THESE 'U Christine FÉRAY - Hydrologie.orghydrologie.org/THE/FERAY.pdf · À ces remerciements...

N° d'ordre : 58-2000 Année 2000

THESE

présentée devant

L'UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

pour l'obtention du

DIPLOME DE DOCTORAT

(arrêté du 30 mars 1992)

spécialité : ÉCOLOGIE MICROBIENNE

par

Christine FÉRAY

NITRIFICATION EN SEDIMENT D 'EAU DOUCE :

INCIDENCE DE REJETS DE STATION D 'EPURATION

SUR LA DYNAMIQUE DE COMMUNAUTES NITRIFIANTES

Soutenue le 3 avril 2000 devant le jury :

Mme M. BIANCHI Directeur de Recherche, CNRS Marseille Rapporteur

M. A. CHALAMET Professeur, Université Lyon I Président du jury

Mme A. CLAYS-JOSSERAND Maître de Conférences, Université Lyon I Examinateur

M. B. MONTUELLE Chargé de Recherche, Cemagref Lyon Directeur de thèse, examinateur

M. J.P. REBILLARD Docteur-Ingénieur, Agence de l'Eau Adour-Garonne Examinateur

M. J.L. ROLS Professeur, Université Toulouse III Rapporteur

1

N° d'ordre : 58-2000 Année 2000

THESE

présentée devant

L'UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I

pour l'obtention du

DIPLOME DE DOCTORAT

(arrêté du 30 mars 1992)

spécialité : ÉCOLOGIE MICROBIENNE

par

Christine FÉRAY

NITRIFICATION EN SEDIMENT D 'EAU DOUCE :

INCIDENCE DE REJETS DE STATION D 'EPURATION

SUR LA DYNAMIQUE DE COMMUNAUTES NITRIFIANTES

Soutenue le 3 avril 2000 devant le jury :

Mme M. BIANCHI Directeur de Recherche, CNRS Marseille Rapporteur

M. A. CHALAMET Professeur, Université Lyon I Président du jury

Mme A. CLAYS-JOSSERAND Maître de Conférences, Université Lyon I Examinateur

M. B. MONTUELLE Chargé de Recherche, Cemagref Lyon Directeur de thèse, examinateur

M. J.P. REBILLARD Docteur-Ingénieur, Agence de l'Eau Adour-Garonne Examinateur

M. J.L. ROLS Professeur, Université Toulouse III Rapporteur

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UNIVERSITE CLAUDE BERNARD LYON I

Président de l'Université M. le Professeur DECHAVANNEVice-Président Fédération Santé M. le Professeur J. DOURYVice-Président Fédération Sciences M. le Professeur R. GARRONEVice-Président du Conseil Scientifique M. le Professeur J. REMILLIEUXVice-Présidents Recherche MM. les Professeurs J. CHEVALEYRE et

D. REVELVice-Président Etudes Doctorales M. le Professeur J.F. MORNEXVice-Président du Conseil des Etudes et de la M. le Professeur D. DEBOUZIEVie UniversitaireSecrétaire Général M.J. FLACHER

FEDERATION SANTE

Composantes :UFR de Médecine Lyon R.T.H. Laënnec Directeur: M. le Professeur

D. VITAL-DURANDUFR de Médecine Lyon Grange-Blanche Directeur: M. le Professeur G. CHAZOTUFR de Médecine Lyon-Nord Directeur: M. le Professeur F. MAUGUIEREUFR de Médecine Lyon-Sud Directeur: M. le Professeur F.N. GILLYUFR d'Odontologie Directeur: M. le Professeur J.DOURYInstitut des Sciences Pharmaceutiques etBiologiques Directeur: M. le Professeur C. COLLOMBELInstitut Techniques de Réadaptation Directeur: Mme le Professeur D. BOISSONDépartement de Formation et Centre deRecherche en Biologie Humaine Directeur: M. le Professeur J.F. MORNEXDépartement de Formation à la Recherche et àl'Evaluation Pédagogiques Directeur: M. le Professeur M. LAVILLE

FEDERATION SCIENCES

Composantes :UFR de Physique Directeur: M. le Professeur J.L. VIALLEUFR de Biologie Directeur: M. le Professeur G. BOSQUETUFR de Mécanique Directeur: M. le Professeur J.N. GENCEUFR de Génie Electrique et des Procédés Directeur: M. le Professeur G. GILLESUFR Sciences de la Terre Directeur: M. le Professeur S. ELMIUFR de Mathématiques Directeur: M. le Professeur Y. KERBRATUFR d'Informatique Directeur: M. le Professeur D. VANDORPEUFR de Chimie Biochimie Directeur: M. le Professeur J.P. SCHARFFUFR STAPS Directeur: M. P. THIRIET Maître de

ConférencesObservatoire de Lyon Directeur: M. le Professeur R. BACONInstitut des Sciences et des Techniques de Directeur: M. le Professeur P. TROMPETTEl'Ingénieur de LyonDépartement de 1er cycle Sciences Directeur: M. J.C. DUPLANlUT A Directeur: M. le Professeur M.ODINIUT B Directeur: M. le Professeur G. MARESTInstitut de Science Financière et d'Assurances Directeur: M. le Professeur J.C. AUGROS

11/10/1999

3

Avant-propos

Ce travail de thèse a été réalisé au laboratoire EcoDynamique des Sédiments du Cemagref de Lyon,sous la direction de Monsieur Bernard Montuelle, responsable du laboratoire.

Je remercie tous les membres de l'équipe EDS : permanents, thésards, post-doctorants, stagiaires…pour leur accueil et leur présence chaleureuse.En particulier, je tiens à exprimer ma reconnaissance à Bernard Montuelle pour m'avoir confié cette étude etpour avoir encadré mon travail, à Bernadette Volat et Hélène Percherancier pour leur soutien amical.

Je remercie Madame Annie Clays-Josserand et Mademoiselle Valérie Degrange pour leurparticipation à l'encadrement de ce travail et pour leur relecture appliquée du manuscrit.

À ces remerciements j'associe le personnel et les étudiants du laboratoire d'Écologie Microbienne del'Université Lyon I pour leur accueil.

Je remercie également les personnes qui ont accepté de juger ce travail : Madame Micheline Bianchiet Monsieur Jean-Luc Rols en qualité de rapporteurs, Madame Annie Clays-Josserand, Messieurs AlainChalamet et Jean-Pierre Rebillard en qualité d'examinateurs.

Merci enfin au personnel de la station d'épuration de Saint-Fons pour m'avoir facilité l'accès auxinstallations.

À ma famille et mes amis pour leur soutien affectif…

4

SOMMAIRE

CHAPITRE I : PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L 'ÉTUDE............................12

CHAPITRE II : NITRIFICATION DANS LES MILIEUX D 'EAU DOUCE : ÉTUDEBIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................18

CHAPITRE III : IMPACT DE REJETS DE STATION D 'ÉPURATION SUR LANITRIFICATION EN SÉDIMENT DE RIVIÈRE : ÉTUDE EN MICROCOSMES ..............57

CHAPITRE IV : IMPACT DE REJETS DE STATION D 'ÉPURATION SUR LANITRIFICATION EN SÉDIMENT DE RIVIÈRE : ÉVOLUTION ET COMPÉTITIONDE POPULATIONS NITRATANTES MODÈLES ..................................................103

CHAPITRE V : ÉTUDE DE COMMUNAUTÉS NITRIFIANTES EN SÉDIMENT :MISES AU POINT ET ADAPTATIONS MÉTHODOLOGIQUES POUR LEDÉNOMBREMENT DU GENRE NITROBACTER ................................................137

CHAPITRE VI : CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES .........................168

TABLE DES ILLUSTRATIONS 5

TABLE DES ILLUSTRATIONS

TABLEAUX

CHAPITRE II

Tableau II - 1 : Formes inorganiques du cycle de l'azote et leur degré d'oxydation. .............. 20Tableau II - 2 : Grille pour les niveaux de pollution par les formes de l’azote. ..................... 22Tableau II - 3 : Différenciation des genres de la famille des Nitrobacteraceae...................... 26Tableau II - 4 : Caractéristiques des systèmes enzymatiques impliqués dans la

nitrification autotrophe................................................................................................. 31Tableau II - 5 : Caractéristiques de croissance des bactéries nitrifiantes. .............................. 34Tableau II - 6 : Habitats des bactéries nitrifiantes autotrophes. ............................................. 38Tableau II - 7 : Principale méthodes de dosage des différentes formes de l’azote

inorganique. ................................................................................................................. 45Tableau II - 8 : Densité des bactéries nitritantes et nitratantes dans l'eau et les

sédiments de lacs.......................................................................................................... 51

CHAPITRE III

Tableau III - 1 : Caractéristiques physico-chimiques du sédiment de la Chalaronne. ............ 62Tableau III - 2 : Variabilité de la méthode de mesure de la nitrification potentielle............... 68Tableau III - 3 : Caractéristiques du sédiment (phase solide) de la Chalaronne. .................... 72Tableau III - 4 : Variabilité intra et inter-réacteurs : test de Kruskal-Wallis. ......................... 76Tableau III - 5 : Variabilité intra-réacteurs........................................................................... 77Tableau III - 6 : Caractéristiques de l'effluent non nitrifié..................................................... 82Tableau III - 7 : Caractéristiques de l'effluent nitrifié. .......................................................... 84Tableau III - 8 : Caractéristiques du mélange d'effluents. ..................................................... 85Tableau III - 9 : Estimation de la quantité de bactéries nitrifiantes apportées à chaque

réacteur par les effluents en 28 jours............................................................................ 87Tableau III - 10 : Récapitulatif des tendances observées à Tfinal des expériences................. 89

CHAPITRE IV

Tableau IV - 1 : Caractéristiques de croissance des souches AG et X14 en culture,pendant la phase de croissance exponentielle.............................................................. 109

Tableau IV - 2 : Caractéristiques de croissance de N. winogradskyi et N. hamburgensisen cultures pures. ....................................................................................................... 110

Tableau IV - 3 : Protocole d'inoculation des batches. ......................................................... 113Tableau IV - 4 : Caractéristiques du sédiment (phase solide) de la Chalaronne................... 117Tableau IV - 5 : Caractéristiques du sédiment (eau interstitielle) de la Chalaronne. ............ 117Tableau IV - 6 : Caractéristiques de l'eau de rivière et de l'effluent stériles......................... 118


Tableau IV - 7 : Évolution des paramètres dans les séries témoins au cours de l'incubation.118Tableau IV - 8 : Rendement de croissance des sérotypes AG et X14 au cours des

incubations................................................................................................................. 125Tableau IV - 9 : Indice de productivité des sérotypes AG et X14 dans les

différentes incubations. .............................................................................................. 130Tableau IV - 10 : Dynamique des souches AG et X14 en situation de compétition ou non,

dans un milieu non limité ou carencé en nitrite........................................................... 133

CHAPITRE V

Tableau V - 1 : Caractéristiques physico-chimiques des sédiments du Neyrieuxet de la Chalaronne..................................................................................................... 142

Tableau V - 2 : Rendements de récupération de l'ADN lors de sa purification surcolonne Elutip-d......................................................................................................... 150

Tableau V - 3 : Dénombrement de Nitrobacter par les 3 techniques dans lesédiment du Neyrieux inoculé. ................................................................................... 159

CHAPITRE VI

Tableau VI - 1 : Différents niveaux d'approche abordés et apports à l'écologie desbactéries nitrifiantes en sédiment de rivière soumis à un rejet de station d'épuration. .. 171

Tableau VI - 2 : Principales perspectives de recherches fondamentales et appliquéessur la nitrification dans les sédiments d'eau douce et cours d'eau. ............................... 174

FIGURES

CHAPITRE I

Figure I – 1 : Évolution de quelques paramètres physico-chimiques et biologiquesen aval d'une pollution organique. ................................................................................ 12

CHAPITRE II

Figure II - 1 : Cycle de l'azote en milieu aquatique............................................................... 20Figure II - 2 : Arbre phylogénétique des Protéobactéries. ..................................................... 28Figure II - 3 : Oxydation de l'ammonium et transport d'électrons chez Nitrosomonas. .......... 30Figure II - 4 : Oxydation du nitrite et transport d'électrons chez Nitrobacter......................... 31Figure II - 5 : Consommation du nitrite et croissance mixotrophique de trois

espèces de Nitrobacter. ................................................................................................ 33Figure II - 6 : Schématisation des transformations de l'azote pendant la nitrification

en batch en l'absence d'inhibiteur.................................................................................. 35Figure II - 7 : Plages d'inhibition de la nitrification par l'ammoniaque libre

et l'acide nitreux. .......................................................................................................... 36


CHAPITRE III

Figure III - 1 : Effet de la présence des inhibiteurs allylthiourée (ATU) et chloratesur les dosages des sels azotés.. .................................................................................... 65

Figure III - 2 : Activités nitrifiante, nitritante et nitratante potentielles dans le sédimentde la Chalaronne : évolution des composés azotés. ....................................................... 65

Figure III - 3 : Dynamique de l’azote au cours des incubations pour les mesuresd'activités potentielles. ................................................................................................. 66

Figure III - 4 : Bilans en azote au cours des incubations pour les mesuresd'activités potentielles : évolution de la somme des teneur en sels azotés dissous.......... 66

Figure III - 5 : Évolution des MPN nitritants et nitratants dans le sédiment au coursd'une incubation pour une mesure d'activité potentielle. ............................................... 68

Figure III - 6 : Protocole de mesure des activités nitritante et nitratante potentielles. ............ 71Figure III - 7 : Schématisation d’un réacteur (microcosme).................................................. 72Figure III - 8 : Schématisation du dispositif expérimental pour les études en microcosmes... 74Figure III - 9 : Variabilité intra et inter-réacteurs.................................................................. 76Figure III - 10 : Variabilité liée à la méthode de mesure et variabilité intra-réacteurs

des communautés et activités nitritante et nitratante. .................................................... 77Figure III - 11 : Analyse en composante principale des données relatives aux

expériences en microcosmes avec effluent non nitrifié (R) et effluentnitrifié (M), à Tinitial (Ti) et Tfinal (Tf). ...................................................................... 81

Figure III - 12 : Communautés nitritantes (A) et nitratantes (B) et activités nitritantes(C) et nitratantes (D) potentielles dans le sédiment soumis à un effluent non nitrifié..... 83

Figure III - 13 : Rapports MPN nitritants/microflore totale (A) et MPN nitratants/microflore totale (B) dans le cas du sédiment soumis à l’effluent non nitrifié. .............. 83

Figure III - 14 : Communautés nitritantes (A) et nitratantes (B) et activités nitritantes (C)et nitratantes (D) potentielles dans le sédiment soumis à l'effluent nitrifié..................... 84

Figure III - 15 : Rapports MPN nitritants/microflore totale (A) et MPN nitratants/microflore totale (B) dans le cas du sédiment soumis à l'effluent nitrifié....................... 85

Figure III - 16 : Communautés nitritantes (A) et nitratantes (B) et activités nitritantes (C)et nitratantes (D) potentielles dans le sédiment soumis au mélange d'effluents.............. 86

Figure III - 17 : Rapports MPN nitritants/microflore totale et MPN nitratants/microfloretotale dans le cas du sédiment soumis au mélange d'effluents. ...................................... 87

Figure III - 18 : Perte (valeur absolue) en azote dans la phase liquide entre l'entrée et lasortie des réacteurs soumis à l'effluent nitrifié à Tf....................................................... 88

Figure III - 19 : Relations entre le pourcentage d'effluent non nitrifié et la densité debactéries nitritantes ou la nitritation potentielle (A), et entre la densité debactéries nitritantes et l'activité nitritante potentielle (B)............................................... 91

Figure III - 20 : Relations entre le pourcentage d'effluent non nitrifié et la densité debactéries nitratantes ou la nitratation potentielle (A), et entre la densité debactéries nitratantes et l'activité nitratante potentielle (B). ............................................ 92

Figure III - 21 : Relations entre le pourcentage d'effluent nitrifié et la densité debactéries nitritantes ou la nitritation potentielle (A), et entre la densité debactéries nitritantes et l'activité nitritante potentielle (B)............................................... 93


Figure III - 22 : Relations entre le pourcentage d'effluent nitrifié et la densité debactéries nitratantes ou la nitratation potentielle (A), et entre la densité debactéries nitratantes et l'activité nitratante potentielle (B). ............................................ 94

Figure III - 23 : Communautés nitritantes et nitratantes déterminées par la technique duMPN-Griess et déduites des mesures d'activités potentielles......................................... 97

Figure III - 24 : Modèle d'impact de rejets nitrifiés et non nitrifiés sur lescommunautés nitrifiantes autochtones et leur activité en sédiment.............................. 101

CHAPITRE IV

Figure IV - 1 : Croissance des souches AG et X14 en culture pure.. .................................... 109Figure IV - 2 : Schématisation d'un batch........................................................................... 111Figure IV - 3 : Évolution des souches de Nitrobacter inoculées dans le sédiment et

cinétique de nitrification dans les batches. .................................................................. 119Figure IV - 4 : Taux de croissance de Nitrobacter au cours des incubations dans les

batches. ..................................................................................................................... 121Figure IV - 5 : Évolution des activités réelles et potentielles au cours des incubations........ 122Figure IV - 6 : Relation entre la densité de Nitrobacter et l'activité nitratante potentielle.... 123Figure IV - 7 : Évolution de l'activité nitratante réelle spécifique et de l'activité

nitratante potentielle spécifique au cours des incubations. .......................................... 124Figure IV - 8 : Dénombrement de Nitrobacter par 3 méthodes : immunofluorescence,

mesure de l'activité potentielle, MPN-Griess. ............................................................. 125

CHAPITRE V

Figure V - 1 : Rendement cumulé des étapes de pré-traitement (dénombrement desbactéries totales par DAPI)......................................................................................... 144

Figure V - 2 : Dosage de l'ADN : Gammes étalons dans différents milieux,pour des concentrations d'ADN de thymus de veau variant de 0 à 1000 ng/ml. ........... 150

Figure V - 3 : Traitement du sédiment pour la détermination des seuils de détectionet rendements des trois méthodes de dénombrement de Nitrobacter. .......................... 157

Figure V - 4 : Détection de Nitrobacter par MPN-PCR (gel d'électrophorèse).................... 158Figure V - 5 : Évolution du nombre de bactéries nitratantes détectées avec la méthode

MPN-Griess au cours du temps d'incubation. ............................................................. 160Figure V - 6 : Détection de Nitrobacter par immunofluorescence : observations au

microscope à épifluorescence d'une culture pure (A), de sédiment stérile réinoculéavec une culture pure (B), d'un sédiment naturel (C). ................................................. 165

