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N° d'ordre : 97 ISAL0129 Année1997

THESE

Présentée devantL'INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON

Pour obtenirLE GRADE DE DOCTEUR

Spécialité BIOCHIMIE

parAlexia ZAKAROFF, épouse GIRARD

DEA de Biochimie

REGULATIONS CROISEES ENTRE SIGNALISATION LIPIDIQUE ETSIGNALISATION DÉPENDANT DES NUCLÉOTIDES CYCLIQUES

DANS L'ACTIVATION LYMPHOCYTAIRE :RÔLE DE L'ACIDE PHOSPHATIDIQUE.

Soutenue le 19 Décembre 1997 devant la commission d'examen

Jury : Mme le Dr. B. GENY (Rapporteur)M. le Pr. M. LAGARDEM. le Dr. G. NEMOZMme le Dr. A.F. PRIGENTM. le Dr. J.S. SAULNIER-BLACHEM. le Dr. C. SETTE (Rapporteur)

Cette thèse a été préparée au Laboratoire de Biochimie et Pharmacologie de l'INSA de LYON

6

A mes parents,Votre affection, vos conseils et votre soutien moral et financier ont contribué à

l'aboutissement de ce travail, ainsi qu'à ce que je suis aujourd'hui.

A Frédéric,avec tout mon Amour.

A Stéphanie et Claire,avec ma plus grande tendresse.

A tous ceux qui me sont chers.

7

Les recherches qui font l'objet de ce mémoire ont été effectuées dans le laboratoire de

Biochimie et Pharmacologie de l'INSA de Lyon, Unité INSERM 352, dirigé par Monsieur le

Professeur Michel Lagarde. Qu'il trouve ici l'expression de ma reconnaissance pour la

confiance qu'il m'a accordée en m'accueillant dans son laboratoire, pour ses suggestions et ses

critiques éclairées, ainsi que pour l'intérêt qu'il a porté à ce travail.

Un grand merci à Madame Annie-France Prigent pour la qualité de son

encadrement. Ses compétences scientifiques, mais aussi ses qualités humaines ont été des

éléments précieux pour l'avancement de ce travail. Je lui suis reconnaissante pour sa patience,

ses encouragements, sa sympathie, sa disponibilité à tout moment, et pour avoir su m'orienter

et me conseiller dans mes travaux.

Je tiens à remercier Madame le Docteur Blandine Geny pour avoir bien voulu juger

ce travail en tant que rapporteur. Qu'elle veuille bien trouver ici l'expression de ma

considération.

Desidero ringraziare sentimentate il Professore Claudio Sette per la sua cortesia

dimostrata negli esaminare l'allegata tesi e di essersi reso disponibile come membro della

commissione giudicante. Distinti saluti.

Monsieur le Docteur Jean-Sébastien Saulnier-Blache a bien voulu participer au jury

de cette thèse. Je suis très honorée de sa présence, et je lui adresse mes remerciements les plus

sincères.

Mes remerciements vont également à Monsieur le Docteur Georges Némoz qui m'a

fait bénéficier de ses connaissances et conseils avisés, et a accepté de participer au jury de

cette thèse.

Merci beaucoup, Nadia, pour ton aide technique lors de mon arrivée au laboratoire. Tu

m'as transmis une grande partie de ton savoir, et j'ai eu énormément de plaisir à travailler avec

toi.

8

Encore merci à Olga et aux Madeleine"s" pour leur sympathie et leurs

encouragements tout au long de ce travail.

Je salue les Lipha's Girls pour leur humour et leur bonne humeur.

Un grand merci à Mathias pour les "Western-Blot" et toute mon amitié pour le reste.

Mes vifs remerciements à Mademoiselle Laurence Lopez pour l'efficacité et la

gentillesse dont elle a fait preuve lors de la saisie et la mise en page de ce mémoire.

Enfin, je ne saurais oublier tout le personnel et mes camarades de laboratoire, pour

l'aide précieuse et constante que j'ai pu trouver auprès d'eux.

9

Le travail présenté dans ce mémoire a fait l'objet de publications parues, soumises ou

en préparation. Certains résultats ont également été présentés lors de congrès scientifiques. En

voici les références :

Publications scientifiques :

A. Zakaroff-Girard , M. Gilbert, M. Lagarde and A.F. Prigent. Tyrosine phosphorylations

and G proteins are involved in the triggering of a PLD pathway by 12(S)-HETE in activated

human mononuclear cells. En préparation.

A. Zakaroff , S. El Bawab, G. Nemoz, M. Lagarde and A. F. Prigent. Phosphatidic acid and

cyclic nucleotide phosphodiesterase activity relationships in control and activated human

peripheral blood mononuclear cells. En révision, J. Cell. Physiol.

A. Zakaroff , N. Meskini, C. Joulain, G. Némoz, M. Lagarde and A.F. Prigent. 12(S)-HETE

primes a phospholipase D pathway in activated human mononuclear cells.

Frontiers in Bioactives Lipids, Ed Vanderhoek, Plenum Press, New-York, 291-297 (1996).

N. Meskini, A. Zakaroff, C. Joulain, G. Némoz, M. Lagarde and A.F. Prigent. Triggering of a

phospholipase D pathway upon mitogenic stimulation of human peripheral mononuclear cells

enriched with 12-(S)-hydroxyicosatetraenoic acid. Eur. J. Biochem. 233, 907-915 (1995)

Participation à des congrès :

A. Gysembergh, J. Loufoua, A. Zakaroff-Girard , A.F. Prigent, Y. Minaire, M. Lagarde and

M. Ovize. Stimulation of PLD alters diacylglycerol production and preconditions the rabbit

heart. 70th scientific sessions of the American Heart Association. Orlando, 9-12 Novembre

1997.

S. Bechoua, A. Zakaroff-Girard , M. Dubois, G. Némoz, M. Lagarde et A.F. Prigent. Les

acides docosahexaénoïque et 12-hydrxyeicosatétraénoïque stimulent la PLD lymphocytaire

avec des effets opposés sur le taux d'acide phosphatidique. Congrès du GERLI, Paris, 11 & 12

Septembre 1997.

10

M. Lagarde, C. Calzada, A. Zakaroff , N. Meskini, A. F. Prigent and E. Vericel. Biological

relevance of the lipoxygenase pathway for platelets and lymphocytes functions.International

conference on lipoxygenases and their products : biological functions, Malte, 21-24 Mai 1997.

A. Gysembergh, A. Zakaroff , A.F. Prigent, Y. Minaire, X. André-Fouët, M. Lagarde, M.

Ovize. Enhanced production of Diacylglycerol, the natural activator of protein kinase C, in the

preconditioned rabbit heart. 69th scientific sessions of the American Heart Association,

Nouvelle Orléans, 10-13 Novembre 1996.

A. Zakaroff , N. Meskini, C. Joulain, G. Nemoz, M. Lagarde and A.F. Prigent. 12-(S)-HETE

primes a phospholipase D in activated human lymphocytes. 13ème Congrès du Groupe de

Réflexion sur la Recherche Cardiovasculaire (GRRC), Lyon, 2 & 3 Avril 1996.

11

SOMMAIRE

SOMMAIRE p.11

LISTE DES ABREVIATIONS p. 19

INTRODUCTION p. 20

RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES p. 24

I- Le système immunitaire. p. 25

II- L'activation lymphocytaire. p. 27

II-1 La transmission du signal. p. 27

a) Les phosphorylations-déphosphorylations de tyrosine.

b) L'hydrolyse des phosphatidylinositols par la PLCγ1.

c) Le rôle du calcium dans la transmission du signal.

d) Les protéines kinases C.

e) La voie p21-ras/MAP-kinase.

II-2 Le rôle des nucléotides cycliques. p. 36

a) Implication de l'AMPc dans l'activation lymphocytaire.

b) Implication du GMPc dans l'activation lymphocytaire.

III- Voies de formation et effets cellulaires de l'acide phosphatidique. p. 42

III-1 Les voies de formation du PA. p. 42

12

a) La voie PLC-DAG-Kinase.

Les phospholipases C.

Les DAG-kinases et les Phosphatidate phosphohydrolases.

b) La voie PLD.

Régulation de la PLD par la PKC.

Régulation de la PLD par les ions calcium.

Régulation de la PLD par ARF.

Régulation de la PLD par les protéines Rho.

Régulation de la PLD par le PIP2.

Régulation de la PLD par les tyrosine-kinases solubles.

III-2 Le rôle physiologique du PA. p. 56

a) Le PA et les flux de calcium.

b) Le PA et les Phospholipases C.

c) Le PA et les Protéines Kinases C.

d) Le PA et la voie MAP-Kinase.

e) Le PA et les kinases lipidiques.

f) Le PA et la NADPH oxydase des neutrophiles.

g) Le PA et la prolifération induite par des facteurs de croissance.

h) Existe-t-il un récepteur pour le PA?

IV- Les phosphodiestérases des nucléotides cycliques (PDEs). p. 65

IV-1 Les différentes familles de PDE. p. 67

a) La PDE de type 1 stimulée par le complexe calcium/calmoduline.

b) La PDE de type 2 stimulée par le GMPc.

c) La PDE de type 3 inhibée par le GMPc.

d) La PDE de type 4 spécifique de l'AMPc.

e) La PDE de type 5 spécifique du GMPc.

f) La PDE de type 6 des photorécepteurs spécifique du GMPc.

g) La PDE de type 7 spécifique de l'AMPc et insensible au Rolipram.

IV-2 Les PDEs dans les cellules lymphoïdes. p. 72

IV-3 Rôle des acides gras sur l'activité PDE. p. 73

V- Altérations du système immunitaire au cours du vieillissement et p. 75

péroxydation lipidique : implication du 12-HETE.

13

V-1 La réponse immune et le vieillissement. p. 75

V-2 Vieillissement et peroxydation lipidique. p. 76

V-3 Le 12-HETE. p. 77

a) Le 12-HETE et les voies de signalisation.

Le calcium.

Les protéines kinases C.

b) Le 12-HETE et la réponse immune.

OBJECTIFS DU TRAVAIL EXPERIMENTAL p. 82

MATERIELS & METHODES p. 84

I- Produits. p. 85

I-1 Produits inertes. p. 85

I-2 Produits radioactifs. p. 86

II- Appareils. p. 87

METHODES p. 88

I- Préparation cellulaires. p. 88

I-1 Préparation des cellules mononucléées humaines du sang périphérique. p. 88

I-2 Activation mitogénique des cellules mononucléées. p. 90

I-3 Lyse des cellules. p. 90

a) Lyse des cellules en vue du dosage d'activité phosphodiestérase.

b) Lyse des cellules en vue du "western-blotting".

II- Méthodes biochimiques. p. 91

II-1 Dosages des protéines. p. 91

a) Dosages des protéines dans les expérience de dosage d'activité PDE.

b) Dosages des protéines en vue des expériences de "western-blotting".

14

II-2 Mesure de l'activité phosphodiestérase des nucléotides cycliques p. 92

(E.C.3.1.4.17).

a) Principe du dosage.

b) Protocole de dosage.

II-3 Dosage de l'AMPc. p. 92

II-4 Mesure des tyrosine phosphorylations par "western-blotting". p. 93

a) Electrophorèse et transfert.

b) Immunodetection.

c) Quantification des protéines.

III- Tests de prolifération. p. 94

IV- Marquage et stimulation des cellules. p. 94

IV- 1 Marquage des cellules. p. 94

IV- 2 Stimulation mitogénique. p. 95

V- Analyses lipidiques. p. 95

V-1 Extraction lipidique. p. 95

V-2 Mise au point d'un système de séparation du PA fiable en vue de p. 95

la quantification par analyse d'image.

V-3 Séparation du phosphatidylalcool. p. 97

VI- Etude de l'effet du 12(S)-HETE sur la production de PA par p. 99

les cellules mononucléées humaines.

VI-1 Influence du 12(S)-HETE sur la production de PA par les PBMC p. 99

marquées au [3H]-AA et stimulées ou non par la Con A.

VI-2 Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par p. 99

les cellules mononucléées enrichies en [3H]-12(S)-HETE et stimulées

ou non par la Con A.

15

VI-3 Analyse de la composition en acides gras du PA par chromatographie p. 99

en phase gazeuse sur colonne capillaire (CPG).

VI-4 Effets du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans les PBMC p. 100

activées ou on par la Con A.

VI-5 Etudes des sites de liaison spécifique du 12(S)-HETE sur les lymphocytes p. 100

T purifiés.

a) Principe.

b) Préparation des lymphocytes T purifiés.

c) Protocole.

RESULTATS p. 102

Chapitre I : p. 103

Production et voies de synthèse de l'acide phosphatidique dans les

cellules mononucléées stimulées par la concanavaline A (Con A).

I- Effets de la Concanavaline A (Con A) sur la synthèse de PA et de p. 104

DAG par les cellules prémarquées à l'acide arachidonique tritié.

I-1 Marquage des cellules mononucléées au repos par une dose traceuse p. 104

d'acide arachidonique tritié.

I-2 Variations de la production de PA et de DAG radiomarqués en fonction p. 104

de la durée de stimulation des cellules mononucléées humaines par la Con A.

II- Effet de la Con A sur la synthèse de PA en masse dans les cellules p. 104

mononucléées humaines.

III- Recherche d'une voie PLD dans la production de PA induite par la p. 108

Con A dans les cellules mononucléées humaines.

III-1 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou p. 108

en présence d'éthanol dans les cellules prémarquées à l'acide arachidonique.

III-2 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PEt-[3H]-arachidonate. p. 110

III-3 Marquage des cellules mononucléées au repos par de l'acide oléïque tritié. p. 112

16

III-4 Effet de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou en présence d'éthanol p. 112

dans les cellules mononucléées humaines prémarquées à l'acide oléïque tritié.

III-5 Effet de la Con A et du TPA sur la production de PEt-[3H]-oléate. p. 114

IV- Implication d'une voie PI-PLC/DAG-Kinase dans la production de p. 114

PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées humaines.

IV-1 Effet du R59022 sur la synthèse de PA induite par la Con A dans les p. 116

cellules mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.

IV-2 Effet de la génistéine sur la synthèse de PA induite par la Con A dans p. 117

les cellules mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.

VIII- Discussion. p. 118

Chapitre II : p. 120

Corrélations entre la production d'acide phosphatidique et

les activités phosphodiestérases des nucléotides cycliques

dans les cellules mononucléées humaines témoins ou activées

I- Synthèse d'acide phosphatidique (PA) dans les cellules p. 121

mononucléées stimulées par les différents agonistes.

II- Effet de la stimulation des cellules mononucléées par les trois p. 121

agonistes sur leurs activités phosphodiestérases des nucléotides

cycliques.

III- Corrélations entre la quantité de PA et l'activité PDE dans les p. 124

cellules mononucléées témoins et activées.

IV- Effet de l'éthanol sur la production de PA et la stimulation des p. 124

activités PDE induites par le TPA.

V- Effet inhibiteur dose-dépendant du composé R59022 sur la production p.126

de PA et la stimulation des activités PDE induites par la Con A.

VI- Effet du composé R59022 sur la prolifération des cellules p. 126

mononucléées humanies induite par la Con A.

17

VII- Variations des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées en p. 130

fonction de la durée de stimulation par l'OKT3 ou la Con A.

VIII- Etude pharmacologique des isoformes de PDE stimulées par p. 133

les différents agonistes dans les cellules mononucléées.

VIII- Discussion. p. 135

Chapitre III : p. 139

Modulation de la production d'acide phosphatidique par l'acide

12(S)-hydroxyeicosatétraènoïque (12(S)-HETE).

I- Effet du 12(S)-HETE sur la production de DAG et de PA par p. 140

les cellules mononucléées humaines stimulées ou non par la Con A.

II- Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par p. 141

les cellules mononucléées marquées au [3H]-12(S)-HETE, en présence

ou non de Con A.

III- Composition en acides gras du PA produit par les cellules p. 144

mononucléées enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées

par la Con A.

IV- Implication d'une voie phospholipase D dans la production de PA p. 146

induite par le 12(S)-HETE.

V- Effet de différents inhibiteurs sur la production de p. 149

phosphatidylbutanol par les cellules mononucléées enrichies ou non

en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A en présence de butanol-1.

V-1 Effet de la Calphostine C. p. 149

V-2 Effet de la Génistéine. p. 149

VI- Effets du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans p. 152

les cellules mononucléées humaines activées par la Con A.

18

VII- Effet de la suramine sur la production de PA induite par la Con A p. 156

dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE.

VIII- Mise en évidence de sites de liaison du 12(S)-HETE sur les p. 158

cellules mononucléées ou les lymphocytes T humains purifiés.

VIII-1 Etude de la fixation spécifique du 12(S)-HETE tritié en fonction du p. 158

temps sur les cellules mononucléées humaines.

VIII-2 Etude de la fixation du 12(S)-HETE tritié en fonction du nombre p. 161

de cellules.

VIII-3 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux cellules p. 161


VIII-4 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes T p. 161

humains purifiés.

VIII-5 Comparaison des courbes de déplacement du 12(S)-HETE tritié par p.164

du 12(S)-HETE non marqué et par d'autres acides gras ou lipides dans les

lymphocytes T humains purifiés.

VIII- Etude des caractéristiques des sites de liaison au 12(S)-HETE dans les p. 166

lymphocytes T purifiés.

a) Effet du GTPγS sur la liaison du 12(S)-HETE aux membranes de


b) Effet de la toxine pertussique (PTX) sur la liaison du 12(S)-HETE

aux


c) Effet de la suramine sur la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes

T

humains purifiés.

IX- Discussionp. 170

CONCLUSION ET PERSPECTIVES p. 174

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES p. 178

19

LISTE DES ABREVIATIONS

AA acide 5,8,11,14-eicosatétraènoïque ou acide arachidoniqueADN acide désoxyribonucléiqueADNc ADN complémentaireAMPc 3',5'-adénosine monophosphate cycliqueARN acide ribonucléiqueARNmARN messagerBHT butyl-hydroxy-toluèneBSA sérum albumine bovineCaM calmodulineCCM chromatographie sur couche minceCMH complexe majeur d'histocompatibilitéCon A concanavaline ACPG chromatographie en phase gazeuseDAG diacylglycérolDGK diacylglycérol kinaseEDTA acide éthylènediamine tétraacétiqueEGTA acide éthylèneglycol tétraacétiqueGMPc 3',5'-guanosine monophosphate cycliqueHEPES acide hydroxy-2-éthyl-4-pipérazinyl-1,2-éthane-sulfoniqueHETE acide hydroxyeicosatétraènoïqueHPETE acide hydroperoxyeicosatétraènoïqueIL interleukineIP3 inositol trisphosphateNADPH dihydrodicotinamide adénine dinucléotide phosphateNO monoxyde d'azotePA acide phosphatidiquePAP phosphatidate phosphohydrolasePBMC cellules mononucléées du sang périphériquePBS phosphate buffer salinePC phosphatidylcholinePDE phosphodiestérase de nucléotides cycliquesPE phosphatidyléthanolaminePG prostaglandinePI phosphatidylinositolPIP2 phosphatidylinositol biphosphatePKA protéine kinase AMPc-dépendantePKC protéine kinase CPKG protéine kinase GMPc-dépendantePL phospholipidePLA2 phospholipase A2PLC phospholipase CPLD phospholipase DPMSF fluorure d'acide phénylméthylsulfoniquePRP plasma riche en plaquettesPS phosphatidylsérinePTK protéine tyrosine kinase

20

TCR récepteur à l'antigène de la cellule TTPA tétradécanoyl-12, acétate-13 phorbolTRIS tris (hydroxyméthyl)-amino-méthane

21

II NNTTRROODDUUCCTTII OONN

22

Le système immunitaire est conçu pour fournir à l'organisme un mécanisme

dynamique et flexible permettant de répondre spécifiquement à des variétés d'antigènes qui

menacent l'intégrité et l'homéostasie de l'organisme. Le fonctionnement correct du système

immunitaire est le résultat d'une communication synergique entre les différentes populations

et sous-populations immunitaires. La production de nombreuses cytokines et les interactions

cellulaires assurent la coordination de ces réponses, les lymphocytes T auxiliaires jouant un

rôle clé dans cette partition.

L'activation des lymphocytes est initiée par l'association d'un agent antigénique ou

mitogénique avec son récepteur spécifique. Une série complexe de signaux biochimiques est

alors transmise vers le cytoplasme et le noyau, déclenchant ainsi la réponse cellulaire

appropriée.

L'interaction de l'antigène avec son récepteur spécifique (TCR : T cell antigen-

receptor) sur la membrane des lymphocytes T conduit à l'activation d'une phospholipase C(PLC) qui hydrolyse le phosphatidylinositol-4, 5-diphosphate (PIP2) pour donner du

diacylglycérol (DAG) et de l'inositoltriphosphate (IP3), deux seconds messagers

intracellulaires. En effet, le DAG active la protéine kinase C (PKC) et l'IP3 permet la

libération du calcium (Ca2+) à partir des réserves intracellulaires. Le DAG peut ensuite être

phosphorylé par une DAG-kinase pour conduire à la formation d'acide phosphatidique (PA).

Plusieurs travaux récents montrent par ailleurs une hausse rapide du taux

intracellulaire d'acide phosphatidique au cours de l'activation lymphocytaire (Bismuth et al.,

1988; Pelassy et al., 1991; Marcoz et al., 1993a) et son implication dans diverses voies de

signalisation. Ainsi, le rôle potentiel de ce composé comme second messager de différentes

hormones (Putney et al., 1980) ou cytokines (Cano et al., 1992) semble de plus en plus étayé

et des arguments expérimentaux de plus en plus nombreux confirment l'effet mitogène de

l'acide phosphatidique dans de nombreux types cellulaires.

Un autre facteur régulateur est souvent mis en cause dans le contrôle de la prolifération

cellulaire : il s'agit de l'adénosine 3'-, 5'-monophosphate cyclique (AMPc) qui est maintenant

reconnu comme un signal inhibiteur de la réponse lymphoproliférative (Hadden et Coffey,

1982; Kammer, 1988). Le taux intracellulaire d'AMPc est contrôlé en partie par la

phosphodiestérase des nucléotides cycliques (PDE) qui met fin à son activité biologique.

Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que l'activation de lymphocytes murins

23

ou humains induit une hausse substantielle et rapide de l'activité d'une isoforme particulière

de PDE (type 4) prépondérante dans les cellules lymphoïdes, cette stimulation contribuant

vraisemblablement à maintenir un taux faible d'AMPc lors des étapes précoces de l'activation.

Il a été montré, d'autre part, que l'activation de la PDE est postérieure à la hausse de PA. En

outre, le PA est capable de stimuler, in vitro, l'activité de cette même isoforme de PDE,

sensible à la Concanavaline A (Con A), mimant ainsi l'effet des mitogènes. Ces résultats ont

conduit à l'hypothèse d'un lien probable entre la hausse précoce de PA induite par les

mitogènes et la hausse d'activité PDE qui lui fait suite.

Différentes voies de synthèse du PA ont été décrites dans la littérature pour divers

types de cellules. Elles impliquent :

-- soit la phosphorylation de 1,2-sn-DAG par une DAG-kinase,

-- soit l'hydrolyse de phospholipides, en particulier la phosphatidylcholine (PC) ou la

phosphatidyléthanolamine (PE) par une phospholipase D (PLD),

-- soit l'acylation de lyso-PA par une acyltransférase spécifique.

L'importance relative des divers mécanismes est très différente d'un type cellulaire à l'autre et

diffère également en fonction de la nature du mitogène utilisé. S'il est bien admis maintenant

que la synthèse de PA est stimulée lors de l'activation mitogénique, une controverse demeure

concernant les voies de synthèse plus particulièrement impliquées lors de la mitogenèse.

Notre premier objectif a été de rechercher la (ou les) voie(s) de signalisation

conduisant à la production de PA dans les cellules mononucléées humaines stimulées par la

Con A. La mise au point d'un système de séparation et de quantification fiable des

phospholipides, à la fois en pourcentage de radioactivité et en masse, nous a permis d'aboutir

à plusieurs résultats importants. Ainsi, l'utilisation de différents marqueurs radioactifs et de

divers inhibiteurs (inhibiteur de DAG-kinase, inhibiteurs de tyrosine-kinase, inhibiteur de

PLD) nous a permis d'étudier dans de bonnes conditions les diverses voies de synthèse du PA

dans les cellules mononucléées humaines lors de l'activation mitogénique(Chapitre I ). Outre

la Con A, d'autres stimuli, en particulier un anticorps monoclonal dirigé contre le complexe

CD3 du TCR, l'OKT3, et l'ester de phorbol TPA, ont également été utilisés pour augmenter le

taux de PA intracellulaire (Chapitre II ).

L'équipe ayant déjà démontré, lors d'études in vitro, que le PA est capable de stimuler

l'activité PDE, nous avons décidé d'étudier parallèlement sur des lymphocytes en culture à la

fois la production de PA induite par les différents stimuli (Con A, TPA, OKT3), l'activité

PDE et les taux de nucléotides cycliques, en particulier l'AMPc (Chapitre II ).

L'intérêt de ce travail est de démontrer une augmentation du taux intracellulaire de PA et une

stimulation d'activité PDE dans une même population cellulaire sous l'influence d'un

mitogène donné, l'établissement d'une corrélation positive entre ces deux paramètres

24

constituant un argument fort en faveur du rôle physiologique du PA dans le contrôle de la

mitogenèse via l'activation de la PDE.

L'autre partie de ce travail a consisté à étudier cette relation PA-PDE dans un modèle

expérimental mimant une situation physiologique particulière, le vieillissement. Il s'agit de

cellules mononucléées humaines enrichies en 12(S)-HETE, dérivé monohydroxylé issu de

l'acide arachidonique par la voie 12-lipoxygénasique.

En effet, il a été montré que la production de 12(S)-HETE augmente avec l'âge dans

les cellules mononucléées périphériques humaines (Meskini et al., 1993) et que cette

production accrue de 12(S)-HETE s'accompagne d'une diminution importante de l'activité

PDE dans ces cellules comparativement aux cellules de témoins jeunes (Meskini et al., 1990).

Or, la réponse lymphoproliférative (Nagel et al., 1988) et les activités PDE (Meskini et al.,

1990) sont fortement diminuées chez les personnes âgées. Notre équipe a également montré

que l'activation par la Con A de PDE dans des cellules de témoins jeunes est diminuée par le

12(S)-HETE (Joulain, 1994). De plus, le 12(S)-HETE exogène inhibe la réponse proliférative

aux mitogènes des cellules mononucléées en culture (Joulain et al., 1995). Ce composé est

également connu pour son rôle inhibiteur de la DAG-kinase dans les cellules endothéliales

(Friedlander et al., 1990), ce qui pourrait induire une diminution de la production de PA à

partir du DAG.

Tous ces résultats suggèrent que chez les personnes âgées, le maintien d'un taux basal

élevé de 12(S)-HETE pourrait conduire à une diminution du taux de PA synthétisé et il nous a

semblé pertinent de déterminer si l'effet inhibiteur de PDE du 12(S)-HETE pouvait être

transmis par une diminution de la production de PA (Chapitre III ). D'autre part, le 12-HETE

en s'estérifiant dans les phospholipides membranaires pourrait conduire à la formation de

seconds messagers modifiés, et en particulier des PA modifiés, incapables d'assurer une

transmission correcte des signaux d'activation.

La dernière étape de ce travail a été consacrée à l'étude des mécanismes impliqués

dans l'effet du 12-HETE sur la production de PA dans les lymphocytes stimulés par la Con A.

Nous avons tenté de déterminer si le 12-HETE agissait de manière extracellulaire ou

intracellulaire. En effet, le 12-HETE estérifié dans les membranes cellulaires est relargué dans

le milieu extracellulaire lors de l'activation par la Con A. Ainsi, un mode d'action par

l'intermédiaire d'un récepteur membranaire serait envisageable. Des expériences de "binding"

utilisant du [3H]-12-HETE comme ligand et de compétition par différents agonistes ont

permis de déterminer s'il existait des sites spécifiques de liaison au 12(S)-HETE à la surface

des lymphocytes et d'en préciser leur nature. Enfin, l'utilisation de divers inhibiteurs

(inhibiteurs de tyrosine-kinase, inhibiteurs de PKC) semble indiquer que cet effet pourrait

impliquer des phosphorylations de résidus tyrosines. Nous avons donc recherché quelles

protéines pouvaient être tyrosine-phosphorylées au cours de ce phénomène par l'utilisation

d'anticorps spécifiques anti-phosphotyrosine.

25

RRAAPPPPEELLSSBBII BBLLII OOGGRRAAPPHHII QQUUEESS

26

I- Le système immunitaire.

La défense des organismes supérieurs contre des agents étrangers (virus, bactéries,

champignons) est assurée par leur système immunitaire. Le rôle du système immunitaire est

d'assurer une surveillance étroite et permanente des organismes et de palier sélectivement à

leur invasion par des agents pathogènes.

Les cellules du système immunitaire permettent donc à l'organisme des vertébrés de

reconnaître une invasion d'antigènes, et la réponse immunitaire qui en résulte est d'une

remarquable spécificité. Il existe deux classes de lymphocytes ayant un rôle dans la

reconnaissance d'antigènes spécifiques : la première est celle des lymphocytes T, la seconde

celle des lymphocytes B. Les lymphocytes B interviennent dans les réponses immunitaires de

type humoral, qui impliquent la production d'anticorps circulant dans le sang et se liant

spécifiquement à l'antigène étranger qui les a induits.

Les lymphocytes T sont responsables de l'immunité à médiation cellulaire. Celle-ci implique

la production de cellules spécialisées qui réagissent principalement avec les antigènes fixés à

la surface des cellules hôtes, soit en tuant la cellule hôte si l'antigène est un virus infectant,

soit en induisant d'autres cellules telles que les macrophages pour détruire l'antigène.

Les lymphocytes B et T circulent dans le sang et la lymphe, et sont concentrés dans les

principaux organes lymphatiques (ganglions lymphatiques et rate). Les lymphocytes ont une

durée de vie assez longue : chez l'homme, ils peuvent rester des années sans se diviser, mais

en réponse à un antigène, les lymphocytes grossissent considérablement, se divisent

rapidement et sécrètent un grand nombre de protéines contribuant à l'élimination de

l'organisme envahisseur ou des substances étrangères.

L'antigène est présenté aux cellules T sous la forme d'un peptide lié au complexe majeur

d'histocompatibilité (MHC) de classe I ou II, et provoque une réponse qui implique une

interaction coopérative entre le complexe récepteur des cellules T/CD3 (complexe TCR/CD3)

et les molécules accessoires CD4/CD8 et CD28 ( Figure 1). Le complexe TCR/CD3 est

composé du récepteur hétérodimérique de reconnaissance de l'antigène TCRα/β, des chaînes

CD3 γ, δ, ε et des homo et hétérodimères de la famille ζ (Figure 2). Les domaines

28

cytoplasmiques de ces protéines (CD3 et ζ) ont des séquences consensus appelées ITAM

(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif). Ces motifs possèdent des résidus

tyrosines qui, lorsqu'ils sont phosphorylés, constituent des sites de fixation de protéines

contenant des domaines SH2 (src homology domain).

Les molécules accessoires CD4 et CD8 se lient aux régions non polymorphes des MHC de

classe II et I, respectivement, alors que le CD28 reçoit un second signal délivré par l'antigène

B7 des cellules B ou des macrophages (cellules présentatrices de l'antigène ou APC).

Ainsi, l'interaction du TCR avec son ligand provoque une activation cellulaire du lymphocyte

qui se traduit par la production de médiateurs biochimiques intracellulaires appelés "seconds

messagers".

II- L'activation lymphocytaire.

II-1. La transmission du signal.

Au cours du processus d'activation, il existe des réponses précoces se produisant en

quelques minutes ou quelques heures après l'initiation de la transduction du signal, alors que

d'autres réponses peuvent se produire des jours après la stimulation. Durant la phase précoce

de l'activation, les lymphocytes T subissent d'énormes modifications biochimiques telles que

des phosphorylations-déphosphorylations de protéines, des variations de la membrane

lipidique, des flux d'ions, des altérations du taux des nucléotides cycliques, des variations de

synthèse d'ARN ainsi que des variations de synthèse protéique.

La réponse cellulaire plus tardive, telle que la prolifération, résulte généralement d'une

cascade complexe d'événements tels que l'activation de gènes. Ce signal permet aux cellules T

de progresser dans le cycle cellulaire et d'entrer en phase S, caractérisée par une synthèse

d'ADN et la réplication des chromosomes. Ce stade nécessite une interaction directe ou

indirecte avec les cellules accessoires (monocytes, macrophages) qui produisent l'interleukine

1 (IL1). L'IL1 stimule les lymphocytes à produire de l'IL2. La réplication des cellules T fait

suite à l'interaction de l'IL2 avec son récepteur. Il semble que les divisions successives ne

nécessitent pas une ré-exposition aux mitogènes, mais plutôt la présence d'IL2.

a) Les phosphorylations-déphosphorylations de tyrosine.

L'un des événements les plus précoces associé à la transduction du signal par le TCR

est la phosphorylation sur des résidus tyrosine de protéines cellulaires telles que la

phospholipase Cγ1 ou PLCγ1 (June et al.,1990 ; Weiss et al.,1991).

30

Ainsi, des inhibiteurs de protéines tyrosine-kinase (PTKs) peuvent inhiber presque en totalité

les événements associés à la stimulation du TCR (June et al., 1990 ; Mustelin et al.,1990).

Cependant, le TCR n'a pas d'activité tyrosine-kinase intrinsèque, et il semble donc qu'il régule

les réponses cellulaires en modulant les activités de différentes protéines tyrosine-kinases.

Quatre familles de PTKs cytoplasmiques sont impliquées dans la transduction du signal par le

TCR : Src, Csk, Tec et Syk (Figure 3).

Les PTKs de la famille Src impliquées dans l'activation sont Lck et Fyn. Des études

génétiques ont démontré que Lck et Fyn sont essentielles pour l'initiation de la transduction

du signal par le TCR et jouent aussi un rôle important dans le développement des cellules T

(Howe et Weiss, 1995; van Oers et al., 1996 a). De plus, des études avec des souris déficientes

en Lck ou Fyn ont suggéré que Lck joue un rôle plus important que Fyn dans la

phosphorylation des ITAMs (van Oers et al., 1996b).

La protéine Csk régule négativement les PTKs de la famille Src et inhibe donc la transduction

du signal. Cette protéine Csk phosphoryle une tyrosine en position C-terminale de Lck et Fyn,

ce qui les maintient à l'état inactivé. La déphosphorylation de la tyrosine carboxy-terminale

effectuée par la protéine tyrosine phosphatase CD45 permet ainsi l'activation de Lck et Fyn

(Weiss et Littman, 1994) (Figure 4).

La PTK de la famille Tec préférentiellement exprimée dans les cellules T est Itk. Des études

récentes sur des souris déficientes en Itk ont permis de mettre en évidence l'implication de

cette PTK dans la signalisation par le TCR, mais le mécanisme de cette régulation n'a pas

encore été élucidé (Liao et Littman, 1995).

Enfin, les PTKs de la famille Syk sont Syk et ZAP-70 (ζ-associated protein-70). La PTK Syk

n'est pas impliquée dans la signalisation par le TCR, mais elle est essentielle dans la

signalisation par le récepteur des lymphocytes B et le développement des cellules B (Cheng et

al.,1995; Mallick-Wood et al.,1996). Par contre, le rôle essentiel de ZAP-70 dans la

signalisation par le TCR et le développement des cellules T a été démontré grâce à des études

à la fois sur des personnes souffrant d'un syndrôme d'immunodéficience résultant de

mutations de ZAP-70 et sur des souris déficientes en ZAP-70 (Gelfand et al.,1995; Negishi et

al.,1995). D'autres études ont permis de démontrer qu'après leur phosphorylation par Lck et

Fyn , les ITAMs se lient avec ZAP-70 par des interactions de haute affinité (Osman et al.,

1995), ce qui permet ainsi la tyrosine phosphorylation de ZAP-70 et son activation par Lck et

Fyn (Iwashima et al., 1994).

Il existe donc des relations complexes entre les différentes protéines tyrosine-kinases et

protéines tyrosine-phosphatases qui sont présentes dans les lymphocytes T, et ces interactions

sont très importantes pour permettre au TCR d'initier les événements de la transmission du

signal.

32

b)L'hydrolyse des phosphatidylinositols par la PLCγ1.

Les activités tyrosine-kinases induites par le TCR conduisent donc à la

phosphorylation de nombreuses protéines cellulaires, en particulier la phospholipase Cγ1 ou

PLCγ1 (June et al.,1990 ; Weiss et al.,1991).

La phosphorylation de cette enzyme sur des résidus tyrosine est responsable de son activationcatalytique, qui induit l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) et conduit

ainsi à la formation d'inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) et de diacylglycérol (DAG), deux

seconds messagers intracellulaires (Figure 5). En effet, l'IP3 permet la libération du calcium à

partir des réserves intracellulaires (Berridge,1984), alors que le DAG stimule une protéine

kinase C ou PKC (Nishizuka,1986). De plus, il a été décrit que la libération de ces seconds

messagers persiste durant tout le temps de la stimulation (Weiss et al., 1987).

c) Le rôle du calcium dans la transmission du signal.

Le calcium contenu dans les réserves intracellulaires est relargué dans le cytosol quand

l'inositol1,4,5-trisphosphate se lie à ses récepteurs (Berridge, 1993). Cette libération du calcium à

partir des réserves intracellulaires est suivie d'entrée du calcium extracellulaire dans la cellule grâce

aux canaux calciques, et cette phase d'augmentation prolongée du taux de calcium semble être

indispensable au franchissement des étapes ultérieures de l'activation des lymphocytes, notamment la

stimulation de l'expression des gènes de l'interleukine 2 (Figure 5). En effet, il est généralement

admis que l'induction de la prolifération lymphocytaire par des mitogènes requiert la présence de

calcium. Ainsi, la chélation des ions Ca2+ par l'EGTA bloque la synthèse d'ARN et d'ADN induite

par la lectine mitogénique Concanavaline A ou Con A (Hadden, 1988).

Enfin, le calcium est cofacteur de plusieurs enzymes, dont la PKC et la PLC (Clapham, 1995), et il est

d'autre part nécessaire à la production de lymphokines. En activant la calcineurine, une phosphatase

Ca2+/calmoduline-dépendante, il induit la déphosphorylation du facteur de transcription cytosolique

NF-ATc (Nuclear Factor of Activated T cells) et sa translocation au noyau où il se complexe avec un

autre facteur de transcription (AP-1) , et permet ainsi l'expression des gènes de lymphokines, en

particulier celui de l'interleukine 2.

d) Les protéines kinases C.

Le diacylglycérol (DAG), formé par hydrolyse du PIP2, conduit à l'activation de

protéines kinases C ou PKC (Nishizuka, 1986).

Les protéines kinases C sont des sérine/thréonine protéines kinases. Les esters de phorbol,

agents promoteurs de tumeurs, peuvent se substituer au DAG pour activer les PKC, mais

contrairement au DAG, les esters de phorbol ne sont pas métabolisés rapidement dans

34

l'organisme et induisent donc une activation prolongée de la PKC. Cette propriété des esters

de phorbol a été largement utilisée dans le but d'étudier les propriétés de la PKC.

Les kinases de la famille des PKC sont des polypeptides comprenant une partie N-terminale

régulatrice et une partie C-terminale catalytique.

Quatre domaines bien conservés ont été décrits (Nishizuka, 1995) (Figure 6) :

- le domaine C1, riche en cystéines, responsable de la liaison du DAG ou des esters de

phorbol. Ce domaine est précédé par une séquence inhibitrice appelée "pseudosubstrat".

- le domaine C2 contient le site de reconnaissance des lipides et dans certaines

isoformes, le site de liaison du calcium.

- les domaines C3 et C4 forment les sites de liaison de l'ATP et du substrat et

constituent la partie catalytique de l'enzyme.

Le mécanisme d'activation de la PKC implique sa liaison à la membrane, suivie d'une

protéolyse qui permet de séparer les deux parties de l'enzyme. La partie catalytique est ainsi

libérée du pseudosubstrat et devient active.

A ce jour, plus de 10 isoformes de PKC ont été identifiées, et classées en trois groupes selon

leur structure et leur régulation par des cofacteurs tels que les ions Ca2+, les esters de phorbol

ou la phosphatidylsérine (Nishizuka,1995).

Les isoformes α, βI, βII et γ appartiennent au premier groupe ayant été découvert et le plus

étudié : celui des PKC conventionnelles. Ces isoformes se distinguent de celles des autres

familles par le fait que leur activité est régulée par le Ca2+ au niveau du site C2.

L'autre groupe assez bien caractérisé est celui des nouvelles PKC, qui comprend les isoformes

δ, ε, η, θ, µ. Ces enzymes ressemblent beaucoup par leur structure aux PKC conventionnelles,

mis à part que leur site C2 ne contient pas de site de liaison au Ca2+.

Les dernières isoformes connues (ζ et λ) font partie de la famille des PKC atypiques, car leur

structure diffère beaucoup de celle des autres familles (Fig. 3). De plus, elles ne répondent ni

aux esters de phorbol, ni au DAG, mais il a été décrit que la PKC-ζ pourrait être activée par

l'acide phosphatidique (Limatola et al., 1994).

Enfin, une dernière sérine/thréonine protéine kinase appelée PKD a été recemment identifiée.

Elle semble être activée par le DAG ou les esters de phorbol, mais n'a pas du tout la même

structure que les autres PKC (Valverde et al., 1994; Van Lint, 1995).

De nombreuses études visant à déterminer la spécificité des PKC par rapport au substrat ont

permis de révéler des mécanismes plus complexes que ceux attendus. Kikkawa et Nishizuka

(1986) ont pu découvrir un grand nombre de substrats physiologiques, qui peuvent être

répartis en trois grandes classes :

- les protéines impliquées dans la transduction du signal (EGF, T cell receptor, Ras,

GAP),

35

- les protéines impliquées dans des voies métaboliques (pompes, canaux),

- les protéines impliquées dans la régulation de l'expression des gènes (facteurs de

transcription).

D'autre part, l'un des substrats les plus important des PKC est la protéine MARCKS

(Myristoylated, Alanine-Rich C Kinase Substrate) qui est phosphorylée lors de l'activation de

macrophages ou au cours de la mitogenèse (Hartwig et al., 1992).

Les isoformes de PKC sont distibuées de manière différentielle à l'intérieur d'une même

cellule, ainsi que d'un tissu à un autre (Dekker et Parker, 1994). De plus, d'autres études ont

montré que l'âge pouvait influencer l'expression de certaines isoformes de PKC (Whisler et

al., 1995).

Dans les cellules T, les isoformes α, βI, δ, ε, ζ et η sont exprimées (Lucas et al., 1990; Mischak

et al., 1993 a et b). On retrouve en particulier l'isoforme β, ce qui suggère qu'elle pourrait

jouer un rôle préférentiel dans l'activation des cellules T (Murray et al., 1993; Tsutsumi et al.,

1993).

