, nous avons observé une corrélation positive entre le logIC50 et le nombre de liaisonsC=C et d’accepteurs de Michael. Ceci souligne le fait que leur toxicité est liée à la formationd’adduits de Michael, ce qui a été confirmé par l’analyse de la formation de liaisons covalentessur la BSA. La capacité d’adduction a été classée :

HDE > HNE > HHE=HDEA > DE > HE=NE > HNEA > HHEA=HA=NA=DA

Cette capacité à former des liaisons covalentes sur la BSA est fortement corrélée avec lelogIC50. Ensemble, ces résultats confirment que la toxicité des hydroxy-alkénals et des aldéhydeschimiquement apparentés est probablement attribuable à la formation d’adduits covalent dansles cellules, et particulièrement sur les protéines.

102


Nom PM(g/mol) Formule Structure LogP

trans-4-hydroxy-2-hexénal HHE 114,1 C6H10O2 0,91

trans-4-hydroxy-2-nonénal HNE 156,2 C9H16O2 2,31

trans-4-hydroxy-2-dodécénal HDE 198,3 C12H22O2 3,70

trans-4-hydroxy-2-hexénaldimethylacétal

HHEA 160,2 C8H16O3 0,85

trans-4-hydroxy-2-nonénaldimethylacétal

HNEA 202,3 C11H22O3 2,24

trans-4-hydroxy-2-dodécénaldimethylacétal

HDEA 244,4 C14H28O3 3,63

trans-2-hexénal HE 98,1 C6H10O1 1,93

trans-2-nonénal NE 140,2 C9H16O1 3,32

trans-2-dodécénal DE 182,3 C12H22O1 4,71

hexanal HA 100,2 C6H12O1 2,28

nonanal NA 142,2 C9H18O1 3,68

dodécanal DA 184,3 C12H24O1 5,07

Table 7.1 – Caractéristiques principales des dérivés chimiques testés en relation structure/activité.Le tableau présente pour chaque dérivé le nom complet et l’abréviation utilisée, le poids moléculaire(PM), les formules brute et développée ainsi que le coefficient de partage octanol/eau (logP), refletde son hydrophobicité.

103


Nom IC50 logIC50 Intervalle de confiance (95%)trans-4-hydroxy-2-hexénal 8,7 1,461 1,399 à 1,523trans-4-hydroxy-2-nonénal 53,0 1,725 1,667 à 1,783trans-4-hydroxy-2-dodécénal 28,9 0,938 0,860 à 1,016trans-4-hydroxy-2-hexénal dimethylacétal 128,6 2,109 1,937 à 2,282trans-4-hydroxy-2-nonénal dimethylacétal 665,1 2,823 2,744 à 2,902trans-4-hydroxy-2-dodécénal dimethylacétal 120,6 2,081 1,837 à 2,326trans-2-hexénal 191,1 2,281 2,126 à 2,437trans-2-nonénal 339,7 2,531 2,356 à 2,706trans-2-dodécénal 50,7 1,705 1,435 à 1,974hexanal 816,1 2,912 2,841 à 2,982nonanal 1175,0 3,070 3,015 à 3,125dodécanal 552,5 2,742 2,696 à 2,789

Table 7.2 – IC50 de la viabilité des cellules L6. Les IC50 sont calculées à partir des dose-réponsesreprésentés sur la figure 7.1

Constitutionnels Pearsonr

Intervalle deconfiance (95%)

valeurde p r2

Molecular weight -0.395 -0.8392 to 0.3648 0.2924 ns 0.1562No. C=C bonds -0.777 -0.9507 to -0.2337 0.0137 * 0.6041No. alcohol groups -0.800 -0.9562 to -0.2901 0.0096 ** 0.6402No. C atoms -0.249 -0.7838 to 0.4972 0.5174 ns 0.0622No. O atoms -0.801 -0.9562 to -0.2901 0.0096 ** 0.6402

Physicochimiques Pearsonr


valeurde p r2

SK MP (SK atomic types) -0.896 -0.9782 to -0.5742 0.0011 ** 0.8037LUMO energy 0.811 0.3168 to 0.9586 0.0081 ** 0.6569Water solvation free energy 0.789 0.2640 to 0.9537 0.0113 * 0.6237logP -0.337 -0.8179 to 0.4220 0.3758 ns 0.1133Polarizability -0.299 -0.8035 to 0.4560 0.4350 ns 0.0892

