Thèse - essai pdf

UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS

DE TOURS

ÉCOLE DOCTORALE Santé Sciences et Technologies

INSERM U966 Morphogenèse & Antigénicité du VIH et des virus des hépatites

THÈSE présentée par :

Marion DEPLA

soutenue le : 27 septembre 2011

pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université François - Rabelais Discipline : Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité : Virologie

MODÉLISATION IN VITRO ET ÉTUDE BIOCLINIQUE DE LA STÉATOSE INDUITE PAR LE VIRUS DE L’HÉPATITE C

THÈSE dirigée par

Pr Philippe ROINGEARD

JURY :

M GUYADER Dominique PU-PH, Université de Rennes 1 Président du jury M DELERS François MCU-PH, Université Pierre&Marie Curie,Paris Rapporteur M WYCHOWSKI Czeslaw DR CNRS, Institut de Biologie de Lille Rapporteur M LERAT Hervé IGR, Université de Paris Est Examinateur M ROINGEARD Philippe PU-PH, Université François Rabelais,Tours Directeur de thèse

Remerciements

« On a beau chercher on ne trouve jamais que soi même » Anatole France.

Au-delà de l’aventure scientifique, c’est une véritable aventure humaine qu’il m’a été donné

de vivre à vos côtés. C’est sans nul doute une des parties les plus dures à rédiger de ma

thèse, où cette fois-ci ce n’est pas la raison qui guide mes mots. Ce n’est donc pas sans

émotions que j’écris ces quelques lignes pour vous remercier.

Philippe, merci de m’avoir fait confiance et de m’avoir fait une place au sein de ton équipe.

Tu t’es toujours rendu disponible pour moi tout au long de ma thèse sans compter tes heures

à parler avec moi de « mes gouttelettes », tu as toujours su me guider et m’épauler pour

mener à bien mes projets. C’est quotidiennement que tu nous pousses à nous dépasser, moi

en tant que ta thésarde bien sur, mais tous autant que nous sommes au labo. Merci à toi de

m’avoir permis de présenter mes travaux en congrès et de les publier. Mais par dessus tout

merci d’être un chef humain à l’écoute de nos problèmes et nos besoins, qui jongle avec nos

caractères si différents. Les futurs étudiants ont bien de la chance de t’avoir à leur côté.

Enfin merci d’avoir constitué cette équipe dynamique et soudée…J’ai souvent entendu que

dans sa carrière il y a LE labo, celui où l’on dit « je vais au labo » comme on dirait « je vais

à la maison ». C’est l’impression que j’avais…merci pour ça.

Merci au Professeur Dominique Guyader d’avoir accepté de juger mon travail en présidant mon

jury de thèse. Merci à Monsieur François Delers et Monsieur Czeslaw Wychowski d’avoir

accepté d’être les rapporteurs de mes travaux.et à Monsieur Hervé Lerat d’en être

l’examinateur. Honorée d’être jugée par mes pairs, c’est avec un grand intérêt que j’attends

de discuter avec vous de ce travail.

Alain, mon binôme préféré pour aller aux poubelles. Merci de m’avoir apporté ton aide sur le

projet virostéatose, tu mérites amplement le titre de Dr ès Séquençage. Promis je dirais pas

aux autres que c’est toi le Père Noël et que des fois tu mets une ceinture de ninja pour nous

faire rire (ou soulager ton dos je sais plus)

Alexis et Audrey, la relève plus motivée que jamais et bourrée d’humour.décalé Alexis je crois

que tu es le seul à comprendre mon penchant pour les grands nains de jardins et la

royauté…merci pour ça ! Merci pour les moments et les rires partagés avec vous cette année.

Amélie, j’ai apprécié nos longues discussions cherchant à marier inlassablement statistique et

recherche. Merci à toi pour ton efficacité et ton aide précieuse.

Anne, discrète et si forte. L’amitié que l’on a construite est durable et n’a fait que se

renforcer ces derniers temps. J’ai toujours été admirative de la volonté dont tu fais preuve

au quotidien au labo pour voir se réaliser tes projets. Ne perds pas cette qualité, même si des

fois c’est difficile. Te faire peur dans les couloirs et te rappeler le chemin des Halles va me

manquer…mais tu n’es pas à l’abri de me voir débarquer chez toi pour un petit barbeuk !

Christine, merci pour ton sourire au quotidien et merci d’avoir chaque année mis tant de cœur

dans l’organisation du téléthon. Y participer était important pour moi, merci de m’en avoir

donné l’opportunité.

Christophe et son « madame raplapla », merci à toi de m’avoir guidée au début de ma thèse

avec grande pédagogie, et merci (ou pas) de m’avoir familiarisé au doux monde du design de

primers !

Denys, merci d’être avec nous au quotidien là haut, d’être confronté à nos réels problèmes et

de nous rappeler « qu’à 14h tout doit être niquel ». Mais merci avant tout de remplir nos

yeux de joie chaque année avec ZE calendrier.accroché avec précaution dans notre bureau.

Elodie, c’est toujours avec beaucoup d’intérêt que j’écoutais tes conseils avisés, tes p’tits

trucs et astuces pour réussir au mieux les manips. Merci pour ça.

Eric, le plus grand fan de JP Madder, qu’il m’ait jamais été donné de rencontrer. Tu m’as

été d’une grande aide tout au long de ma thèse, à me conseiller et me guider au mieux dans

le monde lipidique. Merci pour tes conseils pour la rédaction de ce manuscrit. Et je sais bien

que les sessions d’ABBA dans le L3 vont te manquer !

Dear 똥, dear Eun Yeung, I’ll miss your laugh and your every day.good mood.Thanks for the

bird mascot “yu ku yuk yuk”. Thank you for being the only one to enjoy listening to

Nostalgia and sing with me!

Ma petite Laura, que es la más guapita, la más guapita !! Tu as été la première à m’accorder

ton amitié au détour d’une formation à la Rochelle J’ai vécu à tes côtés des moments forts

et riches en émotions de ceux qui bâtissent une solide amitié. Tu es toujours là pour les

autres et surtout pour moi, c’est ton essence ça coule dans tes veines et dans celles de

Benito, merci de m’avoir toujours accueillie chez vous et conseillée J’ai hâte d’arroser avec de

la Sangria magique mon nouveau pied à terre en Touraine.

Loïc, je reste quelquefois perplexe sur la qualité de tes blagues, mais j’apprécie le point

d’honneur que tu mets à nous les raconter. Merci pour ces derniers moments à Vialle.

Ludo, merci de n’avoir pas compté ton temps pour m’aider dans la réalisation de mes

manips.très colorées Merci pour la « danse qui est à nous ».

Manue, ma petite kkuèt ! On en aura vécu des choses ensemble…des rires, des pleurs, du

grand n’importe quoi et des grandes joies. Toutes ces choses qui me donnent confiance dans

notre amitié et sa durée…tu sais une histoire de personne qui se compte sur les doigts de la

main. Au-delà de ça, le labo ne tournerait pas sans toi…tu es maligne, débrouillarde et rusée,

pour moi c’est ça la vraie intelligence, n’en doutes jamais. Toujours prête à dégainer l’attirail

de bricolo-bricolette pour nous aider…pour m’aider Jamais tu n’as compté tes heures à

m’écouter, m’épauler, me protéger. Tu m’as énormément apporté au quotidien au

labo…comme en dehors, je ne te remercierai jamais assez pour ça.

Pauline, Dr Ferraris, si généreuse et pêchue. La seule à transformer le sas du L3 en cabine

d’essayage, à lire les mails de Madame Carton à 2h du matin.et mettre un point d’honneur à

la visite de l’armoire à poudres Il faudrait t’inventer si tu n’existais pas…Ton amitié aussi

m’est chère et précieuse, et passera les frontières. J’ai adoré nos debriefs scientifiques (ou

pas), à refaire le monde et le cycle viral à la fois, à pleurer et rigoler de notre sort sur fond

« d’envie d’aimer ». Merci à toi d’avoir été là pour moi Dr Ferraris !

Romu, merci à toi pour tes conseils de vieux thésard ! Passer derrière toi n’était chose facile,

car ton empreinte est fortement ancrée au labo. Je te lègue mon manuel de décollage de

fusée à Vialle que tu appréciais tant.

Suzie, ma petite Zizie Pinguouin, être à tes côtés le 23 juillet 2011 pour témoigner de cet

évènement restera sans nul doute le point le plus fort de notre amitié. Je te vois évoluer,

t’affirmer et prendre confiance en toi tous les jours au labo, plus qu’admirative de ton

organisation et du parcours que tu as réalisé. Tu as toujours été là pour moi à me

comprendre sans avoir besoin de parler. J’ai adorée être ta voisine de bureau à partager nos

joies et nos peines. Au-delà de çà, tu es une source d’inspiration inépuisable de phrases chocs

et de situations rocambolesques, comme en témoigne notre mur de porte qui t’est en partie

dédiée ou les traces de cirage au fond du couloir! Pour tout ça, je te remercie.

Valentina, j’ai essayé mais j’arriverai jamais à retenir les quelques mots en italien qui traînent

sur un post-it ! Merci à toi de nous avoir fait bien rire à de nombreuses reprises dans ton

apprentissage du français. J’ai apprécié discuter avec toi dans notre bureau quand les

personnes se faisait rares au labo !

Vincent, le p’tit veinard. Entouré de toutes ces filles, tu devais te sentir bien heureux

(perdu…je sais plus ce qu’il faut dire). Tu manies la langue française avec brio toujours à

l’affût de jeux de mots improbables, à transformer les présentations PP en jeu de puissance 4

et à battre tous les records au QPUC. Merci pour tes imitations plus que réalistes « J’ai

tout… ». J’ai adoré te faire peur dans le L2 et écouter la BO de la petite maison dans la

prairie dans votre labo.

Virginie, la douce Virginie. J’aime savoir que tu as trouvé ton bonheur à Lyon et que c’est la

vie que tu souhaitais menée. Mais saches qu’ici tu m’as manqué, tu nous as manqué. Le trio

des filles de Vialle quoi ! Tu es la première à avoir pris du temps pour moi et à m’avoir fait

découvrir Tours by night…un vendredi en sortant du labo. Merci pour ça !

Wootichai, un chanteur, un danseur. Tu as de multiples facettes qui m’ont fait t’apprécier.

Toujours un sourire accroché à tes lèvres, c’était très agréable de maniper avec toi et de

discuter guitare !

Samia & Floriane, nos chemins se séparent souvent au-delà des frontières. Cela ne nous a pour

l’instant jamais empêché de garder contact, je pense même que ça renforce notre amitié.

Merci d’avoir toujours répondues présentes à mes côtés dans les bons comme dans les mauvais

moments.

Nadine & Sarah, l’administration et moi ça fait deux, heureusement vous étiez là. Merci à

vous deux d’avoir tour à tour veillé sur nous pour que nos thèses se passent au mieux. Vous

avez été d’une grande aide. Nadine, merci à toi pour les clafoutis aux cerises et les randos

téléthon…L’âge c’est dans la tête tu le sais, ça tombe bien car toi tu as 30 ans et tu

débordes d’énergie ! Merci à toi pour ça.

Un grand merci aussi aux filles de microscopie, qui m’ont souvent vu envahir leurs locaux avec

« mes gouttelettes » ou « mes patients ». Merci à Brigitte, Monique, Claude, Isabelle,

Fabienne et Juliette qui m’ont aidé de près ou de loin à la réalisation de mes projets et

m’ont toujours soutenu et encouragé. Un énorme merci aussi à Marie, toujours un sourire aux

lèvres et prête à discuter avec moi de tout et de rien et surtout prête à m’écouter, ton

aide sur le projet virostéatose a été plus que précieuse, merci de m’avoir fait de la place à

tes côtés pour mener à bien mes projets.

Sylvie, aujourd’hui je soutiens ma thèse et tu manques cruellement à l’appel. Sans toi, le

projet virostéatose n’aurait pas pu aboutir. C’est ta voix que j’entends encore dans les

couloirs me demander comment ça se passe pour moi et me dire quel foie tu venais de couper.

Tu laisses un grand vide là haut, tu laisses un grand vide tout court. Merci à toi.

Merci aussi aux garçons de microscopie, Pierre-Yves, Rustem, Pierre-Ivan et Julien. Vous

m’avez initié au monde merveilleux de la microscopie et vous m’avez aidé à de maintes

reprises tout au long de ma thèse. sans sourciller. Merci de m’avoir fait une place dans la

grotte au MET et dans la famille microscopie.

Merci enfin à Manue B, Martine, Catherine, Tanawan, Francis, Alain G, Jean-Christophe M,

Jean-Christophe P, Antoine, Jack qui ont aussi su m’aidé et me guider au cours de ma thèse.

Comment vous oubliez, vous le Comité CHG, Sandra, Noémie, Delphine, Mathilde, Hubert,

Caro, Mumu et Cédric. J’aime à dire que CHG est ma 2ème maison…et c’est une 2ème famille

que j’ai trouvé là bas. Un réel exutoire, un passage obligé en sortant du labo, une bande

d’amis totalement déjantés mais tellement présents quand il fallait…J’ai adoré être votre

« Madame La Présidente » pendant toute cette année, partager avec vous rires et pleurs,

mais surtout RIRE, rire de nous et rire de tout. Merci à vous d’avoir été là.

Mes fidèles amies, Axelle, Bérangère, Betty, Delphine, Laurence, Tiana et Yaëllle, on en a fait

du chemin depuis les bancs du lycée et les cours de Mr Meyer. Qui aurait cru qu’en

remplissant nos fiches de présentation à la rentrée scolaire, 10 ans plus tard on aurait toutes

réussi à faire ce qu’on voulait ? Moi j’y ai toujours cru. Merci à vous d’avoir été là dans les

étapes importantes de ma vie et merci encore d’être là aujourd’hui.

Ma Clémence, ma Marine et ma Marie-Amélie. Impossible de chiffrer le nombre d’heures

passées avec vous à discuter de tout et de rien, de nos vies et de nos envies. Vous êtes des

amies fidèles, là pour moi jour et nuit dans les bons et les mauvais moments, vous savez tout

de moi. Merci à vous d’être vous.

Merci à ma famille qui a toujours su me booster et me redonner confiance en moi. Merci

d’avoir cru en moi et mes projets. Romain, merci de m’épauler et de délirer avec moi, même

si aujourd’hui des kilomètres nous séparent.

Papa, Maman, vous savez comme il a toujours été difficile pour moi de faire le moindre choix.

Vous nous avez toujours donné l’opportunité à Romain et à moi de nous réaliser, sans

compter les heures à nous guider, à nous rassurer sur nos décisions, à nous aimer. C’est sans

nul doute grâce à vous que nous sommes heureux aujourd’hui et que nos projets aboutissent.

Sans vous je n’aurais pas fait le choix de partir sur Tours…pourtant un des meilleurs choix que

j’ai eu à faire jusqu’à aujourd’hui. Merci.

1

Résumé L’infection par le virus de l’hépatite C (HCV) est une cause fréquente de maladie chronique

du foie. Le risque de carcinogenèse augmente si les patients développent une cirrhose ou une fibrose

importante. La cirrhose viro-induite constitue certainement un élément prépondérant dans ce

processus, mais le mécanisme reste mal connu. On suspecte cependant un rôle majeur de certaines

protéines virales dans la survenue d’un hépatocarcinome. Il reste donc pertinent d’étudier les

mécanismes initiant cette cirrhose hépatique. Lors de l’infection, le HCV va détourner et modifier à

son profit le métabolisme de la cellule hôte et notamment le métabolisme lipidique très actif dans le

foie. Ainsi l’infection chronique in vivo est caractérisée dans plus de 50% des cas par une

accumulation excessive de lipides sous forme de gouttelettes lipidiques (GL) dans les hépatocytes

induisant la stéatose hépatique. Chez l’individu chroniquement infecté stéatose métabolique et virale

peuvent ainsi co-exister. La part réellement imputable au virus dans l’établissement de la stéatose reste

donc très difficile à évaluer. De plus le rôle précis, direct ou indirect des différentes protéines virales

dans l’établissement des plates formes de réplication, d’assemblage et de sécrétion des particules

virales reste encore à déterminer. L’accumulation de GL qui est observée in vivo et dans de nombreux

modèles cellulaires in vitro semble être au cœur des mécanismes d’assemblage de la particule virale et

de la pathogenèse liée à l’infection.

L’objectif de ce travail de thèse était de comprendre comment le HCV pouvait induire une

telle accumulation de GL et d’étudier l’impact de la variabilité du virus sur l’intensité de ce

phénomène.

Nous avons tout d’abord développé une étude fondamentale in vitro qui nous a permis, en

analysant qualitativement et quantitativement ces regroupements de GL, de conforter l’idée qu’au

moins une des protéines virales, la protéine de capside, en détournant les GL, est directement

impliquée dans l’établissement de la stéatose hépatique. De plus, les éléments originaux que nous ont

apportés ces travaux nous ont amené à proposer un modèle de la dynamique des GL au sein d’une

cellule.

L’approche bio-clinique que nous avons ensuite présentée s’inscrivait dans la continuité de ce

travail in vitro et visait à vérifier l’impact de la variabilité du HCV sur la stéatose viro-induite in vivo.

Une analyse morphométrique des GL ne nous a pas permis d’établir d’association entre l’intensité de

la stéatose et la nature du génotype. De plus, notre étude a montré que la variabilité qui est plus ou

moins observable au sein des protéines de capside et NS5A du HCV semble avoir un effet mineur sur

la sévérité de la stéatose hépatique in vivo. Nous pensons que les facteurs propres à l’hôte

prédomineraient pour définir et moduler l’intensité de la stéatose viro-induite.

Mots clés : virus de l’hépatite C, stéatose hépatique, gouttelettes lipidiques

2

Abstract Hepatitis C Virus (HCV) infection is a major cause of chronic liver disease. The risk of

carcinogenesis increases when patients develop cirrhosis or significant fibrosis. Virus-induced

cirrhosis constitutes a major element in this process, but the associated mechanisms remains unclear.

However, a direct role of some viral proteins in the development of hepatocellular carcinoma is also

suspected. It is therefore relevant to study the mechanisms initiating the hepatic fibrosis and cirrhosis.

Upon infection, HCV will hijack and modulate the host cell metabolism, including the lipid

metabolism which is particularly active in the liver. In vivo chronic infection is characterized in more

than 50% of infected individuals by an excessive accumulation in hepatocytes of triglycerides in the

form of lipid droplets (LD), inducing steatosis. In chronically infected individuals, metabolic and

virus-induced steatosis can co-exist. Thus, it remains very difficult to assess the part related to the

virus in the development of steatosis. In addition, the precise role of the different viral proteins in the

establishment of replication, assembly and secretion of virus particles remains to be determined. LD

accumulation which is observed in vivo and in many in vitro cell models seems to be important for the

assembly mechanisms of the viral particle and for the viral pathogenesis.

The aim of this thesis was to understand how HCV could induce such LD accumulation and to

study the impact of the viral variability on this phenomenon intensity.

We first developed an in vitro study to analyze qualitatively and quantitatively the LD

clustering. Our study confirmed that at least one viral protein, the capsid protein, is directly involved

in the development of steatosis by hijacking LD. In addition, our study led us to propose a model for

the intracellular LD dynamics.

We then developed a bio-clinical study to analyze the impact of HCV variability on the virus-

induced steatosis in vivo. We performed a morphometric analysis of the LD encountered in the liver

tissue of chronic HCV carriers to precisely quantify their steatosis. We did not find any association

between the degree of steatosis and the nature of the viral genotype. Our study suggests that the

variability which is more or less observable in the capsid and NS5A proteins appears to have a minor

effect on the severity of steatosis in vivo. We conclude that individual host factors seem to play a

much greater role than viral factors in the development and severity of the HCV-induced steatosis.

Keywords: hepatitis C, steatosis, lipid droplets

3

Table des matières

Introduction

I) L’hépatite C...................................................................................................................... 10

A. Découverte ................................................................................................................... 10

B. Epidémiologie .............................................................................................................. 10

C. Modes de transmission ................................................................................................. 11

D. Evolution pathologique ................................................................................................ 12

1. Hépatite aiguë........................................................................................................... 12

2. Hépatite chronique ................................................................................................... 12

E. Thérapies ...................................................................................................................... 13

1. Thérapies actuelles ................................................................................................... 13

2. Thérapies en cours d’expérimentation ..................................................................... 14

3. Thérapies vaccinales ................................................................................................ 15

II) Le virus de l’hépatite C .................................................................................................... 16

A. Taxonomie.................................................................................................................... 16

B. Structure de la particule virale ..................................................................................... 17

C. Organisation génomique .............................................................................................. 17

1. Les extrémités non codantes .................................................................................... 18

a) L’extrémité 5’ non codante (5’UTR) ................................................................... 18

b) L’extrémité 3’ non codante (3’UTR) ................................................................... 19

2. La partie codante ...................................................................................................... 19

a) Les protéines structurales ..................................................................................... 20

(1) La protéine de capside C .............................................................................. 20

(2) Les protéines d’enveloppe E1 et E2............................................................. 23

b) Les protéines non structurales .............................................................................. 24

(1) La protéine p7............................................................................................... 24

(2) La protéine NS2 ........................................................................................... 25

(3) Le complexe NS3/4A................................................................................... 26

(4) La protéine NS4B......................................................................................... 27

(5) La protéine NS5A......................................................................................... 27

(6) La protéine NS5B......................................................................................... 29

3. La protéine F ou ARFP ............................................................................................ 30

D. Variabilité génomique .................................................................................................. 30

4

E. Cycle infectieux............................................................................................................ 32

1. Attachement et entrée............................................................................................... 32

a) Les facteurs d’attachement................................................................................... 32

(1) Les glycosaminoglycanes............................................................................. 32

(2) Les lectines................................................................................................... 32

(3) Le rôle des lipoprotéines .............................................................................. 33

b) Les récepteurs....................................................................................................... 33

(1) Le récepteur aux LDL .................................................................................. 33

(2) Le récepteur scavenger SR-BI......................................................................33

(3) La tétraspanine CD-81 ................................................................................. 34

(4) La protéine claudine-1.................................................................................. 34

(5) La protéine occludine ................................................................................... 34

c) Modèle d’entrée du virus...................................................................................... 34

2. Traduction et maturation .......................................................................................... 35

3. Réplication ............................................................................................................... 36

4. Assemblage et sécrétion ........................................................................................... 36

F. Modèles d’étude ........................................................................................................... 38

1. Les modèles in vivo.................................................................................................. 38

a) Les primates ......................................................................................................... 38

b) Les rongeurs ......................................................................................................... 39

2. Les modèles in vitro ................................................................................................. 40

a) Les cultures primaires et les lignées immortalisées ............................................. 40

b) Le modèle réplicon............................................................................................... 40

c) Le modèle des virus-like particle (VLP et système SFV).................................... 41

d) Le modèle des pseudoparticules virales (HCVpp)............................................... 42

e) Le modèle en culture cellulaire (HCVcc) ............................................................43

f) Le modèle HCVpc................................................................................................ 43

III) Virus de l’Hépatite C et métabolisme lipidique............................................................... 44

A. Le métabolisme lipidique............................................................................................. 44

1. Synthèse et dégradation lipidique ............................................................................ 44

a) Lipogenèse : synthèse des acides gras.................................................................. 44

b) Synthèse des triglycérides (TG) ........................................................................... 44

c) Métabolisme des lipides ....................................................................................... 45

d) Régulateurs transcriptionnels de la lipogenèse et la lipolyse............................... 46

5

(1) Les protéines de la famille des PPAR .......................................................... 46

(2) Le facteur SREBP-1c ................................................................................... 46

(3) Le facteur ChREBP...................................................................................... 46

(4) Le récepteur LXR......................................................................................... 47

2. Le transport des lipides ............................................................................................ 48

a) Structure et classification ..................................................................................... 48

b) Le métabolisme des lipoprotéines ........................................................................ 49

(1) La voie exogène ........................................................................................... 49

(2) La voie endogène : synthèse des VLDL....................................................... 50

(3) La voie inverse : la voie de retour du cholestérol ........................................ 51

3. Les gouttelettes lipidiques........................................................................................ 52

a) Structure et composition des GL.......................................................................... 52

b) Fonction des GL................................................................................................... 54

c) Biogenèse et croissance........................................................................................ 55

(1) Modèles de biogenèse .................................................................................. 55

(2) GL et membranes du RE : une relation étroite ? .......................................... 57

(3) GL : des organites dynamiques .................................................................... 60

d) GL et synthèse des VLDL.................................................................................... 60

B. Syndrome métabolique associé au HCV...................................................................... 61

1. Données cliniques .................................................................................................... 61

2. L’insulino-résistance et le diabète de type 2 ............................................................ 62

a) Insulino-résistance métabolique........................................................................... 62

b) Insulino-résistance viro-induite............................................................................ 63

3. La stéatose hépatique ............................................................................................... 64

a) Histologie ............................................................................................................. 64

b) Stéatose métabolique............................................................................................ 65

(1) Insulino-résistance : cause ou conséquence ? .............................................. 66

(2) Assemblage et sécrétion des VLDL............................................................. 67

(3) ß-oxydation mitochondriale ......................................................................... 67

c) Stéatose viro-induite............................................................................................. 68

(1) Variabilité génotypique et stéatose .............................................................. 68

(2) Stéatose et polymorphismes génétiques chez l’hôte .................................... 69

(3) Stéatose et évolution de la maladie .............................................................. 69

(4) Le rôle de la protéine de capside.................................................................. 71

6

(5) Le rôle de la protéine NS5A......................................................................... 75

(6) Le rôle des autres protéines du HCV ........................................................... 75

C. Cycle viral du HCV et métabolisme lipidique : modèle .............................................. 77

1. Protéine de capside et accumulation de GL ............................................................. 77

2. Protéine NS5A, GL et assemblage viral................................................................... 78

3. GL et enveloppement des nucléocapsides................................................................ 78

4. VLDL et sécrétion des particules virales ................................................................. 79

Objectifs du travail 81

Résultats & Discussion 85

I) Etude in vitro des regroupements de gouttelettes lipidiques induits par le virus de

l’hépatite C. Impact sur la biogenèse des gouttelettes lipidiques............................................. 86

II) Étude bio-clinique VIRO-STÉATOSE : impact de la variabilité du virus de l’hépatite C

sur la stéatose hépatique......................................................................................................... 112

Conclusions & Perspectives 153

Bibliographie 159

7

Liste des figures & tableaux

Figure 1 : Prévalence mondiale de l’infection par le HCV ..................................................... 11

Figure 2 : Evolution clinique de l’infection par le HCV.......................................................... 13

Figure 3 : Famille des Flaviviridae ......................................................................................... 16

Figure 4 : Structure de la particule virale ............................................................................... 17

Figure 5 : Organisation génomique du HCV........................................................................... 18

Figure 6 : Structures et associations membranaires des protéines structurales et non

structurales du HCV................................................................................................................. 19

Figure 7 : Immunomarquage de la protéine de capside sur une biopsie de foie de chimpanzé

infecté par le HCV.................................................................................................................... 21

Figure 8 : Schéma de la maturation de la protéine de capside et de son adressage aux

gouttelettes lipidiques............................................................................................................... 22

Figure 9 : Répartition mondiale des différents sous types du HCV......................................... 31

Figure 10 : Modèle d’entrée du HCV ...................................................................................... 35

Figure 11 : Représentation schématique du cycle infectieux du HCV.....................................38

Figure 12 : Modèle chimère SFV-HCV.................................................................................... 42

Figure 13 : Schéma récapitulatif de la synthèse et la dégradation des lipides ainsi que de leur

régulation. ................................................................................................................................ 47

Figure 14 : Schéma d’une lipoprotéine.................................................................................... 48

Tableau 1 : Classification des lipoprotéines............................................................................ 49

Figure 15 : Représentation schématique de l’assemblage des VLDL ..................................... 51

Figure 16 : Schéma récapitulatif du métabolisme des lipoprotéines....................................... 52

Figure 17 : Structure schématique d’une gouttelette lipidique................................................ 53

Figure 18 : Modèle de biogenèse des gouttelettes lipidiques. ................................................. 57

Figure 19 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes

lipidiques, hypothèse d’une association constante .................................................................. 59

Figure 20 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes

lipidiques, hypothèse d’une dissociation.................................................................................. 60

Figure 21 : Formation des gouttelettes lipidiques et synthèse des VLDL. .............................. 61

Figure 22 : Schéma récapitulatif de l’impact du syndrome d’insulino-résistance sur le

métabolisme lipidique. ............................................................................................................. 63

Figure 23 : Caractères histopathologiques de la stéatose....................................................... 65

Figure 24 : Impact du HCV sur l’insulino-résistance et la stéatose viro-induite.................... 76

9

Introduction

10

I) L’hépatite C

A. Découverte

Jusque dans les années 70, les cas d’hépatites post-transfusionnelles rapportées lors d’études

épidémiologiques menées chez l’homme étaient considérés comme la conséquence de deux

agents viraux : le virus de l’hépatite A (HAV) et le virus de l’hépatite B (HBV). Néanmoins,

un nombre important de nouveaux cas d’hépatites n’était pas associé à l’infection par ces

deux virus et furent ainsi nommées hépatites « non A-non B ». En 1989, les avancées

majeures faites en biologie moléculaire, ont permis à l’équipe de Michael Houghton

d’identifier l’agent responsable de ces hépatites: le virus de l’hépatite C (HCV) (Choo et al.,

1989). En 2000, ces découvertes furent récompensées par le Prix Laske pour la recherche

médicale.

B. Epidémiologie

L’infection chronique par le HCV, qui touche entre 130 à 170 millions de personnes dans le

monde soit 3% de la population mondiale, (W.H.O, 1999) est une cause majeure de cancer du

foie ou hépatocarcinome. La prévalence de l’infection varie suivant les régions géographiques

(Figure 1). On distingue ainsi trois zones : une zone d’endémicité élevée (prévalence

supérieure ou égale à 2%) correspondant aux pays en voie de développement tels que certains

pays d’Asie ou d’Afrique, dont l’Egypte où la prévalence la plus forte a été observée avec

22% de la population infectée ; une zone d’endémicité faible (prévalence inférieure à 1%)

regroupant des pays industrialisés tels que certains pays d’Europe du Nord dont le Royaume

Uni et la Scandinavie où les prévalences les plus faibles ont été observées (0,01-0,1%) ; et une

zone d’endémicité moyenne dont la France fait partie avec en moyenne 1,1% de la population

infectée (environ 360 000 personnes en France) (Shepard et al., 2005); (Alter, 2007),

http://www.invs.sante.fr). Dans certains pays, notamment au Japon et en Europe du Sud,

l’infection par la HCV est la cause principale d’hépatocarcinome, identifiée chez plus de 70%

des malades atteints de ce cancer. L’augmentation de l’incidence globale d’hépatocarcinome

observée actuellement dans les pays occidentaux et au Japon est attribuée d’une part à

l’importance du nombre de malades qui ont été infectés par le HCV dans les années 1970 et

11

qui arrivent maintenant à un stade avancé de la maladie, et d’autre part à la meilleure prise en

charge des malades atteints de ces pathologies (Trinchet & Beaugrand, 1999). En France, plus

du tiers des personnes infectées par le HCV ignore son statut sérologique. En 2009 un plan de

lutte sur trois ans a été lancé par le comité stratégique du Programme National Hépatites

Virales, visant notamment à renforcer le dépistage et à améliorer la surveillance et les

connaissances épidémiologiques. Aujourd’hui, un des enjeux majeurs est de développer des

tests de dépistage rapides, peu coûteux et moins invasifs (DeWeerdt, 2011).

Figure 1 : Prévalence mondiale de l’infection par le HCV (Alter, 2007)

C. Modes de transmission

Le HCV se transmet principalement par le sang. Jusqu’au début des années 90, la transfusion

sanguine, ou la transplantation d’organes constituaient les causes principales d’infection.

Avec l’essor en 1992 d’un dépistage efficace et systématique du HCV, le risque de

contamination par voie sanguine a considérablement diminué. De nos jours, d’autres pratiques

sont également à risque telle que l’usage de drogues par voie injectable ou nasale, principal

mode de contamination dans les pays industrialisés (Roudot-Thoraval, 2002). La transmission

nosocomiale par utilisation de matériel mal désinfecté et l’exposition professionnelle

accidentelle ont aussi été décrites. Enfin les transmissions pas voie sexuelle, périnatale ou

familiale ne sont pas clairement définies et restent rares. Dans 20% des cas, le mode de

contamination demeure inconnu.

12

D. Evolution pathologique

1. Hépatite aiguë

Après la contamination par le HCV, et une période d’incubation allant de 4 à 12 semaines,

survient la phase aiguë de l’infection. Dans 80% des cas cette phase est asymptomatique.

Néanmoins une minorité de patients développe des signes cliniques transitoires tels que :

fatigue, nausée, état pseudo grippal, ictère cutanéo-muqueux. Le diagnostic d’hépatite aiguë

est donc rarement établi et repose essentiellement sur la détection du génome viral 1 à 3

semaines après la contamination, ainsi que l’élévation des transaminases sériques. L’hépatite

sévère ou fulminante reste quant à elle rare. La guérison de l’infection aiguë est définie par

l’absence durable de l’ARN viral dans le sang. Environ 15% des sujets infectés vont éliminer

spontanément le virus, mais pour les 85% restants, l’infection va évoluer vers la chronicité.

2. Hépatite chronique

L’infection chronique est définie par la persistance du génome viral dans le sérum plus de six

mois après la phase aiguë. Elle est généralement asymptomatique ou présente des symptômes

peu spécifiques d’une hépatite (fatigue, anorexie, nausée, douleurs) ce qui explique la

difficulté d’établir un diagnostic à ce stade de la maladie. L’orientation clinique repose donc

sur la détection du génome viral, l’apparition d’anticorps dirigés contre le virus et l’élévation

des transaminases dans le sang des personnes infectées. Le diagnostic peut être complété par

une analyse histologique qui va permettre d’évaluer la gravité de l’atteinte hépatique par une

mesure du score d’activité inflammatoire et de lésions du foie (fibrose) (score METAVIR),.

Ce diagnostic établi sur une biopsie de foie, permet de distinguer l’activité inflammatoire

(Score A de 0 à 3) de l’étendue de la fibrose (Score F de 0 à 4) (Bedossa & Poynard, 1996). Il

existe aussi d’autres techniques complémentaires plus récentes et non invasives telles que

l’élastométrie (Fibroscan) (Sandrin et al., 2003) ou l’évaluation des marqueurs sériques de

fibrose (Fibrotest) (Imbert-Bismut et al., 2001). L’hépatocarcinome se développe après 20 à

40 ans de portage chronique du virus, et le risque augmente si les patients développent une

cirrhose ou une fibrose importante liée à cette infection chronique (Figure 2). L’évolution de

la maladie hépatique est en réalité très variable selon les individus (cf paragraphe III) B. 3.

c)). Ce risque peut être majoré si d’éventuels co-facteurs sont associés, tels que l’âge lors de

l’infection, le sexe, la co-infection par le virus de l’hépatite B (HBV), le virus de

l’immunodéficience humaine (HIV) ou une consommation importante d’alcool (Vaquer et al.,

13

1994). Ainsi en France en 2009, les personnes infectées par le HCV étaient principalement

des hommes (62%), significativement plus jeunes (âge médian : 45 ans) que les femmes (âge

médian 52 ans) (http://www.invs.sante.fr). De plus, la cirrhose prolongée et l’hépatocarcinome

liés à l’infection représentent la première cause de transplantation hépatique en France

(Duclos-Vallée et al., 2009).

Figure 2 : Evolution clinique de l’infection par le HCV

E. Thérapies

Plus de 2,4% des décès mondiaux sont dus à des cirrhoses ou des hépatocarcinomes (W.H.O.,

2002) dont une grande partie fait suite à des infections par le HCV ou le HBV. Dans ce

contexte, le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques curatives et d’un vaccin

prophylactique se révèlent être un réel enjeu de santé publique. Plusieurs molécules

thérapeutiques sont ainsi déjà disponibles pour les personnes chroniquement infectées par le

HCV, et de nombreuses autres sont en cours de développement.

1. Thérapies actuelles

Les traitements curatifs actuels reposent sur l’association d’interféron α pégylé (IFN-α) et de

la ribavirine. L’interféron est une molécule antivirale qui va conduire à la diminution de la

charge virale, l’induction d’un état antiviral dans les cellules non-infectées, une augmentation

de la lyse des cellules infectées et une inhibition de la fibrogenèse hépatique (Feld &

Hoofnagle, 2005). La pégylation de l’interféron améliore sa biodisponibilité et par conséquent

INFECTION HCV

CIRRHOSE

20%

HEPATOCARCINOME

4 %

HEPATITE AIGUE

Sexe masculinHIV+HBV+

Age > 40 ans

4 à 12semaines

GUERISON

15 % 85 %

HEPATITE CHRONIQUE

Alcool > 50g/j

14

son action antivirale. La ribavirine est une molécule dont le mécanisme d’action contre le

HCV n’est pas clairement défini. La ribavirine n’aurait qu’une faible action antivirale, mais

exercerait plutôt un effet immunomodulateur de l’interféron quand elle y est couplée.

(Pawlotsky, 2005); (Thomas et al., 2010). Le traitement est indiqué chez les porteurs

chroniques présentant une atteinte hépatique modérée (Score Métavir A1F2) et des anomalies

persistantes aux tests virologiques. Il consiste classiquement en l’injection hebdomadaire

d’IFN-α et de ribavirine pendant 24 à 48 semaines, le but étant idéalement de ne plus détecter

l’ARN viral sérique (rémission prolongée). L’efficacité de cette bithérapie n’est pas la même

chez tous les sujets infectés (facteurs liés à l’hôte, à l’avancée de la maladie hépatique et au

virus). C’est un traitement coûteux, et l’apparition d’un certain nombre d’effets secondaires

indésirables (syndrome grippal, nausées, fatigue et dépression) peut entraîner un arrêt de ce

traitement chez certains patients. Il devient donc désormais nécessaire de développer de

nouvelles stratégies thérapeutiques mieux adaptées aux malades.

2. Thérapies en cours d’expérimentation

Une des stratégie envisagée est l’amélioration de la tolérance du traitement actuel. Deux

molécules font ainsi actuellement l’objet d’une étude clinique de phase III : l’Albuferon-α

(Laboratoire Human Genome Sciences) qui correspond à l’INF-α fusionné à l’albumine

humaine, lui conférant une demie vie plus longue que l’INF-α ; et la viramidine (Laboratoire

Valéant), précurseur de la ribavirine qui a un effet davantage ciblé sur le foie et qui serait

mieux tolérée à dose équivalente car dépourvue d’activité hémolytique. L’autre possibilité est

d’utiliser des inhibiteurs ciblant spécifiquement le HCV, ceci étant possible grâce aux

connaissances acquises ces dernières années sur le cycle viral du HCV (cf paragraphe II) E.)

et sur les différents systèmes d’études du virus (cf paragraphe II) F.). C’est le cas du

Telaprevir (VX-950) (Laboratoire Vertex) et du Boceprevir (SCH 503034) (Laboratoire

Merck) (inhibiteurs de la protéase) actuellement en essai clinique de phase III qui ciblent une

protéine virale à activité protéasique, nécessaire lors de la traduction et la maturation des

différentes protéines virales (cf paragraphe II) C. 2. b) (3)). Ces deux molécules en

combinaison avec le traitement standard semblent augmenter le taux de guérison tout en

réduisant le temps de traitement de moitié chez certaines personnes infectées, mais peuvent

aggraver les effets indésirables observés dans la thérapie standard (Gravitz, 2011); (Rice,

2011). D’autres molécules comme le R7128 (inhibiteur de la polymérase) (Laboratoire Roche

et Pharmasset) sont elles aussi en essai clinique de phase III, et ciblent une autre protéine

15

virale indispensable à la réplication du génome viral (cf paragraphe II) C. 2. b) (6)). De

nouvelles pistes sont actuellement envisagées comme l’utilisation d’antiviraux composés

d’acides nucléiques (oligonucléotides antisens, siRNA) ciblant diverses régions du génome

viral (Randall et al., 2003) (cf paragraphe II) C. 1. a)). Néanmoins, le fort potentiel

d’adaptation du virus conduit souvent à l’émergence de variants résistants aux différents

inhibiteurs et antiviraux. Une des approche alternative proposée est le développement de

multithérapies (Targett-Adams et al., 2011), Actuellement l’étude INFORM-1 est la première

à s’intéresser aux effets potentiellement synergiques d’une association d’un inhibiteur de

protéase et d’un inhibiteur de polymérase (AASLD pour American Association for the Study of

Liver Diseases, 2009). De même, des molécules ciblant les facteurs cellulaires impliqués dans

le cycle viral sont en cours d’essai clinique (EASL pour European Association Study Liver,

2009).

3. Thérapies vaccinales

Du fait du nombre important de personnes infectées par le HCV (3 millions de nouvelles

infections par an (WHO) du coût et de la toxicité des traitements actuellement proposés, la

recherche d’un candidat vaccin contre l’hépatite C s’avère très active. (Houghton &

Abrignani, 2005). Même si plusieurs candidats vaccins ont été proposés montrant des résultats

encourageants chez la souris et le chimpanzé, aucun n’a fait la preuve définitive de son

efficacité chez l’homme. Plusieurs vaccins à visée thérapeutique sont aussi à l’étude en phase

II chez l’homme (Yu & Chiang, 2010). D’autre part, l’utilisation de la vaccination en

complément des thérapies existantes dans l’idée d’améliorer leur efficacité a aussi été

proposée.