LISTE DES ABRÉVIATIONS 9

LISTE DES ABREVIATIONS

ACP analyse en composante principaleADN acide désoxyribonucléiqueADNr acide désoxyribonucléique ribosomiqueADP Adénosine diphosphateAmo Ammonium monooxygénaseARNm acide ribonucléique messagerARNr acide ribonucléique ribosomiqueA-T adénosine-thymineATP adénosine triphosphateC/N rapport carbone organique / azote organiqueCL50 concentration provoquant 50 % de mortalité dans la population étudiée

(concentration létale moyenne)COD carbone organique dissousCorg carbone organiqueCTC 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chlorideD.O. densité optiqueDAPI 4'6-diamidino-2-phenylindoleEcT écart-typeEDTA éthylènediamine tétra-acétateEPS substances polymères extracellulairesFISH fluorescent in situ hybridization (hybridation in situ par oligonucléotides

fluorescents)G-C guanine-cytosineHao hydroxylamine oxydoréductaseIF immunofluorescenceITCF isothiocyanate de fluorescéinekGy kilograyKm constante de Michaélis-MentenM.O. matière organiqueMmo méthane monooxygénaseMPN most probable number (nombre le plus probable)MPN nitratants nombre le plus probable de bactéries nitratantesMPN nitritants nombre le plus probable de bactéries nitritantesNAD nicotinamide adénine dinucléotideNor nitrite oxydoréductaseNorg azote organiqueNOx oxydes d'azotePCR polymerase chain reaction (réaction de polymérisation de l'ADN en chaîne)pH potentiel hydrogènePI-PCR prokaryotic in situ PCRPVPP polyvinylpolypyrrolidoneq.s.p. quantité suffisante pourRFLP restriction fragments length polymorphism (polymorphisme dans la longueur

des fragments de restriction)

LISTE DES ABRÉVIATIONS 10

RuBisCO ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénaseS.E.Q. système d'évaluation de la qualitéSDS sodium dodécyl sulphateStep station d'épurationTBE tris-borate EDTAtr.min-1 tours par minuteTris tris hydro méthyl amino méthaneu.f. unité de fluorescenceU.V. ultra violetvol/vol volume/volume

CHAPITRE I

PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFSDE L'ETUDE

CHAPITRE I : PROBLÉMATIQUE ET OBJECTIFS DE L'ÉTUDE 12

PROBLEMATIQUE ET OBJECTIFS DE L 'ETUDE

L'azote est un élément biogène participant, sous différentes formes, à la structure, aufonctionnement et à la reproduction des êtres vivants. Toutes les formes azotées font partied'un cycle de transformations et de recyclage, au sein duquel le compartiment microbien joueun rôle prépondérant. Au même titre que l'ensemble des cycles biogéochimiques, le bondéroulement du cycle de l'azote est essentiel pour l'équilibre des milieux naturels.En rivière, cet équilibre peut être menacé par des facteurs "exogènes", parmi lesquels lesrejets de stations d'épuration, qui sont des causes locales de perturbations. De façon générale,les rejets de stations d'épuration engendrent des modifications dans le milieu récepteur etbouleversent l'équilibre biologique de l'écosystème. Les perturbations sont de différentsordres (figure I-1) :

- purement physiques et mécaniques : apport de particules, augmentation du débit plusou moins importante en fonction de la taille du rejet et celle de la rivière…

- physico-chimiques : variations de température, pH, conductivité, teneur en oxygènedissous, apport de composés carbonés, azotés et phosphorés, apport d'éléments susceptibles dese révéler toxiques pour les organismes aquatiques.

- biologiques : perturbation des biocénoses découlant des modifications précédentes,apport de micro-organismes.L'amplitude de ces perturbations et la distance nécessaire pour la restauration du milieu et leretour au niveau de qualité amont dépendent de l'état de dégradation du rejet.

Figure I – 1 : Évolution de quelques paramètres physico-chimiques et biologiques en aval d'une

pollution organique.

O2 dissousbactéries

protozoaires

poissons

O2 dissousMESDCO

NH4+

NO2-

NO3-

effluent

distanceaval

effluent

distanceaval

dégradation restauration retour à laqualité amont

dégradation restauration retour à laqualité amont


En ce qui concerne le cycle de l'azote, les rejets de stations d'épuration représentent desapports concentrés d'azote, auxquels les milieux aquatiques sont très sensibles, et quientraînent, selon leur forme chimique et en lien avec les caractéristiques physico-chimiqueslocales de chaque site, une diminution de la qualité des cours d'eau et des phénomènes depollution parfois importants : toxicité pour la faune aquatique (NH4

+, NO2

-) (Eddy et Williams,1994 ; Garric, 1987), gène aux traitements de potabilisation (NH4

+, NO2

-) (Houel et al., 1982),eutrophisation (NO3

- + PO4

3-) (Capblancq et Dauta, 1990 ; Heathwaite, 1993), consommationaccrue d'oxygène liée à la nitrification (Déri, 1991 ; Lipschultz et al., 1986 ; Pakulski et al.,1995)…Ces effluents de stations d'épuration véhiculent également des quantités importantes demicroorganismes qui se développent au sein des systèmes de traitement des eaux, parmilesquels des bactéries intervenant dans le cycle de l'azote, et représentent un inoculumpotentiel pour le milieu récepteur.

La question de la limitation des effets des pollutions azotées par les stations d'épuration peuts'aborder de deux façons :

- réduire les apports azotés en améliorant les traitements de l'azote en stationd'épuration (systèmes de nitrification/dénitrification)

- compter sur l'auto-épuration de l'azote dans les cours d'eau, c'est à dire les processusspontanés de nitrification puis de dénitrification.La nitrification est le lien biologique entre la forme réduite (NH4

+) et les formes oxydées(NO2

-, NO3-) de l'azote, ces dernières pouvant être élimées du milieu sous forme gazeuse par

dénitrification. Alors qu'un grand nombre de bactéries est capable de dénitrifier, lanitrification est effectuée par un petit nombre de bactéries spécialisées dans cette fonction etreprésente généralement l'étape limitante de l'auto-épuration de l'azote.La compréhension du processus de nitrification, dans ces conditions particulières de rivièresoumise à un rejet de station d'épuration, est donc indispensable, quelle que soit la démarcheentreprise pour une gestion efficace des cours d'eau et des dispositifs de traitement des eauxusées.Alors que de nombreux travaux relatifs à l'ingénierie du traitement de l'azote ont été publiés,mentionnant parfois des taux de nitrification/dénitrification très élevés (par exemple :Collivignarelli et Bertanza, 1999 ; Pochana et Keller, 1999), peu de travaux publiésconcernent l’impact des rejets de ces ouvrages sur la nitrification dans le milieu récepteur(Brion, 1997 ; Colombini, 1996). Nous nous sommes donc intéressés à ce second aspect, ennous attachant à tenter de mieux comprendre le processus de nitrification et le comportementde la communauté nitrifiante dans ce contexte.En effet, dans les milieux aquatiques, seuls les aspects physico-chimiques du processus denitrification sont bien connus, et peu d’études ont été effectuées sur les organismes nitrifiantseux-mêmes, vraisemblablement faute de disposer de techniques fiables et précises d’étude descommunautés nitrifiantes. La plupart des données relatives à la nitrification en rivière sont desbilans établis sur des tronçons de grande longueur par simple analyse des formes de l’azote(Botermans et Admiraal, 1989 ; Scott et Abumoghli, 1995).


Dans les milieux aquatiques, les bactéries nitrifiantes sont essentiellement fixées sur unsupport et sont véhiculées dans l’eau par les particules en suspension ; le compartimentsédimentaire, au niveau de son interface avec la colonne d'eau, est le siège du processus denitrification (Admiraal et Botermans, 1989 ; Gresikowski et al., 1996 ; Hall, 1986 ; Stehr etal., 1995). Nous avons ciblé notre travail sur ce compartiment physique, où des premiersrésultats sur l'impact de rejets de stations d'épuration sur les communautés nitrifiantesfonctionnelles ont déjà été obtenus : la comparaison des densités et activités de bactériesnitritantes et nitratantes en amont et en aval de rejets de stations d'épuration sur différentesrivières a montré un effet de ces rejets sur les activités potentielles, alors que, avec les moyensanalytiques utilisés, peu de différences entre amont et aval ont été observées sur les densitésdes communautés (Montuelle et al., soumis).D'autres travaux, entrepris sur le devenir de Nitrobacter (genre étudié comme modèle de lanitratation, 2ème étape de la nitrification) en rivière après un rejet de station d’épuration, ontétabli que :

- de nombreux Nitrobacter sont généralement présents dans les effluents de stationsd’épuration (Bonnet et al., 1997 ; Montuelle et al., 1996).

- ces Nitrobacter "acclimatés" à la station survivent au stress que représente leurévacuation dans le milieu récepteur. Ils sont fixés à des particules, et sont retrouvés dans leszones sédimentaires où ils se réimplantent (Bonnet et al., 1997), plutôt qu’au niveau desbiofilms épilithiques (Montuelle et al., 1996).

- la composition qualitative (sérotypie) et quantitative des peuplements de Nitrobacteraccompagnant les rejets de station n’est pas en relation avec la granulométrie des particulessur lesquelles ceux-ci sont fixés (Bonnet et al., 1997).Tous ces travaux (sur le terrain et au laboratoire) mettent en évidence un effet des rejets destation d'épuration sur la nitrification (activité, densité et diversité des bactéries nitrifiantes)dans le milieu récepteur. Cependant, les limites des méthodes d'étude (concernantessentiellement le dénombrement des communautés et populations) n'ont jusqu'à présent paspermis de qualifier de façon précise ces effets, notamment en terme de modification ou non dela structure des communautés nitrifiantes.

Différents niveaux d'étude (du terrain à la culture pure) sont possibles pour compléter lesconnaissances sur l'écologie de la nitrification et pour appréhender l'impact de rejets destations d'épuration sur la nitrification. Chaque niveau répond à des objectifs différents(depuis l'effet global jusqu'au mécanisme du processus), et met en œuvre des outilsanalytiques différents.

• Des études "de terrain" permettent notamment de mettre en évidence des différencesamont/aval d'un rejet de station d'épuration. Elles peuvent rendre compte d'un effet global durejet, intégrant tous les paramètres du milieu et ceux liés au rejet. Ceci peut néanmoinsdevenir un inconvénient car il est impossible de dissocier les facteurs susceptibles d'influencerces éventuelles différences amont/aval. De plus, la variabilité spatiale et temporelle inhérenteau terrain requiert une optimisation de la stratégie d'échantillonnage (Baleux et Trousselier,1982 ; Palmer et al., 1997). Quant aux mesures in situ, activité réelle et taille des


communautés ne peuvent pas, à l'heure actuelle, être déterminées de façon précise, faute deméthodes fiables disponibles.

• Des études en pilotes expérimentaux (ou microcosmes) permettent de s'affranchir descontraintes du terrain en contrôlant certains paramètres. Les techniques nécessaires demesures de l'activité nitrifiante et de la taille des communautés associées, sont identiques àcelles requises sur le terrain.

• Une simplification plus poussée des milieux naturels est l'étude en systèmes statiques (ou"batches"), avec utilisation de souches modèles dont les caractéristiques physiologiques sontdéjà connues. Ce type de systèmes permet le contrôle de l'ensemble des paramètres du milieu,et des outils existants sont directement applicables (immunofluorescence notamment, pour ladétection des souches étudiées).

• Enfin, des travaux sur cultures pures, après isolement de souches naturelles, sont nécessairespour l'étude des processus au niveau cellulaire dans des conditions définies, et pour laconnaissance de la physiologie des bactéries. L'utilisation de cultures pures est également uneétape indispensable pour la mise au point et la validation de nouveaux outils d'étude descommunautés. Le risque, dans ce cas, est la difficulté d'extrapolation au terrain.

Quel que soit le niveau d'étude, il apparaît clairement que les techniques de mesure de la tailledes communautés nitrifiantes totales et fonctionnelles et d'étude de la diversité in situdemeurent à améliorer.

En nous appuyant sur les résultats de la littérature, nous avons choisi d’étudier l’impact derejets de station d’épuration sur la dynamique de communautés nitrifiantes (densité, diversité,activité) dans le compartiment sédimentaire du milieu récepteur, et orienté nos travaux versles questions suivantes :

- Quelle est la modification globale de la nitrification en rivière en aval d'un rejet destation d’épuration ?

- Quels sont les paramètres liés aux effluents de stations d'épuration qui influencent lescommunautés nitrifiantes et leur activité ? Comment les influencent-ils ?

- Comment les bactéries nitrifiantes autochtones réagissent-elles à un apport d'effluentde station d'épuration ? Les bactéries nitrifiantes apportées par l’effluent survivent-elles etsont-elles actives dans la rivière ? Existe-t-il des compétitions entre souches (ou sérotypes)autochtones et souches apportées par l'effluent (qui pourraient justifier d'éventuelles variationsd'activités) ?

- Des modifications de structure des communautés de bactéries nitrifiantes entraînent-elles des variations d’activité ?

Afin de tenter de répondre à nos questions, après une étude bibliographique sur le processusde nitrification dans les milieux d'eau douce (chapitre II), deux principaux types de travauxont été engagés :

1- un approfondissement de la connaissance du processus de nitrification dans lecompartiment sédimentaire, dans la situation particulière d'une rivière recevant un effluent


"nitrifié" ou "non nitrifié" de station d'épuration. Ces travaux ont été réalisés au moyen demicrocosmes et de batches.L'étude en microcosmes a pour objectif de différencier, pour chacune des 2 étapes de lanitrification, l'effet substrat (apport de NH4

+ notamment) de l'effet inoculum (apport debactéries nitrifiantes) d'un rejet de station d'épuration (chapitre III).Les expérimentations en batches ont pour objectif l'étude du comportement de souches denitratants dans différentes conditions de milieu, et d'une éventuelle compétition entre cessouches, le genre Nitrobacter étant choisi comme modèle (chapitre IV).

2- des mises au points et adaptations méthodologiques d'outils nécessaires à l'étude dela nitrification in situ, notamment des outils de détection et de dénombrement des bactériesnitrifiantes utilisant des techniques de biologie moléculaire (chapitre V).

CHAPITRE II

NITRIFICATIONDANS LES MILIEUX D 'EAU DOUCE :

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

CHAPITRE II : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE 18

NITRIFICATION DANS LES MILIEUX D 'EAU DOUCE :ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE

1 L’AZOTE EN MILIEU AQUATIQUE ......................................................................... 20

1.1 CYCLE DE L’AZOTE ............................................................................................................ 20

1.2 L'AZOTE DANS LES MILIEUX D ’EAU DOUCE ANTHROPISÉS ....................................................... 21

1.2.1 Origine des pollutions azotées................................................................................. 211.2.2 Conséquences des pollutions azotées..................................................................... 22

1.2.2.1 Pollution par l’ammoniaque ..............................................................................................221.2.2.2 Pollution par les nitrates et nitrites ....................................................................................23

1.2.3 Production d’oxydes d’azote par les milieux aquatiques........................................... 231.3 LA NITRIFICATION : ÉTAPE CLÉ DU CYCLE DE L 'AZOTE............................................................ 24

2 NITRIFICATION ET BACTÉRIES NITRIFIANTES ........................................................ 25

2.1 BACTÉRIES NITRIFIANTES LITHOTROPHES ............................................................................. 25

2.1.1 Taxonomie .............................................................................................................. 252.1.2 Phylogénie .............................................................................................................. 272.1.3 Sérotypie................................................................................................................. 28

2.2 MÉTABOLISME NITRIFIANT .................................................................................................. 29

2.2.1 Métabolisme énergétique ........................................................................................ 292.2.1.1 Oxydation de l’ammonium................................................................................................292.2.1.2 Oxydation du nitrite ..........................................................................................................302.2.1.3 Métabolisme anaérobie....................................................................................................32

2.2.2 Assimilation du carbone .......................................................................................... 322.2.2.1 Métabolisme autotrophe...................................................................................................322.2.2.2 Métabolismes mixotrophique et hétérotrophique ...............................................................32

2.2.3 Capacité de co-métabolisme ................................................................................... 332.3 CARACTÉRISTIQUES DE CROISSANCE DES BACTÉRIES NITRITFIANTES EN CULTURE ................... 34

2.4 FACTEURS DU MILIEU INFLUENÇANT LA CROISSANCE ET L ’ACTIVITÉ DES BACTÉRIESNITRIFIANTES..................................................................................................................... 35

2.4.1 Teneur en oxygène dissous..................................................................................... 352.4.2 Température ........................................................................................................... 362.4.3 pH........................................................................................................................... 362.4.4 Concentration en substrat et en produit d’oxydation................................................. 372.4.5 Composés organiques............................................................................................. 372.4.6 Lumière................................................................................................................... 372.4.7 Attachement aux surfaces et agrégation.................................................................. 37

2.5 NICHES ÉCOLOGIQUES DES BACTÉRIES NITRIFIANTES CHIMIOLITHOTROPHES ............................ 37

2.6 INTERACTIONS NITRIFICATION-DÉNITRIFICATION .................................................................... 38

2.7 AUTRES PROCESSUS D'OXYDATION DE L'AMMONIUM.............................................................. 39

2.7.1 Nitrification par des microorganismes hétérotrophes................................................ 392.7.2 Oxydation de l'ammonium par des bactéries méthanotrophes.................................. 40

3 TECHNIQUES D'ÉTUDE DES BACTÉRIES NITRIFIANTES ET DE LEUR ACTIVITÉ ........... 41

3.1 BACTÉRIES NITRIFIANTES ................................................................................................... 41

3.1.1 Isolement ................................................................................................................ 413.1.2 Culture .................................................................................................................... 413.1.3 Dénombrement ....................................................................................................... 42

3.1.3.1 Méthodes classiques : MPN, immunofluorescence, activité potentielle...............................423.1.3.2 Nécessité de techniques de biologie moléculaire ..............................................................43


3.2 ACTIVITÉ NITRIFIANTE ........................................................................................................ 44

3.2.1 Dosage des différentes formes inorganiques de l’azote ........................................... 443.2.2 Inhibiteurs de la nitrification ..................................................................................... 45

3.2.2.1 Inhibiteurs de la nitritation ................................................................................................453.2.2.2 Inhibiteurs de la nitratation ...............................................................................................46

3.2.3 Mesure des processus de nitrification...................................................................... 46

4 NITRIFICATION DANS LES MILIEUX D 'EAU DOUCE SUPERFICIELS ............................ 48

4.1 BACTÉRIES NITRIFIANTES EN MILIEU AQUATIQUE ................................................................... 484.1.1 Quels sont les genres concernés ?.......................................................................... 484.1.2 Quelle est leur localisation ?.................................................................................... 49

4.1.2.1 Nitrification et biofilms ......................................................................................................494.1.2.2 Nitrification et particules ...................................................................................................49

4.2 NITRIFICATION DANS LES MILIEUX NATURELS NON ANTHROPISÉS ............................................ 504.2.1 Lacs ........................................................................................................................ 504.2.2 Rivières................................................................................................................... 52

4.3 MILIEUX ANTHROPISÉS ....................................................................................................... 53

4.3.1 Impact des activités humaines sur la nitrification...................................................... 534.3.2 Traitement des eaux résiduaires.............................................................................. 55

4.4 LA NITRIFICATION COMME INDICATEUR DE PERTURBATION OU DE TOXICITÉ ............................... 56


1 L’ AZOTE EN MILIEU AQUATIQUE

1.1 CYCLE DE L’AZOTE

L’azote est présent à différents degrés d’oxydation dans la nature, et le va-et-vient entre lesformes les plus oxydées et les plus réduites (tableau II-1) est appelé couramment cycle del’azote.

