Thibault Virus A Et E

V.Thibault DU_janv.-2010 1

Virus de l'hépatite A et E Virus et marqueurs diagnostiques

Vincent THIBAULT Laboratoire de Virologie

Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière

Assistance Publique Hôpitaux de Paris


Hépatites virales

parentéral

non A, non B B 1965 D

1977

A 1972

féco-oral

mode de transmission préférentiel

F, G, TTV, autres…

C 1990

E 1991


Historique VHA � “La Jaunisse”

� 1745 : Cockayne, hépatites épidémiques

� 1908 : McDonald, "notion de virus…"

� Reproduction de la maladie 1942 :

� Volontaires (Voegt, Havens), Paul 1943 ingestion feces/serum

� Entité clinique :

� 17-18ème siècle - 1923 Blumer - 1947 McCallum (VHA "infectious"-VHB "serum")

� Visualisation : 1973 (Feinstone)

� Développement de la sérologie : épidémiologie

� 1979 : culture (Provost et Hilleman)

� 1981... : Clonage, Séquences nucléotidiques

� 1991… : Vaccination

� 2006 : Déclaration obligatoire


Virus de l'hépatite A


Virus de l’Hépatite A

ARN (+)

Vpg

Capside

27-32nm

• Famille : Picornaviridae

(entérovirus type 72)

• Genre : hépatovirus

• Taille 27-32 nm

• Non enveloppé

• Structure icosaèdrique

• ARN simple brin, • polarité positive

• lié de façon covalente à une protéine Vpg

V.Thibault DU_janv.-2010 6 ��

��

��

��

��

��

��

��

VP1 VP3 VP2 VP4 2A Protéines de surface

immunogénicité

3D (POL) 3C (PRO) 2C 2B 1D 1C 1B 3 A-B 2A

P1 prot. Capside

Vpg 2.5kDa

P2 P3

0 7478

1A AAA

Structurales Non structurales

IRES Traduction

3D (POL) 3C (PRO) 2C 2B VP1 VP3 VP2

3 A-B

VP4

2A poly-

protéine 2 227 AA

?

Liaison NTP Hélicase

Vpg

Protéase

ARN Polymérase

Réplication VP1 VP3 VP2 VP4 2A

VP0

Maturation finale

X5 – X12


Cycle de multiplication du VHA en culture de cellules

P3

P2

P1

Traduction Synthèse

de la polyprotéine

+ -

-

+

Réplication

Maturation

Libération du génome

Attachement

Relargage

Mem

brane cellulaire

Réticulum endoplasmique

Espace de Disse

Canalicule biliaire

Empaquetage


VHA : physiopathologie

Absence d'effet cytopathique direct :

cytolyse résultant du processus immun de

défense de l'hôte,

�médiation cellulaire

�médiation humorale


Agents Stabilité

Chaleur

Autoclavage (121°C, 20')100°C60°Ctempérature ambiante

4°CCongelé

InactivationInactivationStable 1 heureStable 1 mois (selles, eaux, sols)Plusieurs jours sur surface sèche4 h. Sur les mainsStable plusieurs moisStable des mois ou années

Acide-base pH 1 : stable 5 h.PH 3-11 : stable au moins 30'

U.V. Inactivation

Chimiques

Chlore, ozone,glutaraldéhyde, iode

Inactivation

Alcool 70° 3' : inactivation partielle

Propriétés Physiques du VHA


Variabilité génétique

� Comparaison nucléotidique

7 Génotypes : IA,B ; II; IIIA,B ; IV-VII

Homme : génotype I (90%), (III, II=VII)

Singes : IV, V, VI

� Sérotype unique

Nombre limité d'épitopes antigéniques VP1, VP3

Tests immunologiques

Vaccination (HM175, CR326)

virus inactivé cultivé sur MRC-5

3D (POL) 3C (PRO) 2C 2B 1D 1C 1B 3 A-B 2A

P1 prot. Capside

Vpg 2.5kDa

P2 P3

0 7478

1A AAA

Structurales Non structurales


IV Nonhuman primate, Philippines V Nonhuman primate, Kenya VI Nonhuman primate, Indonesia

D'après Nainan et al. 2006 Clin. Microb. Rev. ; 19:63-79

Génotypes et phylogénie

Phylogenetic analysis of 3,582 HAV isolates in the VP1/P2B region (315-bp fragment).