En fait, il existe une activation des PKC en deux temps dans les cellules T : tout d'abord, une

activation de la PKC-α en une dizaine de minutes après la stimulation, suivie d'une activation

soutenue de la PKC-β (Szamel et Resch, 1995).

Plusieurs hypothèses sur le mode d'activation des cellules T par les PKC ont été émises. Tout

d'abord, la PKC serait capable d'activer le facteur de transcription AP-1, en phosphorylant c-

fos et en déphosphorylant c-jun (Karin, 1992; Meek et Street, 1992). D'autre part, la PKC

pourrait activer NF-ΚB, un autre facteur de transcription, en phosphorylant la protéine

inhibitrice I-ΚB qui forme un complexe inactivé avec NF-ΚB (Shirakawa et Mizel, 1989;

Ghosh et Baltimore, 1990; Link et al., 1992). Ainsi, les PKC seraient impliquées dans la

transcription des gènes de l'IL-2 et de son récepteur, par deux voies distinctes (AP-1 et NF-

ΚB), mettant probablement en jeu deux isoformes différentes.

Deux autres protéines cibles pourraient être impliquées dans l'activation des cellules T par la

PKC. En effet, une augmentation significative de la protéine p21-ras sous sa forme active liée

au GTP est observée au cours de l'activation, ce qui indique une diminution de l'activité de la

protéine GAP (GTPase Activating Protein) probablement due à une phosphorylation par la

PKC (Downward et al. 1990). Enfin, les études de Bruder et al. (1992) semblent indiquer que

la Ser/Threonine kinase c-raf kinase pourrait être impliquée avec une ou plusieurs PKC dans

une cascade complexe de kinases conduisant à l'activation des cellules T.

37

e) La voie p21-ras/MAP-kinase.

Les protéines Ras sont des protéines de 21 KDa qui se lient au GTP et ont une activité

GTPasique. Un grand nombre de stimuli extracellulaires, tels que les facteurs de croissance,

les lymphokines, les antigènes ou les mitogènes peuvent induire l'activation des protéines Ras,

qui passent alors d'un état lié au GDP à un état lié au GTP. Il existe plusieurs mécanismes qui

permettent de transformer Ras en sa forme active liée au GTP. Ainsi, l'activation du récepteur

des cellules T peut réguler les activités Ras par des interactions avec des facteurs d'échanges

des nucléotides guanyliques (Sos et Vav) et avec des protéines GAP (GTPases Activating

Proteins) (Amrein et al., 1992,1994 ; Gulbins et al., 1993, 1994).

Un lien direct entre le TCR et Ras, impliquant deux protéines adaptatrices Shc et Grb2 et le

facteur d'échange des nucléotides guanyliques Sos a été identifié (Ravichandran, 1993). Après

activation du TCR, les séquences ITAM du TCRζ sont phosphorylées et constituent un point

d'ancrage pour les domaines SH2 de la protéine Shc. Cette protéine Shc est alors

phosphorylée et peut donc interagir avec les domaines SH2 de Grb2, qui contient également

deux domaines SH3 qui se lient aux séquences riches en proline de l'extremité C-terminale de

Sos. Enfin, Sos peut se lier à Ras et l'activer. Une sérine/thréonine kinase codée par le

protooncogène Raf-1 va alors être activée par Ras et être transloquée à la membrane. Les

substrats de la protéine Raf sont deux protéines kinases appelées Mek 1 et Mek 2 (MAP-

Kinase Kinases 1 et 2), qui activent les MAP-Kinases (Mitogen-Activated Protein Kinases) ou

Erk 1 et Erk 2 , en les phosphorylant sur des résidus tyrosine ou thréonine (Burgering et Bos,

1995 ; Pastor et al., 1995).

Les signaux transmis par cette voie des MAP-Kinases modulent l'expression d'un grand

nombre de gènes en stimulant ou en inhibant des facteurs de transcription tels que Fos, Jun ou

NF-ΚB (Karin et Smeal, 1992). Ainsi, l'activation de Ras a pu être corrélée avec l'activation de

la transcription du gène de l'IL2.

II-2. Le rôle des nucléotides cycliques.

La plupart des fonctions cellulaires sont régulées par des variations des taux de

nucléotides cycliques, AMPc (Adénosine MonoPhosphate cyclique ) et GMPc (Guanosine

MonoPhosphate cyclique).

Ainsi, les variations des taux de nucléotides cycliques dans les lymphocytes T ont fait l'objet

de nombreuses études, tout comme leur rôle dans la régulation de la croissance, la

différentiation et la fonction des cellules lymphoides (Parker et al., 1974 ; Coffey et al., 1978 ;

Hadden et Coffey, 1982 ; Kammer, 1988 ; Hadden, 1988).

L'observation d'une augmentation rapide et transitoire d'AMPc et de GMPc durant l'initiation

38

de l'activation des lymphocytes suggère que ces deux nucléotides cycliques pourraient être

impliqués dans la transmission du signal d'activation lymphocytaire.

a) Implication de l'AMPc dans l'activation lymphocytaire.

Le rôle de l'AMPc dans l'activation mitogénique a été très étudié. Ainsi, après

stimulation mitogénique, à la fois une augmentation et une diminution des taux d'AMPc ont

été observées (Wang et al, 1978). D'autre part, une augmentation des taux d'AMPc a été

décrite après stimulation des cellules T par un anticorps anti-CD3 (Ledbetter et al, 1986).

Cet effet pourrait représenter l'activation d'un mécanisme de rétrocontrôle négatif, largement

étudié dans des cellules T ou des lignées cellulaires. En effet, un taux élevé d'AMPc semble

inhiber la réponse lymphoproliférative en supprimant la production d'IL2 (Novogrodsky et al.,

1983) et des études plus récentes ont montré que l'AMPc aurait un effet inhibiteur sur la

transcription des gènes de l'IL2 (Anastassiou et al., 1992). Les auteurs ont proposé trois stades

d'inhibition : le premier au niveau membranaire illustré par la tyrosine phosphorylation d'une

protéine pp100, encore non identifiée, le second au niveau cytoplasmique se traduisant par

une diminution de la demi-vie de l'ARNm de l'IL2, et enfin le troisième au niveau nucléaire

impliquant une inhibition des sites de fixation des facteurs de transcription. D'autres auteurs

ont analysé les effets de concentrations croissantes d'AMPc sur l'activation du facteurs de

transcription NF-kB dans des cellules de Jurkat activées par l'ester de phorbol TPA en

présence de ionophore calcique (A23187), et ont décrit que l'AMPc augmentait la liaison de

l'ADN à NF-kB et la phosphorylation d'une sous-unité de NF-kB (Lahdenpohja et al., 1996).

Ces résultats montrent que l'AMPc serait capable de réguler l'expression des gènes dépendants

de NF-kB en modifiant la composition et l'activité des sous-unités de NF-kB.

D'autres auteurs pensent que l'AMPc serait capable de bloquer la progression et non

l'initiation de la prolifération des cellules T (Lingk et al., 1990). Enfin, Lerner et al. (1988) ont

décrit que les variations des taux d'AMPc pouvaient réguler les taux d'inositolphosphate et de

Ca2+, deux composés essentiels dans la phase précoce de la réponse mitogénique.

Le mode d'action de l'AMPc reste cependant très controversé, même si les protéines kinases

AMPc-dépendantes (PKA) semblent souvent impliquées dans ce phénomène. Les

lymphocytes humains ont deux isoformes de PKA : la PKA de type I, cytosolique et la PKA

de type II, associée à la membrane plasmique. Skälhegg et al. (1994) ont décrit que

l'activation de la PKA de type I par l'AMPc pourrait conduire à sa translocation vers la

membrane plasmique à proximité du complexe TCR/CD3. Ainsi, l'AMPc, par une

phosphorylation PKA-dépendante du complexe TCR/CD3 ou de ses protéines associées,

serait capable d'inhiber la prolifération stimulée par un antigène.

Cependant, le groupe de Kammer a récemment réfuté cette hypothèse, en supposant que la

39

PKA de type I (et non celle de type II) serait rapidement activée après fixation d' un antigène

sur le récepteur des cellules T et activation d'une voie intracellulaire comprenant CD45

phosphatase/PTK/PI/Ca2+/PKC (Laxminarayana et al., 1993, 1996). Ainsi, l'activation des

cellules T impliquerait une rapide activation de la PKA de type I et d'autres protéines

associées à la membrane.

D'autre part, l'hypothèse d'un effet positif indirect de l'AMPc a été décrite par Chakkalath et

al. (1992). Les résultats de leurs travaux indiquent que l'AMPc peut jouer un rôle de

régulation positive dans la prolifération des cellules T stimulées par le TPA, mais de manière

indirecte grâce à des facteurs qui sont secrétés par des monocytes prétraités au dibutyrylAMPc

et qui permettent une augmentation de la production d'IL2 dans les cellules T.

D'autre part, Bauman et al. (1994) ont montré que lorsque les cellules T étaient stimulées par

la PGE2 ou l'isoprotérénol, les deux isoformes de PKA étaient activées, la PGE2 induisant

l'utilisation à parts égales de PKA de type I et de type II, et l'isoprotérénol stimulant deux fois

plus la PKA I que la PKA II. Les cinétiques d'activation des PKA par les deux agonistes sont

identiques, mais l'effet de la PGE2 est plus important. Parallèlement, la PGE2 est plus

immunosuppressive. Là encore, ces résultats suggèrent que les différences d'activité PKA et

de concentration d'AMPc sont des éléments importants de la régulation de la réponse

lymphoproliférative.

Dans les fibroblastes, d'autres auteurs ont décrit une interaction entre la voie de l'AMPc/PKA

et la voie Ras/MAP-Kinase. En effet, dans ces cellules, l'élévation du taux intracellulaire

d'AMPc inhibe l'activité MAP-Kinase stimulée par des facteurs de croissance (Cook et

McCormick, 1993 ; Hordijk et al., 1994). En fait, il a été montré que l'élévation des taux

d'AMPc n'affecte pas la stimulation de Ras, mais inhibe l'activation de Raf, MEK et MAP-

Kinase (Burgering et al., 1993). De plus, d'autres auteurs ont montré qu'il existait une baisse

de son affinité pour Ras (Wu et al., 1993). Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de

Raf, et la baisse d'affinité entre Raf et Ras qui en résulte pourraient être un des mécanismes

expliquant l'effet antiprolifératif de l'AMPc.

Récemment, dans des lymphocytes , les travaux de Tamir et al. (1996) ont montré que l'effet

négatif de l'AMPc sur l'activation cellulaire pouvait également être associée à une diminution

des activités MAP-Kinases.

b) Implication du GMPc dans l'activation lymphocytaire.

Le rôle central du GMPc est connu dans de nombreuses voies de signalisation (Figure 8),

mais reste cependant assez controversé. De nombreuses études ont rapporté que la PHA

(Phytohemagglutinine) et la Con A induisent une augmentation précoce de GMPc dans les

lymphocytes au cours des 30 premières minutes d'activation, suivie d'un retour au taux basal après 60

minutes (Coffey et al., 1978; Hadden et Coffey, 1982). D'autres études ont montré que des agents qui

augmentent le GMPc comme la thymosine (Hadden, 1988), la thymopoietine

40

kinaseprotein

Agonists Cytokines Agonists ANP/BNP CNP STa/Guanylin ?

Ca+ transcrip.Factors Ca+

inducible

I II III

NO

Other Targets

Iconstitutive

IIinducible

NO Synthase Heme oxygenase

constitutive particulate

GC-S α1−3

β1−3

GC-A GC-B GC-C retGC

particulate guanylyl cyclase

soluble guanylyl cyclase

cGMP

cAMP

cGMP-gated

channels

cGMP-inhibited cGMP-stimulated cGMP-dependent cAMP-dependent cAMP-PDE cAMP-PDE Iα, β, ΙΙ

kinase Iα, β, ΙΙαβ

ion flux increased cAMP decreased cAMP protein proteinresponse response phosphorylation phosphorylation

CO

protein

Figure 8 : Voies de transduction du signal conduisant à la synthèse de GMPc et ses effets sur

la réponse cellulaire (d'après Schmidt et al., 1993).

41

(Baker et al., 1988), le LAF (Lymphocyte Activating Factor) ou le monoxyde d'azote NO

(Garbers, 1989; Schmidt et al., 1993) modulent la prolifération lymphocytaire induite par les

mitogènes.

Certains auteurs décrivent le GMPc comme un signal positif de la lymphoprolifération

(Coffey et al., 1978). Ces auteurs ont montré (Hadden et Coffey, 1982) que dans de nombreux

cas d'immunodéficience associée à l'âge ou au cancer, la hausse de GMPc induite par le

mitogène est réduite parallèlement à une réponse lymphoproliférative faible. L'utilisation

d'inhibiteurs de PDE a permis de mettre en évidence que cette augmentation du taux de GMPc

résulterait d'une augmentation de sa synthèse, plutôt que d'une diminution de son métabolisme

(Whitfield et al., 1974). Deviller et al. (1975) sont les premiers à avoir montré que la PHA

active la guanylate cyclase (GC) dans les lymphocytes intacts après deux minutes de

stimulation. Les premières variations d'activité de la GC sont observées d'abord au niveau

membranaire puis ensuite au niveau cytosolique (Coffey et Hadden, 1983; Hadden, 1988).

Les inhibiteurs de phospholipase, de lipoxygénase et non de cyclooxygénase inhibent

parallèlement l'activation de la GC induite par les mitogènes et la prolifération. Plusieurs

produits de la voie des lipoxygénases ont pu être impliqués dans l'activation de la GC. Ainsi,

certains auteurs ont montré que les 5-, 11- et 12-HETEs, produits d'oxydation de l'acide

arachidonique, ainsi que leurs précurseurs (HPETEs) stimulent la GC dans les lymphocytes

activés (Goldberg et al., 1978; Coffey et al., 1981). Par contre, le 15-HETE inhibe l'activation

de la GC induite par le 5-HETE (Gualde et al., 1985).

Ces observation confirment le rôle important de la voie de la lipoxygénase dans l'activation de

la GC.

Par contre, d'autres auteurs ont montré que l'addition de GMPc ou de ses analogues ne modifie pas la

prolifération des lymphocytes T purifiés (Knudsen et al., 1987).

Après stimulation des lymphocytes par du nitroprussiate de sodium (SNP), donneur de monoxyde

d'azote NO, Atkinson et al. (1978) et Kaever et al. (1985 ; 1990) ont observé une augmentation

importante du taux de GMPc mais sans effet sur l'activation des lymphocytes du sang périphérique

humain induite par la Con A.

Haslam et al. (1980) ont montré que le GMPc est un messager intracellulaire négatif, inhibant le

"turnover" des phosphoinositides dans les plaquettes.

En outre, Merryman et al. (1993) ont étudié le rôle du NO et de son dérivé stable le S-nitrosothiol

(SNO-GSH) sur la réponse des lymphocytes T activés. Ils ont montré que seul le dérivé stable du NO

(t1/2>2 heures) inhibe la synthèse d'ADN indépendamment de la production d'IL2, mais en

association avec une accumulation de GMPc par un mécanisme NO-dépendant.

Les macrophages régulent les fonctions lymphocytaires par deux voies opposées. Une première voie

impliquée dans la potentialisation de la réponse immune des lymphocytes T, met en jeu leur

42

PALysoPA DAG PIP2

PC/PE

Lyso PA Acyltransférase

PAP

DAG-Kinase

PLC

PLCPLD

Figure 9 : Les voies de formation du PA.

43

capacité de présentation de l'antigène et de sécrétion de médiateurs solubles. L'autre voie,

suppressive met en jeu le relargage de peroxyde d'hydrogène, de prostaglandines et d'autres

médiateurs suppresseurs.

Le monoxyde d'azote (NO) libéré par les macrophages activés montre des effets antimicrobiens,

contribue à l'activité cytotoxique des macrophages contre les cellules tumorales et supprime la

prolifération des lymphocytes en réponse à la Con A (Granger et al., 1988; Stuehr et Nathan, 1989;

Isobe et Nakashima, 1993). L'hypothèse selon laquelle la régulation négative de la prolifération

lymphocytaire par les macrophages serait dépendante de l'arginine a été étayée par les travaux de

Hoffman et al. (1990) et de Mills (1991) montrant qu'un inhibiteur compétitif de la NO-synthase (le

NMMA, NG monométhyl-Larginine) stimulait la prolifération des lymphocytes. Les mécanismes

biochimiques d'action de NO ne sont pas encore bien compris. Etant capable de diffuser à travers la

membrane cellulaire, le NO provenant des macrophages peut directement activer la GC soluble des

lymphocytes et augmenter le taux de GMPc. Enfin, le GMPc peut potentialiser l'effet des agents qui

augmentent l'AMPc comme la PGI2 par l'inhibition de certaines phosphodiestérases (Maurice et al.,

1990 et 1991). Le NO exercerait son effet inhibiteur de l'agrégation plaquettaire et de relaxation du

muscle lisse, en amplifiant les hausses d'AMPc via l'inhibition des PDE GMPc inhibables.

III- Voies de formation et effets cellulaires de l'acide phosphatidique (PA).

Plusieurs travaux récents ont montré une hausse rapide du taux intracellulaire d'acide

phosphatidique (PA) au cours de l'activation lymphocytaire (Pelassy et al., 1991; Bismuth et al.,

1988; Marcoz et al., 1993a). L'acide phosphatidique est un lipide quantitativement mineur, surtout

connu comme intermédiaire commun à la synthèse des autres phospholipides et des triacylglycérols.

Cependant, le rôle potentiel du PA comme second messager de différentes hormones ou facteurs de

croissance semble de plus en plus solidement étayé.

III-1. Les voies de formation du PA.

Le PA qui se forme pendant l'activation peut être issu d'une ou plusieurs voies de

signalisation dans la cellule. Trois voies principales ont été décrites : (Figure 9)

- l'hydrolyse par des phospholipases C (PLC) spécifiques de certains phospholipides comme

la phosphatidylcholine (PC) ou les phosphatidylinositols (PI) conduisant à la formation de

diacylglycérol (DAG), qui est phosphorylé par la suite par une DAG-Kinase pour donner du PA

(Aussel et al., 1992)

- L'hydrolyse par une phospholipase D (PLD) de phosphatidylcholine (PC) ou

phosphatidyléthanolamine (PE) pour donner directement du PA (Bocckino et al., 1987)

45

- l'acylation par une lysophosphatidate acyltransférase d'un pool de lysophosphatidate

(lysoPA) déjà présent dans la cellules, ou formé très rapidement à partir de la glycolyse par

l'intermédiaire de dihydroxyacétone phosphate (Bursten et al., 1991; Rossi et al., 1991).

L'importance relative des divers mécanismes connus est très différente d'un type cellulaire à

l'autre et diffère également en fonction du mitogène utilisé.

a) La voie PLC-DAG-Kinase.

Les Phospholipases C.

L'hydrolyse du phosphatidylinositolbisphosphate (PIP2) par la PLC survient

généralement en réponse à une stimulation de la cellule par un récepteur membranaire. Elle

conduit à la formation d'inositoltrisphosphate (IP3) et de diacylglycérol (DAG), deux seconds

messagers intracellulaires. En effet, l'IP3 et le DAG augmentent respectivement la

concentration intracellulaire en Ca2+ et l'activité de la PKC.

Comme c'est le cas pour beaucoup de protéines importantes dans la transduction du signal, il

existe plusieurs familles de PLC. Ainsi, plusieurs isoformes de PLC ont été isolées et clonées

à partir d'un grand nombre de tissus de mammifères (Majerus, 1992). Elles ont pu être

classées en trois familles : les PLC β, PLCγ et PLC δ, chaque famille contenant plusieurs

isoformes (Lee et Rhee, 1995) (Figure 10). Il existe d'autres types de PLC, par exemple la

PLCα, mais qui n'ont pas encore été clonés. Seules deux régions de forte homologie sont

présentes dans les trois types β, γ et δ : les régions X et Y, qui contiennent entre 170 et 260

acides aminés, et semblent constituer le domaine catalytique. Toutes les isoformes de PLC de

mammifères possèdent une région N-terminale d'environ 300 acides aminés qui précède la

région X. Les PLC β et PLC δ ont une petite séquence de 50 à 70 acides aminés qui sépare les

régions X et Y, alors que les PLCγ ont une longue séquence d'environ 400 acides aminés qui

contient les domaines SH ou Src Homology (deux domaines SH2 et un domaine SH3). Enfin,

toutes les isoformes contiennent un domaine PH (Pleckstrin Homology) du côté N-terminal,

avant la région X.

Il existe deux mécanismes différents permettant d'activer les PLC : soit une tyrosine

phosphorylation pour les PLCγ, soit par couplage à des protéines G telle que Gp pour la

PLCβ. Le mode d'activation de la PLCδ n'est pas encore connu (Rhee et Choi, 1992). Sa

structure a été étudiée récemment par cristallographie (Essen et al., 1996) et les résultats

suggèrent que cette protéine s'attache à la membrane et que son action sur les

phosphoinositides nécessite du Ca2+.

46

Dans les lymphocytes, les isoformes γ1, γ2 et β sont présentes. Le mécanisme d'activation de la PLC

dans les cellules T a été sujet de nombreuses controverses, et la question de l'implication des

protéines G ou des tyrosines kinases dans ce mécanisme a été beaucoup étudiée (Harnett et Righley,

1992). En effet, alors qu'il apparait évident que l'activation des PLC dans les cellules B est médiée par

une protéine G, il n'en est pas de même dans les cellules T. Malgré des résultats très clairs sur

l'existence d'une voie des inositolphosphates régulée par des protéines G dans les lymphocytes T

(Harnett et Klaus, 1988; Graves et Cantrell, 1991), il n'est absolument pas démontré que cette voie

soit couplée au récepteur des cellules T.

Récemment, Stanners et al. (1995) ont observé une association entre la chaine ε du CD3 et la protéine

Gqα/11, et cette association pourrait conduire à la stimulation de la PLCβ. Les auteurs suggèrent une

régulation réciproque entre tyrosine-kinases et protéines G dans les cellules T.

Cependant, l'isoforme de PLC qui participe majoritairement aux événements précoces de l'activation

lymphocytaire est la PLCγ1. Cette isoforme, grâce à ses groupements SH2, SH3 et PH est activée par

tyrosine phosphorylation (June et al., 1990; Mustelin et al., 1990; Weiss, 1991).

D'autres études ont montré l'existence de PLC qui ne sont pas spécifiques des

phosphatidylinositols. Exton (1990) a décrit l'existence d'une PLC qui hydrolyse la

phosphatidylcholine (PC). Contrairement à l'activation de la PI-PLC, l'activation de la PC-PLC est

prolongée, ce qui permet d'avoir une production de DAG de longue durée et par conséquent une

activation prolongée de la PKC (Exton, 1994). Cependant, cette PC-PLC a été peu étudiée. On sait

qu'elle peut être activée par l'IL1 dans les lymphocytes (Rosoff et al., 1988), par l'angiotensine II dans

des fibroblastes transfectés avec le récepteur de l'angiotensine II (Wen et al., 1995) et par l'IL4 dans

les cellules monocytaires U937 (Ho et al., 1994). Enfin, certains auteurs ont décrit que cette enzyme

pourrait jouer un rôle dans l'apoptose. En effet, il a été décrit que les céramides sont impliqués dans

l'apoptose (Hannun et Obeid, 1995) et la PC-PLC participerait à la production de ces molécules en

activant des sphingomyélinases, en réponse au TNF (Schütze et al., 1992) ou via le récepteur

Fas/APO1 (Cifone et al., 1995). Le couplage entre la PC-PLC et les récepteurs serait assuré par des

protéines G.

Les DAG-Kinases et les Phosphatidate phosphohydrolases.

Le DAG occupe un rôle central dans la biosynthèse des lipides, ainsi que dans la transmission

du signal en activant les PKC. Les taux intracellulaires de DAG sont régulés à la fois par sa synthèse

et par sa dégradation. En particulier, une des voies de dégradation du DAG est sa conversion en acide

phosphatidique. Cette réaction est catalysée par la DAG-Kinase et utilise l'ATP comme donneur du

groupement phosphate (Kanoh et al., 1990). Cette conversion enzymatique est supposée être un

mécanisme important permettant d'atténuer l'activation de la

48

PKC en diminuant les taux intracellulaires de DAG. Cependant, cette hypothèse est nuancée

par le fait que l'acide phosphatidique est lui-même décrit comme un mitogène (Moolenar et

al., 1986). Un autre rôle de la conversion par la DAG-Kinase pourrait être de resynthétiser du

phosphatidylinositol riche en acide arachidonique (Holub et Kuksis, 1978), et récemment une

DAG-Kinase spécifique des espèces contenant de l'acide arachidonique a pu être identifiée

(Walsh et al., 1995). D'autres auteurs ont décrit l'implication de la DAG-Kinase dans la

régulation de la synthèse de l'IL2 dans les cellules de Jurkat (Aussel at al., 1992) ou dans la

réponse proliférative des lymphocytes stimulés par l'IL2 (Mérida et al., 1993; Flores et al.,

1996). Cette enzyme a également été impliquée dans la réponse des cellules NIH3T3 à l'EGF

(Montgomery et al., 1997) ou la réponse des cellules T à la sphingosine (Yamada et al., 1993).

La première isoforme de DAG-Kinase qui a été caractérisée au niveau moléculaire est la

DAG-Kinase α. Cette isoforme a une masse moléculaire de 80 kDa et a été isolée et clonée à

partir de tissus de porc (Sakane et al., 1990) ou de tissus humains (Schaap et al., 1990). Elle

est surtout présente dans les lymphocytes et les oligodendrocytes (Goto et al., 1992).

L'ADNc d'une seconde isoforme, la DAG-Kinase β, a été isolé de cerveau de rat et code pour

une protéine d'environ 90 kDa qui est majoritairement trouvée dans le cerveau (Goto et

Kondo, 1993).

Kai et al. (1994) ont isolé l'ADNc de la DAG-Kinase γ et ont trouvé qu'il était surtout exprimé

dans la rétine. Un ADNc similaire est également très exprimé dans les cellules cérébrales

(Goto et al., 1994).

Récemment, une DAG-Kinase ζ a été identifiée (Bunting et al., 1996) dans les cellules

endothéliales humaines, et retrouvée surtout dans le cerveau et les muscles.

Enfin, plusieurs équipes ont décrit l'existence d'une DAG-Kinase appelée par certains DAG-

Kinase ε et qui serait spécifique des espèces contenant de l'acide arachidonique (MacDonald

et al., 1988a et b; Walsh et al., 1994; Tang et al., 1996).

Quatre régions assez bien conservées ont été décrites (Fig. 11) comprenant un domaine

catalytique avec un site de liaison à l'ATP, une région riche en cystéines (zinc-finger) et un

site de fixation du Ca2+ (EF-hand). Cependant, les isoformes ζ et ε ne contiennent pas ces

domaines.

Enfin, plusieurs inhibiteurs de ces enzymes dont le dioctanoyléthylène glycol, le 1-

monooleylglycérol (Bishop et al., 1986) et le composé R59022 sont maintenant disponibles;

le composé R59022 est un inhibiteur de la DAG-Kinase de 80 Kda très utilisé (de Chaffoy de

Courcelles et al., 1985). Certaines études montrent que la DAG-Kinase est régulée par la PKC

(Van Blitterswijk et al., 1991; Schaap et al., 1993), et par phosphorylation de résidus tyrosines

(Schaap et al., 1993).

49

Contrairement à la DAG-Kinase, la phosphatidate phosphohydrolase (PAP) prolonge

la production du DAG, et ainsi l'activation de la PKC. En effet, plusieurs équipes ont montré

que le DAG formé lors de l'activation cellulaire provient de deux sources. Un premier pic

fugace correspond à des DAG provenant de l'hydrolyse du PIP2 par la PLC, alors que le

deuxième pic prolongé dans le temps correspond à des DAG issus des PC par action

séquentielle d'une PLD et d'une PA hydrolase (Exton, 1990; Billah et Anthès, 1990).

Le rôle de la PAP a été clairement démontré par Bursten et al. (1991). En effet, dans les

cellules mésangiales humaines stimulées par l'IL1, l'activation d'une lyso-PA acyl transférase

et d'une protéine G sensible à la toxine pertussique conduirait à l'activation d'une PAP. Dans

ce type cellulaire, le PA serait ainsi un intermédiare important au cours de l'activation par

l'IL1.

Enfin, la PAP est également impliquée dans la régulation de la synthèse des glycérolipides

(Smith et al., 1967).

Les activités PAP de différents tissus ont été caractérisées et il a été proposé qu'il existait deux

isoformes pouvant être distinguées par leur distribution cellulaire, leur dépendance vis à vis

des ions Mg2+, leur inhibition par le NaF, le N-éthylmaléimide (NEM) ou la chaleur (Jamal et

al., 1991; Walton et Possmayer, 1989; Day et Yeaman, 1992; Aridor-Piterman et al., 1992). Il

a été proposé que l'activité PAP associée à la membrane est insensible au NEM et

indépendante du Mg2+ et prend part à la transduction du signal intracellulaire, alors que

l'activité PAP qui dépend du Mg2+ est trouvée dans le cytosol ou le réticulum endoplasmique,

est inhibée par le NEM et est impliquée dans la synthèse des glycérolipides (Jamal et al.,

1991). Enfin, une activité cytosolique sensible au NEM a été identifiée dans les neutrophiles

humains (Truett et al., 1992).

b) La voie PLD.

La phospholipase D (PLD) est une enzyme distribuée largement dans les cellules de

mammifères. Son substrat le plus courant est la phosphatidylcholine (PC), qui est hydrolysée

en PA et choline, mais la PLD hydrolyse également la phosphatidyléthanolamine (PE) et le

phosphatidylinositol (PI) dans certains organismes ou tissus. Enfin, cette enzyme catalyse

aussi une réaction de transphosphatidylation, qui permet en présence d'alcool primaire dans le

milieu de former du phosphatidylalcool aux dépens du PA. Cette réaction est spécifique de la

PLD et permet ainsi de quantifier son activité dans les cellules.

La PLD a été purifiée à partir de plusieurs sources et a été clonée à partir de bactéries, de

levures, de plantes et de tissus de mammifères (Morris et al., 1996).

Certaines séquences des différentes PLD connues sont bien conservées d'une isoforme à

l'autre (Figure 12) et elles représentent probablement le site catalytique de l'enzyme.

51

La première PLD de mammifère qui a été clonée (hPLD1a) compte 1072 acides aminés et a

une masse moléculaire de 124 kDa (Hammond et al., 1995). Cette PLD est spécifique de PC.

Un variant plus petit de cette isoforme, comptant 1034 acides aminés (hPLD1b) a été identifié

et a les mêmes propriétés que hPLD1a (Hammond et al., 1997). Enfin, une autre PLD (PLD2)

qui contient 932 acides aminés et a 51% d'homologie de séquence avec hPLD1a a été clonée

(Colley et al., 1997).

D'autres PLD ont été identifiées dans des tissus humains et des cellules de gliomes C6

(Ribbes et al., 1996; Yoshimura et al., 1996), et leur séquence indique des ressemblances,

mais pas en totalité, avec hPLD1. Okamura et Yamashita (1994) ont purifié à partir de

poumon de porc une autre PLD spécifique de PC, d'une masse moléculaire d'environ 190 kDa

et avec un pH optimum de 6,6. Une autre PLD a été isolée de membrane de cerveau de porc

par Brown et al. (1995). Elle a une masse moléculaire de 95 kDa et est stimulée par PIP2 et

les petites protéines G : ARF et Rho A. D'autres PLD ont été purifiées et diffèrent par leur pH

optimum, leur réponse au Ca2+, au PIP2, à l'oléate ou aux détergents.

Des études de la localisation intracellulaire des PLD ont montré que l'enzyme est assez

souvent présente dans les membranes mais est également retrouvée dans le Golgi ou le noyau

(Ktistakis et al., 1995, 1996; Whatmore et al., 1996, Balboa et Insel, 1995). Il existe une

activité significative dans le cytosol, mais pas dans les mitochondries. Dans le foie, l'isoforme

membranaire répond plus à Rho A qu'à ARF, et l'inverse est vraie dans les autres fractions

subcellulaires. Des études de PLD dans les fibroblastes indiquent que la PLD2 se situe surtout

dans la membrane plasmique, alors que la PLD1 est retrouvée dans le réticulum

endoplasmique, le Golgi et les endosomes.

Pertile et al. (1995) ont montré que le PIP2 est important pour l'activation de la PLD dans des

cellules intactes, mais il n'est pas évident que les taux physiologiques de PIP2 et PIP3

puissent contrôler l'enzyme in vivo. Cependant, des études sur des PLD purifiées et clonées

montrent que PIP2 et PIP3 activent directement l'enzyme alors que l'oléate serait inhibiteur

(Hammond et al., 1997).

Dans des membranes de cerveau de rat solubilisées avec des détergents, deux pics d'activité

PLD apparaissent et ont été recemment identifiés : l'un activé par l'oléate qui ne dépend ni

d'ARF ni du GTPγS, et l'autre dépendant de l'ARF. Ces deux enzymes montrent des besoins

en co-facteurs différents, ce qui indique que ces enzymes sont contrôlées de manière

différente. Ainsi, l'activité PLD qui dépend de l'ARF a également besoin de PIP2, ce qui n'est

pas le cas de l'activité stimulée par l'oléate (Massenburgh et al., 1994).

Un grand nombre d'agonistes sont connus comme activateurs de la PLD, et parmi ceux-ci plusieurs

agissent par des récepteurs couplés à des protéines G hétérotrimériques Gq ou Gi. C'est pourquoi il

semble maintenant assez évident qu'un signal provenant de l'activation de ces protéines G doit être

transmis à la PLD. D'autre part, certains autres agonistes sont des facteurs de croissance qui agissent

via des récepteurs couplés à des protéines tyrosine-kinases, et il est

52

Agoniste

Récepteur à 7 domaines

transmembranaires

Gq/Gi

PKC

Rho/ARF

PLD

Facteurs de croissance

Récepteur du facteur

de croissance

Autophosphorylation

PI/PLC

PKC

Rho

PLD

Figure 13 : Mécanismes supposés d'activation de la PLD (d'après Exton, 1997).

53

donc aussi possible que le signal d'activation soit transmis à la PLD grâce à des

phosphorylations de résidus tyrosines. En fait, ces résultats indiquent que la PKC serait

impliquée dans la transmission du signal à la PLD, puisque un grand nombre de récepteurs

couplés à des protéines G ou à des protéines tyrosines kinases sont capables d'induire une

hydrolyse significative du PIP2 et ainsi une activation de la PKC. Cependant, il semble

également que l'activation de la PKC ne puisse pas expliquer entièrement l'effet de ces

agonistes sur la PLD, et il doit donc exister d'autres mécanismes d'activation de cette enzyme.

Régulation de la PLD par la PKC.

Il existe de plus en plus de preuves que la PLD est régulée par la PKC. En effet, des

études utilisant les esters de phorbol ou des inhibiteurs de PKC ou bien mettant en jeu une

down-régulation de la PKC, des sur-expressions ou délétions de certaines isoformes de PKC

ont conduit à ce résultat (Pai et al., 1987, 1991; Eldar et al., 1993; Balboa et al., 1994).

D'autre part, les études de Yeo et al.(1994) et de Lee et al. (1994) ont montré que l'hydrolyse

du PI par la PLC était nécessaire à l'activation de la PLD. Plusieurs mécanismes ont été

imaginés et sont illustrés en Fig. 9.

Le mécanisme le plus direct de contrôle de la PLD par la PKC serait une phosphorylation de

l'enzyme. Cependant, les études qui se sont interessées au effets directs de la PKC sur la PLD

ont montré que l'activation n'implique pas l'ATP (Conricode et al., 1992, 1994; Singer et al,

1996; Hammond et al., 1997). En particulier, des études avec une PLD recombinante

exprimée dans des cellules Sf9 indiquent que les PKC α et β peuvent directement activer la

PLD d'une manière independante de l'ATP (Hammond et al., 1997), les autres isoformes étant

inactives (Conricode et al., 1994). L'interaction n'est pas affectée par la staurosporine (un

inhibiteur de PKC) et implique le domaine régulateur de la PKC (Singer et al., 1996).

Néanmoins, même si la régulation de la PLD par la PKC implique des interactions protéines-

protéines, un mécanisme supplémentaire dépendant de phosphorylations n'est pas à exclure in

vivo. En effet, des études utilisant des inhibiteurs de PKC qui interfèrent avec la liaison de

l'ATP (Exton, 1997) ou encore des études sur les effets de l'ATP en système acellulaire

(Lopez et al., 1995) semblent indiquer qu'une partie du mécanisme serait dépendant de

phosphorylations. On peut également penser que la PKC pourrait agir in vivo en

phosphorylant d'autres protéines impliquées dans la régulation de la PLD ou en altérant la

réponse de la PLD à de telles protéines. Ainsi, on peut noter qu'il existe une synergie entre les

effets les protéines Rho A, ARF et la PKC pour activer la PLD.

Enfin, au contrairement aux autres isoformes de PLD, la PLD2 possède une activité basale

élevée, à la fois in vitro et in vivo (Colley et al., 1997). Elle peut être stimulée par le PIP2,

mais ne répond ni à la PKC, ni à ARF, ni à Rho A.

54

Régulation de la PLD par les ions Ca2+.

Des études avec le ionophore calcique A23187 et la ionomycine indiquent qu'une

augmentation du calcium intracellulaire peut activer la PLD (Bocckino et Exton, 1996). La

chélation du Ca2+ par l'EGTA provoque une inhibition de l'activation de la PLD par les

agonistes se liant à des récepteurs couplés aux protéines G (Balboa et al., 1994; Halenda et

Rehm, 1990; Huang et al., 1991; Wu et al., 1992). Il est difficile de savoir si ces résultats

impliquent le calcium dans l'effet de la PKC sur la PLD ou bien si le calcium joue un autre

rôle dans l'activation de la PLD. Des études sur les effets directs du calcium sur des

préparations partiellement purifiées de PLD montrent généralement une stimulation, mais les

concentrations utilisées sont très variables et les fortes concentrations ont même un effet

inhibiteur (Bocckino et Exton, 1996; Brown et al., 1995; Okamura et Yamashita, 1994;

Siddiqi et al., 1995). Ainsi, l'hypothèse d'un contrôle direct de l'activité PLD par le calcium

n'est pas vraiment démontrée.

Régulation de la PLD par ARF.

L'ARF (ADP-Ribosylation Factor) est décrit comme un facteur participant à laribosylation de la protéine Gsα induite par la toxine cholérique (Lopez et al., 1995). On sait

également maintenant qu'il joue un rôle dans le traffic vésiculaire au niveau du Golgi. Ainsi, il

est impliqué dans la fusion de vésicules et d'endosomes et dans l'assemblage de membranes

nucléaires (Moss et Vaughan, 1995).

L'hypothèse de l'effet d'un facteur cytosolique sur l'activation de la PLD provient d'études en

système acellulaire dans lesquelles le cytosol était nécessaire à l'activation de la PLD par le

GTPγS dans des membranes de neutrophiles ou de cellules HL60 (Olson et al., 1991; Anthès

et al., 1991). L'activation de la PLD par ARF a été décrite par le groupe de Strenweiss et

Cockcroft (Brown et al., 1993; Cockcroft et al., 1994). L'enzyme est stimulée par ARF1,

ARF3, ARF5 et ARF6, c'est à dire toutes les classes d'ARF, et les ARF myristoylés sont plus

efficaces que les ARF non-myristoylés (Brown et al., 1995; Massenburg et al., 1994). Des

études avec une PLD recombinante exprimée dans les cellules Sf9 montrent que l'enzyme est

fortement stimulée par ARF (Hammond et al., 1997). D'autres groupes ont indiqué que

certains facteurs cytosoliques augmentaient nettement l'effet d'ARF sur la PLD, et deux de ces

facteurs ont pu être identifiés : l'un est la PKCα (Singer et al., 1996) et l'autre pourrait être la

calmoduline (Takahashi et al., 1996), mais la nature des autres facteurs reste à déterminer

(Shimooku et al., 1996; Singer et al., 1995). Deux groupes ont cependant identifié une

protéine de 50kDa, dont la structure reste inconnue et on ne sait pas si elle agit sur ARF ou

sur la PLD (Lambeth et al., 1995; Bourgoin et al., 1995).

55

L'activité PLD est élevée dans le Golgi et répond à l'ARF (Liscovitch et Chalifa-Capsi, 1996;

Provost et al., 1996; Ktistakis et al., 1995). De plus, la stimulation peut être inhibée par la

brefeldin A, qui est un inhibiteur de l'ARF. Ainsi, Ktistakis et al.(1996) ont décrit que la PLD

activée par l'ARF devait jouer un rôle important dans la régulation du transport vésiculaire du

Golgi.

Cependant, il existe peu d'expériences qui démontrent un effet de l'ARF sur la régulation de

l'activité PLD in vivo. Dans les cellules HEK qui expriment un récepteur muscarinique M3, la

brefeldin A empêche la stimulation de la PLD induite par le carbachol (Rumenapp et al.,

1995) et dans ces cellules, une perméabilisation provoque une libération d'ARF cytosolique,

qui peut être inhibée par addition de GTPγS durant la perméabilisation ou par un prétraitement

au carbachol, car ces deux traitements induisent une translocation d'ARF vers la membrane.

Enfin, l'activation de cellules HL60 avec le fMLP induit une augmentation de la quantité

d'ARF associé à la membrane et une stimulation de la PLD (Houle et al., 1995). Ces résultats

indiquent donc que la stimulation de la PLD par ces agonistes serait médiée par une

translocation d'ARF à la membrane.

Régulation de la PLD par les protéines Rho.

La famille des protéines Rho régule beaucoup d'activités cellulaires, et en particulier

celles impliquant l'actine du cytosquelette. Le groupe de Bowman et al. (1993) a été le

premier à mettre en évidence un régulation de la PLD par les protéines de la famille Rho. Ces

auteurs ont montré que l'effet activateur du GTPγS sur la PLD dans des membranes de

neutrophiles est inhibé par RhoGDI, une protéine qui empêche la dissociation du GDP des

protéines Rho et bloque ainsi leur activation. Il a ensuite été montré, dans des études utilisant

des membranes de foie de rat, de cellules HL60 ou bien de neutrophiles, que Rho A était la

protéine de la famille Rho la plus active sur la PLD (Malcolm et al., 1994; Siddiqi et al.,

1995; Kwak et al., 1995). De plus Rho A stimule aussi la PLD dans des fractions d'autres

cellules ou dans des préparations d'enzyme partiellement purifiées (Provost et al., 1996;

Balboa et Insel, 1995; Singer et al., 1995; Shimooku et al., 1996; Kuribara et al., 1995). Enfin,

des études avec l'enzyme recombinante exprimée dans les cellules Sf9 indiquent que Rho A

interagit directement avec la PLD, et que d'autres membres de la famille des protéines Rho,

tels que Rac et Cdc42 sont aussi actifs (Hammond et al., 1997). De plus, une combinaison des

trois protéines n'active pas plus la PLD qu'une protéine seule, ce qui suggère qu'elles peuvent

interagir avec la PLD sur le même site. Ce résultat est étonnant car les protéines de la famille

Rho ont des effets cellulaires différents, et leur action similaire sur l'activation de la PLD est

inattendue.