Tableau II - 1 : Formes inorganiques du cycle de l'azote et leur degré d'oxydation.

NO3-

NO2-

NO

N2O

N2

NH3 (NH4+)

+5

+3

+2

+1

0

-3

nitrate

nitrite

oxyde nitrique

oxyde nitreux

diazote

ammoniac / ammonium

L’azote est soumis à des cycles d’assimilation, minéralisation, oxydation, réduction, qui sontle fait d’organismes animaux et végétaux, ainsi que de micro-organismes (Heathwaite, 1993)(figure II-1).

Figure II - 1 : Cycle de l'azote en milieu aquatique.


Dans les milieux d'eaux douces superficielles non anthropisées, les origines "endogènes"d'azote sont les formes organiques provenant de cadavres et déjections. Il faut y ajouter lesvégétaux de la ripisylve (1) en décomposition. La principale source "exogène" est la fixation del’azote moléculaire par des organismes procaryotiques (plus particulièrement, desCyanobactéries hétérocystées, des bactéries photosynthétiques et des bactéries hétérotrophes).Les pertes d’azote se font sous les formes NO, N2O et N2, essentiellement par dénitrification.

1.2 L'AZOTE DANS LES MILIEUX D ’EAU DOUCE ANTHROPISÉS

1.2.1 Origine des pollutions azotées

Dans les rivières anthropisées, d'autres sources "exogènes" d'azote viennent s'ajouter auxsources naturelles. Ces apports peuvent être diffus ou locaux (Heathwaite, 1993).

Parmi les apports diffus, citons :- la déposition et l'entraînement par l'eau de pluie de gaz et aérosols contenant de

l'azote minéral (ammoniac et oxydes d'azote), produits par l'industrie (par combustion decarburants fossiles, incinération d'ordures…) et la décharge de composés agricoles (Longhurstet al., 1993 ; Seitzinger et Kroeze, 1998).

- le ruissellement et le lessivage de sols agricoles fertilisés ou de zones de stockaged'excréments animaux, qui apportent essentiellement les formes ammoniaque et nitrate (Krug,1993). L’ion NH4

+ est considéré comme peu mobile dans la plupart des sols car il estfacilement adsorbé dans les sols argileux et contenant beaucoup de matière organique ; ildevient cependant plus mobile dans les sols sableux ou ayant peu de matière organique, etsuite à un lessivage de ces sols. L’ion NO3

- est la forme la plus hydrosoluble de l’azote, et iln’est pas facilement adsorbé sur les particules de sol. Sa présence est étroitement liée auxcycles hydrologiques et il peut être rapidement déplacé par l’action lessivante de l’eauinfiltrante.

Les apports ponctuels concernent essentiellement :- les industries produisant des émissions d'ammoniaque ou en contenant dans leurs

effluents (exploitation du charbon, raffinerie du pétrole, métallurgie, synthèses chimiques,traitement des gaz…) et les industries utilisant les nitrates dans leurs procédés de fabricationet en rejetant dans les eaux (salaison des viandes, production de fertilisants, d'explosifs, deverre…).

- les systèmes de traitement des eaux usées et by-pass des stations d'épuration (enpériode de fortes précipitations), rejetant de l'azote organique et minéral (notamment sous lesformes NH4

+ et NO3-) (Krug, 1993).

(1) Le terme de ripisylve désigne "des écosystèmes forestiers qui croissent le long des fleuves…" (Ramade,1998)


1.2.2 Conséquences des pollutions azotées

Le cycle de l’azote, comme les cycles des autres éléments, est normalement équilibré.Cependant, il peut être, délibérément ou par inadvertance, perturbé par des activités agricolesou industrielles, ou par des causes naturelles. Le résultat est une accumulation indésirabled’intermédiaires du cycle, qui peuvent entraîner un déséquilibre écologique, et dont certainssont toxiques à faible concentration (Heathwaite, 1993 ; Kuenen et Robertson, 1988).L’impact et la toxicité des composés azotés dépendent de leur forme chimique et de leurconcentration. Les concentrations correspondant à différents niveaux de pollution sontrépertoriées dans le tableau II-2.

Tableau II - 2 : Grille pour les niveaux de pollution par les formes de l’azote (Agence de

l’Eau Rhône Méditerranée Corse, 1995).

Formes de

l’azote

NOsituationnormale

N1pollutionmodérée

N2

pollution nette

N3pollution

importante

N4pollution trèsimportante

NH4+

(mg/l)≤ 0.1 0.1 à 0.5 0.5 à 2 2 à 8 > 8

NO2-

(mg/l)≤ 0.1 0.1 à 0.3 0.3 à 1 1 à 2 > 2

NO3-

(mg/l)≤ 5 5 à 25 25 à 50 50 à 80 > 80

N Kjeldahl(mgN/l)

≤ 1 1 à 2 2 à 3 3 à 10 > 10

1.2.2.1 Pollution par l’ammoniaque

SantéLa molécule NH4

+ est un élément nutritif nécessaire à la vie. Cependant, si l’ammonium estdisponible en excès, la forme ammoniaque libre (NH3) peut s’accumuler dans l’organisme etcauser des effets néfastes.L’ammoniaque est un irritant qui affecte souvent les yeux, le nez, la gorge et les poumons.S’il est ingéré, il corrode les parois de la bouche, l’oesophage et l’estomac.

EnvironnementDes niveaux d’ammoniaque excessifs peuvent être néfastes à la vie aquatique.Les poissons peuvent souffrir d’une perte d’équilibre, d’hyperexcitabilité, d’une augmentationde l’activité respiratoire et de la consommation d’oxygène, d’une augmentation du rythmecardiaque. Des effets sublétaux divers peuvent apparaître : réduction du succès d’éclosion,réduction du taux de croissance et du développement morphologique, lésion des branchies, dufoie, des reins... À des niveaux extrêmes en ammoniaque, ils peuvent souffrir de convulsions,suivies de coma et de mort. La concentration létale (CL50 96h) pour un certain nombred’espèces de poissons varie entre 0.2 et 1.1 mg NH3/l pour les salmonidés et entre 0.75 et 3.4mg NH3/l pour les cyprinidés (Garric, 1987).


1.2.2.2 Pollution par les nitrates et nitrites

SantéLes nitrates ne présentent par eux-mêmes aucun danger pour les organismes, mais leurréduction peut s’opérer par les bactéries intestinales qui en font des nitrites, beaucoup plusnocifs. En effet, ils pénètrent dans le sang et oxydent l’hémoglobine en methémoglobine,laquelle est inactive comme transporteur d’oxygène. Les nourrissons constituent le groupe leplus exposé, car ils possèdent encore une forte proportion d’hémoglobine foetale, qui est plussensible à l’oxydation par les nitrites, et leur suc gastrique, moins acide, favorise laprolifération des bactéries réduisant les nitrates en nitrites (Mackerness et Keevil, 1991 ;Pelmont, 1993). Par ailleurs, la modification de produits azotés par les nitrites aboutit à laformation de nitrosamines, qui réagissent facilement avec les bases des acides nucléiques etsont fréquemment des agents mutagènes ou cancérigènes (Pelmont, 1993).

EnvironnementOutre une toxicité des nitrites pour la faune aquatique (Eddy et Williams, 1994), le risqueenvironnemental associé aux nitrates et nitrites est aussi lié à l’enrichissement en élémentsnutritifs qu’ils représentent. En effet, la croissance des macrophytes et du phytoplancton eststimulée essentiellement par les éléments nutritifs tels que le phosphore et l’azote.Généralement, le phosphore est l’élément limitant dans les systèmes d’eau douce (exceptédans les zones estuariennes où l’azote est l’élément limitant). Mais dans de nombreux cas, lesmilieux aquatiques sont soumis à des sources exogènes d’azote et de phosphore, ce qui peutconduire à une production primaire très importante (Capblancq et Dauta, 1990 ; Heathwaite,1993). C'est le phénomène d’eutrophisation, qui a pour conséquences :

- une perte des usages récréatifs due à l’odeur et à la couleur de l’eau en raison de laprolifération d’algues suivie de leur dégradation

- un déficit en oxygène en profondeur, dû à la dégradation des végétaux morts ettombés au fond, par des processus microbiens nécessitant de l’oxygène. Ceci perturbe la vieaquatique, et peut conduire à une perte de diversité, notamment chez les invertébrésbenthiques et les poissons

- un "bloom" d’algues toxiques pour les poissons planctonophages (Cyanophycées)(Codd, 1984)

- un bloom d’algues formant une croûte à la surface de l’eau, empêchant la pénétrationde la lumière, et par conséquent, toute photosynthèse et productivité (Dennison et al., 1993).

1.2.3 Production d’oxydes d’azote par les milieux aquatiques

Les milieux aquatiques (comme les milieux terrestres) sont également le siège d’uneproduction d’oxydes d’azotes (NO, N2O), qui jouent un rôle important dans le cyclestratosphérique de l’ozone et l’effet de serre, et dont la réaction avec des composés organiquesvolatiles contribue également à l’accumulation d’ozone troposphérique (Abeliovich, 1992).


Ces oxydes d'azote (NOx) sont formés par les bactéries impliquées dans le cycle de l’azote viales processus de dénitrification (Knowles, 1982), nitrification (Goreau et al., 1980 ; Poth etFocht, 1985) et réduction dissimilative du nitrate en ammonium (Smith et Zimmerman, 1981).La nitrification par des bactéries méthanotrophes (Roy et Knowles, 1994) (§ 2.7.2) produitégalement de petites quantités de N2O durant l’oxydation du NH4

+ (Knowles, 1985).Cette production biologique d'oxydes d'azotes est en augmentation et est à relier aux apportscroissants, directs ou indirects via le lessivage des sols ou la déposition atmosphérique, decomposés azotés d’origine anthropique dans les milieux aquatiques (Kroeze et Seitzinger,1998).

1.3 LA NITRIFICATION : ÉTAPE CLÉ DU CYCLE DE L 'AZOTE

L’ammonium, le nitrite et le nitrate sont chimiquement stables, et leur transformation dans lanature est majoritairement catalysée biologiquement, par des bactéries dont les activitésdéterminent la distribution des composés azotés. La nitrification est la conversion biologiquede la forme réduite, NH4

+, en la forme oxydée NO3-. Elle n’a pas d’impact sur le bilan global

des écosystèmes, puisqu’elle n’ajoute ni élimine de l’azote, mais elle change uniquement sondegré d’oxydation. C’est en cela qu’elle est d’une importance capitale dans les écosystèmes,puisqu’elle est le lien entre les formes réduites et oxydées du cycle de l’azote. Elle permetl’oxydation de l’ammonium (produit par les hétérotrophes lors de la décomposition de lamatière organique), le liant ainsi à la dénitrification. Elle est par conséquent l'intermédiaireentre la décomposition de la matière organique et la perte d’azote fixé dans l’écosystème.La nitrification est donc très impliquée dans le processus d'auto-épuration des rivières, etl'intérêt de l'étudier concerne, outre les aspects fondamentaux liés à la connaissance de sonécologie, le risque de pollution lié à des apports azotés : eutrophisation, toxicité, ... Il fautcependant également tenir compte de la consommation d'oxygène liée aux réactionsd'oxydation de la nitrification ; le déficit en oxygène engendré pouvant être quantitativementimportant (Déri, 1991 ; Lipschultz et al., 1986 ; Pakulski et al., 1995) et certainement avoirdes effets sur la diversité des biocénoses des milieux.Il est par conséquent impératif de comprendre les facteurs et mécanismes qui régissent cetteactivité, ainsi que le comportement des communautés microbiennes impliquées.

Une étude écologique de la nitrification, en milieu d'eau douce comme dans tout autre milieunaturel, nécessite préalablement de connaître davantage la biologie des micro-organismesimpliqués dans ce processus, et les moyens de les étudier, notamment au point de vuedénombrement et activité. Nous aborderons donc successivement les connaissancesfondamentales sur les bactéries nitrifiantes et les techniques disponibles pour en étudier ladensité, la diversité et l'activité, puis l'état des connaissances sur l'écologie de la nitrificationdans les environnements aquatiques continentaux.


2 NITRIFICATION ET BACTERIES NITRIFIANTES

Deux types de nitrification doivent être distingués (Bock et al., 1991) :- la nitrification lithotrophe, caractérisée par l'utilisation de substrats inorganiques

comme source d'énergie pour la croissance, concerne deux groupes de bactéries spécialiséesdans cette fonction.

- la nitrification hétérotrophe est une cooxydation non couplée à une productiond'énergie, et qui concerne divers groupes de bactéries, champignons, et quelques algues.

La nitrification hétérotrophe étant encore assez mal connue, nous considérerons par la suiteuniquement les bactéries nitrifiantes lithotrophes (excepté dans le § 2.7).

2.1 BACTÉRIES NITRIFIANTES LITHOTROPHES

Elles se composent de deux groupes physiologiques de bactéries, qui ne sont pas liésphylogénétiquement :

- un groupe oxyde l’ammonium en nitrite : ce sont les bactéries nitritantes (ounitrosantes, ou nitreuses), dont les noms de genres portent le préfixe "nitroso".

- un groupe oxyde le nitrite en nitrate : ce sont les bactéries nitratantes (ou nitriques),dont les noms de genres portent le préfixe "nitro".Dans la nature comme dans les cultures, beaucoup de bactéries nitrifiantes se présentent enagrégats, sous forme de zooglées ou de cystes. Ceci est notamment le cas en stationd’épuration, où elles ont une propension à s’attacher à des surfaces et à croître en amas serrés(ou "clusters") (Watson et al., 1989).

2.1.1 Taxonomie

Ce sont des bactéries Gram négatif, de petite taille (de l’ordre du µm), de mobilité variable,appartenant à la famille des Nitrobacteraceae (Watson et al., 1989).Les cellules ont des formes de baguette, de sphère, d’ellipse, de lobe... La plupart possèdentdes membranes intracytoplasmiques disposées en arrangements divers. Elles peuvent êtremobiles ou non, à l’aide de flagelles.Les souches sont attribuées à des genres tout d’abord sur la base de caractéristiquesmorphologiques (tableau II-3). Ainsi, des souches d’une espèce donnée, phénotypiquementsimilaires, peuvent être génétiquement différentes (Woese et al., 1984).

Le groupe des nitritants réunit les genres Nitrosomonas (10 espèces), Nitrosococcus (3espèces), Nitrosospira (5 espèces), Nitrosolobus (2 espèces) et Nitrosovibrio (2 espèces).Le groupe des nitratants renferme les genres Nitrobacter (4 espèces), Nitrospina (1 espèce),Nitrococcus (1 espèce) et Nitrospira (1 espèce). (Pour revue, voir Bock et al., 1989)


Tableau II - 3 : Différenciation des genres de la famille des Nitrobacteraceae (d'après Watson et al.,

1989).

Caractéristiques

Nitr

oso

mo

na

s

Nitr

oso

cocc

us

Nitr

oso

spira

Nitr

oso

lob

us

Nitr

oso

vib

rio

Nitr

ob

acte

r

Nitr

osp

ina

Nitr

oco

ccu

s

Nitr

osp

ira

Oxydation NH3 → NO2

- + + + + + - - - - NO2

- → NO3- - - - - - + + + +

Forme cellulaire bâtonnet droit + - - - - + + - - coque - + - - - - - + - hélice - - + - - - - - + bâtonnet incurvé - - - - + - - - - lobe - - - + - - - - -Reproduction fission binaire uniquement + + + + + - + + + bourgeonnement (autotrophie) oubourgeonnement / fission binaire(hétérotrophie)

- - - - - + - - -

Mobilité D + D + + D - + -Présence de cytomembranes + + - + - c + - b + -Nature des cytomembranes périphériques + De - - - + d - - - arrangements aléatoires - - - - - - - + - centrales - De - - - - - - - tubulaires - - - - - - - + - lamellaires + De - - - + - - - internes, compartimentant la cellule - - - + - - - - -Chimiohétérotrophie facultative D - - -Contenu de l'ADN en G+C (mol%) 45-54 48-51 53-55 53-56 54 60-62 58 51 50Symboles :- = 90% des souches ou plus sont négatives+ = 90% des souches ou plus sont positivesD = variable suivant les taxonsb invaginations occasionnelles de la membrane plasmique dans le cytoplasme, de type "blebs"c invaginations occasionnelles de la membrane plasmiqued uniquement dans la région polaire de la cellulee en amas centraux parallèles ou en arrangements lamellaires périphériques

Les genres les plus fréquemment étudiés sont Nitrosomonas et Nitrobacter :

Genre Nitrosomonas- forme de bâtonnet, voire ellipsoïdale, et parfois coquoïde- multiplication par fission binaire- membranes intracytoplasmiques, formées semble-t-il par des invaginations de la membranecytoplasmique, disposées dans les régions périphériques du cytoplasme ; celles-ci renfermantégalement des inclusions de type carboxysomes et granules de polyphosphate- certaines cellules mobiles grâce à un flagelle polaire.- contenu en G+C : 45 à 54 mol%- temps de génération : 8 h et plus (Bock et al., 1986)


Genre Nitrobacter- forme caractéristique de poire ou raquette- 0.5 à 0.8 µm de largeur et 1 à 2 µm de longueur- multiplication par bourgeonnement- certaines cellules mobiles grâce à un unique flagelle subterminal ou latéral (Watson et al.,1989).- enveloppe cellulaire différente de celle trouvée chez les autres bactéries Gram - : la paroiexterne est bipartite, avec une couche interne plus dense aux électrons que la couche externe(Bock et al., 1986).- membranes intracytoplasmiques formant une calotte polaire composée de 4 à 6 couches dedoubles membranes- dans le cytoplasme, présence de glycogène, carboxysomes, polyhydroxybutyrates,polyphosphates (Bock et al., 1989)- contenu en G+C : 60 à 62 mol%- temps de génération : 10 à 140 h et plus selon les conditions de culture (Bock et al., 1990)

2.1.2 Phylogénie

Les approches moléculaires, et notamment le séquençage des acides nucléiques, procurent desinformations plus précises que la phénotypie, qui repose sur la physiologie bactérienne. Cesméthodes moléculaires sont par ailleurs plus informatives sur les relations évolutives (Woese,1987).Les séquences d’ARNr 16S ont été utilisées pour établir les relations phylogénétiques de cesbactéries (Teske et al., 1994).Toutes les bactéries nitrifiantes font partie des Protéobactéries, large groupe bactérien dontl’ancêtre présumé est photosynthétique (Teske et al., 1994 ; Woese, 1994). La famille desNitrobacteraceae est polyphylétique, puisque les bactéries nitrifiantes se répartissent parmi lesquatre subdivisions des Protéobactéries (figure II-2).Les nitritants constituent un groupe lié dans la subdivision β, à l’exception d’une espèce dugenre Nitrosococcus (subdivision γ) (Woese, 1987).Les nitratants se trouvent dans les subdivisions α, γ, δ. Le genre Nitrobacter forme un grouped’espèces étroitement liées dans la subdivision α, proche d’espèces appartenant aux genresBradyrhizobium, Rhodopseudomonas et Afipia.