VP1/P2A Génotypes : >15% variations Sous types : 7.5% variations


Répartition mondiale des génotypes

Génotypes infectant l'homme en noir , les singes en rouge. Souche PA21 (génotype IIIA), isolée d'un singe Panamanian Owl en vert.

Cristina J, Costa-Mattioli M. Virus Res. 2007 Aug;127(2):151-7.


Symptomes

Ictère

VHA : Paramètres Biologiques

Semaines

Ag foie

VHA Sang

VHA Selles

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 24

IgM

IgG protection contre réinfection

Ac anti-VHA = hépatite A ancienne ou vaccination IgM anti-VHA = hépatite aiguë A (clinique)


Marqueurs indirects (+++) (ELISA)

1- Sang : Marqueurs indirects

� IgM

� IgG

� Génome viral (RT-PCR) 105 virions/mL sang

VHA : Marqueurs disponibles

3- Milieux : � Génome viral (RT-PCR) � Particules virales IEM

4- Foie : � Ag viral à la surface des hépatocytes � Génome viral : hybridation, RT-PCR

Marqueurs directs (plus spécialisé)

2- Selles : 109 virions/g selles � Génome viral (RT-PCR) - épidémiologie

� Particules virales IEM - EIA

Salive :

�IgG (ELISA)

�Génome viral (RT-PCR)


IgM HAV uniquement à bon escient !

� Alaska : test "réflexe" si Ig-VHA totales + � Ig M HAV 32 % de faux + (Castrodale CID 2005:41;e86)

� Vaccination : 8 à 20 % d'IgM VHA + dans les 2 à 3 semaines suivant l'injection…

� NE RECHERCHER L'IgM anti-VHA QU'EN CAS D'HEPATITE AIGUË

Roque Afonso et al. CID 2006:42 -887

82 % 11 % 1 %

Faux positifs


Diagnostic

� Sérologie +++

� IgM anti VHA : infection récente

� IgG anti VHA : infection passée ou vaccination

� IgM et IgG anti VHA

� Diagnostic direct (-) [uniquement dans le cadre d'études]

� Virémie : techniques sensibles (105 v./mL)

� Recherche de virus dans les selles, prolongée, importante

(109v./mL), épidémiologie

� Marqueurs biochimiques

Transaminases (ALAT, ASAT)

Bilirubine

Phosphatase alcaline

Facteurs de coagulation

Salive :

�IgG (ELISA)

�Génome viral (RT-PCR)


Hépatite A : le vaccin virus inactivé

� AVAXIM 160U suspension injectable seringue préremplie

Virus de l'hépatite A souche GBM cultivée sur cellules diploïdes humaines MRC-

5 , inactivé

� HAVRIX 1 440 U Elisa/ml susp inj IM Ad en seringue

� HAVRIX 720 U Elisa/0,5 ml susp inj IM Enf/Nour en seringue

Souche HM 175 du virus de l'hépatite A cultivée sur cellules humaines

diploïdes MRC5

� Le schéma vaccinal habituel comprend 1 dose suivie d'un rappel (1 dose) 6 à

12 mois plus tard.

� La persistance des anticorps anti-VHA après vaccination n'est

actuellement pas connue . Les données disponibles suggèrent la persistance

des anticorps anti-VHA à un niveau protecteur jusqu'à 10 ans (20 ans ?)

après primo-immunisation.

Hepatitis A Vaccine versus Immune Globulin for Post-exposure Prophylaxis Victor et al. 2007 N Engl J Med 357;17


Difficultés diagnostiques En routine

Adresser prélèvements au

Centre national de référence du VHA

Pr E Dussaix Laboratoire de virologie Hôpital Paul Brousse

12-14 av Paul Vaillant Couturier 94804 Villejuif cedex Tel : 01 45 59 37 21

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste


Grippe

SRAS ?

Hépatite E ? Hépatite E ? Grippe Hépatite E ?