De plus, une combinaison de Rho A et ARF résulte en une activation synergique de la PLD

(Hammond et al., 1997; Singer et al., 1996; Kwak et al., 1995; Ohguchi et al., 1996). Cela

56

suggère la présence de sites actifs séparés mais interagissant entre eux pour l'activation de la

PLD par Rho A et ARF.

Enfin, comme pour l'ARF, certaines études montrent que l'effet de Rho A sur la PLD est

augmenté par des facteurs cytosoliques (Shimooku et al., 1996; Kwak et al., 1995) et par la

PKCα (Hammond et al., 1997; Singer et al., 1996; Kwak et al., 1995; Ohguchi et al., 1996).

Cependant les travaux de Vinggard et al. (1997) montrent qu'après une purification partielle,

la PLD de placenta humain perd sa réponse à Rho A mais conserve son activation par ARF. Il

semble donc que les mécanismes d'activation de la PLD par ARF et Rho A soient différents,

mais cela n'a pas encore été prouvé.

D'autres études ont montré que le traitement de fibroblastes Swiss 3T3 par le Lyso PA ou

l'endothélin-1 provoque une rapide translocation de Rho A du cytosol vers la membrane

(Fleming et al. 1996).

Beaucoup de toxines bactériennes qui inactivent les protéines Rho ont été utilisées pour

montrer l'implication de Rho A dans l'activation de la PLD in vivo. Ainsi, l'exoenzyme C3 de

Clostridium Botulinum qui ADP-ribosyle Rho A bloque l'activation de la PLD induite par le

LysoPA dans les fibroblastes de rat (Malcolm et al., 1996). De la même manière, la toxine B

issue de Clostridium Difficile glucosyle et inactive les protéines Rho, et bloque l'activation dela PLD par le carbachol dans des cellules intactes ou par le GTPγS ou AlF4- dans des cellules

perméabilisées (Schmidt et al., 1996a).

Enfin, certaines études suggèrent un couplage entre l'activation de la voie Raf/MAP-kinase et

l'activation de Rho et Rac1 (Khosravi-Far et al., 1995; Prendergast et al., 1995; Qiu et al.,

1995), mais le mécanisme de ce couplage n'est pas encore bien compris. Grb2, molécule

adaptatrice entre Sos et Ras, pourrait être impliquée dans ce phénomène (Matuoka et al.,

1993)

Cependant, même si ces observations suggèrent fortement que Rho A est impliqué dans la

stimulation de la PLD par différents agonistes, il faut également tenir compte du fait que Rho

A peut également réguler la synthèse de PIP2 par son effet sur la PI-4-P 5-Kinase (Chong et

al., 1994) et que les changements d'activité PLD peuvent être dus à des variations des taux de

PIP2 (Schmidt et al., 1996b).

Régulation de la PLD par le PIP2.

Brown et al.(1993) ont été les premiers à suggérer que la PLD pouvait être stimulée

par le PIP2, et beaucoup d'autres études ont confirmé cet effet du PIP2. En fait, on suppose

que le PIP2 est un co-facteur et qu'il est nécessaire aux effets stimulateurs de la PKC et des

petites protéines G ARF et Rho A sur la PLD (Brown et al., 1993, 1995; Massenburg et al.,

57

1994; Kuribara et al., 1995; Ohguchi et al., 1996).

Dans les cellules U937 perméabilisées, l'activation de la PLD induite par le GTPγS est

potentialisée par MgATP, qui maintient les taux de PIP2 et PIP élevés dans les cellules

(Pertile et al., 1995). De plus, lorsque les taux de PIP2 et de PIP sont diminués par des

inhibiteurs de PI-4-Kinase, on note une diminution de l'activation de la PLD par le GTPγS.

Une inhibition similaire de la PLD est observée avec la néomycine, qui se lie aux

phosphoinositides (Liscovitch et al., 1994). Toutes ces expériences sont donc en faveur d'une

dépendence de l'activité PLD vis à vis du PIP2.

Régulation de la PLD par les tyrosine-kinases solubles.

Des facteurs de croissance dont le récepteur possède un activité tyrosine-kinase

intrinsèque sont capables d'activer la PLD. De même, des récepteurs ne possédant pas

d'activité tyrosine-kinase intrinsèque, mais étant couplés à des protéines tyrosine-kinases

solubles, comme le TCR, peuvent également conduire à l'activation de la PLD (Dinh et

Kennerly, 1991; Stewart et al., 1991). Ainsi, certains travaux montrent une activation de la

PLD dans des cellules transformées par V-Src (Song et al., 1991) et Jiang et al.(1995) ont

montré que Ras était impliqué dans l'activation de la PLD. Enfin, l'augmentation de la

phosphorylation non récepteur-dépendante de protéines sur des résidus tyrosines a été

associée à une activation de PLD (Bourgoin et Grinstein, 1992).

D'autre part, certains auteurs supposent que des tyrosine-kinases peuvent jouer un rôle dans la

stimulation de la PLD par des agonistes couplés à des protéines G. Dubyak et al. (1993) et

Kusner et al. (1993) ont observé que l'ATP augmente de manière importante la stimulation de

l'activité PLD dans les cellules U937 perméabilisées stimulées par le GTPγS. De plus, cet

effet est reproduit par le vanadate, qui est un inhibiteur de protéine tyrosine-phosphatase, ou

bien peut être bloqué par des inhibiteurs de tyrosine-kinases (Martinson et al., 1994; Uings et

al., 1992; Wilkes et al., 1993; Brisco et al., 1995). Cependant, les doses d'inhibiteurs utilisées

dans ces études sont souvent fortes et donc, leur spécificité d'action n'est pas garantie. De

plus, une de ces études montre que l'inhibition de la PLD n'est pas corrélée avec celle des

phosphorylations de tyrosines (Martinson et al., 1994).

De la même manière, l'implication exacte des tyrosine-kinases dans l'activation de la PLD par

Rho A n'est pas encore bien définie, malgré quelques études démontrant ce phénomène

(Nobes et Hall, 1995; Rankin et al., 1994; Ridley et Hall, 1992; Seckl et al., 1995).

III-2. Le rôle physiologique du PA.

Le premier effet reconnu de l'acide phosphatidique (PA) est sa capacité à induire des

flux de calcium, en particulier en tant que ionophore calcique. Par la suite, de nombreux

arguments ont conduit à l'hypothèse d'un rôle de second messager pour le PA (Salmon et

58

Honeyman,1980; Putney et al., 1980). Dans de nombreuses études visant à déterminer les

effets du PA, les auteurs ont examiné l'effet de PA exogène ou de PA produit in situ par une

PLD bactérienne. Ces études ont montré que le PA intervient dans la régulation de la synthèse

d'ADN (Moolenaar et al., 1986; Siegmann, 1987), la production d'Il2 (Cano et al., 1992),

l'induction de l'ARNm de proto-oncogènes et facteurs de croissances (Moolenaar et al., 1986;

Siegmann, 1987; Knauss et al., 1990), l'activation de la NADPH oxydase des neutrophiles

(Perry et al., 1993), la mobilisation du calcium intracellulaire et l'entrée du calcium

extracellulaire (Salmon et Honeyman, 1980; Putney et al., 1980), l'inhibition de la formation

d'AMPc (Murayama et Ui, 1987), la transition de la phase G2 à la mitose dans les cellules

A431 (Kaszkin et al., 1992) et la phosphorylation de diverses protéines cellulaires (Bocckino

et al., 1991; Siddiqui et Yang, 1995). Enfin, le PA exerce probablement un grand nombre

d'effets sur la réponse cellulaire en activant certaines isoformes de PKC (Nishizuka, 1986).

a) Le PA et les flux de calcium.

Le PA peut induire des entrées de calcium dans de nombreux tissus ou cellules,

incluant les plaquettes (Ikeda et al., 1979; Imai et al., 1982), les glandes parotides (Weiss et

al., 1982), les hépatocytes (Barritt et al., 1981; Osugi et al., 1984), les terminaisons nerveuses

(Harris et al., 1981) et l'épithélium (Lee et al., 1989). Putney et al. (1980) ont également

étudié le rôle de ionophore calcique du PA. Cependant, les théories attribuant au PA endogène

un rôle de ionophore calcique ont été réfutées par Holmes et Yoss (1983) qui ont démontré

que les effets du PA sur le transport du calcium dans des liposomes étaient dus à la présence

d'acides gras oxydés contaminants et que du PA fraîchement préparé est inactif.

D'autres études montrent cependant une augmentation parallèle des taux endogènes de PA et

de l'entrée de calcium après stimulation des cellules (Somermeyer et al., 1983). Dans les

neutrophiles, le PA synthétisé dans la membrane après activation d'une PLD serait

responsable des transports de calcium à travers la membrane (English et al., 1991). De même,

Kisel et al. (1984) ont montré que la stimulation des cellules endocrines par des hormones

doit impliquer une augmentation du taux de PA endogène suivie d'une entrée de calcium

extracellulaire. Enfin, Ohata et al. (1990 et 1991) ont suggéré que la production de PA

contribue à la contraction des muscles lisses induite par un agoniste en stimulant l'entrée du

calcium à partir de sources extracellulaires.

D'autres part, plusieurs rapports décrivent un effet du PA sur la mobilisation du

calcium intracellulaire, et en particulier dans la libération du calcium à partir des stocks

intracellulaires.

Moolenaar et al. (1986) ont essayé de corréler l'augmentation du taux de calcium

intracellulaire induite par le PA à son effet mitogénique, apprécié notamment par la synthèse

d'ADN et l'expression de certains proto-oncogènes. Ils ont montré que l'augmentation du

59

calcium intracellulaire ne résultait pas d'une entrée du cation mais de sa libération à partir des

réserves intracellulaires. Ils ont conclu que, contrairement à un ionophore, le PA exerçait son

effet en stimulant d'autres réponses cellulaires, par exemple l'hydrolyse des phosphoinositides,

qui permettaient la formation de seconds messagers libérant le calcium. Par la suite, ces

auteurs ont montré que le lyso-PA était l'élément contaminant responsable des réponses

cellulaires observées (van Corven et al., 1989; Jalink et al., 1990). De plus, le lyso-PA est

maintenant largement décrit lui-même comme un second messager, qui agirait via un

récepteur couplé à une protéine G (Jalink et al., 1994).D'autres études ont cependant montré un effet du PA sur l'hydrolyse du PIP2 et la formation

d'IP3 (Dunlop et Larkins, 1989). Dans des cellules parathyroidiennes (Mac Ghee et Shoback,

1990) et dans des ostéoblastes (Kawase et Suzuki, 1988 et 1990), cet effet est associé à une

augmentation transitoire du calcium libre intracellulaire. Ces réponses, qui résultent

apparement d'une activation de la PLC par le PA, sont associées à une prolifération des

cellules.

Enfin, dans les cellules de Jurkat, Breittmayer et al. (1991) ont décrit un pool intracellulaire de

calcium sélectivement mobilisé par le PA. Ainsi, le PA pourrait activer d'autres voies

responsables d'une mobilisation du calcium d'une manière indépendante de la production

d'IP3.

b) Le PA et les Phospholipases C.

Dans les plaquettes humaines, Jackowski et Rock (1989) ont montré que le PA active

une phosphatidylinositol 4,5-bisphophate Phospholipase C (PI-PLC) associée à la membrane.

Dans cette même étude, les auteurs ont montré que le DAG et les acides gras n'ont pas d'effet

sur la PLC. En plus de son effet direct, le PA potentialise la stimulation de la PLC par l'alpha-

thrombine ou les nucléotides guanyliques. Jones et Carpenter (1993) ont étudié l'activation par

le PA de la PLCγ1 native ou phosphorylée sur des résidus tyrosine et ont montré une fixation

directe du PA sur l'enzyme, l'activation résultant des modifications allostériques induites par

cette fixation. Jacob et al. (1993) ont étudié l'activation par le PA de la PLC de la membrane

plasmique d'oocytes de Xenopus laevis et ont montré que l'activité de cette enzyme était

multipliée par deux en présence de PA. Enfin, dans les cardiomyocytes, le PA se fixe avec

une haute affinité sur la PLCδ1, une isoforme majoritaire dans ces cellules (Henry et al.,

1995). Cette fixation est spécifique du PA et provoque une augmentation de l'activité del'enzyme ex vivo, mesurée par la formation d'IP3.

c) Le PA et les Protéines Kinases C.

Beaucoup d'études se sont interessées à l'effet du PA sur les protéines kinases C. Ainsi,

Epand et Stafford (1990) et Senisterra et al. (1993) ont montré que le PA peut remplacer la

60

phosphatidylsérine pour activer la PKC. Stasek et al. (1993) ont également étudié l'effet du

PA sur la PKC de cellules endothéliales et ont montré que l'activation de l'enzyme n'était pas

due à des contaminations par du DAG, ni à une formation de DAG par la PA-

phosphohydrolase. Leur résultats indiquent que le PA et le DAG activent la PKC par des

mécanismes différents qui doivent être impliqués dans les réponses des cellules à différents

stimuli.

Bocckino et al. (1991) ont identifié une protéine kinase dont l'activité est dépendante du

calcium et activable par le PA dans le coeur, la rate, le cerveau, le poumon et le testicule de

rat. Cette protéine cytosolique phosphoryle des protéines différentes de celles phosphorylées

par la PKC. Kahn et al. (1994) ont aussi décrit une nouvelle PKC, indépendante du calcium et

activée par le PA dans des extraits plaquettaires. Ils ont suggéré que cette enzyme était un

membre de la famille des protéines kinases dépendantes des phospholipides, et qu'elle devait

jouer un rôle très important dans la transmission des effets du PA, et même dans la

mitogenèse.

Plusieurs équipes se sont interessées au problème de la spécificité du PA vis à vis des

différentes isoformes de PKC. Limatola et al. (1994) ont testé les effets du PA sur plusieurs

isoformes de PKC en système acellulaire. Leur étude montre que le PA active trois isoformes

de PKC ( les isoformes α, ε et ζ) quand il est ajouté au cytosol de cellules surexprimant toutes

les formes de PKC. Dans les cellules surexprimant la PKCα, le PA est aussi efficace que le

DAG/PS et induit le même profil de protéines phosphorylées. En absence de calcium, la

PKCζ insensible au DAG est cependant activée par le PA; par contre, l'activation des autres

isoformes dépend du calcium. Ainsi, le PA pourrait être un activateur important de la PKCζ

dans des cellules où le calcium est à son taux basal.

Deux équipes (Senisterra et al., 1993; Henry at al., 1995) ont montré que l'activation de la

PKC et de la PLC par le PA ont les mêmes exigences en ions calcium en fonction du pH,

l'effet du PA sous forme dianionique (pH=7,4) ne nécessitant pas de calcium, alors que la

présence de cations Ca2+ est importante pour une activation maximale lorsque le PA est sous

forme monoanionique. Ainsi, l'activation par le PA de ces deux enzymes pourrait se faire par

un même mécanisme ou impliquer des sites communs.

d) Le PA et la voie MAP-Kinase.

Ghosh et al. (1996) ont récemment décrit que le PA se lie à Raf-1 kinase, une

sérine/thréonine kinase activée dans beaucoup de cellules par des facteurs de croissance. Des

études in vitro ont montré une fixation de haute affinité du PA sur le côté C-terminal (acides

aminés 398 à 423 de la kinase Raf-1 humaine). De plus, cette fixation du PA induit la

translocation de l'enzyme à la membrane. De cette manière, Raf-1 pourrait initier la

61

prolifération cellulaire, en activant MEK, l'enzyme qui catalyse la phosphorylation et

l'activation de la MAP-Kinase.

Siddiqi et Yang (1995) ont montré que l'interleukine 11 induisait la production de PA par la

voie PLD et activait la MAP-Kinase dans les cellules 3T3-L1 de souris. En effet,

l'accumulation de PA induite par un inhibiteur de phosphatidate phosphohydrolase comme le

NaF ou par addition de PA exogène augmente spécifiquement la phosphorylation sur des

tyrosines de deux protéines de 44 et 47 kDa, immunoprécipitables par des anticorps

monoclonaux anti-MAP-Kinase et augmente l'activité MAP-Kinase de ces cellules.

Des études plus anciennes montrent que le PA est capable d'inhiber la protéine GAP (GTPase

Activating Protein) qui active l'hydrolyse du GTP lié à Ras en GDP, ce qui permet le retour à

une forme inactive de Ras (Tsai et al., 1989). D'autre part, cette équipe a montré que le PA

augmente l'activité d'une protéine non-identifiée (GTPase inhibiting protein) qui

contrebalance l'effet de la GAP (Tsai et al., 1990). L'effet combiné du PA sur ces deux

protéines tend à augmenter la durée de vie de la forme active de Ras liée au GTP dans la

cellule, et à prolonger ainsi son activité biologique.

e) Le PA et les kinases lipidiques.

Il a été décrit que le PA pouvait activer la PI-4-phosphate-5-kinase (PI-5-kinase) (Moritz et

al., 1992). Cette enzyme conduisant au PIP2, substrat de la voie PLC, peut donc permettre la

régénération du PIP2 hydrolysé. Cet effet a été observé à la fois avec du PA exogène et avec du PA

généré de manière endogène. Récemment, Jenkins et al. (1994) ont étudié l'influence du PA sur des

isoformes particulières de PI-5-kinase. Ils ont montré que le PA stimule aussi bien l'activité de la PI-

5-kinase de type I purifiée à partir de membranes d'érythrocytes que celle de deux isoformes

immunoréactives de type I de cerveau de rat. Dans les mêmes conditions, le PA a peu d'effet sur

l'isoforme de type II.

Par contre, le PA inhibe la PI-3-kinase, qui conduit à la formation de phosphoinositides phosphorylés

en position 3 du cycle inositol, notamment le PI-3,4,5-P3, avec un IC50 de 10 à 20 µM (Lauener et

al., 1995). Ils supposent qu'il pourrait exister un mécanisme de régulation croisée entre la voie PLD

produisant le PA et la voie de la PI-3-kinase. Ainsi, la cytotoxicité de certains lipides pourrait être due

à leur coupure par une PLD, conduisant à la formation de PA suivie de l'inhibition de la PI-3-Kinase.

f) Le PA et la NADPH oxydase des neutrophiles.

Au cours d'une infection ou d'une inflammation, les cellules phagocytaires comme les

neutrophiles engendrent une explosion respiratoire (respiratory burst) résultant en la production de

dérivés oxygénés (anion superoxyde O2-) toxiques pour les agents infectieux. L'enzyme responsable

62

de cette activité est la NADPH oxydase. Cette enzyme est inactive dans les cellules à l'état basal, mais

elle est essentielle pour une défense adéquate. Son absence ou son défaut d'activation dans certaines

maladies chroniques peut conduire les patients à de sévères infections traitées à vie.

Son mécanisme d'activation a été très étudié et les résultats montrent qu'il s'agit d'un processus

dynamique qui résulte de l'interaction de plusieurs composés cytosoliques avec l'enzyme inactive liée

à la membrane. Cette interaction pourrait être induite par le PA. Bellavite et al. (1988) ont montré que

le PA pouvait remplacer à la fois les acides gras et le cytosol pour stimuler l'enzyme dans des

membranes de neutrophiles de porc. Agwu et al. (1991) ont démontré que le PA était un réel, mais

faible, activateur de la NADPH oxydase de neutrophiles humains quand il était apporté avec le

cytosol. Des études plus récentes du groupe de McPhail ont décrit que cette propriété était largement

augmentée en présence de faibles concentrations de diglycérides (Qualliotine-Mann et al., 1993;

McPhail et al., 1995; Waite et al., 1997). Ainsi, le PA généré par activation de la PLD au cours de la

stimulation des neutrophiles, en présence de DAG généré par la PA-phosphatase, doit jouer un rôle

important dans la stimulation de la NADPH oxydase cellulaire. Ces auteurs ont montré que

l'activation induite par le PA en présence de DAG met probablement en jeu des activités protéines

kinases. Ainsi, une protéine kinase stimulée par le PA serait impliquée dans l'activation de la NADPH

oxydase en système acellulaire. Cette protéine kinase aurait une masse de 125kDa et serait différente

des protéines kinases activées par les acides gras (protine kinase N), de la PKC, de la protéine kinase

activée par p21 et enfin des MAP-kinases. Elle phosphoryle un certain nombre de protéines

cellulaires, et en particulier p47-phox, une phosphoprotéine faisant partie du complexe de la NADPH

oxydase. En effet, la phosphorylation de p47-phox précède l'activation de la NADPH oxydase et est

nettement réduite par des inhibiteurs de protéines kinases.

Un autre composé cytosolique semble être impliqué dans l'activation de la NADPH oxydase. Il s'agit

de la petite protéine G, Rac2 (Knaus et al., 1991). Cette protéine est active sous sa forme liée au GTP

et dans les neutrophiles au repos, elle reste exclusivement dans le cytosol où elle forme un complexe

avec la protéine GDI (GDP dissociation inhibitor) (Chuang et al., 1993). Quand les cellules sont

activées, le complexe est détruit, ce qui permet à Rac2 d'être transloquée à la membrane et de

participer à l'activation de la NADPH oxydase. Comme l'acide arachidonique, le PA est capable de

détruire le complexe Rac-GDI, ce qui pourrait expliquer son rôle dans l'activation de la NADPH

oxydase. Cependant, d'autres études seront nécessaires pour confirmer cette hypothèse, d'autant plus

que la signification physiologique de l'activation de cette enzyme par le PA en comparaison avec

d'autres stimuli n'est pas très claire. Malgré tout, si la dissociation du complexe Rac-GDI par le PA

est vraiment impliquée dans l'activation de la NADPH oxydase, alors peut-être que ce type de

mécanisme pourrait expliquer les effets de second messager du PA dans d'autres systèmes.

g) Le PA et la prolifération induite par des facteurs de croissance.

63

Le PA apporté de manière exogène peut exercer un effet mitogénique dans différents types de

cellules, en particulier les fibroblastes (Siegmann, 1987; Pearce et al., 1994; Krabak et Hui, 1991;

Knauss et al., 1990; Wood et al., 1993; Bashir et al., 1992). Les effets du PA exogène ont attribués

par certains auteurs au lyso-PA contaminant les PA commerciaux. Cependant, le PA endogène a été

impliqué dans la réponse proliférative à certains agonistes, tel que l'EGF (Kaszkin et al., 1992), le

PDGF (Knauss et al., 1990; Fukami et Takenawa, 1992), l'interleukine 2 (Cano et al., 1992; Merida et

al., 1993), l'interleukine 1 (Bursten et Harris, 1994; Bursten et al., 1994) et l'interleukine 11 (Siddiqi

et Yang, 1995). De plus, le PA transmet apparemment les effets mitogéniques de la sphingosine et de

la sphingosine-1-phosphate (Spiegel, 1993; Zhang et al., 1990).

Des travaux de notre équipe ont montré que la lectine mitogénique Concanavaline A (Con A)

induisait dans les thymocytes de rat une augmentation des taux de PA qui précédait la prolifération

(Marcoz et al., 1993a). Notre équipe a aussi montré que le PA active in vitro une enzyme qui dégrade

spécifiquement l'AMPc (PDE 4) purifiée par HPLC à partir de thymocytes de rats (Savany et al.,

1996). Cette activation de la PDE4 augmente la Vmax de l'enzyme sans affecter son Km (Marcoz et

al., 1993a). Némoz et al. (1996) ont montré une activation par le PA des isoformes recombinantes de

PDE4 obtenues par transfection de cellules d'insectes ou de mammifères. En outre, ces études

montrent que le PA stimule uniquement l'activité des isoformes ayant une extrémité N-terminale

longue (partie régulatrice de l'enzyme). Outre cette particularité vis à vis des isoformes de PDE,

l'activation par le PA semble dépendre également de la composition en acides gras des espèces

moléculaires de PA (El Bawab et al., 1997). De plus, nous avons également pu établir dans des

cellules mononuclées humaines une corrélation entre la production de PA et l'activation des PDE par

différents agonistes (présent travail). Une activation de la PDE AMPc-spécifique a également été

observée par un autre groupe (Di Santo et al., 1995).

D'autres études ont montré une inhibition par le PA de l'accumulation de l'AMPc induite par la PGE1

dans des fibroblastes WI38 (Proll et al., 1985), par la PGE2 ou la forskoline dans les fibroblastes 3T3

(Wang et al., 1994), en inhibant l'adénylyl cyclase. Murayama et Ui (1987) ont montré que seuls les

PA contenant des acides gras insaturés étaient capables d'inhiber cette enzyme dans les fibroblastes

3T3. Par contre, l'effet inhibiteur du PA n'étant pas retrouvé dans les plaquettes, ces auteurs ont

proposé l'hypothèse d'une spécificité cellulaire pour l'inhibition de l'adénylyl cyclase par le PA.

La diminution des taux d'AMPc qui résulte de l'effet du PA sur ces enzymes pourrait être un des

éléments permettant un déroulement optimal de la réponse proliférative.

Siddiqi et Yang (1995) ont associé la prolifération induite par les facteurs de croissance à une

activation de la MAP-Kinase dépendante du PA, par un mécanisme qui résulterait de l'induction de la

tyrosine kinase, MEK. Dans ce système, le lyso-PA est sans effet. Ainsi, une tyrosine kinase

dépendant des phospholipides pourrait médier certains des effets de second messager du PA.

Cependant, aucune tyrosine kinase dépendante du PA n'a jamais été identifiée en système acellulaire,

64

et le PA pourrait exercer son influence en un autre point de la transduction du signal. Par exemple,

l'activation de la MAP-Kinase pourrait résulter de l'activation de Raf1 par le PA.

Enfin, le récepteur de l'EGF est autophosphorylé sous sa forme active, et il est connu que sa

déphosphorylation par des protéines tyrosine phosphatases permet une régulation négative de ses

fonctions. Tomic et al. (1995) ont montré qu'un traitement des cellules A431 par le PA induit une

activité de déphosphorylation et diminue ainsi les phosphorylations du récepteur de l'EGF. Cet effet

serait du à une interaction du PA avec les protéines tyrosines phosphatases, qui les ferait passer d'un

état inactivé à un état activé, en libérant leur domaine SH2.

h) Existe-t-il un récepteur pour le PA?

Il est possible que certaines réponses induite par le PA résultent de sa liaison à un récepteur.

Plusieurs groupes se sont intéressés à cette possibilité, mais aucun n'a pu montrer réellement une

liaison spécifique du PA aux membranes cellulaires. Par exemple, Murayama et Ui (1987) ont conclu

que des recepteurs membranaires étaient impliqués dans l'inhibition de l'adénylyl cyclase et

l'hydrolyse de phospholipides induites par le PA dans les fibroblastes. Cette hypothèse était étayée

par le fait qu'un prétraitement des cellules avec la toxine cholérique ou la toxine pertussique inhibait

les effets du PA, ce qui indiquait que l'activation était induite par la liaison du PA à un récepteur

couplé à un protéine G.

Pearce et al. (1994) ont suggéré que l'hydrolyse des phosphoinositides et la mitogénèse induites par le

PA dans les astrocytes découleraient de liaison du PA à un récepteur spécifique. D'autres auteurs

pensent que la polymérisation des filaments d'actine dans les fibroblastes pourrait résulter d'une

fixation spécifique du PA sur son récepteur (Ha et Exton, 1993). De plus, Ryder et al. (1993) ont

observé que le turnover des phosphoinositides stimulé par le PA est inhibé par un prétraitement des

cellules avec la toxine pertussique, ce qui est en faveur de l'hypothèse d'une réponse transmise par un

récepteur couplé à une protéine G.

Dans une autre étude, il a été montré qu'à la fois le dioléoyl-PA et le lyso-PA pouvaient induire des

dépolarisations dépendantes du calcium dans les oocytes de Xenopus laevi (Ferguson et Hanley,

1992). De telles réponses n'ont pas pu être obtenues par injection intracellulaire de l'agoniste, ce qui

indique l'intervention d'un récepteur à la surface des cellules. De plus, les réponses des oocytes au PA

se font de la même manière que celles induites par l'activation de récepteurs couplés à des protéines G

pour l'hydrolyse des phosphoinositides. Ces auteurs emettent l'hypothèse que ces cellules doivent

communiquer entre elles par l'activation de récepteurs du PA. Des études supplémentaires sont

nécessaires pour déterminer l'importance de ce système agoniste-récepteur dans d'autres types

cellulaires.

65

Familles de PDE Substrat(s) Modulateursintracellulaires

Inhibiteurs

PDE1 AMPc et GMPc Ca2+/CaMPhosphorylation

IBMX

PDE2 AMPc et GMPc GMPc (+) EHNA

PDE3 AMPc et GMPc GMPc (-)Phosphorylation

FenoximoneMilrinone

PDE4 AMPc PhosphorylationAMPc

RO 20-1724Rolipram

PDE5 GMPc Phosphorylation ZaprinastDipyridamole

PDE6 GMPc Transducine --

PDE7 AMPc ? ?

Tableau 1 : Familles de PDE, spécificité du substrat et des inhibiteurs, régulations.

66

IV- Les phosphodiestérases des nucléotides cycliques (PDEs).

L'AMPc et le GMPc sont des seconds messagers intracellulaires importants,

responsables de réponses biologiques générées par un grand nombre de signaux

extracellulaires. Les concentrations cellulaires de ces nucléotides cycliques sont déterminées

par un équilibre entre leur synthèse et leur dégradation. La régulation de la synthèse des

nucléotides cycliques par les adénylyl et guanylyl cyclases est bien connue maintenant, et la

plupart des étapes de ce mécanisme ont été élucidées. Par contre, le rôle de la dégradation des

nucléotides cycliques par les phosphodiestérases (PDEs) au cours de la stimulation est

nettement moins compris.

Peu de temps après la découverte et la caractérisation de l'AMPc, une PDE supposée ubiquitaire a été

partiellement purifiée par Butcher et Sutherland (1962). Dans les années 1970, la diversité des PDEs a

été reconnue quand Thomson et Appleman (1971) ont séparé et partiellement purifié dans des tissus

variés, différents types de PDEs, ayant des affinités variables pour le GMPc et l'AMPc, ainsi que des

propriétés physiologiques différentes. Depuis, les résultats d'isolement, purification et séquençages

directs de PDEs, ainsi que les techniques de clonage moléculaire ont permis de démontrer clairement

que les PDEs formaient un groupe de plusieurs isoformes appartenant à sept familles distinctes

(Tableau 1). Les sept familles (PDE1 à PDE7) diffèrent par leur séquence primaire d'acides aminés,

leur affinité pour le GMPc et l'AMPc, leur réponse à différents effecteurs, leur sensibilité à des

inhibiteurs spécifiques et leur mécanisme de régulation biologique (Tableau 1). Des études de clonage

moléculaire ont révélé qu'un même gène pouvait conduire à plusieurs isoformes par usage de

promoteurs différents ou par épissage variable des ARNm.

Toutes les PDEs de mammifères présentent une structure commune : un domaine conservé d'environ

270 acides aminés (25 à 40% d'homologie entre les différentes familles et 70-80% dans une même

famille) en général dans la région C-terminale et des régions N-terminales divergentes (Figure 14)

(Charbonneau, 1990).

Diverses études ont permis de montrer que le domaine conservé de la partie C-terminale correspond

au domaine catalytique (Stroop et al., 1989; Stroop et Beavo, 1992; Novack et al., 1991; Meacci et

al., 1992; Jin et al., 1992). Il contient d'une part des éléments spécifiques à chaque famille, qui

déterminent leur affinité pour les substrats ou leur sensibilité aux inhibiteurs, et d'autre part des

éléments de structure communs, en particulier deux séquences consensus de liaison au Zinc riches en

histidines (Francis et al., 1994).

La région N-terminale contient des séquences qui interviennent probablement dans la régulation

particulière de chaque famille de PDE. Ainsi, dans la famille des PDE de type 1, cette région contient

les sites de liaison du complexe Ca2+/CaM et les sites de phosphorylation par une kinase dépendante

de la CaM ou une kinase A. Dans la famille des PDE de type 2, elle

67

H2N COOH

Domaine régulateur Domaine catalytique

Ca2+/CaM GMPc

AMPc et /ou GMPc

Figure 14 : Structure générale des PDEs.

68

comprend le site non-catalytique de liaison du GMPc alors que dans la famille des PDE de

type 3, des domaines hydrophobes de liaison à la membrane ou des sites de phosphorylation

par des kinases sensibles à l'insuline ou des kinases A ont été décrits dans cette région. Des

sites de phosphorylation par des kinases A ont également été trouvés dans cette région dans la

famille des PDE de type 4. Enfin, dans les familles de PDE des types 5 et 6, cette région N-

terminale contient des sites non catalytiques de liaison du GMPc et des sites de

phosphorylation par des kinases G.

IV-1. Les différentes familles de PDE.

a) La PDE de type 1 stimulée par le complexe Calcium/calmoduline (Ca2+/CaM).

Les PDEs de la famille 1 comprennent au moins quatre sous-familles différentes qui

peuvent être activées par le complexe Ca2+/CaM et inhibées par phosphorylation. La plupart

des isoformes ont plus d'affinité pour le GMPc que pour l'AMPc.

Trois gènes de PDE1 sont connus : les gènes A (avec deux variants 1A1 et 1A2), B (un seul

variant) et C (avec cinq variants PDE1C1 à PDE1C5). La PDE1B a la même affinité pour le

complexe Ca2+/CaM que la PDE1A2. L'isoforme B peut être phosphorylée par une protéine

kinase dépendante de la CaM, alors que la PDE1A est substrat de la PKA. La PDE1A1

(59kDa) trouvée dans le coeur de boeuf et la PDE1A2 (61kDa) trouvée dans le cerveau de

boeuf, ont la même séquence primaire, sauf pour les 18 acides aminés N-terminaux. Cette

différence affecte beaucoup la capacité des isoformes à être activées par le calcium. En effet,

la PDE1A1 a une affinité 10 fois plus élevée que la PDE1A2 pour le calcium (Novack et al.,

1991).

Récemment, des expériences de délétions sur l'ADNc de la PDE1A2 ont permis de démontrer

l'existence de deux sites de liaison à la calmoduline séparés par 90 acides aminés (Sonnenburg

et al., 1995). Ces expériences ont également révélé l'existence d'une région inhibitrice située

entre les deux domaines de liaison à la CaM et qui fonctionne en absence de Ca2+ et de CaM.

Récemment, deux rapports sont parus au sujet du clonage et de la caractérisation de la

PDE1C. Deux formes humaines (1C1 et 1C3) avec des extrémités C-terminales différentes

ont été isolées (Loughney et al., 1996). Le gène complet de la PDE1C1 code pour une

protéine de 709 acides aminés et celui de la PDE1C3 pour une protéine de 634 acides aminés.

Une forte expression de ces isoformes est retrouvée dans le cerveau et le coeur humain. Une

protéine tronquée qui commence à la Met-150 de la PDE1C3 a été exprimée dans des levures

et a été caractérisée.

Un autre variant du gène C , le variant PDE1C2 a été cloné à partir d'épithélium olfactif de rat

(Yan et al., 1995). Les paramètres cinétiques de cette isoforme sont proches de ceux des

autres PDE1C qui ont un Km d'environ 1 µM. L'ARNm codant pour cette protéine est

fortement exprimé dans les tissus olfactifs, et il n'a pas été détecté dans les autres tissus testés.

69

Une forte expression de cette isoforme semble donc nécessaire à la signalisation olfactive.

Enfin, d'autres variants de PDE1C, les PDE1C1, 1C4 et 1C5 ont été identifiés dans les tissus

de souris. Ils ont les mêmes propriétés cinétiques, mais répondent différemment à la

stimulation par le Ca2+ (Yan et al., 1996).

Il est important de noter que les variants de PDE1C sont différents des autres PDE1 au point

de vue cinétique. En effet, ils ont une forte affinité à la fois pour l'AMPc et le GMPc, alors

que les PDE1A et PDE1B hydrolysent préférentiellement le GMPc à des concentrations

physiologiques. Cette propriété pourrait permettre la détection de nouvelles isoformes de

PDE1C dans d'autres tissus.

b) La PDE de type 2 stimulée par le GMPc.

A présent, deux isoformes de PDE stimulées par le GMPc et issues d'un même gène

ont été décrites (PDE2A1 et PDE2A2) (Yang et al., 1994). Cette enzyme est présente à la fois

sous forme soluble et sous forme liée à la membrane, et les proprités cinétiques des deux

formes sont vraiment similaires. La région N terminale de ces enzymes contient un site

allostérique de liaison du GMPc, qui peut donc agir comme un effecteur. Ainsi, les deux

isoformes peuvent hydrolyser l'AMPc et le GMPc avec des cinétiques coopératives, et le

GMPc augmente l'hydrolyse de l'AMPc. Le rôle physiologique des PDE2 est donc, en

présence d'un taux élevé de GMPc, de diminuer le taux d'AMPc. Il est possible que de

nouvelles formes de PDE2 soient trouvées.

Un seul inhibiteur spécifique de la PDE2 a été décrit : il s'agit de l'érythro-9-(2-hydroxy-3-

nonyl)adénine (EHNA). Des travaux récents commentent les effets physiologiques de cet

inhibiteur. Ainsi, il est connu que l'AMPc stimule l'entrée de calcium dans les cardiomyocytes

de grenouille. Le GMPc, qui active la PDE2 dans ce type cellulaire, a un effet inhibiteur surles flux de calcium stimulés par l'AMPc. L'EHNA, avec une IC50 de 3 µM, inverse cet effet

inhibiteur du GMPc. Cette dose correspond à l'inhibition spécifique de la PDE2 dans ces

préparations (Mery et al., 1995).

c) La PDE de type 3 inhibée par le GMPc.

La PDE3 a une forte affinité (Km inférieur au µM) à la fois pour l'AMPc et le GMPc,

mais la Vmax d'hydrolyse de l'AMPc est très supérieure à celle d'hydrolyse du GMPc. De

plus, de faibles concentrations de GMPc peuvent inhiber l'hydrolyse de l'AMPc par cette

enzyme. Deux gènes A et B ont été clonés à partir de banques d'ADNc de tissu adipeux de rat

et de coeur humain ( Meacci et al., 1992; Taira et al., 1993). La PDE3A et la PDE3B

possèdent la même extrémité C-terminale mais diffèrent par leur région N-terminale. Le

domaine N-terminal paraît être hydrophobe et serait responsable de l'association de l'enzyme

70

avec la membrane. Enfin, l'activité de ces isoformes peut être régulée par phosphorylation-

déphosphorylation.

Un autre ADNc codant pour une protéine de 658 acides aminés a été isolé récemment d'une

banque d'ADNc de placenta humain (Kasuya et al., 1995). Ainsi, en plus du transcrit de 7,5 kb

du tissu cardiaque humain, un transcrit de 4,4 kb a été identifié dans le placenta humain et les

cellules HeLa. Ce nouveau transcrit pourrait être le résultat d'une transcription à partir d'un

promoteur différent.

L'existence de promoteurs différents et les mécanismes d'épissage variable conduisent à des

protéines différentes exprimées de façon spécifique en fonction du tissu ou de la cellule. Une

expression différente des gènes A et B a été montrée par hybrydation in situ au cours du

développement embryonnaire et postnatal du rat (Reinhardt et al., 1995). En effet, la PDE3B

est fortement exprimée dans les adipocytes durant l'embryogénèse et dans les spermatocytes

chez le rat adulte et peu exprimée dans le foie au cours du développement. L'ARNm de la

PDE3A est abondant dans le muscle lisse et le muscle cardiaque. Il est détecté dans le

myocarde dès le début de la différenciation des myocytes et durant tout le stade adulte.

Contrairement à la PDE2, cette famille compte beaucoup d'inhibiteurs spécifiques

(Manganiello et al., 1995), tels que la milrinone et l'enoximone, qui peuvent stimuler la

contractilité du myocarde et relaxer le muscle lisse vasculaire. Le fait que les différents

variants de PDE3 aient un profil d'expression différent pourrait rendre plus facile l'étude de

l'effet physiologique de chaque isozyme.

d) La PDE de type 4 spécifique de l'AMPC.

Les enzymes de cette famille ont une très haute affinité pour l'AMPc et pratiquement

aucune activité avec le GMPc comme substrat. Une caractéristique commune à toutes les

isoformes de cette famille est leur sensibilité à l'inhibition par le Rolipram. Quatre gènes

différents de PDE4 (PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE4D) ont été identifiés dans des tissus de

rat (Colicelli et al., 1989; Swinnen et al., 1989a et 1989b; Davis et al., 1989), puis la présence

de quatre gènes a également été confirmée chez l'homme (Bolger et al., 1993). Les techniques

de biologie moléculaire ont montré une homologie presque parfaite entre des isoformes de

PDE humaine et de rat (98,2% d'homologie entre la PDE4D3 humaine et celle de rat),

indiquant une grande conservation des gènes de PDE au cours de l'évolution et le rôle crucial

de ces enzymes dans la cellule. Enfin, chacun de ces gènes code pour plusieurs transcrits, ce

qui rend la famille des PDE4 particulièrement complexe.

La diversité de structure des différentes isoformes de cette famille se situe au niveau N-

terminal. Elles se répartissent en 2 groupes : le premier correspondant à des variants longs

possède une séquence peptidique complète du côté N-terminal, alors que le deuxième groupe

71

correspondant à des variants courts possède une séquence tronquée du coté N-terminal.

La première enzyme de cette famille à avoir été clonée est la PDE4A1 (Davis et al., 1989).

L'enzyme recombinante ou l'enzyme native (79 kDa) de cervelet sont toutes les deux liées à la

membrane et on pense qu'elles contiennent une région parmi les 25 acides aminés N-

terminaux qui serait responsable de l'association à la membrane. Un autre clone de taille plus

importante, la PDE4A5 (109 kDa) a été identifiée et caractérisée dans le cerveau (McPhee et

al., 1995). Cette isoforme a un domaine N-terminal unique de 256 acides aminés. De telles

différences dans la région N-terminale, qui résultent de l'épissage variable d'un même gène

induisent des changements importants dans la localisation subcellulaire. La PDE4A1 est

trouvée exclusivement dans les fractions particulaires, alors que la PDE4A5 est détectée dans

les fractions cytosoliques et membranaires de cerveau. Ni des fortes concentrations salines, ni

des détergents tels que le triton X-100 ne sont capables de détacher l'enzyme de la membrane.

La PDE4A1 et la PDE4A5 sont trouvées dans des parties différentes du cerveau de rat : les

deux sont fortement exprimées dans le cortex, l'hypothalamus et le striatum. Par contre, on ne

trouve pas de PDE4A5 dans le cervelet alors que des faibles quantités de PDE4A1 peuvent y

être détectées.