Géométriques Pearsonr


valeurde p r2

H-bond surface area -0.800 -0.9562 to -0.2901 0.0096 ** 0.6402Hydrophobic surface area (unsaturated) -0.777 -0.9507 to -0.2337 0.0137 * 0.6041Hydrophobic surface area (saturated) 0.045 -0.6382 to 0.6887 0.9083 ns 0.0020

Electrostatiques Pearsonr


valeurde p r2

PNSA3 (partial negative surface area) 0.924 0.6740 to 0.9843 0.0004 *** 0.8545PPSA3 (partial positive surface area) -0.923 -0.9840 to -0.6684 0.0004 *** 0.8518DPSA3 (PPSA3 - PNSA3) -0.938 -0.9872 to -0.7269 0.0002 *** 0.8801

Table 7.3 – Corrélations entre la toxicité des hydroxy-alkénals (logIC50) et certains descripteursmoléculaires, après exclusion des valeurs individuelles des dérivés acétals. Les descripteurs ont étécalculés à partir de l’application en ligne preAdmet. Les corrélations ont été effectuées à l’aide dulogiciel Prism

104

Chapitre 8

Discussion générale

Le diabète est une pathologie multifactorielle. Son développement et son évolution ne peuventdonc être expliqués par un seul et unique mécanisme. De nombreuses équipes développent etvalident des théories expliquant chacune en partie la physiopathologie du diabète : prédispo-sitions génétiques, lipotoxicité, glucotoxicité, infections virales ou bactériennes, inflammation(lipopolysaccharides), nutrition, etc. Chacun de ces éléments peut mener au développement del’insulino-résistance, événement majeur dans la physiopathologie du diabète de type 2, maisc’est vraisemblablement l’ensemble de ces facteurs qui conduit au développement de la maladiediabétique.

Il est maintenant bien établi que le stress oxydant joue un rôle causal dans le développementde nombreuses pathologies. Il peut endommager les cellules et les tissus par une attaque directedes biomolécules (glucides, protéines, phospholipides ou ADN), mais aussi via la production denombreux sous-produits de leur dégradation.

Nous nous sommes intéressés dans cette étude au stress oxydant, particulièrement au rôledes 4-hydroxy-2-alkénals, aldéhydes issus de la peroxydation des acides gras polyinsaturés.

Nous avons pu démontrer que le 4-hydroxy-2-hexénal et le 4-hydroxy-2-nonénal peuventinduire une insulino-résistance in vivo par des perturbations de la réponse à l’insuline descellules musculaires et adipeuses.

8.1 Pertinence des concentrations utilisées et du modèle

En conditions physiologiques, la concentration plasmatique de 4-HNE libre dans le plasmaest d’environ 0,5 μM et augmente dans des conditions pathologiques pour atteindre 2 μM (voirtable 1.2, page 24). Dans une étude récente utilisant un nouveau dosage LC-MS/MS, la concen-tration de 4-HNE dans le plasma humain a même été trouvée à 11 μM lors de pathologiespulmonaires [194]. A l’heure actuelle, peu de dosages plasmatiques du 4-HHE sont disponiblesdans la littérature. Dans la présente étude, les concentrations de 4-HHE et de 4-HNE mesuréesdans le plasma de patients diabétiques étaient respectivement de 40 nM et de 50 nM. Chezle rat rendu diabétique par la streptozotocine, nous avons trouvé des concentrations du mêmeordre de grandeur : 13 nM pour le 4-HHE et 65 nM pour le 4-HNE. Que ce soit chez l’hommeou chez le rat, seule la concentration de 4-HHE était différente entre les sujets diabétiques et lescontrôles. Ceci laisse à penser que les dérivés de peroxydation jouent un rôle particulier dans laphysiopathologie du diabète.