16

II) Le virus de l’hépatite C

A. Taxonomie

Le séquençage du HCV a permis de le classer dans la famille des Flaviviridae. Cette famille

regroupe quatre genres dont le genre Flavivirus (composé notamment du virus de la fièvre

jaune (YFV) et du virus de la dengue (DV), pathogènes pour l’homme et l’animal) et le genre

Pestivirus (dont font partie le virus de la peste porcine (CSFV) et le virus de la diarrhée

bovine (BVDV) qui infectent principalement les animaux d’élevage). Les virus hépatotropes

GB classés dans cette famille virale, appartiennent quant à eux au genre Pegivirus (Stapleton

et al., 2010) qui regroupe GBV-A, GBV-C et GBV-D (Epstein et al., 2010). Ces virus

présentent de forte homologie de séquence avec le HCV et peuvent infecter l’homme. Enfin le

genre Hepacivirus comprend le HCV et GBV-B et se distingue des autres genres par

l’organisation des protéines structurales (Choo et al., 1991); (http://www.ncbi.nlm.nih.

gov/ICTVdb/index.htm) (Figure 3).

Figure 3 : Famille des Flaviviridae. En jaune le genre Flavivirus, en bleu le genre Pestivirus, en rouge le genre Hepacivirus et en vert le genre Pegivirus. Le GBV-D récemment découvert n’apparaît pas sur cet arbre (Ferron et al., 2005).

17

B. Structure de la particule virale

Depuis sa découverte en 1989, seule une structure putative du virus a pu être établie, du fait

notamment de la faible quantité de virions circulants dans le sang des patients infectés. Par

analogie avec les autres virus de la famille des Flaviviridae, le HCV est classiquement décrit

comme un virus enveloppé, sphérique, contenant probablement une nucléocapside

icosaédrique d’environ 30nm de diamètre qui renferme le génome viral (Gastaminza et al.,

2010) (Figure 4). D’autre part, une séries d’études sur les sérums de patients infectés a permis

de mettre en évidence plusieurs structures de densité variable contenant le génome viral

(Bradley et al., 1991), (André et al., 2002), (Thomssen et al., 1993). D’après ces données, il

semble que les particules les plus infectieuses aient une densité comprise entre 1,09 et

1,11g/ml (Hijikata et al., 1993a). La faible densité de ces particules virales est liée à leur

association avec des lipoprotéines (André et al., 2002), nommées de ce fait les Lipo-Viro-

Particules (LVP). Cette association reflète l’interaction étroite entre l’assemblage du virus et

la biosynthèse des VLDL (cf paragraphe III) C.).

Figure 4 : Structure de la particule virale (D’après (Popescu & Dubuisson, 2010))

C. Organisation génomique

Le génome du HCV est un ARN simple brin de polarité positive de 9,6kb. Deux phases

ouvertes de lecture (ORF pour Open Reading Frame) ont été identifiées. L’ORF principale

code un polypeptide précurseur d’environ 3000 acides aminés, qui va être maturé de façon co-

et post-traductionnelle pour donner naissances aux protéines structurales (protéine de capside

C et d’enveloppes E1 et E2) et non structurales du HCV (protéines NS2, NS3, NS4A, NS4B,

18

NS5A et NS5B). Cette ORF est entourée de deux régions non-codantes aux extrémités du

génome (5’UTR et 3’UTR). (Figure 5). Le décalage du cadre de lecture au niveau du codon

26(+1) peut aussi conduire à la production d’une protéine additionnelle, la protéine F

(Walewski et al., 2001), (Xu et al., 2001), (Baril & Brakier-Gingras, 2005). Les indications de

longueurs nucléotidiques ou peptidiques sont données en référence à la séquence de la souche

H77 (www.losalamosdatabase)

Figure 5 : Organisation génomique du HCV. Le brin d’ARN positif de 9,6kb est représenté en haut flanqué de ces extrémités non codantes 5’untranslated (5’UTR) et 3’unstranslated (3’UTR). La traduction initiée au niveau de l’IRES donne un polypeptide précurseur qui va être maturé de façon co- et post-traductionnelle (les flèches sur le schéma indiquent les évènements de clivage) pour donner naissance aux protéines struturales (en bleu) et non structurales (en gris). Les tailles des protéines sont indiquées en kD.

1. Les extrémités non codantes

a) L’extrémité 5’ non codante (5’UTR)

La région 5’UTR de l’ARN du HCV correspond aux premiers 341 nucléotides. C’est une

région très conservée et structurée, sans coiffe à son extrémité. Elle consiste en 4 domaines (I

à IV) organisés en tige boucle. Les domaines I et II (nucléotides 1 à 115) sont impliqués dans

la réplication du génome viral (Friebe et al., 2001). Les domaines II, III et IV (nucléotides

116 à 341) constituent le site interne d’entrée du ribosome (IRES pour Internal Ribosome

Entry Site) permettant l’initiation de la traduction de l’ARN viral. Ainsi les fonctions qui lui

sont attribuées et sa grande conservation de séquence, font de cette région une cible clé pour

le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Une étude a ainsi été développée

cellular signal peptidases auto-protease NS2/NS3 cleavage by the NS3-NS4a complex

structural proteins non-structural proteins5’ untranslated

3’untranslated

E1C E2 p7 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b

(U)n30nt

98nt

341nt

CoreRNA & LD interaction

Envelopeproteins

metallo/Cys protéase

&assembly

Ser proteaseNTPasehelicase

NS3 cofacteur

Membranousweb

Phosphoproteinreplication

&assembly

RNA dependantpolymerase

21-23 31-35 70 7kD 23 60 6 27 56-58 68

SPP

Viro-porine

I

IIIRES

III

IV

cellular signal peptidases auto-protease NS2/NS3 cleavage by the NS3-NS4a complex

structural proteins non-structural proteins5’ untranslated

3’untranslated

E1C E2 p7 NS2 NS3 NS4a NS4b NS5a NS5b

(U)n30nt

98nt

341nt

CoreRNA & LD interaction

Envelopeproteins

metallo/Cys protéase

&assembly

Ser proteaseNTPasehelicase

NS3 cofacteur

Membranousweb

Phosphoproteinreplication

&assembly

RNA dependantpolymerase

21-23 31-35 70 7kD 23 60 6 27 56-58 68

SPP

Viro-porine

I

IIIRES

III

IV

19

reposant sur l’utilisation de petits ARN interférants inhibant la traduction (Kanda et al.,

2007).

b) L’extrémité 3’ non codante (3’UTR)

La région 3’UTR, de taille variable (entre 210 et 250 nucléotides), est organisée en trois

régions structurées : (i) une région peu conservée d’environ 30 nucléotides comprenant deux

boucles (VSL1 et VSL2), (ii) une région poly U/UC de taille variable et (iii) une région très

(Ploegh, 2007) conservée dite X-Tail constituée de 98 nucléotides arrangés en trois tiges

boucles (SL1, 2 et 3). La région 3’UTR intervient lors de l’initiation de la réplication via sa

région X-Tail et une partie de la région poly U/UC (Kolykhalov et al., 2000),(Yi & Lemon,

2003). Ces deux régions semblent être aussi impliquées dans le maintien de l’infectiosité du

virus in vivo (Kolykhalov et al., 2000). La région 3’UTR est aussi capable d’interagir avec

d’autres protéines cellulaires ce qui permet notamment de stabiliser l’ARN viral, le protégeant

ainsi d’une éventuelle dégradation (Spångberg et al., 2001), et de favoriser la traduction virale

(Ito et al., 1998);(Song et al., 2006).

2. La partie codante

Figure 6 : Structures et associations membranaires des protéines structurales et non structurales du HCV. Les évènements de clivages sont indiqués par les enzymes cellulaires (ciseaux) et les protéases virales (flèches). Les structures tridimensionnelles des protéines sont représentées lorsqu’elles sont connues. (Moradpour et al., 2007)

20

a) Les protéines structurales

(1) La protéine de capside C

La protéine de capside (nucléotides 342-914) est issue du clivage de la partie N-terminale du

polypeptide précurseur donnant une protéine de 23kD (191 aa) très conservée parmi les

différents génotypes du HCV (Bukh et al., 1993). Lors de la maturation de la polyprotéine,

une séquence signal interne située entre les séquences de la protéine de capside et la protéine

E1, adresse le polypeptide naissant à la membrane du réticulum endoplasmique (RE).

L’ectodomaine de E1 est ensuite transloqué dans la lumière du RE, puis une enzyme

cellulaire, la signal peptidase (SP) libère la protéine de capside de E1 et génère une protéine

de capside immature de 191 aa (23 kD) (Hijikata et al., 1991). La maturation de la protéine de

capside fait intervenir une autre enzyme cellulaire : la signal peptide peptidase (SPP)

(Weihofen et al., 2002); (McLauchlan et al., 2002) qui va cliver la séquence signal de E1

produisant ainsi une protéine mature de 176 aa (21 kD) (Hüssy et al., 1996); (Ogino et al.,

2004); (Lemberg & Martoglio, 2002); (Santolini et al., 1994); (Okamoto et al., 2004);

(Okamoto et al., 2008). Des résidus semblent être essentiels au clivage par la SPP : trois

résidus situés dans la séquence signal Ala180, Ser183 et Cys184 ; (McLauchlan et al., 2002);

(Targett-Adams et al., 2008); (Ait-Goughoulte et al., 2006); (Hope et al., 2006), trois résidus

situés dans le domaine hydrophobe Leu139, Val140 et Leu144 ainsi que deux résidus Ile176 et

Phe177 dans la région en amont du site de clivage (Okamoto et al., 2004). Cependant,

l’importance relative de ces résidus dans le clivage pourrait dépendre des paramètres

expérimentaux établis dans les différentes études citées et de résidus situés à distance de la

séquence signal elle-même. De plus le clivage par la SP serait nécessaire pour exposer le site

de clivage par la SPP (Liu et al., 1997); (Lemberg & Martoglio, 2002). La protéine de capside

est retrouvée de façon diffuse dans le cytoplasme, aux membranes du RE, à la surface des

gouttelettes lipidiques (GL) (Barba et al., 1997); (Moriya et al., 1997a); (Hope &

McLauchlan, 2000); (Qiang et al., 2009), et en plus faible proportion dans le noyau (Yasui et

al., 1998) et au niveau des mitochondries (Moriya et al., 1998); (Schwer et al., 2004).

Cependant, ces deux dernières localisation pourraient être liées à des conditions de

surexpression et restent hypothétiques (Figure 7). La protéine de capside est organisée en

trois domaines dont les limites varient selon les études (Hope & McLauchlan, 2000) : le

domaine I (aa 1 à 118) fortement basique, le domaine II (aa 119 à 173-174) hydrophobe et le

domaine III (aa 174-175 à 191) très hydrophobe. Le domaine I contient un motif hélice α /

boucle / hélice α (aa 7 à 17). Il interagit avec l’extrémité 5’ non codante de l’ARN (Santolini

21

et al., 1994) et jouerait un rôle dans l’homo-oligomérisation (Matsumoto et al., 1996) et la

formation de la nucléocapside. L’acide aspartique en position 111 serait impliqué dans la

morphogenèse virale (Blanchard et al., 2003); (Klein et al., 2005). Le domaine II participe à

la maturation et la conformation du domaine I (Boulant et al., 2005). Il est constitué de deux

hélices α (I et II) amphiphiles séparées par une boucle hydrophobe (Boulant et al., 2006) et est

impliqué dans la liaison avec les membranes du RE et les GL (Hope & McLauchlan, 2000).

Le domaine III constitue la séquence signal d’adressage au RE et de clivage C/E1 (Figure 8).

Dans un modèle de pseudo-virions du HCV, il a été montré que la maturation de la protéine

de capside du HCV par la SPP constitue un pré-requis pour l’assemblage de la particule virale

(Ait-Goughoulte et al., 2006). Par ailleurs, il semble que l’adressage de la protéine de capside

aux GL après son clivage par la SPP faciliterait son rapprochement de l’ARN viral pour

former une particule virale infectieuse (Miyanari et al., 2007); (Targett-Adams et al., 2008);

(Shavinskaya et al., 2007) (cf paragraphe III) C. 1.). Ce résultat va bien dans le sens de

travaux, montrant qu’avec d’autres modèles de Flavivirus du genre Pestivirus ou les virus GB,

les particules virales sécrétées par la cellule infectée contiennent une protéine de capside

clivée par la SPP et que ce clivage est nécessaire à l’infectiosité in vivo (Heimann et al.,

2006); (Targett-Adams et al., 2006). De plus c’est la forme mature de la protéine de capside

qui est retrouvée dans le sérum des patients infectés par le HCV (Yasui et al., 1998).

Figure 7 : A et B Immunomarquage de la protéine de capside sur une biopsie de foie de chimpanzé infecté par le HCV (Barba et al., 1997). La protéine de capside (billes d’or 10nm) s’accumule à la surface d’une gouttelette lipidique cytoplasmique (A) ou le long dur réticulum endoplasmique (B), (barre=0,1µm)

A BA BA BA B

22

Figure 8 : Schéma de la maturation de la protéine de capside et de son adressage aux gouttelettes lipidiques Le polypeptide naissant est adressé à la membrane du RE via une séquence signal située entre les séquences de la protéine de capside et la protéine E1. Puis l’enzyme SP libère la protéine de capside de E1 et génère une protéine de capside immature. La maturation de la protéine de capside fait intervenir une autre enzyme, la SPP, qui va cliver la séquence signal de E1 produisant ainsi une protéine mature. Un repliement correct du domaine II est nécessaire pour que la protéine de capside ne soit pas dégradée par le protéasome. La protéine de capside mature est ensuite transférée aux GL (Boulant et al., 2006).

La maturation de la protéine de capside a lieu aux membranes du RE et son adressage aux GL

dépend de plusieurs paramètres :

i) La présence de GL: dans une cellule dépourvue de GL, la protéine de capside a une

localisation cytoplasmique diffuse principalement aux membranes du RE (Hope &

McLauchlan, 2000).

ii) Le clivage par la SPP, essentiel pour la localisation de la protéine de capside à la

surface des GL. En effet c’est la forme mature de la protéine de capside qui est retrouvée à la

surface des GL (Hope & McLauchlan, 2000). De plus dans des cellules produisant un mutant

de la protéine de capside qui n’est pas clivé par la SPP (Val180 Leu183 Val184), celle-ci n’est

pas adressée aux GL et reste localisée aux membranes du RE (McLauchlan et al., 2002); (Ait-

Goughoulte et al., 2006).

iii) Le domaine II de la protéine de capside, impliqué dans l’interaction avec les GL et

la stabilité de la protéine (Hope & McLauchlan, 2000). Un repliement correct de ce domaine

après clivage par la SPP est nécessaire pour que la protéine de capside ne soit pas dégradée

par le protéasome (Boulant et al., 2006) (Figure 8). Le domaine II n’est pas retrouvé dans la

protéine de capside des Pesti- et Flavivirus, mais il est présent dans la séquence de la protéine

de capside du virus GBV-B ainsi que dans une famille de protéines de cellules végétales, les

oléosines, impliquées dans le maintien de structures stockant les lipides (Hope, 2001). Des

23

motifs très conservés au sein de ces protéines semblent jouer un rôle direct dans l’interaction

avec les GL : le motif « nœud Proline » en position 138-143 (P-XXXX-P), où les prolines

sont entourées par des séquences hydrophobes, et le motif YATC en position 164-167 de la

protéine de capside (Hope, 2001). La présence dans le domaine II d’un continuum de résidus

hydrophobes formés par l’hélice I, la boucle et l’hélice II est également importante pour

l’interaction avec les GL (Boulant et al., 2006). De plus le résidu phénylalanine en position

150 jouerait notamment un rôle dans l’adressage de la protéine de capside aux GL et dans la

stabilité de celle-ci (Boulant et al., 2007).

La protéine de capside peut former des homo-oligomères qui vont permettre la formation de

la nucléocapside (Ai et al., 2009). Elle joue aussi un rôle dans la morphogenèse virale et son

interaction avec les GL semble être primordiale dans ce processus (cf paragraphe III) C. 1.)

(Miyanari et al., 2007); (Shavinskaya et al., 2007). Des modifications dans la séquence du

domaine II qui n’altèrent pas l’adressage de la protéine de capside aux GL mais modifient la

nature de l’interaction avec les GL peuvent moduler l’assemblage et la sécrétion viral

(Shavinskaya et al., 2007); (Majeau et al., 2009). La protéine de capside serait aussi capable

de se lier à une protéine appartenant au système ESCRT (pour Endosomal Sorting Complex

Required for Transport) et serait ainsi impliqué dans la production virale (Blanchard et al.,

2003); (Ariumi et al., 2011).

La protéine de capside est capable de moduler un certains nombres d’acteurs du métabolisme

lipidique contribuant ainsi à la pathogénicité de l’infection par la HCV (cf paragraphe III) B.

3. c) (4)). De plus, la protéine de capside interagit avec de nombreux autres partenaires

cellulaires et pourrait ainsi jouer sur les mécanismes impliqués dans l’apoptose, la

prolifération cellulaire, le stress oxydatif et le système immunitaire, ce qui pourrait moduler là

encore la pathogénicité de l’infection par le HCV (McLauchlan, 2000); (Ray & Ray, 2001).

Selon certaines études, la protéine de capside aurait des fonctions pro- ou anti-apoptotique et

l’inhibition de l’apoptose pourrait ainsi intervenir dans la persistance virale (Chung et al.,

2001).

(2) Les protéines d’enveloppe E1 et E2

Les protéines d’enveloppe E1 (nucléotides 915-1490) et E2 (nucléotides 1491-2579) sont des

protéines de 31 à 35 kD (192 aa) et 70 kD (362 à 369 aa) respectivement. Elles sont obtenues

après le clivage de la polyprotéine précurseur par des peptidases cellulaires. Ce sont des

24

protéines transmembranaires constituées d’un large ectodomaine N-terminal et un domaine

transmembranaire unique C-terminal, qui vont s’assembler en hétérodimères non-covalents

E1-E2 grâce à leurs domaines transmembranaires (Op De Beeck et al., 2000). Des séquences

signal présentes dans la partie C-terminale de la protéine de capside et dans le domaine

transmembranaire de E1 sont responsables de la translocation des ectodomaines de E1 et E2

dans la lumière du RE. Lors de la maturation des protéines d’enveloppe l’acquisition de ponts

disulfures intramoléculaires et de glycanes est nécessaire à leur conformation (Dubuisson &

Rice, 1996); (Meunier et al., 1999); (Goffard & Dubuisson, 2003); (Goffard et al., 2005) ;

(Helle et al., 2010). La protéine E1 présente ainsi quatre sites de glycosylation très conservés

et deux autres sites potentiels uniquement présents pour certains génotypes. La protéine E2

compte neuf sites de glycosylation très conservés ainsi que deux autres sites observés

seulement pour certains génotypes. La partie N-terminale de E2 comprend trois régions

hypervariables, la région HVR1 (aa 384-410) de forte variabilité et les régions HVR2 (aa 473-

480) et HVR3 (aa 431-466). La région HVR1, exposée à la surface de E2, pourrait être

impliquée dans l’échappement du virus au système immunitaire de l’hôte (Farci et al., 1996).

Les protéines d’enveloppe sont en effet hautement antigéniques ce qui en fait des cibles

idéales pour la production d’anticorps neutralisants (Law et al., 2008); (Perotti et al., 2008);

(Meunier et al., 2008). Les protéines d’enveloppe semblent intervenir à plusieurs étapes du

cycle viral : lors de l’entrée virale (reconnaissance de la cellule cible, attachement du virus et

fusion membranaire) (cf paragraphe II) E. 1.) et lors de l’assemblage et la sécrétion de

nouvelles particules virales (cf paragraphe II) E. 4.).

b) Les protéines non structurales

(1) La protéine p7

La protéine p7 (nucléotides 2580-2768) est une petite protéine de 7kD (63 aa). Elle est

constituée de deux hélices α transmembranaires hydrophobes (aa 19-32 et 36-58), séparées

par un court fragment hydrophile (aa 33-35). Les extrémités N-terminale et C-terminale sont

orientées vers le milieu extracellulaire, la partie C-terminale servant de peptide signal à la

protéine NS2. La protéine p7 est localisée au niveau des membranes du RE et des

mitochondries (Carrère-Kremer et al., 2002) et ne semble pas faire partie de la particule

virale. Sa fonction reste mal connue et il a été montré qu’elle était capable de s’oligomériser

(Clarke et al., 2006), formant ainsi un pore (une « viroporine ») qui joue le rôle de canal

ionique dans des bicouches lipidiques artificielles (Griffin et al., 2004); (Pavlović et al.,

25

2003). Elle ne semble pas impliquée dans la réplication virale (Lohmann, 1999) mais est

nécessaire pour la production de particules virales in vitro (Jones et al., 2007); (Steinmann et

al., 2007) et in vivo chez le chimpanzé (Sakai et al., 2003). Effectivement, d’une part la

protéine p7 interagirait avec la protéine NS2 et contrôlerait sa topologie membranaire,

régulant de cette façon les interactions de NS2 avec les protéines virales lors des étapes

d’assemblage (Ma et al., 2011). D’autre part, la protéine p7 serait capable de moduler le pH

intracellulaire, sa présence entraînerait alors une diminution de l’acidification intracellulaire

protégeant ainsi les particules virales naissantes et favorisant leur production (Jones et al.,

2007); (Shavinskaya et al., 2007).

(2) La protéine NS2

La protéine NS2 (nucléotides 2769-3419) est une protéine de 23kD et de 217 aa. Elle serait

composée de trois ou quatre domaines transmembranaires. L’extrémité C-terminale, dirigée

vers le cytosol serait capable d’interagir avec l’extrémité N-terminale de NS3 formant ainsi

une protéase à cystéine avec deux sites actifs structurés en deux hélices α et cinq brins ß

(Lorenz et al., 2006), dont l’activité dépend du zinc (Hijikata et al., 1993b). Cette protéase

assure l’auto-clivage entre NS2 et NS3 (Grakoui et al., 1993) et joue ainsi un rôle important

dans la maturation de la polyprotéine, l’infection in vivo (Kolykhalov et al., 2000) et la

réplication in vitro (Welbourn et al., 2005). Elle n’est pas nécessaire à la formation du

complexe de réplication (Lohmann, 1999). Outre son rôle enzymatique, le domaine C-

terminal de la protéine NS2 interviendrait dans l’assemblage viral et lors de la production

virale. De plus des résidus appartenant au premier segment transmembranaire dans le domaine

N-terminal seraient impliqués (Jones et al., 2007); (Jirasko et al., 2008). Le résidu Serine en

position 168 impliqué dans la phosphorylation et la stabilisation de la protéine NS2 (Franck et

al., 2005) serait important pour l’assemblage viral (Jirasko et al., 2008) et la production de

virus infectieux (Yi et al., 2007); (Yi et al., 2009). En effet ce résidu jouerait un rôle à une

étape tardive de l’assemblage viral, en conférant l’infectiosité aux pré-particules virales avant

leur relarguage dans le milieu extracellulaire, la phosphorylation de ce résidu ne serait

néanmoins pas impliquée (Tellinghuisen et al., 2008); (Yi et al., 2009). La protéine NS2

serait aussi capable d’interagir avec la protéine p7 et modulerait les interactions des

glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 avec les protéines NS3 et NS5A se trouvant dans les

complexes de réplication à proximité des GL dans des zones où l’assemblage viral aurait lieu

(Phan et al., 2009); (Ma et al., 2011); (Popescu et al., 2011); (Stapleford & Lindenbach,

26

2010). De plus, La protéine NS2 serait impliquée dans la régulation transcriptionnelle

(Dumoulin et al., 2003) en induisant un stress au niveau du RE (von dem Bussche et al.,

2010), et la persistance virale (Erdtmann, 2003). Enfin NS2 inhiberait la prolifération

cellulaire créant ainsi un environnement favorable à la réplication virale (Yang et al., 2006).

(3) Le complexe NS3/4A

NS3 (nucléotides 3420-5312) est une protéine de 60kD et 631 aa. Elle possède deux

principales fonctions enzymatiques réparties sur les deux extrémités. L’extrémité N-terminale

de NS3 porte une fonction serine protéase qui, en association avec son cofacteur NS4A,

assure le clivage des protéines non structurales en amont de NS3 (NS3/4A, NS4A/4B,

NS4B/5A, NS5A/5B) (Bartenschlager et al., 1995). Ce domaine de NS3 est structuré en deux

parties identiques constituées chacune de feuillets ß orientés de façon antiparallèle encadrant

le site actif de l’enzyme (Miller & Purcell, 1990); (Kim et al., 1996); (Love et al., 1996). NS4A

(nucléotides 5313-5474) est une petite protéine transmembranaire de 6kD (54 aa) nécessaire à

la stabilisation de NS3 (Kim et al., 1996), à l’adressage et au maintien de la protéine à la

membrane du RE (Wölk et al., 2000), la protéine NS3 ne possédant pas de domaine

transmembranaire. L’activité serine protéase est au cœur de la recherche de nouvelles

thérapies antivirales (Raney et al., 2010), et semble impliquée dans l’échappement du virus à

la réponse immunitaire (Gale & Foy, 2005); (Meylan et al., 2005). Le domaine C-terminal de

NS3 renferme un domaine à activité hélicase à ARN ATP-dépendante, qui dépendrait aussi de

l’association avec le cofacteur NS4A (Pang et al., 2002). Ce domaine est structuré en trois

sous domaines (Frick, 2006). Impliquée lors de l’initiation de la réplication, l’activité hélicase

permettrait le déroulement des duplexes ARN/ARN (Tai et al., 1996), et le déplacement des

protéines liées à l’ARN (Lindenbach & Rice, 2005). Les mécanismes de son action restent

néanmoins peu décrits. In vitro, des mutations adaptatives au niveau de l’extrémité N-

terminale du domaine hélicase, ont été identifiées et joueraient un rôle lors des étapes

précoces de l’assemblage viral (Ma et al., 2008b); (Han et al., 2009); (Phan et al., 2009).

Plusieurs arguments attestent d’un rôle du domaine serine protéase de NS3 dans l’oncogénèse

liée au HCV (Levrero, 2006). Là encore l’implication directe de NS3 n’est pas clairement

définie.

27

(4) La protéine NS4B

La protéine NS4B (nucléotides 5475-6257) est une petite protéine de 27kD (261 aa) organisée

en au moins quatre domaines transmembranaires ancrés dans la membrane du RE (Hügle et

al., 2001), en deux hélices α amphiphatiques (AH1 et AH2) au niveau de l’extrémité N-

terminale, capable d’effectuer un cinquième passage transmembranaire après translocation

dans le RE (Lundin et al., 2003); (Gouttenoire et al., 2009a), et probablement en deux hélices

α pour l’extrémité C-terminale (Gouttenoire et al., 2009b). Des résidus au niveau des hélices

α de l’extrémité N-terminale (aa 6 à 29) et C-terminale (aa 229 à 253) seraient déterminants

dans l’association membranaire et la formation de ces complexes de réplication (Elazar et al.,

2004); (Gouttenoire et al., 2009b). De plus, l’implication de NS4B dans

l’hyperphosphorylation de NS5A (Koch & Bartenschlager, 1999); (Neddermann et al., 1999),

la palmitoylation de deux cystéines à l’extrémité C-terminale de NS4B (Yu et al., 2006), et

plus récemment l’interaction entre son extrémité N-terminale et son extrémité C-terminale

(Paul et al., 2011) semblent importantes pour la formation d’un complexe de réplication

fonctionnel. D’autre part, la protéine NS4B est capable d’induire à elle seule des

modifications membranaires, formant un réseau de vésicules membranaires nommé

« membranous web » associé aux complexes de réplication du HCV (Egger et al., 2002);

(Gao et al., 2004). Cependant, les modifications membranaires induites par la protéine NS4B

seule sont différentes de celles observées dans le cadre de l’expression de la polyprotéine

entière (Egger et al., 2002). La formation du « membranous web » (cf paragraphe II) E. 3.)

impliquerait donc d’autres protéines virales tel que le complexe protéique NS3/4A (Egger et

al., 2002). De plus, des différences dans la séquence de NS4B (Blight, 2007) et des mutations

adaptatives identifiées in vitro (Lohmann et al., 2003) moduleraient l’éfficacité de la

réplication. La protéine NS4B jouerait aussi un rôle dans la régulation de la traduction des

protéines virales et de certaines protéines de l’hôte (Blight, 2007) ainsi que dans le

métabolisme lipidique et la stéatose viro-induite (Park et al., 2009), (cf paragraphe III. B. 3.

c) (6)). Enfin la protéine NS4B possèderait un domaine de liaison à l’ARN à son extrémité C-

terminale (Einav et al., 2008) et pourrait interagir avec d’autres protéines virales afin de

moduler l’assemblage viral (Jones et al., 2008).

(5) La protéine NS5A

La protéine NS5A (nucléotides 6258-7601) est une phosphoprotéine qui existe sous deux

formes : phosphorylée (56 kD, 447 aa) ou hyperphosphorylée (58 kD, 459 aa). Elle est

28

composée à son extrémité N-terminale d’une hélice α suivie de trois domaines notés I à III.

L’hélice α est nécessaire à l’ancrage de la protéine NS5A dans les membranes du RE (Brass et

al., 2002), et jouerait un rôle dans l’interaction protéine/protéine indispensable à la formation

d’un complexe de réplication fonctionnel. Le domaine I est structuré en deux sous domaines :

le domaine IA qui renferme un site de liaison à l’ion Zinc au sein d’un motif très conservé, et

le domaine IB. Les domaines I et II seraient impliqués dans la réplication virale, Le domaine I

est capable de s’homodimériser via le domaine IB pour former une gouttière dans laquelle

l’ARN viral pourrait se lier (Tellinghuisen et al., 2005). NS5A peut se lier aux GL via son

domaine DI et cette capacité serait indispensable pour l’adressage du complexe de réplication

et de l’ARN viral aux GL pour favoriser l’assemblage viral (Miyanari et al., 2007); (Appel et

al., 2008) . Le domaine DI pourrait aussi contribuer à la production de particules virales

infectieuses via sa faculté de liaison aux GL (Miyanari et al., 2007) ou par des mécanismes

impliquant des facteurs cellulaires (Amako et al., 2009). Les domaines II et III sont moins

bien caractérisés. Le domaine II et notamment une petite région appelée ISDR (pour

Interferon Sensitivity Determining Region), interviendrait dans la résistance du HCV à

l’interféron α, mais son rôle dans la réplication virale est controversé (Tellinghuisen et al.,

2007); (Appel et al., 2008). Le domaine DIII semble quant à lui jouer un rôle important dans

la production de particules virales infectieuses (Kim et al., 2011) mais par des mécanismes

différents que ceux impliquant le domaine DI (Tellinghuisen et al., 2008). Le domaine DIII ne

serait pas nécessaire pour la liaison aux GL, mais serait responsable de l’interaction de la

protéine NS5A avec la protéine de capside présente à la surface des GL (Shi et al., 2002);

(Appel et al., 2008); (Masaki et al., 2008). Néanmoins il n’est pas établi si ceci se fait de

façon directe ou non. Un cluster de serines appartenant au domaine III de NS5A serait

impliqué dans cette interaction et dans l’interaction de la protéine de capside avec l’ARN viral

(Masaki et al., 2008), mais aussi lors des étapes d’assemblage (Appel et al., 2008) et de la

production virale (Kim et al., 2011).

La protéine NS5A, l’ensemble des protéines non structurales et l’ARN viral sont capables

d’interagir au sein du complexe de réplication (Egger et al., 2002). In vitro, l’apparition de

mutations adaptatives dans la séquence de NS5A favorise la réplication (Blight et al., 2000);

(Krieger et al., 2001); (Lohmann et al., 2001). De plus, l’interaction de NS5A avec la protéine

NS5B, réplicase virale, est importante pour la réplication virale (Shimakami et al., 2004).

La protéine NS5A est capable de moduler son état de phosphorylation via l’apparition de

mutations adaptatives (Evans et al., 2004); (Appel et al., 2005) ou via l’intervention des

protéines NS3, NS4A et 4B (Koch & Bartenschlager, 1999); (Evans et al., 2004); (Appel et

29

al., 2005); (Neddermann et al., 1999); (Jones et al., 2008). Ces études tendent à montrer que

l’hyperphosphorylation de NS5A ne serait pas nécessaire à la réplication virale. Celle-ci

perturberait l’interaction de NS5A avec la protéine cellulaire hVAP-A conduisant de ce fait à

l’inhibition de la réplication virale (Evans et al., 2004). Néanmoins c’est la forme

hyperphosphorylée qui est retrouvée à la surface des GL participant ainsi au recrutement des

autres protéines non structurales du HCV, de l’ARN viral (Miyanari et al., 2007) et à la

production de particules virales (Appel et al., 2005); (Popescu et al., 2011). La protéine

NS5A appartiendrait donc à deux complexes, le complexe de réplication et un complexe

impliqué dans l’assemblage viral, la phosphorylation de NS5A lui permettrait ainsi de passer

d’un complexe à l’autre (Appel et al., 2005); (Popescu et al., 2011). Cependant les résidus

impliqués dans ces phénomènes n’ont pas été clairement identifiés, la phosphorylation d’un

résidu Serine en position 457 appartenant au DIII jouerait un rôle dans la production virale

(Tellinghuisen et al., 2008); (Kim et al., 2011).

La protéine NS5A est capable d’interagir avec d’autres partenaires cellulaires et de moduler

notamment la résistance au traitement par l’interféron α, la croissance cellulaire et l’apoptose

(Macdonald & Harris, 2004). De plus, l’interaction de la protéine NS5A avec la protéine de

capside et son implication dans le métabolisme lipidique pourraient lier la protéine NS5A à la

pathogenèse associée à l’infection par le HCV (un chapitre consacré à cette implication est

développé paragraphe III) B. 3. c) (5)).

(6) La protéine NS5B

La protéine NS5B (nucléotides 7602-9377) est une protéine membranaire de 68 kD (591 aa).

NS5B assure la fonction d’ARN-polymérase ARN-dépendante (RdRp) au sein du complexe

de réplication. L’extrémité C-terminale de NS5B lui permet de s’ancrer à la membrane du RE,

l’ARN polymérase est alors inactive, un changement conformationnel va ensuite permettre de

déconnecter la partie C-terminale et le site actif de l’enzyme : la protéine NS5B adopte une

structure peu flexible dite en « main droite classique »: la « paume » renferme le site

catalytique, les « doigts » et le « pouce » alors repliés autour de la « paume » vont former un

tunnel par lequel l’ARN est amené au site actif (Lesburg et al., 1999). Un autre tunnel permet

l’entrée des rNTP et leur passage vers le site actif (Bressanelli et al., 1999). La liaison de

l’ARN et l’initiation de la réplication sont régulées par l’extrémité 3’ de l’ARN viral, qui

forme une boucle en « épingle à cheveux » hautement flexible. Cette boucle pointe en

direction du site catalytique et permet le bon positionnement de la matrice ARN (Appel,

30

2006). De plus la liaison de GTP au niveau de l’interface entre le « pouce » et les « doigts »

est nécessaire lors de l’initiation de la réplication (Bressanelli et al., 2002). L’activité

enzymatique de NS5B est régulée d’une part via la protéine NS5A (Shirota et al., 2002) et

d’autre part via des facteurs cellulaires tels que la kinase PRK (Kim et al., 2004), et la

cyclophiline B (Watashi et al., 2005). Compte tenu de son rôle primordial dans le cycle viral,

la protéine NS5B reste une cible de choix pour le développement de nouveaux inhibiteurs de

l’activité ARN polymérase (Burton & Everson, 2009); (Watkins et al., 2010).

3. La protéine F ou ARFP

Un décalage du cadre de lecture au codon 26 (+1) peut se produire au cours de la synthèse du

polypeptide précurseur, et conduirait à la synthèse d’une petite protéine de 14kD, la protéine

F (pour Frameshift) (Xu et al., 2001) ou ARFP (pour Alternative Reading Frame Protein)

(Walewski et al., 2001); (Xu et al., 2001); (Baril & Brakier-Gingras, 2005). La taille de cette

protéine varie de 126 à 160 aa en fonction du génotype. Actuellement le rôle de la protéine F

n’est pas clairement établi, elle pourrait avoir des fonctions immunomodulatrices (Fiorucci et

al., 2007), dans la transformation hépatocytaire (Ma et al., 2008a), ou dans l’organisation du

cytosquelette (Tsao et al., 2006), mais ne serait pas nécessaire à la réplication de l’ARN viral

(McMullan et al., 2007); (Vassilaki et al., 2008). Des anticorps anti-protéine F ainsi qu’une

réponse immunitaire ont été mis en évidence chez des porteurs chroniques du HCV, suggérant

que cette protéine est produite lors de l’infection naturelle (Xu et al., 2001).

D. Variabilité génomique

L’ARN polymérase du HCV est une enzyme peu fidèle qui introduit de nombreuses

mutations au cours de la réplication (1,5 à 2.10-3 mutations par nucléotide copié par an), du

fait d’une part d’un défaut d’activité correctrice et d’autre part d’un taux de réplication élevé

(1010 à 1012 virions par jour). La majorité des séquences ainsi générées sont défectives,

néanmoins certaines modifications, transmises au cours de l’évolution, vont subir les

pressions de sélection liées à l’hôte et son environnement et vont participer à l’émergence de

nouveaux variants. Le HCV présente ainsi une diversité génétique importante à la fois au sein

d’un même individu (on parle alors de quasi-espèces) et/ou au sein de la population infectée.

Cette variabilité génétique n’affecte pas les régions du génome de la même façon : les

séquences des extrémités 5’UTR, 3’UTR et celle de la protéine de capside sont les plus

conservées, alors que les séquences de protéines d’enveloppe sont les plus variables. Les

31

analyses phylogénétiques ont permis de classer les variants en 6 génotypes, notés 1 à 6

(Simmonds et al., 2005); (Murphy et al., 2007), qui diffèrent d’entre eux de 30% dans leur

séquence nucléotidique ; ainsi que de nombreux sous types, notés a, b,c,…, divergeant entre

eux d’environ 20% (Pawlotsky, 2003). La répartition des ces différents génotypes varie selon

les régions du globe (Figure 9) De façon générale, les génotypes 1, 2 et 3 sont répartis sur

toute la surface du globe, le génotype 4 est retrouvé principalement en Afrique du Nord et au

Moyen-Orient, le génotype 5 se focalise uniquement en Afrique du Sud, le génotype 6 est

retrouvé à Hong-Kong, en Chine et au Vietnam (Simmonds, 2004). En France, les génotypes

1b et 1a sont retrouvés majoritairement (60 à 65% des individus infectés), suivi par le

génotype 3a (20%) et 4a (10%), les génotypes 2a et 2c sont responsables des cas restants

(Nicolas-Burdin et al., 2007). D’un point de vue clinique, ces génotypes se comportent

différemment aussi bien pour le versant pathologique (cf. paragraphe III) B. 3. c) (1), (2) et

(3)) que pour le versant concernant la réponse au traitement par l’interféron (Chayama &

Hayes, 2011). Le traitement est en effet plus efficace pour les sujets infectés par les génotypes

2 et 3, que pour le génotype 1 tandis que les génotypes 4, 5 et 6 donnent des taux de réponse

intermédiaire (Zeuzem et al, 2004 ; Legrand-Abravanel et al, 2004).

Figure 9 : Répartition mondiale des différents sous types du HCV. Les génotypes 1, 2 et 3 sont répartis sur toute la surface du globe, le génotype 4 est retrouvé principalement en Afrique du Nord et au Moyen-Orient, le génotype 5 se focalise uniquement en Afrique du Sud, le génotype 6 est retrouvé à Hong-Kong, en Chine et au Vietnam (Gravitz, 2011).

32

E. Cycle infectieux

1. Attachement et entrée

L’entrée du HCV dans la cellule est un processus que l’on peut diviser en plusieurs étapes qui

vont mettre en jeu les protéines d’enveloppe virales E1 et E2, ainsi qu’un certain nombre de

facteurs cellulaires. Ces facteurs cellulaires sont de deux types : les facteurs d’attachement,

qui permettent le recrutement et la concentration des virus à la surface des cellules ; et les

récepteurs qui participent à l’entrée virale proprement dite (Burlone & Budkowska, 2009).

a) Les facteurs d’attachement

(1) Les glycosaminoglycanes

De nombreux virus de la famille des Flaviviridae utilisent les glycosaminoglycanes tels que

l’héparane sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate ou l’acide hyaluronique, pour

s’attacher à la cellule cible. Différentes études on montré que l’héparine (analogue aux

héparanes sulfates) et l’héparinase étaient capable d’intervenir dans l’adsorption du HCV

(Barth et al., 2003); (Barth et al., 2006); (Basu et al., 2007); (Morikawa et al., 2007). La

séquence des protéines d’enveloppe impliquée dans cette interaction n’est néanmoins pas

clairement définie.

(2) Les lectines

Ces protéines seraient impliquées dans la liaison la capture et l’élimination des virus

circulants à la surface des cellules (Cambi et al., 2005). Les protéines de type lectines, DC-

SIGN et L-SIGN s’organisent en microdomaines à la surface des cellules dendritiques et des

lymphocytes (DC-SIGN) ou à la membrane des cellules endothéliales sinusoïdales du foie (L-

SIGN) (Cambi et al., 2004); (Cambi et al., 2005). Le HCV pourrait utiliser ces protéines pour

rentrer dans les cellules, en se liant via les résidus sucrés de la glycoprotéine d’enveloppe E2 à

leur extrémité C-terminale (Lozach et al., 2003); (Lozach et al., 2004).