Figure II - 2 : Arbre phylogénétique des Protéobactéries (Teske, 1994).

2.1.3 Sérotypie

Afin d'étudier la diversité intra-spécifique, ont été développées des techniques sérologiques.Elles sont basées sur la capacité des constituants chimiques des cellules bactériennes (flagelle,pili, paroi, membrane cytoplasmique, capsule, couche lipopolysaccharidique) de se comportercomme des antigènes, c'est à dire d'impliquer la production d'anticorps lors de leur injection àdes animaux.On appelle sérotypes, des souches d'un même genre bactérien, sérologiquement différentes(c'est à dire entraînant la production d'anticorps différents chez les animaux infectés).Chez Nitrobacter, les techniques sérologiques (Fliermans et al., 1974 ; Josserand, 1983 ;Schmidt, 1974) ont permis de différencier de nombreuses souches.


2.2 METABOLISME NITRIFIANT

Les bactéries nitrifiantes ont un métabolisme autotrophe (2), tirant leur énergie de l'oxydationde l'ammonium ou du nitrite, et assimilant le CO2 via le cycle de Calvin. Longtempsconsidérées comme exclusivement lithoautotrophes (2), certaines de ces bactéries sontcependant capables, dans certaines conditions, d'assimiler des composés organiques, grâce àdes métabolismes mixotrophes (3), voire hétérotrophes (4) : l’unique source d’énergie estl’ammonium ou le nitrite, et le CO2 et des composés organiques sont des sources de carbone(Bock, 1976 ; Krümmel et Harms, 1982).

2.2.1 Métabolisme énergétique

En culture pure, les bactéries nitrifiantes oxydent leur substrat selon la cinétique de Michaëlis-Menten. Les nitritantes et nitratantes présentent respectivement des activités spécifiques de0.9 à 31.3 et de 5.1 à 42 fmol NO2

- ou NO3- produit.cell-1.h-1 (tableau II-5).

2.2.1.1 Oxydation de l’ammonium

Elle se déroule en deux étapes :- oxydation de l’ammonium en hydroxylamine, catalysée par une ammonium

monooxygénase (Amo) localisée dans la fraction membranaire de la bactérie (Tsang etSuzuki, 1982) (tableau II-4). NH3 plutôt que NH4

+ serait le substrat de l’Amo (Bédard etKnowles, 1989 ; Bock et al., 1991). En effet, les valeurs de Km pour l’oxydation du NH3 /NH4

+ diminuent considérablement (ce qui signifie que l’affinité pour le substrat augmente)lorsque le pH augmente de 6.5 à 9.1 (or nous savons que l'équilibre NH4

+/NH3 est déplacévers la forme non ionisée lorsque le pH augmente) (Suzuki et al., 1974). La découverte de lalocalisation de l’Amo au niveau de la membrane bactérienne (Tsang et Suzuki, 1982) conduità la même déduction, car les membranes sont très perméables à la forme NH3 non chargée.

- oxydation de l’hydroxylamine en nitrite, catalysée par une hydroxylamineoxydoréductase, enzyme périplasmique (Olson et Hooper, 1983 ; Wood, 1986) (tableau II-4).

(2) Les organismes autotrophes sont capables de subvenir à leurs besoins métaboliques à partir de sources dematières nutritives exclusivement minérales. On distingue les phototrophes, qui emploient comme sourced'énergie le rayonnement solaire (photosynthèse), et les lithotrophes (ou lithoautotrophes ou chimio-lithoautotrophes), qui utilisent l'énergie contenue dans certains composés minéraux par des processusd'oxydation (chimiosynthèse). (d'après Pelmont (1993) et Ramade (1998))(3) Les organismes mixotrophes se développent en utilisant à la fois des composés organiques et minérauxcomme sources de carbone et d'énergie (d'après Pelmont (1993)). Dans le cas des bactéries nitrifiantes, certainsauteurs emploient ce terme pour désigner les bactéries qui utilisent l'ammonium ou le nitrite comme seule sourced'énergie, et le CO2 ou le carbone organique comme source de carbone ; d'autres l'emploient pour désigner lesbactéries utilisant alternativement l'oxydation de l'ammonium ou du nitrite et de la matière organique pour leurproduction d'énergie, et le CO2 comme seule source de carbone.(4) Les organismes hétérotrophes utilisent des composés organiques pour en tirer leur énergie et pour édifier leurbiomasse.


Le système d'oxydation est schématisé ci-après (figure II-3).

La réaction d'oxydation globale serait la suivante :

(1) NH3 + 1/2 O2 → NH2OH(2) NH2OH + H2O → HNO2 + 4 H+ + 4 e- + 63.8 kcal(3) 4 H+ + 4 e- + O2 → 2 H2O

Figure II - 3 : Oxydation de l'ammonium et transport d'électrons chez Nitrosomonas (d'après Wood,

1986).

2.2.1.2 Oxydation du nitrite

Cette oxydation s’effectue sans intermédiaire détectable. La forme exacte du substrat estencore inconnue ; il pourrait s’agir de l’ion NO2

-, de l’acide nitrique non dissocié, ou d’uneautre forme (Bock et al., 1986).Le système oxydant le nitrite est localisé au niveau de la face interne des membranescytoplasmiques et des membranes intracytoplasmiques (Sundermeyer et Bock, 1981 ; Tsien etal., 1968). Il comprend notamment la nitrite oxydoréductase (Nor) (Meincke et al., 1992 ;Sundermeyer-Klinger et al., 1984), les cytochromes a1 et c1, une quinone et une NADHdéshydrogénase, nécessaires au transfert d’électrons (Bock et al., 1986) (figure II-4 ; tableauII-4).

La réaction d'oxydation est la suivante :

(1) NO2- + H2O → NO3

- + 2 H+ + 2 e- + 17.5 kcal(2) 2 H+ + 2 e- + 1/2 O2 → H2O

cytoplasme

ammonium monooxygénase

2 e-

4 e-

hydroxylamine oxydoréductase

NH2OH, H2O

NO2-, 5 H+

cytochromec-554

ubiquinone, cyts. b

cytochromec-552

cytochromea

½ O2, 2 H+

H2O

NH3, O2, 2 H+

NH2OH, H2O

2 e-

flux réversed'électrons

NAD+

périplasme membrane cytoplasmique


Figure II - 4 : Oxydation du nitrite et transport d'électrons chez Nitrobacter

(d'après Wood, 1986).

Tableau II - 4 : Caractéristiques des systèmes enzymatiques impliqués dans la nitrification

autotrophe (d'après Bédard et Knowles (1989) ; Bock et al. (1986) ; Hyman et Arp (1995) ;

Sayavedra-Soto et al. (1996) ; Underhill (1990) ; Wood (1986)).

ammoniaquemonooxygénase (Amo)

hydroxylamineoxydoréductase (Hao)

nitrite oxydoréductase(Nor)

localisation membrane périplasme face interne desmembranescytoplasmiques etintracytoplasmiques

nature (structure) protéine contenant ducuivre

structure complexe molybdène-fer-soufre-protéine de type nitrateréductase

donneur d’électrons cytochrome c554 cytochrome c554 ? NO2-

réaction NH3 + ½ O2 → NH2OH NH2OH + H2O→ HNO2 + 4 H+ + 4 e-

NO2- + H2O

→ NO3- + 2 H+ + 2 e-

production d’énergie non oui ouiKM (µg N.ml-1) 1.00 à 3.65 0.69 à 2.80inductible oui oui ouiréversible ouiinhibiteurs acétylène, thiourée, ...

lumière U.V.hydrazine chlorate

lumière bleue et U.V.

cytoplasme

nitriteoxydoréductase

2 e-

2 e-

cytochromec-550

H2O

NO2-, H2O

flux réversed'électrons

NAD+

périplasme membrane cytoplasmique

n H+

NO3-

2 H+

cytochromeoxydase

½ O22 H+

4 H+

ADP, Pi

ATP

2 H+

transportnitrite, nitrate

NO2-

NO3-


2.2.1.3 Métabolisme anaérobie

Lorsque la concentration en oxygène est faible, voire nulle, les bactéries nitritantes etnitratantes sont capables d'inverser leur métabolisme en réduisant les nitrites et nitrates.Ainsi, pour une oxydation de l'ammonium en conditions de faible pression partielle enoxygène, les bactéries nitritantes utilisent l'ammonium comme donneur d'électrons, et lenitrite et l'oxygène comme accepteur d'électrons, et produisent des oxydes nitrique et nitreuxainsi que du diazote (Bock et al., 1995). En raison de la dépendance en oxygène del'ammonium monooxygénase, l'oxydation chimiolithotrophique de l'ammonium en nitrite nesemblait, jusqu'à ces dernières années, pas possible en conditions strictement anoxiques(Laanbroek et Woldendorp, 1995). Cependant, Bock et al. (1995) ont montré queNitrosomonas est capable de dénitrifier en anoxie, utilisant le nitrite comme accepteurd’électrons, et le dihydrogène ou la matière organique comme donneurs d’électrons.L'hydroxylamine oxydoréductase et une nitrite réductase seraient impliquées dans cesprocessus (Hooper, 1989). Plus récemment, Jetten et al. (1999) ont confirmé la capacité debactéries du genre Nitrosomonas à oxyder l'ammonium en conditions strictement anaérobiesen utilisant le nitrite comme accepteur d'électrons.Quant aux bactéries nitratantes, elles sont incapables de croître via une oxydation du nitriteavec le nitrate comme accepteur d'électrons. Dans les environnements anoxiques, et enprésence de composés organiques simples comme l'acétate ou le pyruvate, elles peuventnéanmoins croître par réduction du nitrate en nitrite, puis ammonium, oxydes nitrique etnitreux (Laanbroek et Woldendorp, 1995). Cette réaction est catalysée par la nitriteoxydoréductase (Sundermeyer-Klinger et al., 1984).

2.2.2 Assimilation du carbone

2.2.2.1 Métabolisme autotrophe

Le CO2 est la principale source de carbone ; il est assimilé via le cycle de Calvin grâce à laribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase (RuBisCO). Certains nitrifiants possèdentune RuBisCO soluble, tandis que chez d’autres, elle est liée aux carboxysomes (5) (Bock et al.,1986).

2.2.2.2 Métabolismes mixotrophique et hétérotrophique

Tous les nitritants étudiés jusqu'à présent sont capables de métaboliser des composésorganiques, dans une certaine limite, et en présence de la source d’énergie inorganique. Engénéral, les composés organiques les plus favorables sont l’acétate, le formate, et dans unemoindre mesure, le pyruvate. Cependant, les sources de carbone organique sont incorporées

(5) Les carboxysomes sont des particules pseudocristallines intracellulaires où se trouve stockée la ribulose 1,5bisphosphate carboxylase. (Pelmont, 1993)


N. hamburgensis

N. winogradskyi

N. sp.

NO2-

(g.l-1)

protéines

(mg.l-1)

jours

dans les composés cellulaires en quantité relativement faible par rapport à la principale sourcede carbone, le CO2 (Bock et al., 1991).Quant aux nitratants, ils sont capables de croître mixotrophiquement lorsque le nitrite est laseule source d’énergie, et le CO2 avec des composés organiques sont les sources de carbone.Les modalités de croissance mixotrophique des différentes espèces de Nitrobacter sontvariables (Bock et al., 1986) (figure II-5). Ainsi, chez N. hamburgensis, l'activité de la Norest maximale dans des conditions mixotrophiques (Milde et Bock, 1985).Certaines souches du genre Nitrobacter sont même capables d’une croissancehétérotrophique, avec l’acétate comme source de carbone par exemple. Cette croissance estcependant plus lente que la croissance lithoautotrophique (temps de génération : 30 à 150 h)(Bock et al., 1991).

Figure II - 5 : Consommation du nitrite

() et croissance mixotrophique de

trois espèces de Nitrobacter : ----- N.

hamburgensis, ….. N. winogradskyi,_._._ N. sp. (d’après Bock et al., 1986).

2.2.3 Capacité de co-métabolisme

L'ammonium monooxygénase (Amo) présente des caractéristiques très proches de la méthanemonooxygénase (Mmo) des bactéries méthanotrophes (Holmes et al., 1995). Or la Mmo estcapable de catalyser la dégradation oxydative de nombreux hydrocarbures, incluant leshydrocarbures halogénés.L'Amo est également capable de cométabolisme (6), et peut oxyder un substrat différent del'ammonium (Abeliovich, 1992 ; Hyman et al., 1988 ; Rasche et al., 1990). Ainsi, lesnitritants sont capables de dégrader des déchets industriels, au moins dans certaines limites :solvants organiques chlorés (Ely et al., 1997), hydrocarbures halogénés (Ou et al., 1997 ;Rasche et al., 1990), alcènes halogénés (Ensign et al., 1992 ; Hyman et al., 1995)… (6) Le cométabolisme est la transformation d'un substrat qui ne peut subvenir seul à la croissance cellulaire,laquelle exige la présence simultanée d'un substrat de croissance. (Pelmont, 1993)


2.3 CARACTÉRISTIQUES DE CROISSANCE DES BACTÉRIES NITRITFIANTES EN CULTURE

Une grande quantité de l'énergie générée par l'oxydation de l'ammonium ou du nitrite (80 %)est utilisée pour générer du pouvoir réducteur, indispensable pour la fixation du CO2,quelques pourcents sont utilisés pour la croissance cellulaire (2 à 11 % chez Nitrobacter(Bock et al., 1986), et le reste est stocké sous forme de granules de poly-β-hydroxybutyrate,polyphosphate et glycogène médiocrement remobilisés par la cellule (Tobback et Landelout,1967).Par conséquent, même dans des conditions optimales :

- le taux de croissance spécifique (µmax) des bactéries nitritantes et nitratantes estfaible, et le temps de génération très long (7 à 24 h pour les nitritants, 10 à 140 h pour lesnitratants (Bock et al., 1991), comparés à ceux des bactéries hétérotrophes.

- le rendement cellulaire est très faible.- à des taux élevés d'oxydation d'ammonium et de nitrite sont associées de faibles

productions de biomasse et de faibles concentrations cellulaires. (tableau II-5)

Tableau II - 5 : Caractéristiques de croissance des bactéries nitrifiantes. (modifié et complété, d'après

Prosser (1989))

µmax (a) rendement (b) activitéspécifique (c)

auteurs

NitritantsNitrosomonas spp.N. europaea

N. europaea ATCCN. europaea FH1N. europaeaN. marinaN. spp.Nitrosomonas sp.Nitrosococcus oceanusNitrosococcus mobilisNitrosocystis oceanusNitrosospira AV2Nitrosospira sp.Nitrosolobus AV3Nitrosolobus multiformis

0.0880.02-0.03

0.0360.017

0.052-0.0660.052-0.054

0.0500.018

0.014

0.033-0.035

0.043-0.044

0.033

0.090.04-0.07

0.081-0.094

0.014-0.0310.06-0.10

0.075-0.096

1.0-7.0

233.7

0.9-4.9

0.9-5.113.7-31.3

23

Skinner et Walker (1961)Drozd (1980)Helder et de Vries (1983)Keen et Prosser (1987)Belser et Schmidt (1980)Belser et Schmidt (1980)Brion et Billen (1998)Glover (1985)Belser (1984)Remacle et DeLeval (1978)Glover (1985)Glover (1985)Carlucci et Strickland (1968)Belser et Schmidt (1980)Belser (1984)Belser et Schmidt (1980)Belser (1979)

NitratantsNitrobacter spp.Nitrobacter winogradskyiN. sp.N. sp.N. sp.N. sp.N. sp.N. spp.N. WN. LNitrococcus mobilisNitrococcus oceanus

0.0510.0580.043

0.0390.0250.033

0.02

0.013-0.0140.01250.02

0.014-0.031

15.4

5.1-13.6

9-42

6.7-11.4

Brion et Billen (1998)Gould et Lees (1960)Keen et Prosser (1987)Schon (1965)Wezernak et Gannon (1967)Helder et de Vries (1984)Belser (1979)Gay et Corman (1984)Gay et Corman (1984)Glover (1985)Glover (1985)

(a) µmax : taux de croissance maximum (en h-1)(b) rendement : rapport CO2 fixé / NO2

- ou NO3- produit

(c) activité spécifique : fmol NO2- ou NO3

- produit.cell-1.h-1


2.4 FACTEURS DU MILIEU INFLUENÇANT LA CROISSANCE ET L ’ACTIVITE DES BACTERIES

NITRIFIANTES

D'une manière générale, la croissance des bactéries nitrifiantes est contrôlée par un certainnombre de paramètres : disponibilité du substrat, température, oxygène dissous, pH, dont ilexiste une limite de tolérance et un optimum permettant une croissance maximale. La plupartdes espèces ont une croissance optimale pour une concentration en substrat jusqu'à 10 mM, unpH compris entre 7.5 et 8.0, et une température de l'ordre de 25 à 30 °C (Bock et al., 1989).La cinétique de nitrification obtenue est schématisée sur la figure II-6.

Figure II - 6 : Schématisation des transformations de l'azote pendant la

nitrification en batch en l'absence d'inhibiteur (d'après Anthonisen et al., 1976).