105

CHAPITRE 8. DISCUSSION GÉNÉRALE

Il est important de souligner que le dosage par GC-MS ou LC-MS ne détecte que la fractionlibre de 4-HNE, les concentrations mesurées dans ces études sont donc susceptibles de sous-estimer la quantité totale produite à l’intérieur même des cellules ou des tissus. Ainsi, lesconcentrations tissulaires ou cellulaires sont généralement considérées comme plus élevées queles concentrations circulantes, même si, à l’heure actuelle, aucune donnée n’est disponible dansla littérature concernant les niveaux de 4-HHE dans les tissus humains ou animaux. Dans laprésente étude, les concentrations de 4-HHE (10 μM) et de 4-HNE (50 μM) ont été choisiespour simuler de façon réaliste les niveaux qui pourraient être observés dans les tissus dans desconditions physiopathologiques. Ces concentrations sont comparables à celles retrouvées dans laplupart des études in vitro, ou les hydroxy-alkénals sont utilisés à des concentrations de 10 μMà 1 mM.

Muscle, foie et tissu adipeux sont les trois cibles principales de l’insuline dans l’organisme,muscle et tissu adipeux étant particulièrement importants dans le maintien de l’homéostasiedu glucose. Ils sont donc un choix judicieux pour étudier le rôle des dérivés de peroxydationlipidique sur le développement de l’insulino-résistance. Nous avons donc choisi pour cette étuded’utiliser des lignées cellulaires de myoblastes L6 et d’adipocytes 3T3-L1.

8.2 Toxicité des hydroxy-alkénals

Les hydroxy-alkénals sont capables de former des liaisons covalentes avec les protéines parconstitution de bases de Schiff (avec le groupe amino des résidus lysine) et d’adduits de Michael(avec les groupes thiol ou amino des résidus cystéine, lysine ou histidine). Dans la plupart des cas,la modification covalente des protéines altère leurs fonctions biologiques. Il est d’ailleurs couram-ment admis que cette adduction est impliquée dans la cytotoxicité des hydroxy-alkénals. Nousavons donc caractérisé ce stress carbonyle dans les cellules musculaires L6. La mesure de l’ac-cumulation d’adduits de Michael et de la carbonylation des protéines dans les cellules exposéesaux hydroxy-alkénals nous a permis de mettre en évidence la formation dose-dépendante d’ad-duits dans les cellules L6. Par immunofluorescence, nous avons montré la formation d’adduitsde Michael dans tous les compartiments cellulaires et nous avons démontré une carbonylationimportante des protéines cellulaires par le 4-HHE et le 4-HNE.

La comparaison du 4-HHE et du 4-HNE avec d’autres dérivés chimiques de structure parentenous a permis de compléter la caractérisation de leur toxicité. En effet, les dérivés acétals nesont plus capables de former de bases de Schiff et les dérivés alkanals ne sont plus capables deformer d’adduits de Michael. Ces dérivés ont une capacité moindre à former des adduits surles protéines et présentent une toxicité beaucoup plus faible que les hydroxy-alkénals. De plus,nous avons montré une corrélation significative entre la toxicité et la capacité des molécules àcarbonyler les protéines, elle même liée à la présence d’une double liaison C=C (accepteur deMichael). Ceci vient confirmer le fait que la formation d’adduits est un médiateur importantdes effets délétères des hydroxy-alkénals.

Parallèlement, le 4-HHE et le 4-HNE induisent un stress oxydant dans les cellules en aug-mentant la production d’espèces radicalaires de l’oxygène. Ceci pourrait contribuer à une am-plification des effets nocifs des hydroxy-alkénals. De plus, 4-HHE et 4-HNE pertubent significa-tivement la structure des organites intracellulaires comme nous l’avons montré par microscopieélectronique.

En résumé, si la toxicité des hydroxy-alkénals passe vraisemblablement par plusieurs mé-

106


canismes, il est certain que la formation d’adduits covalents sur les protéines est responsablede la majorité de leurs effets délétères. Il a été mis en évidence récemment que dans certainesconditions cellulaires, l’accumulation de protéines de conformation anormale dans le réticulumendoplasmique induit une réponse UPR (unfolded protein response) [55]. En effet, la majo-rité des protéines sécrétées et membranaires sont synthétisées dans le réticulum endoplasmiqueoù elles sont repliées et assemblées avant d’être transportées. Dans le cas d’une augmentationimportante de protéines anormales et/ou d’une augmentation de la synthèse protéique, cetteréponse UPR est déclenchée, ce qui pourrait être le cas après un traitement par le 4-HHE ou le4-HNE.