Une autre lectine, le récepteur aux asialoglycoprotéines, a aussi été proposé comme facteur

d’attachement du HCV. Il a été montré dans des cellules d’insectes, que ce récepteur était

capable d’interagir avec les résidus sucrés des protéines d’enveloppe du HCV (Saunier et al.,

2003). Son rôle dans l’entrée virale reste à vérifier.

33

(3) Le rôle des lipoprotéines

Les expériences menées sur les sera de patients infectés par le HCV ont permis de mettre en

évidence que les formes circulantes les plus infectieuses du HCV, les LVP, sont des particules

de faible densité qui résultent de l’association avec les lipoprotéines de faible (LDL) ou de

très faible densité (VLDL) (André et al., 2002). La liaison de ces LVP à des récepteurs

spécifiques des lipoprotéines, favoriserait l’entrée du virus dans la cellule contribuant de ce

fait à son infectiosité (Andréo et al., 2007).

b) Les récepteurs

Dans un second temps les particules virales se lient avec une plus grande affinité à un

récepteur ce qui leur permet de rentrer dans la cellule. Ces récepteurs sont de plusieurs types :

(1) Le récepteur aux LDL

En conditions physiologiques normales, il joue un rôle dans le métabolisme du cholestérol qui

est transporté sous forme de LDL aux cellules hépatiques. Lors d’une infection par le HCV,

ce récepteur pourrait être impliqué dans l’entrée des particules virales associées aux LDL

(Agnello et al., 1999); (André et al., 2002); (Petit et al., 2007).

(2) Le récepteur scavenger SR-BI

SR-BI est un récepteur membranaire présent dans la plupart des cellules, et particulièrement

les cellules hépatiques. C’est un acteur clé du métabolisme lipidique qui lie les différentes

lipoprotéines, il est notamment important dans le transfert des lipides vers la cellule et est

capable de modifier la composition lipidique de la membrane plasmique. C’est le principal

récepteur des lipoprotéines de haute densité (HDL) et peut aussi jouer le rôle de récepteur

pour les LDL et VLDL. SR-BI pourrait alors intervenir dans la liaison des virus associés aux

lipoprotéines et de la cellule (Maillard et al., 2006). Néanmoins, il semble que le HCV puisse

directement se lier à SR-BI par l’intermédiaire de la région HVR1 de la glycoprotéine E2

(Bartosch et al., 2003); (Lavillette et al., 2005). Enfin, SR-BI semble fonctionner de façon

synergique avec un autre facteur, le récepteur CD-81 pour former un « complexe récepteur »

(Kapadia et al., 2007).

34

(3) La tétraspanine CD-81

CD-81 est un récepteur exprimé au sein de tous les tissus, à l’exception des hématies et des

plaquettes. Il est impliqué dans la différenciation cellulaire, l’adhésion et la prolifération

cellulaire, la motilité et la signalisation (Levy & Shoham, 2005). La glycoprotéine E2 du

HCV via sa grande boucle extracellulaire (LER) est capable d’interagir avec CD-81 (Pileri et

al., 1998), des résidus appartenant notamment aux régions hypervariables de E2 seraient

importants pour cette interaction (Roccasecca et al., 2003); (Drummer et al., 2006). Il peut

fonctionner avec d’autres tétraspanines ainsi que des partenaires cellulaires pour former des

« réseaux à tétraspanine » (Levy & Shoham, 2005).

(4) La protéine claudine-1

Claudine-1 est une protéine ubiquitaire exprimée principalement dans le foie et qui intervient

au niveau des jonctions serrées et des jonctions cellule à cellule. Elle pourrait jouer un rôle à

une étape tardive de l’entrée du virus, après la migration latérale des complexes virus-

récepteurs aux jonctions serrées (Evans et al., 2007); (Brazzoli et al., 2008). Des résidus

situés dans la première boucle extracellulaire du récepteur seraient important pour l’entrée

virale, cependant le HCV ne semble pas interagir directement avec claudine-1 (Evans et al.,

2007).

(5) La protéine occludine

L’occludine est une protéine très exprimée dans le foie qui joue un rôle dans les jonctions

serrées (Saitou et al., 1997) de cellule à cellule. Son implication dans le cycle viral du HCV a

été découverte récemment et son rôle exact reste à déterminer (Ploss et al., 2009). Une

interaction avec la glycoprotéine E2 interviendrait tardivement au cours de l’entrée virale et

entraînerait un changement de localisation des jonctions serrées (Benedicto et al., 2008); (Liu

et al., 2009).

c) Modèle d’entrée du virus

L’entrée du virus dans la cellule semble être un processus séquentiel et long qui implique des

facteurs cellulaires et viraux. Les virions circulent en effet sous différentes formes chez les

patients : associé ou non aux lipoprotéines de faible densité; enveloppé ou non. L’ensemble de

ces facteurs rend la mise en place d’un modèle d’entrée virale assez complexe. Néanmoins le

modèle actuellement établi propose que les lectines, les glycosaminoglycanes et le LDL-R

35

facilitent dans un premier temps l’attachement du HCV sur les cellules cibles soit via une

interaction directe avec les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2, soit par l’intermédiaire des

lipoprotéines associées au HCV. Le virus interagit ensuite avec CD-81 qui va agir de façon

coopérative avec SR-BI pour former un « complexe récepteur ». Puis le virus est transféré aux

jonctions serrées où il interagit de façon tardive avec les protéines claudine-1 et occludine. Le

virus est alors endocyté de façon clathrine dépendante (Blanchard et al., 2006), puis

l’acidification de l’endosome entraîne la fusion des glycoprotéines d’enveloppe virale et de la

membrane endosomale (Tscherne et al., 2006); (Lavillette et al., 2007). La libération du

génome viral dans le cytoplasme peut ensuite s’effectuer par décapsidation.

(http://spiral.univ-lyon1.fr/files_m/M5502/WEB/index.html) (Figure 10)

Figure 10 : Modèle d’entrée du HCV (D’après (Popescu & Dubuisson, 2010)). Sur ce schéma, les glycosaminoglycanes (GAGs) ainsi que le récepteur au LDL (LDL-R) facilitent l’attachement du HCV. Puis le virus interagit avec le complexe récepteur formé de SR-BI et CD-8. Le virus est ensuite transféré aux jonctions serrées où il interagit avec les protéines claudine-1 (CLDN1) et occludine (OCLN). Le virus est alors endocyté de façon clathrine dépendante.

2. Traduction et maturation

Une fois l’ARN viral libéré dans le cytoplasme, la traduction débute immédiatement. L’ARN

de polarité positive est directement pris en charge par les ribosomes cellulaires au niveau de

l’IRES à l’extrémité 5’UTR. L’interaction avec l’IRES entraîne le recrutement de facteurs

d’initiation cellulaires. La machinerie de traduction se met alors en place à la membrane du

RE rugueux (RER). La synthèse donne naissance à un polypeptide précurseur de 3000 acides

aminés, ancré dans le RE, qui va être la cible de protéases cellulaires et virales entraînant des

clivages co- et post-traductionnels pour produire les formes matures des protéines du HCV.

Les clivages entre les protéines structurales C/E1, E1/E2 ; E2/p7 et p7/NS2 sont réalisés par

36

des peptidases signal et peptidases de peptide signal cellulaires situées dans la lumière du RE

(cf paragraphe II) C. 2.). La maturation des protéines non structurales a quant à elle lieu grâce

aux activités protéasiques de NS2/3 et NS3/4A. Le domaine protéase de NS2 permet

l’autoclivage NS2/NS3, et l’activité protéase de NS3 et de son cofacteur NS4A réalise les

clivages en cis entre NS3/NS4A, et en trans entreNS4A/4B, NS4B/NS5A et NS5A/NS5B.

3. Réplication

Le mécanisme de la réplication est encore largement méconnu, cependant un modèle a pu être

établi proposant que la réplication du HCV est assurée par un complexe de réplication dans

lequel sont associées les protéines non structurales NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B,

l’ARN viral et des facteurs cellulaires. Cette étape du cycle viral entraîne un remaniement

caractéristique des membranes cellulaires formant une plate forme pour la réplication virale :

le « membranous web » (Gosert et al., 2003); (Moradpour et al., 2003). La protéine NS4B

serait en partie impliquée dans ces remaniements membranaires (Egger et al., 2002); (Gao et

al., 2004). Cet environnement favoriserait les interactions entre les différents partenaires

intervenant dans l’initiation de la réplication. La protéine NS5A via ses propriétés de liaison à

l’ARN, pourrait ainsi recruter l’ARN viral. L’ARN polymérase NS5B reconnaît ensuite la

région X-tail de l’extrémité 3’UTR de la matrice ARN de polarité positive (You & Rice,

2008), et initie ainsi la synthèse du brin complémentaire négatif. La protéine NS3 serait alors

capable de séparer les deux brins d’ARN via son activité hélicase/ NTPase (Tai et al., 1996).

La protéine NS4A permettrait l’ancrage membranaire de NS3 et servirait de cofacteur à NS3

(Pang et al., 2002). Le brin néosynthétisé servirait ensuite de matrice pour la synthèse de

nombreux brins d’ARN de polarité positive. D’autres interactions des protéines virales avec

des facteurs cellulaires et notamment le cytosquelette ont été décrites et semblent nécessaires

à la réplication virale. Ainsi les protéines NS3 et NS5A interagissent avec les filaments

d’actine et les microtubules ce qui favoriserait la mobilité des complexes de réplication (Lai et

al., 2008). Ces derniers résultats restent cependant à confirmer.

4. Assemblage et sécrétion

Par analogie avec les autres virus de la famille des Flaviviridae, un modèle de l’assemblage et

de la sécrétion des néovirions a été proposé. La protéine de capside, associée aux GL au

niveau des membranes du RE est capable d’interagir avec l’ARN viral et la protéine NS5A

qui se trouvent au sein des complexes de réplication (Miyanari et al., 2007). La protéine

37

NS5A pourrait de ce fait appartenir à deux complexes différents : un complexe contenant

NS4B, responsable de la réplication et un complexe contenant la protéine de capside,

responsable de l’assemblage viral (Appel et al., 2008). Des mutations adaptatives dans la

protéine NS5A qui augmentent le titre infectieux sans altérer la réplication virale ont

d’ailleurs été identifiées (Tellinghuisen et al., 2008). En modulant son état de

phosphorylation, la protéine NS5A passerait d’un complexe à l’autre (Popescu et al., 2011). Il

n’est pas encore établi si l’interaction de la protéine de capside avec NS5A s’effectue de

manière directe ou non. Cette interaction est instable et transitoire et il est possible que la

protéine de capside et NS5A interagissent via l’ARN viral, qu’elles sont toutes les deux

capables de lier. Ainsi i) le rapprochement de la protéine NS5A vers les GL portant à leur

surface la protéine de capside serait suffisant pour initier l’assemblage viral (Appel et al.,

2008); (Targett-Adams et al., 2007) mais ii) la protéine NS5A pourrait aussi interagir

directement avec la protéine de capside par l’intermédiaire de son domaine III (Masaki et al.,

2008). (Un chapitre sur les liens étroits entre les protéines de capside, NS5A et les GL lors de

l’assemblage viral est développé au paragraphe III) C. de ce manuscrit). Ensuite, la protéine

de capside en s’associant avec l’ARN viral, peut s’oligomériser entrainant la formation de

nucléocapsides (Kunkel et al., 2001) capables de bourgeonner à la membrane du RE

(Blanchard et al., 2002). Les mécanismes par lesquels les nucléocapsides s’enveloppent sont

encore mal compris : i) la protéine de capside peut se lier aux glycoprotéines d’enveloppe E1

et E2, ce qui permettrait aux nucléocapsides de s’envelopper au niveau des membranes du RE

ou des membranes associées aux GL où la protéine E2 est retrouvée (Miyanari et al., 2007)

ii) la protéine NS2 interagit quant à elle avec la protéine p7 ainsi qu’avec la glycoprotéine

d’enveloppe E2 et pourrait jouer un rôle dans la formation des particules virales en réunissant

les glycoprotéines d’enveloppe et les nucléocapsides naissantes (Yi et al., 2009); (Ma et al.,

2011); (Popescu et al., 2011). La protéine p7 interviendrait aussi probablement en protégeant

les particules virales de l’acidité intracellulaire (cf paragraphe II) C. 2. b) (1)) avant que

celles-ci ne soient sécrétées par exocytose. Le métabolisme lipidique aurait une place

importante lors de la maturation des virions. En effet, il a été montré que les particules virales

sont assemblées sous forme de particules de forte densité (>1,15g/ml) mais qu’elles

acquièrent des éléments (les lipoprotéines) qui leur confèrent une faible densité (<1,14g/ml)

durant leur sécrétion. (Gastaminza et al., 2006); (Lindenbach et al., 2006), ce qui est confirmé

par l’analyse de la densité des virions circulants chez les patients chroniquement infectés par

le HCV (cf paragraphe II) B.). Cette association avec les lipoprotéines pourrait aussi

expliquer le fait que le virus n’ait jamais été visualisé en microscopie électronique.

38

Cependant, selon la cellule hôte dans laquelle les virus sont produits, leur composition en

lipides, leur taille et leur densité sont différentes (Gastaminza et al., 2010); (Merz et al.,

2011). A différentes étapes du cycle infectieux du HCV, le métabolisme lipidique semble

donc être important. Un paragraphe sur cette relation étroite est développé en III) C.

Figure 11 : Représentation schématique du cycle infectieux du HCV (Popescu & Dubuisson, 2010). L’entrée du virus dans la cellule est un processus séquentiel qui aboutit à l’endocytose du HCV (1). L’ARN viral une fois libéré va être traduit et donne naissance à un polypeptide précurseur, ancré dans le RE, qui va être maturé de façon co- et post-traductionnelle pour produire les formes matures des protéines du HCV (2). La réplication du HCV est assurée par un complexe de réplication dans lequel sont associées les protéines non structurales l’ARN viral et des facteurs cellulaires (3). Cette étape du cycle viral est caractérisée par la formation d’une plate forme de réplication, le « membranous web ». L’assemblage viral aurait lieu à la surface des GL associées à la membrane du RE, Le métabolisme lipidique aurait une place importante lors de la maturation et la sécrétion des virions (4).

F. Modèles d’étude

1. Les modèles in vivo

a) Les primates

Expérimentalement, le chimpanzé (Pan troglodyte) est le seul animal à pouvoir être infecté de

façon stable et reproductible par le HCV (Barba et al., 1997); (Wakita et al., 2005);

39

(Lindenbach et al., 2006). Il constitue un modèle animal idéal, proche du modèle humain, qui

a notamment permis l’identification du HCV (Choo et al., 1989). La maladie hépatique

évolue de la même manière que chez l’homme, bien que les signes cliniques soient le plus

souvent atténués, les chimpanzés ne développant pas de cirrhose et/ou de fibrose (Bukh,

2004). Néanmoins, l’utilisation du chimpanzé comme modèle d’étude reste limitée, pour des

raisons éthiques principalement mais aussi du fait de sa rareté et du coût de son entretien

(Grakoui et al., 2001). D’autres primates tels que les tamarins (Sanguinus sp.), les singes

hiboux (Aotus trivirgatus), les ouistitis à toupet blanc (Callithrix jacchus) et la musaraigne

des arbres (Tupaia belangeri chinensis), mammifère proche des primates, se sont aussi révélés

sensibles à l’infection expérimentale par le HCV ou le GBV-B (Schlauder et al., 1995); (Xie

et al., 1998); (Bukh et al., 2001); (Lanford et al., 2003); (Martin et al., 2003), mais ces

modèles restent peu utilisés.

b) Les rongeurs

Les modèles murins et notamment la souris (Mus musculus domesticus) constituent des

modèles moins coûteux et plus facile d’entretien. Deux types de modèles ont été développés :

les souris transgéniques pour certaines protéines virales et les souris possédant un foie

chimérique susceptibles à l’infection par le HCV (foie humanisé). Des souris transgéniques

exprimant spécifiquement dans le foie une ou plusieurs protéines virales du HCV, ont ainsi

permis l’étude de la pathogenèse virale, ces souris développant une stéatose et un

hépatocarcinome (cf paragraphe III) B. c)). Le deuxième modèle fait référence à des souris

immunodéprimées possédant un foie chimérique constitué en partie d’hépatocytes humains

(Mercer et al., 2001); (Bissig et al., 2010). L’infection de ces souris avec des sera de patients

infectés par le HCV induit une virémie durable, similaire à celle observée chez les sujets

atteints et une production de particules virales infectieuses (Lindenbach et al., 2006). Ce

modèle pourra s’avérer utile pour tester de nouveaux agents thérapeutiques (Kneteman et al.,

2006); (Meuleman et al., 2008); (Bissig et al., 2010) mais reste peu utilisé du fait contraintes

dues à sa mise en place. Récemment des souris humanisées avec un système immunitaire

intact et susceptibles à l’infection par le HCV ont été développées et représentent une avancée

majeure pour l’étude de l’entrée virale. Néanmoins le virus ne semble pas se répliquer chez

ces souris et doit donc être améliorer (Dorner et al., 2011); (Dolgin, 2011).

40

2. Les modèles in vitro

a) Les cultures primaires et les lignées immortalisées

Les premiers essais de mise au point d’un système cellulaire d’étude du HCV avaient pour

objectif de reproduire le plus fidèlement l’infection humaine. Le modèle proposé reposait sur

l’utilisation d’hépatocytes isolés de patients chroniquement infectés par le HCV (Ito et al.,

1996) qui, mis en culture étaient capables de répliquer le virus et de produire des particules

infectieuses. Les cultures primaires de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC)

ont aussi été utilisées mais la réplication virale y est faible (Cribier et al., 1995). Cependant

ces systèmes de culture primaire étant peu reproductibles, d’autres essais ont été proposés

dans des lignées cellulaires immortalisées susceptibles à l’infection telles que les lignées de

type hépatique (HepG2, Huh7, PH5CH) et les lignées de lymphocytes T et B (MOLT-4, MT-

2 et Daudi) (Bartenschlager & Lohmann, 2001). Néanmoins là encore, ces cellules ne

permettent pas une forte réplication du virus (Pietschmann et al., 2002).

b) Le modèle réplicon

Ce modèle est basé sur la sélection de cellules où la réplication virale est particulièrement

efficace. Il consiste en un ARN bicistronique, le réplicon, capable de se répliquer de façon

autonome in vitro (Lohmann, 1999). Il est constitué d’une part de la séquence codant un

marqueur de sélection (gène de résistance à la néomycine) placée sous le contrôle de l’IRES

du HCV (premier cistron), et d’autre part de la séquence codant les protéines du HCV,

dépendant de l’IRES du virus de l’encéphalomyocardite (EMCV) (deuxième cistron). Les

premiers modèles mis au point consistaient en des réplicons sous-génomique, portant la

séquence codant les protéines NS2 à NS5B puis NS3 à NS5B (unité minimale de réplication).

Ces réplicons se répliquent de manière efficace dans les cellules hépatocytaires Huh-7, sous

pression de sélection (Lohmann, 1999), les quantités d’ARN viraux produits étant bien

supérieures à celles obtenues avec les modèles précédemment décrits. Cette sélection a permis

l’isolation de sous populations cellulaires permettant une réplication optimale du VHC,

comme les clone Huh-7.5 et Huh-7.5.1 (Blight et al., 2002); (Zhong et al., 2005) (cf

paragraphe II) F. 2. e)). Ces clones se sont ensuite avérés très important lorsqu’ont été établis

les premiers modèles de propagation du HCV in vitro (cf paragraphe II) F. 2. e)). Les hauts

niveaux de réplication obtenus grâce à ces réplicons sous-génomiques ont permis des

avancées importantes quant à la compréhension de la réplication du HCV et l’étude des

41

mécanismes d’action de molécules antivirales. Dans un deuxième temps, des réplicons

génomiques portant la séquence codant pour l’ensemble du génome viral ont été mis au point,

mais ceux-ci n’ont pas permis d’obtenir une production de virus, probablement du fait de la

survenue de mutations adaptatives entrainant un déficit dans l’assemblage viral.

c) Le modèle des virus-like particle (VLP et système SFV)

En l’absence d’un système reproduisant le cycle complet du HCV, des systèmes d’étude des

étapes précoces du cycle viral ont été créés. L’expression en cellules d’insectes d’un

baculovirus portant les séquences des protéines structurales du HCV a permis la production de

pseudo particules virales (VLP) capables de s’auto-assembler mais non sécrétées hors de la

cellule (Baumert et al., 1998). L’utilisation de ce modèle pour étudier l’entrée virale n’est

donc pas idéale. Un autre système d’études a ainsi été mis en place : il s’agit d’un vecteur

dérivant du virus de la forêt de Semliki (SFV) qui permet l’expression des protéines

structurales du HCV (Figure 12A) au sein de lignées cellulaires issues de rein de hamster

(BHK-21). Ce modèle s’est avéré intéressant pour l’étude de la morphogenèse du HCV et la

stéatose viro-induite. Il est en effet possible d’observer au niveau du RE, la formation de GL

liées à l’expression de la protéine de capside du HCV. De plus l’analyse en microscopie

électronique de cellules exprimant cette construction a mis en évidence le bourgeonnement de

pseudo-particules virales d’environ 50nm de diamètre au niveau des membranes du RE

(Figure 12B) (Blanchard et al., 2002), bourgeonnement qui était rendu possible grâce au

clivage par la SPP de la protéine de capside (Ait-Goughoulte et al., 2006). Le

bourgeonnement reste néanmoins incomplet et là encore ne permet pas la production de

particules infectieuses.

42

Figure 12 : Modèle chimère SFV-HCV. A : représentation des génomes des virus SFV et HCV et du modèle chimère SFV-HCV codant les protéines structurales du HCV sous le contrôle du promoteur du virus SFV. B : les flèches indiquent le bourgeonnement de pseudo particules virales dans la lumière du RE de cellules de rein de hamster (BHK-21) exprimant les protéines structurales du HCV en modèle SFV, observées au MET (barre = 100nm) (Blanchard et al., 2002).

d) Le modèle des pseudoparticules virales (HCVpp)

Parallèlement aux VLP, un modèle d’infection simple et reproductible a été développé à partir

de vecteurs rétroviraux. Il consiste en la production dans les cellules embryonnaires humaines

HEK-293T de particules rétrovirales pseudotypées avec les protéines d’enveloppe du HCV

(HCVpp). Ce système repose sur la capacité qu’ont les rétrovirus à incorporer des

glycoprotéines d’enveloppe d’un autre virus (Briggs et al., 2003). Trois vecteurs d’expression

sont utiles à cette production : (i) un vecteur codant les protéines d’enveloppe E1 et E2 du

HCV, (ii) un vecteur codant pour les protéines gag et pol du virus de la leucémie murine

(MLV) ou du VIH, et (iii) un vecteur portant un gène rapporteur (luciférase ou GFP) et des

séquences rétrovirales nécessaires à la production des HCVpp. Les particules rétrovirales

produites portent à leur surface les protéines d’enveloppe E1 et E2 et servent ensuite à infecter

des cellules. L’infectiosité des HCVpp est alors évaluée par la mesure de l’expression du gène

rapporteur. Ce modèle a contribué aux avancées majeures faites sur la compréhension des

mécanismes des étapes précoces de l’entrée virale (Bartosch et al., 2003). Cependant ce

modèle ne permet d’étudier que l’entrée virale mais pas la réplication et l’assemblage du

HCV (Sandrin et al., 2005). Néanmoins il a longtemps été utilisé du fait de l’absence d’un

système de culture du virus complet.

B A

43

e) Le modèle en culture cellulaire (HCVcc)

Ce n’est qu’en 2005, à partir d’un clone cellulaire issu d’un patient japonais atteint d’une

hépatite fulminante (JFH1, génotype 2a), qu’un système de culture du virus complet a été

développé (Wakita et al., 2005). Ce modèle permet la production de particules virales

infectieuses in vitro et in vivo. (HCVcc) (Wakita et al., 2005); (Lindenbach et al., 2005);

(Lindenbach et al., 2006); (Zhong et al., 2005). Bien que ce clone puisse se répliquer dans des

lignées cellulaires autres qu’hépatiques, il semble dépendant de la lignée hépatocytaire Huh-7

et plus particulièrement de ses sous clones Huh-7.5 et Huh-7.5.1 (Lindenbach et al., 2005);

(Bartenschlager & Pietschmann, 2005). Des modèles utilisant des clones d’autres génotypes

ont été décrits, notamment avec des souches de génotype 1a, le plus étudié. Mais ces modèles

se sont révélés peu efficaces dans la production de particules infectieuses (Yi et al., 2006);

(Kato et al., 2007); (Bartenschlager, 2005); (Lindenbach et al., 2006), du fait d’un défaut de la

voie de sécrétion des VLDL dans les cellules Huh-7. Une alternative est la mise en place de

génotypes chimères où une partie du génome du clone JFH1 est remplacé par d’autres

génotypes (Pietschmann et al., 2006). De cette façon, des chimères possédant les séquences

codant de la protéine de capside au début de NS2 de la souche J6 (génotype 2a) ou de la

souche S52 (génotype 3a) fusionné aux séquences codant les protéines non structurales du

clone JFH1 ont été produits. Ces chimères se répliquent efficacement et permettent une

production plus importante de particules virales par rapport à la séquence sauvage JFH1

(Lindenbach et al., 2005); (Gottwein et al., 2007); (Yi et al., 2007).

f) Le modèle HCVpc

Récemment un système plus fidèle à l’infection in vivo a été décrit. Il s’agit d’un modèle en

culture primaire d’hépatocytes humains (Primary cultures of Human adult Hepatocytes PHH)

infectés par des particules HCVcc. Ce système présente l’avantage de produire des particules

virales de faible densité et hautement infectieuses ayant les mêmes propriétés que les

particules produites lors de l’infection naturelle in vivo (Podevin et al., 2010).

44

III) Virus de l’Hépatite C et métabolisme lipidique

Le HCV et le métabolisme lipidique sont étroitement liés et interconnectés. Si le HCV

détourne le métabolisme lipidique à son profit à plusieurs étapes de son cycle viral, il peut

aussi l’influencer et le modifier (Heaton & Randall, 2011).

A. Le métabolisme lipidique

Les lipides sont ingérés par l’organisme principalement sous la forme de triglycérides (TG)

dérivés d’acides gras. Les métabolismes de leur synthèse et de leur dégradation sont contrôlés

par le foie et le tissu adipeux.

1. Synthèse et dégradation lipidique

Les phénomènes décrits dans cette partie sont résumés schématiquement sur la Figure 13.

a) Lipogenèse : synthèse des acides gras

En parallèle de l’apport en lipides alimentaires, la synthèse de novo des lipides à partir du

glucose se déroule essentiellement dans le foie et le tissu adipeux principalement en période

post-prandiale lorsque la glycémie est élevée. La décomposition du glucose lors de la

glycolyse aboutit à la formation de pyruvate qui est capté par les mitochondries où il est

oxydé en acétyl-CoA. L’acétyl-CoA mitochondrial est ensuite pris en charge par un

transporteur puis par l’acétyl-CoA-carboxylase (ACC) qui libère du malonyl-CoA dans le

cytosol. Des composés à deux atomes de carbone sont alors successivement assemblés à

l’aide du complexe enzymatique de la Fatty Acid Synthase (FAS), conduisant à la formation

d’acides gras de 2 à 16 carbones (palmitate). L’élongation des acides gras et leur insaturation

peuvent se poursuivre dans le RE.

b) Synthèse des triglycérides (TG)

Les TG sont des lipides dits « de réserve d’énergie ». Leur synthèse a lieu au niveau du RE

de toutes les cellules de l’organisme et est très importante principalement dans les

entérocytes, les adipocytes et les hépatocytes. La synthèse des TG consiste en une

45

estérification de 3 acides gras avec une molécule de glycérol. Les acides gras sont tout

d’abord activés en acyl-CoA via l’acyl-CoA-synthétase (ACS) ; deux acyl-CoA vont alors

interagir avec le glycérol 3 phosphate issu de la glycolyse pour donner l’acide phosphatidique,

cette réaction étant catalysée par l’acyl transférase. L’acide phosphatidique est ensuite

transformé en diaglycérol (DG) qui va réagir avec un troisième acyl-CoA pour donner un TG.

Cette dernière étape fait intervenir une acyl-CoA diaglycérol transférase (DGAT). En fonction

des besoins énergétiques de la cellule, les TG ainsi formés sont soit stockés au sein de GL (cf

paragraphe III) A. 3.), soit participent à la synthèse des VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b)

(2)) ou sont hydrolysés en acides gras et dirigés vers la ß-oxydation (cf paragraphe III) A. 1.

c)).

c) Métabolisme des lipides

La lipolyse a lieu lorsque la glycémie s’abaisse et que l’organisme est en forte demande

énergétique. Les lipides sont alors dégradés pour fournir de l’énergie. Dans le tissu adipeux,

elle permet l’hydrolyse des TG stockés. Celle-ci est catalysée par l’enzyme HSL (Hormone-

Sensitive Lipase), inhibée par l’insuline dans les conditions physiologiques normales, elle

entraîne une libération d’acides gras libres qui peuvent être utilisés et métabolisés au niveau

hépatique. Les acides gras destinés à être dégradés par la cellule hépatique sont alors

préalablement activés en acyl-CoA par les ACS situées dans la membrane mitochondriale

puis transportés dans la mitochondrie par un composé de la carnitinepalmitoyltransferase I

(CPT I), de la carnitine-acylcarnitine translocase (CAT) et de la carnitine palmitoyltransferase

II (CPT II). La ß-oxydation consiste en un ensemble de cycles réactionnels qui raccourcissent

l’acyl-CoA de deux carbones et libère un acétyl-CoA. Pour les acides gras à très longue

chaine, la ß-oxydation a lieu dans les peroxysomes, cette voie permettant de raccourcir les

acyl-CoA à très longue chaîne, à l’aide d’un complexe enzymatique faisant intervenir

notamment l’acyl-CoA-oxydase (AOX). Ceci permet d’obtenir des acyl-CoA à longue chaîne

qui peuvent ensuite entrer dans la mitochondrie via le système CPT afin de subir une ß-

oxydation complète. En période post-prandiale, la lipolyse est régulée négativement par le

malonyl-CoA, qui, produit lors de la lipogenèse, va inhiber l’activité de la CPT-I.

Il existe une autre voie d’élimination des acides gras au niveau hépatique: elle consiste en leur

estérification en TG et leur sécrétion sous forme de VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)).

46

d) Régulateurs transcriptionnels de la lipogenèse et la lipolyse

Le contrôle de la synthèse et de la dégradation des acides gras est assuré par différents types

de régulateurs transcriptionnels, dont l’activation va dépendre de l’état nutritionnel et

hormonal de l’organisme.

(1) Les protéines de la famille des PPAR

Les PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) sont des facteurs de transcription

dont il existe trois types: PPARα ; PPARδ et PPARγ qui sont exprimés dans le tissu adipeux,

le foie, les muscles et les reins. Dans le foie, PPARγ contrôle l’expression des gènes

impliqués dans la lipogenèse tels que ceux codant pour la FAS et ACC. Son activation par

l’insuline et le glucose favorise ainsi l’accumulation des TG. Les acides gras

intrahépatocytaires peuvent en retour induire l’expression de PPARα qui va stimuler

l’expression des gènes impliqués dans les ß-oxydation peroxysomale et mitochondriale

(Schoonjans et al., 1996); (Dreyer et al., 1992) en activant l’expression des gènes codant

l’ACS responsable de l’activation des acides gras, de l’AOX (peroxysome) et de la CPTI

(mitochondrie) (Brady et al., 1989) responsable de l’entrée des acides gras dans la

mitochondrie.

(2) Le facteur SREBP-1c

Le facteur SREBP-1c appartient à la famille des SREBP (Sterol Regulatory Element Binding

Protein), impliqués dans la régulation des gènes du métabolisme du cholestérol et de la

lipogenèse. L’isoforme SREBP-1c est principalement exprimé dans le foie et le tissu adipeux.

Il est synthétisé sous la forme d’un précurseur lié à la membrane du RE, son activation est

dépendante de l’état nutritionnel. Ainsi, lors d’un apport nutritionnel important, le précurseur

est clivé et la forme mature est transloquée dans le noyau. SREBP-1c va ensuite se lier sur des

éléments de réponse nucléaires spécifiques et induire l’expression d’enzymes telles que

l’ACC et la FAS (Shimano, 2009).

(3) Le facteur ChREBP

ChREBP est un facteur de transcription exprimé essentiellement par le tissu hépatique et le

tissu adipeux qui agit en synergie avec SREBP-1c. Son activation et la translocation nucléaire

qui en découle dépendent du glucose. Il intervient de la même façon que SREBP-1c dans la

47

transcription de gènes impliqués dans la lipogenèse, tels que les gènes codant l’ACC et FAS

(Iizuka et al., 2004); (Iizuka & Horikawa, 2008).

(4) Le récepteur LXR

Le récepteur nucléaire LXR existe sous deux isoformes LXRα, retrouvé dans le foie et le tissu

adipeux, et LXRß, exprimé de façon ubiquitaire. LXR forme un hétérodimère avec RXRα et

est impliqué principalement dans l’homéostasie du cholestérol et de façon plus générale dans

l’homéostasie des acides gras. Le récepteur régule ainsi la transcription des gènes impliqués

dans la lipogenèse, tels que les gènes codant l’ACC et FAS (Joseph et al., 2002) mais aussi

contrôle la transcription des gènes codant SREBP-1c et ChREBP (Liang et al., 2002); (Chen

et al., 2004); (Cha & Repa, 2007).

Figure 13 : Schéma récapitulatif de la synthèse et la dégradation des lipides ainsi que de leur régulation. Les différentes voies représentées sont détaillées dans la partie III) A. 1. de ce manuscrit.

48

2. Le transport des lipides

L’homéostasie des cellules de l’organisme dépend en partie des lipides qu’elles captent dans

le sang. Le transport de ces substances hydrophobes nécessite la formation de particules

présentant des surfaces hydrophiles : les lipoprotéines.

a) Structure et classification

Les lipoprotéines sont des édifices formés d’un cœur lipidique hydrophobe composé de TG et

d’esters de cholestérol, entouré d’une monocouche de phospholipides, de cholestérol libre et

de protéines amphiphiles, les apolipoprotéines qui assurent la liaison entre le cœur

hydrophobe et le milieu sanguin hydrophile (Figure 14). Une classification basée sur les

densités de flottaison de ces particules et donc sur leur contenu en lipides et en apoliprotéines

a permis de définir cinq groupes de lipoprotéines : les chylomicrons, particules composées de

90% de TG, qui ont la densité la plus faible ; les lipoprotéines de très faible densité (VLDL) ;

les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL) ; les lipoprotéines de faible densité (LDL) et

les lipoprotéines de haute densité (HDL) (Tableau 1). Les apolipoprotéines présentes à leur

surface reconnaissent spécifiquement certains récepteurs dans les tissus et assurent aussi la

mobilisation rapide des lipides les composant, en agissant comme des co-facteurs de l’enzyme

responsable du métabolisme des lipides : la lipoprotéine lipase (LPL).

Figure 14 : Schéma d’une lipoprotéine. Elle est formée d’un cœur lipidique composé de TG et d’esters de cholestérol, entouré d’une monocouche de phospholipides, de cholestérol libre et d’apolipoprotéines. (http://homepage.smc.edu/wissmann_paul /anatomy2 textbook /1choles terol.html)

49

Lipoprotéine Densité (g/ml) Diamètre (nm) % protéines % CL % PL % TG Apolipoprotéines

chylomicron 0,93 75-1200 <2 8 7 84 A, B48, C, E

VLDL 0,93-1,006 30-80 10 22 18 50 B100, C, E

IDL 1,006-1,019 27-35 18 29 22 31 B100, C, E

LDL 1,019-1,063 18-27 25 50 21 8 B100

HDL 1,063-1,210 7-12 33 30 29 4 A, C, E

Tableau 1 : Classification des lipoprotéines. Les différentes lipoprotéines sont décrites sur des critères de densité, taille et selon leur composition en lipides et en apolipoprotéines. CL : Cholestérol Libre ; PL : Phospholipides ; TG : Triglycérides.

b) Le métabolisme des lipoprotéines

La formation des lipoprotéines est un processus métabolique dynamique où les lipoprotéines

échangent constamment apolipoprotéines de surface et lipides. Trois voies principales sont

distinguées: la voie exogène, la voie endogène et la voie inverse. (Figure 16)

(1) La voie exogène

Cette voie assure le transport des lipides issus de l’alimentation depuis l’intestin vers le foie,

où ils vont être traités. Elle débute par l’hydrolyse au sein des entérocytes de l’intestin, des

lipides alimentaires qui vont générer des acides gras et du glycérol. Les TG synthétisés à

partir de ces acides gras et du glycérol vont servir à la formation de chylomicrons par

association avec du cholestérol et les apolipoprotéines présentes (ApoB48 et ApoA). Les

chylomicrons sont sécrétés par le pôle basolatéral des entérocytes puis empruntent la voie

lymphatique pour rejoindre la circulation sanguine. Les chylomicrons y échangent alors des

lipides avec d’autres lipoprotéines et s’enrichissent en ApoE et ApoC. La lipolyse des

chylomicrons matures par la LPL fixée à la surface des cellules endothéliales des vaisseaux

sanguins et activée par l’ApoC, entraîne une perte de certaines apoliprotéines de surface, un

appauvrissement en TG et un enrichissement relatif en cholestérol. Des particules résiduelles

de chylomicrons « les chylomicrons rémanants » sont alors générés. Les chylomicrons

rémanants sont ensuite pris en charge par le foie via le récepteur des LDL (LDLR) ou le

récepteur LRP (LDL receptor Related Protein) qui reconnaissent l’ApoE présent à leur

surface, puis métabolisés.

50

(2) La voie endogène : synthèse des VLDL

Cette voie garantit l’apport permanent en TG et cholestérol aux tissus périphériques. Le foie

rassemble les lipides synthétisés ou recyclés, pour former après liaison avec certaines

apolipoprotéines (ApoB100, ApoC), les VLDL. L’assemblage des VLDL se déroule dans le

RE rugueux : au cours de la traduction de l’ApoB100, une partie est transloquée dans le RE

grâce à une protéine présente dans la lumière du RE : la protéine de transfert microsomiale

(MTP). La MTP est une protéine hétérodimèrique formée de deux sous unités, une de 97 kDa

(MTP) et l’autre de 58 kDa (PDI). Elle est aussi responsable du transfert des lipides présents

dans la membrane du RE vers l’ApoB100, empêchant ainsi la dégradation de l’ApoB100

naissante par les voies du protéasome. Une lipoprotéine intermédiaire, la préVLDL, contenant

des TG est ainsi générée, et celle-ci va alors migrer vers un compartiment plus distal de la

voie d’assemblage puis fusionner avec une GL, formée dans le RE lisse, pour donner une

VLDL mature (Shelness & Sellers, 2001) (Figure 15). L’ApoE serait peut être impliquée

dans cette dernière étape, mais les données sont cependant controversées (Mensenkamp et al.,

2001); (Gusarova et al., 2007). Les VLDL sont ensuite secrétées dans la circulation sanguine

où ils sont hydrolysées par la LPL. Les acides gras ainsi libérés sont captés par les tissus

périphériques et seront utilisés comme source d’énergie ou mis en réserve sous la forme de

TG. Des résidus de VLDL, les IDL, sont aussi générés. Ce sont des particules appauvries en

TG et enrichies de façon relative en cholestérol qui vont être captées par le foie via leur

ApoB100 par interaction avec le récepteur aux LDL. Puis en échangeant des lipides et des

apolipoprotéines avec d’autres lipoprotéines, elles sont métabolisées en LDL. Celles-ci sont

prises en charge par le récepteur au LDL présent abondamment au niveau du foie mais aussi

sur la plupart des tissus périphériques, assurant ainsi une source en cholestérol pour les

besoins cellulaires.

51

Figure 15 : Représentation schématique de l’assemblage des VLDL (Shelness & Sellers, 2001). La MTP transfère des lipides présents dans la membrane du RE rugueux vers l’ApoB100 naissante (1, 2). Une lipoprotéine intermédiaire est générée, la préVLDL (3), et va migrer vers un compartiment plus distal de la voie d’assemblage puis fusionner avec une GL formée dans le RE lisse, pour donner une VLDL mature (4, 5 et 6).

(3) La voie inverse : la voie de retour du cholestérol

Elle permet d’éliminer par retour vers le foie, le cholestérol excédentaire présent dans les

tissus périphériques. Les lipoprotéines qui s’en chargent sont les HDL. Ainsi elles vont capter

le cholestérol libre associé aux phospholipides dans les membranes cellulaires grâce au

transporteur ABCA1 (ATP Binding Cassette transporter A1). Les particules HDL natives

(préßHDL) sont des molécules de petite taille et de forme discoïdale. Elles sont synthétisées

principalement par l’intestin, le foie ou pourraient proviennent de la lipolyse des lipoprotéines

riches en TG (chylomicrons et VLDL). La maturation des préßHDL est dépendante de la

lécithine-cholestérol-acyltransférase (LCAT). Présente au sein de ces particules, elle va

assurer un apport en cholestérol estérifié au sein de la particule native. La taille des préßHDL

augmente au fur et à mesure qu’elles s’enrichissent en cholestérol estérifié et en

apolipoprotéines, par échange avec les chylomicrons et les VLDL, évoluant ainsi en particules

HDL3 et HDL2 qui adoptent alors une forme sphérique. La protéine de transfert du

cholestérol estérifié (CETP) peut aussi agir en relais, en échangeant les esters de cholestérol

des HDL contre les TG des VLDL, les LDL et les chylomicrons. Les HDL matures sont alors

captées directement par le foie par l’intermédiaire de leur ApoE ou par l’interaction de leur

ApoA avec le récepteur SR-BI. Le cholestérol est finalement éliminé par la bile ou dégradé en

acides biliaires.