2.4.1 Teneur en oxygène dissous

La nature oxydative du processus de nitrification laisse prévoir une sensibilité des bactériesresponsables à la teneur en oxygène dissous.La concentration en oxygène dissous correspondant à une nitrification optimale se situe entre0.5 et 4 mg/l (Josserand, 1983 ; Stenstrom et Poduska, 1980). L'affinité des bactériesnitrifiantes pour l'oxygène est faible comparée à celle des bactéries hétérotrophes (Sharma etAhler, 1977), et les bactéries nitrifiantes sont souvent peu compétitives en présence de faiblesconcentrations en oxygène (Prosser, 1989).En réponse à une diminution de la pression partielle en oxygène, Nitrosomonas et Nitrobactersont capables d'abaisser leur constante de saturation pour l'oxygène, mais Nitrosomonasprésente une affinité plus grande que Nitrobacter pour l'oxygène et se montre donc pluscompétitif en conditions limitantes (Laanbroek et Gerards, 1993). Cependant, la croissance enanaérobiose du genre Nitrobacter, en lien avec son aptitude à dénitrifier en présence dematière organique lui confère un avantage compétitif vis à vis du genre Nitrosomonas(Laanbroek et al., 1994). En outre, la coexistence de processus d'oxydation et de réduction parNitrobacter au sein d'une même culture a été démontrée (Freitag et al., 1987).


2.4.2 Température

Les températures optimales pour la nitrification en culture pure se situent entre 25 et 37°C,bien que ce processus puisse avoir lieu entre 5 et 42°C pour certaines souches dans lesenvironnements naturels (Gay, 1983 ; Laudelout et Van Tichelen, 1960). Nitrosomonas estcependant plus tolérant aux températures extrêmes que Nitrobacter (Justice et Smith, 1962).La sensibilité différente des bactéries nitritantes et nitratantes à la température peut ainsi être àl'origine d'accumulations de nitrite (Randall et al., 1982).Le taux de croissance spécifique de Nitrosomonas est augmenté de 9.5 %, et celui deNitrobacter de 5.9 %, par une élévation de température de 1°C, dans une gamme detempérature de 8 à 23°C (Knowles et al., 1965).La température peut également intervenir de façon indirecte sur la nitrification en modifiant laconcentration en oxygène dissous, ou la teneur en NH3 conjointement avec le pH (Laudeloutet al., 1976).

2.4.3 pH

Les bactéries nitrifiantes ont une croissance et une activité optimales pour des pH comprisentre 7.5 et 8.5 (Bock et al., 1989 ; Josserand, 1983). Cependant, dans la nature, ces bactériespeuvent tolérer des gammes de pH plus larges, notamment des pH acides (Josserand etBardin, 1981).Par ailleurs, le pH influence indirectement les bactéries nitrifiantes en favorisant ou non laformation des formes libres de l’ammonium (NH3) ou de l’acide nitreux (HNO2), qui inhibentles bactéries. Ainsi, à pH acide, l’inhibition serait due à la formation de HNO2, et à pHbasique, à la formation de NH3 (Anthonisen et al., 1976) (figure II-7).

Figure II - 7 : Plages d’inhibition de la nitrification par l'ammoniaque libre et l'acide

nitreux (d'après Anthonisen et al., 1976).

pH

N-N

H4+

(m

g.l-1

)

N-N

O2- (

mg.

l-1)

zone 1

inhibitionde Nitrosomonas

et Nitrobacterpar NH3

zone 2

inhibitionde Nitrobacter

par NH3

zone 4

inhibitionde Nitrobacter

par HNO2

zone 3

nitrificationcomplète

N-N

H3 : 10 - 150 m

g.l -1

N-N

H3 : 0.1 - .01 m

g.l -1N

-HN

O 2 :

0.2

- 2.8

mg.

l-1


2.4.4 Concentration en substrat et en produit d’oxydation

En condition de substrat non limitant, les bactéries nitrifiantes peuvent être inhibées par leurpropre substrat, ainsi que par leurs produits d’oxydation.L’inhibition par le substrat est essentiellement due à la formation des formes libres NH3 etHNO2 en fonction des conditions de pH (Anthonisen et al., 1976). En général, desconcentrations en NH4

+ de 2 à 10 mM et en NO2- de 2 à 30 mM sont optimales (Bock et al.,

1986).Les produits d’oxydation, nitrite et nitrate, sont inhibiteurs à des concentrationsrespectivement de 300 mg/l pour le genre Nitrosomonas, et 4000 mg/l pour le genreNitrobacter (Bock et al., 1989). Ces valeurs très élevées sont quasi-inexistantes dansl’environnement.

2.4.5 Composés organiques

Initialement supposés inhibiteurs pour les bactéries nitrifiantes, les composés organiquess'avèrent au contraire stimulateurs de la croissance de nombreuses espèces nitrifiantes (Bock,1976), avec des différences de croissance selon les souches (Gay et Corman, 1984).Cependant, en culture mixte et en présence de matière organique, la compétition pour le NH4

+

entre nitrifiants et hétérotrophes favorise ces derniers (Verhagen et Laanbroek, 1991).

2.4.6 Lumière

Les bactéries nitrifiantes présentent une photoinhibition aux longueurs d’onde inférieures à480 nm, par un mécanisme de photooxydation du cytochrome c (Bock et al., 1986). Lesnitratants sont plus sensibles à la lumière que les nitritants (Olson, 1981).

2.4.7 Attachement aux surfaces et agrégation

Les bactéries nitrifiantes sont capables de s'attacher à divers supports, et le taux denitrification peut augmenter avec l'addition de particules dans des suspensions bactériennes(Diab et Shilo, 1988 ; Gadkari, 1990). Nous reviendrons sur cette notion d'attachement dans lecas des milieux aquatiques (§ 4.1.2).

2.5 NICHES ÉCOLOGIQUES DES BACTÉRIES NITRIFIANTES CHIMIOLITHOTROPHES

Dans la nature, la nitrification peut avoir lieu dans une gamme de conditions plus large quecelles qui sont tolérables en cultures pures. Ainsi, les bactéries nitrifiantes sont présentes dansla plupart des environnements aérobies où la matière organique est minéralisée, et il y asouvent coexistence de différentes espèces de bactéries nitrifiantes. Cependant, la sensibilitéaux facteurs environnementaux est différente selon les espèces, et à des niches écologiquesparticulières correspondent des nitrifiants hautement spécialisés (Bock et al., 1989).


Des bactéries nitrifiantes ont été isolées de nombreux habitats : sols, rivières, lacs, océans,eaux saumâtres, systèmes de traitement d'eaux usées, pierres (tableau II-6).

Tableau II - 6 : Habitats des bactéries nitrifiantes autotrophes. (d'après Bock et Koops (1992) ; Bock et

al. (1989) ; Bock et al. (1990) ; Koops et al. (1991) ; Montuelle et al. (1996) ; Schramm et al. (1999) ;

Sorokin et al. (1998) ; Watson et al. (1989))

Oxydation Genre Espèce Habitat

NH4+ → NO2

-Nitrosomonas europaea

communisureaeaestuariimarinanitrosaeutrophaoligotrophahalophilacryotolerans

sols, eaux doucessolssols, eaux douceseaux marines et estuaireseaux marines et lacs salésenvironnements eutropheseaux usées, environnements eutropheseffluents industriels (chimiques)eaux marineseaux marines

Nitrosococcus nitrosusoceanusmobilis

solsenvironnements marinseaux saumâtres

Nitrosospira briensis sols, eaux doucesNitrosolobus multiformis solsNitrosovibrio tenuis sols

NO2- → NO3

-Nitrobacter vulgaris

hamburgensiswinogradskyialkalicus

sols, pierres, eaux douces, souterraineset saumâtres, stations d’épurationsols, eaux douces, stations d’épurationsols, eaux douces, stations d’épurationsols, sédiments alcalins

Nitrospina gracilis environnements marinsNitrococcus mobilis environnements marinsNitrospira marina

sp.environnements marinseaux douces, stations d’épuration

2.6 INTERACTIONS NITRIFICATION-DÉNITRIFICATION

La dénitrification est d’une grande importance écologique, puisqu’il s’agit de la voie majeurede la perte d’azote fixé dans l’environnement. Elle occupe donc une place importante dans lebilan de l’écosystème à l’échelle globale. La dénitrification est aussi un mode respiratoire quipermet aux bactéries anaérobies facultatives de continuer à minéraliser du carbone organiqueen l’absence d’oxygène moléculaire. Dans cette respiration, les oxydes d’azote sont réduitsdepuis la forme nitrate jusqu'aux formes gazeuses de l'azote : N2, N2O, NO, via le nitrite. Lesbactéries dénitrifiantes influencent donc à la fois le cycle du carbone et celui de l’azote, et leurimpact varie en fonction de la tension locale en oxygène.Nous avons vu précédemment que la nitrification et la dénitrification sont très liées.Bien que la physiologie des bactéries nitrifiantes et dénitrifiantes suggère que lesenvironnements qui encouragent leur croissance soient mutuellement exclusifs, de nombreuxmilieux possèdent des interfaces oxiques/anoxiques au niveau desquelles les deux processuspeuvent interagir. Les substrats et produits peuvent diffuser le long de gradients pour subir


des oxydations et des réductions. Ces gradients peuvent s’étendre sur plusieurs mètres dansles océans, jusqu'à quelques µm dans les sols ou les sédiments.Généralement, dans les milieux d'eau douce, la perte d'azote fixé par dénitrification est trèsimportante : elle représente souvent au moins 40 % de la quantité d'azote inorganiqueapportée à l'écosystème. Les sources de NO2

- et NO3- pour la dénitrification comprennent la

nitrification dans les sédiments, le NO3- + NO2

- présent dans l'eau de surface, et, dans certainscas, l'advection à travers les sédiments d'eaux souterraines contaminées par du NO3

-. Lanitrification a lieu dans les quelques millimètres de sédiment en surface, où l'O2 pénètre, et ladénitrification se produit à proximité de cette fine couche de sédiment de surface oxygénée.L'O2 pénètre également dans les galeries d'animaux, ou à proximité des rhizomes de plantesaquatiques si elles relarguent de l'O2. Ceci permet d'étendre la zone de couplage nitrification /dénitrification plus en profondeur (Jörgensen, 1989 ; Seitzinger, 1993).

2.7 AUTRES PROCESSUS D'OXYDATION DE L'AMMONIUM

Outre la possibilité d'oxydation anaérobie de l'ammonium par des bactéries nitritantes(§ 2.2.1.3), il existe, parallèlement à la nitrification chimiolithotrophe, des processusd'oxydation de l'ammonium dont les mécanismes et l'importance sont encore mal connus.

2.7.1 Nitrification par des microorganismes hétérotrophes

La nitrification hétérotrophe est la production de nitrate à partir de formes réduites,organiques ou inorganiques, de l’azote. Il s’agirait d’une cooxydation, non couplée à uneproduction d’énergie, effectuée par divers groupes taxonomiques de bactéries, champignons,et même par quelques algues (Killham, 1986).

Différentes voies biochimiques seraient impliquées dans ce processus (Killham, 1986):

- voie "inorganique" :NH4

+ → NH2OH → NOH → NO2- → NO3

-

niveau d’oxydation : -3 -1 +1 +3 +5

- voie "organique" :RNH2 → RNHOH → RNO → RNO2 → NO3

-

niveau d’oxydation : -3 -1 +1 +3 +5

Il peut également s’agir d’une combinaison de ces deux voies.

Aucun des nitrifiants hétérotrophes ne peut croître autotrophiquement. Par rapport à lanitrification lithoautotrophique, seules de faibles quantités de nitrite et de nitrate sont formées,mais la nitrification hétérotrophique peut être à prendre en compte si la nitrificationautotrophe est inhibée par des conditions environnementales.


Parmi les hétérotrophes capables de nitrification, les champignons sont considérés comme lesplus nombreux et les plus efficaces. La plupart des travaux ont été menés au laboratoire surl’espèce Aspergillus flavus (Killham, 1986).En milieu aquatique, la nitrification hétérotrophe est souvent le fait de bactéries dénitrifiantes,qui sont très abondantes dans les sédiments (Hall, 1986). L’exemple souvent étudié estThiosphaera pantotropha (ancien nom : Paracoccus denitrificans) (Arts et al., 1995).L'oxydation du nitrite par des bactéries hétérotrophes comme Arthrobacter, Bacillus,Pseudomonas... (bactéries présentes dans les stations d'épuration) semble également fréquentesous des conditions nutritionnelles et d'oxygénation convenables (Sakai et al., 1996).

La nitrification hétérotrophe ne peut pas être évaluée par des mesures d’accumulation denitrite et nitrate, car souvent, une dénitrification a lieu simultanément. Les taux de nitrificationhétérotrophe publiés (généralement 104 à 105 fois inférieurs à la nitrification autotrophe) sontdonc vraisemblablement souvent sous-estimés (van Niel et al., 1993). Des calculs denitrification hétérotrophe basés sur la disparition de l’ammonium ont révélé que ce taux étaiten fait de 102 à 103 inférieur par unité de biomasse (Kuenen et Robertson, 1987). Ainsi, dansles situations où les hétérotrophes surnombrent abondamment les autotrophes, comme dansles boues ou dans les sols, la part de nitrification due à ces 2 types de nitrifiants peut êtrecomparable. Dans certaines conditions, comme un bas pH, un rapport C/N élevé (>10), ou defaibles concentrations en oxygène (<25 µM), la nitrification hétérotrophe pourrait jouer unrôle significatif par rapport à la nitrification autotrophe (van Niel et al., 1993).

2.7.2 Oxydation de l'ammonium par des bactéries méthanotrophes

Les bactéries méthanotrophes participent également à l'oxydation de l'ammonium : beaucoupsont capables de co-oxyder l’ammonium en nitrite en utilisant l’enzyme méthanemonooxygénase (Mmo) (et réciproquement, le système ammonium monooxygénase peutoxyder le méthane en méthanol ou dioxyde de carbone) (Bédard et Knowles, 1989). En effet,les gènes codant pour la méthane monooxygénase et l’ammonium monooxygénase présententde fortes homologies de séquences, et l’analyse des séquences d’acides aminés révèle uneforte conservation des structures primaire et secondaire, suggérant que ces deux enzymes sontreliées évolutivement (Holmes et al., 1995).Chez les bactéries nitritantes, le CH4 se lie au même site actif de l’Amo que le NH3, agissantainsi comme un inhibiteur compétitif de l’oxydation de l’ammonium (Roy et Knowles, 1994).La présence de CH4 peut donc conduire à une suppression de la nitrification, qui peutégalement être la conséquence d’une compétition entre les méthanotrophes et les nitrifiantspour l’O2 et pour l’azote minéral (Roy et Knowles, 1994).


3 TECHNIQUES D'ETUDE DES BACTERIES NITRIFIANTES ET DE LEUR ACTIVITE

3.1 BACTÉRIES NITRIFIANTES

3.1.1 Isolement

Il faut d’abord désorber les bactéries de leur support (particules de sol, de sédiments, …), soitpar sonication (Chartrain et Rizet, 1983), soit par action d’un Waring-Blender (Crozat etCleyet-Marel, 1984).Deux techniques d’isolement sont principalement utilisées :

- l’isolement par dilution (Soriano et Walker, 1968) consiste à enrichir suffisammentles cultures en nitrifiants pour que leur nombre égale ou dépasse le nombre des contaminantshétérotrophes. Les cultures sont alors diluées de manière à obtenir environ une cellule partube. Parmi tous les tubes inoculés, quelques-uns ne devraient contenir que des cultures puresde nitrifiants.

- l’isolement par étalement sur boîte (Schmidt et al., 1973) s’effectue aprèsl’élimination maximale des contaminants hétérotrophes par des transferts successifs en milieude culture liquide. Les cultures sont alors étalées sur un milieu solide inorganique contenantde l’ammonium ou du nitrite.

3.1.2 Culture

Les cultures sont maintenues par transferts successifs d’inoculums dans des tubes contenantun milieu minéral, à une température d’incubation de 28 °C, à l’obscurité et sous agitation.Différents milieux sont proposés dans la littérature (7). Les transferts sont réalisés toutes lesquatre semaines environ. Le développement des souches de nitritants est vérifié par le test deGriess (apparition de NO2

-) et par un changement de l'indicateur de pH du bleu vert au jaune,indiquant une production d'acide (soit l'oxydation du NH4

+ en NO2-) ; celui des souches de

nitratants, par le test de Griess également (disparition du NO2-). La pureté de la culture est

vérifiée par étalement de quelques gouttes de culture sur gélose nutritive (Josserand, 1983).En culture en batch, le nombre maximum de Nitrobacter est de 4.107 cellules/mg de NO2oxydé. Le nombre de cellules augmente en présence de matériel organique et de filtrat deculture d’hétérotrophes. Ceci peut expliquer pourquoi la nitrification est souvent plus rapidedans les cultures contaminées que dans les cultures pures (Bock et al., 1986).

(7) Nous utiliserons par la suite les milieux de Schmidt et al. (1973), Bock et al. (1983), Schmidt et Belser (1994).


3.1.3 Dénombrement

Jusqu'à ces dernières années, le cycle de l’azote était essentiellement abordé d’un point de vueflux global, sans nécessairement étudier les processus d’un point de vue microbiologique.Aujourd'hui, l’approche microbiologique est de plus en plus requise pour mieux comprendreces processus, et des études de plus en plus fines sont réalisées, par exemple dans l’ingénieriedes stations d’épuration. Ceci nécessite l'emploi de diverses techniques de dénombrement desbactéries nitrifiantes.

3.1.3.1 Méthodes classiques : MPN, immunofluorescence, activité potentielle

Dénombrement par MPN :

Le dénombrement des bactéries nitrifiantes dans les environnements aquatiques a longtempsété réalisé exclusivement par la technique du MPN ("most probable number" ou nombre leplus probable), basée sur le développement des bactéries nitrifiantes dans un milieu électif(Cochran, 1950 ; Schmidt et Belser, 1994). L’inconvénient majeur de cette méthode est lalongue période d’incubation qu’elle requiert, en raison du long temps de génération desbactéries nitrifiantes. Elle est cependant toujours utilisée selon le type d’étude réalisée, carelle permet de traiter un grand nombre d'échantillons en assez peu de temps.Les populations ainsi dénombrées peuvent être nulles ou très faibles, comparées aux activitésnitrifiantes observées (Hall, 1986 ; Ward, 1986). Cette sous-estimation, parfois importante, dela population réellement présente, peut avoir plusieurs raisons (Sandén et al., 1996) :

- il est possible que les tubes positifs représentent des "clusters" de cellules et non descellules uniques.

- les bactéries nitrifiantes requièrent de très longues périodes d’incubation, et tous lesgenres et souches recherchés doivent être capables de croître dans le milieu utilisé.

- la présence de nitrifiants viables mais non actifs métaboliquement n’est pas prise encompte.

- le calcul et l’évaluation des résultats présentent une incertitude inhérente à laméthode statistique.

Mesure de l’activité potentielle :

Le principe est de comparer l’activité des échantillons avec l’activité d’un nombre connu decellules d'un genre donné (en culture), et de calculer ainsi la concentration en cellulesrecherchées dans l’échantillon (Belser et Mays, 1982 ; Sandén et al., 1996).Le principal défaut de cette méthode est qu'elle ne tient pas compte du fait que, au sein d'unecommunauté fonctionnelle, différents genres ou différentes espèces parmi ces genres,présentent des activités spécifiques parfois très différentes.