8.3 Rôle des hydroxy-alkénals dans l’insulino-résistance

Au cours de cette étude, nous avons pu mettre en évidence l’implication des hydroxy-alkénalsdans l’insulino-résistance en montrant trois effets délétères majeurs :

1. L’injection de 4-HHE in vivo induit une insulino-résistance2. Le 4-HHE et le 4-HNE inhibent le transport de glucose in vitro en pertubant les voies de

signalisation de l’insuline dans les cellules musculaires et adipeuses3. Le 4-HHE et le 4-HNE forment des adduits covalents sur l’insuline et perturbent ses

propriétés hypoglycémiantes in vivo et d’activation des voies de signalisation in vitro

8.3.1 Insulino-résistance in vivoNous avons utilisé la méthode de référence de mesure de l’insulino-résistance in vivo : le

clamp hyperinsulinémique euglycémique. Ceci nous a permis de démontrer que l’injection de4-HHE par voie intraveineuse à des rats induit une insulino-résistance. Les GIR nécessairespour maintenir l’euglycémie chez les rats traités au 4-HHE sont très significativement diminuéscomparativement aux animaux ayant reçu une injection de DMSO seul. Nous démontrons ainsipour la première fois un rôle causal du 4-HHE dans le développement et/ou le maintien d’unétat d’insulino-résistance chez le rat. Les dosages que nous avons réalisé chez l’homme montrentque le 4-HHE est augmenté chez les patients diabétiques, il est donc possible que cet aldéhydejoue un rôle important dans la physiopathologie du diabète, d’autant plus qu’il est environ 5fois plus délétère que le 4-HNE sur la base des concentrations actives. Les raisons qu’une telledifférence restent cependant à éclaircir.

8.3.2 Inhibition des voies de signalisation de l’insuline

Nous avons démontré pour la première fois que le 4-HHE inhibe le transport de glucose dansles myoblastes L6 et ce à une concentration 5 fois inférieure au 4-HNE. Dans les adipocytes 3T3-L1, le 4-HHE inhibe également le transport de glucose, mais pour des concentrations équivalentesau 4-HNE. Ce transport de glucose réduit résulte d’une altération des voies intracellulairesde signalisation de l’insuline. En effet, l’activation par phosphorylation de la sérine 473 de laprotéine kinase B (Akt) est inhibée par ces aldéhydes.

Les IRS sont des substrats directs du récepteur et des sites majeurs de régulation de cette voiede signalisation. Ils sont activés par phosphorylation sur tyrosine et inhibés par phosphorylationsur sérine, ce qui permet un réglage précis de la transduction du signal. Il est couramment admis

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qu’une faible inhibition de la phosphorylation sur tyrosine des IRS est suffisante pour inhibertotalement le transport de glucose. Nous avons montré pour la première fois que le 4-HHE inhibela phosphorylation sur tyrosine de l’IRS1, pour une concentration 5 fois moins importante quele 4-HNE. En bon accord avec ces résultats, l’association de la sous-unité régulatrice p85 de laPI3K avec l’IRS1 est également inhibée.

Les voies MAPK sont activées par de nombreux facteurs de stress et il est bien décrit quela phosphorylation de l’IRS-1 sur sérine par ERK et JNK, conduit à une inhibition du signalde l’insuline. Sur les myoblastes L6, nous avons effectivement observé une augmentation del’activation des voies ERK, JNK et p38 par le 4-HHE et le 4-HNE, mais cette activation n’estpas responsable de l’inhibition de la phosphorylation de l’IRS. En effet, la stimulation parl’insuline des MAPK n’est pas différente en présence ou non de 4-HHE ou de 4-HNE, et nousn’avons en conséquence pas recherché de phosphorylations inhibitrices sur l’IRS1. Ainsi, dansnotre modèle, ce n’est pas une activation des voies de stress qui est responsable de la diminutionde la phosphorylation de l’IRS induite par les hydroxy-alkénals.