52

Figure 16 : Schéma récapitulatif du métabolisme des lipoprotéines. Les différentes voies représentées sont détaillées dans la partie III) A. 2. de ce manuscrit. CM : chylomicron ; REM : chylomicron rémanant; AG : acides gras ; TG : triglycéride ; CL : cholestérol libre ; CE : cholestérol estérifié ; GLY : glycérol

3. Les gouttelettes lipidiques

La plupart des organismes eucaryotes ont mis en place un système de stockage des lipides

sous la forme de corps gras ou GL dans de nombreux types cellulaires et principalement les

adipocytes du tissu adipeux, mais aussi les cellules hépatiques, les cellules du muscle

squelettique ou les leucocytes.

a) Structure et composition des GL

Les GL adoptent une forme sphérique dont le diamètre varie de 25nm à 100µm. Elles sont

constituées d’un cœur de lipides neutres (triacylglycérol (TAG), diaglycérol (DAG) selon les

types cellulaires et des esters de cholestérol), entouré d’une monocouche de phospholipides

53

dans laquelle s’intègrent ou s’associent du cholestérol libre et des protéines spécifiques

(Murphy & Vance, 1999); (Tauchi-Sato, 2002). Ces protéines sont présentes à la surface et

parfois dans le cœur lipidique des GL (Robenek et al., 2011); elles participent à la formation,

au maintien et à la maturation des GL. (Figure 17)

Figure 17 : Structure schématique d’une gouttelette lipidique (25nm à 100µm) composée d’un cœur de lipides neutres et entourée par une monocouche de phospholipides dans laquelle s’insèrent du cholestérol libre et des protéines (D’après (Fujimoto et al., 2008)).

Les protéines de la famille PAT (Perilipine, ADRP, TIP-47) récemment renommées PLIN

dans les cellules mammifères (Kimmel et al., 2010) sont les protéines majoritairement

retrouvées en surface des GL (Londos et al., 1999); (Miura, 2002). Elles sont

interchangeables à la surface des GL et la présence de chacune d’elle dépend du type

cellulaire et des besoins de la cellule (Bickel et al., 2009). L’ADRP et la perilipine sont

constitutivement présentes à la surface des GL (CPAT : Constitutively TAG-associated PAT

proteins) et réguleraient constamment les réserves de TG en fonction des demandes

énergétiques (Wolins et al., 2006). La perilipine est la protéine majoritaire des GL retrouvées

dans les adipocytes (Greenberg et al., 1991); (Blanchette-Mackie et al., 1995); (Blanchette-

Mackie et al., 1995); (Brown, 2001). Elle participerait au maintien des GL, leur évitant leur

dégradation par les lipases cytosoliques. L’ADRP est exprimée de façon ubiquitaire (Murphy

& Vance, 1999) et serait impliquée dans la formation et la stabilisation des GL ainsi que dans

l’accumulation des TG (Imamura et al., 2002). Elle est présente en grande quantité à la

surface des GL dans les cellules qui n’expriment pas la perilipine (Fujimoto et al., 2004). Elle

joue un rôle dans le maintien du contenu en lipides des GL lors de la lipolyse et dans le

transfert des lipides entre les membranes du RE et les GL. D’autres protéines de la famille

PAT/PLIN sont présentes à la surface des GL de façon réversible (EPAT : Exchangeable

TAG-associated PAT proteins) lorsqu’un stockage rapide des TG est nécessaire (Wolins et

al., 2006): ainsi, la protéine TIP47, exprimée de façon ubiquitaire et la protéine S3-12

25nm à 100µm25nm à 100µm

54

présente principalement dans le tissu adipeux s’accumulent à la surface des GL en réponse à

un stimulus lipogénique ou lipolytique (Wolins et al., 2001); (Wolins et al., 2003);

(Brasaemle, 2004). La protéine OXPAT, exprimée notamment dans le tissu adipeux et le foie

(Wolins et al., 2006), participe quant à elle au maintien du contenu des GL (Dalen et al.,

2007).

Une autre protéine, la séipine, qui se trouve à la jonction entre le RE et les GL, participe au

maintien de la structure et de la taille des GL (Szymanski et al., 2007). De plus des protéines

dérivant du RE comme la calnexine et la protéine BiP (Ploegh, 2007), des protéines

impliquées dans la lipogenèse (Fujimoto et al., 2004) et dans la signalisation cellulaire (Ozeki

et al., 2005) ont aussi été trouvées à la surface des GL. Enfin, les cavéolines (Brown, 2001),

qui dans des conditions physiologiques normales sont plutôt retrouvées à la membrane

plasmique, seraient redirigées à la surface des GL pour favoriser la mise en réserve des lipides

quand leur concentration extracellulaire ou celle du cholestérol deviennent trop importantes.

Les cavéolines ressemblent aux oléosines identifiées chez les plantes (cf paragraphe II) C. 2.

a) (1)). Elles s’associent aux GL via un domaine spécifique. Dans les adipocytes, elles

seraient impliquées dans le maintien de la structure des GL lors de leur croissance en régulant

l’apport de cholestérol libre et de phospholipides au sein de la couche de phospholipides (Le

Lay et al., 2006); (Blouin et al., 2010). Les cavéolines sont aussi retrouvées dans le cœur

lipidique des GL (Robenek et al., 2004), néanmoins leur rôle reste mal connu.

b) Fonction des GL

Tout d’abord identifiées pour leur rôle dans le stockage des lipides, les GL constituent une

réserve d’énergie rapidement mobilisable par l’organisme. Néanmoins il est maintenant admis

que les GL sont des organites extrêmement dynamiques qui pourraient participer, d’après les

données protéomiques, à de nombreuses autres fonctions cellulaires telles que le trafic des

vésicules intracellulaires, (Liu, 2003) et la signalisation cellulaire (Umlauf, 2004); (Ozeki et

al., 2005); (Bartz et al., 2007). Plusieurs protéines de la famille Rab pourraient ainsi interagir

avec les GL. Lorsque la lipolyse est stimulée, la protéine Rab18 est adressée à la surface des

GL ce qui favorise le rapprochement des GL avec les membranes du RE et ainsi le transfert

des lipides (Ozeki et al., 2005). La protéine Rab5 serait quant à elle impliquée dans

l’interaction entre les GL et les endosomes (Liu et al., 2007). Les GL semblent aussi être le

point de convergence des mécanismes de dégradation par le protéasome et l’autophagie

(Fujimoto & Ohsaki, 2006).

55

c) Biogenèse et croissance

(1) Modèles de biogenèse

Le modèle couramment accepté est celui d’une synthèse de TG et d’une formation des GL

concomitantes dans les membranes du RE (Murphy & Vance, 1999). Les lipides en cours de

synthèse s’accumulent dans la membrane du RE puis, lorsque leur nombre dépasse la capacité

que peut retenir la double membrane du RE, les lipides commencent à s’insérer entre les deux

feuillets de la membrane formant un globule lipidique. Les techniques de microscopie

actuelles ne sont pas assez résolutives pour permettrent de voir cette suite d’évènements.

Néanmoins, dans des cellules pour lesquelles les mécanismes de dégradation de l’ApoB sont

inhibés, des GL arborant des ApoB à leur surface ont été observées (croissant ApoB) (Ohsaki

et al., 2008); (Ohsaki et al., 2009). L’apport de lipides au niveau de ces ApoB ce fait via

l’enzyme MTP présente dans les membranes du RE. Les ApoB lipidées non dégradées

s’accumulent alors sur le feuillet interne de la membrane du RE. L’existence de telles GL va

donc dans le sens d’une accumulation de lipides entre les feuillets de la membrane du RE. De

plus, des régions spécialisées du RE associées aux mitochondries (MAM : Membranes

Associées aux Mitochondries) qui concentrent les enzymes responsables de la synthèse des

lipides neutres (DGAT et Acyl-CoA cholestérol acyltransférase ACAT) ont été mises en

évidence (Murphy & Vance, 1999) et auraient une composition en phospholipides différente

du reste de la membrane du RE (Ohsaki et al., 2008). Ces enzymes étant impliquées dans la

synthèse des esters de cholestérol, il a été suggéré que les esters de cholestérol nouvellement

formés pourraient jaillir de ces régions en s’entourant d’une enveloppe de phospholipides

formant ainsi des GL (Chang et al., 2001).

Puis lorsqu’à son tour le globule lipidique contenu entre les feuillets de la membrane du RE

atteint une taille critique (Figure 17):

i) soit il bourgeonnerait de la membrane du RE en emportant avec lui une partie du

feuillet externe, donnant ainsi naissance à une GL indépendante (Ploegh, 2007); (Fujimoto et

al., 2008) (Figure 18 A à E) ; cependant, il est possible que la GL reste physiquement

attachée à la membrane du RE (Goodman, 2008) (Figure 18 E). Un paragraphe sur la relation

étroite qui lie la membrane du RE et les GL est développé dans la suite de ce manuscrit (cf

paragraphe III) A. 3. c) (2)).

56

ii) soit il pourrait se former à partir des deux feuillets de la membrane du RE en

emportant avec lui une partie de la double membrane créant ainsi un transitoirement un pore

au niveau de la membrane (Ploegh, 2007) (Figure 18 F et G). Cette hypothèse permettrait de

comprendre comment la cavéoline, initialement retrouvée au niveau du feuillet interne de la

membrane du RE, pourrait se retrouver dans le cœur des GL (Robenek et al., 2004).

Cependant, le mécanisme d’un tel transfert reste mal compris. D’autre part l’existence d’un tel

dispositif permettrait d’expliquer le fait que des protéines transmembranaires dérivées du RE

telles que la calnexine et BiP se retrouvent à la surface des GL (Ploegh, 2007).

Les protéines de la famille PAT participeraient à la déformation du feuillet externe de la

membrane du RE lorsque la GL bourgeonnerait (Wolins et al., 2006). Ces protéines sont aussi

retrouvées sur la membrane plasmique, ainsi en cas d’apport trop important de lipides dans la

cellule, et lorsque tous les sites pouvant jouer un rôle dans la biogenèse et/ou la croissance des

GL au niveau des membranes du RE seraient saturés. Dans ce cas, la synthèse des GL pourrait

avoir lieu au niveau de la membrane plasmique (Robenek et al., 2009); (Robenek et al.,

2011).

Dans les leucocytes, des GL contenant en leur cœur des ribosomes et d’autres protéines en

plus des lipides ont été identifiées. Ces GL résulteraient d’une compilation des membranes du

RE et d’autres membranes cellulaires, dans lesquelles les lipides se seraient déposés ou

auraient été directement synthétisés (Wan et al., 2007).

57

Figure 18 : Modèle de biogenèse des gouttelettes lipidiques. Schématiquement le feuillet externe de la membrane du RE est représenté en bleu, le feuillet interne, en vert. Les protéines de surface (en rouge et marron) et une protéine transmembranaire (violet) sont aussi figurées. Les lipides s’accumulent entre les feuillets de la membrane du RE formant un globule lipidique (A et B). Lorsqu’il atteint une taille critique : soit le globule bourgeonne de la membrane du RE en emportant avec lui une partie du feuillet externe, donnant ainsi naissance à une GL (C et D) ou ne se détache pas complètement de la membrane du RE (E). Soit il éclot à partir des deux feuillets de la membrane du RE en emportant avec lui une partie de la double membrane créant ainsi un transitoirement un pore au niveau de la membrane et emportant avec lui les protéines associées (F et G).

(2) GL et membranes du RE : une relation étroite ?

Les données actuelles ne nous permettent pas de savoir si les GL sont des organites cellulaires

totalement détachés des membranes du RE ou si elles sont en contact permanent avec le RE. Il

est également possible que ces deux types de GL co-existent. Plusieurs hypothèses ont été

formulées sur les mécanismes par lesquels elles régulent leur contenu en lipides et accroissent

leur taille. Des arguments sont en faveur de l’hypothèse d’une association constante des GL et

58

des membranes du RE (Figure 19): i) le feuillet externe de la membrane du RE serait en

continuité avec la surface des GL (Blanchette-Mackie et al., 1995). De plus, les membranes

du RE et les GL semblent bouger de façon coordonnée (Targett-Adams, 2003) (Figure 19 A);

ii) un autre modèle expliquant la biogenèse et/ou la croissance des GL serait l’apposition des

GL avec des membranes dérivées du RE riches en adipophiline, formant une sorte de

coquetier (le RE) portant un œuf (la GL) qui permettrait un échange constant des lipides et de

l’ADRP (Robenek et al., 2006); (Robenek et al., 2011), mais sans fusion des membranes

(Figure 19 B et C). Lors d’une stimulation entraînant une accumulation de GL, les protéines

de la famille PAT pourraient se réorganiser et s’agréger dans des zones de la membrane

plasmique juxtaposées aux GL Un tel mécanisme pourrait avoir lieu au niveau de la

membrane du RE contribuant ainsi à un transfert constant des lipides du RE aux GL

(Robenek, 2005); (Goodman, 2008); iii) la synthèse des TG pourrait avoir lieu dans ces zones

du RE proches de la surface des GL, ce qui expliquerait comment des GL existantes

pourraient augmenter leur taille via l’apport de TG (Kuerschner et al., 2008). Ceci serait

régulé par la présence des enzymes DGAT1 (aux membranes du RE) et DGAT2 (au niveau

des GL ou d’une partie de la membrane du RE associée aux GL) (Yen et al., 2008). Chez la

levure, il a aussi été mis en évidence que le transport des protéines de la membrane du RE aux

GL et inversement intervient de façon rapide et que cela ne semble pas dépendre de la

température ni nécessiter de l’énergie, ce qui serait en accord avec une association constante

de la membrane du RE et des GL (Jacquier et al., 2011).

59

Figure 19 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes lipidiques, hypothèse d’une association constante (Robenek et al., 2006); (Zehmer et al., 2009) avec (A) ou sans (B et C) fusion des membranes. En A, la surface de la GL est en continuité avec le feuillet externe de la membrane du RE. En B la GL avec des membranes dérivées du RE riches en adipophiline, formant une sorte de coquetier (le RE) portant un œuf (la GL) en C. LDIMP pour Lipid Droplet Integral Membrane Proteins, réfère à des protéines intégrées dans la membrane du RE qui peuvent s’accumuler à la surface des GL.

D’autres arguments sont en faveur d’une dissociation des GL et de la membrane du RE

(Figure 20): i) dans des fractions enrichies en GL, purifiées à partir de cellules hépatiques,

des activités enzymatiques liée à la synthèse des TG telle que celle de l’ACS, ont été

identifiées (Fujimoto et al., 2004). En parallèle, des enzymes clés impliquées dans la synthèse

des phospholipides ont été identifiées à la surface des GL (Guo et al., 2008). Ceci pourrait

expliquer comment des GL lipidiques préexistantes pourraient augmenter leur surface ; ii) les

GL portent à leur surface des protéines de type SNARE impliquées dans les phénomènes de

fusion des GL entre elles (Boström et al., 2007); (Söllner, 2007) mais l’implication de ce

mécanisme dans la croissance des GL reste controversé (Thiele & Spandl, 2008); (Ohsaki et

al., 2009). Deux autres mécanismes ont été proposés pour expliquer la croissance des GL.

Dans un premier cas les GL établiraient des cycles de fusion/fission avec la membrane du RE

pour se fournir en lipides (Zehmer et al., 2009); (Fujimoto et al., 2008), dans un second cas

des vésicules de transport spécifiques des lipides pourraient fournir les lipides et des protéines

de la membrane du RE aux GL (Fujimoto et al., 2008); (Guo et al., 2008);(Beller et al.,

2008). Ces mécanismes impliqueraient cependant la mise en place d’un système d’hémifusion

A

B C

A

B C

60

entre une double membrane (RE ou transporteurs spécifiques) et une simple membrane (GL),

un tel modèle reste donc hypothétique (Murphy et al., 2009).

Figure 20 : Relation entre les membranes du réticulum endoplasmique et les gouttelettes lipidiques, hypothèse d’une dissociation (Zehmer et al., 2009). Les GL établiraient des cycles de fusion/fission avec la membrane du RE pour se fournir en lipides.

(3) GL : des organites dynamiques

Les GL sont des organites très dynamiques qui semblent interagir étroitement avec le réseau

de microtubules qui jouerait alors un rôle dans le maintien de l’association des GL au RE

(Luckenbill & Cohen, 1966) et/ou dans l’établissement des cycles de fusion/fission avec les

membranes du RE (Fujimoto et al., 2008). Certaines GL semblent en effet capables de se

déplacer le long des microtubules via la protéine de transport dynéine (Targett-Adams, 2003);

(Boulant et al., 2008). De plus le rapprochement des GL via le réseau de microtubules

pourrait contribuer à la formation et/ou fusion des GL entre elles (Bostrom, 2005);

(Andersson et al., 2006), mais cette implication des microtubules reste néanmoins

controversée (Cheng et al., 2009). Enfin la dynéine pourrait être impliquée dans la biogenèse

des GL, les mécanismes restent cependant méconnus (Andersson et al., 2006).

Par ailleurs, des interactions entre les GL et les mitochondries, les peroxisomes, les

phagosomes, ainsi que les endosomes (cf paragraphe III) A. 3. b)) ont aussi été identifiées,

confirmant que les GL sont des organites non pas restreints au stockage des lipides mais aussi

impliqués dans de nombreux processus cellulaires.

d) GL et synthèse des VLDL

La présence accrue de TG dans le foie conduit soit à leur stockage sous forme de GL soit à

leur sécrétion sous forme de VLDL. Les VLDL sont formés préférentiellement à partir des

lipides contenus dans les GL cytoplasmiques plutôt que ceux du milieu extracellulaire ou ceux

nouvellement synthétisés par la cellule (Gibbons et al., 2000). Les GL seraient donc

61

mobilisées dans des régions du RE spécialisées dans la production des VLDL (Targett-

Adams, 2003) ce qui irait en faveur des mécanismes de fusion/fission des GL cytoplasmiques

avec les membranes du RE. Ainsi les enzymes DGAT2, ACAT2 et la phospholipase D sont

utilisées à la fois pour la synthèse des lipides contenus dans les GL et pour ceux des VLDL

(Buhman et al., 2000); (Ohsaki et al., 2008). L’enzyme MTP est aussi impliquée dans la

formation des GL à partir des membranes du RE (Olofsson et al., 1999). Néanmoins, les

mécanismes de transfert des lipides des GL vers les VLDL restent mal compris. Une

hypothèse serait que la mobilisation des GL aux membranes du RE fournirait des TG à la

MTP contribuant ainsi à la formation des VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)) (Figure 21).

Figure 21 : Formation des gouttelettes lipidiques et synthèse des VLDL. L’accumulation de lipides entre les feuillets de la membrane du RE va entraîner la formation de GL. Les lipides contenus dans GL peuvent aussi être recyclés à la membrane du RE et contribuer à la formation des VLDL (Ohsaki et al., 2008).

B. Syndrome métabolique associé au HCV

1. Données cliniques

Les expériences menées sur les sera de patients infectés par le HCV ou in vivo chez le

chimpanzé ont permis de mettre en évidence que les formes circulantes du HCV ayant la plus

forte infectivité spécifique, les LVP, sont des particules de faible densité qui résultent de

l’association des lipoprotéines de très faible densité (VLDL) portant à leur surface l’ApoB,

l’ApoE et l’ApoCI avec la nucléocapside virale (André et al., 2002); (Meunier et al., 2008).

Le HCV est capable d’interagir directement avec le métabolisme glucidique et lipidique.

L’infection chronique par le HCV est ainsi souvent associée à une insulino-résistance, un

diabète de type 2 et une stéatose hépatique. Dans le sérum des patients chroniquement infectés

on constate aussi une baisse du cholestérol circulant et des concentrations d’ApoB (Hofer et

al., 2002); (Poynard et al., 2003); (Siagris et al., 2006); (Serfaty et al., 2001); (Wu et al.,

62

2010) ainsi qu’une plus faible concentration en TG (Siagris et al., 2005); (Marzouk et al.,

2007); (Dai et al., 2008). Lors d’une infection par un génotype 3 du HCV, la stéatose est plus

sévère et les diminutions en cholestérol (Hofer et al., 2002); (Poynard et al., 2003); (Grassi et

al., 2005); (Siagris et al., 2006), TG (Poynard et al., 2003) et ApoB circulants (Serfaty et al.,

2001) semblent s’accentuer. Néanmoins la concentration en TG ne semblerait pas être un bon

indicateur du profil lipidique des patients infectés par le HCV, les données étant controversées

à ce sujet (Wu et al., 2010); (Ramcharran et al., 2011).

2. L’insulino-résistance et le diabète de type 2

a) Insulino-résistance métabolique

Dans des conditions physiologiques normales, en période post prandiale, l’insuline sécrétée

par le pancréas assure l’utilisation et la mise en réserve des substrats énergétique glucidiques

et lipidiques, par fixation à son récepteur spécifique notamment dans les cellules du foie et du

tissu adipeux. Le récepteur à l’insuline possède une activité catalytique Tyrosine Kinase, la

fixation de l’insuline à son récepteur entraîne l’autophosphorylation de celui-ci. Le récepteur

ainsi activé est à son tour responsable de la phosphorylation, au niveau de leurs résidus

Tyrosine, des protéines substrats du récepteur: les IRS (Insulin Receptor Substrate)

impliquées dans la voie de transduction du signal. L’insuline augmente ainsi l’entrée du

glucose dans les cellules et stimule sa conversion en acides gras en vue de le stocker (cf

paragraphe III) A. 1. a)). Parallèlement, elle inhibe la lipolyse des TG et ainsi la libération

d’acides gras libres dans la circulation sanguine (cf paragraphe III) A. 1. c)).

Une altération de la voie de signalisation de l’insuline est observée chez les personnes obèses

et/ou présentant une insulino-résistance pouvant amener au développement d’un diabète

insulino-résistant (diabète non insulino-dépendant ou diabète de type 2). L’état d’insulino-

résistance se traduit i) au sein du tissu adipeux par une augmentation de la lipolyse, l’insuline

n’étant plus capable d’inhiber la HSL (Lewis et al., 2002) (cf paragraphe III) A. 1. c)) ii) au

niveau périphérique par une hyperinsulémie et une hyperglycémie qui vont favoriser la

lipogenèse hépatique en stimulant l’activation du facteur de transcription SREBP-1c via

l’hyperinsulémie (Shimomura et al., 1999); (Stoeckman & Towle, 2002), du facteur ChREBP

via l’hyperglycémie (Yamashita et al., 2001) et en augmentant l’expression du facteur PPARγ

(hyperinsulémie et hyperglycémie) (Zhang et al., 2006) comme il a été montré dans plusieurs

63

modèles murins (cf paragraphe III) A. 1. d)). Ces paramètres vont ainsi contribuer de façon

concomitante à l’augmentation d’acides gras et de TG dans le foie (Figure 22).

Figure 22 : Schéma récapitulatif de l’impact du syndrome d’insulino-résistance sur le métabolisme lipidique. Les différentes voies représentées sont schématisées en rouge et détaillées dans la partie III) B. 2. a).

b) Insulino-résistance viro-induite

Le diabète de type 2 est une complication fréquente des maladies hépatiques néanmoins

plusieurs études cliniques ont établi un lien entre l’infection par la HCV et la perturbation du

métabolisme du glucose dans la survenue d’une résistance à l’insuline et d’un diabète de type

2 (Allison et al., 1994); (Hung et al., 2011). Ainsi, l’infection par le HCV est associée à un

risque plus élevé de développer une résistance à l’insuline (Yoneda et al., 2007). Cependant,

cet effet semble dépendre du génotype et pourrait être lié à la quantité d’ARN du HCV (Hui et

al., 2003); (Moucari et al., 2008). L’infection par le HCV est susceptible d’accroître la

survenue d’un diabète de type 2 dans une population présentant des facteurs de risque (IMC

élevé, âge) (Mehta et al., 2003) ou non (Wang et al., 2007). De plus, suite à une thérapie anti

64

virale efficace amenant à l’élimination du HCV, la sensibilité à l’insuline est restaurée, et

l’apparition de diabète de type 2 est moins fréquente (Kawaguchi et al., 2007); (Romero-

Gómez, 2006); (Romero-Gómez et al., 2008).

La protéine de capside du HCV pourrait être incriminée dans l’apparition d’une insulino-

résistance hépatique soit i) indirectement via la stimulation de la sécrétion de la cytokine pro-

inflammatoire TNFα qui va activer des Serine/Thréonine kinases qui vont phosphoryler les

IRS sur des résidus Serines et/ou Thréonine. Cette phosphorylation s’opposant à celle des

résidus Tyrosines par le récepteur à l’insuline, les IRS ne sont alors plus capables de se lier au

récepteur à l’insuline interférant ainsi avec la voie de signalisation de l’insuline (génotype 1 et

2) (Aytug et al., 2003); (Shintani et al., 2004); (Pazienza et al., 2007). De plus la protéine de

capside (génotype 3a) serait capable d’induire la formation de microARNs pouvant interférer

avec l’expression de la phosphatase and tensin homolog (PTEN) (PTEN a été identifié comme

un gène suppresseur de tumeur qui est souvent muté dans l’hépatocarninome). Cette

diminution de l’expression de la protéine PTEN pourrait en retour entraîner une baisse

d’expression des IRS (Clément et al., 2011) ii) directement en favorisant la dégradation par le

protéasome des IRS (génotype 1b) (Kawaguchi et al., 2004), (génotype 3) (Pazienza et al.,

2007); (Pazienza et al., 2010). Cependant, in vivo, chez l’homme, c’est la voie indirecte

entraînant des taux de TNFα élevés qui serait privilégiée. En effet, des concentrations

importantes de TNFα ont été constatées chez les patients atteints d’hépatite chronique C

(Larrea et al., 1996); (Valenti et al., 2005). Les protéines NS5A et NS5B (NS5B de génotype

1b) peuvent aussi, en augmentant la production de TNFα, participer au développement de

l’insulino-résistance (Choi et al., 2006). De plus d’autres protéines virales telles que NS3 et

NS5A (NS5A de génotype 1b) peuvent contribuer à l’apparition d’un syndrome d’insulino-

résistance via l’induction d’un stress oxydatif (Bureau, 2001); (Gong et al., 2001);(Christen et

al., 2007); (Bernsmeier et al., 2008); (Mitsuyoshi et al., 2008). En parallèle l’insulino-

résistance contribue à une baisse d’efficacité du traitement antiviral (Romero-Gómez et al.,

2005).

3. La stéatose hépatique

a) Histologie

La stéatose est une lésion histologique du foie caractérisée par l’accumulation de lipides (TG)

dans les hépatocytes, sous forme de GL. En fonction de la taille et de la morphologie des GL,

65

on distingue la stéatose macrovésiculaire (les GL fusionnent et forment une grosse vacuole

repoussant le noyau de l’hépatocyte en périphérie), ou la stéatose microvésiculaire (les GL ne

fusionnent pas et restent en périphérie du noyau hépatocytaire) qui sont liées à des altérations

différentes du métabolisme lipidique mais peuvent néanmoins coexister (Hwang & Lee,

2011). La stéatose peut être diffuse ou systématisée. L’examen histologique de la biopsie du

foie permet d’apprécier les lésions de la stéatose : aspect, densité, topographie. Le degré de

sévérité de la stéatose est évalué de façon semi-quantitative par un examen

anatomopathologique de la surface du lobule hépatique touché par la stéatose, permettant

ainsi d’évaluer le pourcentage d’hépatocytes atteints. Classiquement on distingue la stéatose

légère, modérée et sévère (Brunt et al., 1999). Cependant, aucune classification telle que

celles qui existent pour quantifier les lésions du foie de type fibrose (cf paragraphe I) D. 2.)

n’a été décrite à ce jour. La stéatose hépatique pourrait constituer un facteur de risque de

l’évolution de l’atteinte hépatique vers une fibrose et après plusieurs années pourrait conduire

au développement d’une cirrhose et d’un cancer du foie (cf. paragraphe III) B. 3) c) (3)).

(Figure 23)

Figure 23 : Caractères histopathologiques de la stéatose (observation dans des biopsies de foies humains). Stéatose macrovésiculaire (A), les GL fusionnent et forment une grosse vacuole repoussant le noyau de l’hépatocyte en périphérie ; stéatose microvésiculaire (B), les GL ne fusionnent pas et restent en périphérie du noyau hépatocytaire (Reddy & Rao, 2006).

b) Stéatose métabolique

La stéatose hépatique peut avoir diverses étiologies : la consommation d’alcool, une surcharge

pondérale, un diabète, ou d’autres dérèglements métaboliques (comme c’est le cas lors de

l’abetalipoprotéinémie (mutation du gène codant la MTP), de l’hypobetaloprotéinémie

familiale (mutation du gène codant l’ApoB), ou de la maladie d’Anderson (appelée aussi

maladie de rétention des chylomicrons) caractérisée par un défaut de sécrétion des VLDL; ou

66

en présence de lipodystrophies familiales pour lesquelles il existe un défaut de dépôt des TG

ou bien encore dans des maladies liées à un problème de stockage des lipides, du cholestérol

estérifié associées à une diminution de l’hydrolyse des TG hépatiques, ou lors ses troubles de

la β-oxidation des acides gras… (Hooper et al., 2011). Ces facteurs vont avoir pour

conséquence un déséquilibre de l’homéostasie lipidique hépatique et une présence accrue de

TG dans le foie. Les mécanismes de cette accumulation de TG sont souvent liés à une

insulino-résistance sous jacente, qui entraîne des bouleversements dans les mécanismes

d’assemblage et/ou de sécrétion des VLDL, et/ou de la ß-oxydation mitochondriale.

(1) Insulino-résistance : cause ou conséquence ?

La contribution du syndrome d’insulino-résistance dans le développement d’une stéatose

métabolique a été décrite dans plusieurs modèles murins. Un des facteurs impliqués dans

l’accumulation de TG dans le foie est SREBP-1c, fortement activé en cas d’hyperinsulémie

qui conduit à une augmentation de la lipogenèse (cf paragraphe III) A. 1. d)). Une

augmentation de la concentration en TG entraînant l’apparition d’une stéatose a ainsi été

observée dans le foie souris surexprimant la forme active de SREBP-1c (Shimano et al.,

1997); (Bécard et al., 2001) ou chez des souris obèses (ob/ob) présentant des concentrations

similaires en SREBP-1c (Shimomura et al., 1999). Chez ces souris ob/ob, l’expression du

facteur ChREBP est aussi augmentée et pourrait potentialiser l’effet de SREBP-1c dans

l’apparition d’une stéatose sévère (Dentin et al., 2006). Enfin, le facteur PPARγ, activé en

réaction à l’insulino-résistance, pourrait de la même façon contribuer au développement d’une

stéatose : en effet, chez les souris ob/ob, l’expression de PPARγ est augmentée, l’inactivation

chez ces souris du gène codant pour PPARγ, entraîne la diminution de l’accumulation de TG

au niveau du foie (Matsusue et al., 2003). Cependant de façon surprenante, il a été montré que

l’expression du facteur SREBP-1 n’est pas modifiée dans le foie de patients atteints de

cirrhose ou présentant un hépatocarcinome (Wu et al., 2010).

Cependant, l’accumulation excessive de TG dans le foie est à l’origine de l’apparition d’une

insulino-résistance hépatique. Les mécanismes sous jacents impliquent un défaut de la voie de

signalisation de l’insuline soit i) via l’activation de l’isoforme spécifique de la Protéine

Kinase C (PKCε) qui va se lier au récepteur à l’insuline et inhiber son activité kinase (Samuel

et al., 2007), soit ii) via l’activation de voies entraînant des phosphorylations des résidus

Serine et/ou Thréonine au détriment des résidus Tyrosine au niveau des IRS, comme c’est le

67

cas lors encore lors d’un stress du RE (Ozcan et al., 2004). In vivo dans des foies de patients

présentant de la stéatose, la protéine perilipine s’accumule à la surface des GL (alors que dans

les hépatocytes on retrouve plutôt ADRP et TIP47) (Straub et al., 2008). Elle pourrait ainsi

jouer un rôle protecteur contre la lipolyse et favoriserait l’insulino-résistance.

(2) Assemblage et sécrétion des VLDL

Une concentration importante de TG dans le foie, comme c’est le cas lors d’une insulino-

résistance, ne conduit pas forcément à leur accumulation et au développement d’une stéatose.

En effet pour compenser cette augmentation, les TG en excès peuvent être excrétés hors de la

cellule sous la forme de VLDL. D’une part, l’augmentation de TG disponibles favorise la

lipidation par la MTP de l’ApoB100 qui n’est alors plus dégradée contribuant de ce fait à une

synthèse accrue de VLDL. D’autre part, l’hyperinsulémie consécutive à l’insulino-résistance

entraîne une augmentation de la synthèse d’ApoB100 et une diminution de sa dégradation

(Blasiole et al., 2007). Néanmoins l’activation de la voie de sécrétion des VLDL ne serait pas

suffisante pour compenser à elle seule l’apport important de TG, les TG auraient tendance à

s’accumuler plutôt qu’à être excrétés contribuant ainsi au développement d’une stéatose. De

plus, une baisse de l’assemblage et de la sécrétion des VLDL pourrait aussi contribuer à

l’accumulation de TG au sein du foie. Ainsi chez des personnes atteintes de stéato-hépatite,

(atteinte plus sévère que la simple stéatose, elle correspond à une stéatose associée à une

inflammation et des lésions hépatiques), il a été mis en évidence qu’une diminution de la

quantité d’ApoB100 nécessaire à la synthèse des VLDL pouvait intervenir dans l’apparition

d’une stéatose et dans le développement d’une stéato-hépatite (Charlton et al., 2002). De

même, une stéatose survient chez des personnes atteintes d’hypobetaliprotéinémie (déficit en

ApoB) (Serfaty et al., 2001).

(3) ß-oxydation mitochondriale

Chez les personnes atteintes de stéato-hépatite ainsi que dans le modèle de souris obèses

(ob/ob), non seulement la lipogenèse mais aussi la ß-oxydation mitochondriale sont

augmentées (Sanyal et al., 2001); (Brady et al., 1985), alors qu’une diminution serait

logiquement attendue du fait d’une concentration intracellulaire élevée de malonyl-CoA (cf

paragraphe III) A. 1. c)). Les mécanismes reliant l’augmentation de la lipogenèse et celle de

la ß-oxydation mitochondriale sont mal compris mais pourraient faire intervenir le facteur

PPARα. Effectivement, l’afflux d’acides gras intrahépatocytaires lors d’une lipogenèse

accrue, ou chez les souris obèses (ob/ob) entraîne une augmentation de l’activation de PPARα

68

(Memon et al., 2000). Cette augmentation d’expression de PPARα pourrait expliquer la

synthèse plus importante de la CPT-I (cf paragraphe III) A. 1. c) et d) (1)) (Brady et al.,

1985); (Brady et al., 1989) observée chez ces souris qui contribuerait alors à l’augmentation

de la ß-oxydation mitochondriale. L’intérêt de la mise en place d’un tel mécanisme reste là

encore assez flou. D’un côté l’activation la lipolyse via l’augmentation de la ß-oxydation

mitochondriale pourrait lutter contre l’accumulation de TG dans le foie. D’un autre côté,

l’augmentation de la ß-oxydation mitochondriale, en favorisant la production d’espèces super-

réactives de l’oxygène (ROS pour Reactive Oxygen Species), serait impliquée dans

l’induction d’un stress oxydatif conduisant au développement d’une stéato-hépatite (Sanyal et

al., 2001).

c) Stéatose viro-induite

La stéatose est souvent retrouvée dans les maladies chroniques du foie. Elle est retrouvée chez

40 % à 86% des porteurs chroniques du virus de l’hépatite C (Asselah, 2006) et dépend de

facteurs propres à l’hôte tels que la consommation d’alcool, le surpoids ou bien encore la

présence d’un diabète de type 2. La stéatose trouve la plupart du temps son origine dans un

dérèglement du métabolisme lipidique. Cependant, même lorsque toutes ces causes possibles

peuvent être exclues, un nombre important de patients atteints d’hépatite C chronique (40%

environ) présente une stéatose, suggérant que le virus de l’hépatite C serait capable à lui seul

d’induire une stéatose hépatique : la stéatose viro-induite.

(1) Variabilité génotypique et stéatose

Stéatose métabolique et virale peuvent coexister chez un même individu, néanmoins plusieurs

études sur des patients atteints d’hépatite C chronique ont montré que l’infection par un

génotype 3 était associée significativement et directement avec la survenue d’une stéatose.

Ainsi 73% des patients infectés par un génotype 3 présentent une stéatose contre 50% des

patients infectés par un autre génotype (Asselah, 2006). L’apparition d’une stéatose chez les

individus infectés par un génotype 3 serait induite directement par le HCV tandis que la

stéatose observée chez les individus infectés par les autres génotypes serait liée à des facteurs

de risques métaboliques. De plus, la stéatose est souvent plus sévère chez les individus

infectés par un génotype 3. Chez de tel sujets, le degré de sévérité est corrélé à la quantité

d’ARN viral présent dans le foie ou le sérum (Rubbia-Brandt et al., 2000); (Adinolfi et al.,

2001), et la stéatose diminue ou disparaît totalement après un traitement anti-viral efficace,

69

(Rubbia-Brandt et al., 2000); (Kumar et al., 2002); (Poynard et al., 2003). La stéatose

réapparaît cependant en cas de rechute (Rubbia-Brandt et al., 2001).

(2) Stéatose et polymorphismes génétiques chez l’hôte

Chez les porteurs chroniques du HCV, en plus des facteurs viraux, des polymorphismes

génétiques semblent être associés au développement d’une stéatose hépatique. Les études

menées à ce jour tendent à montrer que dans la plupart des cas, les gènes de l’hôte influent sur

le développement de la stéatose d’une façon dépendante du génotype du virus infectieux.

Ainsi des polymorphismes du gène codant la PPARγ (cf paragraphe III) A. 1. d) (1)) ainsi que

le gène interleukine-28B (IL-28B) (qui code pour l’interféron λ3 (INF-λ3) impliqué dans la

réponse au traitement contre le HCV) seraient liés au risque d’apparition d’une stéatose

hépatique et ceci préférentiellement chez les personnes infectées par un génotype non-3 (Cai

et al., 2011) (les mécanismes n’étant pas connus). De la même façon, un polymorphisme dans

le gène codant la Patatin-like phospholipase domain-containing protein 3 (PNPLA3 ou

adiponutrin) (son rôle reste à déterminer mais elle semblerait agir dans l’hydrolyse des TG)

serait associé à un risque plus élevé de stéatose chez des individus infectés par un génotype

non-3 (Sookoian et al., 2009); (Cai et al., 2011). De plus, un polymorphisme du gène codant

la MTP (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)) serait lié à la survenue d’une stéatose sévère,

cependant les données sont controversées quant à la relation avec le génotype viral

(Mirandola et al., 2009); (Zampino et al., 2008); (Cai et al., 2011). Un polymorphisme du

gène codant l’ApoE semble quant à lui associé à une atteinte hépatique légère et protégerait

contre des dommages plus sévères dus à l’infection par le HCV (Wozniak et al., 2002).

(3) Stéatose et évolution de la maladie

La plupart des études transversales et longitudinales menées sur la durée et la vitesse de

progression de l’infection par le HCV chez des patients chroniquement infectés par le HCV,

estiment que l’apparition d’une fibrose fait suite à 20 à 40 ans de portage chronique du virus.

Néanmoins la plupart du temps les patients étudiés n’étaient pas représentatifs de la

population de patients chroniquement infectés par l’hépatite C. L’évolution de la maladie

hépatique est en réalité très variable selon les individus et dépend de nombreux facteurs liés à

l’hôte, son environnement et au virus. Ainsi l’âge au moment de l’infection, le sexe masculin,

une forte consommation d’alcool et la coinfection avec le VIH ou le VHB sont associés à la

progression de la maladie. Le surpoids, le diabète de type 2, la stéatose et le HCV lui même

70

seraient des facteurs de l’évolution de la maladie vers la fibrose (Everhart et al., 2009).

Certaines études ont montré que la fibrose pouvait se développer indépendamment de la

survenue d’une stéatose chez des patients chroniquement infectés par le HCV (Poynard et al.,

2001); (Asselah et al., 2003); (Leandro et al., 2006), alors que d’autres ont montré qu’il y

avait une association entre les deux (Hourigan et al., 1999); (Adinolfi et al., 2001).