Dénombrement par immunofluorescence :

L’emploi de techniques d’immunofluorescence, développées par Fliermans et al. (1974) etSchmidt (1974) a permis d’obtenir des résultats cohérents en milieu naturel (Montuelle et al.,


1996 ; Ward, 1986). La détection par immunofluorescence, basée sur des distinctionssérologiques (marquage des bactéries à l'aide d'anticorps spécifiques portant un fluorochrome(principe en annexe 6)), est en effet la seule méthode utilisable pour l'identification de cellulesindividuellement, et pour la numération de souches dans les échantillons naturels.Cependant, cette technique présente des inconvénients non négligeables :- L'inconvénient majeur de cette méthode est qu'elle requiert l'isolement et la culture dessouches bactériennes pour produire des anticorps. Or, dans les systèmes naturels,l'enrichissement et la culture ne sont pas toujours possibles. De nombreuses cellulesbactériennes présentes dans les peuplements naturels sont viables mais ne peuvent êtrecultivées par les procédés classiques.- Les anticorps ne permettent pas de différencier des cellules viables et des cellules nonviables, et ils présentent souvent des réactions croisées avec d'autres bactéries del'environnement.- Les méthodes immunologiques sont basées sur la reconnaissance de sites antigéniques, doncde caractéristiques phénotypiques, dont l'expression peut être régulée par des facteursenvironnementaux et donc peut affecter la sensibilité et la spécificité de ces techniques(Voytek et Ward, 1995).- L’utilisation de l’immunofluorescence est délicate sur biomasse de station d’épuration, car laréaction immunitaire peut être empêchée par la "gaine muqueuse" qui recouvre les bactéries.Cette méthode s’est révélée non utilisable dans le cas de biofilms d’un réacteur à biomassefixée (Szwerinski et al., 1985).- Enfin, il peut exister des problèmes d'observation microscopique, liés à une fluorescenceparasite en milieu complexe comme le sédiment (Féray et al., 1999).

3.1.3.2 Nécessité de techniques de biologie moléculaire

Les méthodes précédemment décrites (basées sur des cultures) ne sont souvent pas assezperformantes pour dénombrer les bactéries nitrifiantes et étudier leur diversité dans lesmultiples habitats qu'elles sont capables de coloniser.

Des techniques plus récentes de biologie moléculaire sont donc appliquées à l'écologie desbactéries nitrifiantes :

- La PCR ("polymerase chain reaction" ou polymérisation d'ADN en chaîne) permetd’amplifier des séquences d’ADN spécifiques à partir d’un petit nombre de copies de l’ADNcible (principe en annexe).Elle peut être utilisée pour détecter ou dénombrer les bactéries nitrifiantes dans différentsmilieux (Nejidat et Abeliovich (1994) pour Nitrosomonas ; Voytek et Ward (1995) pour lesnitritants ; Degrange et Bardin (1995) pour Nitrobacter).

- L'utilisation de séquences génômiques amplifiées par PCR comme substrat pour desenzymes de restriction suivie de l'étude des profils de restriction obtenus (PCR-RFLP) apermis de caractériser des populations naturelles de Nitrobacter isolées de plusieurs sols etétangs (Navarro et al., 1992).


- L’hybridation in situ ("FISH") permet de détecter des micro-organismes spécifiquesà l’aide de sondes oligonucléotidiques couplées à un fluorochrome (ex : Wagner et al. (1996)(bactéries nitrifiantes en station d'épuration) ; Mobarry et al. (1996)).

Les méthodes PCR et hybridation in situ présentent une certaine flexibilité dans leurspécificité, et l’on peut choisir de travailler à un niveau plus ou moins élevé despécificité suivant les séquences cibles utilisées.L’avantage des méthodes de biologie moléculaire est qu'elles permettent d’étudier lesorganismes au niveau de leur génôme, sans les cultiver. Ainsi, la diversité génétique depopulations non cultivables peut être investiguée, et des populations non encore identifiéespeuvent être détectées.Par exemple, Hiorns et al. (1995) ont utilisé différentes amorces de PCR pour estimerl’abondance relative des nitritants et nitratants dans de l’ADN extrait d’un lac. Ils ont trouvéque les séquences les plus communément détectées par PCR n’étaient pas celles des espècesles plus facilement cultivées. Ceci confirme le biais sélectif inhérent aux cultures, et donc lebiais dans la compréhension du fonctionnement des populations naturelles.

L’étude des processus biogéochimiques encourage quant à elle l’utilisation de sondes baséessur les enzymes ou les gènes directement impliqués dans les processus de transformation.Ainsi, des sondes "fonctionnelles" peuvent fournir des informations sur la distribution etl’expression des gènes impliqués dans une certaine voie biochimique, sans déterminerobligatoirement l’identité taxonomique des organismes qui possèdent ce gène dans la nature(Ward, 1996).

Ces deux types d’approches : "populations" et "fonctions", sont actuellement développéeschez les communautés impliquées dans le cycle de l’azote.

3.2 ACTIVITÉ NITRIFIANTE

3.2.1 Dosage des différentes formes inorganiques de l’azote

Le choix d'une méthode d'analyse des composés azotés dépend de la forme analysée, de saconcentration et de la présence éventuelle de composés pouvant interférer avec le dosage.Pour l'analyse du nitrite, la méthode la plus courante utilise la réaction de diazotation. Pourl'analyse de l'ammonium et du nitrate, plusieurs méthodes sont proposées (tableau II-7).


Tableau II - 7 : Principale méthodes de dosage des différentes formes de l’azote inorganique (modifié,

d'après Daniels et al. (1994)).

Formedosée

Méthode Sensibilité(µg N / l)

Interférences Avantages Inconvénients

NH4+ bleu indophénol 10 particules, échantillons

colorés, phenol, Cl-, excèsd’acide ou de base, petitscomposés azotés

simple utilisation de phénolinstabilité des réactifspeut nécessité unedistillation

Nessler 400 particules, échantillonscolorés, ions Mg, Fe, Ca, S,Mn, et Cl, petits composésorganiques

utilisation de mercurepeut nécessité unedistillation

pyridine-pyrazole

50 ions Fe, Zn, Ag et Cu,cyanate

spécifique deNH4

+utilisation de pyridine

électrodessélectives

amines volatiles suivi en continu lourd à mettre enoeuvre

NO2- diazotation 1 échantillons colorés, ions

Cl, Sb, Fe, Pb, Hg, Ag etCu

simple interférences avec Cl-

et Fe3+


suivi en continu lourd à mettre enoeuvre

NO3- mesure de A220 40 nombreux produits

organiques, NO2-,

échantillons colorés...

simple interférences par lesorganiques

acidechromotropique

100 échantillons colorés, ionsBa, Pb, I, Se, Cr

coloration stablependant 24 h

faible sensibilité

acidenitrophenoldi-sulfonique

20 produits organiques, Cl- simple nécessite unedessication


HCO-, Cl- suivi en continu lourd à mettre enoeuvre

diméthyl-2,6phénol

60 NO2-, Cl- simple

3.2.2 Inhibiteurs de la nitrification

L’activité des bactéries chimioautotrophes est bloquée spécifiquement par de nombreuxcomposés. Un certain nombre d’entre eux ont été particulièrement étudiés pour leur capacité àinhiber la nitrification dans les sols agricoles, et quelques uns sont aussi utilisés pour estimerl’activité des bactéries nitrifiantes dans l’environnement (Bédard et Knowles, 1989).

3.2.2.1 Inhibiteurs de la nitritation

Le nitrite s’accumule rarement (dans le sol), suggérant que l’oxydation de l’ammonium estl’étape limitante de la nitrification. La plupart des inhibiteurs de la nitrification trouvés dans lecommerce ont pour cible la première étape de la nitrification.Trois principaux groupes de composés inhibent la nitritation (Bédard et Knowles, 1989 ; McCarty, 1999) :

- Une des cibles des inhibiteurs de la nitrification est l’enzyme ammoniummonooxygénase ; certains composés exercent leur action inhibitrice en chélatant son


groupement métallique (cuivre). Ceci est le cas de nombreux composés soufrés incluant lesthiosulfates, les thiocarbamates, les xanthates, les acides aminés soufrés et plusieurs pesticideset fongicides. Citons par exemple la thiourée et l’allylthiourée, le potassium éthyle xanthate,le sodium diéthylthiocarbamate…

- Les composés acétyléniques sont des "substrats suicide" pour l'ammoniummonooxygénase. Ils sont oxydés en produits très réactifs qui forment des liaisons covalentesavec l'enzyme, causant une inhibition irréversible.

- De nombreux composés azotés hétérocyclés (le plus utilisé est la 2-chloro-6-trichlorométhyle pyridine, ou nitrapyrine) forment le troisième grand groupe d'inhibiteurs dela nitritation. Leur mode d'action n'est pas encore précisément déterminé.

3.2.2.2 Inhibiteurs de la nitratation

Le chlorate (ClO3-) est jusqu'à présent le seul composé utilisé pour inhiber la nitratation

(Belser et Mays, 1980). Son action, via la forme chlorite, produit de réduction du chlorate,affecte également, dans une moindre mesure, la nitritation (Hynes et Knowles, 1983).De plus, l’inhibition de la nitratation par le chlorate n’est pas totalement efficace(Smorczewski et Schmidt, 1991).

3.2.3 Mesure des processus de nitrification

Deux types de mesures de la nitrification peuvent être effectués : des mesures d'activité réellein situ, dans les conditions naturelles, et des mesures d'activité potentielle, dans des conditionsoptimales et souvent standardisées qui présentent l'avantage de permettre de comparer lesrésultats obtenus entre eux (à défaut de pouvoir les comparer avec ceux obtenus par d'autresauteurs). En milieu aquatique, la plupart des mesures sont des activités potentielles, car lesmesures d'activité réelle sont plus difficiles à mettre en œuvre.La conversion en activité réelle d'une mesure d'activité potentielle en tenant compte desparamètres environnementaux (température, profondeur de pénétration de l'oxygènedissous, ...) est également possible (Cooper, 1984).

Deux principales catégories de méthodes sont employées : celles utilisant un traceurisotopique et celles dites non isotopiques, à base de dosages chimiques.Parmi les méthodes isotopiques, la technique du traceur 15N est la plus courante (Jensen et al.,1996 ; Rysgaard et al., 1993), bien que l’incorporation du 14C soit également utilisée pourmesurer, de façon indirecte, l’activité des bactéries nitrifiantes litho-autotrophes (Brion etBillen, 1998).Le principe des techniques non isotopiques consiste à mesurer les changements deconcentration des sels azotés (ammonium, nitrite, nitrate) au cours d'un temps d’incubation.Les mesures de vitesse de nitrification in situ utilisent souvent la combinaison d’inhibiteursspécifiques des deux étapes de la nitrification et le dosage de traceurs ou de sels azotés(Fosset et Bianchi, 1995). Ainsi, par exemple, Sloth et al. (1992) proposent d'évaluer


l'intensité de la nitrification par la mesure de la différence entre l'accumulation de NH4+ dans

l'eau surnageante d'une carotte de sédiment après un blocage à l'acétylène de la nitritation etl'accumulation de NH4

+ dans l'eau surnageante avant l'introduction de l'inhibiteur. Le principede cette technique a été utilisé pour des mesures de la nitrification directement dans le lit de larivière, à l'aide de cloches benthiques (pour les sédiments fins) et de réacteurs étanches (pourles galets colonisés par des biofilms) (Teissier et Torre, 1997).

Des techniques de mesure indirecte de l'activité nitrifiante ont également été mises au point.La nitrification peut ainsi être déduite de mesures de dénitrification du nitrate produit à l'aidede dosages de N2O par chromatographie (Lensi et al., 1985 ; Lensi et al., 1986).Enfin, le suivi de l'élimination de l'azote dans les systèmes de traitement des eaux usées aengendré le développement de nouvelles méthodes de mesure de la nitrification dans cesmilieux particuliers. Dans ce contexte, des mesures de respirométrie et de titrimétrie sontutilisées pour caractériser les boues activées (Gernaey, 1998 ; Gernaey et al., 1998 ; Massoneet al., 1998 ; Massone et al., 1996).


4 NITRIFICATION DANS LES MILIEUX D 'EAU DOUCE SUPERFICIELS

4.1 BACTÉRIES NITRIFIANTES EN MILIEU AQUATIQUE

4.1.1 Quels sont les genres concernés ?

Les bactéries nitrifiantes sont présentes, dans des proportions plus ou moins importantes, danstous les écosystèmes aquatiques continentaux : lacs, étangs, rivières.Parmi les genres nitrifiants, seuls Nitrosomonas et Nitrobacter ont longtemps été considéréscomme renfermant des souches aquatiques.Des isolements de bactéries dont les caractéristiques morphologiques se rapprochent de cellesde Nitrosospira ont cependant été réalisés (Wullenweber et Koops, 1980 ; Yoshioka et Saijo,1984). De plus, le développement plus récent de techniques basées sur la détection des gènesde l’ARNr 16S (ADNr 16S) pour déterminer la présence et la distribution de différentsgroupes de nitrifiants dans l’environnement, a permis de mettre en évidence la présence enproportion non négligeable du genre Nitrosospira (Hiorns et al., 1995).De même, l’analyse, à l’aide de sondes nucléiques, des bactéries nitrifiantes d’un aquariumd’eau douce dans lequel de forts taux de nitrification existent, n’a pas révélé la présence debactéries de la lignée α des Protéobactéries (à laquelle appartient le genre Nitrobacter), et arévélé, dans quelques échantillons seulement, la présence de bactéries nitritantes de la lignéeβ (à laquelle appartient notamment le genre Nitrosomonas) ; ceci suggère que des bactériesdifférentes de celles classiquement recherchées (Nitrosomonas et Nitrobacter) interviennentdans la nitrification des écosystèmes aquatiques naturels (Hovanec et DeLong, 1996).L’importance accordée au genre Nitrosomonas, en particulier Nitrosomonas europaea, en tantque principal nitritant dans l’environnement, résulte vraisemblablement partiellement d’unbiais dû à la culture. Il est possible que Nitrosomonas europaea présente, en milieu de culture,une meilleure croissance que d’autres nitrifiants d’une importance écologique supérieure etplus denses que Nitrosomonas spp. dans des populations mixtes. Ceci renforcerait lesobservations de Hiorns et al. (1995), qui suggèrent que les Nitrosomonas spp. sontprédominants seulement dans des cultures d’enrichissement et pas forcément dans deséchantillons bruts de l’environnement.Smorczewski et Schmidt (1991) émettent l'idée que Nitrosomonas, seul genre détecté dans lessédiments d’un lac dimictique (8) soumis à une période d’anaérobiose durant la stratificationestivale du lac, possède une capacité d’adaptation accrue par rapport aux genres Nitrosolobuset Nitrosospira, détectés uniquement lorsque le sédiment est oxygéné. L’aptitude deNitrosomonas à produire de l’oxyde nitreux dans des conditions de forte concentration enNH4

+ et faible concentration en O2, pourrait favoriser sa persistance par rapport aux deuxautres genres. Cette capacité d’adaptation pourrait expliquer en partie le fait que ce genre a étéidentifié comme le type dominant associé aux environnements d’eau douce. (8) Lac caractéristique des régions tempérées, gelant en hiver (stratification inverse) et dont l'eau de surface estsupérieure à 4°C en été (stratification directe), présentant deux périodes de mélange : au printemps et àl'automne. (d'après Pourriot et Meybeck (1995))


De même, il existe des bactéries nitratantes autres que Nitrobacter spp. dans d’autressubdivisions des Protéobactéries. D’autres études ont montré l’existence d’une activiténitratante en l’absence de Nitrobacter (Wagner et al., 1996) et ont détecté le genre Nitrospiradans des boues de station d'épuration par l'intermédiaire de la nitrite oxydo-réductase(Bartosch et al., 1999 ; Juretschko et al., 1998 ; Schramm et al., 1999).

4.1.2 Quelle est leur localisation ?

Il y a peu de bactéries nitrifiantes planctoniques. La plupart se trouvent au niveau des biofilmsépilithiques et des sédiments (Matulewich et Finstein, 1978), ou dans la colonne d'eau, liées àdes particules en suspension.

4.1.2.1 Nitrification et biofilms

Le rôle des biofilms benthiques dans la nitrification en rivière est admis depuis longtemps(Tuffey et al., 1974). Cependant, les biofilms nitrifiants ont essentiellement été étudiés enstations d'épuration, en raison de l'intérêt technologique qui en découle.

Les bactéries nitrifiantes constituant des biofilms présentent des différences physiologiquespar rapport aux cellules planctoniques (Batchelor et al., 1997).Bien que les bactéries nitrifiantes fixées présentent généralement une activité inférieure àcelle des bactéries libres (Keen et Prosser, 1988), elles peuvent croître et maintenir leuractivité dans des biofilms à des pH significativement inférieurs à ceux requis pour lacroissance des cellules planctoniques (Allison et Prosser, 1993 ; Keen et Prosser, 1987). Lesbiofilms nitrifiants sont également beaucoup plus résistants aux inhibiteurs de la nitrification(Powell et Prosser, 1991 ; Underhill et Prosser, 1987). Ce rôle de protection contre dessubstances inhibitrices est cependant controversé (Abeliovich, 1992).Ces effets sont fréquemment attribués à la production de substances polymèresextracellulaires (EPS) (Stehr et al., 1997).En fonction des conditions environnementales, il s'établit une stratification microbienne dansles biofilms. Ainsi par exemple, les bactéries nitrifiantes qui présentent une affinité pourl'oxygène plus faible que les bactéries hétérotrophes se situent généralement dans la partieexterne des biofilms (Schramm et al., 1996), mais un taux de carbone organique élevé peutentraîner la domination des hétérotrophes dans les couches externes (Okabe et al., 1995).

4.1.2.2 Nitrification et particules

De nombreuses études mentionnent des quantités de bactéries nitrifiantes, ou des taux denitrification, nettement supérieurs en association avec les particules en suspension ou dans leszones sédimentaires, plutôt que dans la colonne d'eau (ex : Admiraal et Botermans (1989) ;Gresikowski et al. (1996) ; Hall (1986) ; Stehr et al. (1995)).