Historique VHE � Découverte dépendante de la connaissance des virus des hépatites

1955 : Inde, hépatite chez des personnes immunisées contre le VHA, épidémie particulière. "NANBH"

� Entité clinique 1980 - similitude avec l’hépatite A :

� Inde : prévalence de l’hépatite A importante

� Epidémie : autre virus des hépatites, contamination par l’eau

� 1983 : reproduction de l’hépatite non A-non B chez un volontaire immunisé contre VHA (Balayan)

� Hépatite à J36

� J28-45, visualisation de particules virales > VHA (27-30nm)

� Reproduction de l’infection chez le singe (cynomolgus)

� Hépatite "non A - non B" à transmission entérique (ENANB)

� 1990 : Reyes et al. clonage et séquençage � "VHE"

� 1991 : Tam et al. VHE

� 2000 : Panda et al. cDNA infectieux


VHE Virus non enveloppé Sphérique (SRV)

Surface irrégulière Capside 27-34 nm

Symétrie icosaédrique

ARN simple brin hélice droite polarité + 7,5kb

poly-A extrémité 3’

Stabilité Au laboratoire : instable(-70 à +8°C)

Décongélation/congélation Tractus GI : stable (pH)

Famille : Hepeviridae Genre : Hepevirus


Organisation génomique Non structurales Structurales

28 5109 7124 5’ NC 3’NC Poly-A

ARN polarité + 7 200 nt

Protéines immunogènes

DIAGNOSTIC

MeT Y Pro P X Hel RdRp

ORF3

ORF2

Génotypes 1-3

Hétérogénéité génétique

� Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous groupes dont homologues animaux :

� Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2

� Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype

Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre les différents types ?)

Vaccin : ORF 2 recombinante


Hétérogénéité génétique

� Au moins 4 groupes majeurs (<20% hétérogénéité ORF2) subdivisés en 24 sous

groupes dont homologues animaux :

I- Birmanie et certaines souches africaines et asiatiques

II- Mexique et certaines souches du Niger

III- Amérique, Italie, NZ, Autriche, Grèce, Argentine (+ souches porcines)

IV- Chine, Taiwan et Japon (plus sévère que III ?)

� Epitopes majeurs : parties C-ter de l’ORF3 et ORF2

Connaissances limitées sur l’immunité contre les Ag natifs

Parties structurales variables

Grande homologie des parties non structurales

Protection croisée entre différentes souches : un seul sérotype

Développement de tests sérologiques (performances équivalentes entre

les différents types ?)

Vaccin : ORF 2 recombinante


301 nt 5' end of ORF2 sequences from 275 HEV strains,

1 2

3

4

1a

1b

1c

1e

1d

0.05

4d

4c

4b

4a

4e

3f

3e 3c

3d 3b

3a

D'après Lu et al. Rev. Med. Virol. 2006;16:5-36

Inde, Népal, Birmanie, Japon, Espagne

Chine, Pakistan, Bengladesh

Chine, Inde, Nepal, Russie

Maroc, Algérie

Algérie, Namibie, Afrique C.

Mexico, Nigeria

US, Japon, Corée, NL + porc

Japon + porc

NL (porc) Taiwan (porc)

France, UK, Japon, Espagne + porc

Espagne, UK, Grèce, NL, Japon + porc

Chine, Taiwan

Chine, Taiwan Japon, Vietnam

Chine (porc)

Inde (porc)

Génotype < 20% hétérogénéité ORF2


Similarités des souches humaines et

animales

Borgen et al. BMC Infectious Diseases 2008, 8:61

Genetic relatedness between HEV strains from human and non-human sources and from various countries. Minimal spanning trees of 81 sequences of 148 nucleotides HEV RNA showing genetic distances between genotype 3 HEV strains from humans and animals. Dutch cases are marked with ID numbers inside the colored circles.


Similarités des souches humaines et animales Bilic et al. Journal of General Virology

(2009), 90, 863–873

Unrooted phylogenetic tree of four avian HEV and nine mammalian HEV isolates, based on the complete genome region

aviaires humaines


Similarités des souches humaines et animales

Phylogenetic tree of based on

full-length sequences HEV

genotypes 1, 2, 3, 4, and

avian HEV and the new

genotype from rabbits.