Néanmoins les relations de cause à effet ne sont pas clairement établies. La stéatose ne

pourrait être qu’un marqueur de l’évolution vers la fibrose et non pas une cause. De plus chez

les patients atteints d’hépatite C chronique, stéatose métabolique et virale peuvent coexister et

jouer un rôle dans l’évolution vers la fibrose: la question de savoir si la présence d’une

stéatose affecte la progression de la maladie liée à l’infection par le HCV (effet synergique)

ou si elle contribue à la sévérité de l’infection HCV impliquée dans le développement d’une

stéatose virale (effet additif), reste largement débattue. La stéatose viro-induite semble être un

facteur prépondérant de l’évolution de la maladie vers le stade fibrose mais uniquement pour

des patients infectés par certains génotypes du HCV (Asselah, 2006). Ainsi chez les patients

chroniquement infectés par un génotype 1, la stéatose est significativement associée à une

fibrose avancée (Leandro et al., 2006). La stéatose observée lors d’une infection par un

génotype 2 n’est pas directement associée à la fibrose (Leandro et al., 2006). Enfin, chez les

patients infectés par un génotype 3, qui présentent une stéatose plus sévère, la relation entre la

stéatose viro-induite et la progression de la maladie au stade fibrose reste controversée

(Bochud et al., 2009): en effet des études montrent que la stéatose induite par un génotype 3

serait associée au développement d’une fibrose (Westin et al., 2002); (Monto et al., 2002);

(Castéra et al., 2003); (Rubbia-Brandt, 2004) ou ne serait au contraire pas corrélée à

l’apparition d’une fibrose (Leandro et al., 2006) ou à une vitesse de progression plus rapide de

la fibrose (Bochud et al., 2009). L’insulino-résistance métabolique est un facteur de risque de

l’apparition de la stéatose (cf. paragraphe III) B. 3. b) (1)), au même titre que l’insulino-

résistance viro-induite (Clément et al., 2011). De la même façon, l’insulino-résistance peut

contribuer de manière indépendante au développement d’une fibrose chez les personnes

chroniquement infectées par le HCV (Hui et al., 2003); (Kawaguchi et al., 2004); (Moucari et

al., 2008). L’implication de la stéatose dans l’apparition de l’hépatocarcinome reste elle aussi

controversée (Ohata et al., 2003); (Kumar et al., 2005); (Pekow et al., 2007); (Wu et al.,

2010). Enfin le polymorphisme du gène codant la PNPLA3 est non seulement associé à un

risque plus élevé de développer une stéatose (cf paragraphe III) B. 3. c) (2)) mais aussi une

susceptibilité plus importante pour l’apparition d’une fibrose (Sookoian & Pirola, 2011) .

71

La plupart des études menées à ce jour montrent que l’infection chronique par un génotype 3

est associée à une stéatose plus sévère. Ceci suggère un rôle direct de certaines protéines

virales dans la survenue de la stéatose. Ces interactions sont représentées sur la Figure 24.

(4) Le rôle de la protéine de capside

i) Interaction avec les GL

Il a été montré dans des modèles de souris transgéniques que l’expression de la protéine de

capside du HCV (génotype 1b) induit une stéatose hépatique (Moriya et al., 1997b); (Moriya

et al., 1998); (Lerat et al., 2002) et un hépatocarcinome (Moriya et al., 1998); (Lerat et al.,

2002). Des études in vitro ont montré que la protéine de capside se localisait à la surface des

GL dans plusieurs lignées cellulaires et aussi dans des biopsies de foies de chimpanzés

infectés et dans le foie de souris transgénique (Hope, 2001); (Qiang et al., 2009); (Barba et

al., 1997); (Moriya et al., 1997a) (cf paragraphe II) C. 2. a) (1)). In vitro la protéine de

capside est capable d’induire une augmentation des GL et cet effet semble encore majoré avec

une protéine de capside de génotype 3 (Abid et al., 2005); (Hourioux et al., 2007); (Piodi et

al., 2008); (Jhaveri et al., 2008); (Jhaveri et al., 2009); (Clément et al., 2011). Le rôle précis

de cette association demeure mal connu mais la stéatose semble résulter d’un effet direct de la

protéine de capside sur le métabolisme lipidique (Roingeard & Hourioux, 2008). En effet il

semble que la protéine de capside agisse à différents niveaux : lors de la synthèse de novo des

lipides, lors de l’élimination des acides gras ou bien encore lors de la sécrétion des

lipoprotéines.

ii) Augmentation de la lipogenèse

Chez le chimpanzé infecté par un HCV de génotype 1a, plusieurs protéines impliquées dans la

lipogenèse sont surexprimées et ceci ferait intervenir les SREBP (Su et al., 2002). La protéine

de capside est ainsi capable d’interagir avec plusieurs enzymes impliquées dans la lipogenèse.

Les protéines de capsides de génotype 1b et 3a activent SREBP-1 (Kim et al., 2007); (Waris

et al., 2007); (Jackel-Cram et al., 2007) qui va à son tour réguler la transcription de l’enzyme

FAS (Jackel-Cram et al., 2007). La protéine de capside de génotype 3a potentialise cette

activation et le résidu phénylalanine en position 164 (dans le domaine de liaison aux GL)

semble jouer un rôle primordial (Jackel-Cram et al., 2007). Dans des cellules infectées par la

souche JFH1 l’expression des enzymes FAS et ACC (Yang et al., 2008); (Waris et al., 2007)

est augmentée. Néanmoins in vivo chez l’homme, aucun lien direct entre l’activation des

72

SREBP et/ou de l’enzyme FAS et la stéatose n’a été établi (McPherson et al., 2008); (Ryan et

al., 2011), en effet de façon surprenante la sévérité de la stéatose serait ici associée à une

diminution d’expression du facteur SREBP-1c (McPherson et al., 2008). Les gènes impliqués

dans le métabolisme lipidique sont régulés de façon positive ou négative, ceci semble

dépendre du génotype du virus. Il a été montré que la protéine de capside (génotype 1b)

pouvait augmenter l’expression de PPARγ ce qui contribuait à l’activation de gènes impliqués

dans la lipogénèse (Kim et al., 2007), mais dans le cas de cellules exprimant une protéine de

capside de génotype 3a, il y avait une réduction du facteur PPARγ (De Gottardi et al., 2006).

La protéine de capside n’interagit pas directement avec les SREBP. La modulation de

l’activité des SREBP et notamment de SREBP-1c pourrait dépendre de l’activation par la

protéine de capside de la liaison du complexe LXR-RXRα avec le promoteur du gène codant

SREBP-1c (cf paragraphe III) A. 1. d)) et de la présence au niveau nucléaire d’un activateur

du protéasome, PA28γ (Moriishi et al., 2007).

L’alignement de près de 300 séquences de capside du HCV a montré la présence de résidus

spécifiques du génotype 3, par rapport aux autres génotypes du HCV. L’un de ces résidus (Y

en position 164, substituée en F dans les séquences de génotype 3) se situe dans le domaine II

de la protéine de capside, qui joue un rôle important dans l’association de la protéine avec les

GL (Hourioux et al., 2007). Un mutant Y164F de la protéine de capside de génotype 1a a été

exprimé dans le modèle d’expression SFV en cellules BHK-21 (cf paragraphe II) F. 2. c)). En

microscopie confocale et ME, la formation de « clusters » périnucléaires de GL a pu être

visualisé dans les cellules transfectées avec les constructions exprimant une protéine de

capside sauvage ou mutée. Avec ce modèle et une méthode morphométrique originale sur

coupes de ME, pour déterminer la quantité de GL au sein des cellules exprimant la protéine de

capside, il a été montré que la quantité de GL était plus importante dans des cellules qui

exprimaient la protéine de capside portant un résidu spécifique de génotype 3, par rapport à

des cellules exprimant la protéine de capside sauvage (génotype 1a) (Hourioux et al., 2007).

Ces résultats montraient que la stéatose viro-induite et sa majoration en fonction du génotype

pouvaient être modélisées in vitro.

Dans le même temps, un travail récent a montré que la protéine de capside de génotype 3a

induit in vitro dans la lignée hépatocytaire humaine Huh7 une accumulation lipidique

cytoplasmique nettement supérieure à celle occasionnée par les génotypes 1b et 3h, eux-

mêmes plus stéatogènes que les génotypes 2a, 4h et 5a (Abid et al., 2005). Dans ce travail, les

séquences utilisées ont été amplifiées et clonées à partir de prélèvements de plusieurs patients,

73

infectés chroniquement par différents génotypes. Lorsque les auteurs ont cherché à étudier par

mutagenèse dirigée le rôle de phénylalanine en position 164 dans ce phénomène de stéatose in

vitro, ils n'ont pas observé de variation imputable à ce résidu, ce qui constituait une différence

avec le modèle du vecteur SFV en cellules BHK-21. Il faut cependant noter que l'approche

méthodologique utilisée dans ce travail est différente, les auteurs basant leur quantification

des GL sur le pourcentage de cellules positives en GL et sur un dosage intracellulaire des

triglycérides.

iii) Diminution de la dégradation des acides gras

Chez le chimpanzé infecté par un virus de génotype 1a, dans les foies de patients infectés par

différents génotypes du HCV, dans un modèle de souris transgénique ou in vitro dans des

cellules exprimant la protéine de capside de génotype 1b, on observe une baisse d’expression

de PPARα, facteur impliqué dans les β-oxydations mitochondriale et peroxysomale (Su et al.,

2002); (Dharancy et al., 2005);(Yamaguchi et al., 2005) ce qui a pour conséquence de limiter

la dégradation des acides gras. Cette diminution est plus importante dans le cas d’infections

par un génotype 3 (De Gottardi et al., 2006). La protéine de capside de génotype 1b est quant

à elle capable d’interagir, in vitro et dans un modèle de souris transgénique, avec le domaine

de liaison à l’ADN du facteur RXRα qui peut former un hétérodimère avec PPARα, activant

ainsi l’expression des gènes portant un élément de réponse à RXRα et/ou à PPARα (Tsutsumi

et al., 2002). De plus, des souris transgéniques exprimant la protéine de capside (génotype 1b)

et une forme constitutivement active de PPARα développent une stéatose (Tanaka et al.,

2008). En général, l’activation de PPARα, n’est pas associée à une majoration de la stéatose,

mais en corrélation avec l’induction d’un stress oxydatif par la protéine de capside cela

pourrait contribuer au développement de l’hépatocarcinome (Tanaka et al., 2008).

iv) Diminution de la sécrétion des lipoprotéines

Dans les sera des patients chroniquement infectés par le HCV et présentant une stéatose, de

faible concentration en cholestérol (hypocholestérolémie) et en ApoB circulante

(hypobetalipoprotéinémie) sont observées. De plus, chez les patients infectés par un génotype

3, la stéatose est directement corrélée à cette hypoβlipoprotéinémie (Serfaty et al., 2001), ou à

la diminution de la quantité d’ARNm codant pour la MTP (Mirandola et al., 2006). Dans un

modèle de souris transgénique exprimant la protéine de capside (génotype 1b), l’activité de la

MTP est réduite mais pas son taux d’expression. Cependant, la MTP n’est alors plus capable

74

de transférer les TG, entraînant ainsi une baisse de la formation et de la sécrétion des VLDL

(PERLEMUTER et al., 2002), ce qui pourrait expliquer l’accumulation intrahépatocytaire des

TG. Les mécanismes par lesquels la protéine de capside modifie l’activité de la MTP ne sont

pas élucidés. La protéine de capside n’interagit pas directement avec l’ApoB ou la MTP, une

hypothèse serait que la protéine de capside en interagissant avec les GL ou avec les lipides

contenus dans la membrane du RE, empêche la MTP de se lier sur ces mêmes lipides,

empêchant ainsi le transfert des TG vers la lumière du RE et/ou vers l’ApoB (PERLEMUTER

et al., 2002). En contre partie, la protéine de capside (génotype 1b et 1a) interagit in vivo et in

vitro avec l’ApoAII, composante des HDL (Barba et al., 1997); (Sabile et al., 1999);

(PERLEMUTER et al., 2002). Cette association semble limiter l’effet inhibiteur de la

protéine de capside sur la MTP, en dirigeant la protéine de capside hors de la cellule.

v) Induction d’un stress oxydatif

La protéine de capside est capable d’induire un stress oxydatif dans le foie de souris

transgénique sans pour autant qu’une stéatose ne se développe (Moriya et al., 2001); (Koike,

2009), mais cela pourrait contribuer au développement de l’hépatocarcinome. En effet la

protéine de capside semble augmenter in vitro et in vivo la production d’espèces super-

réactives de l’oxygène (ROS) et parallèlement elle diminuerait les mécanismes antioxydants

ce qui contribuerait en partie à l’établissement de sévères lésions hépatiques (Okuda et al.,

2002); (PERLEMUTER et al., 2002); (Koike, 2009). Les mécanismes de cette augmentation

de la synthèse des ROS ne sont pas encore clairement définis. Ils sembleraient liés à la faculté

de la protéine de capside de s’associer directement aux mitochondries (Moriya et al., 1998);

(Schwer et al., 2004) et d’entraîner des dysfonctionnements de la chaîne de transport des

électrons et/ou de modifier de façon indirecte la perméabilité membranaire des mitochondries

entraînant le relarguage de molécules pro-apoptotiques (Korenaga, 2005); (Okuda et al.,

2002); (Machida et al., 2006). De plus, la production de ROS pourrait à son tour déstabiliser

le transport des électrons dans la mitochondrie potentialisant ainsi l’effet de la protéine de

capside (Okuda et al., 2002).

L’induction d’un stress oxydatif lié à l’expression de la protéine de capside, peut aussi

entraîner le clivage et la phosphorylation des facteurs de transcription SREBP. Ce phénomène

semble dépendre du génotype (génotype 3a) et pourrait jouer un rôle direct dans le

développement d’une stéatose (Waris et al., 2007).

75

(5) Le rôle de la protéine NS5A

Une étude récente a montré que la protéine NS5A de certains génotypes du HCV serait

capable d’induire une stéatose in vivo (Wang et al., 2009). Cependant, très peu de choses sont

encore connues sur les mécanismes par lesquels la protéine NS5A participerait à

l’établissement de la stéatose. Des études suggèrent que la protéine NS5A et le métabolisme

lipidique sont fortement liés. En effet, la protéine NS5A colocalise in vitro avec la protéine de

capside à la surface des GL (Shi et al., 2002); (Miyanari et al., 2007) et pourrait moduler les

gènes du métabolisme lipidique, via son interaction in vitro et in vivo avec l’apolipoprotéine

ApoAI, l’ApoB et l’ApoE (Shi et al., 2002); (Domitrovich et al., 2005); (Benga et al., 2010)

et in vitro avec PPARγ (Kim et al., 2009). De plus, la protéine NS5A induit un stress aux

membranes du RE qui pourrait stimuler la production de ROS par la mitochondrie (Gong et

al., 2001); (Dionisio et al., 2009) et ainsi contribuer à l’apparition de lésions hépatiques.

(6) Le rôle des autres protéines du HCV

La protéine NS4B (génotype 3a et 1b) (Waris et al., 2007); (Park et al., 2009), et la protéine

NS2 (génotype 1a) (Oem et al., 2008) peuvent induire le clivage des SREBPs dans des

cellules infectées par le HCV, indiquant un rôle possible dans la synthèse de novo des acides

gras. NS4B peut aussi induire une accumulation de GL in vitro et activer tout comme NS2

l’expression de FAS (Park et al., 2009); (Oem et al., 2008). Les protéines non structurales

seraient aussi impliquées dans une baisse d’activité de la MTP et de son promoteur ainsi

qu’une diminution de l’expression de son ARNm (Domitrovich et al., 2005) entraînant une

baisse de sécrétion des lipoprotéines et favorisant ainsi les mécanismes de stéatose. Enfin, la

protéine NS3, via l’activation d’une enzyme oxydase (Nox 2), contribue à l’apparition de

ROS. Il s’agit d’un mécanisme différent de celui mis en place lors de l’expression des

protéines de capside et NS5A, qui va favoriser l’établissement de lésions hépatiques (Bureau,

2001). La protéine E1 participerait aussi à l’induction d’un stress oxydatif, les mécanismes

restent cependant mal compris (Machida et al., 2006).

76

Figure 24 : Impact du HCV sur l’insulino-résistance et la stéatose viro-induite. ROS : Reactive Oxygen Species. Le rôle direct de certaines protéines virales dans l’insulino-résistance et/ou la survenue de la stéatose est schématisé par les flèches vertes. Les mécanismes d’action sont détaillés dans la partie III) B. de ce manuscrit.

ROS

ROS

ROS

77

C. Cycle viral du HCV et métabolisme lipidique : modèle

La relation étroite et complexe qui semble lier le HCV au métabolisme lipidique comme il a

pu être constaté dans la deuxième partie de ce manuscrit n’est pas une simple coïncidence. Ce

dernier chapitre fait écho à la première partie de cette thèse. Il tente de mettre en lumière le

profit que semble tirer le HCV du métabolisme lipidique dans l’établissement de son cycle

viral et propose un modèle où les GL sont au cœur de l’assemblage viral.

1. Protéine de capside et accumulation de GL

Par différents mécanismes, certaines protéines virales telle que la protéine de capside

contribuent à l’établissement et au maintien d’une stéatose dans les hépatocytes infectés par le

HCV. Cette accumulation de GL n’est pas restreinte à l’infection par le HCV et est d’ailleurs

nécessaire lors de la multiplication de Chlamydia trachomatis (Kumar et al., 2006) et lors du

cycle viral du virus de la Dengue (Samsa et al., 2009), les GL semblent aussi jouer un rôle

important lors de la multiplication du Rotavirus (Cheung et al., 2010). De plus, il a été montré

que la protéine de capside du GBV-B se localise aussi à la surface des GL (Hope, 2001).

Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer la suite d’événements conduisant à

l’association entre la protéine de capside du HCV et les GL. Ainsi, la protéine de capside

pourrait diffuser le long du RE jusqu’à ce qu’elle rencontre une GL apposée ou attachée à la

membrane du RE. D’une part, la protéine de capside serait capable d’interagir avec l’enzyme

DGAT1 située dans des domaines spécifiques du RE impliqués dans la genèse des GL

(Herker et al., 2010). D’autre part, le domaine D2 de la protéine de capside ayant une plus

forte affinité pour la surface des GL, cela favoriserait le transfert de la protéine des

membranes du RE aux GL (Targett-Adams, 2003); (Boulant et al., 2006). Puis, au fur et à

mesure que la protéine de capside est produite aux membranes du RE, elle s’accumulerait à la

surface des GL d’abord à un site unique puis de façon progressive sur toute la surface

(Boulant et al., 2007). L’établissement de cette plate-forme d’assemblage semble avoir un

impact majeur dans le cycle viral du HCV. En effet, il a été montré que des modifications

dans la séquence du domaine D2 qui n’altèrent pas l’adressage de la protéine de capside aux

GL mais modifient la nature de l’interaction avec les GL peuvent moduler l’assemblage et la

sécrétion viral (Shavinskaya et al., 2007). La protéine de capside associée aux GL serait alors

capable de recruter les protéines non structurales, l’ARN viral et les complexes de réplication

78

aux membranes associées aux GL (Miyanari et al., 2007); (Herker et al., 2010). Les protéines

non structurales pourraient alors contribuer à la production de virus infectieux soit

indirectement en créant un microenvironnement adapté autour des GL, soit directement en

participant à la formation des complexes de réplication (Jirasko et al., 2010). De cette façon,

l’adressage de la protéine de capside et d’une des protéines non structurales (NS5A) aux GL

mais aussi l’interaction de ces deux protéines à la surface des GL sont importants pour la

production de particules virales (Masaki et al., 2008).

2. Protéine NS5A, GL et assemblage viral

La protéine NS5A semble être la protéine structurale la plus interconnectée avec le

métabolisme lipidique. Il a été montré que la protéine NS5A en s’associant aux GL

déstabiliserait la réplicase NS5B ce qui entraînerait le détournement de la protéine NS5A et

de l’ARN viral en faveur des mécanismes d’assemblage (Miyanari et al., 2007); (Masaki et

al., 2008); (Tellinghuisen et al., 2008). De plus, la protéine NS5A au sein des complexes de

réplication peut interagir de façon indirecte avec l’ApoE. Ceci permettrait le recrutement de

l’ApoE à la surface des GL riches en protéine de capside et serait important lors de

l’assemblage viral (Jones & McLauchlan, 2010); (Benga et al., 2010). Ainsi la protéine NS5A

présente sur la plate-forme de GL, participerait au recrutement des autres protéines non

structurales et de l’ARN viral (Miyanari et al., 2007). Il a été proposé que les ARN

nouvellement synthétisés accrochés à NS5A seraient relâchés des membranes du complexe de

réplication, et pourraient être capturés par la protéine de capside capable d’interagir avec le

domaine III de NS5A à la surface des GL ou aux membranes associées aux GL. Les ARN

viraux seraient alors encapsidés et l’assemblage viral aurait lieu dans ce microenvironnement

(Appel et al., 2008); (Masaki et al., 2008).

3. GL et enveloppement des nucléocapsides

Une fois la nucléocapside formée, celle-ci doit être enveloppée. Des mécanismes impliquant

les GL, la protéine de capside et/ou la protéine NS2 ont été évoqués (cf paragraphe II) E. 4.),

cependant cette étape reste peu décrite. Les protéines d’enveloppe E1 et E2 sont synthétisées

aux membranes du RE et la protéine E2 est localisée aux membranes du RE associées aux GL

(Miyanari et al., 2007). De plus, la protéine de capside peut se lier aux glycoprotéines

d’enveloppe E1 et E2. Ainsi, les nucléocapsides formées à la surface des GL

s’envelopperaient en bourgeonnant des membranes du RE ou des membranes du RE accolées

79

aux GL où la protéine E2 est retrouvée (Blanchard et al., 2002); (Roingeard et al., 2004);

(Appel et al., 2008); (Miyanari et al., 2007). Il a été proposé que les glycoprotéines E1 et E2

pourraient diffuser le long des membranes du RE lisse jusqu’à un site de formation de GL.

Les protéines E1 et E2 seraient alors transférées à la GL naissante, puis celle ci irait alors

fusionner dans un compartiment plus distal de la voie de sécrétion avec la lipoprotéine

intermédiaire de la voie de synthèse des VLDL (cf paragraphe III) A. 2. b) (2)) (Icard et al.,

2009). Néanmoins l’implication de ce modèle dans l’enveloppement des nucléocapsides n’est

pas discutée.

4. VLDL et sécrétion des particules virales

Plusieurs arguments sont en faveur d’une production des particules virales dépendante de la

voie de sécrétion des VLDL (Huang et al., 2007); (Gastaminza et al., 2007). Néanmoins il

existe une controverse entre les données in vitro et in vivo dans le rôle attribué aux différents

composants de cette voie de synthèse du fait notamment d’un défaut de sécrétion des VLDL

dans les cellules Huh7. Ainsi la composition en lipides et donc la taille et la densité des

virions dépend de la cellule hôte dans laquelle le virus est produit (Gastaminza et al., 2010);

(Merz et al., 2011). Les études in vitro ont permis d’établir que l’ApoB et la MTP (Huang et

al., 2007); (Gastaminza et al., 2007) seraient nécessaires à la production de particules virales

infectieuses. De plus, l’ApoE (Chang et al., 2007) et son interaction de la protéine NS5A

(Benga et al., 2010) seraient non seulement importantes lors des étapes d’assemblage mais

aussi lors de la sécrétion de particules virales. Les virions ainsi produits ont une composition

en lipides unique dans le monde viral et proche de celles des VLDL (Merz et al., 2011). Enfin

la sécrétion des particules virales associées aux VLDL permettrait de favoriser l’entrée du

virus dans d’autres cellules en détournant certains récepteurs des lipoprotéines (cf paragraphe

II) E. 1. b) et c)).

Récemment un modèle où les GL semblent être la plate-forme centrale de

l’assemblage viral a ainsi été proposé (Boulant et al., 2008). Dans ce modèle, la protéine de

capside serait capable de déplacer de façon progressive une protéine de la famille PAT/PLIN,

l’ADRP, de la surface des GL, entraînant ainsi une redistribution des GL en zone

périnucléaire. La redistribution complète des GL a lieu quand la protéine de capside recouvre

entièrement la surface des GL. Les GL sont redistribuées au niveau des membranes du RE qui

80

entourent alors partiellement la GL pour former une structure (cf paragraphe III) A. 3. c) (2))

qui faciliterait le transfert des composants viraux entre le RE et les GL. L’accumulation des

GL en zone périnucléaire pourrait alors concentrer la protéine de capside avec les sites de

réplication qui contiennent les ARN nouvellement synthétisés et les protéines non structurales

favorisant ainsi les mécanismes d’assemblage viral. Par ailleurs, l’accumulation des GL dans

ces mêmes zones pourrait aussi faciliter la sécrétion des particules virales nouvellement

synthétisées.

81

Objectifs du travail

82

Les études fondamentales actuelles sur les GL suggèrent que ces organites sont

extrêmement dynamiques, mais les mécanismes de leur trafic intracellulaire sont encore

inconnus. Une partie de mon travail de thèse a consisté à mieux comprendre les mécanismes

régissant la relocalisation des GL induite par la protéine de capside du HCV. La mise en place

d’une telle plate-forme lipidique pourrait permettre de favoriser le contact entre la protéine de

capside du virus présente à la surface des GL, et l’ARN viral présent au sein d’un réseau

multi-membranaires portant les complexes de réplication, à proximité du réseau de GL. La

relocalisation des GL interviendrait lors des étapes précoces de l’assemblage viral donnant

ainsi lieu à la formation des nucléocapsides. Pour mieux étudier ce phénomène, nous avons

utilisé le système in vitro dérivé du SFV pour comparer la quantité et la localisation

subcellulaire des GL dans des cellules exprimant une protéine de capside mature ou

immature. Ce travail a montré que les protéines de capside mature ou immature étaient toutes

les deux capables d’augmenter le nombre de GL dans les cellules par rapport à une protéine

contrôle, mais que la protéine mature était capable d’amplifier ce phénomène par rapport à la

protéine immature. Par ailleurs, seule la protéine de capside mature était capable d’entourer

les GL et de les redistribuer en zone périnucléaire. Une analyse morphologique en 3D

montrait clairement que les GL ne se regroupent pas autour des centrosomes comme cela

avait été suggéré dans une récente étude, mais que les GL seraient plutôt synthétisées de novo

au niveau de membranes du RE riches en protéine de capside. Ces travaux permettent

d’apporter des éléments nouveaux, à la fois sur la dynamique des GL au sein d’une cellule et

sur la compréhension des mécanismes impliqués dans la stéatose viro-induite.

Ils ont fait l’objet d’une publication originale: Depla M, Uzbekov R, Hourioux C,

Blanchard E, Le Gouge A, Gillet L, Roingeard P., Ultrastructural and quantitative analysis

of the lipid droplet clustering induced by the hepatitis C virus core protein, Cell Mol Life Sci.

2010 Sep;67(18):3151-61.

Ils ont également permis la réalisation d’une review qui prolonge la discussion concernant

l’impact de ce travail sur la compréhension de la biogenèse et de la dynamique des GL :

Roingeard P, Depla M. The birth and life of lipid droplets : learning from the hepatitis C

virus, Biol Cell 2011 May; 103 (5): 223-231.

Une évolution très importante et indispensable des travaux de l’équipe sur les

interactions HCV/GL in vitro était de les compléter par une approche bio-clinique. Nous

83

avons ainsi initié une étude avec les cliniciens hépatologues des principaux Centres

Hospitaliers de la Région Centre, et le Centre d’Investigation Clinique (CIC) INSERM 0202

du CHRU de Tours dans le cadre d’un projet « Recherche Translationnelle » INSERM-

DHOS. Même si plusieurs études cliniques ont indiqué un lien entre l’infection par un

génotype 3 du HCV et la sévérité de la stéatose, l’impact du génotype viral sur la stéatose

hépatique reste encore débattu. Le fait qu’une stéatose hépatique chez un sujet chroniquement

infecté par le HCV soit vraisemblablement due à des facteurs viraux et à des facteurs

métaboliques propres à l’hôte compliquent la détermination d’un tel lien. Par ailleurs, aucune

de ces études n’a été basée sur une véritable étude morphométrique des GL dans les biopsies

hépatiques des patients chroniquement infectés. Un aspect novateur de notre étude était donc

d’adapter l’analyse morphométrique des GL que nous avions mise au point sur des modèles

cellulaires et publiée récemment dans GUT à des biopsies hépatiques de patients infectés

chroniquement par le HCV sans facteur de risques de stéatose métabolique. Les effectifs

prévus de l’étude étaient 15 patients infectés par un HCV de génotype 3 et 15 patients infectés

par un HCV d’un autre génotype. Cependant, devant la difficulté d’inclusion de patients

infectés par un génotype 3, pour lesquels la réalisation d’une biopsie hépatique dans le cadre

de leur suivi médical est de moins en moins justifié, seuls 12 patients infectés par un HCV de

génotype 3 ont pu être inclus dans l’étude. Au delà de la comparaison de l’intensité de la

stéatose chez ces patients en fonction du génotype, notre étude prévoyait également

d’analyser les séquences des virus qui auraient pu être associées à une stéatose sévère.

Le bilan de ce travail montre que chez un groupe de patients, certes restreint mais pour

lesquels toute suspicion de stéatose métabolique et de consommation excessive d’alcool ont

été éliminées, on ne retrouve pas de lien entre l’infection par le génotype 3 et l’intensité de la

stéatose. Aucune association n’a été établie entre la sévérité de la stéatose et la nature du

génotype ainsi que la présence de résidus particuliers dans la séquence des protéines de

capside et NS5A des virus qui infectaient ces patients. Ceci ne remet pas en cause le fait que

le HCV peut être impliqué dans la genèse de cette stéatose, voir même que certains résidus

spécifiques de génotypes pourraient être impliqués dans l’intensité de cette stéatose, par

rapport à ce qui a pu être observé dans des modèles in vitro. Cependant, notre étude suggère

que ces éléments auraient un rôle minoritaires in vivo, et que des facteurs propres à l’hôte

prédomineraient pour déterminer l’intensité de la stéatose.

84

Cette étude bio-clinique a fait l’objet de la rédaction d’un manuscrit, actuellement soumis

pour publication : Depla M, d’Alteroche L, Le Gouge A, Moreau A, Hourioux H,

Meunier J-C, Gaillard J, de Muret A, Bacq Y, Kazemi F, Avargues A, Roch E, Piver E,

Gaudy-Graffin C, Giraudeau B, Roingeard P. Viral diversity in chronic carriers of

hepatitis C virus has a low impact on liver steatosis.

85

Résultats & Discussion

86

I) Etude in vitro des regroupements de gouttelettes

lipidiques induits par le virus de l’hépatite C. Impact

sur la biogenèse des gouttelettes lipidiques

Article 1

Ultrastructural and quantitative analysis of the lipid droplet

clustering induced by the hepatitis C virus core protein

Marion DEPLA, Rustem UZBEKOV, Christophe HOURIOUX, Emmanuelle BLANCHARD,

Amélie LE GOUGE, Ludovic GILLET, Phillippe ROINGEARD

Publié en 2010 dans Cellular and Molecular Life Sciences

RESEARCH ARTICLE

Ultrastructural and quantitative analysis of the lipid dropletclustering induced by hepatitis C virus core protein

Marion Depla • Rustem Uzbekov • Christophe Hourioux •

Emmanuelle Blanchard • Amelie Le Gouge •

Ludovic Gillet • Philippe Roingeard

Received: 18 February 2010 / Revised: 1 April 2010 / Accepted: 8 April 2010

Ó Springer Basel AG 2010

Abstract Hepatitis C virus (HCV) release is linked to the

formation of lipid droplet (LD) clusters in the perinuclear

area of infected cells, induced by the core protein. We used

electron microscopy (EM) to monitor and compare the

number and size of LD in cells producing the mature and

immature forms of the HCV core protein, and 3D EM to

reconstruct whole cells producing the mature core protein.

Only the mature protein coated the LD and induced their

clustering and emergence from endoplasmic reticulum

membranes enriched in this protein. We found no particular

association between LD clusters and the centrosome in

reconstructed cells. The LD clustering induced by the

mature core protein was associated with an increase in LD

synthesis potentially due, at least in part, to the ability of

this protein to coat the LD. These observations provide

useful information for further studies of the mechanisms

involved in HCV-induced steatosis.

Keywords HCV � Lipid droplet � Steatosis �

Electron microscopy � 3D reconstruction

Abbreviations

HCV Hepatitis C virus

ER Endoplasmic reticulum

SPP Signal peptide peptidase

SFV Semliki forest virus

EM Electron microscopy

b-Gal b-Galactosidase

WT Wild-type

Introduction

Hepatitis C virus (HCV), a member of the Flaviviridae

family, is a major cause of chronic liver disease, infecting

an estimated 170 million people worldwide [1]. The

spectrum of severity of the liver disease associated with

HCV is broad and the rate of progression to advanced

fibrosis and cirrhosis is highly variable. This rate seems to

depend on many host-related cofactors, such as age at

infection, sex, alcohol consumption, being overweight and

co-infections with hepatitis B virus or human immunode-

ficiency virus [2]. Retrospective studies have shown that

advanced fibrosis is associated with the presence and

severity of liver steatosis, characterised by the deposition

of triglycerides in the liver [3, 4]. There is, therefore,

considerable interest in dissecting the mechanisms of ste-

atosis in HCV infection, particularly in relation to other

metabolic disturbances. Steatosis is frequent in hepatitis C

patients. Indeed, before the advent of serological testing,

the presence of fatty acids in the liver was widely con-

sidered to be suggestive of a diagnosis of non-A, non-B

Electronic supplementary material The online version of thisarticle (doi:10.1007/s00018-010-0373-z) contains supplementarymaterial, which is available to authorized users.

M. Depla � R. Uzbekov � C. Hourioux � E. Blanchard �

P. Roingeard (&)

INSERM U966, Faculte de Medecine, Universite Francois

Rabelais, CHRU de Tours, 10 boulevard Tonnelle,

37032 Tours Cedex, France

e-mail: [email protected]

A. Le Gouge

INSERM CIC 0202, Universite Francois Rabelais,

CHRU de Tours, Tours Cedex, France

L. Gillet

INSERM U921, Universite Francois Rabelais,

CHRU de Tours, Tours Cedex, France

Cell. Mol. Life Sci.

DOI 10.1007/s00018-010-0373-z Cellular and Molecular Life Sciences

hepatitis [5]. Steatosis depends on both viral and host

factors. Virus-induced steatosis is mostly reported in

patients infected with HCV genotype 3, in whom fat

accumulation is correlated with HCV replication in the

serum [3] and liver [6], and is resolved by successful

antiviral treatment [7, 8], strongly suggesting that specific

viral products are involved in the fat deposition. By con-

trast, most cases of mild steatosis in patients infected with

genotypes other than 3 seem to have a metabolic patho-

genesis, with being overweight identified as the most

significant clinical correlate [3]. This type of steatosis tends

to be associated with a lower likelihood of virological

response to antiviral drugs [9] and frequently persists in

patients responding to antiviral treatment, consistent with

HCV playing no major role in its pathogenesis [8, 9]. Both

types of steatosis (viral and metabolic) may co-exist in at

least some chronic hepatitis C patients, although steatosis is

more likely to be predominantly viral in origin in patients

infected with genotype 3 viruses and predominantly met-

abolic in patients infected with viruses of other genotypes.

The HCV genome consists of a positive-sense, single-

stranded RNA molecule of 9.6 kb [10]. Translation of the

genome generates a polyprotein of approximately 3,000

amino acids, which is cleaved by a combination of viral

and cellular proteases to produce the mature structural and

non-structural proteins. The structural protein involved in

nucleocapsid assembly—the core protein—has been shown

to induce steatosis in two lines of transgenic mice [11, 12].

HCV core protein production is associated with multiple

changes in lipogenic gene expression [13–16] and lipo-

genic proteins activity [17, 18], and also has effects on

mitochondrial oxidative function [19–21]. In vitro studies

on various cell lines rapidly established that the HCV core

protein was located at the surface of lipid droplets acting as

intracellular storage sites for triglycerides and cholesterol

esters [22–25]. Moreover, HCV core has been shown to be

present on lipid droplets in liver biopsy specimens from

infected chimpanzees [23]. These observations raise the

intriguing possibility that this particular localisation is

somehow linked to liver steatosis [26]. Recent fundamental

research studies made possible by the isolation of a virus

strain (JFH-1, Japanese Fulminant Hepatitis clone 1) pro-

ducing infectious HCV from tissue culture cells have

demonstrated that the initiation of nascent virions assembly

and production takes place at lipid droplets [27]. Indeed,

attachment of the HCV core protein to lipid droplets is

linked to the release of infectious progeny virions from

infected cells. This release is accompanied by the redis-

tribution of lipid droplets within infected cells, with the

clustering of these lipid droplets in the perinuclear area

[28]. This redistribution requires only the mature HCV core

protein, generated by cleavage with two cellular enzymes:

signal peptidase and signal peptide peptidase (SPP). The

first of these enzymes releases the core protein from the

polyprotein targeted to the endoplasmic reticulum (ER)

membrane, generating an immature form of the core pro-

tein that contains the signal peptide [29]. Complete

processing of the protein requires further proteolysis by

SPP, which cleaves within the signal peptide. This second

cleavage event is essential for the trafficking of the core

protein to the lipid droplet [29]. The redistribution of lipid

droplets induced by the mature HCV core protein depends

on the microtubule network and is thought to increase the

likelihood of interaction between the core protein and the

site of HCV RNA replication within a network of mem-

branes in the perinuclear area [28]. Thus, the association of

the HCV core protein with lipid droplets seems to play a

central role in both HCV pathogenesis and morphogenesis,

suggesting that virus-induced steatosis may be essential for

the viral life cycle.

We have previously established a cellular model based

on HCV core protein production in which lipid droplets

accumulate and cluster in the perinuclear area of the

transfected cells [30]. Using this model, together with a new

method for monitoring the number and size of lipid droplets

in transfected cells, we demonstrated that the production of

a core protein bearing residues specific to HCV genotype 3

was associated with a higher amount of lipid droplets than

the production of a wild-type (WT) core protein of geno-

type 1 [30]. Thus, our cellular model seems to mimic, in

vitro, virus-induced steatosis and its genotype-specific

influence. In this study, we used this model to compare the

amount of intracellular lipid droplets in cells producing

immature and mature HCV core proteins. We also analysed

the clustering of lipid droplets induced by the mature HCV

core protein, by 3D electron microscopy, and considered

the implication of these observations for the potential

mechanisms underlying HCV-induced steatosis.

Materials and methods

Insertion of the HCV core sequences into Semilki forest

virus (SFV) vectors and site-directed mutagenesis

to generate an HCV core mutant not cleaved by SPP

The HCV core 1a construct was obtained from our previ-

ously described [31] genotype 1a cDNA clone (Dj6.4;

Genbank accession number AF529293) containing the

C-E1–E2 coding sequence. The WT core construct was

amplified by PCR, using PfuTurbo DNA polymerase

(Stratagene, La Jolla, CA, USA) with primers flanked by

BamH1 sites, as previously reported [32]. Site-directed

mutagenesis within the C-terminal core signal sequence

was performed with antisense primers leading to (1) the

generation of a triple mutant VLV180-3-4 (Fig. 1a) and (2)

M. Depla et al.

the insertion of a stop codon at the 30 end of the core

protein-coding region [33]. This particular mutant has been

shown to be resistant to SPP cleavage [33]. The sequences

encoding the WT and mutated core proteins were inserted

separately into the polylinker BamH1 site of the expression

vector pSFV1 (Life Technologies, Rockville, MD, USA).

DNA sequencing was used to check that the original

sequence was conserved in both constructs and that the

VLV180-3-4 mutations were correctly introduced in the

mutant.

Cell culture and transfection with RNA

Baby hamster kidney cells (BHK-21) were cultured and

electroporated with recombinant SFV RNA encoding the

HCV WT or VLV180-3-4 core protein, as previously

described [30, 33]. Briefly, cells were cultured at 37°C in

Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) supple-

mented with 5% foetal calf serum and 8% tryptose

phosphate. For recombinant RNA synthesis, the various

pSFV1 constructs were linearised by digestion at the SpeI

restriction site downstream from the 30 non-coding region

of the SFV replicon. Transcription was then carried out in

vitro with SP6 RNA polymerase, making use of the SP6

promoter located upstream from the 50 extremity of the

SFV replicon, as recommended by the manufacturer

(Invitrogen). As a control, we synthesised a recombinant

RNA encoding b-galactosidase (b-Gal). For transfection,

10 9 106 cells were mixed with 5 lg of recombinant SFV

RNA and electroporated by a single pulse at 350 V,

750 mF (Easyject One; Eurogentec). Cells were cultured

for 16 h following electroporation, as our previous studies

have shown that the major morphological events associated

with HCV structural protein production occur during this

period in this system [30, 33]. All experiments other than

confocal microscopy studies of the subcellular distribution

of core proteins were conducted with BHK-21 cells. For

these confocal microscopy studies, we transfected the

human hepatocellular carcinoma cell line FLC4 under

similar conditions. The lower efficiency of the SFV vectors

in these cells resulted in the production of smaller amounts

of protein than in BHK-21 cells, allowing a more precise

analysis of the subcellular distribution of proteins and an

analysis of co-localisation with lipids [30, 33].

Western blotting

Transfected BHK-21 cells were treated with a lysis buffer

containing 1% NP-40, 140 mM NaCl, 100 mM Tris–HCl

pH 8, 1% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl

sulphate, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 2 lg/ml

aprotinin and 2 lg/ml leupeptin. Samples were then sepa-

rated by SDS-PAGE in 15% polyacrylamide gels and the

resulting bands were transferred to a polyvinylidene

difluoride membrane. The membrane was blocked by

incubation in 0.05% (vol/vol) Tween 20 in phosphate

buffered saline (PBS) supplemented with 2% (wt/vol)

skimmed milk powder (PBS-T). Membranes were incu-

bated with the human monoclonal anti-HCV core B12F8

antibody (gift of Dr M. Mondelli) diluted 1:500 in PBS-T,

washed and incubated with a horseradish peroxidase-con-

jugated anti-human antibody diluted 1:5,000 in PBS-T.

Antibody binding was detected by enhanced chemilumi-

nescence (ECL Plus; Amersham Bioscience).