Contrairement à une étude antérieure sur des adipocytes 3T3-L1, la baisse de la phosphory-lation de PKB/Akt et de l’IRS1 dans notre étude n’est pas due à une diminution de synthèse ouà une augmentation de la dégradation des protéines. En effet, la quantité totale de PKB/Akt etd’IRS-1 est restée inchangée dans nos conditions. Ceci a été démontré également dans d’autresmodèles cellulaires traités avec du 4-HNE en utilisant des concentrations et des temps d’incu-bation proches de ceux présentés dans notre étude [212, 112]. Seuls les travaux de l’équipe deE. Van Obberghen montrent une diminution importante de la quantité totale d’IRS1 et d’Aktdans les adipocytes 3T3-L1 traités avec le 4-HNE [42], laissant supposer une activation d’autresvoies de signalisation.

Ensemble, ces résultats mettent en évidence que les effets toxiques des aldéhydes peuventêtre dus à différents mécanismes :

– L’adduction de l’IRS1 par le 4-HNE a déjà été démontrée [42] et il est possible que lafixation des aldéhydes sur certaines protéines clefs de la voie de signalisation cellulaire,contribue à l’inhibition de cette dernière.

– L’activation de la voie UPR décrite plus haut inhibe le transport de glucose dans lesadipocytes de rats insulino-résistants [143]. Cette réponse UPR pourrait être une consé-quence directe de la présence en grande quantité de protéines adduites par le 4-HHE etle 4-HNE et contribuer à l’inhibition du transport de glucose induit par ces aldéhydes.

– L’induction de la production de radicaux libres par le 4-HHE et le 4-HNE a été démontréedans notre étude, mais également dans d’autres modèles. Les radicaux libres sont connuspour être des inhibiteurs forts de la transduction du signal insuline, et sont potentiellementresponsables d’une part des effets observés [12].

– Certaines voies de signalisation sont activées par le 4-HHE et le 4-HNE [109]. Nous avonsmontré dans cette étude une activation de ERK, JNK et p38. D’autres études confirmentcette activation des MAPK par les hydroxy-alkénals, et montrent également l’activationd’autres voies telles ques PKC ou NF-kB qui pourraient être responsables de l’inhibitionde la phosphorylation de l’IRS.

8.3.3 Altération de la fonction biologique de l’insuline

Nous avons montré que le 4-HHE et le 4-HNE sont capables de former des adduits cova-lents sur l’insuline. La fixation de 1 à 5 molécules d’aldéhyde par molécule d’insuline perturbe

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significativement la fonction biologique de l’insuline, in vivo et in vitro. Ainsi, chez la souris,les insulines modifiées présentent une moindre activité hypoglycémiante. De même, dans lesadipocytes et les myoblates en culture, le transport de glucose induit par les insulines modifiéesest diminué comparativement aux insulines natives.

Cependant, les concentrations de 4-HHE et de 4-HNE nécessaires pour la formation d’adduitssont beaucoup plus importantes que celles observées in vivo, même en conditions pathologiques.Nous avons dans cette étude incubé 2,5 mg/mL d’insuline (0,43 mM) avec 5 mM d’aldéhyde,ce qui correspond à un rapport d’environ 12 molécules d’aldéhyde pour 1 molécule d’insuline.Ce ratio peut être largement atteint in vivo, les concentrations d’insuline étant de l’ordre dupM et celles du 4-HHE de l’ordre du nM. Néanmoins, le plasma contient, outre l’insuline,de nombreuses protéines qui constituent des cibles potentielles de fixation des aldéhydes etentrent donc en compétition avec l’insuline circulante. De plus, la demi-vie de l’insuline dans lacirculation sanguine est de quelques minutes, alors que nous avons montré qu’il faut au moins2 heures pour avoir une adduction importante de l’insuline par le 4-HHE ou le 4-HNE. Tousces éléments montrent qu’une fixation de 4-HHE ou de 4-HNE sur l’insuline dans la circulationsanguine est possible mais peu vraisemblable in vivo.