Récemment, une nouveau transcrit provenant d'un ARNm ayant subi un autre épissage et issu

d'un locus de PDE4A de rat a été identifié et nommé PDE4A8 (Bolger et al., 1996). La

structure de cette isoforme est différente de celle de la PDE4A1 ou de la PDE4A5 à cause

d'une variation d'épissage à son extrémité 5'. Quand elle est exprimée dans les cellules COS,

cette protéine de 763 acides aminés est présente aussi bien dans le cytosol que dans les

membranes, ce qui ressemble à la distribution cellulaire de la PDE4A5. De plus, la PDE4A8 a

une autre propriété en commun avec la PDE4A5 : toutes les deux ont une Vmax qui est 3 à 5

fois plus faible que celle de la PDE4A1. Cependant, la PDE4A8 a un profil d'expression

unique, puisqu'elle est retrouvée dans les testicules et pas du tout dans les tissus où les

PDE4A1 et PDE4A5 sont exprimées.

L'identification des isoformes de PDE4 exprimées dans certains types de cellules a permis

d'étudier les différences fonctionnelles entre les membres de cette famille. L'expression

simultanée des quatre gènes de PDE4 a été démontrée par hybridation in situ dans les

testicules de rat (Morena et al., 1995). Les PDE4A et 4C sont trouvées préferentiellement

dans les cellules germinales aux stades méiotique et post-méoitique de la différentiation, alors

que les PDE4B et 4D sont trouvées surtout dans les cellules de Sertoli. Il a été montré que le

taux de PDE4D variait selon les différentes sections des tubes séminifères. De telles

fluctuations de la PDE4D dans les tubes séminifères correspondent probablement à des

fluctuations dans la réponse à la FSH des cellules de Sertoli. Cependant, la signification

72

fonctionnelle de l'expression différentielle des gènes de PDE4 reste à déterminer.

e) La PDE de type 5 spécifique du GMPc.

La PDE5 a une grande affinité pour le GMPc comparativement à son affinité pour

l'AMPc, et possède des sites non catalytiques de liaison du GMPc. Cette enzyme est fortement

exprimée dans les tissus pulmonaires, le muscle lisse vasculaire et les plaquettes. Cependant,

malgré le fait qu'une activité PDE5 soit retrouvée dans un grand nombre de tissus, une seule

isoforme, la PDE5A, a été isolée et clonée (McAllister-Lucas et al., 1993). La séquence de la

région catalytique ressemble davantage à celle de la PDE des photorécepteurs (PDE6) qu'à

celle des autres PDEs. La partie N-terminale contient deux domaines répétitifs, qui ont une

séquence d'acides aminés comparable à celle des domaines non catalytiques de liaison du

GMPc présents dans les PDE2 et PDE6. Des études sur la cinétique de dissociation du GMPc

de ces sites de fixation suggèrent qu'il existe probablement plus d'un site de liaison du GMPc.

Plus récemment, deux sites de liaison du GMPc ont été localisés dans un région conservée

proche de l'extrémité N-terminale (McAllister-Lucas et al., 1995). Par des analyses de

mutation ponctuelle, il a été déterminé que les résidus acide aspartique sont importants dans

chacun des deux sites.

f) La PDE de type 6 des photorécepteurs spécifique du GMPc.

Le rôle fonctionnel des PDEs des photorécepteurs dans la phototransduction est

maintenant bien établi : la PDE6 est un effecteur critique dans le processus de

phototransduction, comparable à l'adénylyl cyclase dans la transduction du signal induite par

un récepteur. La PDE des batonnets est un tetramère (αβγ2), qui contient deux sous-unités

catalytiques (αβ) et deux sous-unités inhibitrices (γ). Cette enzyme est maintenue à l'état

inactivé (dans le noir) par l'interaction entre les sous-unités inhibitrices γ et les sous-unités

catalytiques αβ. La PDE des cônes est un homodimère de deux sous-unités identiques α'

(PDE6C) (Li et al., 1990). Récemment, un ADNc humain codant pour la sous-unité α' des

cônes a été isolé (Viczian et al., 1995). Une identité de séquence de 89 et 78% a été montrée

entre la PDE de cônes humaine et les PDEs de cônes de boeuf et de poulet, respectivement.

g) La PDE de type 7 spécifique de l'AMPc et insensible au rolipram.

Cette enzyme (PDE7A1) a d'abord été clonée à partir d'une banque d'ADNc humain, et

plus tard la présence de formes natives a été détectée dans plusieurs tissus et en particulier

dans le muscle squelettique (Michaeli et al., 1993). Une PDE7 recombinante montre une très

forte affinité pour l'AMPc (environ 0,2 µM), mais n'est pas inhibée par les inhibiteurs de

73

PDE4 (tel que le rolipram) ou le GMPc ou les inhibiteurs de PDE3 comme la milrinone.

IV-2 Les PDEs dans les cellules lymphoïdes.

En 1972 déjà, Lagarde et Colobert avaient détecté une activité phosphodiestérasique

dans des lymphocytes de sang périphérique humain et avaient étudié les propriétés cinétiques

et l'affinité pour les substrats de ces PDEs.

Une forte activité PDE est généralement associée à une croissance rapide dans des lignées de

cellules lymphoïdes humaines ou dans des cellules leucémiques (Epstein et al., 1977;

Thompson et al., 1976; Epstein et Hachisu, 1984). L'équipe d'Epstein a également montré que

l'activitée PDE lymphocytaire est augmentée de 5 à 10 après 24-48H de stimulation avec la

phytohémagglutinine (PHA). Takemoto et al. (1979) ont montré que la prolifération de

lymphocytes humains de sang périphérique en réponse à la Con A est associée à un

changement d'activité AMPc-PDE, qui devient plus active et moins sensible à l'inhibition par

le GMPc. Ce processus d'induction semble recquérir une élévation du GMPc, mais ce GMPc

agirait probablement sur les étapes précoces de la synthèse protéique plutôt qu'à travers une

interaction directe avec l'enzyme. En outre, l'augmentation de l'activité PDE suit en parallèle

l'augmentation d'incorporation de thymidine tritiée, et les doses optimales pour la hausse

d'activité PDE sont aussi optimales pour l'incorporation de thymidine tritiée. De plus, le

cycloheximide empêche l'élévation de l'activité PDE et l'incorporation de thymidine tritiée, ce

qui prouve qu'une synthèse protéique de novo est nécessaire à la hausse d'activité PDE

observée.

Inversement, en cas de réponse immunitaire diminuée, l'activité PDE est faible. Ainsi, d'après

des résultats de notre équipe, les cellules mononucléées de patients atteints de sarcoïdose

possèdent une activité PDE réduite de moitié par rapport à celle des cellules de témoins sains

(Némoz et al., 1993). Meskini et al. (1990) ont trouvé une activité PDE significativement

diminuée dans les PBMC de personnes âgées par rapport à des cellules de témoins jeunes.

Cette observation peut être liée au déclin des défenses immunitaires qui accompagne le

vieillissement.

Dans les lymphocytes, toutes les familles de PDE ne sont pas représentées.

En effet, la PDE1 n'existe pas dans les cellules T normales au repos (Epstein et al., 1987;

Valette et al., 1990, Marcoz et al., 1993 a et b; Robicsek et al., 1989 et 1991). Cependant,

certains auteurs ont montré une activité PDE de type 1, la PDE1B1, dans des lignées

leucémiques et pensent que cette enzyme serait impliquée dans l'apoptose (Jiang et al., 1996).

Les données de la littérature concernant la présence de PDE2 dans les lymphocytes sont

74

contradictoires. Epstein et al. (1977), Azhaeva et al. (1987) et Robicsek et al. (1989) n'ont pas

mis en évidence de forme stimulable par le GMPc dans des lymphocytes purifiés et

fractionnés. De nombreux travaux antérieurs ont pourtant identifié cette isoforme dant des

thymocytes de rat (Francks et Macmanus, 1971) et dans des lymphocytes humains (Hait et

Weiss, 1979). Notre équipe a montré l'existence de cette forme de PDE GMPc-stimulable

dans les thymocytes de rat (Valette et al., 1990; Marcoz et al., 1993b), mais pas dans les

PBMC (Meskini, 1992). Récemment, Michie et al. (1996) ont décrit qu'en présence de faible

concentrations de GMPc (10 µM), l'activité PDE2 constitue la majorité de l'activité PDE de

thymocytes murins (environ 80%).

Les autres familles de PDEs ont été décrites dans les cellules lymphoïdes.

La PDE3 a été identifiée par plusieurs équipes dans des lymphocytes de sang périphérique

humain (Takemoto et al., 1978 et 1979; Epstein et Hachisu, 1984; Robicsek et al., 1991;

Ichimura et Kase, 1993; Tenor et al., 1995). Notre équipe a montré l'existence de cette forme

dans le coeur de rat (Dubois et al., 1990), les thymocytes de rat (Valette et al., 1990, Marcoz

et al., 1993 a et b) et les lymphocytes humains (Meskini, 1992). Marcoz et al. (1993 b) ont

montré que l'association d'un inhibiteur de PDE3 comme la milrinone et d'un inhibiteur de

PDE4 comme le rolipram ont un effet synergique sur l'accumulation d'AMPc et sur

l'inhibition de la prolifération de thymocytes de rat. Des résultats similaires ont également été

obtenus avec l'association d'inhibiteurs de PDE4 et de PDE5 comme le M&B22948. En

inhibant la PDE5, le M&B22948 induit une augmentation du taux de GMPc intracellulaire qui

en retour inhibe l'hydrolyse de l'AMPc par la PDE3. D'autre part, Ichimura et Kase (1993) ont

identifié une nouvelle isozyme de PDE dans les cellules T et plus récemment, d'autres auteurs

ont montré que cette nouvelle isoforme est probablement la PDE7A1 (Bloom et Beavo, 1996).

Enfin, Giembycz et al. (1996) ont montré que la fraction particulaire de lymphocytes CD4+ et

CD8+ contient majoritairement de la PDE3, alors que la fraction cytosolique est plus riche en

PDE4 (65%) et contient également de la PDE7. Les isoformes de PDE4 présentes dans les

lymphocytes T de sang périphérique humain ont été analysées (Némoz et al., 1996). En

utilisant un anticorps anti-PDE4, ces auteurs ont montré que la PDE4A5 est l'isoforme

majoritaire exprimée dans ces cellules. Lorsqu'un anticorps sélectif, anti-PDE4D est utilisé,

deux isoformes, la PDE4D1 et la PDE4D2 sont détectées. Par contre, bien que l'ARNm de la

PDE4D3 soit exprimé dans ces cellules, la protéine correspondante n'est pas détectable.

IV-3 Rôle des acides gras sur l'activité PDE.

En 1983, Coquil avait observé une inhibition de la PDE5 du poumon de rat et une

stimulation de la PDE1 du cerveau de rat par des acides gras insaturés (18:1n-9, 18:2n-6,

20:4n-6). La puissance de l'inhibition augmente avec le nombre de doubles liaisons sur la

chaîne carbonée. Les acides gras saturés (14:0, 16:0, 18:0 et 20:0) ne modifient pas l'activité

75

PDE5 et activent fortement la PDE1. Les esters méthyliques de ces acides gras ne modifient

pas l'activité phosphodiestérasique. Yamamoto et al.(1984) et Laychock (1989) ont montré

que les acides gras saturés n'ont pas d'effet sur la PDE2 du foie de veau alors que les acides

gras polyinsaturés sont plutôt inhibiteurs. Par contre, un effet activateur a été observé en

présence d'acides myristoléïque et palmitoléïque.

Parallèlement, Dubois et al. (1993) ont montré que les acides gras polyinsaturés sont des

inhibiteurs plus puissants que les acides gras saturés quelle que soit l'isoforme considérée dans

le cytosol de coeur de rat : PDE1, 2, 3, 4. La PDE2 semble l'isoforme la plus sensible aux

effets inhibiteurs des acides gras polyinsaturés testés.

Dans le cadre d'une étude nutritionnelle, Valette et al. (1991) ont observé que la

phosphodiestérase de thymocytes de rats nourris avec des régimes riches en huiles de poisson

(acides gras n-3) répond moins bien à l'activation par la Con A.

Dans notre équipe, Marcoz et al. (1993a) ont étudié les effets de l'acide phosphatidique et de

l'acide arachidonique sur les cinq isoformes de PDE présentes dans les thymocytes de rat.

Parmi les 5 pics d'activité PDE présents, seuls deux correspondant à des PDE4 sont sensibles

au PA à des concentrations physiologiques. L'acide phosphatidique active significativement la

PDE4, rolipram sensible, alors que l'acide arachidonique est un inhibiteur puissant de toutes

les isoformes de PDE sauf de la PDE4. Enfin, le dérivé 5-hydroxylé de l'acide arachidonique

(5-HETE) est faiblement activateur des PDEs 2 et 4.

D'autres travaux de notre équipe ont permis de montrer que le dérivé 12-hydroxylé de l'acide

arachidonique (12-HETE) avait également un effet sur les activités phosphodiestérasiques des

PBMC. En effet, le 12-HETE augmente les activités AMPc-PDE et GMPc-PDE dans les

cellules mononucléées humaines de sang périphérique (Joulain, 1994).

Des études plus récentes de Savany et al. (1996) ont montré que les effets du PA sur les

activités PDEs dépendent de sa composition en espèces moléculaires. Ainsi, le pic 3 (PDE4)

est activé par le PA, avec une efficacité variable en fonction de la composition et du degré

d'insaturation du phospholipide. Le pic 2 (PDE4 également) est inhibé seulement par des PA

contenant des acides gras saturés. D'autre part, El Bawab et al.(1997) ont étudié les effets de

différentes espèces moléculaires de PA sur l'activité d'une isoforme recombinante, la

PDE4A5. Tout d'abord, leurs résultats montrent que le PA extrait de cellules stimulées par la

Con A est plus activateur que le PA extrait de cellules non stimulées. De plus, l'analyse des

espèces moléculaires de PA extrait de cellules stimulées ou non par la Con A révèle une

augmentation significative de l'espèce 18:0/20:4 et une diminution significative des autres

espèces moléculaires, en particulier celles contenant du palmitate, au cours de l'activation.

Enfin, les espèces contenant des acides gras insaturés sont activatrices alors que celles

contenant deux acides gras saturés n'ont pas d'effet sur l'activité de l'enzyme. En utilisant des

isoformes de PDE4 recombinantes provenant de trois gènes différents (PDE4A, PDE4B et

PDE4D), Némoz et al. (1997) ont étudié la structure des PDEs activées par le PA et ont

cherché quel(s) mécanisme(s) pouvai(en)t intervenir dans cette activation. Les variants

76

"longs" exprimés à partir de chaque gène (PDE4A5, PDE4B1 et PDE4D3) sont activés par le

PA, alors que les variants "courts" (PDE4A1, PDE4B2, PDE4D1 et PDE4D2) ne le sont pas.

La phosphatidylsérine est un activateur aussi efficace que le PA, mais pas la

phosphatidylcholine, ce qui indique que seuls les phospholipides anioniques sont activateurs.

Le PA augmente la Vmax de l'enzyme sans affecter le Km et induit également des

changements dans les besoins en Mg2+ pour l'hydrolyse. Le demi-effet stimulateur du PA est

obtenu avec une dose de 10 µg/ml. Enfin, le mécanisme de la stimulation par le PA n'implique

pas une phosphorylation, et plusieurs observations indiquent qu'il existe une interaction

directe entre la protéine et le PA.

V- Altérations du système immunitaire au cours du vieillissement et peroxydation

lipidique : implication du 12-HETE.

V-1. La réponse immune et le vieillissement.

De nombreuses études ont montré que le vieillissement est accompagné d'une

altération de la régulation du système immunitaire (Makinodan et Day, 1980). Ainsi, le déclin

progressif des fonctions immunes dû à l'âge peut être relié à l'apparition de rhumatismes ou de

maladies infectieuses ou malignes (Solana et al., 1991).

Bien que tous les types cellulaires du système immunitaire soient affectés par l'âge, l'altération

majeure se produit dans les lymphocytes T (Makinodan et Day, 1980). La dimunition de la

réponse immunitaire des lymphocytes du sang périphérique n'est pas due à un changement ni

du nombre, ni de la composition des sous-populations lymphocytaires chez les sujets âgés par

rapport aux sujets jeunes (Nagel et al., 1981; Grossman et al., 1989).

Parmi tous les changements fonctionnels liés à l'âge, la diminution de la réponse proliférative

des lymphocytes humains ou de rongeurs à des lectines végétales ou des mitogènes a été bien

caractérisée (Gillis et al., 1981; Nagel et al., 1989; Khansari et al., 1991). Cette réponse

mitogénique diminuée pourrait provenir de la baisse de la production de l'IL2 ou de la

diminution d'expression du récepteur à l'IL2 observées dans ces cellules, altérations

accompagnées par une diminution de l'expression des ARNm correspondants (Nagel et al.,

1988). Cependant, la plupart des expériences réalisées in vivo ou in vitro ont montré que

l'addition d'IL2 exogène ne restaure que partiellement la réponse proliférative des cellules

aussi bien chez l'animal que chez l'homme âgés (Gillis et al., 1981; Rabinovitch et al., 1982).

Orson et al. (1989) ont montré que les lymphocytes de personnes âgées libèrent des quantités

importantes de récepteurs à l'IL2 solubles dans l'environnement extracellulaire sans l'exprimer

à la surface cellulaire. Ils supposent que, chez les sujets âgés, le récepteur à l'IL2 subirait une

transformation l'empêchant de s'exprimer à la surface des cellules.

77

D'autres études suggèrent que l'augmentation de la sensibilité aux prostaglandines (PGs)

sécrétées par les macrophages peut contribuer à affaiblir la réactivité des cellules T avec l'âge

(Goldwin et Messner, 1979). Cependant, Larson (1980), confirmant cette augmentation de la

sensibilité aux PGs avec l'âge a montré qu'une simple supplémentation en indométhacine

(inhibiteur de la PG-synthase) ne restaure pas la réponse proliférative des cellules T stimulées

par la Con A ou par des antigènes. De plus, des populations de cellules T purifiées

(dépourvues de macrophages et donc de PGs) montrent encore une réponse proliférative

diminuée avec l'âge (Grossman et al., 1989).

En outre, parmi les diverses hypothèses émises au cours des dernières décennies, en matière

de vieillissement, celles impliquant la peroxydation lipidique semblent jouer un rôle

fondamental.

V-2. Vieillissement et peroxydation lipidique.

Une diminution des défenses antioxydantes conduisant à une augmentation des

dommages peroxydatifs a été décrite dans de nombreux tissus animaux (Cand et Verdetti,

1989).

L'oxygénation des acides gras polyinsaturés conduit aux peroxydes d'acides gras qui sont les

produits primaires de la peroxydation lipidique. Deux modes de peroxydation lipidique,

enzymatique ou non, peuvent être définis selon le type d'oxygénation réalisé sur l'acide gras

insaturé, en particulier l'acide arachidonique. La cyclooxygénase catalyse une double

dioxygénation de l'acide arachidonique en endoperoxydes (PGG2 et PGH2), précurseurs des

prostaglandines et du thromboxane. Les lipoxygénases catalysent une monooxygénation de

l'acide arachidonique en hydroperoxydes (HPETEs) qui sont réduits par la suite en dérivés

hydroxylés (HETEs). Ces deux voies d'oxygénation enzymatiques sont responsables de la

peroxydation lipidique spécifique. La peroxydation non-enzymatique des acides gras

polyinsaturés est induite par des radicaux libres dérivés de l'oxygène qui attaquent les

phospholipides membranaires.

Le stress oxydant est responsable de l'altération d'un certain nombre de réponses immunes, en

particulier la différenciation des cellules souches (Fishman et al., 1981), la synthèse d'ARN

(Post et al., 1985), la production d'IL2 (Post et al., 1985) et la synthèse d'ADN (Freed et al.,

1987). Duncan et Lawrence (1990) ont rapporté que des lymphocytes ayant subi un stress

oxydant restent en phase G0/G1 durant une stimulation mitogénique.

L'organisme possède des systèmes de protection capables de neutraliser les radicaux

peroxyles. Ainsi, il est bien connu que le glutathion protège les cellules contre les dommages

oxydatifs (Nathan et al., 1981). De plus, il existe des enzymes permettant de neutraliser les

peroxydes : la superoxyde dismutase (SOD), la catalase, la glutathion peroxydase (GSH-Px),

la glutathion transférase. Les cellules possèdent aussi des systèmes non-enzymatiques appelés

piégeurs de radicaux libres qui sont principalement la vitamine E, la vitamine C et le carotène.

78

Cependant, chez les sujets âgés, le taux de ces enzymes est diminué (Courtière et al., 1989),

ce qui conduit à une accumulation des radicaux libres et des peroxydes, et provoque une

attaque des membranes cellulaires par oxydation des phospholipides.

Parallèlement à l'hyperactivité plaquettaire observée avec l'âge, de nombreux marqueurs de

peroxydation lipidique tel que le MDA (malondialdehyde) sont augmentés dans les plaquettes

de personnes âgées comparativement à celles de témoins jeunes (Véricel et al., 1992). En

outre, une réduction significative des systèmes de protection (Vitamines E et GSH-Px) est

observée dans les plaquettes de personnes âgées (Véricel et al., 1992). De plus, Véricel et al.

(1988) avait rapporté une augmentation du métabolisme oxygéné de l'acide arachidonique

endogène dans des plaquettes stimulées ou non par la thrombine, en particulier la production

de 12-HETE. Ainsi, l'accumulation de peroxydes dépendants des lipoxygénases dans le

microenvironnement des cellules immunitaires pourrait constituer un facteur de

dysfonctionnement majeur des réponses immunes.

V-3. Le 12-HETE.

Les produits monohydroxylés de la lipoxygénase étaient initialement considérés

comme des produits inertes de détoxification du métabolisme de l'acide arachidonique. Il

existe maintenant de nombreuses preuves que les HETEs jouent un rôle dans la modulation

des sécrétions hormonales, de la réponse immune ou inflammatoire, de certaines voies

enzymatiques et de la croissance cellulaire (Spector et al., 1988).

Le 12-HETE est le dérivé hydroxylé synthétisé majoritairement dans les macrophages activés

et les plaquettes (Rabinovitch et al., 1981; Hamberg et Samuelsson, 1974) (Figure 15). Des

études plus récentes ont montré une production de 12-HETE dans les cellules tumorales

(Ruzicka et al., 1983). Dans les cellules tumorales, le 12-HETE semble induire un

réarrangement rapide des microfilaments et une phosphorylation des protéines associées aux

cytosquelette (Taylor et al., 1990).

Les fonctions physiologiques du 12-HETE ne sont pas bien caractérisées, mais beaucoup de

résultats indiquent qu'il pourrait être impliqué dans un grand nombre d'activités biologiques

telles que la stimulation de la sécrétion d'insuline par le tissu pancréatique, la suppression de

la production de rénine, le chimiotactisme des leucocytes et des macrophages durant

l'inflammation (Spector et al., 1988). Le 12-HETE semble également réduire la biosynthèse

de prostacycline par les cellules endothéliales vasculaires (Hadjiagapiou et Spector, 1986), et

joue un rôle central dans l'activation et l'agrégation plaquettaire (Sekiya et al., 1994). Plus

récemment, le 12-HETE est décrit comme le métabolite de l'acide arachidonique

majoritairement présent dans le sang menstruel (Hofer et al., 1993) et le tissu intrautérin

(Wetzka et al., 1993), mais la signification physiologique de cette découverte n'est pas claire.

80

a) Le 12-HETE et les voies de signalisation.

Plusieurs travaux impliquent le 12-HETE dans la régulation de certaines voies de

signalisation.

Le calcium.

Stern et al. (1993) ont étudié le rôle du 12-HETE dans le signal calcique induit par

l'angiotensine II dans les cellules glomérulaires de rat. L'addition de 12-HETE à ces cellules

induit une hausse du taux de calcium dose-dépendante qui est maintenue au delà de 15

minutes. Yoshino et al. (1994) ont montré dans les neutrophiles humains, que le 12-HETE

augmente rapidement le taux de calcium intracellulaire à partir du pool intracellulaire sensible

à l'IP3. Les effets du 12-HETE sur le taux de calcium intracellulaire sont atténués par la

nifédipine, antagoniste des canaux calciques lents, mais maintenus dans un milieu sans

calcium, ce qui suggère une mobilisation des stocks intracellulaires. La baïcaléine et le

BW755C, inhibiteurs de la 12-lipoxygénase, inhibent l'effet de l'angiotensine II sur le taux de

calcium intracellulaire. Cet effet est rétabli par addition de 12-HETE exogène. Ces résultats

suggèrent donc que l'activation de la voie lipoxygénase dans le glomérule surrénalien de rat

contribue aux changements de flux calciques intracellulaires. Enfin, très récemment, Reynaud

et al. (1997) ont montré que le 12-HETE synthétisé dans les plaquettes peut agir de manière

transcellulaire pour stimuler la libération du calcium intracellulaire dans les neutrophiles.

Les protéines kinases C.

De nombreuses données expérimentales suggèrent que le 12-HETE est une molécule

cruciale dans la signalisation intracellulaire conduisant à l'activation de la PKC, et impliquée

dans le mécanisme d'action de nombreux facteurs de croissance comme les cytokines, le

PDGF et l'EGF. Honn et al. (1994) ont montré que le 12-HETE augmente le potentiel

métastasique de cellules tumorales et l'adhésion des cellules tumorales à la paroi vasculaire,

phase importante de la métastase. Ils ont montré par la suite que le 12-HETE exerce ses effets

via l'activation de la PKC. Des observations expérimentales antérieures avaient montré que le

12-HETE mime l'effet de l'ester de phorbol (TPA) en augmentant l'expression des récepteurs

d'intégrines et de molécules d'adhésion (Grossi et al., 1989). Des résultats obtenus dans des

cellules de carcinome (W256) de rat montrent que le 12-HETE induit une augmentation de

100% de l'activité PKC associée à la membrane. De plus, la "down-régulation" de la PKC par

un traitement prolongé par le TPA abolit l'augmentation de l'adhésion des cellules W256 à

l'endothélium induite par le 12-HETE (Honn et Tang, 1992). Liu et al. (1995) ont également

montré que le 12-HETE provoque une translocation de la PKCα vers la membrane plasmique

et les plaques d'adhésion focales, conduisant ainsi à une augmentation de l'adhésion des

cellules de mélanome (B16a) à la fibronectine. En outre, de nombreux effets biologiques du

81

12-HETE peuvent être annulés par des inhibiteurs sélectifs de la PKC (Timar et al., 1992; Liu

et al., 1994). Hagerman et al. (1993) ont montré que le 15-HETE comme le 12-HETE, active

la PKC.

Le mécanisme par lequel le 12-HETE active la PKC n'est pas bien défini. Il semble que dans

différents types cellulaires, le 12-HETE induise préférentiellement une augmentation de la

translocation de l'isoforme α de PKC et pas celle de l'isoforme δ, du cytosol vers la membrane

plasmique. D'autres études réalisées en présence de BAPTA, un chélateur de calcium

intracellulaire, suggèrent que l'isoforme de PKC activée par le 12-HETE est dépendante du

calcium (Liu et al., 1994). Des études plus récentes suggèrent un mécanisme d'action du 12-

HETE médié par un récepteur (Liu et al. 1995). Ces auteurs ont montré que le 12-HETE

augmente rapidement les taux intracellulaires de DAG et d'IP3 dans les cellules B16a. De

plus, les effets du 12-HETE sur l'adhésion des cellules B16a à la fibronectine sont sensibles

aux inhibiteurs de PLC ou à la toxine pertussique. Enfin, des expériences de "binding" ont

permis de détecter un site de liaison de haute affinité (Kd=1nM) pour le 12-HETE sur ces

cellules. Ces résultats indiquent que la régulation de la PKCα par le 12-HETE pourrait

impliquer un récepteur couplé à une protéine G et l'hydrolyse des PIs par la PLC. D'autres

équipes ont également décrit l'existence de récepteurs au 12-HETE, par exemple dans les

kératinocytes avec un Kd d'environ 3-4 nM (Arenberger et al., 1993) ou dans les cellules de

carcinome avec un Kd de 0,4 nM (Herbertsson et Hammarstrom,1991) ou enfin dans des

cellules basophiles leucémiques, mais avec une plus faible affinité, Kd=500nM environ (Kang

et Vanderhoek, 1995).

Une autre possibilité expliquant l'accumulation de DAG après traitement par le 12-HETE est

l'inhibition de l'activité DAG-kinase. Ainsi, Setty et al. (1987) ont rapporté que dans les

cellules endothéliales d'aorte bovine, le 12- et le 15-HETE inhibent l'activité DAG-kinase et

induisent une accumulation de DAG.

Probablement, les deux mécanismes (activation de la PLC et inhibition de la DAG-kinase)

existent dans ces cellules provoquant éventuellement une augmentation de DAG puis une

activation spécifique de certaines isoformes de PKC.

b) Le 12-HETE et la réponse immune.

Les effets du 12-HETE observés dans différents types de cellules lymphoïdes sont

assez variés.

La mitogénèse induite par la PHA dans des splénocytes de souris et mesurée par incorporation

de thymidine tritié, est largement inhibée par des concentrations micromolaires de 12-HETE

(Low et al., 1984). Le traitement des PBMC avec du 12-HETE résulte également en uneinhibition dose-dépendante de la prolifération des lymphocytes, avec un IC50 de 10 µM

(Hadjiagapiou et al., 1992) à 20µM (Joulain et al., 1995). Enfin, un effet antimitogénique du

82

12-HETE a été démontré par Werner et al. (1985) dans des cellules de neuroblastome.

Les travaux de notre équipe ont également montré une quantité accrue de 12-HETE dans les

PBMC de sujets âgés par rapport aux PBMC de témoins jeunes (Meskini et al., 1993), ce qui

nous a amené à proposer l'hypothèse selon laquelle la production accrue de 12-HETE dans les

cellules de personnes âgées pourrait être responsable de la diminution de la réponse immune

accompagnant le vieillissement.

Le mécanisme par lequel le 12-HETE affecte les fonctions lymphocytaires n'est pas bien

élucidé. Plusieurs hypothèses peuvent être proposées :

Tout d'abord, ce composé est connu pour inhiber la DAG-kinase dans les cellules

endothéliales (Friedlander et al., 1990), ce qui pourrait induire une diminution de la

production de PA à partir du DAG. Ainsi, chez les personnes agées, le maintien d'un taux

élevé de 12-HETE pourrait conduire à une diminution du taux de PA synthétisé.

D'autre part, Joulain et al. (1995) ont montré que le 12-HETE pouvait s'estérifier dans les

phospholipides membranaires des PBMC. Il pourrait alors conduire à la formation de seconds

messagers modifiés, et en particulier des PA modifiés, incapables d'assurer une transmission

correcte des signaux d'activation.

Enfin, sous stimulation mitogénique par la Con A, les cellules mononuclées préchargées avec

du 12-HETE, relarguent du 12-HETE non modifié à partir des phosphatidylinositols (Joulain

et al., 1995). Ce résultat suggère que sous stimulation mitogénique, le 12-HETE, après sa

libération à l'extérieur de la cellule, pourrait aller agir sur un récepteur extracellulaire et altérer

la transmission du signal mitogénique de façon paracrine.

83

OOBBJJEECCTTII FFSSDDUU

TTRRAAVVAAII LLEEXXPPEERRII MMEENNTTAALL

84

De l'acide phosphatidique (PA) est produit normalement dans les cellules lymphoïdes

sous stimulation mitogénique, et ce composé est largement décrit comme un second messager

intracellulaire. Cependant, son effet sur ses différentes cibles dépend en grande partie de sa

composition en acides gras, qui dépend elle-même du compartiment phospholipidique dont il

est issu. Par ailleurs, les travaux antérieurs de notre équipe ont montré que le PA est capable

de stimuler in vitro l'activité de certaines isoformes de phosphodiestérases des nucléotides

cycliques. Enfin, une hausse d'activité PDE est observée dans les cellules mononucléées

humaines stimulées par la lectine mitogénique Concanavaline A (Con A). Cependant, aucune

corrélation n'a jamais été établie entre la hausse de la synthèse de PA et la hausse d'activité

PDE dans une même population cellulaire provenant d'un même donneur. L'un des objectifs

du travail expérimental de cette thèse a donc consisté à étudier l'effet de l'acide

phosphatidique sur les activités phosphodiestérases des nucléotides cycliques dans les cellules

mononucléées humaines. Ce travail comporte deux volets, qui seront détaillés dans les

chapitres I et II.

Chapitre I : "Production et voies de synthèse de l'acide phosphatidique dans les

cellules mononucléées humaines stimulées par la Concanavaline A."

Dans cette partie du travail, nous avons cherché à répondre aux questions suivantes :

---> Quelles sont les variations du taux de PA intracellulaire au cours des premières

minutes de l'activation mitogénique?

---> Quelle est ou quelles sont les voies de formation du PA stimulées par la lectine

mitogénique Con A dans les cellules mononucléées humaines?

Dans le Chapitre II : "Corrélations entre la production d'acide phosphatidique et les

activités phosphodiestérases dans les cellules mononucléées humaines témoins ou activées",

nous avons examiné l'effet de différents mitogènes sur la production de PA, les activités PDE

et les taux d'AMPc dans une même population cellulaire provenant d'un même donneur. Nous

avons cherché à corréler ces paramètres, et déterminé la nature des isoformes de PDE activées

par les différents mitogènes.

La seconde partie de ce travail, présentée dans le Chapitre III a consisté à étudier la modulation de la

synthèse de PA par un acide gras monohydroxylé qui s'accumule dans les cellules mononucléées de

personnes âgées, et qui est considéré par certains aspects comme marqueur du vieillissement. Ayant

démontré que le 12(S)-HETE est capable d'activer une voie de signalisation supplémentaire par

rapport au mitogène seul, voie supplémentaire mettant en jeu l'activation d'une PLD, nous avons

cherché à déterminer les mécanismes impliqués dans cette activation.

85

MMAATTEERRII EELLSS&&

MMEETTHHOODDEESS

86

MATERIELS

I- PRODUITS.

I-1 Produits inertes

Acide 12(S)-hydroxy-5,8,10,14-eicosatétraénoïque (12-HETE) TEBUAcide 15(S)-hydroxy-5,8,11,13-eicosatétraénoïque (15-HETE) TEBUAcide acétique MERCKAcide arachidonique SIGMAAcide éthylène glycol tétraacétique (EGTA) SIGMAAcide éthylène diamine tetraacétique (EDTA) CARLO ERBAAcide formique MERCKAcide N-2-hydroxyéthylpiperazine N'-2-ethane sulforic (HEPES) SIGMAAdénosine 3',5'-monophosphate cyclique, sel de sodium SIGMAAcides phosphatidiques SIGMAAcrylamide/bis acrylamide (30 : 0,8) SIGMAAnticorps anti-phosphotyrosineAnticorps de chèvre anti-IgG de souris couplé à la péroxydase du raifort BIO-RADAzideBio-rad protein assay (réactif de bradford) BIO-RADBleu de Bromophénol SIGMABleu de Coomassie SIGMABleu Trypan SIGMABorohydrure de sodium (NaBH4) SIGMAButyl hydroxytoluène (BHT) SIGMAß mercaptoéthanol FLUKACalphostine C SIGMAConcanavaline A SIGMADextran SIGMAFiltres GF/C WHATMANGénistéine SIGMAGlucose PROLABOGlycine SIGMA

87

Glycérol PROLABOGuanosine 3',5'-monophosphate cyclique, sel de sodium SIGMA

Inhibiteurs de PDE ;Rolipram SCHERING1-méthyl, 3-isobutylxanthine SIGMAMilrinone SIGMAEHNA SIGMA

Kit ECL AMERSHAMMilieux de séparation, de lavage et de culture :

Aprotinine (INIPROL) CHOAY LABORATOIRIESFicoll-Hypaque, milieu de séparation des lymphocytes SIGMAGlutamine, Pénicilline/Streptomycine SIGMAPepstatine SIGMABenzamidine SIGMAPMSF SIGMARPMI 1640 Dutch modification SIGMASérum AB humain INSTITUT JACQUES BOYSérum de veau foetal BIO MEDIA

Nucléotidase 5' (Ophiophagus hannah) SIGMAOrthovanadate de sodium SIGMAPlaques de gel de silice G60, 20 x 20 cm, 0,25mm MERCKPlaques microtiter COSTARRésine AG 1X2, 200-400 mesh BIO-RADR59022 (6-[2-(4-[(4-fluorophenyl)phenylméthylène]-1-piperidinyl]éthyle]-7-méthyle-5H-

thiazolo[3,2-a]pyridine) SIGMASaccharose PROLABOScintillant liquide "Pico-Fluor TM" 15 PACKARDSels (MgCl2, NaOH, NaCl, KCl, KH2PO4, Na2HPO4....) SIGMASerum almumine fraction V SIGMASolvants organiques SDSStandards lipidiques SIGMAStaurosporine SIGMASuramine SIGMATemed SIGMATétradécanoyl phorbol acétate (TPA) SIGMATris SIGMATriton X-100 SIGMATween 20 SIGMA

I-2 Produits radioactifs

Acide [5,6,8,9,11,12,14,15-3H]arachidonique, activité spécifique 200 Ci/mmoleAMERSHAMAcide [9,10 (n)-3H]-myristique, activité spécifique 54 Ci/mmole AMERSHAMAcide [9,10 (n)-3H]-oleïque, activité spécifique 2-10 Ci/mmole AMERSHAMAcide [glycérol-14C (U)]-phosphatidique, 1-α-dipalmitoyl,

activité spécifique 120 mCi/mmole NEN-RESEARCH PRODUCTS[8-3H]-Adénosine monophosphate 3',5'-cyclique, sel d'ammonium,

88

activité spécifique 20-30 Ci/mmole AMERSHAM[8-3H]-guanosine 3',5'-monophosphate cyclique, sel d'ammonium,

activité spécifique 8-10 Ci/mmole NEN-RESEARCH PRODUCTS[14C (U)]-adénosine, activité spécifique 400-600 mCi/mmole CEA[14C (U)]-guanosine, activité spécifique 400-600 mCi/mmole NEN-RESEARCHPRODUCTS[3H]-12-HETE, activité spécifique : 215Ci/mmole NEN-RESEARCH PRODUCTS[methyl-3H] thymidine , activité spécifique 42 Ci/mmole AMERSHAMKit de dosage RIA [125I] de l'AMPc NEN-RESEARCH PRODUCTS

II- APPAREILS

Appareil de chromatographie en phase gazeuse PERKIN ELMERBalances METTLERCentrifugeuses JOUANCompteur à scintillation liquide PACKARDFACS-Star BECTON DICKINSONLecteur de plaques LB 511 BERTHOLDLecteur de plaques multipuits LASYSTEMS iEMS READER MF (logiciel BIOLISE)Microscope photonique NIKONPotter verre-téflon POLY-LABOSonicateur LABO-MODERNESpectrophotomètre BECKMANStéricult BIOBLOCKSystème d'électrophorèse et de transfert BIO-RADSystème de filtration Cell-Harvester Autowash 2000 DYNATECHSystème d'imagerie assistée par ordinateur VILBER LOURMAT (logiciel Bioprofil)Ultracentrifugeuse KONTRON , rotors KONTRON 45-6

89

METHODES

I- PREPARATIONS CELLULAIRES.

I-1 Préparation des cellules mononucléées humaines du sang périphérique (PBMC).

Les cellules mononucléées (lymphocytes et monocytes) sont préparées selon le

protocole décrit sur la figure (Figure 16) à partir de sang veineux prélevé sur anti-coagulant

CPD (CTS de Lyon). Le plasma riche en plaquettes est d'abord éliminé par centrifugation

pendant 20 min à 120 g. Le culot qui en résulte est remis en suspension dans du NaCl/EDTA

0,9%, en présence de dextran 1% final afin d'éliminer les hématies. Après 30 min de repos à

37°C, le surnageant dextran contenant les leucocytes est séparé par centrifugation sur un

gradient de Ficoll Hypaque pendant 15 min à 600 g. Les cellules collectées à l'interface sont

lavées trois fois dans du RPMI 1640 (avec HEPES et bicarbonate) par centrifugation à faible

vitesse (400 g) pour éliminer le maximum de plaquettes contaminantes. Les cellules sont

ensuite resuspendues dans du RPMI 1640 à la concentration désirée (généralement 4 x 107

cellules/ml) et utilisées pour les expériences d'activation mitogénique.

La viabilité cellulaire mesurée par le test d'exclusion au Bleu Trypan est supérieure à 95%.

L'analyse par cytométrie de flux (FACS-Star, Becton Dickinson) des préparations cellulairesmontre que 65-70% des cellules sont des lymphocytes T CD3+ (clone T3, Coulter), 4-6% sont

des lymphocytes B CD19+ (clone B4, Coulter), 15-20% sont des monocytes CD14+ (clone

UCHM-1, Sigma) et 2-4% sont des plaquettes CD41a+ (GP IIb IIIa, clone P2, Immunotech).

Tous les anticorps primaires sont des IgG de souris. L'anticorps secondaire est un anticorps de

chèvre anti-souris conjugué à la fluorescéine (FITC conjugué, Tago Inc.).

91

I-2 Activation mitogénique des cellules mononucléées.

Des études cinétiques préliminaires effectuées par l'équipe ont montré que l'effet de la

Concanavaline A (Con A) sur la synthèse de PA est maximal après 5 min d'incubation. Les

cellules sont donc incubées pendant 5 min à 37°C en absence (témoin) ou en présence de Con

A à la concentration de 5 µg/106 cellules. Dans les expériences d'analyses lipidiques, la

réaction d'activation est arrêtée par de l'ethanol puis la suspension cellulaire est acidifiée à pH

3-4 avec de l'HCl 2M. Pour les dosages d'activité PDE, les incubations sont arrêtées dans la

glace et les cellules sont lysées selon le protocole décrit ci-dessous. Dans le cas des dosages

d'AMPc, les essais sont placées à 100°C au bain-marie bouillant pendant 2 min. Enfin, dans le

cas des expériences de "western-blotting", la réaction est arrêtée dans la glace et les cellules

sont lysées selon le protocole ci-dessous.

I-3 Lyses des cellules.

a) Lyse des cellules en vue du dosage d'activité phosphodiestérase.