Fig. 1 Analysis of HCV core protein production and core-E1 signal

peptide processing. a Signal sequences of the two HCV core proteins

used in this study: the wild-type (WT) protein and the VLV180-3-4

mutant. The transmembrane region of the signal sequence at the core-

E1 junction is boxed. b Production of the WT and VLV180-3-4 mutant

core proteins in BHK-21 cells, and analysis of HCV core protein

processing by SDS-PAGE and western blotting. The WT core protein

was fully cleaved by SPP, appearing at 21 kDa, whereas the

VLV180-3-4 mutant core protein remained uncleaved, resulting in

detection of the p23 kDa form of the core protein. Cells producing

b-gal were used as a control and an anti-actin antibody was used to

normalise the western blot. c Immunofluorescence of WT and

VLV180-3-4 core proteins, combined with Nile Red staining of lipid

droplets in FLC4 cells. Lipid droplets were evenly distributed

throughout the cytoplasm of cells producing b-gal (negative control).

Significant clusters of lipid droplets co-localised with core protein

were observed in the perinuclear area of cells transfected with the WT

core construct, but not in cells producing the VLV180-3-4 mutant core

HCV-induced lipid droplet clustering

Confocal microscopy

Transfected FLC4 cells were cultured on glass coverslips

for 16 h and were then fixed by incubation for 30 min in

4% paraformaldehyde in PBS at room temperature. The

reaction was quenched and the cells were permeabilised

by incubation for 30 min in 0.05% saponin-0.2% bovine

serum albumin (BSA) in PBS. HCV core proteins were

detected by incubating the cells for 30 min with

the mouse monoclonal anti-HCV core antibody C7-50

(Abcam, Cambridge, MA, USA), diluted 1:100 in

permeabilisation buffer. The cells were then washed and

incubated with a secondary anti-mouse antibody coupled

to Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Eugene, OR,

USA), diluted 1:1,000 in permeabilisation buffer. For

lipid staining, the cells were treated with Nile Red

(Sigma-Aldrich), diluted 1:1,000 (from a 1 mg/ml stock

solution in acetone) in permeabilisation buffer, during

incubation with the secondary antibody. Confocal

microscopy was performed with an Olympus Fluoview

500 instrument.

Electron microscopy and immuno-electron microscopy

For standard electron microscopy (EM), transfected BHK-

21 cells were fixed by incubation for 48 h in 4% parafor-

maldehyde and 1% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate

buffer (pH 7.2) and postfixed by incubation for 1 h with

2% osmium tetroxide (Electron Microscopy Science, Hat-

field, PA, USA). They were dehydrated in a graded series

of ethanol solutions, cleared in propylene oxide, and

embedded in Epon resin (Sigma), which was allowed to

polymerise for 48 h at 60°C. Ultrathin sections were cut,

stained with 5% uranyl acetate, 5% lead citrate, and placed

on EM grids coated with collodion. The sections were then

observed with a Jeol 1230 transmission electron micro-

scope (Tokyo, Japan) connected to a Gatan digital camera

driven by Digital Micrograph software (Gatan, Pleasanton,

CA, USA) for image acquisition and analysis. For immuno-

EM, transfected BHK-21 cells were fixed by incubation in

a solution containing 4% paraformaldehyde in 0.1 M

phosphate buffer (pH 7.2) for 16 h. The cells were col-

lected by centrifugation and the cell pellet was then

dehydrated in a graded series of ethanol solutions at

-20°C, using an automatic freezing substitution system

(AFS; Leica), and embedded in London resin white

(Electron Microscopy Science). The resin was allowed to

polymerise at -25°C, under UV light, for 72 h. Ultrathin

sections were cut and blocked by incubation with 1%

fraction V bovine serum albumin (BSA; Sigma) in PBS.

They were then incubated with anti-HCV core C7-50

monoclonal antibody diluted 1:50 in PBS supplemented

with 1% BSA, washed and incubated with goat anti-mouse

antibodies conjugated to 15 nm gold particles (British

Biocell International, Cardiff, UK) diluted 1:40 in PBS

supplemented with 0.1% BSA. We used conjugated goat

secondary antibodies without prior incubation with pri-

mary antibody to check that the reaction was specific.

Ultrathin sections were stained and observed as described

above.

Lipid droplet quantification and statistical analysis

We used our recently established method for morphometric

analysis of the lipid droplets encountered in cells [30].

Briefly, for each construct (b-Gal, WT core, VLV180-3-4

core mutant), the number and diameter (in lm) of lipid

droplets were determined on the computer screen for 100

consecutive EM (standard) sections of the transfected

BHK-21 cells. Lipid droplet diameter was converted into

an area in lm2. By summing these areas, we were able to

determine the cumulative lipid droplet area, in lm2, for

each cell section. Lipid droplet areas in 100 consecutive

EM sections of the transfected cells seemed to follow

mixed distributions. Indeed, the probability of observing a

null area (discrete component of the distribution) was non-

null, whereas a probability density function existed for all

non-zero values of cumulative areas (continuous compo-

nent of the distribution). We therefore categorised the

variable before carrying out statistical tests. Based on

Sturges’ rule, we defined seven classes of cumulative lipid

droplet area (0, 0–0.25, 0.25–0.5, 0.5–1, 1–1.5, 1.5–2 and

2–4 lm2), thereby defining an ordinal variable. Constructs

were compared by chi-squared test for trend taking into

account the ordinal nature of the newly created variables.

We also considered the proportion of cell sections with null

area which were compared by a chi-squared test. Data were

analysed with SAS 9.1 software.

Triglyceride quantification

Ten millions of BHK-21 cells transfected with recombinant

SFV RNA encoding the HCV WT, VLV180-3-4 core

protein or b-galactosidase were collected in 1 mL of PBS.

Total lipids extraction was performed using a method

adapted from Folch et al. [34]. Briefly 3 mL of a 2:1

chloroform–methanol (v/v) mixture and 1 mL water were

added to 1 mL of cell suspension. After homogenisation

and centrifugation the resulting mixture separated into two

phases. The lower phase containing total lipids was col-

lected, then evaporated, and lipids were dissolved in

isopropanol. Triglyceride concentration was then measured

by enzymatic reaction using the colorimetric kit TG PAP

150 (BioMerieux, Marcy l’Etoile, France). Data were dis-

played with the b-galactosidase as control (test/control

ratio of the optic density values).

M. Depla et al.

Three-dimensional (3D) reconstruction analysis

of whole cells producing the WT HCV core protein

We have recently described the use of serial EM sections

for the 3D reconstruction of large cellular microdomains in

cells producing the HCV core protein [35]. This previous

study demonstrated that the budding of the HCV-like

particles formed by self-assembly of the HCV core protein

was initiated mostly at ER membranes closely associated

with lipid droplets [34]. In this study, we used a similar

approach to reconstruct several whole BHK-21 cells pro-

ducing the WT HCV core protein. Briefly, we resized our

Epon blocks to cut a ribbon of serial ultrathin sections

(75 nm thick) of transfected cells. EM grids were stained as

described above, and electron micrographs were collected

with a digital camera for the same region of cells in each of

the series of sections. Photoshop software was used to align

image stacks for these serial EM sections. As the electron

beam distorts ultrathin sections slightly, it was necessary to

align the images based on the position of specific structures

of interest. Contours were carefully drawn with IMOD

software [36] through the same specific cellular structures

on different serial sections. These structures included the

plasma membrane, nuclear envelope, lipid droplets and

centrosome. The contours from a stack of serial sections

were then arranged into objects with IMOD. Using the

IMODmesh feature of IMOD, we then joined the contours

of each object to form a 3D model. Nine cells were ana-

lysed thoroughly to determine the subcellular distribution

of their lipid droplets. A lipid droplet cluster was defined as

at least three droplets grouped together, with the individual

droplets of the cluster separated by less than the mean

diameter of a lipid droplet (i.e. 0.5 lm). A lipid droplet

cluster was considered to be closely associated with a

centrosome if at least one lipid droplet from the cluster was

less than 1.5 lm from the nearest centriole.

Results

Expression and processing of HCV WT core

and VLV180-3-4 core mutant proteins

Sixteen hours after transfection with the constructs

encoding HCV core proteins or the b-gal control, the cells

were harvested and lysed for western blot analysis

(Fig. 1b). Consistent with our previous findings [30–33],

the WT core protein encoded by the Dj6.4 sequence

appeared to be fully cleaved by SPP, leading to the

detection of a p21 protein, whereas the VLV180-3-4 core

mutant remained uncleaved, resulting in the detection of a

p23 form of the core protein. We used Image J software for

gel analysis to quantify the WT and mutant core proteins in

the scanned blot and found that these two proteins were

present in similar amounts.

Colocalisation of HCV core proteins with lipid droplets

Nile Red labelling in cells transfected with the b-gal con-

struct showed that lipid droplets were evenly distributed

throughout the cytoplasm (Fig. 1c). Transfection with the

WT core construct induced the clustering of large lipid

droplets in the perinuclear area, as previously reported for

our model [30, 33] and for other in vitro cellular models

[28]. The surface of these droplets was strongly stained for

HCV core protein, as previously described in these models

[28, 30, 33]. Transfection with the VLV180-3-4 core

mutant construct did not induce lipid droplet clustering,

and this mutant core protein displayed only a weak asso-

ciation with lipids, which were evenly distributed

throughout the cytoplasm, as previously described [33].

Similar results were obtained when the experiment was

repeated and for analyses of large numbers of cells (only

one cell is shown for each construct in Fig. 1c, to show the

colocalisation of HCV core proteins and lipid droplets as

clearly as possible).

Electron microscopy and immuno-electron microscopy

Standard electron microscopy showed that the ultrastruc-

tural changes observed in cells transfected with

recombinant SFV vectors encoding the WT core protein

were consistent with our previous findings [30, 33], with

the clustering of large lipid droplets in the perinuclear area

(Fig. 2, top). These lipid droplet clusters were systemati-

cally surrounded by convoluted ER membranes rich in

HCV-like particles budding towards the lumen of this

convoluted ER compartment, as previously described

(Fig. 2) [35]. Transfection with b-Gal RNA had no effect

on ER morphology, with linear ER membranes evenly

distributed throughout the cytoplasm (not shown).

Immuno-electron microscopy on freeze-substituted cells

producing the WT core protein showed that the surface of

the clustered lipid droplets and their surrounding ER

membranes stained strongly positive for HCV core protein

(Fig. 2, bottom). Standard electron microscopy in cells

transfected with the recombinant SFV RNA encoding the

VLV180-3-4 core mutant revealed multiple layers of dense

ER membranes, as previously described [33] (Fig. 2, top).

It has been suggested that this particular mutant, which is

not processed by SPP and thus remains anchored in the ER

membrane by its transmembrane sequence signal, induces

these multi-layered ER membranes by protein–protein

interaction [33]. This hypothesis was recently confirmed by

another group [37]. Immuno-electron microscopy on

freeze-substituted cells producing this mutant showed that


these multi-layered ER membranes were strongly positive

for HCV core protein (Fig. 2, bottom).

Lipid droplet quantification

We determined the cumulative area covered by lipid

droplets for 100 consecutive cell sections, for each con-

struct, studied in random order (Fig. 3). The cumulative

area of the lipid droplets was higher for both core proteins

than for the control protein b-gal (p\ 0.0001 for the WT

core protein; p = 0.0029 for the VLV180-3-4 core mutant).

This cumulative area was greater for the WT core protein

than for the VLV180-3-4 mutant core protein, although this

difference was of low significance (p = 0.0634). However,

the proportion of cell sections with null areas (thick lines in

0) was lower with the WT core protein than with the VLV

180/3/4 core mutant protein (respectively, 35 vs 56%,

p = 0.003).

Triglyceride quantification

We measured the total amount of triglycerides in cells

transfected with the various constructions, using a com-

mercially available colorimetric assay. Triglyceride

accumulation in cell producing the VLV180-3-4 core

mutant or the WT core protein was about 1.5-fold and

2.0-fold with respect to the control b-galactosidase protein,

respectively (Fig. 4).

3D reconstruction analysis of whole cells producing

the WT HCV core protein

Nine cells producing the WT core protein and containing at

least one lipid droplet cluster were fully reconstructed in

3D with our method based on serial EM sections (between

150 and 180 sections for a typical cell). We considered a

lipid droplet cluster to have formed when three of more

Fig. 2 Electron micrographs of ultrathin sections of BHK-21 cells

producing the WT core or VLV180-3-4 core mutant protein studied by

regular EM (upper image) or freeze substitution and immunogold

labelling with a monoclonal anti-HCV core (lower image). Cells

producing the WT core protein contained convoluted ER membranes

surrounding clusters of lipid droplets (LD). These convoluted

membranes surrounding the droplets and the surface of the droplets

themselves stained strongly for the HCV core by immunogold

labelling. Cells producing the VLV180-3-4 core mutant contained

abundant electron-dense, multi-layered structures formed by the

interaction of multiple ER membranes (see also the inset correspond-

ing to an enlargement of the area indicated by the arrow). These

multi-layered ER membranes were strongly positive for the HCV core

protein on immunogold labelling. No gold labelling was detected at

the surface of the lipid droplets in these cells. All these structures

were specific to the HCV core protein, as none of these modifications

or immunogold labelling was detected in cells producing b-gal (data

not shown). Scale bars 0.5 lm in all micrographs

M. Depla et al.

lipid droplets were found in close proximity (less than the

mean lipid droplet diameter, 0.5 lm, apart). We observed

1–4 lipid droplet clusters per cell in these nine cells and

analysed 20 lipid droplet clusters in total. A lipid droplet

cluster was considered to be associated with a centrosome

when at least one of the lipid droplets of the cluster was

found to be located less than 1.5 lm from the nearest

centriole. Only 4 out of these 20 lipid droplet clusters

observed were associated with a centrosome. In the cases in

which only one lipid droplet cluster per cell was observed,

the lipid droplet cluster concerned was never associated

with the centrosome. Figure 5 illustrates a typical cell with

a single large lipid droplet cluster, in which the centrosome

is opposite the lipid droplet cluster within the cytoplasm

(see also the QuickTime movie of the 3D reconstruction of

this cell in the electronic supplementary material, which

illustrates the spatial distribution of these different organ-

elles within the cell).

Discussion

A recent study assessing the spatial dispersion of lipid

droplets through the cytoplasm by confocal microscopy

demonstrated that these organelles group together in clus-

ters in the perinuclear area of HCV-infected cells [28].

Disruption of the microtubule network or the microinjec-

tion of dynein antibodies prevent the formation of these

Fig. 3 Quantification of the

cumulative area covered by

lipid droplets in sections of

BHK-21 cells producing the

WT core protein, the

VLV180-3-4 core mutant or the

b-galactosidase control protein.

The cumulative area covered by

lipid droplets per cell section (in

lm2) was determined on 100

consecutive cell sections for

each protein. The cumulative

lipid droplet area was

categorised into seven classes:

0, 0–0.25, 0.25–0.5, 0.5–1,

1–1.5, 1.5–2 and 2–4 lm2. The

probability distributions were

mixed distributions. The thick

line in 0 indicates the frequency

of null areas, whereas non-null

areas are presented as

histograms. The chi-squared test

associated with the comparison

of the WT core with the

VLV180-3-4 core mutant or

b-galactosidase yielded p values

of 0.0634 and\0.0001,

respectively. The chi-squared

test associated with the

comparison of VLV180-3-4 core

mutant with b-galactosidase

yielded a p value of 0.0029


clusters, which are thought to occur specifically around the

centrosome. The authors of this previous study interpreted

these results as indicating a global redistribution of the pre-

existing lipid droplets following HCV infection, through

the trafficking of these organelles along the microtubule

network and towards the centrosome. This phenomenon

was observed in the hepatoma cell line Huh7 infected with

the complete virus (the JFH-1 strain), and also in Huh7

cells producing only the mature HCV core protein of var-

ious genotypes [28]. An immature core protein (i.e. not

cleaved by SPP) did not induce these specific clusters in the

Huh7 cells and the lipid droplets therefore remained dis-

persed through the cytoplasm. This previous study was

based on a system of core protein production from an SFV

vector, resulting in the rapid induction of these lipid droplet

clusters in 16 h, rather than 3 days required in cells

infected with the complete virion [28]. To investigate this

phenomenon further, we used here SFV vectors to produce

the mature and immature core proteins in the BHK-21 cell

line. This cell line was chosen for the high percentage of

transfected cells (near 100%) reached after electroporation,

allowing a better analysis of the changes induced by the

core proteins in the lipid droplets amount. Moreover, this

cell line has been previously shown to accumulate tri-

glycerides in cytoplasmic lipid droplets [38]. We used

different EM approaches such as immuno-EM, 3D recon-

structions and EM for lipid droplet quantification. EM has

been shown to be a more appropriate method than light

microscopy for quantifying the lipid droplets within cells

[35], and 3D EM reconstructions gave a more precise

subcellular localisation of centrosomes and lipid droplets.

Our morphometric analysis of lipid droplets in cells

transfected with the various constructs clearly shows that

HCV core protein production is associated with a larger

cumulative area being covered by lipid droplets. This

greater area was observed for both the mature (WT) and

immature (uncleaved mutant) forms of the HCV core

protein. This was also supported by the quantification of

the triglycerides in the transfected cells, showing an

increase in triglyceride synthesis in cells producing the WT

and mutant core proteins, as compared to the b-galactosi-

dase control protein. Thus, the various mechanisms

potentially involved in core-induced steatosis, including

Fig. 4 Triglyceride quantification in BHK-21 cells producing the

WT core protein, the VLV180-3-4 core mutant, or the b-galactosidase

control protein, using a commercially available assay (Biomerieux).

Data are displayed with the b-galactosidase as control (test/control

ratio of the optic density values), and are mean ± standard deviations

of four independent quantifications

Fig. 5 Three-dimensional reconstruction of a BHK-21 cell producing

the WT core protein. a Typical single ultrathin section of this cell,

showing its centrosome (arrow and enlargement in the inset) distant

from the cluster of lipid droplets (LD). Bars 2 lm. b Four different

views of the reconstruction of this cell obtained with IMOD software

and a total of 145 serial ultrathin (60–70 nm thick) EM sections,

showing the plasma membrane (light green), the nucleus (purple), the

centrosome (light purple and arrow) and the lipid droplets (yellow).

The cluster of lipid droplets is located in a cellular domain opposite to

the centrosome (arrows). A QuickTime movie of this 3D reconstruc-

tion is also provided in the electronic supplemental material

M. Depla et al.

lipogenic gene expression [13–16], the modulation of

lipogenic protein functions [17, 18], and effects on mito-

chondrial oxidative function [19–21] may also potentially

be induced by an uncleaved HCV core protein. Both

mature and immature core proteins have been shown to be

involved in upregulation of the fatty acid synthetase (FAS)

gene promoter [39]. Our results suggest that the change in

the distribution of lipid droplets observed in cells produc-

ing the mature core protein is not due simply to the

redistribution of the pre-existing droplets. This redistribu-

tion seems instead to be associated with the synthesis of

new lipid droplets, due to the direct lipogenic effects of the

HCV core protein. Further support for this interpretation is

also provided by our 3D reconstructions of whole cells

producing the mature core protein. These 3D reconstruc-

tions show that clusters of lipid droplets do not specifically

arise close to the centrosome. The precise localisation of

the lipid droplets clusters and centrosomes possible with

this EM approach and the use of serial ultrathin sections is

not consistent with the formation of these clusters by the

simple migration of pre-existing droplets towards the

centrosome. Again, our 3D EM analysis is more consistent

with the de novo synthesis of lipid droplets at the site of

cluster formation.

It remains unclear how triglycerides and other neutral

lipids are packaged into cytosolic droplets. Several

hypotheses have been proposed concerning nascent lipid

droplet formation [39–42]. According to the most widely

supported of these hypotheses, lipids accumulate between

the two leaflets of the ER membrane, gradually taking on a

globular shape and then being pinched off from the ER to

become independent lipid droplets surrounded by a single,

ER-derived, monolayer membrane [40–43]. However,

neither nascent lipid droplets nor lipid deposition in the ER

membrane has ever been visualised, due to technical con-

straints and the extremely rapid nature of this phenomenon,

which takes place over the course of a few minutes [44].

Nevertheless, it has been suggested that the proteins of the

PAT (perilipin-adipophilin-Tip47) family, which coat the

lipid droplets, may be involved in this mechanism [45]. All

PAT proteins have similar sequences and can bind to the

surface of intracellular lipid droplets, either constitutively

or in response to metabolic stimuli, such as an increased in

lipid flux into or out of lipid droplets [46]. Each PAT

protein has a unique tissue distribution, subcellular locali-

sation and lipid-binding properties consistent with each of

these proteins playing a unique role in triglyceride man-

agement [47]. These proteins are exchangeable at the

surface of the lipid droplets in various conditions, and these

exchanges regulate the storage of lipids within the cell [45,

46]. It has been suggested that PAT family proteins not

only coat the droplets but actually order triglyceride

packaging, by managing the interface between the droplet

and the cytosol and contributing to membrane curvature

and the pinching off of the lipid droplet [45]. It has been

shown that the mature HCV core displaces adipophilin

from the surface of the lipid droplet [28]. Thus, in cells

producing the mature HCV core protein, lipid droplets may

emerge from the ER membranes in which the core protein

is synthesised, due to a specific role of the mature core

protein in lipid droplet morphogenesis. This may also

explain how the HCV core protein replaces adipophilin at

the surface of the lipid droplet. Immuno-EM observations,

such as that shown for the mature/WT core protein in

Fig. 2 support this model. Indeed, the lipid droplets seem to

emerge from ER membranes rich in HCV core protein.

Similar findings were obtained if the experiment was

repeated and for large numbers of cells. It is indeed diffi-

cult to believe that lipid droplets dispersed throughout the

cytoplasm would move specifically towards these areas

with a core-rich ER membrane. It seems more likely that

these lipid droplets surrounded by the HCV core protein

bud from these specific ER domains enriched in core

protein. So, what makes this phenomenon possible? Recent

studies have suggested that lipid droplets are extremely

dynamic organelles that may undergo repeated cycles of

fusion and fission with the ER membrane, thereby accu-

mulating or regressing within the confines of ER

membranes [40, 41, 43, 47]. Lipids may then diffuse lat-

erally in the ER towards the nascent lipid droplets [43].

This movement of lipid droplet may make it possible to

deliver lipids to various membrane organelles in the cell for

lipid exchange [48]. The fusion and fission of lipid droplets

is probably favoured by the mobility of these organelles

along the microtubule network [41, 48]. This could concern

the radial, centrosome-attached microtubules and also the

whole network of non-centrosomal microtubules. Thus,

this mobility would account for the prevention of lipid

droplet clustering in response to HCV core protein fol-

lowing disruption of the microtubule network or the

microinjection of antibodies against motor proteins such as

dynein [28].

Cells producing the WT/mature core protein contained

larger amounts of lipid droplets than cells producing the

immature/uncleaved mutant core protein. The reason for

this difference is unknown, but it may be due to the ability

of the mature core protein to localise at the surface of the

lipid droplets, contributing to the morphogenesis of these

organelles. Indeed, the overexpression of various members

of the PAT family, such as adipophilin and perilipin, is

associated with an expansion of the pool of lipid droplets

within the cell [49–51]. The HCV mature core protein

present at the surface of the lipid droplet may exert an

additional effect through specific lipid interaction,

increasing the number and/or size of lipid droplets within

the cell, or by inducing the fusion of many small and


invisible lipid droplets forming large, more visible drop-

lets. Alternatively, the mature core protein may induce a

higher amount of triglyceride synthesis, as suggested by

our intracellular triglyceride quantification. However, all

these mechanisms may act together to induce the accu-

mulation of lipid droplets in clusters seen in cells

producing the WT HCV core protein, the fusion of nascent

or existing lipid droplets to form larger droplets remaining

a matter of debate [52].

In conclusion, we have shown that the clustering of lipid

droplets induced by the HCV core protein does not result

from a simple redistribution of pre-existing organelles.

Instead, the HCV core protein seems to induce the de novo

synthesis of lipid droplets in the perinuclear area of the

cell. These results provide some insight into how HCV

‘‘hijacks’’ these organelles for its own life cycle. They also

shed light on the mechanisms of lipid droplet morpho-

genesis and dynamic, which have remained poorly

understood. Furthermore, our study demonstrates that the

formation of these clusters by the HCV core protein is

associated with a major increase in the cumulative area

covered by lipid droplets. This increase may be due to the

intrinsic properties of the core protein (mature or imma-

ture) and its interaction with various molecules involved in

the lipid metabolism, but may also be due in part to the

ability of the mature core protein to coat the nascent lipid

droplets. These results should help to guide future studies

of the mechanisms involved in the pathogenesis of HCV-

induced liver steatosis.

Acknowledgment This work was supported by a grant INSERM-

DHOS « Virosteatose ». M.D. was supported by a fellowship from

the INSERM and Region Centre. We thank Dr Mario Mondelli

(Istituto di Clinica delle Malattie Infettive, Pavia, Italy) for providing

us with the monoclonal B12F8 anti-HCV core reagent. We thank

Sylvie Trassard and Fabienne Arcanger for technical assistance. We

thank Bruno Giraudeau, Eric Piver and Pierre Besson for helpful

discussions and feedback on this work. Our data were obtained with

the assistance of the RIO Electron Microscopy Facility of Francois

Rabelais University.

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98

Article 2

The birth and life of lipid droplets: learning from the hepatitis

C virus

Phillippe ROINGEARD and Marion DEPLA

Publié en 2011 dans Biology of the Cell

Biol. Cell (2011) 103, 223–231 (Printed in Great Britain) doi:10.1042/BC20100119 Scientiae forum

Models and Speculations

The birth and life of lipid droplets:learning from the hepatitisC virusPhilippe Roingeard1 and Marion Depla

INSERM U966, Universite Francois Rabelais and CHRU de Tours, 10 Boulevard Tonnelle, 37032 Tours, France

LDs (lipid droplets) are probably the least well-characterized cellular organelles. Having long been considered simple

lipid storage depots, they are now considered to be dynamic organelles involved in many biological processes.

However, most of the mechanisms driving LDs biogenesis, growth and intracellular movement remain largely

unknown. As for other cellular mechanisms deciphered through the study of viral models, HCV (hepatitis C virus) is

an original and relevant model for investigations of the birth and life of these organelles. Recent studies in this model

have raised the hypothesis that the HCV core protein induces the redistribution of LDs through the regression and

regeneration of these organelles in specific intracellular domains.

IntroductionCytoplasmic LDs (lipid droplets) are intracellular

structures that store neutral lipids. Until recently,

they were classified into the same category as glyco-

gen granules, as simple inert storage sites for energy,

increasing and decreasing as a function of metabolic

energy requirements. However, considerable interest

has recently been focused on LDs as dynamic organ-

elles at the hub of lipid exchanges between intra-

cellular compartments and energy metabolism (Mar-

tin and Parton, 2006; Murphy et al., 2009). Major

findings highlighting the dynamic nature of LDs

include the identification of key proteins involved

in LD biology and the discovery of differences in

the protein and lipid compositions of LDs in differ-

ent cell types and physiological states (Bickel et al.,

2009). There is also increasing evidence to suggest

that LDs interact dynamically with other membrane-

bound organelles, including the ER (endoplasmic

1To whom correspondence should be addressed at: Laboratoire de BiologieCellulaire, INSERM U966, Faculte de Medecine, Universite Francois Rabelais,10 Boulevard Tonnelle, 37032 Tours, France ([email protected]).Key words: endoplasmic reticulum (ER), hepatitis C virus (HCV), lipid droplet(LD), organelle dynamics.Abbreviations used: ADRP, adipose differentiation-related protein; BHK-21cell, baby-hamster kidney-21 cell; DGAT1, diacylglycerol acyltransferase-1;DGAT2, diacylglycerol acyltransferase-2; ER, endoplasmic reticulum; HCV,hepatitis C virus; LD, lipid droplet; NS, non-structural; SP, signal peptidase;SPP, signal peptide peptidase; TEM, transmission electron microscopy.

reticulum), mitochondria, endosomes, peroxisomes

and the plasma membrane, probably as a means

of providing these organelles with neutral lipids

and phospholipids (Goodman, 2008; Murphy et al.,

2009). More intriguingly, LDs have also been shown

to have a number of unexpected functions such as

constituting a protective reservoir for unfolded pro-

teins or other compounds unrelated to lipids to pre-

vent harmful interactions with other cell components

(Ohsaki et al., 2006; Welte, 2007).

However, despite rapid progress in LD research, the

mechanisms underlying the formation and dynam-

ics of LDs remain elusive. Recent studies on HCV

(hepatitis C virus), an important human pathogen,

have demonstrated that HCV uses LDs as a platform

for viral assembly (Miyanari et al., 2007). This phe-

nomenon is linked to the ability of the HCV core pro-

tein to induce the redistribution of LDs, through the

clustering of these organelles in the perinuclear area

(Boulant et al., 2008; Depla et al., 2010). Many other

cellular mechanisms have already been deciphered by

studying viruses, and HCV may be a relevant model

for elucidating the birth and life of LDs.

LD morphology and compositionAlthough best known for their role in lipid stor-

age in mammalian adipocytes in adipose tissue, LDs

are present in almost all eukaryotic cells, including

www.biolcell.org | Volume 103 (5) | Pages 223–231 223

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P. Roingeard and M. Depla

yeasts, and even in some prokaryotes. Unlike vesicular

organelles, the aqueous contents of which are enclosed

by a phospholipid bilayer, LDs consist of a highly hy-

drophobic lipid core surrounded by a phospholipid

monolayer (Murphy and Vance, 1999; Tauchi-Sato

et al., 2002). On TEM (transmission electron mi-

croscopy) analysis of conventional ultrathin sections,

LDs are visible as spherical structures with a highly

homogeneous content (Figure 1A).

LDs store neutral lipids, predominantly triacylgly-

cerols and sterol esters. These substances are crucial

for the cell. Triacylglycerols are the principle com-

pounds used for energy storage, and both triacylgly-

cerols and sterol esters serve as reservoirs of membrane

lipid components. Adipocytes contain mostly tri-

acylglycerols, whereas macrophages contain mostly

sterol esters. Ether-linked glycerolipids also account

for 10–20 % of the lipids in several cultured cell

lines (Bartz et al., 2007a). The phospholipids form-

ing the monolayer, with their inward-pointing acyl

chains, are essentially very similar to those found

in the ER (Bartz et al., 2007a). However, differ-

ent proteins are present on the surface of LDs. Per-

ilipin, which is found in adipose tissues, is one of the

best-studied proteins associated with LDs (Greenberg

et al., 1991). Perilipin stabilizes the LDs and is

also essential for lipolysis, becoming highly phos-

phorylated upon adrenergic stimulation, thereby at-

tracting hormone-sensitive lipase to the LD (Sztalryd

et al., 2003). However, perilipin belongs to a larger

family of animal LD-binding proteins, all contain-

ing the PAT domain, named after the three founding

members of this family: perilipin, adipophilin [or

ADRP (adipose differentiation-related protein)] and

TIP47 (tail interacting protein of 47 kDa). More re-

cently, a new nomenclature leading to the name of

PLIN proteins has been established for the mam-

malian PAT-proteins (Kimmel et al., 2010). Each

PAT/PLIN protein has unique tissue and subcellu-

lar distributions, and LD-binding properties consist-

ent with a unique role in LD content management

(Goodman, 2008). Some of these proteins are ex-

changeable at the surface of LDs in various condi-

tions and regulate the storage of lipids within the cell

(Wolins et al., 2006; Bickel et al., 2009). Individual

cells may also contain subsets of LDs with different

populations of PAT/PLIN proteins, varying with size,

age and the level of metabolic activity (Wolins et al.,

2006; Brasaemle, 2007; Digel et al., 2010).

LDs have been subject to many proteomic studies

in recent years (Bartz et al., 2007b; Hodges and Wu,

2010). These studies unexpectedly picked up pro-

teins regulating trafficking pathways, such as mem-

bers of both the Rab and ARF (ADP-ribosylation

factor) families of small GTPases, caveolin and other

proteins thought to be specific for vesicle-docking

events in exocytosis pathways. Of the potentially

LD-associated Rab proteins, only a limited number

have been examined in detail in the context of the

LD. However, Rab18 has received particular atten-

tion because it shows specific regulated localization to

the surface of LDs (Ozeki et al., 2005; Martin et al.,

2005). The identification of these proteins on LDs

provides evidence for a role for LDs in communica-

tions between organelles (Zehmer et al., 2009a). In

addition, motor proteins, such as dynein and kinesin,

have been identified in some LDs, suggesting the pos-

sible movement of these structures on microtubules

during the transfer of molecules to various organelles

(Zehmer et al., 2009a).

LD formationThere is considerable evidence to indicate that LDs

are derived from the ER. TEM studies have revealed

that LDs are tightly associated with the ER mem-

brane (Figure 1B), and proteomic studies of LDs isol-

ated from various cell lines have revealed the pres-

ence of many ER proteins (Liu et al., 2004; Bra-

saemle et al., 2004; Wan et al., 2007). It has been

suggested that LDs associated closely with the ER,

with the ER membrane forming a structure resem-

bling an egg cup and holding the LD, which re-

sembles an egg (Robenek et al., 2006). However,

the prevailing model for LD formation involves the

emergence of LDs from the ER lipid bilayer as a

lens-shaped mass of neutral lipids that then buds

off from the cytoplasmic face of the bilayer to form

a droplet within the cytoplasm (Brasaemle, 2007;

Wolins et al., 2006). It has been suggested that ex-

changeable PAT/PLIN proteins curve the ER mem-

brane to mediate this budding, acting as coatamer-

like proteins (Wolins et al., 2006). This model is

attractive because it accounts for the phospholipid

monolayer surrounding LDs and localizes the birth-

place of LDs to the organelle in which the enzymes

mediating neutral lipid synthesis are found on bio-

chemical analysis. Moreover, DGAT2 (diacylglycerol

224 C© The Authors Journal compilation C© 2011 Portland Press Limited

Lipid droplets in HCV infection Scientiae forum

Figure 1 Three-dimensional reconstruction from serial ultrathin sections of a subcellular domain containing LDs

(A) Sample of one (central) TEM ultrathin section of this subcellular domain, showing the LDs (yellow), ER (light blue) and

mitochondria (brown). (B) View of a full reconstruction, using the same colour code, of this subcellular domain corresponding to

15 serial TEM ultrathin (60–70 nm) sections, showing that all LDs are tightly bound to smooth ER membranes. The LDs shown in

these TEM photographs are from BHK-21 cells (baby-hamster kidney-21 cells), and the cellular microdomain was reconstructed

with IMOD software, as described elsewhere (Roingeard et al., 2008; Depla et al., 2010). Scale bar: 1 µm. A QuickTime movie of

this 3D reconstruction is also provided as Supplementary material at http://www.biolcell.org/boc/103/boc1030223add.htm.

acyltransferase-2), a key enzyme involved in triacyl-

glycerol synthesis, is found in areas in which LD

are tightly associated with the ER, under conditions

promoting LD formation (Kuerschner et al., 2008).

There is some evidence to suggest that LDs never

leave the ER, instead constituting specialized re-

gions of the ER. TEM studies have frequently shown

continuity between the cytosolic leaflet of the ER

and the boundary leaflet of the LDs (Blanchette-

Mackie et al., 1995). Moreover, three-dimensional

reconstructions of large cellular domains have shown

that LDs are invariably intimately linked to the ER

compartment (Figure 1B; see also the Supplement-

ary QuickTime movie of a three-dimensional recon-

struction of such large microdomain, at http://www.

biolcell.org/boc/103/boc1030223add.htm). This no-

tion that LDs are specialized regions of the ER is

attractive because this organization would provide

a simple mechanism for the exchange of lipids

and proteins between these two compartments.

For example, during metabolic stress requiring

the rapid hydrolysis of esterified fatty acids and the

release of non-esterified fatty acids, the leaflet must

rapidly shrink. Continuity with the ER would make

it possible for this compartment to act as a sink for

these leaflet components (Goodman, 2008). Altern-

atively, there is evidence to suggest that the traf-

ficking of membrane-derived vesicles may connect

the ER with LDs that have been fully released from

the ER membrane (Farese and Walther, 2009). How-

ever, this model cannot account for the fusion of ves-

icles surrounded by a bilayer membrane with the

monolayer surrounding LDs. In addition, many of

the proteins identified in the LD proteome are pre-

dicted to have multiple membrane spans and it is

difficult to imagine them arranged in a single leaf-

let surrounding a hydrophobic core of neutral lip-

ids (Goodman, 2009). These observations suggest

that these proteins are more likely to be present

in specialized ER membranes tightly bound to the

LD that could be separated from the bulk ER dur-

ing fractionation, thus being purified with the LD.

However, this model remains speculative and caution

should be employed when using it as a basis for other

hypotheses.

LD growth and mobilizationLD size varies tremendously, from a diameter of

only 50–100 nm to a diameter of 100 µm in white

adipocytes. LD can also clearly grow in size. It is



possible that LDs expand as single organelles, like in-

flated balloons. If LDs remain physically attached to

the ER, proteins and newly synthesized lipids could

diffuse laterally into the LDs. If LDs are fully de-

tached from the ER, these proteins and lipids must be

transported to the LDs in vesicles, although the topo-

logical problems arising from the fusion of a vesicular

bilayer membrane with the monolayer membrane at

the surface of LD suggest that this is unlikely. Al-

ternatively, the neutral lipids in the LD core may be

produced locally by enzymes such as DGAT2, which

is present on the surface of LDs (Kuerschner et al.,

2008). However, any such increase in the volume of

neutral lipids would need to be matched by a cor-

responding increase in the synthesis of phospholipids

at the surface of LDs. The recent demonstration that

key enzymes required for phospholipid synthesis are

present at the LD surface provides support for this

potential mechanism (Guo et al., 2008).

The fusion of several smaller LDs to form lar-

ger LDs may also contribute to LD growth (Guo

et al., 2008), and models in which SNARE (soluble

N-ethylmaleimide-sensitive fusion protein-attach-

ment protein receptor) proteins and motor proteins

are involved in LD fusion have been proposed (An-

dersson et al., 2006; Bostrom et al., 2007; Olofsson

et al., 2008; Ducharme and Bickel, 2008). However,

due to the extremely low frequency of this phe-

nomenon in live imaging, LD fusion remains a con-

troversial subject (Thiele and Spandl, 2008; Farese

and Walther, 2009; Cheng et al., 2009; Murphy

et al., 2010). Indeed, it has been pointed out that LD

fusion is not observed in situations in which

LD are densely packed such that there are obvious

signs of mechanical strain, with LDs being pressed

against each other (Thiele and Spandl, 2008). This

is remarkable, given that LDs have only a monolayer

membrane, and so their fusion would therefore re-

quire only one simple step. It has also been argued

that the small amount of protein recovered from LD

preparations is consistent with the absence of a dense

coverage of proteins with anti-fusion activities on the

surface of LDs (Thiele and Spandl, 2008). It there-

fore seems possible that the composition of the LD

monolayer may contribute to the inhibition of spon-

taneous fusion. Moreover, LD fusion would generate

a large excess of phospholipids originating from the

surface of the small original LDs, and it is unclear as

to how the large LD formed by fusion could simul-

taneously adjust its phospholipid monolayer (Ohsaki

et al., 2009).

LDs not only grow but also shrink through lipoly-

sis induced by the lipases present at the LD surface.

The proteins of the PAT/PLIN family play a key role

in the organization and regulation of this process

(Brasaemle, 2007). More recently, it has been shown

that autophagy induced by nutrient deprivation

(Singh et al., 2009) or dengue virus infection (Heaton

and Randall, 2010) may also regulate the mobil-

ization of lipids from LDs. In adipocytes, it has

been suggested that LDs may undergo fission dur-

ing lipolysis. This would greatly increase the sur-

face area of LDs, improving the access of lipases to

the neutral-lipid core (Marcinkiewicz et al., 2006).

However, this increase in surface area would re-

quire more surface phospholipids and the mechan-

ism by which this could be achieved remains un-

clear. It therefore appears most likely that LDs are

never completely severed from the ER, instead re-

maining permanently connected to the outer leaf-

let of the ER membrane. Pioneer TEM observa-

tions have suggested that LDs accumulate or regress

within the confines of ER membranes (Blanchette-

Mackie et al., 1995). More recent studies have also

provided support for this model by demonstrating

experimentally that LDs are formed from and re-

gress to the ER as part of a cyclic process that does

not involve trafficking through the secretory pathway

(Zehmer et al., 2009b).

Intracellular movements of LDsLive imaging has shown that LDs move around

the cytoplasm in many cells. In some cases, the

distribution of the entire population of LDs in

cells may change dramatically within a few hours

(Welte, 2009). This mobility seems to involve mostly

microtubule-based transport. The pharmacological

disruption of microtubules typically prevents this

movement of LDs, whereas the disruption of actin

filaments has little effect. Moreover, cytoplasmic

dynein, a minus end-directed microtubule motor, is

often physically associated with LDs, and the func-

tional inactivation of dynein prevents LDs from mov-

ing within the cell in various models (Welte, 2009).

Although it is tempting to speculate that these

changes are due to LDs moving along the micro-

tubules from one location in the cell to another, as

suggested by some movies, other interpretations have



been considered. It has also been suggested (Welte,

2009) that LDs may not move as a unit, instead re-

gressing and being regenerated at their destination.

The requirement of dynein as a co-factor for the form-

ation of a nascent LD is consistent with this hypo-

thesis (Andersson et al., 2006). This process would

involve lipids from shrinking LDs diffusing laterally

through the expansive ER network to form new LDs

elsewhere in the cell (Murphy et al., 2009; Welte,

2009).