En revanche, il existe au cours du diabète un stress oxydant important dans les cellules βdu pancréas et une production locale importante de 4-HNE [177, 108, 157]. Il a également étémontré que le 4-HNE est capable d’inhiber la sécrétion d’insuline et d’induire l’apoptose descellules β en culture [136, 192, 93, 27]. Nous pouvons donc émettre l’hypothèse qu’au coursd’un stress oxydant, la concentration locale de 4-HHE et de 4-HNE dans ces cellules pourraitêtre suffisante pour entraîner une adduction de l’insuline lors de sa synthèse. Nous avons misen évidence que les résidus histidine de l’insuline sont des cibles privilégiées d’adduction par le4-HHE et le 4-HNE. Ces résidus sont impliqués dans la cristallisation de l’insuline à l’intérieurdes vésicules sécrétoires en permettant une coordination de 6 monomères d’insuline autour d’unatome de zinc. Ces acides aminés sont donc indispensables pour une bonne organisation dustockage et de la sécrétion d’insuline par les cellules β. Ceci nous permet de supposer qu’unemodification covalente de l’insuline lors de sa synthèse dans le pancréas aurait des effets délétèressur la formation d’hexamères et donc sur le stockage de l’insuline dans les vésicules sécrétoires.Les molécules d’insuline seraient donc modifiées avant même leur sécrétion, diminuant ainsi laquantité d’insuline active pouvant être libérée par le pancréas.

Nous avons mis en évidence dans cette étude que le 4-HHE et le 4-HNE peuvent formerdes adduits covalents sur l’insuline. Ces insulines modifiées présentent une moindre activitébiologique in vivo et in vitro. Ce mécanisme contribue à diminuer la quantité d’insuline activedans l’organisme, notamment dans les situations associées à un stress oxydant, tel que le diabète.Nous proposons donc un nouveau mécanisme pouvant contribuer au développement et/ou àl’entretien de l’insulino-résistance.

8.4 Rôle du glutathion

La détoxification des aldéhydes dans les cellules est réalisée par plusieurs enzymes et sys-tèmes antioxydants, le glutathion et les glutathion S-transférases étant les détoxifiants majeursdu 4-HNE. Comme le 4-HHE et le 4-HNE induisent une diminution significative du GSH,probablement par adduction directe, nous avons émis l’hypothèse qu’une augmentation phar-macologique de GSH pourrait protéger les cellules. Ainsi, le prétraitement des cellules avec du

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D3T permet une réversion totale des effets délétères du 4-HHE et du 4-HNE sur le transportde glucose, ce qui démontre que l’augmentation de GSH peut contrebalancer la résistance àl’insuline induite par les hydroxy-alkénals.

L’hypothèse principale que nous avons faite à la vue de ces résultats est que le 4-HHE et le4-HNE forment préférentiellement des adduits sur le GSH, ce qui conduit à leur détoxification.Lorsque le pool de GSH est totalement consommé, le 4-HHE et le 4-HNE forment alors desadduits sur les autres biomolécules présentes, notamment les protéines, ce qui conduit à unedysfonction globale du métabolisme cellulaire. En conséquence, une augmentation du GSHdans les cellules permettrait simplement de séquestrer le 4-HHE et le 4-HNE et de prévenirla formation d’adduits sur les protéines clés, par exemple celles impliquées dans les voies designalisation de l’insuline. Cette hypothèse est confirmée par l’effet bénéfique obtenu avec desantioxydants tels que la NAC, l’AGD ou la SAMe connus pour augmenter le GSH ou agircomme agents chélateurs d’aldéhydes. Ces résultats pourraient pemettre d’envisager de nouvellesstratégies pharmacologiques et/ou nutritionnelles afin de diminuer l’impact délétère des produitsde peroxydation lipidique.

8.5 Perspectives

Le 4-HHE et le 4-HNE ne sont bien évidement pas les seuls déterminants du développementde l’insulino-résistance. Cependant, nous apportons plusieurs éléments nouveaux concernant lerôle physiopathologique de ces dérivés au cours du diabète. Nous avons ainsi montré pour lapremière fois que ces aldéhydes dérivés des acides gras insaturés peuvent induire une insulino-résistance in vitro et in vivo et diminuer l’action biologique de l’insuline in vivo.

La présente étude permet donc de caractériser les effets nocifs d’une élévation des concen-trations circulantes et tissulaires des dérivés de peroxydation lipidique. Etant donné l’originede ces dérivés, cette étude pointe également du doigt les effets délétères que peuvent avoir lesacides gras polyinsaturés lorsqu’ils sont exposés à des situations associées à un stress oxydantimportant. Ensemble, ces résultats permettent d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiquesde traitement du diabète, visant à diminuer la production de dérivés toxiques du stress oxydant.