En effet, le compartiment sédimentaire et les particules en suspension jouent un rôleconsidérable dans le processus de nitrification : le premier offre des conditions souventfavorables au niveau de son interface avec la colonne d’eau, qui représente un site particulierd'échanges, et les secondes permettent aux bactéries nitrifiantes fixées d'être véhiculées dansl’eau.Deux raisons peuvent expliquer le fait que le nombre de bactéries nitrifiantes et leur activitésont étroitement associés aux particules en suspension (Gresikowski et al., 1996) :

- les particules offrent une surface solide pour l’adhésion des bactéries.- les éléments nutritifs sont concentrés au niveau des particules : de la matière

organique et des composés azotés inorganiques sont adsorbés sur ces particules (les composésazotés inorganiques sont 100 à 1000 fois plus concentrés au niveau des particules que dans lacolonne d’eau).La composition et la texture des particules en suspension affectent le degré d’attachement desbactéries : celles-ci sont le plus souvent attachées à des minéraux de petite taille. Par ailleurs,les taux de nitrification les plus élevés sont associés aux sédiments de texture fine etorganique : il existe une forte corrélation entre le contenu en argile et le taux de nitrification.Ceci peut s’expliquer par le fait que les argiles présentent des sites d’échanges pour les ionsNH4

+. De plus, un sédiment fin fournit une plus grande surface colonisable (Montuelle et al.,soumis ; Wyer, 1988).

4.2 NITRIFICATION DANS LES MILIEUX NATURELS NON ANTHROPISÉS

Les apports d'azote aux milieux non anthropisés sont essentiellement de deux types : fixationde N2 par certains procaryotes et azote organique par les berges. Cet azote organique doit êtreminéralisé avant d'être utilisé par les végétaux ou de devenir disponible pour une éliminationpar nitrification-dénitrification. Cette minéralisation, et la libération d'ammonium associée,dépendent notamment du rapport C/N (un C/N bas indique un matériel aisément dégradable)(Labroue et al., 1995).En présence d'ammonium nitrifiable disponible, la nitrification est soumise à l'effet dedifférents facteurs environnementaux qui interagissent : oxygène, température, pH,luminosité, caractéristiques du substratum…

4.2.1 Lacs

En milieu lacustre, deux principaux facteurs conditionnent la nitrification : les nutriments(eutrophie ou oligotrophie) et le cycle annuel des températures et des brassages (Hall, 1986),qui influence de nombreux paramètres.

Au niveau de la colonne d’eau, l’activité nitrifiante est généralement maximale durant lespériodes de brassage ou de circulation hivernale. Ceci semble dû à la remise en suspension


des sédiments et au brassage de la zone de l'hypolimnion (9), riche en ammonium, avec l’eaude surface. La nitrification est généralement faible pendant l’été, en raison des faiblesconcentrations en ammonium dans l’eau de surface, dues à l’assimilation par les algues. Cettechute d’activité est souvent précédée d’activités intenses au printemps (Takahashi et al.,1982), qui peuvent être liées au bloom printanier de diatomées dans les lacs eutrophes : celles-ci sédimentent, et leur décomposition fournit de l’ammonium (Hall, 1986).La nitrification a tendance à augmenter avec la profondeur, peut-être en raison de laphotoinhibition des bactéries nitrifiantes (Hall, 1986). Dans les lacs stratifiés, il sembleégalement que la zone de nitrification se déplace verticalement au fil des saisons : auprintemps, avant que la stratification estivale s'installe, la chimiocline (10) ammonium-oxygènese situe au niveau de l'interface eau-sédiment, zone privilégiée pour la nitrification ; en été,l'hypolimnion devient progressivement anoxique et la chimiocline remonte peu à peu jusqu'aumétalimnion où la nitrification est la plus active, puis elle redescend après le brassaged'automne (Christofi et al., 1981).

Le compartiment sédimentaire joue un rôle important dans la nitrification en lac. En effet, lespopulations bactériennes sont 103 à 104 fois plus nombreuses dans les sédiments que dans lacolonne d’eau ; ce rapport est d’au moins 102 en ce qui concerne les bactéries nitrifiantes(tableau II-8) (Hastings et al., 1998). L’azote ammoniacal y est au moins 10 fois plusconcentré, et des changements dans les conditions rédox peuvent résulter en un relargage dece NH4

+ vers l’eau superficielle (Hall, 1986).

Tableau II - 8 : Densité des bactéries nitritantes et nitratantes dans l'eau et les sédiments de lacs.

(d'après Hall (1986))

laccolonne d'eau

(bact./ml)

sédiment

(bact./g séd. humide)

nitritants nitratants nitritants nitratants

Balgavies

Blelham

Plubsee

Malaren

Grasmere

Kizaki

Biwa

Rouille

0 – 2.5×102

1 – 6.3×102

0 - 1.0

2 - 104

0 - 17

2.3

<1

--

0 – 2.5×102

1 – 3.2×102

0 – 2×102

0 - 2

--

5.1

<1

--

1.6×102 - 1.6×104

2.0×102 – 5.0×104

--

--

--

--

93 - 7×102

50 - 103

2.0×102 - 1.6×104

1.0×102 – 5.0×103

--

10 - 3×103

--

--

90 – 4.3×103

2.5 - 15×103

(9) En limnologie, la thermocline, zone située à une profondeur d'eau variable, caractérisée par une variationbrutale de la température, délimite la zone du métalimnon et sépare deux couches constituées par des eaux detempératures très différentes et qui se mélangent très difficilement. La couche située au-dessus de la thermoclineest dénommée épilimnion, la couche profonde est appelée hypolimnion. (d'après Ramade (1998))(10) La chimiocline est une zone de discontinuité dans un biotope aquatique au niveau de laquelle s'observe unerapide variation de la concentration d'un élément ou d'un composé minéral. (Ramade, 1998)


L’environnement "sédiment" est hétérogène et caractérisé par de forts gradients verticaux derédox, qui peuvent être mesurés à l’échelle du cm ou du mm (Jones, 1979 ; Vincent etDownes, 1981). Ces gradients sont importants en terme d’activité bactérienne et de processusde décomposition. Les processus aérobies tels la nitrification peuvent se produire dans desgammes rédox de +600 mV (eau saturée en O2) à +250 mV. L’oxygène est apporté auxsédiments de surface par diffusion depuis l’eau de surface (la remise en suspension dessédiments ou le brassage peuvent être importants dans certaines conditions comme nousl'avons vu plus haut) et les gradients sont maintenus par la consommation d’O2 dans lessédiments. La profondeur de pénétration dépend de la concentration dans l’eau superficielle etdu taux de consommation dans le sédiment. Généralement, les conditions d’oxygénationn’excèdent pas 3 cm dans les dépôts sédimentaires (Hall, 1986).

4.2.2 Rivières

Dans les milieux d'eau "courante", il faut différencier les petites rivières ou l'amont desfleuves (crénon + rhitron), où le fort potentiel nitrifiant associé au benthos bénéficie d'unebonne oxygénation de la zone supérieure du sédiment, et les grandes rivières ou l'aval desfleuves (potamon), où le rapport surface benthique/unité de volume de la colonne d'eau estplus faible et l'oxygénation souvent limitée, mais qui en revanche, véhiculent davantage departicules en suspension. (Chesterikoff et al., 1992 ; Tuffey et al., 1974)

Outre ses caractéristiques physico-chimiques importantes pour l'hébergement d'un potentielnitrifiant (Gresikowski et al., 1996 ; Wyer, 1988), "l'environnement sédiment" présente desparticularités qui interviennent dans la régulation de la nitrification in situ (Cooper, 1984 ;Jörgensen, 1989).Tout comme dans les milieux lacustres, ceci concerne notamment l'oxygène : de par soncaractère aérobie, la nitrification est restreinte à la couche superficielle des sédiments, et selonles saisons, la profondeur de pénétration de l’oxygène dissous varie. La profondeur jusqu'àlaquelle diffuse l’oxygène dans un sédiment est contrôlée par les taux relatifs deconsommation et de diffusion de cet oxygène. En été, les taux de consommation de l’oxygènebenthique sont à leur maximum, vraisemblablement en raison de la température élevée dans lecours d’eau, de la forte biomasse microbienne, ou de la forte charge organique. Parconséquent, la profondeur de pénétration diminue, donc le volume de sédiment pouvant être lesite de la nitrification également. Cependant, la présence d’une nitrification potentielle a puêtre observée à plusieurs reprises dans des strates anoxiques de sédiments. Les nitrifiantsapparaissent donc capables de survivre dans des conditions où l’activité oxydative n’est paspossible. Les nitrifiants présents dans ces couches anoxiques deviennent actifs immédiatementaprès une exposition à l’oxygène dans des tests de nitrification potentielle, suggérant que dansl’environnement, les nitrifiants tirent rapidement profit de l’augmentation de la pénétration del’oxygène en profondeur dans les sédiments.De plus, les nitrifiants qui se trouvent dans les zones anoxiques peuvent recevoir de l'oxygènepar de multiples mécanismes qui entraînent la formation de niches contenant de l'O2 au seinde sédiments anoxiques :


- bioturbations par des macroinvertébrés benthiques (Oligochètes, Polychètes...)(Caffrey et Miller, 1995).

- production d'O2 au niveau des racines des plantes aérenchymateuses, le nitrateproduit pouvant ensuite être utilisé par les bactéries dénitrifiantes présentes dans les sédimentsanoxiques adjacents (Bodelier et al., 1996 ; Risgaard-Petersen et Jensen, 1997).

Facteur commun à tous les milieux d'eau douce superficiels, la compétition avec leshétérotrophes et les algues pour l'ammonium et/ou l'oxygène est à prendre en compte.Ainsi, par exemple, en conditions où la quantité d'ammonium est limitante, les bactériesnitrifiantes, avec leur constante de Michaélis-Menten (Km) élevée et donc leur faible affinitépour l'ammonium comparée à celle des bactéries hétérotrophes, sont de faibles compétiteurs,et n'utilisent donc que l'ammonium non utilisé par les hétérotrophes (Rosswall, 1982 (étude ensol) ; Verhagen et Laanbroek, 1991). Le sort de l'ammonium dépend du rapport C/N del'environnement considéré : en dessous d'un certain rapport C/N, les bactéries hétérotrophessont limitées en carbone, et le surplus d'ammonium est disponible pour les bactériesnitrifiantes (Verhagen et al., 1992 ; Verhagen et Laanbroek, 1991).Si la lumière inhibe les bactéries nitrifiantes (§ 2.4.6), elle permet aussi, grâce à laphotosynthèse par le microphytoplancton épibenthique, la production d'O2 dont dépendent lesbactéries nitrifiantes ; elle offre donc indirectement une zone plus étendue pour la nitrification(Lorenzen et al., 1998 ; Risgaard-Petersen et al., 1994). Cependant, les surfaces de sédimentscolonisées par des microalgues n'hébergent paradoxalement pas une nitrification très élevée ;plusieurs explications sont possibles, dont la compétition entre les microalgues et lesnitrifiants pour l'ammonium, et la production possible par les algues d'agents chimiquesinhibant les nitrifiants (Lorenzen et al., 1998).

À ces facteurs naturels qui régissent la nitrification dans les milieux non anthropisés peuvents'ajouter de façon ponctuelle des stress violents comme une variation brusque du régimehydraulique suite à un orage. Ceci se traduit par une chute de l’activité nitrifiante benthique,conséquente à l’abrasion des biofilms nitrifiants, puis à un retour à une situation d’équilibreaprès une dizaine de jours (Cooper, 1983). Dans une telle situation, la remise en suspension etle déplacement de sédiments fins influencent vraisemblablement aussi fortement lanitrification.

4.3 MILIEUX ANTHROPISES

4.3.1 Impact des activités humaines sur la nitrification

Il peut tout d'abord s'agir de perturbations physiques et mécaniques du milieu, qui vont serépercuter sur les activités biologiques, dont le potentiel nitrifiant. Ainsi, des différences dansle débit de l'eau, la taille des particules des sédiments et l'intensité du trafic de navigation(aération, turbulences) semblent être responsables de différents taux de nitrification observés


dans différents bras du Rhin (Admiraal et Botermans, 1989). La navigation fluviale contribuedonc à l'augmentation des échanges eau-sédiment, et à l'augmentation de la nitrification qui endécoule.

Mais la plupart des modifications de la nitrification sont dues à la présence de perturbationschimiques occasionnées par les activités humaines à travers l'apport dans les milieux decomposés azotés ou de substances toxiques.Les apports d'azote aux milieux anthropisés se présentent essentiellement sous les formesazote organique, NH4

+ (zones urbanisées et industrialisées essentiellement) et NO3-

(caractéristique des zones rurales agricoles, facilement entraînée par lessivage des sols).Les rejets ou apports diffus d'ammonium dans des sites où les conditions de température et depH sont favorables à la dissociation de la forme NH4

+ en la forme libre NH3, inhibant lanitratation et, dans une moindre mesure, la nitritation (§ 2.4.3), peuvent conduire à des taux denitrite anormalement élevés en rivière, entraînant une toxicité pour la faune piscicolenotamment (Smith et al., 1997).En présence de nitrate dans la colonne d'eau, la diffusion de celui-ci vers le compartimentsédimentaire est associée à une augmentation de la dénitrification, qui consommeprogressivement de la matière organique tout en réduisant la demande locale en oxygène ;ceci permet à l'oxygène dissous de diffuser plus profondément et donc à la nitrification des'étendre (Cooke et White, 1987 ; Cooke et White, 1988).Par ailleurs, la présence de nitrate en association avec d'autres nutriments (le phosphore enparticulier) peut conduire au processus d'eutrophisation, dont la conséquence indirecte sur lanitrification est un manque d'oxygène, voire une asphyxie totale du milieu.Enfin, les bactéries nitrifiantes sont sensibles à de nombreux polluants environnementaux telsque les hydrocarbones haliphatiques chlorés, les phénols et benzènes halogénés. Elles sontenviron 10 fois plus sensibles que des bactéries hétérotrophes aérobies (Blum et Speece,1991).

Les rejets de stations d'épuration sont l'une des origines ponctuelles de perturbation desmilieux aquatiques. Outre les effets toxiques qu'ils peuvent engendrer, ces rejets représententégalement une source importante de NH4

+ nitrifiable et de bactéries nitrifiantes. Des étudessur la Seine, en aval de la station d'épuration d'Achères, ont montré que ces bactéries profitentde l'enrichissement en ammonium pour se développer, lorsque les conditions de températureet d'oxygène ne sont pas limitantes, c'est à dire en période d'étiage estival (Brion, 1997).Cependant, cet effet ne pourrait être marqué que plusieurs centaines de kilomètres en aval durejet, car les bactéries nitrifiantes issues du rejet ont besoin de plusieurs jours pour sedévelopper (Chesterikoff et al., 1992 ; Colombini, 1996).Dans une étude sur un cours d'eau de plus petite taille, la densité de nitrifiants (dans lesbiofilms benthiques) en aval d'un rejet de station d'épuration augmente jusqu'à une distance de300 m du rejet, indiquant une possible compétition des nitrifiants avec les hétérotrophes enaval immédiat du rejet (Jancarkova et al., 1997), notamment en raison de la diminution de laconcentration en oxygène dissous (Kennedy et Bell, 1986). Une baisse de l'abondance desnitratants en aval d'un rejet dans une rivière de taille moyenne a déjà été observée par ailleurs


(Montuelle et al., 1996). Montuelle et al. (soumis) ne notent pas d'effet significatif de rejetsde stations d'épurations sur les densités de nitritants et nitratants dans 3 rivières, alors que lesactivité nitritante et nitratante potentielles sont affectées (Il s'agit peut-être ici d'un manque desensibilité de la méthode de dénombrement).

4.3.2 Traitement des eaux résiduaires

Pour des raisons de coûts d’exploitation élevés associés à l'élimination de l'ammoniaque pardes technologies chimiques, la nitrification bactérienne est le procédé le plus courammentutilisé dans l’épuration des eaux usées.La nitrification est une étape importante pour de multiples raisons (Painter, 1986) : nonseulement elle empêche le relargage dans le milieu récepteur de sels ammoniacaux,potentiellement toxiques pour les poissons, mais elle est aussi un préalable indispensable pourl’élimination ultérieure de l’azote par dénitrification, pour éviter l’eutrophisation de la rivière.Enfin, il s’agit d’un indicateur de l’efficacité du traitement en raison de la lenteur de lacroissance et de la sensibilité des nitrifiants (comparés à la plupart des hétérotrophes).Des travaux récents ont montré que les procédés utilisant des biofilms nitrifiants (litsbactériens, disques rotatifs…) offrent la possibilité de surmonter les difficultés rencontréesdans les systèmes de nitrification utilisant des flocs en suspension, telles que l’âge des boues,l’élimination des bactéries nitrifiantes du systèmes par lavage... (Liu et Capdeville, 1996 ;Thörn et al., 1996). En effet, il a été observé à plusieurs reprises que, dans les systèmes àboues activées, durant la sédimentation des boues dans le bassin de clarification, les nitrifiantssont éliminés du système par lessivage (Oga et al., 1991). Ceci résulte vraisemblablement decaractéristiques de sédimentation et de floculation des bactéries nitrifiantes différentes decelles des hétérotrophes.Cependant, l’installation et le maintien d’une nitrification efficace sont également délicatsdans les systèmes à biomasse fixée, car les caractéristiques d’attachement des bactériesnitrifiantes sont inférieures à celles des hétérotrophes (Oga et al., 1991).Il faut aussi noter que, avec l’accroissement de la production et de l’usage de substanceschimiques synthétiques, les risques de présence d’inhibiteurs dans les stations d’épuration ontaugmenté, et ce type d'inhibition est parfois la cause d’une nitrification à un taux insatisfaisant(Painter, 1986). Cette inhibition est due essentiellement à des substances rejetées par lesindustries (Blum et Speece, 1991 ; Jonsson et al., 1996 ; Schweighofer et al., 1996).De nouveaux procédés d'élimination de l'azote sont développés, associés à des outilsperformants de suivi des activités microbiennes associées (Verstraete et Philips, 1998).

Comme dans les milieux naturels, les organismes nitrifiants en station d’épuration ontlongtemps été supposés majoritairement autotrophes, avec les genres Nitrosomonas etNitrobacter dominants (Painter, 1986). La présence d'autres genres (Nitrosococcus,Nitrosospira, Nitrospira) a récemment été montrée (Burrell et al., 1999 ; Juretschko et al.,1998 ; Schramm et al., 1999).Ces bactéries nitrifiantes présentes en station d’épuration pourraient provenir des eaux delessivage des sols où elles sont fixées à des particules, et pénétrer dans les réseaux d’égouts,


où elles colonisent les surfaces aux endroits où les conditions sont favorables à leur croissance(Brion, 1997 ; Sandén et al., 1996). Des facteurs environnementaux essentiels à ces bactéries,tels que du carbone inorganique, une source d’énergie et de l’oxygène, sont certainementprésents à plusieurs endroits dans le réseau d’égout, ce qui leur permet d'arriver ainsi jusqu'àl’entrée de la station d'épuration.Lors d’une étude menée sur une station d’épuration de grande taille à Stockholm, il a étémontré que la quantité de nitrifiants présents dans la station d’épuration peut être influencéepar les activités humaines domestiques et industrielles raccordées au réseau (Sandén et al.,1996).