The HCV modelHCV infection is rapidly becoming a major global

health issue, with more than 130 million people in-

fected worldwide (Alter, 2007). Of those exposed to

HCV, 80 % become chronically infected, and at least

30 % of carriers go on to develop severe liver diseases

such as cirrhosis and liver carcinoma. There is cur-

rently no vaccine to prevent new infections and the

efficacy of current therapies remains limited. In recent

years, the impact of HCV infection on lipid metabol-

ism and in particular the development of a liver ste-

atosis has emerged as a clinically important topic

in liver diseases (Roingeard and Hourioux, 2008;

Piver et al., 2010). HCV has a positive-sense, single-

stranded RNA genome encoding a single polypro-

tein that is both co- and post-translationally cleaved

at the ER membrane by host or viral proteases to

generate several proteins (Moradpour et al., 2007).

The N-terminal component of the polyprotein en-

codes the structural proteins: the core protein, which

forms the viral capsid, and the two envelope proteins

that surround the capsid to form the virion. The C-

terminal region of the polyprotein contains the NS

(non-structural) proteins involved in the formation of

replication complexes for the synthesis of viral RNA

(Moradpour et al., 2007).

Many years before a tissue culture system for produ-

cing infectious HCV in vitro had been developed, the

HCV core protein was reported to be associated with

the surface of LDs (Moradpour et al., 1996; Barba

et al., 1997). This association is dependent on the

release of the protein from the polyprotein by two

different cellular proteases: SP (signal peptidase) and

SPP (signal peptide peptidase) (McLauchlan et al.,

2002). SP cleaves the polyprotein at the C-terminus

of a signal peptide between the core and envelope

proteins, producing an immature form of the core

protein that is unable to associate with LDs. The

second cleavage, by SPP, occurs within the signal pep-

tide and generates the mature form of the protein,

which is then transported towards the LD surface

(McLauchlan et al., 2002). During this trafficking

step, the HCV core protein remains attached to the

ER cytosolic monolayer membrane and then to the

monolayer membrane surrounding the LD, through

its C-terminal domain, which probably interacts in-

plane with these membranes (McLauchlan, 2009a).

Following the long-awaited successful propagation of

an HCV strain in cultured hepatic Huh7 cells, it has

recently been shown that LDs are directly involved in

the production of infectious HCV particles (Miyanari

et al., 2007). This study demonstrated that the HCV

core protein on LDs recruits NS proteins and rep-

licated RNA to LD-associated membranes, and that

this structural arrangement plays a crucial role in the

formation of infectious viruses. Disruption of the as-

sociation of HCV core protein with LDs was found

to cause a defect in the localization of HCV RNA

and NS proteins to regions surrounding LDs, thereby

preventing infectious virus assembly (Miyanari et al.,

2007; Boulant et al., 2007). Further investigations of

this infectious HCV system demonstrated that HCV

core protein initially attached to a discrete site on

LDs after processing by SPP, subsequently coating

the entire LD (Boulant et al., 2007). This observa-

tion suggested that there might be a defined loading

site for the core protein, probably at points of con-

tact between LDs and the ER membrane (Boulant

et al., 2007). More recently, it has been demonstrated

that a key enzyme involved in triacylglycerol syn-

thesis, the DGAT1 (diacylglycerol acyltransferase-

1), is involved in the HCV infectious cycle. Both

DGAT1 and DGAT2 are ER resident enzymes that

catalyse the final step in triacylglycerol biosynthesis

and are essential in LD biogenesis, but only DGAT2

remains associated with the LDs. Recent studies have

demonstrated that DGAT1 interacts with the HCV

core protein and promotes its traffic to the surface of

DGAT1-generated LDs (Herker et al., 2010). It re-

mains unclear as to why HCV targets LDs, but this

targeting may be linked to the contribution of these

LDs to the formation of VLDLs (very-low-density

lipoproteins) in hepatocytes, as the viruses circulating

in chronically infected patients are associated with

lipoproteins (Andre et al., 2002; Icard et al., 2009;

McLauchlan, 2009b).



Figure 2 HCV core production induces the relocalization, within a few hours, of LDs to perinuclear areas

(A) On conventional TEM, these clustered LDs are connected to the convoluted electron-dense ER membrane (arrows).

(B) Freeze substitution TEM and immuno-gold labelling with a specific monoclonal antibody shows the presence of a large

amount of HCV core protein in these convoluted ER membranes linked to LDs (arrows) and the membranes surrounding LDs.

The LDs shown on these photomicrographs are from BHK-21 cells (see Depla et al., 2010 for details of the materials and methods

used). Scale bars: 1 µm (A), 0.5 µm (B).

Nevertheless, one of the key elements underlying

the production of infectious virions is the modific-

ation of LD distribution within cells by HCV core

protein, such that LDs tend to aggregate in the per-

inuclear area (Boulant et al., 2008; Roingeard et al.,

2008). This redistribution of LDs may lead to the

close apposition of LDs with sites of viral RNA

replication containing newly synthesized viral gen-

omes and the NS proteins (Boulant et al., 2008).

HCV RNA is replicated at perinuclear ER-derived

membranes known as the membranous web (Morad-

pour et al., 2003), and the clustering of LDs around

these membranes is thought to increase the like-

lihood of interaction between the HCV core pro-

tein and the newly synthesized RNA, thereby pro-

moting genome packaging, the first step in virus

assembly. Light microscopy studies demonstrated

that the LD clustering induced by the HCV core

protein was blocked by disrupting the microtu-

bule network or impairing dynein function (Boulant

et al., 2008; Lyn et al., 2010). The authors naturally

interpreted these results as indicating a redistri-

bution of the pre-existing LDs through the traf-

ficking of these organelles along the microtubule

network and towards the centrosome. However, ana-

lyses of this phenomenon by conventional or three-

dimensional TEM have shown that the aggregating

LDs are much larger than the pre-existing LDs, and

do not preferentially cluster in the centrosome area

(Depla et al., 2010). In addition, aggregated LDs

have been shown to emerge from ER membranes

rich in HCV core protein (Depla et al., 2010; Fig-

ure 2). This suggests that these aggregated LDs sur-

rounded by the HCV core protein budded from spe-

cific ER membranes enriched in HCV core protein,

consistent with the LD regression/regeneration hy-

pothesis outlined above (Figure 3). Indeed, it seems

unlikely that LDs dispersed throughout the cyto-

plasm would move specifically towards these areas

with a core-rich ER membrane. It remains unclear

as to whether the HCV core protein is actively in-

volved in lipid mobilization, membrane curvature

and LD budding, as suggested for PAT/PLIN proteins

(Wolins et al., 2006; Listenberger et al., 2007). How-

ever, the HCV core protein has been shown to displace

ADRP, like other exchangeable PAT/PLIN proteins

(Boulant et al., 2008). Although some studies have

suggested that the same LD may experience a gradual

exchange of PAT/PLIN proteins (Wolins et al., 2005),

the LD regression/regeneration hypothesis would also



Figure 3 Possible mechanisms of LD redistribution induced by the HCV core protein

LDs that have initially emerged from the ER bilayer as a lens-shape mass of neutral lipids remain attached to the ER mem-

brane to form a round structure surrounded by a phospholipid monolayer containing PAT/PLIN proteins. These LDs dispersed

throughout the cell could regress towards ER membranes and regenerate in distant-specific ER membrane domains enriched

in HCV core protein. The HCV core protein may contribute to curve the ER membrane to mediate the LD budding. The LD

regression/regeneration hypothesis provides a comprehensive model accounting for the replacement of a host cell PAT/PLIN

protein by the HCV core protein at the surface of newly synthesized LDs. The structures depicted in this model are not drawn to

scale.

provide a comprehensive model accounting for the

replacement of ADRP by the HCV core protein

in newly synthesized LDs (Figure 3). Interestingly,

LD clustering has also been observed in other cellu-

lar models, without HCV infection. In some cases,

the degree of LD clustering seemed to depend on the

metabolic state, with lipolysis counteracting cluster-

ing (Marcinkiewicz et al., 2006). In the yeast model,

the absence of seipin, an LD-associated protein, res-

ulted in LD clustering (Szymanski et al., 2007). In

contrast, overexpression of various PAT/PLIN pro-

teins may also lead to LD clustering (Targett-Adams

et al., 2003; Listenberger et al., 2007). Altogether,

these results suggest that the replacement of a given

LD-associated protein by one or other LD-associated

protein could induce this intracellular relocalization

of LDs. This reinforces the hypothesis that, follow-

ing their biogenesis, LDs remain tethered to the

ER membrane, allowing the exchange of proteins

between the LD surface to occur.

Conclusion and perspectivesIntracellular LDs have gone from being largely ig-

nored as static cytoplasmic inclusions to being act-

ively studied as dynamic organelles regulating not

only cellular lipid storage but also lipid exchange

with various organelles. However, several funda-

mental questions about the biology of LDs remain

unanswered. In particular, we still know little about

the process by which they are formed. The HCV

core protein, which seems able to induce the rapid

regression and regeneration of cytoplasmic LDs, is a

potentially valuable model for the visualization of LD

morphogenesis by correlative fluorescence/electron

microscopy during the first few minutes of LD form-

ation. We need to determine whether the regression

and regeneration of LDs that seems to be induced

by the HCV core protein is a widespread mech-

anism of LD motion also occurring in other con-

texts. It should be remembered that movies provided

as supplementary material of several published



manuscripts have shown that at least some LDs re-

mained intact throughout the period of movement

between regions of the cells (Targett-Adams et al.,

2003; Digel et al., 2010). Future investigation should

help to explain the highly regulated, integrated

and strongly compartmentalized cellular network of

metabolism, signalling and trafficking leading to LD

formation and degradation.

FundingResearch on HCV and LD interactions in our laborat-

ory was supported by grants from INSERM-DHOS

and Ligue Contre le Cancer (Comite du Loir et Cher

& Comite de l’Ille et Vilaine). M.D. was supported

by a Ph.D. fellowship provided by INSERM, Region

Centre and the Fondation pour la Recherche Medicale

(FRM). Our TEM photographs are obtained with the

assistance of the RIO EM Facility of Francois Rabelais

University.

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Received 7 October 2010/7 March 2011; accepted 9 March 2011

Published on the Internet 7 April 2011, doi:10.1042/BC20100119


Discussion

Récemment, il a été montré in vitro dans des cellules infectées par le HCV que

l’association de la protéine de capside du HCV aux GL est liée à la production de virus et à

l’accumulation des GL en zone périnucléaire (Boulant et al., 2008). Cette accumulation des

GL du cytoplasme vers les zones périnucléaires dépend du réseau de microtubules et n’est

observée qu’avec la protéine de capside mature c’est à dire après son clivage par deux

enzymes cellulaires : la SP qui libère la protéine de capside de la polyprotéine et la dirige (via

sa séquence signal) vers le RE, et la SPP qui permet à la protéine de capside de s’associer aux

GL. Les auteurs proposaient alors un modèle dans lequel la relocalisation des GL favoriserait

le contact entre la protéine de capside du virus, présente autour des GL, et l’ARN viral,

présent au niveau d’un « membranous web » périnucléaire, lors de l’assemblage viral

(Boulant et al., 2008). Cette étude suggérait que la localisation périnucléaire des GL se

formait par une simple relocalisation des GL migrant le long des microtubules et se

concentrant autour du centrosome.

Un des objectifs de nos travaux était donc d’avancer dans la compréhension des

mécanismes fondamentaux régissant la relocalisation de GL induites par la protéine de

capside. Pour étudier ce phénomène, nous disposions du modèle in vitro dérivé du SFV et

d’une méthode morphométrique originale d’analyse des GL sur coupes de microscopie

électronique déjà validés au sein du laboratoire (Ait-Goughoulte et al., 2006); (Hourioux et

al., 2007).

Dans un premier temps, il s’agissait de comparer la quantité et la localisation

subcellulaire des GL dans des cellules exprimant une protéine de capside mature ou

immature, ainsi qu’une protéine contrôle. De cette façon, nous avons montré que les protéines

de capside mature ou immature étaient toutes les deux capables d’augmenter le nombre de GL

dans les cellules par rapport à une protéine contrôle, mais que la protéine mature pouvait

amplifier ce phénomène par rapport à la protéine immature. Néanmoins, seule la protéine de

capside mature était capable d’entourer les GL et de les relocaliser en zone périnucléaire

(Depla et al., 2010). Le rôle précis de cette association reste mal connu mais la protéine de

capside semblerait agir de façon directe sur le métabolisme lipidique : durant la synthèse de

novo des lipides (Su et al., 2002); (Kim et al., 2007); (Waris et al., 2007); (Jackel-Cram et al.,

2007); (Yang et al., 2008), lors de l’élimination des acides gras (Su et al., 2002); (Dharancy et

109

al., 2005); (Tanaka et al., 2008) ou lors de la sécrétion des lipoprotéines (PERLEMUTER et

al., 2002). Nos résultats ont confirmé cette idée puisque les cellules exprimant les protéines de

capside mature ou immature induisaient une synthèse de TG plus importante que des cellules

exprimant la protéine contrôle (Depla et al., 2010). Il avait d’ailleurs été montré que les

protéines de capside mature et immature pouvaient toutes les deux réguler positivement le

promoteur du gène codant l’enzyme FAS impliquée dans la synthèse des TG (Jackel-Cram et

al., 2007).

Dans un second temps, une analyse morphologique en 3D montrait clairement que les

GL ne se regroupent pas autour des centrosomes, mais suggérait que les GL étaient localisées

au niveau des zones de la membrane du RE riches en protéine de capside (Depla et al., 2010).

Les études fondamentales sur les GL qui ont été présentées dans l’introduction de ce

manuscrit (cf paragraphe III) A. 3.) suggèrent que ces organites sont extrêmement

dynamiques, seulement les mécanismes de leur biogenèse et de leur trafic intracellulaire sont

encore mal compris. Depuis la publication de la revue de Murphy et Vance en 1999 (Murphy

& Vance, 1999), le modèle couramment exposé voudrait qu’une accumulation trop importante

de lipides que ne saurait retenir la membrane du RE entraînerait une déformation de celle-ci

aboutissant à l’émergence d’une GL. Néanmoins, à ce jour aucune technique de microscopie

ne s’est révélée adaptée ou assez résolutive pour visualiser cette suite d’événements

vraisemblablement très rapide (Kuerschner et al., 2008). De plus il n’est toujours pas connu si

la GL est capable de s’individualiser ou bien si elle reste physiquement attachée à la

membrane du RE (Zehmer et al., 2009); (Fujimoto et al., 2008). L’analyse des protéines à la

surface des GL pourrait nous permettre de réponde à cette question.

En effet, les GL, organites dits « de réserve» constituent un stock permanent d’énergie

pour les besoins cellulaires. A la surface des GL, on retrouve de façon constitutive les

protéines de la famille PAT/PLIN (Kimmel et al., 2010) qui ont chacune un rôle précis dans

le maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des GL. Ces protéines sont échangeables

à la surface des GL et leur composition varie en fonction des besoins cellulaires (Bickel et al.,

2009). Elles agiraient aussi lors de la genèse des GL en mobilisant les lipides et en favorisant

les mécanismes contribuant au bourgeonnement des GL (Wolins et al., 2006). Nos résultats

nous amènent à proposer le modèle in vitro de l’infection par le HCV et particulièrement

l’expression de la protéine de capside comme base pour étudier les mécanismes impliqués

dans la biogenèse et la croissance des GL. En effet, dans des cellules exprimant la protéine de

capside, les GL sont regroupées dans des zones de la membrane du RE riches en protéine de

110

capside. Celle-ci s’accumule à la surface des GL et peut remplacer une des protéines de la

famille PAT/PLIN : l’ADRP, à la surface des GL. Nous proposons que la protéine de capside

mature pourrait à son tour jouer un rôle équivalent à celui d’une protéine de la famille

PAT/PLIN et agir sur la morphogenèse des GL. Ainsi les GL portant à leur surface la protéine

de capside du HCV pourraient provenir et émerger des zones de la membrane du RE riches en

protéine de capside et y rester regroupées.

Dans la première partie de ce projet nous avons donc confirmé les données in vitro

publiées par notre équipe et par d’autres sur la capacité de la protéine de capside à induire une

relocalisation des GL. De plus nous avons montré que cette relocalisation était accompagnée

d’une synthèse de novo de GL puisque nous avons observé un nombre plus important de GL

dans des cellules exprimant la protéine de capside mature. Nous pensons que cette synthèse de

novo pourrait en partie s’expliquer par les propriétés de liaison de la protéine de capside

mature aux GL qui contribue ainsi à la morphogenèse des GL, et d’autre part par la capacité

de la protéine de capside mature à moduler le métabolisme lipidique comme en témoigne la

synthèse plus importante de TG dans des cellules qui expriment cette protéine. Nos

observations en microscopie électronique et en modèle 3D nous ont permis dans la seconde

partie de ce travail de suggérer que la synthèse de novo mise en évidence in vitro pouvait

avoir lieu dans des zones de la membrane du RE riches en protéine de capside mature. En

effet, il est difficile de penser qu’il y ait une simple redistribution des GL dispersées dans le

cytoplasme spécifiquement au niveau des zones de la membrane du RE riches en protéine de

capside. Un modèle où les GL seraient constamment dans des cycles de fusion/fission avec la

membrane du RE vient ainsi appuyer notre hypothèse : dans ce modèle les GL pourraient

régresser et émerger de façon dynamique ce qui permettrait d’établir des échanges constants

de lipides avec les membranes cellulaires d’autres organelles (Fujimoto et al., 2008); (Zehmer

et al., 2009). Le réseau de microtubules, comme il a déjà été suggéré (Boulant et al., 2008)

pourrait avoir un rôle crucial dans la motilité des GL et donc dans le dynamisme de ces

échanges.

Nos travaux nous ont ainsi amené à proposer un modèle (Roingeard & Depla, 2011)

où l’expression de la protéine de capside du VHC pourrait induire une régression des GL au

niveau des membranes du RE assortie d’une reformation de ces GL au niveau de domaines

membranaires du RE où la protéine de capside du HCV serait synthétisée en quantité

importante. Ce modèle de régression/régénération des GL induit par la protéine de capside

pourrait aussi expliquer dans les travaux publiés par Boulant et al, (Boulant et al., 2008)

111

comment l’ADRP à la surface des GL pourrait être remplacée, lorsque la GL régresse, par la

protéine de capside mature, lorsque la GL émerge. Cet échange d’une protéine de la famille

PAT/PLIN par une autre ou par la protéine de capside du HCV pourrait aussi

indépendamment contribuer à la relocalisation intracellulaire des GL comme il a déjà été

montré dans d’autres modèles sans qu’il y ait infection par le HCV (Marcinkiewicz, 2006);

(Targett-Adams, 2003); (Listenberger et al., 2007). Ce modèle vient appuyer ce qui avait été

proposé par Zehmer et al (Zehmer et al., 2009) qui était en faveur d’une association constante

entre les GL nouvellement formées et la membrane du RE. L’établissement d’une telle

association permettrait d’une part une rapide mobilisation des GL induite par la protéine de

capside du HCV lors de l’infection virale (régression), d’autre part un échange constant de

lipides et de protéines entre ces deux entités lors de la régénération. Dans le cas de l’infection

par le HCV, cette régénération serait accompagnée d’une synthèse de novo de TG et de GL.

112

II) Étude bio-clinique VIRO-STÉATOSE : impact de

la variabilité du virus de l’hépatite C sur la stéatose

hépatique

Article 3

Viral diversity in chronic carriers of hepatitis C virus has a

low impact on liver steatosis

Marion Depla, Louis d’Alteroche, Amélie Le Gouge, Alain Moreau, Christophe Hourioux,

Jean-Christophe Meunier, Julien Gaillard, Anne de Muret, Yannick Bacq, Farhad Kazemi,

Aurélie Avargues, Emmanuelle Roch, Eric Piver, Catherine Gaudy-Graffin, Bruno

Giraudeau, Philippe Roingeard

Soumis pour publication

Depla et al. HCV diversity and steatosis page 1

Viral diversity in chronic carriers of hepatitis C virus has

a low impact on liver steatosis

Marion Depla,1 Louis d’Alteroche,

1, 2 Amélie Le Gouge,

3Alain Moreau,

1

Christophe Hourioux,1, 4, 5

Jean-Christophe Meunier,1 Julien Gaillard,

5

Anne de Muret,6 Yannick Bacq,

2 Farhad Kazemi,

7 Aurélie Avargues,

3

Emmanuelle Roch,1 Eric Piver,

1, 8 Catherine Gaudy-Graffin,

1, 9 Bruno

Giraudeau,3 Philippe Roingeard

1, 4, 5

1INSERM U966, Université François Rabelais and CHRU de Tours, France

2Service d’Hépatogastroentérologie, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours, France

3INSERM CIC 0202, Université François Rabelais and CHRU de Tours, France

4Unité de Biologie Cellulaire, Hôpital Bretonneau, CHRU de Tours, France

5Plate-Forme des Microscopies, PPF ASB, Université François Rabelais, Tours, France

6Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours, France

7Service d’Hépatogastroentérologie, Centre Hospitalier de Blois, France

8Service de Biochmie, Hôpital Trousseau, CHRU de Tours, France

9Service de Bactériologie-Virologie, Hôpital Bretonneau, CHRU de Tours, France

Running Head: HCV diversity and steatosis

Word count : 3974

Correspondence to: Philippe Roingeard, INSERM U966, Université François Rabelais,

Faculté de Médecine, 10 boulevard Tonnellé, 37032 Tours Cedex, France.

Tel: (33) 2 34 37 96 46; Fax: (33) 2 47 47 82 07; email: [email protected]


ABSTRACT (235 words)

Background and objective: Most clinical studies suggest that the prevalence and severity of

liver steatosis are higher in patients infected with hepatitis C virus (HCV) genotype 3 than in

patients infected with other genotypes. This may reflect the diversity and intrinsic properties

specific to genotype 3 virus proteins. We analyzed the possible association of particular

residues of the HCV core and NS5A proteins known to dysregulate lipid metabolism with

severity of steatosis in the livers of patients chronically infected with HCV.

Methods: We used transmission electron microscopy to quantify liver steatosis precisely in a

group of 27 patients, 12 of whom were infected with a genotype 3 virus, the other 15 being

infected with viruses of other genotypes. We determined the area covered by lipid droplets in

their liver tissue and analyzed the diversity of the core and NS5A regions encoded by the viral

variants circulating in these patients.

Results: The area covered by lipid droplets did not differ significantly between patients

infected with viruses of genotype 3 or another genotype. The core and NS5A protein

sequences of the viral variants circulating in patients with mild or severe steatosis were evenly

distributed throughout the phylogenic trees established with all the collected sequences.

Conclusion: Individual host factors seem to play a much greater role than viral factors in the

development of severe steatosis in patients chronically infected with HCV, including those

infected with a genotype 3 virus.


SUMMARY BOX

Significance of this study

What is already known about this subject?

- HCV genotype 3 seems to induce more severe steatosis than other genotypes in vivo, but

underlying mechanisms remain unclear.

- Conflicting results have been published concerning the ability of genotype 3 core protein to

increase lipid droplet accumulation in vitro.

What are the new findings?

- There is no association between genotype 3 and steatosis frequency and intensity.

- There are no core and NS5A protein residues associated with more severe steatosis.

How might it impact on clinical practice in the foreseeable future?

- Individual host factors seem to play a greater role than viral factors in the development of

severe steatosis in HCV-infected patients, including those infected with a genotype 3 virus.

- We now need to identify these individual host factors.


INTRODUCTION

Hepatitis C virus (HCV), which infects 130 million people worldwide, is a major cause of

liver disease. The liver injury induced by HCV results in chronic hepatitis, fibrosis and,

eventually, cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC). Progression towards these end-

stage liver diseases is influenced by several cofactors including sex (progression more likely

in men), age at infection, excessive alcohol consumption, obesity and co-infection with the

hepatitis B virus (HBV) or the human immunodeficiency virus (HIV).1-4

Moreover,

retrospective studies have reported an association between the presence and severity of

steatosis in chronic HCV infection and advanced fibrosis.5-8

Steatosis is characterised by

triglyceride deposition in the liver and is probably related to host metabolic and viral factors.

The HCV core protein is known to deregulate a large number of genes involved in lipid

metabolism.9-16

In cell culture, HCV core protein associates with lipid droplets and induces

the clustering of these lipid storage organelles.17-20

This clustering of the lipid droplets, which

play an important role in the viral life cycle,18, 20

results from the de novo synthesis of lipid

droplets in infected cells, rather than the simple subcellular redistribution of these

organelles.17

The HCV NS5A protein has also recently been shown to modulate various genes

involved in lipid metabolism,21-25

and to accumulate on the surface of lipid droplets in cell

culture.21

Nonetheless, the molecular mechanisms leading to HCV-induced steatosis are not

clearly understood. The HCV RNA genome displays considerable diversity, both within and

between isolates, and three levels of classification have been adopted, grouping viral

sequences into six genotypes, several dozen subtypes and intra-isolate variants.26, 27

Several

clinical studies have demonstrated that the prevalence and severity of steatosis are higher in

patients infected with genotype 3 HCV than in patients infected with other genotypes, 1, 5, 28-32

suggesting that one or more viral proteins may play a direct role in triggering steatosis.


However, conflicting conclusions have been drawn from in vitro studies on the role of

specific residues of the HCV-genotype 3 core protein in steatosis.19, 33, 34

Nevertheless, the

method used to quantify lipid droplet accumulation differed between studies, potentially

accounting for these discrepancies. In previous investigations on cultured cells producing

various wild-type or mutated HCV core proteins, we established an original method for

quantifying steatosis by transmission electron microscopy (TEM).17, 19

We investigated the

impact of HCV diversity on the severity of steatosis, by applying this method to the analysis

of liver biopsy specimens from chronic HCV carriers with viruses of genotype 3 or other

genotypes. We aimed to quantify precisely the accumulation of lipid droplets in liver tissues.

We also determined the sequence of the core and NS5A proteins of the viruses infecting these

patients, with the aim of assessing the correlation between specific amino-acid residues and

steatosis severity.

METHODS

Patients

HCV-infected patients were recruited from two hospitals in the Loire Valley (Tours, Blois) on

the basis of the following criteria: (i) known chronic HCV infection; (ii) never treated or with

antiviral treatment failure resulting in no further treatment for at least 11 months; (iii) known

genotype of the infecting virus, previously evaluated with the VERSANT HCV Genotype

Assay (LiPA, Bayer); (iv) age between 18 and 75 years; (v) need for histological monitoring

of the liver, justifying liver biopsy. We excluded patients with metabolic causes of steatosis,

by applying the following exclusion criteria: (i) presence of a metabolic syndrome,

characterised by a waist ≥ 94 cm (male)/≥ 80 cm (female), and at least two of the following

criteria: triglycerides >1.7 mmol/l or treated for hypertriglyceridaemia, HDL-cholesterol


<1.03 mmol/l (male)/ <1.29 mmol/l (female), systolic blood pressure ≥ 130 mmHg/diastolic

blood pressure ≥ 85 mmHg or treated arterial hypertension, sugar concentration in a fasting

blood sample ≥ 5.6mmol/l or treated diabetes; (ii) suspected associated hepatic disease

(Wilson’s diseases, alpha1-antitrypsin deficiency, haemochromatosis, autoimmune hepatitis);

(iii) alcohol consumption > 2 glasses / day in the three months preceding liver biopsy; (iv)

HIV or HBV coinfection; (v) “by pass” gastrointestinal gastroplasty, parenteral nutrition,

extensive resection of the small intestine, intestinal bacterial overgrowth; (vi) drug treatment

potentially inducing or interfering with liver steatosis.

Twenty-seven patients were included in this study: 12 patients infected with HCV

genotype 3 and 15 patients infected with HCV of another genotype (14 genotype 1 and 1

genotype 5). Serum viral load (IU/ml) was determined, and other blood tests, including

ALAT, ASAT, �GT and alkaline phosphatase concentration (IU/l) determinations, were also

carried out at the time of liver biopsy.

The study was approved by the local institutional review board and all patients

provided written informed consent.

Steatosis quantification in liver biopsy specimens

Liver biopsies were examined blind to patient information by a pathologist (A.d.M), for

routine histological diagnosis. To this end, a slice of at least 15 mm of each liver biopsy

specimen was fixed in formalin and embedded in paraffin. Sections were cut and stained with

haematoxylin-eosin-safran. Fibrosis and activity were graded on the basis of METAVIR

scores. For comparison with TEM results, steatosis was also routinely graded as grade 0 (0%

hepatocytes with fat), grade 1 (<20% hepatocytes with fat), grade 2 (20-50% hepatocytes with

fat), grade 3 (>50% hepatocytes with fat).


The remainder of each liver biopsy specimen (at least 5 mm) was fixed by incubation

for 48 h in 4% paraformaldehyde and 1% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2),

and post-fixed by incubation for 1 h with 2% osmium tetroxide, for steatosis quantification by

TEM. Samples were dehydrated in a graded series of ethanol solutions, cleared in propylene

oxide and embedded in Epon resin, which was allowed to polymerise for 48 h at 60°C.

Ultrathin sections (70 nm) were cut with a Reichert ultramicrotome (Heidelberg, Germany),

stained with 5 % uranyl acetate 5 % lead citrate, and placed on EM grids. The sections were

then observed with a Jeol 1230 transmission electron microscope (Tokyo, Japan) connected to

a Gatan digital camera driven by Digital Micrograph software (Gatan, Pleasanton, CA), for

image acquisition and analysis. Lipid droplets in these liver biopsy specimens were quantified

with a modified version of a method originally developed for their quantification in cultured

cells.19

Slides were analysed blind to information about the patient. Lipid droplets diameter

was determined on the computer screen for five consecutive squares (5000 µm2 each) of two

independent TEM grids (representing the analysis of 10 different areas of 5000 µm2 of hepatic

tissue, for each biopsy). Lipid droplet diameter was then converted into a disk area in µm2.

The areas covered by the lipid droplets partially superimposed by a TEM grid bar were

specifically determined with the Image J program (National Institute of Health, USA). By

summing these areas, we were able to determine the cumulative lipid droplet area in µm2 per

TEM grid square. For each biopsy, we summed the areas in the 10 squares analyzed.

Statistical analysis of the cumulative lipid droplet areas determined by TEM

Samples from the patients were classified as infected with a genotype 3 virus or with a virus

of another genotype (3 or non-3). The differences between these groups were assessed with

Fisher’s exact tests for qualitative variables and Wilcoxon tests for quantitative variables.

Cumulative lipid droplet areas were compared between the two groups, in a non-parametric


Wilcoxon test. The correlation between the results obtained by TEM and classification by the

pathologist during routine histopathological diagnosis was assessed by calculating

Spearman’s rank correlation coefficient with a 95% confidence interval. Data were analysed

with SAS 9.2 and R software.�

RNA extraction, cDNA synthesis and amplification

RNA was extracted from 140 µl of serum with the QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) and

stored at -80°C until processing. For the amplification of core and NS5A coding regions, RT-

PCR was performed for 50 min with the Superscript III First Strand Synthesis System

(Invitrogen), using 8 µl of the extracted RNA and 2 µM custom primers designed based on

information in the HCV sequence database of the Los Alamos National Laboratory

(http://hcv.lanl.gov). Amplification was performed with the Platinium PCR Supermix High

Fidelity DNA polymerase (Invitrogen) by simple PCR (core region) or nested PCR (NS5A

region), with the custom primers and hybridisation temperatures reported in Table 1.

Cloning and sequence analysis

PCR products were purified according the manufacturer’s instructions (Wizard SV Gel and

PCR Clean-Up System, Promega) and inserted into the pGEMT vector (Promega). We

selected about 20 colonies after the transformation of chemically competent E. coli bacteria.

Plasmid DNA was isolated with the Nucleospin Plasmid DNA kit (Macherey Nagel) and

screened by restriction digestion. Five to 18 clones per patient were generated for each region

(mean : 9 for the core region and 13 for the NS5A region). Core and NS5A quasispecies

variant sequences were determined with the BigDye Terminator® v3.1 Cycle Sequencing kit

(Applied Biosystems), on an ABI PRISM 3100 machine (Applied Biosystems). BioEdit was

used for the comparison of amino-acid sequences.


Phylogenetic analysis

Phylogenetic and molecular evolutionary analyses were conducted with MEGA (Molecular

Evolutionary Genetics Analysis) 5 software.35

Analysis was based on the maximum

likelihood method. Using the substitution rate for each amino-acid over time, as described by

Jones, Taylor and Thornton (1992), we estimated the likelihood (bootstrap value > 75%) of

the position and length of the branches of the tree. An evolutionary distance of 0.01

corresponded to 10 mutations per 1000 residues. We carried out a phylogenetic analysis of the

NS5A region to confirm genotype identification by the VERSANT HCV Genotype Assay

(see above).

RESULTS

General characteristics of the patients at the time of liver biopsy

Patients were assigned to one of two groups on the basis of viral genotype (3 or non-3). The

patients infected with HCV genotype 3 did not differ from those infected with HCV of other

genotypes in terms of sex ratio, age, BMI, duration of infection, source of infection, alcohol

intake, ALAT, ASAT and alkaline phosphatase concentrations, glycaemia, viral load or

METAVIR score (Table 2). However, patients infected with a genotype 3 virus had lower

serum cholesterol, TG and �GT concentrations than patients infected with viruses of other

genotypes (Table 2). The difference in serum cholesterol concentrations between patients

infected with genotype 3 viruses and those infected with viruses of other genotypes has

already been described,1, 36-37

but the impact of HCV genotype on TG level remains unclear.

38, 39


Steatosis quantification by TEM and analysis

The area covered by lipid droplets in 10 different areas of 5000 µm2 of hepatic tissue (50,000

µm2 in total) was determined by TEM for each liver biopsy specimen. Figure 1 shows lipid

droplets on ultrathin sections from the liver biopsy specimens of three different patients with

representative profiles. A box plot was generated for the analysis of these cumulative lipid

droplet areas as a function of viral genotype (Figure 2). We found no significant difference in

median cumulative droplet area between the two groups (see the horizontal dark line in each

box): 5461.1[2165.2; 10027.9] for the genotype 3 group, versus 3538.7[2184.6; 4984.4] for

the genotype non 3 group (p=0.581). However, the cumulative lipid droplet areas of the

patients infected with genotype 3 viruses were much more variable than those of patients

infected with viruses of other genotypes (Figure 2).

The quantification of lipid droplets by TEM was compared with the results of steatosis

assessment during routine histopathological analysis of the liver biopsy specimen. With a

Spearman’s rank correlation coefficient of 0.87 [0.73; 0.94], the histopathological grade of

steatosis was strongly correlated with the cumulative lipid droplet area obtained by TEM. The

slight differences observed were accounted for by the detection, by TEM, of the accumulation

of small lipid droplets (microsteatosis) in some patients considered not to have steatosis in

routine histopathological assessments (data not shown).

Analysis of the HCV core and NS5A protein sequences as a function of steatosis severity

We investigated the involvement of HCV core and NS5A protein residues in steatosis

severity, in an analysis on a restricted number of patients: those with severe liver steatosis,

with a lipid droplet area of more than 10,000 µm2 on TEM (6 patients: 3 infected with a

genotype 3 virus, 2 infected with a genotype 1 virus and 1 infected with a genotype 5 virus);

and those with very little or no steatosis, characterised by a lipid droplet area of less than


1,000µm2 on TEM (5 patients: 3 infected with a genotype 1 virus and 2 infected with a

genotype 3 virus).

For the entire core region, we observed no association of particular amino-acid

residues or motifs with severe steatosis. For example, Figure 3 shows the alignment of the

HCV core protein domains 2 (D2) and 3 (D3) of the consensus sequence determined for the

11 patients. HCV core protein D2 (residues 119-173) and D3 (residues 174-191) are known to

be important for the association of the protein with the surface of the lipid droplet, and some

key residues have been shown, in vitro, to increase lipid droplet accumulation in cultured

cells.19, 34

Residues highly specific for genotype 3 strains, such as the phenylalanine residue in

position 164, were found in all genotype 3 viruses, but the presence of this particular residue

was not associated with steatosis severity (Figure 3), despite the demonstration of

involvement in steatosis for this residue in vitro.19

Similarly, the 182LI186 and 182FV186

motifs, which have also been shown to be associated with higher levels of lipid droplet

accumulation in in vitro models,34

were not associated with severe steatosis in our patients

(Figure 3).

We established a phylogenetic tree with the core protein sequences of all variants

found in the 11 patients. The sequences clustered according to genotype (Figure 4A), with one

group for the genotype 1 sequences (14 patients), one group for the genotype 3 sequences (12

patients) and an isolated sequence for genotype 5 (1 patient). Due to the high degree of core

sequence conservation within the various genotypes, clones from the same patient did not

necessarily cluster, instead mixing with those from other patients. Thus, clusters were found

for only seven patients, for whom diversity within the various clones is indicated by the

triangle at the top of the branch. Patients with little or no (green) and severe (red) steatosis

were evenly distributed over this phylogenic tree, with no particular branch of the phylogenic

tree associated with severe steatosis.


For the NS5A region, the alignment of consensus sequences from the 11 patients

showed that no particular amino acid or motif was associated with severe steatosis (data not

shown). We then constructed phylogenetic trees with the sequences of all the variants found

in these patients. As for the core protein, the distribution of the variants between the three

groups depended on genotype (Figure 4B). NS5A protein sequences were highly

heterogeneous and we were therefore able to evaluate diversity for each patient (triangles at

the end of each branch). However, patients with little or no steatosis (green) and those with

severe (red) steatosis were again even distributed over the phylogenic tree, indicating a lack of

association between any particular branch of the phylogenic tree and severe steatosis.

DISCUSSION

The mechanisms leading to liver steatosis in chronic hepatitis C are difficult to decipher,

probably due to the existence of two different entities: (i) steatosis with common causes, such

as obesity, diabetes mellitus or alcohol intake, (ii) steatosis without known risk factors,

presumably at least partly related to the viral infection.40

Steatosis seems to be mostly (but

probably not exclusively) virus-induced in infections with genotype 3 viruses, whereas it is

principally associated with host factors in infections with viruses of other genotypes. We

designed this study to investigate this question with a small number of patients, due to

restrictive criteria of inclusion, but with precise quantification of lipid droplet accumulation

in the liver tissue of patients infected with viruses of genotype 3 and viruses of other

genotypes. In tissue fixed with formalin and embedded in paraffin for sectioning for routine

histological diagnosis, the lipid droplets fuse and seem to form holes, deformed to various

extents, in tissue sections.41

Steatosis is evaluated by determining the percentage of

hepatocytes presenting this pattern. This routine evaluation of steatosis was performed in our

study, but we set up, in parallel, an original method for determining, by TEM, the cumulative


area covered by lipid droplets in liver biopsy specimens from our patients. The main

advantage of TEM was that it enabled us to detect the accumulation of small lipid droplets

(microsteatosis) in some patients considered not to have steatosis in routine histopathological

diagnosis. However, overall, there was a good correlation between the results obtained with

the two approaches. Using this original technique, we were able to show that the cumulative

area covered by lipid droplets in the livers of patients infected with viruses of genotype 3 did

not differ significantly from that in the livers of patients infected with viruses of other

genotypes. These results differ from those of many other studies showing that infection with

genotype 3 viruses is more frequently associated with severe steatosis,1, 5, 28-32

but are

consistent with several studies showing that this link is not statistically significant.32, 36

Serum

cholesterol concentration was lower in patients infected with genotype 3 viruses than in

patients infected with viruses of other genotypes, as reported in other studies,1, 31, 36, 37

and this

was not due to differences in the demographic profiles of the patients. Lower serum

cholesterol concentrations have been found in patients infected with various HCV genotypes,

probably due to a global deficit in lipid and lipoprotein metabolism induced by HCV that

might be exacerbated in patients infected with genotype 3 viruses.42

However, this lower

serum cholesterol concentration in patients infected with genotype 3 viruses was not

correlated with more severe steatosis in our study.

The mechanisms by which viral proteins affect the development of genotype-3-

specific steatosis remain hypothetical. The HCV core protein accumulates at the surface of

lipid droplets in vitro and in vivo,43, 44

and has been shown to induce steatosis in the livers of

transgenic mice,45-47

and to deregulate a large number of genes involved in lipid metabolism.