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Stress oxydantAntioxydants

GlutathionChélateurs

Adduits covalents

44 HHE, 4HHE, 4 HNEHNE

Adduits covalents

InsulineProtéinescellulaires

Circulation PancréasMuscle Tissu adipeux

Miwa et al. 2000,Demozay et al. 2009,

Activité biologiquede l’insuline

Stockage etsécrétion d’insuline

Voies de signalisation de l’insulineIRS/Akt

EndocrinologyDiabetes

InsulinoInsulino résistancerésistanceDiabètesDiabètes

Figure 8.1 – Synthèse de l’étude : hypothèses, résultats, et expériences validées pard’autres équipes.

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131

Annexes

Anticorps Fournisseur/référence Utilisation Dilutionp-Akt1/2/3 (Ser 473) Santa Cruz sc-7985 WB, 16H à 4°C 1/1000, 5% BSAAkt1/2/3 Santa Cruz sc-8312 WB 1/1000, 5% BSAIRS-1 (C-20) Santa Cruz sc-559 IP 5 μg/échantillonAnti-IRS-2 Millipore 06-506 IP 5 μg/échantillonp-Tyr (PY99) Santa Cruz sc-7020 WB, 16H à 4°C 1/1000, 3% BSAAnti-PI3 Kinase, p85 Millipore 06-497 WB 1/1000, 3% BSAPhospho-p38 MAPK Cell Signaling 9211 WB, 16H à 4°C 1/1000, 5% BSAp38 MAP Kinase Cell Signaling 9212 WB 1/1000, 5% BSAPhospho-SAPK/JNK Cell Signaling 4668 WB, 16H à 4°C 1/1000, 5% BSASAPK/JNK Cell Signaling 9258 WB 1/1000, 5% BSAp-ERK (E-4) Santa Cruz sc-7383 WB, 16H à 4°C 1/1000, 5% BSAAnti-α-Tubuline Sigma Aldrich T6074 WB 1/1000, 3% BSAAnti-HNE-Adducts Calbiochem 393207 WB/IF, 16H à 4°C 1/1000, 3% BSAAnti-HHE Adducts CosmoBio N213730-EX WB/IF, 16H à 4°C 1/1000, 3% BSAGoat Anti-Mouse IgG BioRad 172-1011 Anticorps secondaire, 1H 1/10 000Goat Anti-Rabbit IgG BioRad 172-1019 Anticorps secondaire, 1H 1/10 000

Table 8.1 – Anticorps utilisés lors des expérimentations. Toutes les dilutions sont effectuées dans dutampon TBS contenant 0,1% (v/v) Tween-20. WB= Western Blot, IP= immunoprécipitation, IF=immunofluorescence

132

BIBLIOGRAPHIE

Nom

Nb

C=

CN

bC

-ON

bac

cept

eurs

deM

icha

elL

UM

OP

NSA

3P

PSA

3D

PSA

3W

NSA

3

HH

E1

11

-0,3

2-1

3,85

7,95

21,7

9-2

,01

HN

E1

11

-0,3

5-1

4,39

8,45

22,8

4-2

,84

HD

E1

11

-0,3

7-1

4,88

8,93

23,8

1-3

,70

HH

EA

15

01,

51-1

0,59

16,1

126

,70

-2,1

7H

NE

A1

50

1,54

-11,

1016

,59

27,6

9-2

,85

HD

EA

15

01,

56-1

1,59

17,0

728

,67

-3,5

8H

E1

01

-0,2

7-1

1,12

4,13

15,2

5-1

,51

NE

10

1-0

,25

-11,

624,

6116

,23

-2,1

7D

E1

01

-0,2

5-1

2,11

5,09

17,2

1-2

,89

HA

00

00,

80-6

,66

2,43

9,09

-0,9

1N

A0

00

0,80

-7,1

52,

9210

,07

-1,3

5D

A0

00

0,78

-7,6

43,

4011

,04

-1,8

4

Table 8.2 – Valeurs individuelles des descripteurs moléculairesutilisés en corrélation avec le logIC50 pour les dérivés chimiques

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