Les cellules sont lavées avec du tampon Phillips, puis lysées au glycérol selon la

méthode décrite par Caldwell et al. (1988). Cette technique consiste à mettre en suspension les

cellules dans du tampon Phillips (4 x 107 cellules /ml), dont la composition est la suivante :

glucose 86 mM, NaCl 96 mM, EGTA 0,1 mM, EDTA 5 mM, HEPES 20 mM, inhibiteurs de

protéases (PMSF 0,5 mM, pepstatine 2 µg/ml, benzamidine 0,5 mM, aprotinine 200U/ml), à

pH 7,4. Les cellules sont centrifugées par la suite pendant 5 min à 400 g et resuspendues à la

même concentration dans une solution de glycérol à 60% dans le tampon Phillips. Après 10

min de repos à température ambiante, la suspension cellulaire est centrifugée pendant 10 min

à 900 g, puis resuspendue à la même concentration dans un tampon hypotonique, ce qui

provoque l'éclatement des cellules. La composition du tampon de lyse est la suivante : HEPES

20 mM, saccharose 25 mM, EGTA 0,1 mM et inhibiteurs de protéases (PMSF 60 µM,

pepstatine 2 µg/ml et aprotinine 200 U/ml) à pH 7,4. Les échantillons sont stockés à -80°C.

Un tel traitement au glycérol suivi d'un choc osmotique lyse la plus grande partie des cellules.

La viabilité cellulaire vérifiée à l'aide de bleu trypan est toujours inférieure à 6%.

Les cellules lysées sont ensuite homogénéisées dans le tampon de lyse, à l'aide d'un potter

verre-téflon (2 x 20 aller-retours), qui est ensuite rinçé avec un volume de tampon de lyse.

L'homogénat total est ultracentrifugé pendant 20 min à 42000g. Le surnageant est dilué avec

du tampon de dosage d'activité PDE (Tris 40 mM, pH=8) de manière à obtenir l'équivalent de

1,5 x 107 cellules/ml. Le culot est repris dans du tampon Tris 40 mM, pH=8 et réhomogénéisé

au potter verre-téflon (2 x 10 aller-retours). Le potter verre-téflon est rinçé par le même

tampon et les volumes sont ajustés de manière à obtenir l'équivalent de 3 x 107 cellules/ml.

92

b) Lyse des cellules en vue du "western-blotting".

A la fin de l'activation, les cellules sont suspendues (4 x 107 cellules/ml) dans le

tampon de lyse suivant : Tris HCl 20 mM pH 8, NaCl 150 mM, Triton X100 1%, EDTA

2mM, glycérol 10%, orthovanadate 1 mM, PMSF 1 mM, aprotinine 200 U/ml et leupeptine

10 µg/ml et maintenues pendant 10 min dans un bain de glace . Après centrifugation pendant

25 min à 2000 g, les échantillons sont congelés à -80°C. Après décongélation, le surnageant

est dilué à 3 x 107 cellules/ml avec du tampon de Laëmmli concentré 4 fois (Tris 62,5mM pH

7,8, SDS 8%, saccharose 40%, ß-mercaptoéthanol 20% et du bleu de bromophénol), puis les

protéines sont dosées avant d'effectuer les dépots sur gel d'électrophorèse.

II- METHODES BIOCHIMIQUES.

II-1 Dosages des protéines.

a) Dosages des protéines dans les expériences de dosage d'activité

phosphodiestérase.

Les protéines solubles, membranaires et totales sont dosées selon la méthode de

Bradford (1976). Les échantillons sont soniqués au préalable pendant 30 min. La quantité de

protéines est déterminée par comparaison à une gamme de sérum albumine bovine variant de

0 à 20 µg de protéines. La DO est lue à 595 nm au spectrophotomètre.

b) Dosage des protéines en vue des expériences de "western-blotting".

Les protéines des échantillons contenant le tampon de lyse et le tampon de Laëmmli

sont dosées par la méthode de Schaffner et Weissmann (1973) par comparaison à une gamme

étalon de sérum albumine bovine variant de 0 à 27 µg de protéines. Cette technique consiste à

précipiter l'échantillon par de l'acide trichloroacétique à 60% en présence de SDS. Les

échantillons sont ensuite filtrés sur membrane Millipore et colorés avec une solution à

l'Amidoschwarz (MeOH/Ac.Acétique/H2O (90/20/90, v/v/v), Amidoschwarz 1 mg/ml). Les

membranes sont ensuite rincées dans plusieurs bains successifs de la solution de rinçage :

MeOH/Ac.Acétique/H2O (90/2/8, v/v/v). Après séchage, les dépots colorés sont découpés au

scalpel et placés dans des tubes contenant 1 ml de solution éluante : NaOH 25 mM, EDTA

50 µM dans de l'éthanol à 50% pendant 10 min. La lecture est effectuée à 630 nm au

spectrophotomètre.

93

II-2 Mesure de l'activité phosphodiéstérase des nucléotides cycliques (E.C.3.1.4.17).

a) Principe du dosage.

L'activité phosphodiestérase est déterminée selon la méthode radioisotopique en deux

étapes de Thompson et al. (1979), modifiée par Prigent et al. (1981). Dans une première étape,

la PDE hydrolyse le [8-3H] AMPc ou le [8-3H] GMPc en 5'[8-3H] AMP ou 5'[8-3H] GMP.

Dans une seconde étape, une 5'-nucléotidase (venin de cobra) exogène convertit le 5'-

nucléotide en nucléoside correspondant, [3H] adénosine ou [3H] guanosine. Les substrats et

les produits finaux sont séparés sur une résine anionique (AG 1-X2). Cette résine fixe

sélectivement le nucléotide cyclique qui n'a pas réagi. Après 10 min de centrifugation à 2000

g, la radioactivité de l'adénosine ou de la guanosine se trouvant dans le surnageant est

mesurée. Les rendements sont contrôlés par addition du nucléoside 14C correspondant lors de

la seconde étape. La quantité d'enzyme et le temps d'incubation sont ajustés de telle manière

qu'on ne dépasse pas les 20% d'hydrolyse du substrat afin de travailler dans les conditions de

vitesse initiale.

b) Protocole de dosage.

Le milieu réactionnel (400 µl) contient du Tris-HCl 40 mM à pH 8, du MgCl2 5 mM,

de la BSA 0,5 mg/ml, du 2-mercaptoéthanol 3,75 mM et de l'AMPc [3H] ou du GMPc [3H]

0,25µM (25 nCi) et 100 µl de culot ou de surnageant préparés comme décrit dans le

paragraphe I-3. La réaction enzymatique est arrêtée par dénaturation de l'enzyme à 100°C

dans un bain-marie pendant 1 min. On ajoute 100 µl de venin de cobra (0,6 mg/ml dans l'eau

distillée) contenant de l'adénosine [14C] ou de la guanosine [14C] (environ 3000 cpm/essai)

qui constituent un étalon interne de rendement. Après incubation pendant 10 min à 30°C, 1 ml

de résine activée (AG1-X2) sous forme acétate pour l'AMPc-PDE ou formiate pour la GMPc-

PDE est ajouté. Le mélange est incubé 15 min à 4°C et centrifugé à 2000 g pendant 10 min à

la même température. 400 µl de surnageant sont prélevés et comptés dans 5 ml de liquide

scintillant.

II-3 Dosage de l'AMPc.

Le contenu en AMPc des PBMC humaines a été mesuré par radioimmunoessai (Kit

RIA [125I] de l'AMPc, NEN-Research products). Après la stimulation mitogénique dans des

tubes en verre borosilicaté, les réactions sont arrêtées au bain-marie à 100°C pendant 2 min et

les échantillons sont stockés à -80°C. Les protéines sont séparées par centrifugation à 4500 g

pendant 15 min. Les surnageants sont dilués dans le tampon d'immunoessai et l'AMPc est

94

quantifié selon les recommandations du fabricant. Dans certaines expériences, les cellules ont

été préincubées 30 min en présence de l'inhibiteur de PDE4, rolipram à 100 µM ou 10 min en

présence de l'inhibiteur de DAG-Kinase R59022 à 10 µM, avant l'activation par la Con A.

II-4 Mesure des tyrosine phosphorylations par "western-blotting".

a) Electrophorèse et transfert.

Les protéines totales (10 µg, correspondant à environ 300 000 cellules) sont séparées

par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (10%) en milieu dénaturant (SDS-PAGE)

(tableau). La dénaturation s'effectue par chauffage des échantillons contenant le tampon de

Laëmmli à 100°C au bain-marie bouillant pendant 5 min. Les échantillons sont ensuite

déposés dans les puits du gel de concentration (4%).

Les échantillons sont analysés par électrophorèse avec des standards de poids moléculaires,

dans un tampon dénaturant (Tris base 25 mM, Glycine 192 mM, SDS 0,1%) à pH 8,3 pendant

1 heure à 150 volts. Les protéines sont en premier lieu concentrées dans le gel de

concentration, puis elles sont séparées dans le gel de résolution selon leur masse moléculaire,

les protéines les plus petites étant les moins retenues.

Les protéines sont alors transférées électrophorétiquement sur membrane de nitrocellulose. Le

transfert se déroule à 100 volts pendant 1 heure dans un tampon réfrigéré (Tris base 25 mM,

Glycine 192 mM, méthanol 20%) à pH 8,3.

b) Immunodétection.

Toutes les étapes se déroulent dans un tampon salin contenant 0,1 % de Tween-20

(TBS-T : Tris base 20 mM, NaCl 137 mM ajusté à pH 7,6 avec HCl), sous agitation orbitale.

A l'issue du transfert, la membrane est incubée dans du TBS-T contenant 5% de lait écrémé,

soit 3 heures à température ambiante soit une nuit à 4°C. La combinaison de lait écrémé et de

Tween-20 permet de limiter les fixations non-spécifiques. Après lavages, la membrane est

incubée avec l'anticorps spécifique des tyrosines phosphorylées (anti-phosphotyrosinemonoclonal IgG2bk, 100µg/µl, Upstate Biotechnology) dilué à 1/2000, soit pendant 3 heures à

température ambiante soit une nuit à 4°C. La membrane est lavée puis incubée 1 heure en

présence d'un anticorps anti-IgG de souris couplé à la peroxydase du raifort (dilution

1/15000). Immédiatement après lavage, les protéines sont spécifiquement révélées sur un film

par une détection chimioluminescente (détection ECL). Le film est ensuite développé dans un

révélateur, rincé sous un courant d'eau, baigné dans un fixateur, rincé à nouveau puis séché.

c) Quantification des protéines.

Les bandes révélées sur le film sont analysées par densitométrie et quantifiées par un

95

analyseur d'images (logiciel Bioprofil).

III- TEST DE PROLIFERATION.

Les cellules mononucléées purifiées comme décrit précédemment sont resuspendues à

une concentration de 2 x 106 cellules/ml dans du RPMI 1640 (avec HEPES et bicarbonate)

complémenté avec 1% de sérum AB humain, de la glutamine 2 mM, de la streptomycine 100

µg/ml et de la penicilline 100 U/ml. La suspension cellulaire est distribuée dans une plaque 96

puits (microtiter Costar). Chaque puits reçoit 100 µl de suspension cellulaire (soit 200 000

cellules/puits) et 50 µl de Con A à la concentration finale de 5 µg/106 cellules. Les témoins

reçoivent 50 µl de RPMI supplémenté.

Pour l'étude de l'effet du PA ou de certains inhibiteurs sur la prolifération lymphocytaire,

différentes concentrations de PA ou d'inhibiteurs sont ajoutées au milieu de culture sous un

volume de 50 µl par puits en présence ou en absence de Con A.Les cellules sont incubées à 37°C dans une atmospère contenant 5% de CO2 et 95%

d'humidité, pendant 48 heures dans un volume final de 200 µl . Chaque test est réalisé en 8

exemplaires. A la fin de la période d'incubation, 0,5 µCi de thymidine tritiée sont ajoutés dans

chaque puits. Après 18 heures d'incubation, les cellules sont collectées sur des filtres en fibre

de verre, à l'aide d'un "cell-harvester". La quantité de radioactivité incorporée est évaluée par

comptage de la radioactivité adsorbée sur les filtres dans 4,5 ml de liquide scintillant.

IV- MARQUAGE ET STIMULATION DES CELLULES.

IV-1 Marquage des cellules.

La suspension cellulaire (4 x 107 cellules/ml) est incubée soit avec une dose traceuse

d'acide arachidonique tritié (1,5 µCi/ml), soit avec une dose traceuse d'acide oléique tritié (1,5

µCi/ml), soit avec une dose traceuse d'acide myristique tritié (3 µCi/ml) pendant 1 heure à

37°C. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont lavées trois fois dans du milieu frais

afin d'éliminer la radioactivité non incorporée dans les cellules, puis resuspendues à la

concentration finale de 4 x 107 cellules/ml. Le rendement moyen d'incorporation est de 70%

pour l'acide arachidonique et de 30% pour l'acide oléique et l'acide myristique.

Dans les expériences visant à corréler les taux de PA, les activités PDE et les taux d'AMPc, la

suspension cellulaire a été séparée en 3 fractions, et seuls les essais utilisés pour doser le PA

ont été radiomarqués. Les cellules utilisées pour les dosages d'activité PDE et les dosages

96

d'AMPc ont été incubées avec du RPMI seul et lavées 3 fois, de manière à être traitées dans

les mêmes conditions avant l'activation.

IV-2 Stimulation mitogénique.

Les cellules prémarquées sont incubées pendant 5 min à 37°C en absence ou en

présence de Con A (5 µg/106 cellules) ou d'OKT3 (30 ng/ml ou 100 ng/ml) ou pendant 15 min

à 37°C en absence ou en présence de TPA (100 nM).

Dans certaines expériences, les cellules ont été prétraitées en présence de drogues avant la

stimulation. Le R59022, un inhibiteur de DAG-kinase a été utilisé à des concentrations

croissantes allant de 5 à 50 µM pendant 10 min avant l'activation. La génistéine, un inhibiteur

de tyrosine-kinase a été utilisée à des concentrations finales variant de 100 µM à 400 µM

pendant 15 min avant l'activation. Les inhibiteurs de PKC, tels que la staurosporine et la

calphostine C ont été respectivement utilisés à 1 µM et 126 nM pendant 30 min avant la

stimulation mitogénique. Enfin, la suramine, un inhibiteur de l'activité PLD a été utilisé à la

concentration finale de 1 mM pendant 1 heure avant l'activation mitogénique. Dans d'autres

expériences les cellules ont été stimulées par les différents mitogènes en présence d'alcools

(ethanol, butanol-1, butanol-2) à une concentration finale de 1%.

L'incubation des cellules en présence des divers stimuli ou inhibiteurs pendant la période de

temps choisi est arrêtée selon des protocoles différents (voir le paragraphe I-2) en fonction du

dosage envisagé.

V-ANALYSES LIPIDIQUES.

V-1 Extraction lipidique.

Les lipides sont extraits selon la technique décrite par Boukhchache et Lagarde (1982)

à l'aide d'un mélange ethanol/chloroforme (3/6, v/v) contenant du butyl-hydroxytoluène

(BHT, antioxydant) à la concentration finale de 5 x 10-5 M. Un standard interne (acide

phosphatidique marqué au 14C, 1500 cpm/ml de phase aqueuse) est ajouté dans la suspension.

Le mélange est mis à décanter pendant une nuit à 4 °C. Les phases organiques sont évaporées

sous-vide, les résidus secs repris dans un mélange éther/méthanol (9/1, v/v), et stockés à -

20°C jusqu'à l'analyse.

V-2 Mise au point d'un système de séparation du PA fiable en vue de la quantification

97

par analyse d'image.

Les techniques utilisant le marquage des cellules avec des traceurs d'acides gras

permettent d'apprécier les variations du pourcentage d'acide phosphatidique par rapport aux

lipides totaux marqués, mais ne renseignent pas sur la masse réelle de PA intracellulaire. Or,

le PA est un phospholipide minoritaire, donc il était intéressant de mettre au point une

méthode colorimétrique de quantification du PA en masse rapide, facilement utilisable et

suffisamment sensible pour quantifier le PA des lymphocytes.

Un premier système chromatographique utilisant deux migrations successives dans la même

dimension : première migration dans hexane/éther/acide acétique (50/50/1, v/v/v) et une

deuxième migration dans chloroforme/méthanol/acide acétique/eau (60/30/10/1, v/v/v/v) a été

utilisé. Il permettait de séparer le PA des autres phospholipides avec un Rf de 0,9. Une telle

séparation avec un Rf élevé n'est pas fiable sachant qu'une meilleure séparation est

généralement obtenue pour des Rf inférieurs à ou de l'ordre de 0,5. Le PA est quantifié par

une méthode colorimétrique au bleu de Coomassie permettant une large détection aussi bien

des lipides simples que des lipides complexes sur plaques de silice (Nakamura et Handa,

1984). A la fin de la migration, les plaques sont séchées et la radioactivité est mesurée à l'aide

d'un lecteur de plaque (Berthold LB 511). Les plaques sont ensuite colorées au bleu de

Coomassie à 0,03% dans une solution de NaCl (0,9%)-méthanol 20% pendant 20 min, puis

elles sont lavées dans la même solution NaCl (0,9%)-méthanol 20% pendant 10 min.

L'intensité de coloration du spot correspondant au PA est évaluée par rapport à une gamme

étalon de PA standard séparée sur la même plaque, à l'aide d'un analyseur d'image (système

d'imagerie assisté par ordinateur Bioprofil). La quantité de PA mesurée par analyse d'image

après ce type de CCM était de l'ordre de 3 ng/106 cellules (probablement trop faible si l'on

compare aux données de la littérature pour d'autres types cellulaires).

Nous avons alors utilisé la CCM monodimensionnelle décrite par Legrand et al. (1991), qui

permet d'obtenir le PA avec un Rf de 0,45. Avec ce système, la masse de PA est évaluée à 29

ng/106 cellules, une valeur dix fois supérieure à la première mesure. Des analyses

complémentaires nous ont permis de montrer que cette forte valeur de PA est due à une

contamination du spot de PA par d'autres phospholipides.

Le dernier système testé et retenu, suggéré par les travaux de Broekman et al. (1980) présente

l'avantage de séparer les phopholipides en deux dimensions, permettant ainsi une meilleure

purification du PA (Figure 16). La première migration est effectuée dans un système de solvant

basique : chloroforme/méthanol/ammoniaque (65/35/5,5, v/v/v) et la deuxième migration dans la

deuxième dimension est effectuée dans un système de solvant acide :

chloroforme/acétone/méthanol/acide acétique/eau (30/40/10/10/5, v/v/v/v/v). Les différentes classes

de phospholipides (PC, PS, PI, PE) ainsi que le PA sont identifiés par comparaison des Rf à ceux de

standards non marqués, séparés sur la même plaque et révélés à l'iode. Chaque spot est ensuite gratté

et sa radioactivité est mesurée par comptage en scintillation liquide. Les résultats sont exprimés en

98

pourcentage de la radioactivité liée aux PL totaux. Le rendement en PA de ce système d'extraction et

de séparation calculé grâce au comptage en scintillation liquide de la radioactivité 14C est de l'ordre

de 40%. Après coloration au bleu de Coomassie, la quantité moyenne de PA en masse trouvée dans

les cellules témoins est alors de 14,62 ng/106 cellules.

Figure 17 : Chromatogramme type obtenu après coloration au bleu de Coomassie.

Dans le but de tester encore la fiabilité de ce système, nous nous sommes assurés qu'il existait

une relation linéaire entre la quantité de cellules ou le volume d'extrait analysés et la quantité

de PA estimée par l'analyse. Les résultats présentés en Figure 18 montrent qu'une telle relation

existe et ces résultats permettent d'adopter ce dernier système de séparation pour toutes les

analyses ultérieures.

V-3 Séparation du phosphatidylalcool.

Plusieurs système de séparation de phosphatidylalcool ont été décrits dans la

littérature. Nous avons également utilisé une chromatographie bidimensionnelle dans le cas de

cette séparation. La première migration est identique à celle utilisée pour la séparation du PA.

Par contre, la deuxième migration est effectuée dans le système de solvant : éthyl

acétate/isooctane/acide acétique (9/5/2, v/v/v).

99

1008060402000,0

0,5

1,0

1,5

Quantité de cellules (millions)

Qua

ntité

de

PA

dos

ée (

µg)

a

1501005000

1

2

Volume d'extrait lipidique déposé (µl)

Qua

ntité

de

PA

dos

ée (

µg)

b

Figure 18 : Relation entre la quantité de cellules ou le volume d'extrait analysés et la quantité

de PA mesurée.

Des quantités croissantes de cellules ont été incubées dans du RPMI à 37°C pendant 5

minutes (a) ou des volumes croissants provenant de la séparation d'un même extrait lipidique

ont été déposés sur plaque (b), et la quantité de PA formé a été dosée dans les deux cas par la

méthode colorimétrique et l'analyse d'image.

100

VI- ETUDE DE L'EFFET DU 12(S)-HETE SUR LA PRODUCTION DE PA PAR LES

CELLULES MONONUCLEEES HUMAINES.

VI-1 Influence du 12(S)-HETE sur la production de PA par les PBMC marquées au

[3H] AA et stimulées ou non par la Con A.

Les phospholipides des cellules mononucléées sont enrichis en 12(S)-HETE selon le

protocole mis au point dans l'équipe par Joulain et al. (1995). La suspension de cellules

mononucléées à la concentration de 4 x 107 cellules/ml est incubée 3 fois successivement en

présence de 1 µM de 12(S)-HETE non marqué, pendant 30 min à 37°C. Les cellules témoins

sont incubées pendant le même temps en absence de 12(S)-HETE. Les cellules sont ensuite

lavées 2 fois dans du RMPI 1640, puis resuspendues à la concentration finale de 4 x 107

cellules/ml. Le rendement moyen d'incorporation du 12(S)-HETE, déterminé dans des

expériences parallèles utilisant du [3H]-12(S)-HETE, est de 20%. Les cellules sont par la suite

incubées en présence d'une dose traceuse d'acide arachidonique tritié (1,5 µCi/ml) pendant 1

heure à 37°C. A la fin de la période d'incubation, les cellules sont lavées 3 fois dans du RPMI

1640. Le rendement d'incorporation du [3H]-AA dans ces cellules préalablement chargées en

12(S)-HETE n'est pas différent de celui observé dans les cellules témoins.

L'activation mitogénique des cellules enrichies en 12(S)-HETE est ensuite réalisée comme

décrit dans le paragraphe IV-2.

VI-2 Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par les cellules

mononucléées humaines enrichies en [3H]-12(S)-HETE et stimulées ou non par la Con A.

La suspension de cellules mononucléées (4 x 107 cellules/ml) est incubée 3 fois

successivement en présence de 1 µM de 12(S)-HETE tritié (0,25 µCi/ml, activité spécifique

215 Ci/mmol), pendant 30 min à 37°C. Les cellules témoins sont incubées selon le même

protocole avec de l'acide arachidonique tritié (0,25 µCi/ml). Les cellules sont ensuite lavées 2

fois dans du RPMI 1640, puis resuspendues à la concentration finale de 4 x 107 cellules/ml.

L'activation mitogénique des cellules enrichies en 12(S)-HETE et des cellules témoins est

ensuite réalisée comme décrit dans le paragraphe IV-2.

VI-3 Analyse de la composition en acides gras du PA par chromatographie en phase

gazeuse sur colonne capillaire (CPV).

La composition en acides gras du PA est déterminée après sa séparation sur CCM. Les

zones de gel correspondant au PA sont grattées et récupérées immédiatement dans des tubes à

vis. Les acides gras sont transméthylés selon la technique de Morrisson et Smith (1964).

101

Brièvement, 0,5 ml de mélange toluène/méthanol (20/30, v/v) sont ajoutés à la silice en

présence de 0,5 ml de trifluorure de bore à 10% dans le méthanol (Sigma, B-1252). La

réaction est effectuée dans un bain sec durant 1h30 à 100°C, puis arrêtée après refroidissementpar addition de 1 ml de K2CO3 5% dans l'eau. Les acides gras ainsi méthylés sont extraits

deux fois par 2 ml et 1 ml d'isooctane. Les phases isooctaniques sont combinées, et 5 µl de la

solution d'étalon interne de chromatographie (ester méthylique de l'acide pentadécanoïque,

Sigma P-6250) à 300 µg/ml sont ajoutés à tous les tubes. Les échantillons sont conservés à -

20°C en attendant d'être analysés à l'aide d'un chromatographe PERKIN ELMER qui est

équipé :

- d'un injecteur vaporisateur à température programmable, couplé à un système de

réchauffement et refroidissement par air comprimé. Le système d'injection permet

l'évaporation du solvant (pentane) à 40°C. La température augmente ensuite très rapidement à

230°C, ce qui permet la vaporisation des acides gras dans la colonne.

- d'une colonne SUPELCO SP 2380 (30 m x 0,32 mm), très polaire.

- d'un four, dont le programme de température est le suivant : la température initiale du

four est de 135°C pendant 5 min, puis augmente de 2°C/min jusqu'à 160°C pendant 2 min.

Elle augmente ensuite jusqu'à 205°C à 1,5°C/min. Le gaz vecteur est l'hélium et la pression

utilisée est de 0,8 psi.

- d'un détecteur à ionisation de flamme à 250°C (mélange air et hydrogène)

- d'un ordinateur permettant la programmation et le contrôle de toutes les fonctions

nécessaires à l'analyse (température, pression, etc...), l'impression des profils

chromatographiques et l'intégration des pics correspondants.

VI-4 Effet du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans les PBMC activées

ou non par la Con A.

Les cellules mononucléées à la concentration de 4 x 107 cellules/ml sont prétraitées au

12(S)-HETE comme décrit dans le paragraphe VI-1, mais elles ne sont pas marquées à l'acide

arachidonique tritié. L'activation mitogénique est ensuite effectuée comme décrit dans le

paragraphe IV-2. La réaction d'activation est arrêtée dans la glace et les cellules sont lysées

selon le protocole décrit en I-3-b. Les protéines phosphorylées sont quantifiées par "western-

blotting".

VI-5 Etude des sites de liaison spécifique du 12(S)-HETE sur les lymphocytes T

purifiés.

a) Principe.

Le but est d'examiner en détail l'association du 12(S)-HETE aux lymphocytes T

102

humains purifiés à la température de 4°C. L'exposition de 3 x 106 cellules dans 0,5 ml de

tampon à une gamme de concentrations variables de [3H]-12(S)-HETE à 4°C pendant 3

heures, suivie de l'élimination de la radioactivité non associée aux cellules par une technique

de filtration rapide, permet d'isoler les cellules marquées.

b) Préparation des lymphocytes T purifiés.

Les cellules mononucléées préparées selon le protocole décrit en I-1 sont resuspendues

à la concentration de 1 x 106 cellules/ml dans le milieu de culture suivant : RPMI 1640

contenant 10% de sérum de veau foetal, 2 mM de glutamine, 100 µg/ml de steptomycine et

100 U/ml de penicilline, et réparties par 50 ml dans des flacons de 75 cm2. Les cellules sontincubées à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 et 95% d'humidité pendant 72

heures, en absence ou en présence de Con A à 1 µg/ml. A la fin de la période d'incubation, les

cellules mortes sont éliminées par centrifugation sur gradient de Ficoll hypaque à 600 g

pendant 15 min. Les cellules collectées à l'interface sont lavées trois fois dans du tampon PBS(NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4 1,15 mM) à pH 7,0, puis sont

utilisées pour les expériences de liaison.

b) Protocole.

La technique a été mise au point à partir des travaux de Vonakis et Vanderhoek (1992)

concernant l'étude des récepteurs du 15-HETE sur une lignée cellulaire de basophiles PT-18.

Les lymphocytes T purifiés sont resuspendus dans du PBS contenant 11 mM de glucose, à la

concentration de 3 x 106 cellules/250 µl.

La fixation spécifique du 12(S)-HETE est mesurée par filtration rapide sur des filtres en fibre

de verre type GF/C. Le milieu réactionnel contient 200 µl de 12(S)-HETE froid (1 x 10-9 à 10

x 10-6 M) et 50 µl de [3H]-12(S)-HETE (0,26 nM et 0,025 µCi par essai). La réaction est

initiée par addition de la suspension cellulaire (3 x 106 cellules par essai). L'incubation sur

oscillateur dure 3 heures à 4°C. La fixation aspécifique (blancs) est déterminée en présence

d'un excès de 12(S)-HETE froid (3 x 10-6 M ou 10 x 10-6 M, selon les expériences). La

réaction est arrêtée par dilution avec 1 ml de PBS froid et filtrée sous vide sur filtres GF/C.

Pour limiter l'adsorption non spécifique du 12(S)-HETE sur la fibre de verre , les filtres sont

au préalable incubés dans du PBS contenant 1% de PolyEthylèneImine (PEI). Les filtres sont

lavés 3 fois par 3 ml de PBS froid à pH 7,0. Les essais sont réalisés en triple. La radioactivité

du complexe [3H]-12(S)-HETE/récepteur adsorbé sur les filtres est comptée dans 4,5 ml de

liquide scintillant.

103

RREESSUULLTTAATTSS

104

CHAPITRE I

Production et voies de synthèse de l'acide phosphatidique dansles cellules mononucléées humaines stimulées par la

Concanavaline A (Con A).

L'acide phosphatidique, un phospholipide quantitativement mineur dans les cellules,

est l'intermédiaire commun à la synthèse de tous les phospholipides et des triacylglycérols. De

plus, de nombreux arguments suggèrent que ce composé pourrait être un second messager

impliqué dans la mitogénèse. Plusieurs voies de formation de l'acide phosphatidique à partir

de plusieurs compartiments phospholipidiques ont été décrites dans différents types cellulaires

sous l'influence de mitogènes variés, conduisant à la production d'espèces moléculaires de PA

de composition différente déterminée par la composition en acides gras du compartiment

phospholipidique d'origine. De plus, les résultats de la littérature montrent que les effets du

PA sur cibles enzymatiques spécifiques (PKC, PLCg, Raf-1 kinase, GAP) varient en fonction

de l'espèce moléculaire.

L'équipe ayant démontré que l'activation des PDE4 par le PA, in vitro, dépend également de la

nature des espèces moléculaires de PA en présence, il était très important de connaitre la (les)

voies de formation du PA activée(s) in situ par les différents mitogènes, afin de déterminer si

les espèces moléculaires de PA formées physiologiquement lors de la mitogénèse étaient bien

des espèces actives vis-à-vis de la PDE. Cette connaissance était également indispensable

pour moduler les taux de PA intracellulaire par des traitements pharmacologiques spécifiques,

afin d'examiner les conséquences de ces variations sur les activités PDE cellulaires.

105

I- Effets de la Concanavaline A (Con A) sur la synthèse de PA et de DAG par les cellules

prémarquées à l'acide arachidonique tritié.

I-1 Marquage des cellules mononucléées au repos par une dose traceuse d'acide

arachidonique tritié.

Après préincubation des cellules mononucléées pendant 1 heure à 37°C en présence d'une

dose traceuse (7,5 nM) d'acide arachidonique tritié [3H]-AA (1,5 µCi/ml), la majeure partie de la

radioactivité liée aux lipides totaux est retrouvée dans les phospholipides (PL) (70%) et les lipides

neutres (27%).

La répartition de la radioactivité entre les différentes classes de phospholipides et dans les lipides

neutres est indiquée dans le Tableau 2 : 47% de la radioactivité liée aux PL totaux se trouve associée

à la phosphatidylcholine (PC), 36% au phosphatidylinositol et à la phosphatidylsérine (PI/PS) et 18%

à la phosphatidyléthanolamine (PE). Les diacylglycérols (DAG) représentent environ 0,6% de la

radioactivité totale incorporée et l'acide arachidonique non-estérifié est de l'ordre de 0,4%. La

radioactivité incorporée dans le PA est de l'ordre de 0,5-0,8% de la radioactivité totale incorporée

dans les phospholipides.

I-2 Variations de la production de PA et de DAG radiomarqués en fonction de la

durée de stimulation des cellules mononucléées humaines par la Con A.

La stimulation mitogénique des cellules mononucléées humaines (PBMC) préalablement

marquées par de l'acide arachidonique tritié ([3H]-AA) n'induit pas de variation significative de la

production de DAG radiomarqué au cours de la période de temps considérée (0-30 min). Par contre,

la Con A augmente de manière significative la proportion de PA-[3H]-AA (Figure 19a). Cette

augmentation est maximale dès la 5ème minute de stimulation et commence à décliner après 10

minutes. Pendant cette période, la proportion de PA radiomarqué est plus que triplée (basal : 0,61 vs

stimulé : 2,27%) (Figure 19b).

II- Effet de la Con A sur la synthèse de PA en masse dans les cellules mononucléées

humaines.

Dans les cellules mononucléées marquées à l'acide arachidonique tritié, les variations de la

proportion de PA radioactif donnent des indications sur le "turn-over" des espèces moléculaires riches

en acide arachidonique mais ne reflètent pas obligatoirement les variations de la masse totale de PA.

Il était donc important de déterminer si l'augmentation de la proportion de PA radioactif induite par la

Con A s'accompagnait d'une augmentation de la masse totale de PA.

106

Tableau 2 : Répartition de la radioactivité liée à l'acide arachidonique dans les différentesclasses lipidiques des cellules mononucléées humaines.

a) n Pourcentage de laradioactivité liée aux

lipides totauxPhospholipides totaux 15 69,96 ± 3,21

Triglycérides 15 20,16 ± 2,46Lipidesneutres

Esters destérols

15 6,07 ± 0,89

DAG 7 0,63 ± 0,8acide arachidonique libre 15 0,44 ± 0,13

b)n

Pourcentage de laradioactivité liée aux

phospholipidestotaux

PI/PS 11 35,53 ± 3,83PC 11 46,62 ± 2,97PE 11 17,68 ± 3,83PA 10 0,61± 0,05

Les cellules mononucléées ont été marquées par une dose traceuse d'acide arachidoniquetritié pendant 1 heure à 37°C. Après lavages, les lipides ont été extraits et séparés commedécrit dans le chapitre Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de laradioactivité liée aux lipides totaux (a) et en pourcentage de la radioactivité liée auxphospholipides totaux (b) et représentent les moyennes ± SEM de n expériences réalisées avecn donneurs différents. Les lipides mineurs n'étant pas pris en considération, le total deschiffres ans le tableau (a) est inférieur à 100.

107

30201000

1

2

PADAG

Temps (min)

PA

ou

DA

G

(% d

e la

rad

ioac

tivité

liée

aux

lipi

des

tota

ux)

**

a

b

0

1

2

3

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

* *+272%

Con ATémoinFigure 19 : Effet de la Concanavaline A sur la production de DAG et de PA par les cellulesmononucléées marquées à l'acide arachidonique.

Les cellules ont été marquées par du [3H]-AA et stimulées par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant destemps variables allant de 0 à 30 minutes. En (a), les résultats sont exprimés en % de la radioactivité liée auxlipides totaux et représentent les moyennes ± SEM de 4 expériences réalisées avec 4 donneurs différents. Lesrésultats sont soumis à une analyse de variance (ANOVA) et les moyennes obtenues après chaque temps sontcomparées à celle du temps 0 par un test de t protégé (Fisher). * indique une différence significative (p<0,05)par rapport au temps 0. La figure b montre l'augmentation de la proportion de PA radiomarqué après 5 min destimulation par la Con A. Les résultats sont exprimés en % de la radioactivité liée aux phospholipides totaux etreprésentent les moyennes ± SEM de 10 expériences réalisées avec 10 donneurs différents. Les résultats sontanalysés par ANOVA et les moyennes comparées par un test de t protégé (Fisher). ** indique une différencesignificative (p<0,01) par rapport au niveau non stimulé.

108

0

20

40

60

80

PA

form

é (n

g/m

illio

n d

e ce

llule

s)

*+230%

Témoin Con A

Figure 20 : Effet de la Concanavaline A sur la synthèse d'acide phosphatidique en masse.Les cellules ont été stimulées par la Con A (5µg/106cellules) pendant 5 min. Les résultats

sont exprimés en ng de PA formé par 106 cellules (b) et représentent la moyenne ± SEM de10 expériences différentes réalisées avec 10 donneurs différents. Les résultats sont comparéspar analyse de variance (ANOVA STATVIEW II). * indique une différence significative(p<0,01) par rapport au niveau basal (sans Con A).

109

La quantification du PA par colorimétrie et vidéodensitométrie (Fig. 20) indique que la Con A

induit également une augmentation significative de la masse de PA (+230%; basal : 14,62 vs

stimulé : 47,18 ng/106 cellules).

Les résultats de la littérature décrivant deux voies principales de formation du PA sous

stimulation mitogénique (PLD et PI-PLC/DAG-KINASE), nous nous sommes proposés

d'étudier ces deux possibilités. Nous avons tout d'abord recherché la présence éventuelle d'une

activité PLD dans les cellules mononucléées au repos ou stimulées. D'autre part, l'absence

d'effet apparent de la Con A sur la production de DAG-[3H]-AA par les cellules

mononucléées suggérait une phosphorylation rapide du DAG en PA par la DAG-kinase,

comme cela a été décrit pour des lymphocytes murins stimulés par la Con A (Hasegawa-

Sasaki et Sasaki, 1982) ou des cellules de Jurkat stimulées par des anticorps spécifiques et des

lectines (Aussel et al., 1992). Pour vérifier cette hypothèse, nous avons ensuite étudié l'effet

d'un inhibiteur de DAG-kinase sur la production de PA induite par la Con A.

III- Recherche d'une voie PLD dans la production de PA induite par la Con A dans les

cellules mononucléées humaines.

Grâce à sa capacité unique de transphosphatidylation, la PLD conduit à la synthèse de

phosphatidylalcool lorsque les expériences sont réalisées en présence d'alcool primaire, alors qu'en

présence d'eau, il se forme du PA. Par conséquent, une activation de la PLD en présence d'éthanol

conduit à la synthèse de phosphatidyléthanol (PEt), ce qui diminue parallèlement la production de

PA. La comparaison de la production de PA en absence et en présence d'éthanol, et la quantification

du phosphatidyléthanol constituent donc une mesure de l'activité PLD particulièrement fiable. Enfin,

l'utilisation de l'ester de phorbol TPA, activateur reconnu de la PLD dans la plupart des types

cellulaires permettra de tester la présence d'une activité PLD dans ce type de cellules.

Il s'agira ensuite de déterminer si cette voie est mise en jeu lors d'une stimulation par la Con A.

III-1 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou en présence

d'éthanol dans des cellules prémarquées à l'acide arachidonique tritié.

Les résultats obtenus lors de ces expériences sont présentés dans les Figures 21a et 21b.

Plusieurs points importants peuvent être soulignés :

- le TPA augmente la radioactivité liée au PA mais de façon moins importante que la

Con A (+193% vs +342%). Par contre, l'augmentation de PA en masse induite par le TPA est plus

importante que celle induite par la Con A (+1034% vs +285%), et cette différence est significative

(p<0,01);

110

- EtOH

+ EtOH*

*

0

1

2

3

4

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

a

Témoin Con A TPA

0

50

100

150

200 - EtOH

+ EtOH

PA

form

é (n

g/m

illio

n de

cel

lule

s) *

* †

b

Témoin Con A TPA

Figure 21 : Effet du TPA ou de la Con A sur la synthèse de PA en présence ou en absenced'éthanol.

Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence de [3H]-AA comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées soit par 100nM deTPA pendant 10 min soit par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min en présence ou enabsence de 1% d'éthanol. Les cellules témoins sont incubées pendant le même temps dans duRPMI en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les résultats sont exprimés en pourcentagede la radioactivité liée aux phospholipides (a) ou en ng de PA formé par 106 cellules (b) etreprésentent la moyenne de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Lesrésultats sont comparés par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II).* indique une différence significative (p<0,05) par rapport au témoin. † indique une différencesignificative (p<0,05) entre les niveaux stimulés par TPA en présence et absence d'éthanol.

111

- l'éthanol ne semble pas avoir d'effet ni sur la synthèse basale de PA (0,60 vs 0,54%

de la radioactivité liée aux PL totaux; 10,71 vs 10,78 ng/106 cellules) ni sur celle induite par la Con A

(2,67 vs 2,40% de la radioactivité liée aux PL totaux; 41,27 vs 46,31 ng/106 cellules);

- l'éthanol diminue légèrement (-30%) la radioactivité liée au PA lorsque les cellules

sont stimulées par le TPA (1,77 vs 1,20% de la radioactivité liée aux PL totaux) et diminue de

manière significative (-52%) la production de PA en masse (121,38 vs 58,35 ng/106 cellules, p<0,01).

III-2 Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PEt radiomarqué à

l'arachidonate.

Afin de démontrer que la diminution de synthèse de PA sous l'effet de l'éthanol dans les

cellules stimulées par le TPA n'est pas due à un effet toxique mais bien à l'activation d'une PLD, nous

avons recherché en parallèle la formation de phosphatidyléthanol (PEt). Les résultats présentés dans

la Figure 22 montrent que :

- l'éthanol n'induit pas de formation de PEt radioactif dans les cellules témoins (0,06

vs 0,06% de la radioactivité liée aux PL totaux) ni dans les cellules stimulées par la Con A (0,09 vs

0,05% de la radioactivité liée aux PL totaux);

- l'éthanol induit une synthèse de PEt radioactif dans les cellules stimulées par le TPA

(0,09 vs 0,47% de la radioactivité des PL totaux).

Ces résultats indiquent qu'il existe bien une activité PLD activable par le TPA dans ce modèle

cellulaire, et suggèrent que l'activation mitogénique par la Con A ne fait pas intervenir cette voie. En

particulier, l'absence d'effet de l'éthanol sur la production de PA en masse induite par la Con A

indique clairement que ce mitogène n'induit pas d'activation massive de la PLD, ce qui n'exclut pas la

contribution limitée d'une activité PLD agissant sur un compartiment particulier de phospholipides.

En effet, chaque classe de phospholipides présente une composition en acides gras particulière, les

phosphoinositides étant beaucoup plus riches en acide arachidonique que les phosphatidylcholines, et

inversement les phosphatidylcholines étant beaucoup plus riches en acide oléïque que les

phosphoinositides. C'est pour cela que la nature de l'acide gras utilisé comme traceur pour le

marquage des cellules a un rôle important, l'acide arachidonique permettant une meilleure estimation

des PA issus des phosphoinositides et l'acide oléïque celle des PA issus des phosphatidylcholines.

Ainsi, grâce à l'utilisation d'acide oléïque tritié pour le marquage des lipides cellulaires, Kazkin et al.

(1992) sont parvenus à démontrer l'existence d'une voie PLD, active sur un pool phospholipidique

riche en oléate, dans une lignée de cellules épithéliales transformées (A431); une telle voie n'était pas

apparente lorsque le traceur radioactif utilisé était l'acide arachidonique. Cela nous a conduit à

prémarquer les cellules mononucléées humaines avec de l'acide oléïque, dans le but de tester

l'hypothèse de l'intervention d'une voie PLD lors de la synthèse de PA induite par la Con A, par une

autre approche.

112

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5 - EtOH

+ EtOH

PE

t (%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

Témoin Con A TPA

Figure 22 : Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de PEt radiomarqué à l'arachidonate.Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence de [3H]-

AA comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées soit par 100nM deTPA pendant 10 min soit par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min en présence ou enabsence de 1% d'éthanol. Les cellules témoins sont incubées pendant le même temps dans duRPMI en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les résultats sont exprimés en pourcentagede la radioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expérience.