9-16 This protein has therefore been the main focus of interest of many investigators. Several

in vitro studies have shown that the core protein from genotype 3 strains interacts specifically

with lipid metabolism. Early experiments based on the production of HCV core proteins from


viruses of different genotypes showed that all core proteins induced triglyceride

accumulation, but that the genotype 3 core protein enhanced this phenomenon.48

In particular,

it strongly induced fatty acid synthase (FAS), an enzyme required for intracellular triglyceride

production, in a sterol response element binding protein 1 (SREBP1)–dependent manner.15

HCV core protein has been shown to induce the cleavage of sterol regulatory element binding

proteins and their phosphorylation, by triggering oxidative stress, leading to fatty acid

synthesis, and this phenomenon is genotype-dependent.14

It has recently been demonstrated

that the phosphatase and tensin homologue (PTEN) is downregulated by a genotype 3 core

protein, via a mechanism involving a microRNA-dependent blockade of PTEN mRNA

translation, whereas a genotype 1 core protein has no effect.49

The functional differences

between genotype 1 and 3 core proteins are probably related to differences in amino-acid

sequences, although these sequences are very similar. However, single amino-acid differences

between these proteins may modulate local folds, stability and interactions with host cell

proteins. Domain 2 of the core protein (amino acids 119-173) has been implicated in lipid

droplet association.18,50-53

Within this domain, the Y164F mutation of a genotype 1 core

protein, resulting in the incorporation of a residue highly specific for genotype 3 strains, has

been shown to increase lipid droplet accumulation in vitro, in cellular models.19

This

particular mutant has also been implicated in the stronger FAS activation observed with the

genotype 3 core protein than with the genotype 1 core protein.15

One group has also reported

a possible link between the polymorphism in domain 3 (amino acids 174-191) of the genotype

3 core protein and steatosis.34, 54

The FV or LI combination of residues at positions 182 and

186 in viral sequences (as opposed to FI) was found to be associated with the presence of

severe intrahepatic steatosis in patients. The in vitro production of core proteins with these

steatosis-associated polymorphisms increased intracellular lipid levels over those obtained

with non steatosis-associated core isolates.34, 54

However, the presence of these particular


residues was not correlated with severe steatosis in our patients. We identified no particular

amino-acid residues or motifs within the entire core sequences that could be considered to be

associated with severe steatosis. Furthermore, careful analysis of all collected core sequences

in a phylogenic tree showed an absence of correlation between a particular branch and the

steatosis status of the patients. These results are consistent with those of Piodi et al.33

, who

found no difference between the genes encoding the core proteins of genotype 3 viruses

between patients with and without steatosis. However, as Piodi et al. showed that the HCV

core protein of genotype 3 strains was able to induce the formation of larger lipid droplets in

vitro than genotype 1,33

we also analysed individual lipid droplet diameter and surface on

liver biopsy specimens. Again, we found no significant difference between genotype 3 and the

other genotypes (p=0.92; data not shown).

It has recently been shown that the HCV NS5A protein co-localises with the core

protein on lipid droplets55, 56

and interacts with apolipoprotein (Apo) A1, ApoB and ApoE21,

22, 25 and with peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ).

24 Furthermore, the NS5A

protein has recently been shown to induce steatosis in a transgenic mouse model.23

We

therefore analyzed the NS5A sequences of the multiple variants circulating in our patients.

The considerable variability of the NS5A region complicated the analysis of sequence

alignment (data not shown). However, we found no amino-acid differences between patients

with little or no steatosis and those with severe steatosis. Finally, an analysis of all the

collected N5A sequences in a phylogenic tree showed no correlation between any particular

branch and the steatosis status of the patients.

Overall, our study shows that core and NS5A protein variability in HCV genotypes

and strains has little effect on the severity of steatosis in chronic HCV carriers. In particular,

the effects of the genotype 3 core protein identified in experiments carried out in vitro15, 19, 34,

48, 49, 54 seem to be much milder in vivo, in conditions in which host factors may have a much


stronger effect on the severity of steatosis. This is consistent with the lack of a direct

relationship in vivo between steatosis and the presence of HCV proteins within steatotic

hepatocytes.36

Furthermore, the specific induction of higher SREBP1 levels by a genotype 3

core protein in vitro15

was not confirmed in a recent analysis of gene expression in the livers

of human patients infected with HCV of various genotypes.57, 58

Our study is consistent with

the findings of Piodi et al.,33

suggesting that in patients infected with a genotype 3 virus

individual host factors play a greater role in the development of liver steatosis than viral

factors, contrary to the conclusions of most of the clinical studies that have previously

addressed this question. Interestingly, a body of new data has emerged, suggesting that the

polymorphism of various genes, including PPARγ, IL-28B, adiponutrin and microsomal

triglyceride transfer protein (MTP), may influence the development of more severe steatosis

in chronic carriers of HCV.59-63

We may also hypothesise that an indirect factor, such as

alcohol consumption, which some patients might find it difficult to acknowledge, has

contributed in previous studies for a difference between patients infected with genotype 3

viruses and with viruses of other genotypes. Indeed, epidemiological studies in Western

Europe, including France in particular, have shown that alcohol abuse is frequently observed

in patients with a history of intravenous drug use (IVDU)64, 65

and that genotype 3 infection is

frequently found in patients with a history of IVDU.66

In conclusion, our study suggests that individual host factors seem to play a greater

role than viral factors in the development of severe steatosis in patients chronically infected

with HCV, including those infected with genotype 3 viruses.


Acknowledgement We thank Fabienne Arcanger, Julie Léger, Marie-Paule Regner and

Juliette Rousseau for technical assistance. We thank Frédéric Dubois, Nathalie Juteau and

Pierre-Ivan Raynal for helpful discussions and feedback on this work. Our data were obtained

with the assistance of the RIO Electron Microscopy Facility of François Rabelais University.

Funding This work was supported by grants from INSERM-DHOS « Recherche

Translationnelle : Virostéatose » and by the Ligue Contre le Cancer (Loir et Cher and Ile et

Vilaine). M.D. was supported by a fellowship from INSERM-Région Centre and the

Fondation pour la Recherche Médicale.

Competing interest None.

Ethics approval This study was conducted with the approval of the Institutional Review

Board of the Tours University Hospital (CPP), France.


Table 1 Sequences of the primers used and conditions for RT-PCR amplification of the

core and NS5A protein-coding regions

_____________________________________________________________________

Primer Sequence

CORE sense 5' CGG ATC CCT TGT GGT ACT GCC TGA TAG GG 3'

CORE Gen 1 antisense 5' GGG ATC CTT AGB GAC CAG TTC ATC ATC ATA TCC CA 3'

CORE Gen 3 antisense 5' AGG ATC CTT ACC AAT TCA TCA TCA TAT CCC AAG C 3'

NS5A Gen 1 out sense 5' CAG TGG ATG AAC CGG CTR ATA 3'

NS5A Gen 1 out antisense 5' TGT GGT GAC GTA GCA ACG AGT TGC T 3'

NS5A Gen 1 in sense 5' TCC GGT TCC TGG CTA AGR GA 3'

NS5A Gen 1 in antisense 5' CAG GAG TAA GAC ATT GAG CAG CAC 3'

NS5A Gen 3 out sense 5' CAC TAT GTT CCC GAG AGC G 3'

NS5A Gen 3 out antisense 5' CGA AGG TAA CCT TCT TCT GAC G 3'

NS5A Gen 3 in sense 5' GCG GTT ACA CCA GTG GAT CAA TG 3'

NS5A Gen 3 in antisense 5' GTG TTA TCA TGG CGC CCG TCC 3'

NS5A Gen 5 out sense 5' CAC TAC GTG CCC GAG ACG GAC GC 3'

NS5A Gen 5 out antisense 5' CAA AAG TGA CCT TTT TCT GCC T 3'

NS5A Gen 5 in sense 5' GAG GCT CCA CAC GTG GAT CGG TG 3'

NS5A Gen 5 in antisense 5' GGG TGA TGA GCG CCC CCG TCC 3'

___________________________________________________________________________

PCR first round

primers

T°C

hybridisation

PCR second round

primers

T°C

hybridisation

CORE sense none CORE Genotype 1/5

CORE Gen 1 antisense 55

none none

CORE sense none CORE Genotype 3

CORE Gen 3 antisense 55

none none

NS5A Gen 1 out sense NS5A Gen 1 in sense NS5A Genotype 1

NS5A Gen 1 out antisense 49 or 55

NS5A Gen 1 in antisense 49 or 55


NS5A Gen 3 out antisense 57

NS5A Gen 3 in antisense 59


NS5A Gen 5 out antisense 46

NS5A Gen 5 in antisense 57


Table 2 Demographic, biochemical and histopathological characteristics of the patients

___________________________________________________________________________

Genotype 3 Genotype non 3 p-value

n=12 n=15

Male (%) 8 (66.7) 8 (53.3) NS

Age (median) 49.0 [47.0; 50.5] 51.0 [48.0; 61.0] NS

BMI (median) 22.9 [21.2; 24.8] 24.7 [21.4; 26.1] NS

Duration of infection (median) 28.5 [20.5; 31.5]a 29.0 [24.0; 31.0]

b NS

Source of infection (%) NS

Drug addiction 6 (50.0) 5 (33.3)

Transfusion 2 (16.7) 6 (40.0)

Other 2 (16.7) 2 (13.3)

Unknown 2 (16.7) 2 (13.3)

Alcohol intake (%) NS

0 glass/day 10 (83.3) 11 (73.3)

1-2 glass/day 2 (16.7) 4 (26.6)

Biochemical data (median)

ALAT (IU/l) 120.0 [49.5; 144.5] 79.0 [54.0; 111.0] NS

ASAT (IU/l) 71.0 [40.5; 92.5] 54.0 [40.0; 94.0] NS

GGT (IU/l) 71.5 [43.0; 103.5] 130.0 [99.0; 233.0] 0.012

Alkaline phosphatase 69.5 [61.0; 95.5] 81.0 [64.0; 108.0] NS

Total cholesterol (mmol/l) 3.9 [3.3; 4.0] 4.8 [4.4; 5.7] 0.0002

Glycaemia (mmol/l) 5.0 [4.7; 5.6] 5.4 [4.8; 5.8] NS

Triglyceridaemia (mmol/l) 0.74 [0.62; 1.13] 1.36 [1.14; 1.67] 0.004

Viral load (log) 6.1 [5.8; 6.5] 6.2 [5.8; 6.6] NS

METAVIR Score (%) NS

A1F1 3 (25.0) 3 (20.0)

A1F2 1 (8.3) 1 (6.7)

A1F4 1 (8.3) 0 (0.0)

A2F1 2 (16.7) 3 (20.0)

A2F2 1 (8.3) 3 (20.0)

A2F3 3 (25.0) 3 (20.0)

A2F4 0 (0.0) 2 (13.3)

A3F4 1 (8.3) 0 (0.0)

__________________________________________________________________________aData missing for 4 patients

bData missing for 2 patients


Figure Legends

Figure 1. TEM observation of representative liver biopsy specimens from three patients

chronically infected with HCV. The liver in A shows a small number of small lipid droplets

(arrows) and was found to have a lipid droplet area < 1000 µm2

per 50,000 µm2

of tissue. The

liver in B has extremely large lipid droplets (LD) and was found to have a lipid droplet area >

10,000 µm2

per 50,000 µm2

of tissue. The TEM photograph in C shows a high magnification

of an individual hepatocyte with several large lipid droplets (LD), taken from a liver biopsy

specimen considered intermediate to the other two in terms of steatosis severity. Scale bars:

20 µm in A and B; 2 µm in C.

Figure 2. Comparative analysis of the cumulative lipid droplet areas determined by TEM on

liver biopsy specimens from patients infected with genotype 3 viruses and viruses of other

genotypes, in µm2. Cumulative lipid droplet areas were summed for all patients with genotype

3 infection (left boxplot) and for patients infected with viruses of other genotypes (right

boxplot). Boxplots show the median lipid droplet area (horizontal black line), the 25th

and the

75th

percentile. Dot plots indicate the extreme values of cumulative lipid droplet area. There

was no significant difference between the two groups (5461.1[2165.2; 10027.9] for the

genotype 3 group versus 3538.7[2184.6; 4984.4] for the non-3 group, p=0.581).

Figure 3. Alignment of amino acids 119-191 of the core protein consensus sequences from 5

patients with little or no steatosis (in green) and 6 patients with severe steatosis (in red). The 5

patients in with little or no steatosis had a lipid droplet area < 1000 µm2

per 50,000 µm2

of

liver tissue. The 6 patients with severe steatosis had a lipid droplet area > 10,000 µm2

per


50,000 µm2

of tissue. Patients infected with genotype 3 strains are indicated with an asterisk

(*) and such patients are present in both groups. The residues at each position are indicated

with the single-letter amino-acid code. Amino acids identical to the first sequence are

indicated by a dot. The positions of the residues shown in previous studies to increase lipid

droplet accumulation in vitro, in cultured cells, are indicated in red. No association was found

between a particular amino-acid residue or motif and the presence of severe steatosis.

Figure 4. Phylogenic trees for the core (A) and NS5A (B) protein sequences of all variants

identified in the 27 patients included in the study. The 5 patients in green had a lipid droplet

area < 1000 µm2

per 50,000 µm2

of liver tissue. The 6 patients in red had a lipid droplet area

> 10,000 µm2

per 50,000 µm2

of tissue. The remaining 16 patients, with steatosis of

intermediate severity, are shown in black. Diversity in individual patients is represented by a

triangle at the top of the branches, with the magnitude of the diversity observed increasing

with the area of the triange. Bootstrap values exceeding 75% are shown (numbers in dark

blue). Scale bars indicate evolutionary distance (0.01 indicates 10 mutations for every 1000

residues). Patients are grouped according to viral genotype. Patients with little or no stenosis

(green) and those with severe (red) steatosis are evenly distributed over these phylogenic

trees, with no particular branch displaying an association with severe steatosis.


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20µm 20µm

A B

C

LD

LD

Fig

ure

1

Cumulative lipid droplet area per patient

Gen

oty

pe

Fig

ure

2

120 130 140 150 160 170 180 190

....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.

P01 VGKVIDTLTCGLADLMGYIPFVGAPLGGVARALAHGVRVVEDGVNYATGNLPGCSFSIFLLALLSCLTIPASA

P06 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IH..AS

P13 L..........F........L.......A..........L.................V..........V....

P16 L..........F........L.......A..........L............................V....

P23 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IN..AS

P12 L...................L.......A..........L.................................

P14 L..........F........L..G.V.............L...................I........V....

P17 L..........F........L.......A..........L............................V....

P20 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IH..AS

P24 L..........F........L....V............AL...I.F.................F...IH..AS

P26 L..........F........L....V............AL...I.F.....................IN..AS

*

*

*

*

*

Fig

ure

3

P01

99

80

90

9286

84

92

92

89

P0378

858686

86

P06

86

91

P26

94 P2586

85

86

8299

P14

98

89

0.01

Core

Genotype 1

P01

P02

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P04

P05

P07

P08

P11

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Genotype 3

P06

P09

P10

P19

P20

P21

P22

P23

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P25

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P27

Genotype 5

Figure 4A

NS5A

93

92

819582 86 1

00

100

10

0

100

99

100

100

88

95

100

85

10

0

99

959

3

9092

98100

100

100

0.01

0.01

P03

P14

P12P01

Genotype 1

Genotype 3

Genotype 5

P1593

P16

92

P11

81

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95

P0282

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P13100

100

95

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P22

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P27

P09

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90

P2592

P21

P23 98

P10

100

P24

100

100

P27

0.01

Figure 4B

Discussion

La stéatose hépatique est consécutive à une accumulation excessive et anormale de

lipides dans le foie. Elle peut avoir différentes origines liées à des problèmes

comportementaux (obésité, alcoolisme) ; des maladies relatives à des troubles du métabolisme

ou des infection virales comme c’est le cas lors de l’infection chronique par le virus de

l’hépatite C. On distingue ainsi la stéatose d’origine métabolique et la stéatose sans facteurs

de risque connus, probablement d’origine virale (Asselah, 2006). Cependant, au cours de

l’infection par le HCV, il est difficile de mettre en évidence de façon tranchée si les

mécanismes sous jacents au développement de la stéatose hépatique impliquent des troubles

métaboliques ou sont dus à la seule infection virale. La plupart des études menées à ce jour

ont établi que la stéatose est principalement, mais pas exclusivement, induite par le virus lors

d’infections par un génotype 3; alors qu’elle serait associée aux facteurs liés à l’hôte dans le

cas d’infections par d’autres génotypes du HCV.

L’intérêt de l’étude bio-clinique que nous proposions était donc d’essayer de

discriminer réellement la part imputable au virus dans la survenue d’une stéatose sur une

cohorte restreinte de patients infectés par un génotype 3 versus d’autres génotypes que nous

avions sélectionné selon des critères précis pour se soustraire au mieux de toute stéatose

métabolique.

Nous avons mis au point une technique en microscopie électronique à transmission

(MET) qui nous a permis tout d’abord de quantifier finement la stéatose sur des coupes

ultrafines de biopsies de patients, en parallèle de la graduation classique établie par

l’anatomopathologiste en microscopie optique sur des coupes fines de ces mêmes biopsies. La

quantification de la stéatose en MET a pour avantage de chiffrer précisément (µm2) la surface

occupée par les GL sur une surface donnée de tissu, alors que la graduation classique évalue

un pourcentage d’hépatocytes atteints qui présentent de la stéatose macro et/ou

microvésiculaire. Même si l’analyse quantitative en MET se fait sur une zone plus restreinte

de tissu hépatique par rapport à l’évaluation classique, elle est plus résolutive et peut détecter

de très petites GL (micro-stéatose) chez des patients pour lesquels le diagnostic

anatomopathologique aurait conclu à une absence de stéatose. Néanmoins la zone de tissu

étudiée n’est pas toujours représentative de la biopsie réalisée et peut varier d’une coupe à

l’autre. Ceci pourrait aussi expliquer les disparités entre l’analyse anatomopathologique et la

quantification en MET tout comme les méthodes de préparation et de fixation des coupes de

149

biopsies qui diffèrent d’une technique à l’autre. Ainsi, les préparations pour l’observation en

MET permettent de mieux conserver l’ultrastructure et le corps lipidique des GL que la

méthode employée durant la graduation par l’anatomopathologiste qui a tendance à ne laisser

qu’un espace vide et déformé à la place du corps lipidique (Fujimoto et al., 2008). Lors de

l’analyse de biopsies de foies présentant de la stéatose avec des GL de taille importante nous

avons constaté une des limites de la technique en MET. Effectivement une forte proportion

des GL était coupée par les bords du carreau de grille d’observation rendant leur surface

difficile à évaluer par la technique que nous avions mise au point. Ainsi la surface occupée

par ces GL a été mesurée grâce au logiciel Image J qui nous permet de délimiter précisément

les limites de la surface à évaluer. Malgré les contraintes liées aux deux techniques, nous

avons obtenu une corrélation forte entre l’évaluation classique et la quantification en MET

(coefficient de corrélation : 0,87 [0,73 ; 0,94]). Ceci nous a permis de montrer que la surface

cumulée occupée par les GL au sein du tissu hépatique des patients infectés par un génotype 3

n’était pas significativement différente de celle des patients infectés par d’autres génotypes

(non 3). Ces résultats vont à l’encontre de ce qui est couramment admis et de nombreuses

études montrant que l’infection par un génotype 3 était plus souvent associée à la survenue

d’une stéatose sévère (Mihm et al., 1997); (Rubbia-Brandt et al., 2000); (Rubbia-Brandt et

al., 2001); (Hofer et al., 2002); (Adinolfi et al., 2001); (Poynard et al., 2003) mais va dans le

sens de quelques études montrant que la sévérité de la stéatose n’était pas sytématiquement

associée à l’infection par le génotype 3 (Kumar et al., 2002); (Grassi et al., 2005). Nous avons

aussi cherché à déterminer si il y avait une différence dans les données démographiques,

cliniques et histopathologiques (autres que la stéatose) entre les patients de génotype 3 et ceux

d’autres génotypes. Ainsi nous avons constaté que les patients infectés par un génotype 3

avaient des concentrations sériques en cholestérol plus faibles que les patients infectés par

d’autres génotypes comme il avait déjà été rapporté par d’autres (Poynard et al., 2003);

(Hofer et al., 2002); (Grassi et al., 2005); (Siagris et al., 2006), et que ceci n’était pas dû à des

différences démographiques entre les patients. La baisse des concentrations sériques en

cholestérol est connue lors d’infections par le génotype 3 et par d’autres génotypes du HCV et

serait probablement due à un défaut du métabolisme des lipides et/ou des lipoprotéines. De

plus, cette diminution pourrait être amplifiée dans le cas d’infections par un génotype 3 (Piver

et al., 2010). Néanmoins, dans notre étude la baisse de concentration en cholestérol observée

chez les patients de génotype 3 ne semble pas être associée à une sévérité particulière de la

stéatose chez ces mêmes patients.

150

Si il est admis que la stéatose peut avoir une origine en partie virale, les mécanismes

sous jacents et notamment le rôle que joueraient les différentes protéines virales dans

l’établissement de la stéatose reste mal compris. Le HCV peut influencer et détouner le

métabolisme lipidique à son profit. La protéine de capside du HCV est une des mieux

caractérisée quant à son influence sur ce métabolisme. En effet il a été montré qu’elle

s’accumulait à la surface des GL in vitro et in vivo (Barba et al., 1997); (Poynard et al.,

2003); (Qiang et al., 2009), qu’elle était capable à elle seule d’induire une stéatose dans des

modèles de souris transgéniques (Moriya et al., 1997b); (Moriya et al., 1998); (Lerat et al.,

2002) et qu’elle dérégulait plusieurs gènes impliqués dans le métabolisme lipidique (Su et al.,

2002); (Tsutsumi et al., 2002); (Dharancy et al., 2005); (De Gottardi et al., 2006); (Kim et al.,

2007); (Waris et al., 2007); (Jackel-Cram et al., 2007); (Moriishi et al., 2007). Compte tenu

de l’ensemble de ces données, de nombreuses études se sont penchées sur le rôle de la

protéine de capside dans l’établissement de la stéatose. Ainsi il a été montré que la protéine de

capside de génotype 3 était capable d’interagir spécifiquement avec le métabolisme lipidique

à différents niveaux, lors de la synthèse de novo des TG ou lors de la dégradation des acides

gras.

Les protéines de capside des différents génotypes du HCV sont toutes capables d’induire in

vitro une accumulation de TG mais la protéine de capside de génotype 3 semble potentialiser

ce phénomène (Abid et al., 2005). Effectivement, elle pourrait d’une part activer le facteur

SREBP-1 qui va à son tour réguler la transcription de l’enzyme FAS impliquée dans la

synthèse de novo des TG (Jackel-Cram et al., 2007). D’autre part, elle pourrait générer un

stress oxydatif qui serait à l’origine de l’activation des SREBP qui moduleraient en retour la

voie de synthèse des TG (Waris et al., 2007). Elle pourrait aussi interférer avec expression du

facteur PPARα, ce qui limiterait la dégradation des acides gras et contribuerait alors à

l’accumulation de TG (De Gottardi et al., 2006). De plus la protéine de capside pourrait

entraîner une baisse d’expression des éléments de réponse à l’insuline (IRS) en interférant

avec l’expression de la PTEN (Clément et al., 2011) ou agirait directement en favorisant la

dégradation par le protéasome des IRS (Pazienza et al., 2007); (Pazienza et al., 2010). Ceci

aurait pour conséquence le développement d’une insulino-résistance hépatique qui pourrait à

son tour participer à l’établissement et/ou à l’évolution de la stéatose.

Aux vues de ces données et compte tenu du fait que les séquences des protéines de capsides

sont très conservées d’un génotype à l’autre, il est difficile de comprendre comment la

protéine de capside de génotype 3 puisse agir différemment des protéines de capsides des

151

autres génotypes. Néanmoins, il a été suggéré qu’un ou plusieurs changements dans la

séquence d’acides aminés pouvaient avoir un impact sur la conformation, la stabilité et/ou les

interactions avec les protéines cellulaires de l’hôte (Hourioux et al., 2007); (Piodi et al.,

2008). La protéine de capside du HCV est structurée en trois domaines (I, II et III). Si le

domaine I ne semble pas interférer avec le métabolisme lipidique, les domaines II et III

seraient directement impliqués dans l’accumulation de TG. Le domaine II (aa 119 à 174) de la

protéine de capside s’avère particulièrement intéressant du fait de son rôle dans l’association

aux GL (Hope & McLauchlan, 2000); (Hope, 2001); (Boulant et al., 2006); (Shavinskaya et

al., 2007); (Boulant et al., 2007). Il a d’ailleurs été montré au sein de notre équipe, qu’une

protéine de capside de génotype 1 portant un résidu spécifique de génotype 3 en position 164

(Y164F) était capable d’augmenter l’accumulation de GL in vitro (Hourioux et al., 2007).

Parallèlement, une étude montrait que ce mutant induisait une plus forte activation de

l’enzyme FAS comparée à la protéine de capside de génotype 1 (Jackel-Cram et al., 2007). Le

domaine III (aa 175 à 191) de la protéine de capside pourrait aussi être incriminé dans cette

accumulation de TG. Ainsi une équipe a mis en évidence que deux polymorphismes en

position 182 et 186 (FV et LI à la place de FI) étaient liés à la présence d’une stéatose sévère

chez des patients infectés par un génotype 3, et que l’expression in vitro de ces protéines de

capsides clonées à partir du virus qui infectait le patient conduisait à une augmentation du

niveau de lipides (Jhaveri et al., 2008); (Jhaveri et al., 2009). Dans la cohorte de patients que

nous avons établie, la présence de ces résidus dans la séquence de la protéine de capside des

virus circulants chez les patients n’est pas associée à une stéatose sévère. Par ailleurs aucun

résidu spécifique ni motifs dans la séquence de la protéine de capside ne se sont révélés être

corrélés à la présence d’une stéatose forte in vivo. Ces observations ont été confirmées par la

construction d’un arbre phylogénique réalisé sur l’ensemble des clones obtenus pour chaque

patient. Sur cet arbre il était possible de voir que les branches se formaient selon le génotype

des patients et non selon la présence d’une stéatose sévère. Nos résultats viennent ainsi

conforter l’étude publiée par Piodi et al, (Piodi et al., 2008) où aucune différence n’avait été

observée dans les séquences des protéines de capsides des virus qui infectaient les patients

présentant une stéatose sévère ou peu/pas de stéatose. Néanmoins les protéines de capside

clonées à partir des virus circulants chez ces patients, quelque soit le génotype, avaient la

capacité d’induire une accumulation de GL lorsqu’elles étaient exprimées in vitro, même si in

vivo chez le patient aucune stéatose n’était observée (Piodi et al., 2008). De plus, il avait été

montré que les GL avaient une taille plus importante dans des cellules exprimant la protéine

de capside de patients infectés par un génotype 3, par rapport à un génotype 1 (Piodi et al.,

152

2008). Nous avons voulu vérifier, avec le matériel clinique dont nous disposions, la

pertinence de ces observations faites en modèle in vitro. Ainsi nous avons évalué le diamètre

individuel de GL sur des coupes semi fines des biopsies de foies des patients en parallèle des

coupes ultrafines réalisées pour la quantification en MET. Les coupes semi-fines (0,5µm) ont

été réalisées comme suit : après inclusion dans de la résine Epon les fractions de biopsies sont

coupées au microtome (Reichert) puis colorées au bleu de toluidine pour une observation avec

un microscope optique relié à une caméra (Nikon). Ainsi le diamètre individuel (µm) et la

surface (µm2) de 100 GL consécutives ont été déterminés pour chaque patient avec le

programme Nikon NIS-Element (Nikon). Nous avons décidé d’évaluer cette surface

individuelle sur les coupes semi-fines plutôt que sur les coupes ultrafines pour se soustraire du

problème que nous rencontrions pour évaluer le diamètre des GL coupées par un des bords du

carreau de grille de microscopie. Nous n’avons cependant pas choisi de quantifier la stéatose

avec cette technique sur coupes semi-fines qui ne nous permettait pas une quantification

précise, les GL de taille inférieure à 1,5µm n’étant pas clairement visualisables. Bien que la

surface médiane individuelle des GL chez les patients infectés par un génotype 3 (19,4[8.0 ;

47.7] µm2) était légèrement plus élevée que celle de personnes infectées par un autre génotype

(16,1[6.2 ; 50.7] µm2), ce résultat n'était pas significativement différent entre les deux groupes

(p = 0,92).

La protéine de capside du HCV même si elle reste la mieux caractérisée, n’est pas la seule à

interférer avec le métabolisme lipidique. Ainsi, la protéine NS5A colocalise in vitro avec la

protéine de capside à la surface des GL (Miyanari et al., 2007); (Appel et al., 2008) et

interagit notamment avec l’ApoA1, l’ApoB et l’ApoE (Shi et al., 2002); (Domitrovich et al.,

2005); (Benga et al., 2010) ainsi qu’avec le facteur PPARγ (Kim et al., 2009). En parallèle de

l’analyse des séquences de la protéine de capside des variants circulant chez les patients, nous

avons trouvé pertinent de réaliser cette même étude pour la protéine NS5A. Contrairement à

la protéine de capside, la protéine NS5A présente une grande variabilité de séquences, rendant

l’alignement de séquences difficile. Néanmoins, de la même façon, nous avons établi un arbre

phylogénique à partir des séquences des clones de l’ensemble des patients. Là encore nous

n’avons pas mis en évidence de corrélation entre la formation d’une branche particulière et la

sévérité de la stéatose observée in vivo.

153

Conclusions & Perspectives

154

Lors de l’infection chronique par le HCV, ce virus au tropisme hépatique va détourner

à son profit le métabolisme de la cellule hôte et notamment le métabolisme lipidique très actif

au niveau du foie. Ainsi l’infection chronique in vivo est caractérisée dans plus de la moitié

des cas par une accumulation excessive de lipides sous forme de GL dans les hépatocytes

induisant la stéatose hépatique. Chez l’individu chroniquement infecté, deux types de stéatose

peuvent ainsi coexister : la stéatose métabolique et la stéatose virale. La part réellement

imputable au virus dans l’établissement de la stéatose reste donc très difficile à évaluer. En

outre, le rôle précis, direct ou indirect des différentes protéines virales dans l’établissement

des plates formes de réplication, d’assemblage et de sécrétion des particules virales reste

encore à déterminer. L’accumulation de GL qui est observée in vivo et dans de nombreux

modèles cellulaires in vitro semble être au cœur des mécanismes d’assemblage de la particule

virale. Ainsi, à travers deux approches, une étude fondamentale in vitro et une étude clinique

in vivo, nous avons voulu comprendre comment le HCV pouvait induire une telle

accumulation de GL et étudier l’impact de la variabilité du virus sur l’intensité de ce

phénomène.

Pour répondre à ces questions nous avons donc développé dans la première partie de

mon travail de thèse un projet fondamental in vitro qui a pu être mis en place rapidement

grâce à un outil d’expression de la protéine de capside du HCV en modèle cellulaire (modèle

SFV) avec lequel il était possible de mimer la stéatose viro-induite et sa majoration en

fonction du génotype. Il s’agissait alors d’utiliser ce modèle pour comprendre le rôle de la

protéine de capside dans l’induction de la stéatose viro-induite, en quantifiant les GL dans des

cellules exprimant une protéine de capside mature ou immature, et en analysant finement les

phénomènes de regroupement des GL induits par la protéine de capside mature.

La conclusion principale qu’apporte cette étude est que dans les cellules exprimant la

protéine de capside mature, le regroupement des GL ne s’explique pas par une simple

redistribution de GL préexistantes mais plutôt par une synthèse de novo de GL dans les zones

à la périphérie du noyau. Ces travaux permettent donc d’apporter des éléments nouveaux et

originaux, d’une part sur la dynamique des GL au sein d’une cellule, et d’autre part sur la

façon dont le HCV détourne les GL à son profit et met en place des phénomènes impliqués

dans la stéatose viro-induite.

Concernant les informations apportées sur la dynamique des GL au sein d’une cellule,

il serait maintenant pertinent de confirmer notre modèle de régression/régénération des GL en

réalisant une cinétique en temps réel de la formation des GL induites par la protéine de

155

capside. Tout récemment, une équipe canadienne a mis au point une approche microscopique

combinant la microscopie confocale bi-photon, la microscopie Raman et le contraste

interférentiel différentiel (Lyn et al., 2010) pour étudier ce phénomène en dynamique. Même

si cette approche a permis de visualiser une redistribution des GL dans la cellule exprimant la

protéine de capside, il est difficile d’en conclure si ce regroupement se fait par un trafic

individuel des GL ou par notre hypothèse de regression/régenération, voire une combinaison

des deux phénomènes. Cependant, les auteurs de ce travail ont utilisé un vecteur d’expression

différent du nôtre, et il pourrait être pertinent d’étudier nos cellules transfectées avec un

vecteur SFV par leur technique. Dans des travaux précedemment réalisés au sein de notre

équipe sur différents modèles viraux, il a été démontré que ce vecteur d’expression SFV n’est

pas associé à une surexpression particulière par rapport à un vecteur d’expression plus

classique, mais que par contre il induit une expression beaucoup plus rapide des protéines

d’intérêt. Cette particularité permet de visualiser des phénomènes qui n’ont jamais pu être

visualiés avec d’autres vecteurs d’expression (Patient et al., 2007). Pour cette raison, nous

avons également tenté d’utiliser les propriétés bien particulières de notre modèle pour

visualiser la biogenèse des GL, qui représente une étape encore largement méconnue.

L’hypothèse couramment admise est celle d’une accumulation de lipides entre les feuillets de

la membrane du RE, même si aucune équipe n’a réussi à visualiser un tel phénomène. Ainsi,

afin de comprendre cette étape précoce de la formation des GL, nous avons réalisé une

cinétique heure par heure de la formation des regroupements de GL induits par la protéine de

capside, lors de son expression in vitro en modèle SFV. Cependant, il ne nous a pas été

permis de visualiser l’accumulation de lipides entre les feuillets de la membrane du RE. Ceci

peut s’expliquer par le manque de résolution de la technique, par la rapidité de ces

évènements ou tout simplement par la faible probabilité de réaliser une coupe cellulaire

ultrafine sur le site même de cette accumulation.

D’autre part notre travail a permis de conforter l’idée du rôle direct de la protéine de

capside (mature ou immature) dans l’accumulation in vitro des GL ainsi que dans la

modulation du métabolisme lipidique contribuant à la synthèse de novo de GL. Nous avons

aussi pu constater l’effet supplémentaire que semble avoir la protéine de capside mature du

fait de sa capacité de liaison aux GL. Ces travaux confirment donc qu’au moins une des

protéines du HCV a bien un effet direct dans l’induction de la stéatose hépatique.

La deuxième partie de mon projet de thèse s’inscrivait donc dans la continuité de ce

travail in vitro et visait à vérifier l’impact de la variabilité du HCV et notamment de ses

156

protéines virales, sur la stéatose viro-induite in vivo. Nous disposions pour répondre à cette

question d’un groupe de patients chroniquement infectés par différents génotypes du HCV,

pour lesquels toute cause de stéatose métabolique avaient été exclue. Notre étude a montré

que la variabilité qui est plus ou moins observable au sein des protéines de capside et NS5A

des virus infectant ces patients semble avoir un effet mineur sur la sévérité de la stéatose

hépatique. Les effets imputables à la protéine de capside de génotype 3 qui ont pu être

observés in vitro (Abid et al., 2005); (Hourioux et al., 2007); (Jackel-Cram et al., 2007);

(Jhaveri et al., 2008); (Jhaveri et al., 2009); (Clément et al., 2011) semblent donc avoir peu

d’impact in vivo. Ainsi, lors de l’infection in vivo, les facteurs de l’hôte pourraient prédominer

dans la détermination du degré de stéatose. Plusieurs données viennent par ailleurs étayer une

telle hypothèse. Une étude a montré que la stéatose observée in vivo dans les hépatocytes ne

semble pas liée à la présence des protéines du HCV dans ces mêmes hépatocytes, comme on

aurait pu s’y attendre si la stéatose résultait d’un effet direct des protéines du HCV (Grassi et

al., 2005). Plus récemment, il a été mis en évidence que l’expression du facteur SREBP1

n’était pas augmentée dans le foie de patients infectés par différents génotypes du HCV

(McPherson et al., 2008); (Ryan et al., 2011), alors qu’une telle augmentation avait été

constatée lors d’expériences in vitro avec la protéine de capside de génotype 3 (Jackel-Cram

et al., 2007). De ce fait, de plus en plus d’études s’intéressent aux facteurs génétiques liés à

l’hôte qui pourraient contribuer au développement d’une stéatose plus sévère chez les porteurs

chroniques du HCV. Les études menées à ce jour tendent à montrer que dans la plupart des

cas, les gènes de l’hôte influent sur le développement de la stéatose d’une façon qui dépend

du génotype du virus. Ainsi des polymorphismes du gène codant la PPARγ, le gène IL-28B

(Cai et al., 2011), la PNLPLA3 (Sookoian et al., 2009); (Cai et al., 2011), la MTP (Mirandola

et al., 2009); (Zampino et al., 2008); (Cai et al., 2011) ont été mis en évidence et seraient liés

à un risque plus important d’apparition d’une stéatose hépatique lors de l’infection. Au

contraire un polymorphisme dans le gène codant l’ApoE serait associé à une atteinte

hépatique légère et protégerait contre des dommages plus sévères (Wozniak et al., 2002) (cf

paragraphe III) B. 3. c) (2)). Le groupe de patients dont nous disposons est certes restreint

mais constitue un groupe de choix pour déterminer l’impact direct de ces polymorphismes

puisque la majeure partie des facteurs liés au développement d’une stéatose métabolique ont

été écartés. Dans la suite de ce travail, il serait donc pertinent d’étudier le polymorphisme de

ces différents gènes et de chercher une éventuelle association avec la présence ou l’absence de

stéatose chez ces patients.

157

Par ailleurs, le matériel clinique original que nous avons récolté nous donnera

l’opportunité de mieux comprendre le lien entre la présence de la protéine de capside à la

surface des GL et la production de virus in vivo. En effet, la relation entre la sévérité de la

stéatose et la charge virale reste controversée (Rubbia-Brandt et al., 2000); (Adinolfi et al.,

2001); (Grassi et al., 2005). Ainsi l’étude de Grassi et al, montrait que dans une cohorte de

patients infectés par le HCV, la présence de stéatose dans les hépatocytes n’était pas liée à la

présence des protéines virales dans ces mêmes cellules (Grassi et al., 2005). De plus, même si

il est établi que la protéine de capside s’accumule à la surface des GL in vitro et in vivo, les

données in vivo restent rares (Barba et al., 1997); (Moriya et al., 1997a). Néanmoins, dans le

foie de souris transgéniques exprimant la protéine de capside en quantité équivalente à celle

retrouvée dans le sérum de patients chroniquement infectés, la sévérité de la stéatose semble

liée au niveau d’expression de la protéine de capside (Moriya et al., 1998); (Moriya et al.,

2001). Les données obtenus in vitro montrent aussi maintenant clairement que les GL

constituent une sorte de plate-forme pour l’assemblage viral. Pour toutes ces raisons, nous

envisageons donc de réaliser une étude originale visant à établir un parallèle entre la charge

virale de quelques patients de notre étude présentant une stéatose sévère ou modérée et la

quantité de protéines de capside du HCV à la surface des GL observées dans les biopsies de

foie en ME, à l’aide d’un immuno-marquage (immuno-gold) avec des anticorps spécifiques

dirigés contre la protéine de capside. Notre laboratoire a mis au point cette technique

d’immuno-gold in vitro dans des cellules infectées par la souche JFH1. Nous nous proposons

d’appliquer cette technique aux biopsies de patients de notre étude. A notre connaissance, ce

type d’investigation n’a jamais été réalisé. Nous pensons effectuer des semi-quantifications de

la protéine de capside à la surface des GL (par comptage des billes d’or) et voir si le nombre

de billes d’or (représentatif de la quantité de capside en surface des GL) peut être corrélé à la

charge virale.

Les résultats fondamentaux et biocliniques que nous présentons au travers de cette

thèse illustrent la difficulté d’évaluer la part liée au virus et celle liée à des facteurs de l’hôte

dans l’induction d’une stéatose hépatique chez les patients chroniquement infectés par le

HCV. Les données in vitro suggèrent que le virus joue un rôle direct dans l’induction d’une

stéatose, notamment par les propriétés de sa protéine de capside, et que la variabilité du virus

peut avoir un impact sur l’intensité de cette stéatose. Notre étude bioclinique suggère que la

variabilité du virus semble avoir un rôle beaucoup plus modéré in vivo. Ainsi, chez les

patients chroniquement infectés par le HCV, les facteurs de l’hôte joueraient un rôle majeur

158

pour moduler le dégré de la stéatose associée au virus et de prochaines études seront

nécessaires pour établir la nature de ces facteurs.

159

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Marion DEPLA MODÉLISATION IN VITRO ET ÉTUDE

BIOCLINIQUE DE LA STÉATOSE INDUITE PAR LE VIRUS DE

L’HÉPATITE C

Résumé

Les résultats fondamentaux et biocliniques que nous présentons au travers de cette thèse

illustrent la difficulté d’évaluer la part liée au virus et celle liée à des facteurs de l’hôte dans

l’induction d’une stéatose hépatique chez les patients chroniquement infectés par le HCV. Les

données in vitro suggèrent que le virus joue un rôle direct dans l’induction d’une stéatose,

notamment par les propriétés de sa protéine de capside, et que la variabilité du virus peut

avoir un impact sur l’intensité de cette stéatose. Notre étude bioclinique suggère que la

variabilité du virus semble avoir un rôle beaucoup plus modéré in vivo. Ainsi, chez les

patients chroniquement infectés par le HCV, les facteurs de l’hôte joueraient un rôle majeur

pour moduler le dégré de la stéatose associée au virus et de prochaines études seront

nécessaires pour établir la nature de ces facteurs.

Mots clés : Virus de l’hépatite C, stéatose, gouttelettes lipidiques

Abstract

The results presented in this thesis illustrate the difficulty of assessing the part related to the

virus and that related to host factors in the induction of hepatic steatosis in patients

chronically infected with HCV. In vitro data suggest that the virus plays a direct role in the

induction of steatosis, due to the properties of its capsid protein, and that the variability of the

virus can affect the intensity of the steatosis. Our bio-clinical study suggests that this

variability seems to have a much more moderate impact in vivo. Thus, in patients chronically

infected with HCV, host factors seem to play a major role to modulate the degree of steatosis

associated with the virus. Further studies are needed to establish the nature of these factors.

Keywords : Hepatitis C virus, steatosis, lipid droplets

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