Zhao et al. Journal of Medical Virology 81:1371–1379 (2009)


Culture et Modèles animaux

• Culture � Difficile � Culture primaire d’hépatocytes de macaques (cynomolgus)

� Cellules PLC/PRF/5 hépatocarcinome (Tanaka et al. J. Gen Virol. 2007)

� Cellule embryonnaire

• Modèles animaux � Primates : reproduction de la pathologie humaine � Volontaires...

� VHE du porc, du poulet

� Présence d’Ac chez poulet, porc, rat, souris, mouton...


Symptomes

Ictère

VHE : Paramètres Biologiques

Jours

VHE Sang

VHE Selles

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 200

IgM

IgG

Titre peu élevé protection contre réinfection ?


HEV – virémie- transmission

Matsubayashi K, et al. Transfusion. 2008 Jul;48(7):1368-75.

serum

salive

selle

IgG

IgM

Concentré de plaquettes à J0 Transfusé à un homme de 64 ans traité pour Lymphome non-Hodgkinien par GM autologue


Immunodépression, hépatite chronique et stratégie diagnostique

Kamar et al. American Journal of Transplantation 2008; 8: 1744–1748

Dans le cadre d'une investigation chez un patient immuno déprimé,

La détection du génome viral (RT-PCR) sera privilégiée !

(ceci s'applique pour de nombreux diagnostics viraux - PCR)


� Marqueurs non biologiques

� circonstances de la maladie (voyage, autres causes, épidémie)

� A adapter en fonction de la zone géographique ? (Sud versus Nord ?)

� clinique : hépatite “classique”, absence de chronicité (chez

l'immunocompétent ! )

� Absence de marqueurs biologiques : diagnostic d'exclusion

� Absence des marqueurs des virus des autres hépatites (A, B, C, D)

� Notions sérologiques pour d’autres virus (EBV, CMV, herpès)

� Marqueurs sérologiques spécifiques

� IgM anti-HEV

� IgG anti-HEV (+++)

� RT-PCR : détection du génome viral (sang, selles)

Stratégie Diagnostique


Spécificité et Sensibilité des ELISAs

� Epidémie Indonésie, 82 symptomatiques; 174 asymptomatiques; 496 contrôles

� Comparaison de 5 tests sérologiques Référence = RT-PCR

Concordance IgM : 81%

Concordance IgG : 85%

Myint et al. JCM, 2006, p. 1581–1583


Performance des tests

MicroplaqueAdaltis

MicroplaqueMP Diagnostics

941644545Total (n=50)

544545Negatif (n=9)

437239140Positif (n=41)

négatifpositifnégatifpositifnégatifpositif

Test rapideMP Diagnostics

IgM anti-HEV

anti-HEV IgG

97.810010082Test rapide

MP Diagnostics

98.595.799.588Microplaque

MP Diagnostics

98.810010090MicroplaqueAdaltis

Spécificité%

Sensibilité%

VPN %

VPP%

J. Izopet Comm. Pers. CVV 2008

Panels 50 sérums ARN HEV (+), G3 406 sérums IgG ARN HEV (-)


Stratégie Diagnostique Se donner les moyens de faire le diagnostic

- - + Immunité ancienne

- - +++ Douteux

+ - - ou + Probable

+ ++ ++ Certain

RT-PCR IgM IgG Diagnostic

Diagnostic Direct

Recherche du génome sur

prélèvements sang et selles

Diagnostic Indirect

Recherche de l'immunité antivirale

IgM anti VHE

IgG anti VHE


VHE et vaccination

Risque cumulé d'un premier épisode d'hépatite E

Moyenne géométrique du taux d'anticorps anti-VHE

20 µg d'antigène rHEV (capside exprimée dans baculovirus) dans 0.5 ml de PBS sur 0.5 mg d'hydroxyde d'aluminium. 3 injections

Shrestha,et al 2007 N Engl J Med 356;9

Efficacité : 95,5% après 3 doses


Adresser les prélèvements au

Centre national de référence du VHE

Dr E Nicand Laboratoire de biologie

HIA Val de Grâce Tel : 01 40 51 40 00

http://invs.sante.fr/surveillance/cnr/liste

Thibault Virus A Et E

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