113

III-3 Marquage des cellules mononucléées au repos par de l'acide oléïque tritié.

Après préincubation des cellules mononucléées pendant une heure à 37°C en présence d'une

dose traceuse (150 nM) d'acide oléïque tritié (1,5 µCi/ml), la majeure partie de la radioactivité totale

est, comme pour le marquage par le [3H]-AA, retrouvée dans les PL et les lipides neutres (60 et 37%

respectivement). La radioactivité liée au DAG représente environ le même pourcentage de la

radioactivité liée aux lipides totaux (0,7%) quel que soit l'acide gras utilisé comme marqueur. Il en est

de même pour le PA estimé après la deuxième migration. Par contre, la répartition de la radioactivité

dans les différentes classes de PL diffère de celle observée en présence d'acide arachidonique

(Tableau 3), ce qui est en bon accord avec les résultats de la littérature (Kazkin et al., 1992). En effet,

67% de cette radioactivité est retrouvée dans les PC, alors que seulement 17% sont trouvés dans

PI/PS, ce qui indique une incorporation préférentielle de l'oléate dans les phosphatidylcholines

Tableau 3 : Répartition de la radioactivité liée à l'acide oléïque dans les différentes classes dephospholipides des cellules mononucléées humaines.

n Pourcentage de laradioactivité liée aux

phospholipidestotaux.

PI/PS 4 16,87 ± 0,67PC 4 66,92 ± 0,86PE 4 15,63 ± 0,54PA 4 0,42 ± 0,06

Les cellules mononucléées ont été marquées par une dose traceuse d'acide oléïque tritié pendant 1heure à 37°C. Après lavages, les lipides ont été extraits et séparés comme décrit dans le chapitreMéthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipidestotaux et représentent les moyennes ± SEM de n expériences réalisées avec n donneurs différents. Leslipides mineurs n'étant pas pris en considération, le total des chiffres ans le tableau (a) est inférieur à100.

III-4 Effet de la Con A sur la synthèse de PA en absence ou en présence d'éthanol dans les

cellules mononucléées humaines prémarquées à l'acide oléïque tritié.

La stimulation mitogénique des PBMC prémarquées par une dose traceuse d'acide oléïque

augmente la proportion de PA marqué (Figure 23) d'environ +145% (basal : 1,06 vs stimulé : 2,59%

de la radioactivité liée aux PL totaux). Cette augmentation est plus faible que celle observée pour la

masse (+230%, Fig. 20), ce qui indique qu'une partie au moins du PA provient d'un compartiment

phospholipidique non marqué et suggère l'existence de plusieurs voies de synthèse du PA stimulées

par la Con A dans ce type cellulaire. Afin de tester l'activation possible d'une PLD, des expériences

ont été réalisées en présence d'éthanol.

114

0

1

2

3

4

- EtOH

+ EtOH

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

*

†

Témoin Con A

Figure 23 : Effet de l'éthanol sur la proportion de PA radiomarqué à l'oléate dans les cellulesmononucléées au repos ou stimulées par la Con A.

Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acideoléique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées par la ConA (5 µg/106 cellules) pendant 5 min en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les cellulestémoins sont incubées pendant le même temps dans du RPMI en présence ou en absence de1% d'éthanol. Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée auxphospholipides et représentent la moyenne de 4 expériences différentes réalisées avec 4donneurs différents. Les moyennes sont comparées par un test de t apparié (STATWORK).*indique une différence significative (p<0,05) par rapport au témoin. † indique une différencesignificative (p<0,05) entre les niveaux stimulés par la Con A en présence et absenced'éthanol.

115

Les résultats présentés dans la Figure 23 indiquent que l'éthanol ne semble pas avoir

d'effet sur la proportion de PA radiomarqué dans les cellules non stimulées (1,06 vs 1,11% de

la radioactivité liée aux PL totaux). Par contre, l'augmentation de la proportion de PA

radioactif induite par la Con A est diminuée significativement par l'éthanol de 20% (2,59 vs

2,00 de la radioactivité liée aux PL totaux, p<0,01).

La synthèse de PA radioactif induite par la Con A étant diminuée par l'éthanol, nous pouvons

penser qu'une voie PLD, active sur un pool phospholipidique riche en oléate, pourrait

intervenir de façon minoritaire lors de la stimulation par la Con A. Afin de vérifier cette

hypothèse, nous avons étudié la formation de PEt, parallèlement à la formation de PA.

III-5 Effet de la Con A et du TPA sur la production de PEt radiomarqué à l'oléate.

Les résultats obtenus au cours de ces expériences montrent que (Figure 24) :

- aucune synthèse de PEt n'est observée dans les cellules témoins (0,07 vs

0,09% de la radioactivité liée aux PL totaux) ou stimulées par la Con A (0,08 vs 0,06% de la

radioactivité liée aux PL totaux);

- une synthèse de PEt radioactif est notée dans les cellules stimulées par le TPA

(0,12 vs 0,24% de la radioactivité des PL totaux).

Bien que l'éthanol diminue légèrement la radioactivité du PA lorsque les cellules marquées à

l'oléate sont stimulées par la Con A, nous n'avons pas pu démontrer la formation de PEt

radiomarqué par l'oléate.

L'ensemble de tous ces résultats suggère que la voie PLD n'est pas stimulée par la Con A ou

que la stimulation (si elle existe) n'est que très marginale. Le PA produit dans les cellules

mononucléées humaines stimulées par la Con A proviendrait donc préférentiellement de

l'hydrolyse des phosphoinositides par une phospholipase C suivie d'une phosphorylation par

une DAG-kinase. C'est dans le but de vérifier cette hypothèse que nous avons effectué les

expériences suivantes.

IV- Implication d'une voie PI-PLC/DAG-kinase dans la production de PA induite par la

Con A dans les cellules mononucléées humaines.

Dans un premier temps, nous avons vérifié l'implication d'une DAG-kinase dans la

formation du PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées humaines. Pour cela,

nous avons utilisé le composé R59022 qui est décrit comme un inhibiteur de DAG-kinase.

116

0,0

0,1

0,2

0,3

- EtOH

+ EtOH

PE

t (%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

Témoin Con A TPA

Figure 24 : Effet du TPA et de la Con A sur la synthèse de Phosphatidyléthanol radiomarquéà l'oléate.

Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acideoléique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite stimulées soit par100nM de TPA pendant 10 min soit par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min enprésence ou en absence de 1% d'éthanol. Les cellules témoins sont incubées pendant le mêmetemps dans du RPMI en présence ou en absence de 1% d'éthanol. Les résultats sont exprimésen pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expérience.

117

IV-1 Effet du R59022 sur la synthèse de PA induite par la Con A dans les cellules

mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.

La préincubation des cellules mononucléées avec l'inhibiteur de DAG-kinase, R59022

(100 µM) pendant 10 min diminue la proportion relative de PA radiomarqué et la production

de PA en masse induite par la Con A. Ainsi, alors que la Con A stimule la production de PA

radioactif de 190% dans les cellules non traitées, cette augmentation n'est plus que de 10%

lorsque les cellules ont été prétraitées avec du R59022. L'effet sur l'augmentation de la masse

de PA est moins important (150 vs 46%) et n'est pas significatif (Tableau 4).

Tableau 4 : Diminution de la production de PA induite par la Con A dans les cellulespréincubées en présence du composé R59022.

Pourcentage

d'augmentation par rapport

aux cellules non stimulées

par la Con A

- R59022

Pourcentage



par la Con A

+ R59022

PA radiomarqué 190±55 10±3 *

PA en masse 150±84 46±24

Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acidearachidonique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite incubées enprésence de 100 µM de R59022 pendant 10 min, puis stimulées par la Con A (5 µg/106

cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'augmentation de laproduction de PA dans les cellules activées par rapport aux cellules témoins et représentent lesmoyennes ± SEM de 4 expériences différentes réalisées avec 4 donneurs différents. Lesmoyennes sont comparées par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II). * indique unedifférence significative par rapport aux cellules non traitées par le R59022 (p<0,05).

Ces résultats suggèrent que la voie PI-PLC est largement impliquée dans la synthèse de PA

stimulée par la Con A. Or, une des toutes premières étapes de la cascade d'activation induite

par les mitogènes comprend l'activation de la PLCγ spécifique de l'hydrolyse du PIP2 par

phosphorylation sur des résidus tyrosines, assurée par des protéines tyrosine kinases

cytosoliques de la famille src. Nous avons donc effectué des expériences en présence d'un

inhibiteur de tyrosine-kinase (la génistéine) dans le but de vérifier l'hypothèse de l'implication

118

de la voie PI-PLC suggérée par nos précédents résultats.

IV-2 Effet de la génistéine sur la synthèse de PA induite par la Con A dans les cellules

mononucléées prémarquées à l'acide arachidonique.

La préincubation des cellules mononucléées avec l'inhibiteur de tyrosine-kinase,

génistéine (400 µM) pendant 10 min diminue la proportion relative de PA radiomarqué et la

production de PA en masse. En effet, alors que Con A stimule la synthèse de PA marqué de

246% dans les cellules non traitées, cette augmentation n'est que de 49% lorsque les cellules

sont prétraitées par la génistéine. De plus, la masse de PA est augmentée de 378% par la Con

A seule, alors qu'elle n'est augmentée que de 117% en présence de génisteine. Ces différences

sont significatives (p<0,05), que ce soit en radioactivité ou en masse (Tableau 5).

Tableau 5 : Diminution de la production de PA induite par la Con A dans les cellulespréincubées en présence de Génistéine.

Pourcentage



par la Con A

- Génistéine

Pourcentage d'augmentation

par rapport aux cellules non

stimulées par la Con A

+ Génistéine

PA radiomarqué 246±50 49±42 *

PA en masse 378±87 117±26 *

Les cellules mononucléées sont incubées pendant une heure à 37°C en présence d'acidearachidonique tritié comme décrit dans le chapitre Méthodes. Elles sont ensuite incubées enprésence de 400 µM de Génistéine pendant 10 min, puis stimulées par la Con A (5 µg/106

cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage d'augmentation de laproduction de PA dans les cellules activées par rapport aux cellules témoins et représentent lesmoyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Lesmoyennes sont comparées par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II). * indique unedifférence significative par rapport aux cellules non traitées par la génistéine (p<0,05).

Ces résultats suggèrent fortement l'implication de tyrosine kinases dans la stimulation de la

synthèse de PA par la Con A et confirment donc notre hypothèse.

119

VIII- Discussion.

Du PA est produit normalement par les cellules lymphoïdes après activation

mitogénique, comme cela a été décrit dans les thymocytes de rat (Marcoz et al., 1993; El

Bawab et al., 1995), ou dans les cellules Jurkat (Aussel et al., 1992; Mollideno et al., 1994).

De plus, de nombreux arguments expérimentaux montrent que le PA est mitogène dans la

plupart des types cellulaires. Ainsi, ce phospholipide semble largement impliqué dans un

certain nombre de voies de signalisation. C'est pourquoi il nous a paru important de

déterminer quelles étaient les voies impliquées dans sa production.

Nous avons mis au point une méhode de dosage du PA mettant en jeu une coloration des

phospholipides sur plaque de silice et une quantification de l'intensité de coloration des spots

de PA par analyse d'image par comparaison à une gamme de PA déposée sur la même plaque.

Cette méthode se montre très sensible puisqu'elle permet de doser des quantités de PA de

l'ordre de 0,1 µg alors que les méthodes colorimétriques classiques (dosage du phosphate

après minéralisation) ne permettent pas de détecter des quantités de phospholipides inférieures

à 20 µg. Elle est fiable et rapide, ce qui permet son utilisation pour la quantification de la

masse de PA en routine.

L'ensemble des résultats présentés dans ce chapitre indique que la synthèse de PA induite par

la Con A dans les cellules mononucléées humaines implique l'activation de la voie PI-

PLC/DAG-kinase, et que cette voie doit être activée par des protéines tyrosine-kinases.

En effet, la proportion de PA marqué induite par la Con A est largement augmentée (+272%)

au cours des premières minutes de la stimulation quand les cellules mononucléées sont

prémarquées avec du [3H]-AA (Figure 20 a et b). Ce résultat est en accord avec les études

d'Hasegawa-Sasaki et Sasaki (1993) dans les lymphocytes murins ou de Marcoz et al. (1993)

dans les thymocytes de rat. Parallèlement, la production de PA en masse est aussi augmentée

(+230%) et cet effet est sensiblement du même ordre que celui observé sur le PA marqué

(Figure 21).

Quand les cellules mononucléées sont prémarquées à l'oléate tritié, la radioactivité incorporée

dans les PC est plus importante que lorsque les cellules sont marquées à l'arachidonate [3H]

(Tableaux 2 et 3). De plus, l'augmentation de la masse de PA induite par la Con A (+272%)

est nettement plus importante que celle observée pour le PA marqué à l'oléate (+145%). Ce

résultat suggère que seule une petite partie du PA synthétisé provient des PC. Cependant, les

PI/PS sont tout de même légèrement marqués quand les cellules sont incubées en présence

120

d'oléate [3H], et nous pouvons donc supposer qu'une partie du PA marqué provient des PI. Le

marquage relativement faible des PI dans le cas où l'oléate est utilisé comme traceur radioactif

pourrait donc expliquer la production relativement plus faible de PA marqué. Enfin, ces

résultats suggèrent également que les espèces moléculaires de PA produites sous stimulation

par la Con A contiennent en majorité de l'acide arachidonique. Un tel résultat a d'ailleurs été

démontré par El Bawab et al.(1995) dans les thymocytes de rat.

Plusieurs résultats expérimentaux indiquent que la stimulation de la production de PA par la Con A

n'implique pas d'activation de PLD. D'une part, l'éthanol n'a pas d'effet significatif sur la synthèse de

PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées marquées au [3H]-AA et a un effet très

marginal dans les cellules marquées au [3H]-oléate (Figures 22 et 24). D'autre part, on n'observe pas

de production de PEt radioactif lorsque les cellules mononucléées sont stimulées par la Con A, quel

que soit le marqueur radioactif utilisé. Au contraire, quand les cellules mononucléées sont incubées

en présence d'éthanol et stimulées par le TPA, la production de PA est significativement diminuée et

on observe une production de PEt radioactif lorsque les cellules sont incubées en présence d'éthanol.

Ces résultats permettent de déduire deux conclusions : (1) une voie PLD existe dans les cellules

mononucléées humaines ; (2) cette voie PLD n'est pas impliquée dans la synthèse de PA induite par la

Con A.

Dans le but de mieux comprendre le mécanisme de la production du PA induite par la Con A, la

stimulation de cellules mononucléées par la Con A a été effectuée en absence ou en présence de

l'inhibiteur de DAG-kinase R59022. Cet inhibiteur a été utilisé par Aussel et al. (1992) dans les

cellules de Jurkat pour montrer l'implication d'une DAG-kinase dans la synthèse du PA. Nos résultats

démontrent que la hausse de PA induite par la Con A est largement diminuée en présence de R59022,

ce qui implique une DAG-kinase dans l'activation mitogénique par la Con A. Ceci est en bon accord

avec les résultats précédents et est en faveur d'une voie PI-PLC/DAG-kinase.

Les expériences réalisées en absence ou en présence de l'inhibiteur de tyrosine-kinase, génistéine,

confirment ces résultats. En effet, l'incubation des cellules mononucléées en présence de Con A et de

génistéine diminue significativement la formation de PA. Ce résultat indique le recrutement de

tyrosine kinases en amont de la production de PA dans la voie de signalisation activée par la Con A,

en bon accord avec le schéma d'activation proposé par Weiss (1993) pour l'activation mitogénique

des lymphocytes.

Cependant, les données de la littérature montrent que la PLD peut être activée par de multiples

mécanismes, impliquant entre autres, des protéines tyrosine-kinases. Ainsi, nos expériences en

présence de génisteine pourraient être compatibles avec l'activation d'une PLD au cours de la

stimulation de la synthèse de PA par la Con A. Mais les effets de l'éthanol sur la production de PA et

l'absence de formation de PEt contredisent cette hypothèse, et indiquent qu'aucune activité PLD n'est

stimulée par la Con A seule.

En conclusion , l'ensemble de nos résultats montre que la production de PA stimulée par la Con A

dans les cellules mononucléées humaines implique la voie Tyr-kinase/PI-PLC/DAG-kinase.

121

CHAPITRE II

Corrélations entre la production d'acide phosphatidique et lesactivités phosphodiestérases dans les cellules mononucléées

humaines témoins ou activées.

Les expériences présentées dans le Chapitre I de ce travail ont permis de démontrer

que l'activation mitogénique des cellules mononucléées humaines conduit à une hausse

précoce de la production d'acide phosphatidique. D'autre part, des résultats antérieurs de

l'équipe avaient montré que la stimulation mitogénique des cellules conduit à une hausse

d'activité PDE maximale après 10 à 30 minutes de stimulation, donc postérieure à

l'augmentation du taux de PA. Enfin, l'équipe avait également démontré que le PA est capable

de stimuler in vitro l'activité de certaines isoformes de PDE (Marcoz et al., 1993a ; Savany et

al., 1995 ; Némoz et al., 1996). L'ensemble de ces données et en particulier, les données

cinétiques relatives aux taux de PA (Figure 19) et aux hausses d'activités PDE (Meskini et al.,

1992) suggéraient un lien de cause à effet entre ces deux événements, sans en apporter la

preuve directe, puisque les résultats avaient été obtenus dans des expériences indépendantes.

Afin de conforter l'hypothèse que la hausse du taux intracellulaire d'acide phosphatidique est

bien responsable de l'activation des PDEs, et que ces événements corrélés constituent une

étape clef de l'activation lymphocytaire, il était important de mesurer, dans la même

population cellulaire provenant d'un même donneur, à la fois les taux de PA, les activités PDE

et les taux de nucléotides cycliques.

122

I- Synthèse d'acide phosphatidique (PA) dans les cellules mononucléées stimulées par

différents agonistes.

Les phospholipides membranaires des PBMC ont été marqués en incubant les cellules en

présence d'une dose traceuse (7,5 nM) d'acide arachidonique tritié (1,5 µCi/ml) pendant 1 heure à

37°C. A la fin de la période d'incubation, les cellules ont été lavées et stimulées soit par la lectine

mitogénique Con A (5 µg/106 cellules) soit par l'anticorps anti-CD3, OKT3 (30 ng/ml) pendant 5

min, soit par l'ester de phorbol TPA (100 nM) pendant 15 min. Comme le montrent les résultats

présentés dans la Figure 25a, les trois agonistes augmentent de manière significative la quantité de

[3H]-AA-PA par rapport au témoin et la Con A et l'OKT3 ont un effet plus important (4,3 fois et 3,1

fois, respectivement) que le TPA (2,9 fois). Au contraire, quand on observe la production de PA en

masse (Figure 25b), les effets des 3 agonistes sont assez différents. Ainsi, le TPA augmente plus la

production de PA en masse (9,2 fois) que la Con A (5,6 fois) ou l'OKT3 (2,9 fois). Ces résultats sont

en accord avec les mécanismes d'action qui ont été décrits pour ces trois agonistes en ce qui concerne

la production de PA. Comme nous l'avons vu dans le Chapitre I, le TPA active une PLD spécifique de

l'hydrolyse des PC, alors que la Con A stimule surtout une voie PI-PLC/DAG-kinase. Un mécanisme

similaire à celui de la Con A a été décrit pour l'anticorps anti-CD3, OKT3 (Aussel et al., 1992). Sur

une partie aliquote de chaque population cellulaire traitée par l'un ou l'autre agoniste, ou non traitée

(témoins) les activités PDE ont été mesurées.

II- Effet de la stimulation des cellules mononucléées par les trois agonistes sur leurs

activités phosphodiestérases des nucléotides cycliques.

L'activation des cellules mononucléées par la Con A (Figure 26) induit une

augmentation plus importante de l'activité GMPc-PDE de l'homogénat total (+98% par

rapport au niveau basal, P=0,004) que de l'activité AMPc-PDE (+33% par rapport au niveau

basal, P=0,021). De plus, la stimulation des deux activités phosphodiestérases est plus

importante dans la fraction cytosolique que dans la fraction particulaire (44 vs 10% pour

l'activité AMPc-PDE et 112 vs 68% pour l'activité GMPc-PDE, respectivement).

Au contraire, l'anticorps anti-CD3 induit un profil d'activation des phosphodiestérases

légèrement différent (Figure 26). En effet, on observe une augmentation faible mais

significative des activités AMPc-PDE (+16%, P=0,002) et GMPc-PDE (+21%, P=0,008) de

l'homogénat total des cellules activées. Cette augmentation reflète celle des activités

enzymatiques particulaires (+35% et +30% pour les activités AMPc-PDE et GMPc-PDE avec

des valeurs de P égales à 0,005 et 0,02, respectivement), alors que les activités de la fraction

cytosolique ne sont presque pas affectées.

123

*

*

*

0

1

Témoin+ TPA+ ConA+ OKT3

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)a

0

20

40

60

80

PA

form

é (n

g/m

illio

n de

cel

lule

s)

b

*

*

*

Figure 25 : Synthèse d'acide phosphatidique dans les cellules mononucléées stimulées par la Con A,l'OKT3 ou le TPA.

Les cellules mononucléées sont incubées pendant 1 heure à 37°C en présence de [3H]-AA (VoirMéthodes) puis sont incubées 5 min en absence (témoin) ou en présence de Con A (5 µg/106 cellules)ou de l'anticorps anti-CD3 (30 ng/ml), ou incubées pendant 15 min en présence de 100nM de TPA.Les résultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides totaux (a) ou enng de PA formé par 106 cellules (b). Ils représentent la moyenne de n expériences différentesréalisées avec n donneurs différents (n=9 pour les cellules témoins ou traitées par le TPA, 6 pour lescellules traitées par la Con A et 5 pour les cellules traitées par l'OKT3). Les moyennes sont comparéspar analyse de variance (ANOVA STATVIEW II) et par le test de Fisher PLSD.* indique une différence significative (p<0,05) par rapport au niveau basal.

124

0

50

100

150

200

250

Act

ivité

PD

E (

% d

u té

moi

n)

+ Con A

AMPc-PDE

*

*

*

*

*

GMPc-PDE0

50

100

150

Act

ivité

PD

E (

% d

u té

moi

n)

+ OKT3

AMPc-PDE

* *

* *

GMPc-PDE

0

50

100

150

200

250

Act

ivité

PD

E (

% d

u té

moi

n)

+ TPA

AMPc-PDE

* *

** *

*

GMPc-PDE

TémoinHomogénat stimulé

Cytosol stimulé

Culot stimulé

Figure 26 : Activités AMPc et GMPc-PDE dans l'homogénat total, les fractions cytosoliqueet particulaire des cellules mononucléées témoins ou traitées par différents agonistes.

Les cellules mononucléées ont été incubées 5 min en absence (témoin) ou en présence deCon A (5 µg/106 cellules) ou de l'anticorps anti-CD3 (30 ng/ml) ou incubées pendant 15 minen présence de TPA (100 nM). A la fin de la période d'incubation, les cellules ont été culotées,lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activités PDE ont été mesurées dans leshomogénats et les fractions cytosoliques et particulaires des cellules témoins ou activées. Pourchaque traitement, les activités PDE sont exprimées en pourcentage par rapport à la valeur dutémoin et représentent les moyennes de n expériences différentes réalisées avec n donneursdifférents (n=9 pour les cellules témoins ou traitées par le TPA, 6 pour les cellules traitées parla Con A et 5 pour les cellules traitées par l'OKT3). Pour l'analyse statistique, les activitésPDE spécifiques moyennes (pmole/min/mg de protéines) ont été comparées par le test de t deStudent apparié.

* indique une différence significative (p<0,05) par rapport au niveau basal.

125

Enfin, l'ester de phorbol TPA a un peu moins d'effet que la Con A et un peu plus que l'OKT3

sur la stimulation des activités phosphodiestérases de l'homogénat total (Figure 26). Tout comme la

Con A, le TPA induit une plus forte augmentation de l'activité GMPc-PDE que de l'activité AMPc-

PDE (+48%, P=0,002 vs +20%, P=0,02, respectivement), mais tout comme l'OKT3, il augmente de

manière plus importante l'activité de la fraction particulaire que celle de la fraction cytosolique.

III- Corrélations entre la quantité de PA et l'activité PDE dans les cellules mononucléées

témoins et activées.

Les activités PDE mesurées dans les différents compartiments cellulaires ont été étudiées en

relation avec la proportion de [3H]-AA-PA et la masse de PA dans les mêmes extraits cellulaires,

indépendemment du traitement utilisé.

Des corrélations linéaires et positives ont pu être établies (Tableau 6) entre l'activité AMPc-PDE de

l'homogénat total ou de la fraction cytosolique et la quantité de PA radiomarqué (P=0,025 et 0,05,

n=31, respectivement), alors que les activités AMPc-PDE ou GMPc-PDE de la fraction membranaire

sont mieux corrélées avec la masse de PA (P=0,001 et 0,002, n=28, respectivement).

Tableau 6 : Corrélations entre les activités AMPc et GMPc-PDE et la masse de PA ou le PAradioactif.

AMPc-PDE

GMPc-PDE

Corrélation entre

Homogénat

Fractionparticulair

e

Fractioncytosoliqu

e

Homogénat

Fractionparticulair

e

Fractioncytosoliqu

eMasse de

PANS P=0,001 NS NS P=0,002 NS

PAradioactif

P=0,025 NS P=0,05 NS NS NS

NS : non significatif

IV- Effet de l'éthanol sur la production de PA et la stimulation des activités PDE

induites par le TPA.

Dans les cellules mononucléées humaines (Chapitre I de ce travail), la synthèse de PA induite

par le TPA est largement diminuée par l'éthanol. Les résultats présentés dans la Figure 27 indiquent

que, en plus de son effet inhibiteur sur la production de PA radioactif et en masse induite par le TPA

(Figures 27a et 27b), l'éthanol supprime totalement la hausse des activités PDE cytosoliques induite

par le TPA (Figure 27c) et réduit de 50% celle de la fraction

126

0,0

0,5

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

a

0

20

40

60

PA

(ng

/mill

ion

de c

ellu

les) b

c

0

10

20

30

40

Act

ivité

PD

E (

pmol

/min

/mg

prot

)

AMPc-PDE GMPc-PDE

Témoin+ TPA+ EtOH+ TPA + EtOH

Figure 27 : Effet de l'éthanol sur la synthèse de PA et l'activation des PDEs induites par leTPA.

Les cellules mononucléées marquées (a et b) ou non (c) à l'acide arachidonique tritié (voirMéthodes) ont été stimulées ou non pendant 15 min par le TPA (100 nM) en absence (témoin,+ TPA) ou en présence d'1% d'éthanol (+EtOH, +TPA +EtOH). En a et b, les lipides ont étéextraits des cellules plus milieu à la fin de la période d'incubation, et ont été séparés sur CCM.En c, les cellules ont été culotées, lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activitésPDE ont été dosées dans les fractions cytosoliques des cellules témoins ou activées. Lesrésultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides (a) ou bienen ng de PA/106 cellules (b) ou en activité PDE spécifique (pmol/min/mg de protéines) (c) etcorrespondent à une expérience effectuée en triple.

127

particulaire (résultats non montrés). Ainsi, lorsque la production de PA est diminuée dans les

cellules, la hausse d'activité PDE l'est également. Ce résultat est en faveur d'une participation

du PA dans l'activation des PDEs qui fait suite à la stimulation mitogénique des cellules


Dans le but de confirmer encore cette hypothèse, nous avons utilisé une autre méthode, décrite

dans le Chapitre I, permettant de diminuer la production de PA. Les cellules ont été stimulées

par la Con A en présence de l'inhibiteur de DAG-kinase, R59022.

V- Effet inhibiteur dose-dépendant du composé R59022 sur la production de PA et la

stimulation des activités PDE induites par la Con A.

Le prétraitement des cellules mononucléées humaines avec des concentrations

croissantes de l'inhibiteur de DAG-kinase R59022 (5 à 50 µM) diminue de manière dose-

dépendante à la fois la proportion de [3H]-AA-PA et la masse de PA dans les cellules activées

par la Con A (Figures 28a et 28b), ce qui est en accord avec les résultats présentés dans le

Chapitre I du présent travail, et avec ceux de la littérature (Aussel et al., 1992; El Bawab et

al., 1995). A la concentration intermédiaire de 10µM en R59022, l'effet de la Con A sur la

production de PA radioactif et sur la masse de PA est diminué de 30 et 60 % respectivement.

Simultanément, ce composé inhibe également de façon dose-dépendante la hausse des

activités PDE cytosoliques induite par la Con A (Figure 28c). En effet, l'activation de l'AMPc-

PDE cytosolique par la Con A est diminuée de 36, 42 et 80% par des concentrations en

R59022 de 5, 10 et 50µM, repectivement (Fig. 29). Enfin, l'inhibiteur de DAG-kinase

s'oppose de façon similaire à l'effet de la Con A sur les PDEs particulaires (résultats non

montrés).

VI- Effet du composé R59022 sur la prolifération des cellules mononucléées humaines

induite par la Con A.

Dans le but de corréler l'effet du composé R59022 sur la production de PA et les

activités PDE stimulées par la Con A à une réponse fonctionnelle, nous avons étudié l'effet de

ce composé sur la prolifération des cellules induite par la Con A.

D'une manière intéressante, le R59022 à la concentration de 10 µM est capable d'inhiber de

70% la prolifération des cellules mononucléées induite par la Con A, une inhibition totale

étant observée pour une concentration de R59022 de 50 µM (Figure 30).

Tous ces résultats sont en faveur de l'existence d'une corrélation positive entre les taux de PA

et la hausse d'activité PDE. De plus, lorsque la production de PA et les activités PDE sont

128

témoin+ R59022 50µM+ Con A+ Con A + R59022 5µM+ ConA + R59022 10µM+ ConA + R59022 50µM

0

10

20

PA

(ng

/mill

ion

de c

ellu

les)

b

*

*

*

0

1

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

a*

*

*

0

20

40

60

80

Act

ivité

PD

E (

pmol

/min

/mg

prot

) c

AMPc-PDE GMPc-PDE

*

*

**

*

*

Figure 28 : Effet de l'inhibiteur de DAG-kinase R59022 sur la synthèse de PA et l'activationdes PDEs induites par la Con A.

Les cellules mononucléées marquées (a et b) ou non (c) à l'acide arachidonique tritié (voirMéthodes) ont été préincubées pendant 10 min en absence (témoin, + ConA) ou en présencede 5, 10 ou 50 µM de R59022 (+R59022 50 µM, +Con A +R59022 5, 10 et 50 µM), puisstimulées ou non par la Con A (5µg/106 cellules) pendant 5 min. En a et b, les lipides ont étéextraits des cellules plus milieu à la fin de la période d'incubation, et ont été séparés sur CCM.En c, les cellules ont été culotées, lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activitésPDE ont été dosées dans les fractions cytosoliques des cellules témoins ou activées. Lesrésultats sont exprimés en pourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides (a) ou bienen ng de PA/106 cellules (b) ou en activité PDE spécifique (pmol/min/mg de protéines) (c) etreprésentent les moyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneursdifférents. * indique une différence significative par rapport au niveau stimulé par la Con A enabsence de R59022 (ANOVA, p<0,05).

129

0

20

40

60

80

100PA radioactifmasse de PAAMPc-PDEGMPc-PDE

[R59022] µM

Act

ivat

ion

rési

duel

le (

Effe

t de

la C

on A

en

abs

ence

de

R59

022

égal

à 1

00)

5 500 10

Figure 29 : Inhibition de l'effet stimulateur de la Con A en fonction de la concentration enR59022.Pour chaque concentration de R59022 utilisée, l'effet de la Con A sur la production de PAradiomarqué, la masse de PA et les activités AMPc et GMPc-PDE est comparé à l'effet de laCon A en absence de R59022 (égal à 100). Les valeurs sont issues de la Figure 28.

130

100806040200

Sans inhibiteur

+ 10 µM R59022

+ 50 µM R59022

Incorporation de [3H]thymidine (dpmx103)

+ ConA Témoin

Figure 30 : Inhibition de la réponse proliférative des cellules mononucléées à la Con A parl'inhibiteur de DAG-kinase R59022.

Les cellules mononucléées ont été cultivées dans du RPMI 1640 + 10% de SVF en absenceou en présence de 10 ou 50 µM de R59022 et en absence (témoin) ou en présence de 5 µg ConA/ml (+Con A). Après 48 heures, la thymidine tritiée est ajoutée et les cellules sont incubéespendant 18 heures avant d'être filtrées. La radioactivité des filtres est mesurée par scintillationliquide. Les résultats sont exprimés en dpm/puits et représentent les moyennes ± SE de 2expériences différentes réalisées avec 2 donneurs différents. Dans chaque expérience, chaquerésultat est la moyenne de six mesures.

131

diminuées dans les cellules mononucléées, la réponse proliférative des cellules est aussi

fortement diminuée. Cet argument est encore en faveur d'une activation des

phosphodiestérases par l'acide phosphatidique dans les cellules mononucléées, activation

conduisant à une diminution du taux intracellulaire d'AMPc, et autorisant une réponse

proliférative optimale. Dans le but de confirmer cette hypothèse, nous avons donc ensuite

étudié les variations des taux d'AMPc en présence de Con A ou d'OKT3.

VII- Variations des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées en fonction de la durée

de la stimulation par l'OKT3 ou la Con A.

Après une augmentation transitoire jusqu'à 15 min, le taux d'AMPc diminue

régulièrement jusqu'à plus de 60 min après la stimulation par la Con A (Figure 31). Dans les

cellules mononucléées au repos, le taux d'AMPc ne varie pas de manière significative au

cours de la période de temps considérée. Quand les cellules sont prétraitées avec 10µM de

R59022 pendant 10 min, puis stimulées par la Con A, l'augmentation initiale du taux d'AMPc

est beaucoup plus soutenue qu'en présence de Con A seule (5,5 vs 2,9 pmol/106 cellules à

15 min), et ne commence à décroître qu'à partir de 20 min de stimulation. De plus, les taux

d'AMPc mesurés dans les cellules prétraitées avec du R59022 sont significativement plus

élevés que ceux mesurés dans les cellules activées par la Con A seule, quel que soit le tempsde stimulation (sauf t0).

D'autre part, lorsque les cellules sont prétraitées avec 100 µM de Rolipram, un inhibiteur

puissant et sélectif des PDE4, pendant 30 min, puis stimulées par la Con A, la diminution du

taux d'AMPc commençant à 15 min n'est plus observée. Ce résultat suggère que la diminution

du taux d'AMPc induite par la Con A à partir de 15 min de stimulation pourrait être due à une

augmentation de son hydrolyse par les AMPc-phosphodiestérases.

Au contraire, dans les cellules mononucléées stimulées par l'OKT3, le taux d'AMPc

commence à diminuer dès le début de l'incubation sans période de latence (Figure 32). Cette

diminution est linéaire en fonction du temps au cours de la période considérée, atteint 20% au

bout de 20 min et 32% à 50 min. Des analyses de regression linéaires montrent une pente

significativement inférieure à zéro, p<0,01.

Ces résultats suggèrent donc que la hausse de PA qui fait suite à l'activation mitogénique des

cellules mononucléées par la Con A ou l'OKT3 pourrait être responsable de l'activation des

PDEs, et ainsi d'une diminution des taux d'AMPc.

132

604020000

2

4

6

8

10

+ ConA+ ConA + R59022+ ConA + Rol

Temps (min)

AM

Pc

(pm

ol/m

illio

n de

cel

lule

s)

** * * * * *

*

Figure 31 : Cinétique de variation des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées stimulées par laCon A seule (+ Con A) ou en présence (+ Con A + Rol) de 100 µM de Rolipram ou en présence (+Con A + R59022) de 10 µM de R59022.

Les cellules mononucléées ont été stimulées par la Con A en absence ou en présence de Rolipram(100 µM) ou de R59022 (10 µM) pendant les périodes de temps indiquées. A la fin de l'incubation, lescellules ont été placées pendant 2 min au bain-marie à 100°C, puis les taux d'AMPc ont été mesuréspar RIA comme décrit dans Méthodes. Les résultats sont exprimés en pmol/106 cellules etreprésentent la moyenne ± SE de 3 à 5 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents.* indique une différence significative par rapport au taux d'AMPc mesuré à 15 min. A chaque temps(sauf t0), le taux d'AMPc mesuré en présence de R59022 est significativement différent de celuimesuré en présence de Con A seule.

133

0,4

0,6

0,8

1

1,2

AM

Pc

(pm

ol/M

illio

n de

cel

lule

s)

0 10 20 30 40 50 60

Temps (min)

Témoin

+ OKT3

Figure 32 : Diminution des taux d'AMPc dans les cellules mononucléées stimulées parl'OKT3.

Les cellules mononucléées ont été stimulées par l'anticorps anti-CD3 (30ng/ml) pendant lespériodes de temps indiquées. A la fin de l'incubation, les cellules ont été placées pendant 2min au bain-marie à 100°C, puis les taux d'AMPc ont été mesurés par RIA comme décrit dansMéthodes. Les résultats sont exprimés en pmol/106 cellules et représentent la moyenne ± SEde 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Des analyses de regressionlinéaire des valeurs indiquent une pente significativement inférieure à zéro, P<0,01.

134

VIII- Etude pharmacologique des isoformes de PDE stimulées par les différents

agonistes dans les cellules mononucléées.

Les activités AMPc-PDE et GMPc-PDE, mesurées dans les différentes fractions

cellulaires sont la résultante des activités d'une ou plusieurs isoformes fonctionnant

simultanément. Cependant, l'existence d'inhibiteurs extremement puissants et sélectifs de l'une

ou l'autre famille de PDE permet d'envisager des approches pharmacologiques simples pour

répondre aux questions sur l'identité des isoformes de PDE concernées.

Dans le but d'étudier quelles isoformes d'AMPc-PDE sont stimulées par les trois agonistes,

l'activité AMPc-PDE de l'homogénat total de cellules témoins ou stimulées par les différents

agonistes a été testée en présence de concentrations croissantes (10-9 M à 10-4 M) de

l'inhibiteur sélectif de PDE4, Rolipram. Ce composé est connu pour inhiber les PDE4recombinantes avec des IC50 de l'ordre de 10-7 M, une inhibition totale étant toujours obtenue

à la concentration de 10-5 M. Dans l'homogénat des cellules témoins, le Rolipram à la

concentration de 10-5M inhibe l'activité AMPc-PDE de 35% (Tableau 7), ce qui indique que

la PDE4 représente une faible part de l'activité totale d'hydrolyse de l'AMPc dans ces cellules.

Ce résultat est en accord avec ceux décrits par Robicsek et al. (1991) pour les lymphocytes T

et par Erdogan et Houslay (1997) pour les cellules de Jurkat. Comme le montrent les résultats

présentés dans le Tableau 7, la Con A stimule de manière identique l'activité d'hydrolyse de

l'AMPc sensible au Rolipram et celle qui est insensible au Rolipram. Au contraire, l'OKT3

stimule préférentiellement la PDE4 sensible au Rolipram (36 vs 13%), alors que le TPA estplus actif sur l'activité PDE insensible au Rolipram. Cependant, la valeur d'IC50 pour le

Rolipram n'est pas modifiée de manière significative quel que soit le traitement (2,16 ± 0,28 x

10-7 M, n=4).

L'inhibiteur sélectif de PDE2, l'EHNA, n'inhibe que faiblement (15-20%) l'activité AMPc-

PDE des cellules mononucléées, en absence ou en présence de GMPc 10-5 M et quel que soit

l'agoniste utilisé (résultats non montrés). Ces résultats sont en bon accord avec ceux de la

littérature qui montrent que la PDE2 est pratiquement absente des lymphocytes humains ou

des cellules de Jurkat (Erdogan et Houslay, 1997) alors qu'elle est bien présente dans les

thymocytes (Valette et al., 1990; Marcoz et al., 1993 a et b; Michie et al., 1996).

Enfin, l'activité d'hydrolyse du GMPc des homogénats de cellules mononucléées est fortement

inhibée (70-80%) par l'inhibiteur sélectif de PDE5, le M&B 22948. En présence de 10-4 M de

M&B 22948, l'activation de la PDE5 induite par la Con A, l'OKT3 et le TPA est totalement

abolie (résultats non montrés). Ces résultats montrent que la PDE5 assure la quasi totalité de

l'hydrolyse du GMPc dans les cellules mononucléées et qu'elle est la cible principale des trois

agonistes.

135

Tableau 7 : Identification pharmacologique des activités AMPc-PDE stimulées par la Con A,l'OKT3 et le TPA dans les cellules mononucléées humaines.

Traitementcellulaire

Activité AMPc-PDEtotale

(pmol/min/mg prot)

Activité AMPc-PDEinhibée par 10-5M de

rolipram

(pmol/min/mg prot)

Activité AMPc-PDEinsensible à 10-5M de

rolipram

(pmol/min/mg prot)témoin 29,76 ± 1,26 10,32 ± 0,77 19,43 ± 0,57

+ ConA 35,89 ± 1,97(+ 20,6%)

12,68 ± 0,80(+22,9%)

23,22 ± 2,74(+19,5%)

+ OKT3 35,99 ± 1,18(+ 20,9%)

14,04 ± 0,43(+36,0%)

21,94 ± 1,49(+12,9%)

+ TPA 36,98 ± 2,30(+24,3%)

12,72 ± 0,78(+23,2%)

25,29 ± 2,77(+30,2%)

Les cellules mononucléées ont été incubées pendant 5 min en absence (témoin) ou enprésence de Con A (5 µg/106 cellules), ou de l'anticorps anti-CD3 (30 ng/ml), ou incubéespendant 15 min en présence de 100 nM de TPA. A la fin de la période d'incubation, lescellules ont été culotées, lavées et lysées comme décrit dans Méthodes. Les activités PDE ontété mesurées sur l'homogénat total en utilisant 0,25 µM d'AMPc comme substrat en absenceou en présence de 10-5 M de rolipram. Les résultats sont exprimés en pmol d'AMPchyrdolysées/min/mg de protéines, et représentent les moyennes ± SE de 2 expériencesréalisées en triple. Les valeurs entre parenthèses indiquent le pourcentage d'activation induitpar chaque agoniste.

136

VIII- Discussion.

Dans cette étude, nous avons montré qu'il existe une corrélation étroite entre les taux

de PA et les activités PDE dans les cellules mononucléées humaines. En effet, les trois

agonistes utilisés pour augmenter la production d'arachidonoyl-PA et de PA en masse sont

aussi capables de stimuler les activités AMPc et GMPc-PDE mesurées dans les mêmes

préparations cellulaires. A la fois le PA formé par activation directe de la voie PLD dans les

cellules stimulées par la TPA, et le PA provenant de la voie PI-PLC/DAG-kinase dans les

cellules stimulées par la Con A ou l'anticorps anti-CD3 peuvent être associés à une

augmentation des activités PDE. De plus, les drogues capables de diminuer la synthèse de PA,

telles que l'inhibiteur de DAG-kinase (R59022) dans les cellules stimulées par la Con A ou

l'éthanol dans les cellules stimulées par le TPA suppriment l'activation des PDE dans ces

cellules.

Une activation des PDE est très probablement responsable de la diminution des taux d'AMPc

dans le temps, observée dans les cellules stimulées par la Con A ou l'OKT3. Dans les cellules

activées par la Con A, la hausse transitoire du taux d'AMPc qui atteint son maximum après

15 min est probablement sans relation avec les propriétés mitogéniques de la lectine, comme

cela a été décrit par Kammer (1988), et résulte sûrement d'une augmentation de la synthèse de

l'AMPc induite par des liaisons non spécifiques à des glycoprotéines de surface. Après cette

période de 15 min, le taux d'AMPc diminue régulièrement et atteint une différence

significative à partir de 30 min. Cette durée correspond à l'activation maximale de l'AMPc-

PDE par la Con A observée dans des expériences de cinétique (Meskini et al., 1992). Dautre

part, aucune diminution du taux d'AMPc n'a pu être observée quand les cellules mononucléées

ont été stimulées par la Con A en présence de l'inhibiteur spécifique de PDE4, Rolipram, ce

qui renforce l'hypothèse que l'activation de l'AMPc-PDE joue un rôle crucial dans le maintien

du faible taux d'AMPc nécessaire à la réponse proliférative.

Un autre argument en faveur de cette hypothèse a été obtenu dans les expériences effectuées

en présence de l'inhibiteur de DAG-kinase, R59022. Cet inhibiteur, qui diminue de manière

dose-dépendante la synthèse de PA induite par la Con A, ainsi que l'activation des PDE

(Figures 28 et 29), et qui supprime entièrement la réponse proliférative des cellules

mononucléées à la Con A (Figure 30) est capable d'augmenter le taux intracellulaire d'AMPc.

Contrairement à la Con A, l'anticorps monoclonal anti-CD3 n'induit pas de hausse d'AMPc

intracellulaire, même de manière transitoire, ce qui est en accord avec les observations du

groupe de Kammer (Kammer et al., 1988). Dans les cellules stimulées par l'OKT3, le taux

d'AMPc diminue progressivement au cours du temps en dessous du niveau basal tout au long

de la période considérée. Ces résultats sont en accord avec l'hypothèse que même une

diminution modeste de l'activité AMPc-PDE est suffisante pour assurer une baisse

significative du taux d'AMPc intracellulaire.

137

Même si l'observation d'une augmentation concomitante des taux de PA et des activités PDE

dans les cellules mononucléées n'est pas en soi une preuve suffisante d'une relation de cause à

effet entre ces deux événements, plusieurs arguments étayent l'hypothèse d'un effet direct de

la hausse de PA intracellulaire sur les activités PDE dans les cellules stimulées par la Con A,

l'OKT3 ou le TPA : (1) la hausse de PA et l'activation des PDE se produisent avec des

cinétiques similaires. Dans le Chapitre I, nous avons montré que la synthèse de PA induite par

la Con A est maximale à 5 min, alors que l'activation des PDE se maintient jusqu'à 30 min

avant de décliner (Meskini et al., 1992), (2) des corrélations significatives ont pu être établies

entre d'une part la quantité de PA marqué, qui représente surtout des espèces de PA contenant

de l'acide arachidonique, et l'activité AMPc-PDE cytosolique, et d'autre part entre la masse de

PA et les activités AMPc et GMPc-PDE de la fraction particulaire, (3) quelle que soit la voie

de formation du PA, les drogues capables de bloquer l'augmentation du taux de PA dans les

cellules stimulées sont également capables de prévenir l'activation des PDE.

L'ensemble de ces résultats suggère fortement que le PA est impliqué, directement ou

indirectement, dans la régulation des activités PDE, et que cette régulation des activités PDE

par le PA doit avoir une importance physiologique au cours de l'activation lymphocytaire.

Plusieurs mécanismes peuvent être considérés pour expliquer l'effet stimulateur du PA

sur les activités PDE. Il est connu que l'activité PDE4 spécifique de l'AMPc est assez

abondante dans les cellules mononucléées humaines (Essayan et al., 1994), les lymphocytes T

(Robicsek et al., 1991; Tenor et al., 1995), et dans les cellules de Jurkat (Erdogan et Houslay,

1997). Récemment, Némoz et al. (1996) ont montré la présence de protéines correpondants

aux PDE4D1, PDE4D2 et PDE4A5 par "western-blotting" dans des extraits de PBMC

humaines. D'autre part, il a été montré, en système acellulaire, que le PA pouvait stimuler par

interaction directe la PDE4A5, qui correspond à un variant long exprimé à partir du gène

PDE4A (Némoz et al., 1997). Ainsi, une interaction directe du PA synthétisé en réponse à

l'activation cellulaire, avec l'isorforme de PDE4 sensible au PA pourrait contribuer à

l'augmentation de l'hydrolyse de l'AMPc observée dans les cellules stimulées. De plus, étant

donné que l'activation de la PDE par le PA in vitro est instantanée, notre hypothèse est

compatible avec les cinétiques observées pour les augmentations du taux de PA et d'activité

PDE dans les cellules mononucléées stimulées. Cependant, les expériences que nous avons

effectuées en présence de Rolipram indiquent que la PDE4 n'est pas la seule activité

d'hydrolyse de l'AMPc à être augmentée au cours de l'activation cellulaire. D'autre part,

l'activité GMPc-PDE des cellules activées est également augmentée. Enfin, étant donné que le

PA n'a pas d'effet direct in vitro sur les enzymes appartenant aux autres familles de PDE

(Marcoz et al., 1993; Savany et al., 1996), il paraît assez clair que les activations des PDE

induites par le TPA, la Con A ou l'OKT3 doivent probablement impliquer d'autres

mécanismes, reliés ou non à l'augmentation du taux de PA.

Dans les cellules traitées par la Con A, l'augmentation transitoire du taux d'AMPc qui précède

138

la diminution pourrait être suffisante pour activer une protéine kinase dépendante de l'AMPc

(PKA). Cette enzyme phosphoryle et active les enzymes de la famille des PDE3, ainsi que

certaines isoformes de la famille des PDE4 (Conti et al., 1995). Cependant, l'inhibition

importante par le R59022 de l'activation des PDE par la Con A suggère qu'un tel mécanisme

dépendant de l'AMPc ne peut que contribuer faiblement à l'effet total de la Con A.

Contrairement aux résultats obtenus dans les cellules traitées à la Con A, aucune

augmentation du taux d'AMPc n'a pu être détectée dans les cellules mononucléées traitées à

l'OKT3. Par conséquent, dans les cellules stimulées par l'OKT3, un mécanisme de

phosphorylation dépendant de l'AMPc peut raisonnablement être exclu. D'une manière

intéressante, Michie et al. (1996) ont décrit récemment une augmentation soutenue de

l'activité PDE4 dans des thymocytes de souris stimulés pendant plus de 20 min avec à la fois

un anticorps anti-CD3 et un anticorps anti-TCR. Bien que ces auteurs n'aient pas déterminé

les mécanismes impliqués dans ce phénomène, il est assez tentant de penser que les deux

anticorps ont pu augmenter la production d'acide phosphatidique dans ces cellules.

Il a déjà été décrit que le traitement de cellules intactes ou de tissus par l'ester de phorbol TPA

stimule l'activité PDE. Par exemple, l'addition de 10 µM de TPA à des fractions cytosoliques

préparées à partir de coeurs hypertrophiés de hamster syriens stimule l'activité d'hydrolyse de

l'AMPc dans ces préparations (Lee et al., 1994). D'autres études du même groupe ont montré

que cette stimulation ne concerne que l'enzyme qui dépend du complexe

calcium/calmoduline, la PDE1 (Yu et al., 1996) et implique un mécanisme dépendant de la

PKC (Cai et Lee, 1996). Le traitement de cellules CHO avec le TPA conduit également à une

augmentation transitoire de l'activité PDE1, qui atteint un maximum au bout de 13 heures

avant de diminuer (Spence et al., 1995). D'autre part, dans des cellules transfectée avec la

PKCα, l'activation de la PDE1 est maximale après 1 heure de stimulation par le TPA et est

atténuée par l'actinomycine D, ce qui suggère l'existence d'une régulation dépendante de la

PKC au niveau transcriptionnel. Dans les cellules mononucléées humaines non transformées,

les enzymes de la famille des PDE1 ne sont pas exprimées de manière constitutive, mais

seulement induites par des traitements de longue durée par des mitogènes (Jiang et al., 1996).

En bon accord avec ces données, nous n'avons détecté aucune activité PDE1 quel que soit

l'agoniste utilisé pour stimuler les PBMC au cours de la période de temps étudié (5-15 min).

La plupart des travaux relatifs à l'effet du TPA sur les activités PDE décrivent une activation

des PDE1 par un mécanisme PKC dépendant. Cependant, le TPA est aussi décrit comme un

stimulateur de l'activité PDE4 sensible au Rolipram dans les tubules renaux de rat (Tetsuka et

al., 1995). La question reste posée de savoir si dans les cellules mononucléées humaines

l'activation par le TPA des activités AMPc et GMPc-PDE nécessite l'activation des PKC. Il

est connu que l'isoforme PKCζ ne répond pas au DAG et au esters de phorbol, mais peut être

fortement stimulée par le PA (Limotola et al., 1994). De plus, cette isoforme semble

ubiquitaire (Nishizuka, 1995). Ainsi, le TPA pourrait stimuler les PDE par une activation de

la PKCζ induite par le PA. Quels que soient les mécanismes impliqués, les résultats de notre

139

étude montrent clairement qu'une hausse du taux de PA intracellulaire est nécessaire à

l'activation des PDEs par le TPA puisque cette activation est complètement supprimée en

présence d'éthanol.

L'ensemble de ces résultats montre que l'augmentation de la synthèse de PA dans les cellules

mononucléées s'accompagne d'une activation importante des enzymes hydrolysant l'AMPc et

le GMPc. Bien qu'un effet activateur direct du PA par des interactions lipide-protéine n'ait pu

être démontré que dans le cas de la PDE4, il est clair que dans les cellules mononucléées

humaines, le PA stimule également la PDE3 et la PDE5. Le PA est produit de manière très

précoce au cours de l'activation des lymphocytes, et a des effets mitogéniques propres. Même

si la signification physiologique de la régulation des activités PDE par le PA n'est pas encore

bien comprise, elle semble faire partie d'un mécanisme permettant de maintenir le taux de

nucléotides cycliques en dessous d'un seuil nécessaire à une réponse lymphoproliférative

optimale.

140

CHAPITRE III

Modulation de la production d'acide phosphatidique parl'acide 12(S)-hydroxyeicosatétraénoïque (12(S)-HETE).

Le dernier chapitre de ce travail a consisté à étudier la relation PA-PDE dans un

modèle expérimental mimant une situation physiologique particulière, le vieillissement. Des

travaux antérieurs de notre équipe ont montré que l'activation des PDEs et la prolifération

induites par la Con A dans les cellules mononucléées humaines étaient diminuées avec l'âge.

D'autre part, il est connu qu'un dérivé monohydroxylé issu de l'acide arachidonique par la voie

lipoxygénasique, le 12(S)-HETE, est produit en quantité plus importante dans les cellules

mononucléées de personnes âgées par rapport à celles de témoins jeunes. Par ailleurs, ce

composé inhibe l'activation des PDEs par la Con A et la réponse lymphoproliférative lorsqu'il

est apporté de façon exogène à des cellules de témoins jeunes. De plus, ce composé est décrit

comme un inhibiteur de DAG-kinase dans les cellules endothéliales (Friedlander et al., 1990;

Setty et al., 1987). Tous ces résultats suggèrent que chez les personnes âgées, le maintien d'un

taux basal élevé de 12(S)-HETE pourrait conduire à une diminution du taux de PA synthétisé.

Nous nous sommes donc proposés de déterminer si cette accumulation de 12(S)-HETE dans

les cellules mononucléées pouvait être responsable d'une diminution de la production de PA

par inhibition d'une DAG-kinase ou pouvait conduire à la production d'espèces moléculaires

particulières de PA (contenant du 12(S)-HETE, par exemple) incapables de transmettre

correctement le signal mitogénique.

Des travaux réalisés dans notre équipe ont montré que les cellules mononucléées

humaines peuvent incorporer de façon dose-dépendante du 12(S)-HETE radiomarqué dans

leurs phospholipides, majoritairement dans les phosphatidylcholines (80% de la radioactivité

liée aux lipides totaux). La capture du 12(S)-HETE est rapide, maximale dès la 30ème minute

d'incubation, et la radioactivité liée aux PL reste stable lorsque l'incubation est prolongée

141

jusqu'à 18 heures. D'autre part, la quantité de 12(S)-HETE estérifiée dans les PL peut être

augmentée en incubant les cellules avec plusieurs charges successives de 12(S)-HETE.

Joulain et al. (1995) ont ainsi montré que l'apport de [3H]-12(S)-HETE en trois charges

successives de 1 µM pendant 30 min, permet de multiplier la radioactivité liée aux PL totaux

par 6 et celle liée aux PC par 11, par comparaison aux résultats obtenus après une seule charge

de 1 µM pendant 1 heure. Nous avons donc utilisé ce procédé mis au point dans l'équipe pour

obtenir un enrichissement important des PL en 12(S)-HETE, les cellules témoins subissant le

même cycle d'incubation à 37°C en présence du véhicule.

I- Effet du 12(S)-HETE sur la production de DAG et de PA par les cellules

mononucléées humaines stimulées ou non par la Con A.

Tableau 8 : Effet du 12(S)-HETE sur la production de [3H]-DAG par les cellulesmononucléées humaines stimulées ou on par la Con A.

Production basale de [3H]-

DAG

Production de [3H]-DAG

induite par la Con A

% de la radioactivité liée aux lipides totaux

Cellules non traitées 0,634 ± 0,078 0,600 ± 0,057

Cellules enrichies en

12(S)-HETE

0,614 ± 0,070 0,400 ± 0,043 *

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12-HETE, puisont été marquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes) et incubées en absence ou enprésence de Con A (5 µg/106 cellules ) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés enpourcentage de la radioactivité liée aux lipides totaux et représentent la moyenne ± SEM de 7expériences différentes réalisées avec 7 donneurs différents. Les valeurs ont été comparées partest de t de Student apparié. * indique une différence significative par rapport au témoin nonstimulé par la Con A (p=0,024).

142

Ces résultats sont en désaccord avec l'hypothèse de l'inhibition d'une DAG-kinase par le12(S)-HETE, et montrent au contraire une diminution de la proportion relative de [3H]-DAGdans les cellules mononucléées stimulées par la Con A. Nous avons donc étudié en parallèlel'effet de l'enrichissement en 12(S)-HETE des cellules mononucléées humaines sur laproduction de PA induite ou non par la Con A.

Quand les cellules mononucléées humaines sont enrichies en 12(S)-HETE inerte, puis

marquées par de l'acide arachidonique à dose traceuse, la proportion de PA-[3H]-AA n'est pas

significativement modifiée par rapport aux cellules témoins en absence de Con A. La

radioactivité liée au PA représente 0,61% de la radioactivité liée aux PL totaux dans les

cellules témoins et 0,60% dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE.

En présence de Con A, la production de PA-[3H]-AA est significativement augmentée aussi

bien dans les cellules contrôles que dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE (Figure 33a).

L'effet stimulateur de la Con A sur la production de PA-[3H]-AA observé dans les cellules

traitées par le 12(S)-HETE (+252%) n'est pas significativement différent de celui noté dans

les cellules témoins (+300%).

Par contre, le 12(S)-HETE potentialise la synthèse de PA en masse induite par la Con A de

manière significative (P<0,01) (Figure 33b). En effet, dans les cellules témoins, la Con A

provoque une hausse de la quantité de PA de 258% (basal : 10,4 ± 1,5 vs stimulé : 37,3 ±5,0

ng/106 cellules), alors que dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE l'augmentation due à la

Con A est de 287% (basal : 17,2 ± 3,4 vs stimulé : 66,6 ± 8,8 ng/106 cellules).

La synthèse de PA induite par la Con A est donc significativement plus élevée dans les

cellules enrichies en 12(S)-HETE que dans les cellules témoins (66,6 vs 37,3 ng/106 cellules,

P<0,01).

Ces résultats, en accord avec ceux obtenus dans les expériences étudiant les variations de [3H]-DAG,

confirment que dans ce modèle cellulaire le 12(S)-HETE n'inhibe pas l'activité DAG-kinase. La

hausse du taux de PA observée après stimulation par la Con A des cellules prétraitées au 12(S)-HETE

est en désaccord avec l'hypothèse d'une diminution de la production de PA impliquée dans l'effet

antimitogénique du 12(S)-HETE. Nous avons alors essayé de déterminer si l'enrichissement des

phospholipides cellulaires en 12(S)-HETE pouvait être responsable d'une production d'espèces

moléculaires de PA modifiées, contenant par exemple du 12(S)-HETE.

II- Mise en évidence d'une production de PA-[3H]-12(S)-HETE par les cellules

mononucléées marquées au [3H]-12(S)-HETE, en présence ou non de Con A.

Après enrichissement des cellules mononucléées humaines en [3H]-12(S)-HETE, une

quantité appréciable de radioactivité se trouve associée au PA (2,66% de la radioactivité liée

aux PL totaux) alors que seulement 0,46% de la radioactivité est liée au PA dans les cellules

143

- ConA

+ ConA

*

*

0

1

2

3

PA

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

+252%

+300%

a

Témoin + 12(S)-HETE 3x1µM

*

0

20

40

60

80

PA

form

é (n

g/m

illio

n de

cel

lule

s)

*

+258%

+287%

†

b

Témoin + 12(S)-HETE 3x1µMFigure 33 : Effet du 12(S)-HETE sur la production d'acide phosphatidique induite par la Con A dansles cellules mononucléées humaines.

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE, puismarquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes) et incubées en absence ou en présence deCon A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage de laradioactivité liée aux phospholipides (a) ou en ng de PA formé/106 cellules (b), et représentent lamoyenne ± SEM de n expériences différentes réalisées avec n donneurs différents (n=14 pour lescellules témoins et 8 pour les cellules traitées). Les valeurs ont été comparées par analyse de variance(ANOVA STATVIEW II) et par le test de t protégé (Fisher).* indique une différence significative par rapport au groupe non stimulé (P<0,01); † indique unedifférence significative par rapport au groupe stimulé par la Con A et non traité par le 12(S)-HETE(P<0,01).

144

0,0

0,1

0,2

0,3

[3H

]12(

S)-

HE

TE

-PA

(pm

ol/m

illio

n de

cel

lule

s)

a

Basal + Con A

Basal + Con A0

20

40

60

80

100

120

140

PA

tota

l (pm

ol/m

illio

n de

cel

lule

s) b

Figure 34 : Formation de [3H]-12(S)-HETE-PA dans les cellules mononucléées marquéesavec du [3H]-12(S)-HETE et stimulées par la Con A.

Les cellules mononucléées ont été marquées par 3 charges successives (30 min) de [3H]-12(S)-HETE 1 µM. Après lavages, les cellules ont été incubées pendant 5 min en absence(basal) ou en présence de Con A (5 µg/106 cellules) (+ Con A). Les résultats sont exprimés enpmol de [3H]-12(S)-HETE-PA synthétisé/106 cellules (a) ou en pmol de PA total/106 cellules(b) et représentent la moyenne ± SEM de 5 expériences différentes réalisées avec 5 donneursdifférents. Les moyennes ont été comparées par test de t de Student apparié.En (a), P=0,025; en (b), P=0,014.

145

marquées à l'acide arachidonique tritié (Figure 34). Lorsque les cellules mononucléées sont

marquées avec du [3H]-12(S)-HETE, plus de 80% de la radioactivité associée aux

phospholipides est retrouvée sous forme de 12(S)-HETE non modifié (Joulain et al., 1995).

Par conséquent, la radioactivité associée au PA dans nos expériences correspond

probablement à du [3H]-12(S)-HETE non transformé. Etant donnée la radioactivité spécifique

du [3H]-12(S)-HETE, la quantité de PA marqué est évaluée à 0,09 ± 0,03 pmoles/106 cellules

alors que la masse totale de PA représente 22,7 ± 3,0 pmoles/106 cellules. Ainsi, dans les

cellules au repos, le PA contenant du 12(S)-HETE représente environ 0,4% du PA total

(Figure 34). Sous stimulation par la Con A, le PA marqué au [3H]-12(S)-HETE est faiblement

mais significativement augmenté (+54%, P=0,025), alors que la masse totale de PA augmente

de 300% (P=0,014), ce qui fait que le PA contenant du 12(S)-HETE correspond à 0,15% du

PA total. Dans les cellules stimulées par la Con A, la hausse du taux de PA marqué est

accompagnée d'une diminution significative de la radioactivité associée à la fraction PI/PS

(13,6 ± 1,8% dans les cellules contrôles vs 10,7 ± 1,1% dans les cellules activées par la Con

A, P=0,028), alors que celle associée aux PC ne varie pas de manière importante (69,1 ± 3,5%

dans les cellules témoins vs 69,9 ± 3,6% dans les cellules activées par la Con A). Ces résultats

indiquent que les espèces moléculaires de PA contenant du 12(S)-HETE proviennent surtout

du pool des PI sous stimulation par la Con A, et que dans le même temps, la masse de PA

issue d'un pool phospholipidique peu marqué est fortement augmentée. Ces résultats

conduisent à plusieurs conclusions.

Tout d'abord, la proportion relative d'espèces moléculaires de PA contenant du 12(S)-HETE

est plus faible dans les cellules stimulées par la Con A que dans les cellules non stimulées. Ce

résultat indique qu'il n'y a pas d'enrichissement du PA en espèces moléculaires contenant du

12(S)-HETE lors de l'activation par la Con A. Cependant, la composition en espèces

moléculaires du PA synthétisé après enrichissement en 12(S)-HETE et stimulation par la Con

A peut quand même être modifiée par rapport à celle du PA produit sous stimulation par la

Con A dans les cellules non enrichies.

Pour répondre à cette question, nous avons analysé par chromatographie en phase gazeuse la

composition en acides gras des PA isolés à partir de cellules non enrichies en 12(S)-HETE

stimulées ou non par la Con A, et à partir de cellules enrichies en 12(S)-HETE et stimulées.

III- Composition en acides gras du PA produit par les cellules mononucléées enrichies

ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A.

Comme notre équipe l'a déjà observé dans les thymocytes de rat (El Bawab et al.,

1995), les acides gras saturés représentent plus de 50% des acides gras totaux du PA présent

dans les cellules non stimulées (Tableau 9).

146

Tableau 9 : Composition en acides gras du PA dans les cellules témoins et dans les cellulesstimulées par la Con A enrichies ou non en 12-HETE.

Quantité dans

Acide grasCellules témoins Cellules non

enrichies en 12(S)-

HETE stimulées par

la Con A

Cellules enrichies en

12(S)-HETE

stimulées par la

Con A

mol/100mol

16:0 29,7 ± 2,0 22,1 ± 1,9 a 27,1± 1,4

18:0 28,9 ± 2,4 35,1 ± 2,5 40,9 ± 3,0 a

18:1(9) 20,9 ± 2,4 17,1 ± 1,6 18,0 ± 3,8

18:2(9,12) 9,4 ± 2,0 9,6 ± 1,8 5,5 ± 0,2

20:4(5,8,11,14) 11,2 ± 1,9 16,2 ± 2,2 8,4 ± 1,5 b

•n-6 20,6 ± 3,5 25,8 ± 3,5 13,9 ± 1,5 b

• sat 58,6 ± 3,8 57,1 ± 3,6 68,0 ± 3,1 c

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12-HETE(1 µM), puis marquées avec de l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes). Après lavages, lescellules ont été incubées en absence ou en présence de Con A (5 µg/106 cellules). Les résultatscorrespondent aux moyennes ± SEM obtenues dans 7 expériences différentes réalisées avec 7donneurs différents. Les valeurs ont été comparées par le test de t de Student apparié.

a Différent par rapport à la valeur obtenue dans les cellules témoins, P•0,02.b Différent par rapport à la valeur obtenue dans les cellules non enrichies en 12-

HETE stimulées par la Con A, P•0,02.c Différent par rapport à la valeur obtenue dans les cellules non enrichies en 12-

HETE stimulées par la Con A, P=0,05.

147

Dans les cellules non-enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A, la quantité relative

d'acide palmitique est diminuée significativement (-26%, P•0,02) alors que les proportions

d'acides stéarique et arachidonique tendent à augmenter (+20 et +44%, respectivement). Dans

les cellules enrichies en 12(S)-HETE, on n'observe pas du tout les mêmes variations de la

composition en acides gras sous stimulation par la Con A. En particulier, la proportion d'acide

palmitique n'est pas diminuée du tout par la Con A, alors qu'une hausse significative de la

proportion d'acide stéarique est observée (+42%, P•0,02). De plus, la quantité relative d'acide

arachidonique n'est plus augmentée par la Con A dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE,

et semble même diminuée. Ainsi, la composition en acides gras du PA synthétisé sous

stimulation par la Con A diffère énormément selon que les cellules ont été enrichies ou non en

12(S)-HETE. Dans les cellules stimulées par la Con A et enrichies en 12(S)-HETE, le PA

contient moins d'acide arachidonique (-48%, P•0,02) et d'acides gras polyinsaturés de la série

n-6 (-45%, P•0,02) que les cellules non enrichies, et plus d'acides gras saturés (+19%,

P•0,05). Ce résultat confirme l'hypothèse de l'activation par le 12(S)-HETE d'une voie de

production du PA autre que celle stimulée par la Con A seule. Nous avons donc étudié la

possibilité de l'implication d'une voie PLD dans ce phénomène.

IV- Implication d'une voie Phospholipase D dans la production de PA induite par le

12(S)-HETE.

Dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE, la hausse de la masse de PA induite par la Con A

est significativement plus importante que dans les cellules non traitées. Ce résultat suggère que le

12(S)-HETE pourrait induire un voie de formation du PA supplémentaire, qui ne serait pas activée

par la Con A seule. Pour tester l'hypothèse de l'activation d'une PLD, la production de PA induite par

la Con A a été évaluée en présence de 1% d'éthanol, dans les cellules enrichies ou non en 12(S)-

HETE, et comparée à celle induite par l'ester de phorbol TPA. Les résultats présentés dans la Figure

35 (a et b), en accord avec ceux du Chapitre I, montrent que, dans les cellules non-enrichies en 12(S)-

HETE, la synthèse de PA induite par la Con A n'est pas altérée par la présence d'éthanol, qu'elle soit

évaluée en % de la radioactivité liée aux phospholipides totaux ou en masse. Au contraire, dans les

cellules enrichies en 12(S)-HETE, la hausse de PA en masse induite par la Con A est

significativement diminuée (-63%) en présence d'éthanol (Figure 35b). Parallèlement, la proportion

de PA marqué à l'acide arachidonique tritié est peu diminuée (-36%, non significatif). Des résultats

similaires sont obtenus quand les cellules sont stimulées avec 100nM de TPA.

Puisque la diminution du taux de PA qui se produit au cours de la réaction de transphosphatidylation

est accompagnée d'une synthèse de phosphatidylalcool, des expériences ont été effectuées dans le but

d'évaluer la production de phosphatidylalcool marqué à l'acide arachidonique tritié à la fois dans les

cellules témoins et les cellules enrichies en 12(S)-HETE

148

+ EtOH

- EtOH

3210PA (% de la radioactivité liée aux PL totaux)

- 30%

- 36%

- 36% aTémoin

Con A

12(S)-HETE

12(S)-HETE + Con A

TPA

140120100806040200

PA formé (ng/million de cellules)

- 52%

- 63%

b

*

*

Témoin

Con A

12(S)-HETE

12(S)-HETE + Con A

TPA

Figure 35 : Effet de l'éthanol sur la production d'acide phosphatidique basale ou induite par unagoniste dans les cellules mononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE.

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE, puismarquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes). Les cellules traitées ou non par le 12(S)-HETE ont été incubées 10 min en absence ou en présence de 1% d'éthanol, puis stimulées ou non parla Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min. Dans les expériences utilisant le TPA, les cellules ont étéstimulées par le TPA (100nM) pendant 15 min en absence ou en présence d'éthanol 1%. Pour tous leséchantillons, la durée totale d'incubation est de 15 min. Les résultats sont exprimés en pourcentage dela radioactivité liée aux phospholipides (a) ou en ng de PA formé /106 cellules (b) et représentent lesmoyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3 donneurs différents. Les valeurs ontété comparées par analyse de variance (ANOVA STATVIEW II) et par le test de t protégé (Fisher).* indique une différence significative par rapport à la valeur de l'essai sans éthanol, P<0,01.

149

0

1000

2000

3000

4000

- EtOH

+ EtOH

Pho

spha

tidyl

étha

nol (

dpm

/ess

ai) *

Con A 12(S)-HETE +Con A

a

0

1000

2000- BuOH

+ 1-BuOH

+ 2-BuOH

*

12(S)-HETE+Con A

Pho

spha

tidyl

buta

nol (

dpm

/ess

ai)

b

Figure 36 : Effets d'alcools primaires et secondaire sur la production de phosphatidylalcoolsmarqués à l'acide arachidonique tritié induite par la Con A dans des cellules mononuclééeshumaines enrichies en 12(S)-HETE.

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE,puis marquées à l'acide arachidonique tritié (voir Méthodes). Les cellules enrichies en12(S)-HETE ont été incubées pendant 10 min en absence ou en présence de 1% d'éthanol (a),de 1% de butanol-1 ou de 1% de butanol-2 (b). Les cellules non enrichies ont été traitées de lamême manière, en absence ou en présence de 1% d'éthanol (a). Les cellules ont ensuité étéstimulées par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés endpm/essai et représentent les moyennes ± SEM de 4 expériences différentes réalisées avec 4donneurs différents. Les valeurs ont été comparées par analyse de variance (ANOVASTATVIEW II) et test-F de Scheffe.* indique une valeur différente par rapport à celle mesurée sans alcool, P<0,01.

150

prémarquées au [3H]-AA. En présence d'alcools primaires, éthanol et butanol-1, une hausse

significative de 2,5-3 fois de la synthèse de phosphatidylalcool est observée dans les cellules

enrichies en 12(S)-HETE alors que le butanol-2 est inefficace. Au contraire, comme nous l'avions

déjà montré dans le chapitre I, il n'y a pas de production de phosphatidyléthanol dans les cellules non

enrichie en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A en présence d'éthanol (Figure 36).

Collectivement, ces résultats suggèrent que la Con A est capable de stimuler une activité PLD dans

les cellules enrichies en 12(S)-HETE, mais pas dans les cellules témoins non traitées.

Les données de la littérature indiquent que la PLD peut être activée par des PKC ou par des protéines

tyrosine-kinases. Nous avons donc étudié l'effet de différents inhibiteurs (inhibiteur de PKC,

inhibiteur de tyrosine-kinase) sur l'activation de la PLD par la Con A en présence de 12(S)-HETE,

dans le but d'identifier un peu plus clairement les mécanismes impliqués.

V- Effet de différents inhibiteurs sur la production de phosphatidylbutanol par les

cellules mononucléées enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A en

présence de butanol-1.

V-I Effet de la Calphostine C.

La Calphostine C est un composé décrit comme un inhibiteur très sélectif d'activité PKC.

L'inhibition se produit par une interaction avec le domaine régulateur, et dépend de la lumière. Il est

connu que la PLD peut être activée par l'intermédiaire de PKC. Nous avons donc étudié l'effet de cet

inhibiteur sur l'activité PLD induite par la Con A en présence de 12(S)-HETE dans les cellules


Les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE ont été prétraitées pendant 30 min en absence ou

en présence de Calphosptine C (126 nM) puis stimulées par la Con A en présence de butanol-1 à 1%.

Les résultats présentés dans la Figure 37 montrent que la Calphostine C n'a pas d'effet sur la

production de phosphatidylbutanol induite par la Con A dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE.

Ce résultat suggère que le mécanisme par lequel le 12(S)-HETE stimule la PLD en présence de Con

A n'est pas PKC-dépendant.

V-II Effet de la Génistéine.

Dans la première partie de ce travail, nous avons montré que la génistéine est capable de

diminuer la synthèse de PA induite par la Con A seule, ce qui indiquait l'implication de tyrosine-

kinases en amont de la cascade PLCγ/DAG-Kinase. Lorsque les phospholipides cellulaires sont

enrichis en 12(S)-HETE, la Con A active aussi en parallèle une PLD. Certaines activités PLD étant

régulées par des activités tyrosine-kinases, il nous a semblé intéressant

151

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

- calphostine

+ calphostine

P

hosp

hatid

ylbu

tano

l (

% d

e la

rad

ioac

tivité

liée

aux

pho

spho

lipid

es)

Con A Con A + 12(S)-HETE

Figure 37 : Effet de la Calphostine C sur la production de phosphatidylbutanol dans lescellules mononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A .

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE,puis marquées à l'acide arachidonique tritié pendant 1 heure à 37°C. Après lavages, lescellules témoins et les cellules enrichies en 12(S)-HETE ont été incubées pendant 30 min à37°C en absence ou en présence de 126 nM de calphostine C, puis stimulées par la Con A (5µg/106 cellules) pendant 5 min en présence de butanol-1 à 1%. Les résultats sont exprimés enpourcentage de la radioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expériencereprésentative.

152

- génistéine

+ génistéine

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

Pho

spha

tidyl

buta

nol

(%

de

la r

adio

activ

ité li

ée a

ux P

L to

taux

)

Con A Con A + 12(S)-HETE

Figure 38 : Effet de la Génistéine sur la production de phosphatidylbutanol dans les cellulesmononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A.

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12-HETE, puismrquées à l'acide arachidonique pendant 1 heure à 37°C. Après lavages, les cellules témoinset les cellules enrichies en 12(S)-HETE ont été incubées pendant 15 min à 37°C en absence ouen présence de 100 µM de génistéine, puis stimulées par la Con A (5 µg/106 cellules) pendant5 min en présence de butanol-1 à 1%. Les résultats sont exprimés en pourcentage de laradioactivité liée aux phospholipides et correspondent à une expérience représentative.

153

VI- Effets du 12(S)-HETE sur les tyrosine phosphorylations dans les cellules

mononucléées humaines activées par la Con A.

Nous avons étudié les tyrosine-phosphorylations induites par la Con A en absence ou en

présence de 12(S)-HETE par une technique d'immunodétection avec un anticorps anti-

phosphotyrosine. Pour cela, les cellules mononucléées ont été lysées selon le protocole décrit dans le

chapitre Méthodes, et les protéines présentes dans la fraction cytosolique ont été analysées par

électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes, puis transférées sur membrane

de nitrocellulose (voir Méthodes). Les blots sont révélés à l'aide d'un anticorps anti-phophotyrosine

couplé à une détection ECL.

La quantité de β-actine présente dans chaque échantillon a été évaluée sur la même membrane avec

un anticorps anti-β-actine, de manière a obtenir un standard interne permettant d'estimer la quantité

de protéines présentes dans chaque échantillon. La quantification de la β-actine montre que les

quantités de protéines déposées dans chaque puits ne sont pas identiques. Les résultats ont donc été

normalisés par rapport au signal obtenu pour la β-actine.

La photographie d'un blot représentatif (Figure 39) montre qu'il existe un grand nombre de protéines

phosphorylées sur des résidus tyrosine dans les cellules mononucléées humaines. L'analyse par

vidéodensitométrie des signaux obtenus permet de dégager plusieurs conclusions. Une visualisation

du profil de chaque piste (Figure 40) permet de comparer les profils sans correction par la β-actine, et

d'évaluer les effets des différents traitements. Les résultats présentés dans la Figure 40a montrent que

la Con A induit un grand nombre de tyrosine phosphorylations dans les cellules mononucléées

humaines, et que la génistéine est capable de diminuer ces phosphorylations. D'autre part, les résultats

présentés dans la Figure 40b montrent que, dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE

et stimulées par la Con A, le profil des tyrosine-phosphorylations est qualitativement le même que

celui observé pour la Con A seule, mais beaucoup plus sensible à l'inhibition par la génistéine que

celui induit par la Con A seule. Enfin, la comparaison des profils présentés en Figure 40c montre que

le 12(S)-HETE en présence de Con A induit un peu moins de tyrosine-phosphorylation que la Con A

seule, sauf dans le cas d'un pic correspondant à une protéine de masse moléculaire comprise entre 44

et 50 KDa qui est identique quel que soit le traitement.

154

Figure 39 : Immunodétection des protéines phosphorylées sur des résidus tyrosine aprèstransfert sur membrane de nitrocellulose.

Con

A

+ 1

2HE

TE

Con

A

+ 1

2HE

TE

+ G

en

Tém

oin

67 KDa

56 KDa

40 KDa

Con

A

Con

A

+ G

en

β-actine

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives (30 minutes) de12(S)-HETE (1 µM). Après lavages, les cellules ont été prétraitées pendant 20 min avec lagénistéine (100 µM), puis stimulées par la Con A (5 µg/106 cellules). Les réactions ont étéarrêtées et les cellules ont été lysées comme décrit dans le chapitre Méthodes. Une mêmequantité de protéines (10 µg) a été déposée dans chaque puits, et la séparation a été effectuéesur gel de polyacrylamide (10%) en conditions dénaturantes. Après transfert sur membrane denitrocellulose, les membranes ont été incubées pendant 3 heures en présence d'un anticorpsantiphosphotyrosine (voir Méthodes), puis révélées par l'ECL. Cette photographie représenteles résultats d'une expérience.

155

a) Témoin ----, Con A ---- et Con A + génistéine ----.

b) Témoin ----, Con A + 12HETE ---- et Con A + 12HETE + génistéine ----.

c) Témoin ----, Con A ---- et Con A + 12HETE ----.

Figure 40 : Visualisation des profils obtenus pour chaque piste par vidéodensitométrie.Le film obtenu après révélation ECL de la membrane a été photographié et l’image a été

analysée par vidéodensitométrie (Bioprofil, Vilber Lourmat). Les profils des différentes pistesont été superposés afin de permettre une comparaison des effets des différents traitements.

156

0

100

200

300

400

Tyr

osin

e ph

osph

oryl

atio

n

(

% d

u té

moi

n)

Té

mo

in

Co

n A

Co

n A

+

Ge

n

Co

n A

+

12

(S)-

HE

TE

Co

n A

+

12

(S)-

HE

TE

+

Ge

n

a

44-50 KDa

Tyr

osin

e ph

osph

oryl

atio

n

0

100

200

300

(%

du

tém

oin)

c

56 KDa

Té

mo

in

Co

n A

Co

n A

+

Ge

n

Co

n A

+

12

(S)-

HE

TE

Co

n A

+

12

(S)-

HE

TE

+

Ge

n

0

100

200

300

400

500

600

Tyr

osin

e ph

osph

oryl

atio

n

(

% d

u té

moi

n)

b

67 KDa

Té

mo

in

Co

n A

Co

n A

+

Ge

n

Co

n A

+

12

(S)-

HE

TE

Co

n A

+

12

(S)-

HE

TE

+

Ge

n

Figure 41 : Analyse vidéodensitométrique du blot présenté dans la Figure 38.

Les résultats sont exprimés en pourcentage des tyrosine-phosphorylations du témoin sur la

protéine de 44-50 KDa (a), sur la protéine de 67 KDa (b) et sur la protéine de 56 KDa (c), et

représentent les valeurs d'une expérience.

157

Suite à ces observations, nous avons éffectué l'analyse densitométrique de la bande de poids

moléculaire compris entre 44 et 50 KDa et qui correspond à ce pic. Une analyse

densitométrique de ce signal, ainsi que ceux correspondants à des protéines de masses

moléculaires de 56 et 67 KDa a été effectuée. Les résultats normalisés par rapport à la β-

actine, sont présentés dans la Figure 41. La Con A seule augmente d'environ 3 fois le niveau

de tyrosine phosphorylation d'une protéine de masse moléculaire 44-50 KDa par rapport au

témoin (Fig. 41a). Une nette potentialisation de cet effet est observée en présence de 12(S)-

HETE (x4). Alors que la génistéine n'inhibe que de 25% les tyrosine phosphorylations de

cette protéine induites par la Con A seule, une inhibition substantielle de plus de 50% est

observée en présence de 12(S)-HETE.

La présence de 12(S)-HETE ne modifie pas significativement le niveau des tyrosine

phosphorylations induites par la Con A des protéines de 67 et 56 KDa (Fig. 41 b et c), mais

potentialise fortement l'effet inhibiteur de la génistéine (-18 vs -44% pour la protéine de

67 KDa ; -30 vs -60% pour la protéine de 56 KDa).

L'ensemble de ces résultats suggèrent que l'enrichissement des cellules mononucléées en

12(S)-HETE augmente les phosphorylations des résidus tyrosine induites par la Con A d'une

protéine de masse moléculaire comprise entre 44 et 50 KDa. D'autre part, le 12(S)-HETE

augmente la sensiblité à la génistéine de ces tyrosine-phosphorylations quelle que soit la

protéine étudiée, et cela suggère que les tyrosines kinases impliquées dans la phosphorylation

de résidus tyrosine en absence ou en présence de 12(S)-HETE sont peut-être différentes.

VII- Effet de la suramine sur la production de PA induite par la Con A dans les cellules

mononucléées enrichies ou non en 12(S)-HETE.

Des études antérieures de notre équipe ont montré que la stimulation par la Con A de

cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE induit la libération de 12(S)-HETE dans le

milieu extracellulaire. Nous avons donc émis l'hypothèse que la stimulation par la Con A

pourrait libérer du 12(S)-HETE, qui pourrait activer une voie PLD à partir de sites de liaison

localisés sur la face extracellulaire des membranes plasmiques. La suramine, composé

polyanionique dérivé de l'acide naphtalène-sulphonique, est un inhibiteur connu de la PLD

(Gratas et Powis, 1993). En raison de ses charges négatives, ce composé ne peut pas entrer

dans les cellules et agit de manière extracellulaire. Dans le but de mieux comprendre par quel

mécanisme le 12(S)-HETE stimule la production de PA induite par la Con A, nous avons

mesuré l'accumulation de PA en réponse à la Con A, en absence ou en présence de suramine

(Figure 42). Cette expérience montre que la suramine (1 mM) n'affecte pas la hausse de PA en

masse induite par la Con A dans les cellules témoins, mais diminue beaucoup celle induite

dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE. La suramine semble aussi diminuer le taux

158

0

20

40

60

- Suramine+ Suramine

PA

form

é (n

g/m

illio

n de

cel

lule

s)

*

12(S)-HETE Con A 12(S)-HETE+Con A

Figure 42 : Effets de la Suramine sur la production d'acide phosphatidique induite par la ConA dans les cellules mononucléées humaines enrichies ou non en 12(S)-HETE.

Les cellules mononucléées ont été incubées avec 3 charges successives de 12(S)-HETE.Après lavages, les cellules témoins et les cellules enrichies en 12(S)-HETE ont été incubéespendant 60 min à 37°C en absence ou en présence de 1mM de suramine, puis stimulées par laCon A (5µg/106 cellules) pendant 5 min. Les résultats sont exprimés en ng de PA formé par106 cellules et représentent les moyennes ± SEM de 3 expériences différentes réalisées avec 3donneurs différents. Les valeurs ont été comparées par analyse de variance (ANOVASTATVIEW II) et par le test de t protégé (Fisher).* indique une différence par rapport à la quantité mesurée en absence de suramine, p<0,01.

159

basal de PA dans les cellules enrichies en 12(S)-HETE en absence d'activation par la Con A.

Ces résultats indiquent que l'activation de la PLD par la Con A en présence de 12(S)-HETE

met en jeu des sites extracellulaires qui pourraient être des sites spécifiques de liaison du

12(S)-HETE.

VIII- Mise en évidence de sites de liaison du 12(S)-HETE sur les cellules mononucléées

ou les lymphocytes T humains purifiés.

Suite aux résultats obtenus en présence de suramine, qui ne pénètre pas dans les

cellules, nous avons cherché à étudier la liaison du 12(S)-HETE sur les membranes des

cellules mononucléées. De plus, les résultats antérieurs de notre équipe (Joulain et al., 1995)

montrant que les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE libèrent du 12(S)-HETE

dans le milieu extracellulaire lorsqu'elles sont stimulées par la Con A étaient en faveur de

cette hypothèse. La fixation du 12(S)-HETE tritié sur les cellules mononucléées et les

lymphocytes humains purifiés a été étudiée par une technique de filtration rapide selon la

méthode décrite par Vonakis et Vanderhoek (1992).

Avant d'étudier les caractéristiques de cette fixation, nous avons déterminé la cinétique

d'association du 12(S)-HETE tritié aux cellules, ainsi que le nombre optimal de cellules à

utiliser dans chaque essai.

VIII-1 Etude de la fixation spécifique du 12(S)-HETE tritié en fonction du temps sur

les cellules mononucléées humaines.

Les cellules mononucléées humaines (3,5 x 106 cellules/essai) ont été incubées pendant des

temps variables allant jusqu'à 4 heures 30, à 4°C sous agitation en présence de [3H]-12(S)-HETE

(0,01 µM et 0,025 µCi par essai). La fixation non spécifique a été déterminée en présence d'un large

excès de 12(S)-HETE non marqué (10 µM). La réaction est arrêtée par dilution avec 1 ml de PBS

froid et chaque échantillon est filtré sous vide sur des filtres GF/C. Dans ces conditions d'incubation

(4°C), une quantité substantielle de radioactivité reste associée aux cellules après filtration. Des

études antérieures effectuées dans l'équipe ont montré, après analyse par chromatographie sur couche

mince des extraits lipidiques des cellules fixées sur les filtres, que la majeure partie de la radioactivité

correspond à du 12(S)-HETE non estérifié et non dégradé (70 à 75%). Les résultats présentés dans la

Figure 43 montrent que la fixation du 12(S)-HETE atteint son maximum après 1 heure d'incubation,

puis reste stable tout au long de la période de temps considéré. Nous avons donc effectué toutes les

manipulations suivantes en incubant les cellules pendant 3 heures à 4°C sous agitation. Cette figure

montre également que la fixation non spécifique de 12(S)-HETE sur les membranes cellulaires reste

stable au cours du temps et représente environ 30% de la radioactivité totale fixée.

160

30020010001000

2000

3000

4000

5000

6000Fixation non spécifiqueFixation totale

Temps (min)

dpm

/ess

ai

Figure 43 : Association du 12(S)-HETE tritié aux cellules mononucléées humaines enfonction du temps.

Les cellules mononucléées humaines ont été incubées pendant des temps variables allantjusqu'à 270 min en présence de 12(S)-HETE tritié (0,01 µM et 0,025 µCi par essai). Lafixation non spécifique a été déterminée en présence d'un large excès de 12(S)-HETE nonmarqué. Les réactions ont été arrêtées comme décrit dans Méthodes. Chaque point représentela moyenne ± SEM de 3 déterminations.

161

5432100

1000

2000

3000

4000

5000

fixat

ion

sp

écifi

que

(dp

m/e

ssai

)

Nbre de cellules (x106)

Figure 44 : Fixation spécifique du 12(S)-HETE tritié en fonction du nombre de cellulesmononucléées humaines.

Des quantités croissantes de cellules mononucléées humaines ont été incubées en présencede 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) pendant 3 heures à 4°C sous agitation.La réaction a été arrêtée comme décrit dans Méthodes. La liaison spécifique est analyséecomme décrit dans Méthodes et représente 70% de la fixation totale du [3H]-12(S)-HETE.Chaque point représente la moyenne ± SEM de trois déterminations.

162

VIII-2 Etude de la fixation du 12(S)-HETE tritié en fonction du nombre de cellules.

Des quantités croissantes de cellules mononucléées ont été incubées pendant 3 heures à 4°C

sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai). La fixation non

spécifique a été déterminée en présence d'un large excès de 12(S)-HETE non marqué (3 µM). Les

résultats présentés dans la Figure 44 montrent que la fixation spécifique augmente de manière linéaire

en fonction du nombre de cellules et que 2 à 3 millions de cellules sont nécessaires par essai pour

obtenir une fixation spécifique au moins égale à 3000 dpm. Les manipulations suivantes ont donc été

effectuées en présence de 3 x 106 cellules par essais.

VIII-3 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux cellules mononucléées

humaines.

Les cellules mononucléées (3,4 x 106 cellules par essai) ont été incubées pendant 3 heures à

4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et de

concentrations croissantes de 12-HETE non marqué (0 à 10 µM).

Les résultats présentés dans la Figure 45a montrent que la quantité de 12(S)-HETE fixée de manière

spécifique aux cellules mononucléées augmente en fonction de la concentration de 12(S)-HETE

ajouté jusqu'à 0,5-1 µM. Cette fixation atteint ensuite un léger plateau, ce qui indique un début de

saturation. Entre 1 et 5 µM, la fixation augmente de nouveau, ce qui indique l'existence d'autres sites

de liaison ayant une affinité plus faible pour le 12(S)-HETE.

La représentation de Scatchard (Figure 45b) confirme qu'il existe deux types de sites de forte et faible

affinités pour le 12(S)-HETE sur les cellules mononucléées humaines et permet de calculer un Kd de

"forte affinité" de 312 nM avec un nombre maximal de sites de liaison Bmax de 6,62 pmoles

fixées/106 cellules.

VIII-4 Caractéristiques de la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes T humains

purifiés.

Afin de vérifier que la liaison du 12(S)-HETE que nous avons observée sur les cellules

mononucléées humaines concerne bien les lymphocytes T, nous avons effectué les mêmes

expériences avec des lymphocytes T humains purifiés.

Les lymphocytes T (1,5 à 2 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à 4°C sous

agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et de concentrations

croissantes de 12(S)-HETE non marqué (0 à 10 µM).

Les résultats présentés dans la figure 46a montrent que la liaison du 12(S)-HETE augmente en

fonction de la concentration de 12(S)-HETE ajouté et atteint un plateau à partir de 0,5.

La représentation de Scatchard (Figure 46b) confirme qu'il existe une seule catégorie de sites de

liaison au 12(S)-HETE sur les lymphocytes T purifiés. Cette courbe permet de

163

5000400030002000100000

10

20

30

40

50

[12(S)-HETE] nM

B (

pmol

/ess

ai)

a

504030201000

10

20

30

40

50

60

70

80

B(pmol/essai)

B/F

nM

b

Figure 45 : Courbes de saturation et de Scatchard de la liaison du 12(S)-HETE aux cellulesmononucléées humaines.

Les cellules mononucléées humaines (3,4 x 106 cellules/essai) ont été incubées pendant 3heures à 4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai)et de concentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué.

La courbe (a) représente le nombre de pmoles de 12(S)-HETE fixées en fonction de laconcentration de 12(S)-HETE ajoutée. Chaque point représente la moyenne de 3déterminations.

La courbe de Scatchard (b) représente la moyenne de 3 déterminations.

164

60005000400030002000100000

2

4

6

8

10

[12(S)-HETE] nM

B (

pmol

/ess

ai)

a

1816141210864200

10

20

B (pmol/essai)

B/F

(µM

)

b

Figure 46 : Courbes de saturation et de Scatchard de la liaison du 12(S)-HETE auxlymphocytes T humains purifiés.

Les lymphocytes T purifiés (1,5 à 2 x 106 cellules/essai) ont été incubés pendant 3 heures à4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et deconcentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué.

La courbe (a) représente le nombre de pmoles de 12(S)-HETE fixées en fonction de laconcentration de 12(S)-HETE ajoutée. Chaque point représente la moyenne de 3déterminations.

La courbe de Scatchard (b) représente la moyenne de 3 déterminations.

165

calculer un Kd de 773 nM avec un Bmax de 7,38 pmoles fixées/106 cellules. Cette courbe est

représentative d'une expérience réalisées en triple. Une deuxième expérience a donné desrésultats similaires (Kd = 543 nM ; Bmax = 12,38 pmoles fixées/106 cellules). D'autre part, au

cours de ces expériences, une partie des lymphocytes a été stimulée par de la PHA lors de la

mise en culture (voir Méthodes). Les représentations de Scatchard réalisées à partir des

données obtenues avec ces populations cellulaires stimulées par la PHA permettent decalculer des Kd de 706 nM et 669 nM, avec des Bmax de 21,62 et 13,74 pmoles fixées/106

cellules, respectivement. Nous avons conclu que la PHA n'influençait pas la liaison du 12(S)-

HETE aux lymphocytes T purifiés et les expériences suivantes ont été réalisées avec des

lymphocytes non activés.

D'autre part, les Kd obtenus avec les lymphocytes T purifiés non activés sont comparables à

ceux obtenus avec les cellules mononucléées. De plus, on peut supposer que les sites de très

faible affinité observés avec les cellules mononucléées proviennent probablement d'une autre

population cellulaire que les lymphocytes T.

VIII-5 Comparaison des courbes de déplacement du 12(S)-HETE tritié par du 12(S)-

HETE non marqué et par d'autres acides gras ou lipides dans les lymphocytes T humains

purifiés.

Dans le but d'étudier la spécificité de la liaison du 12(S)-HETE sur les lymphocytes T

humains purifiés, nous avons effectué des expériences de compétition avec d'autres lipides ou

acides gras. Les résultats de ces expériences sont présentés dans la Figure 47. Ils indiquent

que l'acide oléïque (Fig. 47a) n'est pas capable de déplacer le 12(S)-HETE tritié, et que l'acide

arachidonique (Fig. 47b) est un très faible compétiteur. Par contre, le DHA (Fig. 47c) et l'EPA

(Fig. 47d) déplacent le 12(S)-HETE tritié aussi bien que le 12(S)-HETE non marqué. Enfin,

les acides gras hydroxylés, 15-HETE (Fig. 47e) et 13-HODE (Fig. 47f) sont moins efficaces

que le DHA ou l'EPA, mais déplacent cependant assez bien le 12(S)-HETE tritié.

Ces résultats suggèrent que les sites de liaison du 12(S)-HETE ne sont pas spécifiques de ce

composé. Le 12(S)-HETE se lie donc probablement sur des récepteurs spécifiques d'autres

molécules, ce qui expliquerait également l'affinité relativement faible (Kd assez élevé) que

nous avons observée en VIII-3 et VIII-4.

Nous nous sommes ensuite posés la question de savoir sur quel type de récepteur le 12(S)-

HETE pouvait se lier, et nous avons effectué des expériences en présence de différents

inhibiteurs.

166

log [C]

0

20

40

60

80

100

120 12-HETE

15-HETE

Fix

atio

n s

péci

fiqu

e (%

du

tém

oin

)

e

0 -9 -8 -7 -6 -5

0

20

40

60

80

100

120 12-HETE

Arachidonate

Fix

atio

n sp

éci

fique

(%

du

tém

oin

)

log [C]

b

0 -9 -8 -7 -6 -50

20

40

60

80

100

120 12-HETE

Oléate

log [C]

Fix

atio

n sp

éci

fique

(%

du

tém

oin

)

a

0 -9 -8 -7 -6 -5

0

20

40

60

80

100

120 12-HETE

EPA

Fix

atio

n sp

écifi

que

(% d

u té

mo

in)

log [C]

d

0 -9 -8 -7 -6 -5

0

20

40

60

80

100

120 12-HETE

13-HODE

Fix

atio

n sp

écifi

qu

e (%

du

tém

oin

)

log [C]

f

0 -9 -8 -7 -6 -5

0

20

40

60

80

100

120 12-HETE

DHA

Fixa

tion

sp

écifiq

ue

(%

du

tém

oin

)

log [C]

c

0 -9 -8 -7 -6 -5

Figure 47 : Comparaison entre le déplacement du [3H]-12(S)-HETE tritié par du 12(S)-HETE froid et pard'autres acides gras ou lipides dans des lymphocytes T humains purifiés.

Les lymphocytes T purifiés (3 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à 4°C sous agitationen présence de 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai) et de 12(S)-HETE froid (0 à 3 µM). Lesmêmes expériences ont été effectuées en remplaçant le 12(S)-HETE froid par différents acides gras ou lipides (0à 3 µM) tel que l'acide oléïque (a), ou l'acide arachidonique (b), ou le DHA (c), ou l'EPA (d), ou le 15(S)-HETE(e), ou le 13-HODE (f). Les réactions ont été arrêtées comme décrit dans Méthodes. La liaison spécifique est

analysée comme décrit dans Méthodes et représente environ 70% de la liaison totale du [3H]-12(S)-HETE.Chaque point représente la moyenne de 2 expériences réalisées en triple.

167

VIII- Etude des caractéristiques des sites de liaison au 12(S)-HETE dans les

lymphocytes T purifiés.

a) Effet du GTPγS sur la liaison du 12(S)-HETE aux membranes de


Dans le but de tester l'implication d'un récepteur agissant par l'intermédiaire de

protéines G hétérotrimériques, nous avons étudié l'effet du GTPγS sur la liaison du 12(S)-

HETE aux lymphocytes T. Le GTPγS, en se liant à une protéine G dissocie les sous-unités α

et βγ de la protéine, ce qui conduit à son activation. La protéine G ainsi activée se dissocie du

récepteur, ce qui diminue l'affinité du récepteur pour son ligand. D'autre part, le GTPγS ne

pénètre pas dans les cellules. C'est pour cette raison que nous avons testé son effet sur des

fractions particulaires.

Les cellules cultivées 3 jours ont été lysées selon le protocole de lyse au glycérol décrit dans

Méthodes. Les membranes (correspondant à 2 x 106 cellules/essai) ont été incubées 3 heures à

4°C sous agitation en présence de 12(S)-HETE tritié (0,58 nM et 0,056 µCi par essai) et de

concentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué, en absence ou en présence de GTPγS

(100 µM). La représentation de Scatchard (Figure 48) obtenue avec les données de cetteexpériences permet de calculer un Kd de 1,09 µM avec un Bmax de 6,37 pmol/106 cellules

pour les membranes incubées en absence de GTPγS. Les résultats d'une autre expérienceréalisée dans les mêmes conditions permettent d'obtenir un Kd de 0,803 µM avec un Bmax de

2,5 pmol/106 cellules. Ces résultats suggèrent que l'affinité du 12(S)-HETE pour les

membranes isolées est plus faible que celle obtenue pour les cellules entières.D'autre part, un Kd de 2,58 µM avec un Bmax de 13,39 pmol/106 cellules peut être calculé

lorsque les membranes sont incubées en présence de GTPγS. Ce résultat montre donc que le

GTPγS diminue l'affinité du 12(S)-HETE pour les membranes isolées. Cela suggère que les

sites de liaison du 12(S)-HETE pourraient être couplés à une protéine G. Nous avons donc

testé ensuite l'effet de la Toxine Pertussique sur la liaison spécifique du 12(S)-HETE aux

lymphocytes T humains purifiés, dans le but d'étayer encore cette hypothèse.

b) Effet de la Toxine Pertussique (PTX) sur la liaison du 12(S)-HETE aux


La toxine pertussique est capable d'activer les protéines G de manière irréversible. La

protéine G ainsi activée se dissocie du récepteur, ce qui diminue l'affinité de ce récepteur pour

son ligand.

Les résultats présentés dans la Figure 49 montrent que la toxine pertussique (5 ng/ml) diminue

nettement la liaison spécifique du 12(S)-HETE, et ce résultat confirme donc l'implication de

sites de liaison couplés à une protéine G dans ce mécanisme.

168

3025201510500

2

4

6

8

10

12

14

sans GTPγS

avec GTPγS

B(pmol/essai)

B/F

µM

Figure 48 : Représentation de Scatchard de la liaison du 12(S)-HETE aux membranes delymphocytes T humains purifiés en absence et en présence de GTPγS.

Les lymphocytes T purifiés ont été lysés selon le protocole au glycérol décrit dansMéthodes. Les membranes (correspondant à 2 x 106 par essai) ont été incubées en présence de12(S)-HETE tritié (0,58 nM et 0,056 µCi par essai) et de concentrations croissantes de 12(S)-HETE non marqué en absence ou en présence de GTPγS (100 µM). Les réactions ont étéarrêtées comme décrit dans Méthodes. Les résultats représentent la moyenne de 3déterminations.

169

0

1000

2000

Fix

atio

n s

péc

ifiqu

e (d

pm/e

ssai

)

12(S)-HETE seul 12(S)-HETE + PTX 5 ng/ml

Figure 49 : Effet de la toxine pertussique sur la fixation spécifique du 12(S)-HETE auxlymphocytes T humains purifiés.

Les lymphocytes T purifiés (2,2 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à4°C sous agitation avec du 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai), en absence ouen présence de Toxine Pertussique à 5 ng/ml. La fixation spécifique a été estimée commedécrit dans Méthodes. Les résultats sont exprimés en dpm/essai et représentent les moyennesde 3 déterminations.

170

0

1000

2000

3000

Fix

atio

n s

péc

ifiqu

e (d

pm/e

ssai

)

*

12(S)-HETE seul 12(S)-HETE + suramine

Figure 50 : Effet de la suramine sur la fixation spécifique du 12(S)-HETE aux lymphocytes Thumains purifiés.

Les lymphocytes T purifiés (3,3 x 106 cellules par essai) ont été incubés pendant 3 heures à4°C sous agitation avec du 12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai), en absence ouen présence de Suramine 1 mM. La fixation spécifique a été estimée comme décrit dansMéthodes. Les résultats sont exprimés en dpm/essai et représentent les moyennes de 6déterminations ± SEM. * indique une différence significative (p<0,05) par rapport au niveausans inhibiteur.

171

Enfin, suite aux résultats obtenus en présence de Suramine sur l'activité PLD induite dans les

cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A, il nous a semblé

interessant de déterminer quel était l'effet de la Suramine sur la liaison du 12(S)-HETE aux


c) Effet de la suramine sur la liaison du 12(S)-HETE aux lymphocytes T

humains purifiés.

Les lymphocytes T humains purifiés ont été incubés pendant 3 heures à 4°C avec du

12(S)-HETE tritié (0,26 nM et 0,025 µCi par essai). La fixation non spécifique a été

déterminée en présence d'un large excès de 12(S)-HETE non marqué (3 µM). Toutes ces

incubations ont été effectuées en absence ou en présence de suramine à la concentration de 1

mM. Les résultats présentés dans la Figure 50 montrent que la suramine diminue de manière

importante la fixation spécifique du 12(S)-HETE sur les lymphocytes T humains purifiés. Ce

résultat montre que la suramine est capable de déplacer le 12(S)-HETE de ses sites de liaison

spécifiques. Or, la suramine bloque également l'activation de la PLD induite par la Con A en

présence de 12(S)-HETE, ce qui suggère que les sites de liaison du 12(S)-HETE pourraient

être directement ou indirectement couplés à une PLD.

IX- Discussion.

Les résultats présentés dans ce dernier chapitre montrent que le 12(S)-HETE

potentialise la production d'acide phosphatidique induite par la Con A dans les cellules

mononucléées humaines. Ce résultat est inattendu puisque le 12(S)-HETE a été décrit comme

un inhibiteur de DAG-Kinase dans les cellules endothéliales aortiques bovines. La formation

de PA contenant du 12(S)-HETE dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE

constitue un autre résultat important de ce travail. Bien que le 12(S)-HETE soit métabolisé par

peroxydation dans la plupart des cellules qui l'incorporent, la radioactivité associée au PA

dans les cellules mononucléées marquées avec du 12(S)-HETE tritié correspond bien à du

12(S)-HETE non transformé. En effet, des études antérieures de l'équipe ont montré que,

après saponification des lipides de cellules enrichies en 12(S)-HETE tritié et analyses HPLC

des extraits saponifiés, plus de 80% de la radioactivité est retrouvée sous forme de 12(S)-

HETE non modifié. Les données de la littérature décrivent des espèces moléculaires de DAG

contenant du 15-HETE dans des cellules endothéliales d'artère pulmonaire bovine, enrichies

en 15-HETE et stimulées par la bradykinine (Legrand et al., 1991) ou bien des expèces

moléculaires de DAG contenant du 13-HODE dans des cellules de l'épiderme enrichies en 13-

HODE (Cho et Ziboh, 1994). En absence de stimulation mitogénique, le PA contenant du

172

12(S)-HETE ne représente que 0,4% de la masse totale de PA présent dans les cellules

mononucléées humaines. Cette proportion relative est même diminuée dans les cellules

activées par la Con A puisque, dans ces conditions, la masse de PA augmente beaucoup plus

que la proportion de PA marqué au 12(S)-HETE tritié. Cependant, ce résultat ne permet pas

d'exclure que les espèces de PA contenant du 12(S)-HETE puissent jouer un rôle

physiologique important. Le PA contenant du 12(S)-HETE pourrait être synthétisé dans un

compartiment particulier de la membrane lipidique, empêchant le bon déroulement des

événements impliqués dans la transduction du signal mitogénique. Ce phénomène peut avoir

un effet physiologique important dans le contexte de l'immunodéficience liée au

vieillissement, puisqu'il a été démontré que le taux de 12(S)-HETE est significativement plus

élevé dans les cellules mononucléées de personnes âgées que dans celles de témoins jeunes.

Une autre hypothèse permettant d'expliquer l'effet antimitogénique du 12(S)-HETE est la

production d'espèces moléculaires de PA contenant un taux important d'acides gras saturés et

une faible proportion d'acide arachidonique dans les cellules mononucléées enrichies en

12(S)-HETE et stimulées par la Con A, comparativement aux cellules activées par la Con A

seule (Tableau 9). Il a été démontré que l'effet mitogénique du PA probablement de la

longueur et du dégré de saturation des acides gras qui le composent, le PA-1-stéaroyl, 2-

arachidonoyl étant le plus mitogène dans des fibroblastes (van Corven et al., 1992). Nous

avons donc émis l'hypothèse que le 12(S)-HETE favorisait la production d'espèces

moléculaires de PA ayant un faible pouvoir mitogénique, et nous nous sommes proposés de

déterminer et d'étudier par quel mécanisme ce PA pouvait être synthétisé.

Nos résultats suggèrent que, non seulement le 12(S)-HETE ne bloque pas la voie de synthèse

du PA induite par la Con A dans les cellules mononucléées humaines, mais stimule

probablement une ou plusieurs autres voies de production du PA dans ces cellules. En effet,

les résultats montrés dans le Tableau 8 confirment l'absence d'effet activateur du 12(S)-HETE

sur la DAG-Kinase, puisqu'on observe une diminution de la proportion de DAG tritié dans les

cellules enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A. D'autre part, plusieurs arguments

suggèrent que le 12(S)-HETE stimule une voie PLD dans les cellules mononucléées humaines

activées par la Con A. Tout d'abord, la production de PA en masse induite par la Con A dans

les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE est très nettement diminuée lorsque les

cellules sont stimulées en présence d'éthanol, ce qui suggère l'intervention d'une

transphosphatidylation caractéristique de la PLD. De plus, nos résultats montrent que les

cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A produisent du

phosphatidyléthanol ou du phosphatidylbutanol quand elles sont activées en présence

d'éthanol ou de butanol, respectivement, ce qui n'est pas le cas lorsque les cellules sont

stimulées par la Con A seule en présence d'alcool primaire. Ce dernier résultat confirme les

résultats obtenus dans le chapitre I montrant que, contrairement à l'ester de phorbol TPA, la

Con A seule ne stimule pas d'activité PLD dans les cellules mononucléées humaines.

Nous avons ensuite étudié l'effet de différents inhibiteurs sur la production de

173

phosphatidylbutanol dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées

par la Con A. Nos résultats indiquent que la PLD activée par la Con A dans les cellules

mononucléées humaines enrichies en 12(S)-HETE n'est pas régulée par une PKC. Ceci

suggère que cette activité PLD pourrait être différente de celle activée dans ces mêmes

cellules par l'ester de phorbol TPA, qui est un activateur reconnu de PKC.

Les expériences effectuées en présence de l'inhibiteur de tyrosine-kinase, génistéine, montrent

que l'activité PLD induite par la Con A dans les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-

HETE pourrait être régulée par des phosphorylations sur des résidus tyrosines.

Nous avons commencé une étude visant à déterminer quelles pouvaient être les protéines

phosphorylées sur des résidus tyrosine au cours de ce phénomène. Nos résultats préliminaires

montrent que la Con A seule induit des phoshorylations de tyrosine sur un grand nombre de

protéines par rapport au cellules témoins, et que la génistéine est capable de diminuer ces

phosphorylations. Les mêmes résultats sont obtenus en présence de 12(S)-HETE. L'analyse

par vidéodensitométrie des profils de chaque piste montre qu'une protéine de masse

moléculaire comprise entre 44 et 50 KDa est davantage tyrosine-phosphorylée dans les

cellules enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A que dans les cellules stimulées

par la Con A seule. Cette protéine sensible à l'effet du 12(S)-HETE pourrait correspondre à

une MAP-Kinase (44KDa) ou à une tyrosine-kinase Csk (50 KDa). Par ailleurs,

l'enrichissement en 12(S)-HETE des cellules mononucléées humaines ne modifie les tyrosine-

phosphorylations des protéines de 56 et 67 KDa (pouvant correspondre aux PTK Lck 56 et

ZAP-70). Par contre, l'effet inhibiteur de la génistéine est plus important dans les cellules

enrichies en 12(S)-HETE que dans les cellules non traitées, quelle que soit la protéine étudiée.

Ce résultat suggère que le 12(S)-HETE pourrait recruter des tyrosine-kinases différentes de

celles stimulées par la Con A seule. Cependant, ce résultat est un résultat préliminaire qui

reste à confirmer.

Un autre résultat étayant l'hypothèse de l'implication d'une PLD dans la production de PA en

masse induite par le 12(S)-HETE en présence de Con A est celui obtenu avec l'inhibiteur de

PLD, suramine. En effet, la suramine n'affecte pas la production de PA en masse induite par la

Con A seule, alors qu'elle inhibe de manière significative celle induite par la Con A dans les

cellules prétraitées par le 12(S)-HETE. Nous avons envisagé deux hypothèses pour expliquer

l'effet de la suramine : (1) soit le 12(S)-HETE estérifié dans les phospholipides membranaires

modifie les caractéristiques des sites de liaison à la Con A, (2) soit le 12(S)-HETE sous forme

libre peut agir lui-même comme un ligand extracellulaire. Des résultats antérieurs de notre

équipe ayant montré que les cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE tritié libèrent du

12(S)-HETE dans le milieu extracellulaire lorsqu'elles sont stimulées par la Con A, nous nous

sommes intéressés à la seconde hypothèse. En effet, étant donné que l'activation de la PLD

nécessite la présence à la fois de la Con A et du 12(S)-HETE, la Con A pourrait agir en

mobilisant le 12(S)-HETE stocké dans les phospholipides membranaires et en augmentant le

taux de 12(S)-HETE libre dans le milieu extracellulaire. Les expériences de liaison du 12(S)-

174

HETE tritié ont montré l'existence de deux classes de sites de liaison du 12-HETE sur les

cellules mononucléées humaines avec un Kd pour la fixation de plus forte affinité d'environ300 nM et un Bmax de 6,62 pmoles fixées/106 cellules. Dans les lymphocytes T purifiés, on

ne trouve plus qu'une seule classe de sites de liaison du 12(S)-HETE avec un Kd d'environ550-750 nM et un Bmax d'environ 7 à 10 pmoles fixées/106 cellules. D'autre part, nos

expériences ont montré que l'activation par la PHA des lymphocytes T purifiés n'avait pas

d'influence sur la fixation spécifique du 12(S)-HETE sur les membranes cellulaires. Enfin, les

expériences de compétition effectuées en présence de divers lipides suggèrent que les sites de

liaison du 12(S)-HETE reconnaissent également d'autres acides gras, puique le DHA et l'EPA

sont capables de déplacer le 12(S)-HETE tritié de la même manière que le 12(S)-HETE froid.

Des sites de liaison de forte affinité pour le 12(S)-HETE ont déjà été décrits, par exemple

dans les kératinocytes avec un Kd d'environ 3-4 nM (Arenberger et al., 1993) ou dans les

cellules de carcinome avec un Kd de 0,4 nM (Herbertsson et Hammarstrom,1991). Nos

résultats montrent la présence sur les cellules mononucléées humaines de sites de liaison de

faible affinité, ce qui a aussi été décrit dans des cellules basophiles leucémiques (Kd=500nM

environ) (Kang et Vanderhoek, 1995). La signification physiologique de l'existence de ces

sites de faible affinité reste à démontrer, mais cela pourrait expliquer la nécessité de quantités

micromolaires de 12(S)-HETE pour obtenir un effet antiprolifératif. Enfin, les expériences

réalisées en présence de GTPγS, toxine pertussique et suramine suggèrent l'implication de

sites de liaison couplés à une protéine G dans l'effet du 12(S)-HETE. Des expériences visant à

tester les effets de la toxine pertussique et du GTPγS sur la PLD dans les cellules

mononucléées humaines enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A devraient

permettre de confirmer ce résultat.

L'ensemble des résultats présentés dans ce chapitre suggère que le 12(S)-HETE potentialise la

production de PA en masse induite par la Con A par l'activation d'une PLD. La stimulation de

cette PLD pourrait se produire par l'intermédiaire de sites de liaison du 12(S)-HETE couplé à

une protéine G, suivie de l'activation de protéines tyrosine-kinases. Les espèces moléculaires

de PA produites dans ces conditions contiennent du 12(S)-HETE, et sont plus riches en acides

gras saturés que les espèces moléculaires de PA produites dans les cellules activées par la Con

A seule. De telles modifications dans la composition en acides gras du PA synthétisé dans les

cellules mononucléées enrichies en 12(S)-HETE et stimulées par la Con A pourraient

expliquer une mauvaise transmission des signaux d'activation.

175

CCOONNCCLLUUSSII OONNEETT

PPEERRSSPPEECCTTII VVEESS

176

L'activation antigénique ou mitogénique des lymphocytes initie une séquence

ordonnée et complexe d'événements extra et intracellulaires, et les mécanismes intracellulaires

responsables de la transduction des signaux activateurs ne sont que partiellement élucidés.

L'étude de ces mécanismes, notamment ceux impliquant des médiateurs lipidiques, du fait de

l'intense métabolisme phospholipidique mis en oeuvre juste après stimulation mitogénique,

sont indispensables à une meilleure compréhension des phénomènes précoces de l'activation

lymphocytaire. D'autre part, il est bien établi maintenant qu'un taux élevé d'AMPc bloque la

réponse proliférative de différents types cellulaires, en particulier le lymphocyte, ce qui

suggère que l'hydrolyse des nucléotides cycliques par les phosphodiestérases (PDE) joue un

rôle capital dans la régulation et le contrôle de la prolifération.

Les travaux antérieurs de notre équipe ont montré que l'activation de lymphocytes murins ou

humains induit une hausse substantielle et rapide d'une isoforme particulière de PDE (type 4)

prépondérante dans les cellules lymphoïdes, cette stimulation contribuant vraisemblablement

à maintenir un taux faible d'AMPc lors des étapes précoces de l'activation. En outre, le PA est

capable de stimuler in vitro l'activité de cette même isoforme, sensible à la Con A, mimant

ainsi l'effet des mitogènes, d'où l'hypothèse d'un lien probable entre la hausse de PA et la

hausse d'activité PDE induites par les mitogènes.

Les résultats présentés dans ce travail ont contribué à étayer plus solidement cette hypothèse.

En effet, nous avons montré que la Con A augmente de manière significative la synthèse de

PA dans les cellules mononucléées dès les 5 premières minutes de stimulation et que cette

production de PA induite par la Con A se fait majoritairement par la voie classique PI-

PLC/DAG-Kinase. Ce résultat est important, car il est connu que cette voie de signalisation

conduit à des PA riches en espèces moléculaires comportant de l'acide arachidonique en

position sn-2. Or, ces PA sont précisément les plus actifs pour activer les PDE4 en système

acellulaire et ils sont connus également pour être beaucoup plus mitogènes que les PA saturés.

Les résultats antérieurs de l'équipe avaient montré une hausse d'activité PDE maximale après

10 à 30 minutes de stimulation par la Con A, et donc postérieure à la hausse de PA, suggérant

que l'augmentation de PA intracellulaire pouvait être directement ou indirectement

responsable de l'activation des PDE par les mitogènes.

Grâce à l'étude, en parallèle, de la production de PA, des activités PDE et des taux d'AMPc

induits par la Con A dans une même population cellulaire provenant d'un même donneur,

177

nous avons pu montrer qu'il existe une corrélation étroite entre les taux de PA et les activités

PDE. A la fois le PA formé par activation directe de la voie PLD dans les cellules stimulées

par le TPA, et le PA provenant de la voie PI-PLC/DAG-Kinase dans les cellules stimulées par

la Con A ou l'OKT3 peuvent être associés à une augmentation des activités PDE. De plus, les

drogues capables de diminuer la synthèse de PA, comme l'inhibiteur de DAG-Kinase R59022,

suppriment l'activation des PDEs dans les cellules, et inhibent également la réponse

proliférative des cellules à la Con A. L'activation précoce des PDEs dans les premières étapes

de la stimulation mitogénique se traduit par une baisse modeste mais significative du taux

intracellulaire global d'AMPc, ce qui n'exclut pas des variations plus importantes dans

certains compartiments subcellulaires. Tous ces résultats suggèrent que le PA est impliqué,

directement ou indirectement dans la régulation des activités PDE et que ce phénomène doit

avoir une importance physiologique au cours de l'activation lymphocytaire.

L'étude pharmacologique des différentes PDEs impliquées dans ce mécanisme a montré que la

PDE4, qui est la seule enzyme activable par le PA en système acellulaire, n'est pas la seule

cible des mitogènes dans la cellule. En effet, nous avons également observé une stimulation

de l'activité AMPc-PDE insensible au Rolipram, correspondant probablement à des PDE3 et

7, et une stimulation de l'hydrolyse du GMPc assurée en totalité par la PDE5 dans ces

cellules. Des études en système acellulaire, en cours dans notre laboratoire, indiquent que

parmi les différentes PDE4, seules les isoformes possédant un domaine supplémentaire du

côté N-terminal sont sensibles à l'effet activateur du PA. Un effet direct du PA par des

interactions lipide-protéine, au niveau d'un site situé dans cette région N-terminale est donc

envisageable. Cependant, le mécanisme de cette activation reste encore à élucider. Des études

de mutagenèse dirigée visant à modifier spécifiquement le domaine N-terminal des PDE4

sensibles au PA devraient apporter des éléments de réponse.

Il est connu que l'activité de la plupart des PDEs, en particulier celle des PDE3, 4 et 5 peut

être modulée par phosphorylation/déphosphorylation. De plus, une isoforme particulière de

PKC, la PKCζ est stimulée préférentiellement par le PA, et ne répond pas au DAG et aux

esters de phorbol. Il serait donc intéressant de tester l'effet sur les activités PDE des différents

agonistes capables d'augmenter le PA, en présence d'inhibiteurs sélectifs des différentes

isoformes de PKC, et en particulier de la PKCζ.

Un autre résultat important de ce travail concerne l'effet du 12(S)-HETE sur la production de

PA dans les cellules mononucléées au repos ou activées par la Con A. Le 12(S)-HETE ayant

été décrit comme un inhibiteur de DAG-Kinase dans certains types cellulaires, nous avons

émis l'hypothèse qu'un enrichissement en 12(S)-HETE des phospholipides de cellules

mononucléées de témoins jeunes pouvait induire une diminution de la production de PA. Les

résultats obtenus sont en désaccord avec cette hypothèse, puisque nous avons démontré que

l'enrichissement en 12(S)-HETE provoque une augmentation de la synthèse de PA induite par

la Con A, par un mécanisme mettant en jeu l'activation d'une PLD. Nos résultats suggèrent

178

que la PLD activée par le 12(S)-HETE en présence de Con A est probablement différente de

la PLD activable par le TPA, puisque l'inhibiteur de PKC, Calphostine C n'a pas d'effet. Par

contre, cette PLD est sensible à l'inhibiteur de tyrosine-kinase, génistéine. Les expériences de

western-blotting utilisant un anticorps anti-phosphotyrosine suggèrent que le 12(S)-HETE

pourrait stimuler la tyrosine-phosphorylation d'une protéine particulière de masse moléculaire

44-50 KDa. Des expériences supplémentaires seront nécessaires pour identifier plus

précisément cette protéine. D'après les poids moléculaires estimés, il pourrait s'agir d'une

MAP-Kinase p44 ou d'une tyrosine-kinase particulière, la Csk 50. L'utilisation d'anticorps

spécifiques anti-MAP-Kinase ou anti-Csk 50 devrait permettre d'identifier cette protéine.

D'autre part, il serait très important d'identifier la ou les PLD exprimées dans les cellules

mononucléées humaines, et en particulier de déterminer si la PLD1 est présente dans ces

cellules. En effet, les données de la littérature décrivent que cette isoforme de PLD (type 1)

serait activée à la suite de la translocation vers la membrane des petites protéines G (Rho et/ou

ARF). Ainsi, l'enrichissement des cellules en 12(S)-HETE pourrait induire des modifications

membranaires favorisant la translocation des petites protéines G.

Enfin, les résultats obtenus en présence de suramine suggèrent que le 12(S)-HETE pourrait

agir de manière extracellulaire. Cette hypothèse est en bon accord avec les résultats antérieurs

de l'équipe montrant que du 12(S)-HETE est libéré dans le milieu extracellulaire quand des

cellules préalablement enrichies sont activées par la Con A. Les expériences de liaison du

12(S)-HETE et de compétition que nous avons effectuées sur des cellules mononucléées et

des lymphocytes T humains purifiés ont permis d'établir l'existence de sites de liaison de

faible affinité du 12(S)-HETE sur les cellules. D'autre part, l'étude de cette fixation en

présence toxine pertussique ou de GTPγS suggère que les sites de liaison du 12(S)-HETE

pourraient être couplés à une protéine G. La suramine est connue pour se lier de façon

préférentielle au récepteur du lyso-PA, et il serait possible que le 12(S)-HETE se fixe sur ce

récepteur. Des expériences de compétition en présence de lyso-PA, suivies d'une étude des

effets du 12(S)-HETE sur la production de PA dans des cellules surexprimant le récepteur au

lyso-PA permettraient d'approfondir cette étude sur le mécanisme d'action du 12(S)-HETE.

179

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FOLIO ADMINISTRATIF...........................................THESE SOUTENUE DEVANT L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON. ............. ...................... ................. ...................... ..................... ........ .................... ............ ...........................

NOM : ZAKAROFF epouse GIRARD

(avec precision du nom de jeune fille, le cas echeant)

Prenoms : Alexia

DATE de SOUTENANCE Doc’ll

cLYC

19112197

TITRE : REGULATIONS CROISEES ENTRE SIGNALISATION LIPIDIQUE EISIGNALISATION DEPENDANT DES NUCLEOTIDES CYCLIQUE; fc;A;L’ACTIVATION L Y M P H O C Y T A I R E : ROLE DE ,

PHOSPHATIDIQUE.

NATURE : Doctorat

Formation doctorale : BIOCHIMIE

Numero d’ordre : 97 ISAL

Zote B.I.U. - Lyon : T 50/210/19 I et bis CLASSE :

RESUME : L’activation mitogenique des cellules mononucleees de sang peripherique humain(PBMC) augmente la production d’acide phosphatidique (PA) et stimule l’activite phosphodiesterase(PDE) des nucléotides cycliques. De plus, en systeme acellulaire, le PA stimule directement l’activittPDE. L’effet mitogenique du PA pourrait done etre dQ a une activation des PDE conduisant a unediminution du taux intracellulaire d’AMPc, signal inhibiteur de la lymphoproliferation.

Ce travail montre que la lectine mitogenique Concanavaline A (Con A) augmente significativementla synthese de PA dans les PBMC des 5 min de stimulation, majoritairement par la voie PI-PLC/DAG-Kinase. D’autre part, l’etude en parallele de la production de PA, des activites PDE et des taux d’AMPcinduits par differents mitogenes dans une population cellulaire issue d’un meme donneur montre qu’ilexiste une correlation Ctroite entre les taux de PA et les activites PDE. De plus, les drogues diminuant lasynthese de PA suppriment l’activation des PDE et la reponse proliferative des cellules aux mitogenes.Enfin, les taux d’AMPc sont modestement, mais significativement diminuts en reponse aux mitogenes.

Le lien entre PA et reponse mitogenique a aussi ete etudie dans un modele experimental mimantune situation physiologique particuliere : le vieillissement. 11 s’agit de PBMC enrichies en 12-HETE,derive monohydroxyle issu de l’acide arachidonique par la voie 12-lipoxygenasique, caracterides parune reponse proliferative diminuee. Le 12-HETE &ant d&-it comme un inhibiteur de DAG-Kinase,notre hypothese ttait qu’il pouvait diminuer les taux de PA. Au contraire, nous avons montre unesynthbe accrue de PA, par un mecanisme impliquant l’activation d’une PLD. De plus, cette activation nedepend pas de PKC, met en jeu des tyrosine-phosphorylations, et probablement des sites de liaison du12-HETE de faible affinite, couples B une proteine G.

MOTS-CLES :

Lymphocyte, Acide phosphatidique, Phosphodiesterase, Nucleotide cyclique,

Phospholipase D, 12-HETE.

Laboratoire (s) de recherches : Laboratoire de Biochimie et Pharmacologic , INSERM U352, Bat. 406

20, av. A. Einstein, 69621 VILLEURBANNE CEDEX

Directeur de these : Annie-France PRIGENT

President du jury :

Composition du jury : GENY Blandine - LAGARDE Michel - NEMOZ Georges - PRIGENT

Annie-France - SAULNIER-BLACHE Jean-Sebastien - SETTE Claudio.

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