4.4 LA NITRIFICATION COMME INDICATEUR DE PERTURBATION OU DE TOXICITE

La nitrification a de larges conséquences pour la qualité des systèmes aquatiques : elle peutd'une part être un processus important en relation avec la toxicité du NH4

+ et du NO2- dans les

sédiments, et d'autre part, elle est sensible à de multiples paramètres et polluantsenvironnementaux.La nitrification peut donc être un indicateur écologique de la santé des rivières traversant deszones urbanisées et industrialisées, puisqu'elle est sensible non seulement à la concentrationen ammoniaque et en acide nitreux non ionisés (NH3 et HNO2), mais aussi à des toxiqueschimiques (Botermans et Admiraal, 1989).L'apparition de nitrite dans les sédiments de nombreuses rivières, vraisemblablement enrelation avec une conversion du nitrate en nitrite par des dénitrifiants facultatifs (Kelso et al.,1997), incite à s'orienter vers de nouveaux indicateurs écologiques du fonctionnement desrivières (Verstraete et Philips, 1998). Il s'agirait ici de prendre en compte les communautésnitrifiantes et dénitrifiantes.

Étant donnés le rôle important des bactéries nitrifiantes dans le processus d'élimination del'azote en station d'épuration, et la sensibilité des bactéries nitrifiantes à de multiplespolluants, de nombreux tests de toxicité basés sur la réponse des nitrifiants aux toxiques sontdéveloppés pour des applications en traitement des eaux.Certains tests sont basés sur des mesures directes ou indirectes de l'activité nitrifiante(Gernaey et al., 1998 ; Gernaey et al., 1997 ; Massone et al., 1998 ; Massone et al., 1996).D'autres utilisent les bactéries nitrifiantes comme organismes tests. Les nitratants (genreNitrobacter) ont été utilisés (Wang et Reed, 1984 ; Williamson et Johnson, 1981), mais ils sesont révélés moins sensibles que les nitritants (genre Nitrosomonas) (Hockenburry et Grady,1977), qui sont dorénavant davantage utilisés (Blum et Speece, 1991 ; Iizumi et al., 1998).

CHAPITRE III

IMPACT DE REJETS DE STATIOND'EPURATION SUR LA NITRIFICATION EN

SEDIMENT DE RIVIERE :ETUDE EN MICROCOSMES

CHAPITRE III : ÉTUDE EN MICROCOSMES 58

IMPACT DE REJETS DE STATION D 'EPURATION SUR LA NITRIFICATIONEN SEDIMENT DE RIVIERE : ETUDE EN MICROCOSMES

1 INTRODUCTION................................................................................................. 60

2 1ÈRE PARTIE : MESURE DES ACTIVITÉS NITRITANTE ET NITRATANTE POTENTIELLES

EN SÉDIMENT.................................................................................................... 61

2.1 CHOIX DE LA MÉTHODE DE MESURE D'ACTIVITÉ NITRIFIANTE ................................................... 61

2.2 MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................................. 62

2.2.1 Sédiment................................................................................................................. 622.2.2 Dosage des formes de l'azote ................................................................................. 622.2.3 Protocole de mesure des activités potentielles......................................................... 632.2.4 Estimation de la variabilité de la méthode retenue ................................................... 642.2.5 Estimation de l'évolution des communautés nitritante et nitratante au cours

de l'incubation ......................................................................................................... 642.3 RÉSULTATS....................................................................................................................... 65

2.3.1 Interactions des inhibiteurs sur les dosages............................................................. 652.3.2 Mesures de nitrification potentielle sur le sédiment de la Chalaronne....................... 652.3.3 Bilans en azote au cours des incubations ................................................................ 662.3.4 Variabilité de la méthode ......................................................................................... 682.3.5 Evolution des MPN au cours de l'incubation ............................................................ 68

2.4 DISCUSSION : AVANTAGES ET LIMITES DE LA MÉTHODE ......................................................... 69

3 2ÈME PARTIE : ÉTUDE EN MICROCOSMES ............................................................. 72

3.1 MATÉRIELS ET MÉTHODES .................................................................................................. 72

3.1.1 Microcosmes........................................................................................................... 723.1.1.1 Sédiment .........................................................................................................................723.1.1.2 Effluents ............................................................................................................... ...........723.1.1.3 Eau de rivière ..................................................................................................................723.1.1.4 Réacteurs........................................................................................................................72

3.1.2 Démarche expérimentale ........................................................................................ 733.1.2.1 Estimation de la variabilité intra- et inter-réacteurs ............................................................733.1.2.2 Impact des effluents.........................................................................................................73

3.1.3 Analyses ................................................................................................................. 743.1.3.1 Dénombrements bactériens .............................................................................................743.1.3.2 Activités nitritante et nitratante potentielles .......................................................................753.1.3.3 Suivi des réacteurs : bilans entrée/sortie...........................................................................75

3.1.4 Analyse de données................................................................................................ 753.2 RÉSULTATS....................................................................................................................... 76

3.2.1 Variabilité intra- et inter-réacteurs............................................................................ 763.2.2 Effet des effluents sur les communautés et activités nitrifiantes ............................... 78

3.2.2.1 Observations préliminaires ...............................................................................................783.2.2.2 Comportement du tronçon témoin “non perturbé” R0-R1 ...................................................803.2.2.3 Effet "global" des effluents................................................................................................803.2.2.4 Effet d’un effluent non nitrifié ............................................................................................823.2.2.5 Effet d’un effluent nitrifié...................................................................................................843.2.2.6 Effet d’un mélange d’effluents nitrifié et non nitrifié............................................................853.2.2.7 Effet inoculum des effluents .............................................................................................873.2.2.8 Bilan entrée/sortie des réacteurs (cas de l'effluent nitrifié) .................................................883.2.2.9 Bilan global des 3 séries ..................................................................................................89


3.3 DISCUSSION...................................................................................................................... 90

3.3.1 Effet "substrat" et effet "inoculum" des effluents de station d'épuration.................... 903.3.1.1 Cas de l'effluent non nitrifié ..............................................................................................903.3.1.2 Cas de l'effluent nitrifié.............................................................................................. .......933.3.1.3 Discussion générale.........................................................................................................94

3.3.2 Pertinence des paramètres étudiés ......................................................................... 953.3.2.1 Communautés et populations nitrifiantes...........................................................................953.3.2.2 Activité nitrifiante..............................................................................................................963.3.2.3 Activité potentielle en tant que mesure de taille de communauté ?.....................................97

3.3.3 Travail en microcosmes........................................................................................... 983.3.4 Transposition au terrain des résultats en microcosmes............................................ 99

4 CONCLUSION ................................................................................................. 101


1 INTRODUCTION

Parmi les paramètres qui peuvent expliquer des modifications de la nitrification dans un coursd'eau soumis à un rejet de station d'épuration, certains sont sous la dépendance :

- de l'environnement global : température, pH, oxygène dissous…- de l'effluent : matière organique, ammonium, nitrite, nitrate, contaminants, bactéries

hétérotrophes, bactéries nitrifiantes…- des communautés nitrifiantes elles-mêmes : abondance et diversité des communautés

autochtones et des communautés issues de la station d'épuration.Tous ces facteurs interagissent et il est difficile de dissocier leurs effets sur la nitrification.Ainsi, lors d'une étude de terrain comparant en différents sites la densité et l'activitépotentielle des bactéries nitrifiantes en amont et aval de stations d'épuration, Montuelle et al.(soumis) ont montré que la conjonction de l'ensemble des paramètres crée des conditionsenvironnementales uniques sur chaque site. Cette spécificité liée au site empêche unegénéralisation de la prévision de l'impact d'un rejet de station d'épuration, bien que dans tousles cas, des modifications du potentiel nitrifiant ont été observées en aval du rejet.Afin de mieux comprendre le processus de nitrification in situ, et les modifications qu'il peutsubir en lien avec un rejet de station d'épuration, il est nécessaire au préalable de tenter dedissocier les différents facteurs qui interviennent dans la régulation de ce processus.Les facteurs liés à l'environnement sont à présent relativement bien connus (cf chapitre II).Nous allons nous intéresser plus particulièrement aux facteurs directement liés à l'effluent,notamment à l'enrichissement en sels azotés et en bactéries nitrifiantes que ces rejets peuventreprésenter.Nos objectifs sont :

- d'une part d'évaluer l'impact de rejets de stations d'épuration sur les deux étapes de lanitrification (nitritation et nitratation) en sédiments de rivière,

- d'autre part de tenter d'évaluer séparément l'effet des apports d'ammonium ("effetsubstrat") et de l'inoculum en bactéries nitrifiantes ("effet inoculum").Pour répondre à ces objectifs, nous devons au préalable définir un protocole d'étude, avec desoutils adaptés. Nous allons donc dans un premier temps travailler à la standardisation d'uneméthode de mesure de l'activité nitrifiante potentielle en sédiment, dissociant les 2 étapes(nitritation et nitratation), et à l'adaptation d'un système de microcosmes, qui permet desimuler un sédiment de rivière soumis à différents types de rejets de station d'épuration touten s'affranchissant des contraintes du terrain en contrôlant certains paramètres. Nousréaliserons ensuite des expériences avec un effluent dit "non nitrifié" (à teneur élevée en NH4

+

et assez peu de bactéries nitrifiantes) et avec un effluent dit "nitrifié" (contenant beaucoupmoins de NH4

+ et 10 fois plus de bactéries nitrifiantes) afin de qualifier leur effet respectif surles communautés nitrifiantes du milieu récepteur, au point de vue densité et activité.


2 1ERE PARTIE : MESURE DES ACTIVITES NITRITANTE ET NITRATANTEPOTENTIELLES EN SEDIMENT

2.1 CHOIX DE LA METHODE DE MESURE D'ACTIVITE NITRIFIANTE

Nous avons vu (chapitre II) que, in situ, les taux de nitrification peuvent être mesurés etcalculés grâce à des méthodes isotopiques ou non isotopiques, basées sur des dosageschimiques.Les principaux isotopes utilisés sont le 15N et le 14C. Les méthodes utilisant le 15N sont desméthodes de mesure directe de l'activité nitrifiante, consistant à suivre l'apparition de 15NO2

-

et de 15NO3- dans un échantillon enrichi en 15NH4

+ (Enoksson, 1986 ; Lipschultz et al., 1986),ou bien à suivre la dilution isotopique suite à la production de 14NO3

- dans un échantilloninitialement enrichi en 15NO3

- (Rysgaard et al., 1993). La méthode au bicarbonate marqué au14C est une mesure indirecte de l'activité nitrifiante, basée sur la chimioautotrophie desbactéries nitrifiantes : l'oxydation du NH4

+ en NO3- permet aux bactéries nitrifiantes

d'incorporer du bicarbonate pour la synthèse de leur biomasse. Un taux d'incorporation de 14Cest calculé en mesurant la différence d'incorporation de H14CO3

- dans deux échantillons : l'untraité par un inhibiteur de la nitrification chimioautotrophe, l'autre non traité. Le rapportCincorporé/Noxydé est préalablement déterminé et est considéré comme constant dans desconditions expérimentales définies (Billen, 1976 ; Brion et Billen, 1998).Le principe des méthodes non isotopiques consiste à mesurer les changements deconcentration des sels azotés (NH4

+, NO2-, NO3

-) au cours d'une incubation en présence ounon (échantillon témoin) d'inhibiteur(s) spécifique(s) de la nitrification (Fosset et Bianchi,1995).D'autres techniques sont également utilisées, par exemple : une mesure du taux d'oxygèneconsommé ou du taux de protons produits par la nitrification (Massone et al., 1996), unemesure de la nitrification par dénitrification, en dosant par chromatographie le N2O produitpar dénitrification du NO3

- (Lensi et al., 1986).

Le but de notre travail est ici de définir un protocole standardisé pour la suite de nosexpérimentations, adapté au matériau avec lequel nous travaillons et à nos conditionsd'expériences.Les mesures d'activité réelle décrivent une situation dans laquelle le taux de nitrificationévalué intègre de multiples interactions du milieu sur les communautés impliquées(notamment : quantité de substrat disponible, température, oxygène, pH…). L'activitépotentielle, qui exprime le potentiel enzymatique de la communauté nitrifiante, permetd'étudier l'effet éventuel de certains facteurs sur cette communauté, en restreignant lavariabilité due à des paramètres environnementaux non contrôlés. Nous avons choisi cettedernière approche, et défini notre protocole de mesure en considérant à la fois la nécessité dedistinguer les deux étapes de la nitrification et les moyens techniques à notre disposition aulaboratoire. La méthode retenue, dite de "slurry", consiste en une incubation du sédiment enprésence d'une solution contenant le substrat azoté de la nitrification (NH4

+) et d'inhibiteursspécifiques de la nitritation ou de la nitratation, avec un dosage de l'azote minéral (NH4

+, NO2

-


et NO3

-) à différentes étapes de l'incubation. Les inhibiteurs choisis sont : l'allylthiourée(C4H8N2S), qui inhibe la nitritation en chélatant le groupement cuivre de l'enzyme ammoniummonooxygénase, et le chlorate de sodium (NaClO3), qui inhibe la nitratation.Les étapes pour le choix de la méthode et l'élaboration du protocole sont résumées enannexe 1.

2.2 MATERIELS ET METHODES

2.2.1 Sédiment

Le sédiment utilisé pour ces mises au point a été prélevé dans la rivière Chalaronne (Ain). Sescaractéristiques physico-chimiques sont résumées dans le tableau III-1.

Tableau III - 1 : Caractéristiques physico-chimiques du sédiment de la Chalaronne.

Texture (%) Corg Norg C/N

500-200 µm 200-50 µm 50-0 µm (% poids sec)

Chalaronne 12.3 32.2 55.5 5.5 0.55 10

2.2.2 Dosage des formes de l'azote

Les méthodes de dosage des sels azotés retenues pour les mesures d'activités potentielles sontles suivantes :

- NH4+ : méthode spectrophotométrique au bleu d’indophénol. Norme française

homologuée NF T90-015.- NO2

- : méthode par spectrométrie d’absorption moléculaire. Norme internationaleISO 6777-1984(F).

- NO3- : méthode spectrométrique au diméthyl-2,6 phénol. Norme internationale ISO

7890/1-1986(F) (11).Pour des raisons pratiques (grand nombre d'échantillons à traiter), les volumes utilisés dansces protocoles ont été réduits (protocoles en annexe 2).La linéarité de ces méthodes dans un milieu "complexe" (en sédiment) a été vérifiée parl'établissement de 3 gammes étalons (NH4Cl, NaNO2, KNO3) en présence de sédiment(origine : rivière d’Ain) : à 3 g de sédiment humide (stérilisé par autoclavage) ont été ajoutés6 ml de différentes concentrations des solutions étalons. Après homogénéisation au vortex 30secondes, l'ensemble a été centrifugé (17000 g, 15 min.), puis une prise d'essai pour un dosagede la forme azotée concernée a été effectuée dans le surnageant.L'influence éventuelle de la présence d'allylthiourée ou de chlorate sur le résultat du dosage deces sels azotés a également été recherchée. Des solutions de (NH4)2SO4, NaNO2 et KNO3 enconcentrations connues ont été préparées (6 mg/l et 60 mg/l N-NH4

+, 2 et 20 mg/l N-NO2- et

(11) Cette méthode, en cours de normalisation lors de nos expériences, n'a finalement pas été homologuée.


N-NO3-), puis dosées, en présence d'allylthiourée (concentration finale 1.7 mM) ou de

chlorate (concentration finale 9.3 mM), ou en l'absence d'inhibiteur.

2.2.3 Protocole de mesure des activités potentielles

Des essais préliminaires d’incubations de sédiment humide en tubes, en présence ou nond’inhibiteurs spécifiques de la nitritation ou de la nitratation ont fait apparaître deuxinconvénients majeurs : une oxygénation insuffisante (donnant lieu à une dénitrificationsimultanée : perte de NO2

-), et des faibles variations de concentrations des sels azotés,entraînant d’importantes erreurs d’estimations des activités. Des essais d’incubations pendant6, 24, 48, 72 heures, ont montré que, pour le sédiment étudié, les variations de concentrationsen sels azotés ne sont significatives qu’entre 24 et 48 h. De même, l’introduction desinhibiteurs à t0 des incubations pose un problème pour la nitratation, car l’absence de substraten quantité suffisante pour cette étape ne permet pas l’expression de tout le potentielenzymatique.Nous avons donc abouti à un protocole impliquant une incubation en volume relativementgrand (125 ml de "slurry" en erlenmeyer de 250 ml), pendant une durée de 96 heures, à 28°C(température optimale de croissance pour les bactéries nitrifiantes), à l’obscurité et sousagitation (100 rpm).

- t0h : à 12.5 g de sédiment humide sont ajoutés 100 ml d'eau Milli-Q et 12.5 ml d'unesolution riche en ammonium (NaHCO3 60 mM ; (NH4)2SO4 20 mM). Trois répétitions sonteffectuées par échantillon de sédiment.

- t0h à t48h : acclimatation du sédiment aux conditions de l’expérience et production deNO2

- à partir du NH4+ fourni à t0h.

- t48h : introduction des inhibiteurs spécifiques :- 1.25 ml d'une solution d'allythiourée 172 mM (concentration finale 1.7 mM),pour inhiber la nitritation (et donc mesurer la nitratation) dans un premiererlenmeyer.- 1.25 ml d'une solution de chlorate de sodium 939 mM (concentration finale9.3 mM), pour inhiber la nitratation (et donc mesurer la nitritation) dans unsecond erlenmeyer.- le troisième erlenmeyer ne reçoit pas d'inhibiteur.

- t48h à t96h : cinétique de nitrificationDes aliquotes sont prélevées à t0h, t48h et t96h, centrifugées (17000 g, 15 min.), et les sels azotéssont dosés dans les surnageants selon les méthodes spectrophotométriques citées plus haut.

Les activités potentielles peuvent alors être calculées comme suit :

avec : AP : activité potentielle en mg N oxydé (ou produit) par gramme de sédiment sec et par jourNt48h et Nt96h : concentration en N-NH4

+, N-NO2- ou N-NO3

- en mg/l au temps t48h et t96h

V : Volume de "slurry" en litres (0.125)P : poids humide du sédiment en grammes (12.5)p : poids sec du sédiment en % sec/humide

2pP

V)N(NAP

t48ht96h

×××−=


2.2.4 Estimation de la variabilité de la méthode retenue

Trois séries d'incubations et de mesures (sans inhibiteur, avec ATU, avec chlorate) ont étéréalisées en triplicats avec le sédiment de la Chalaronne selon le protocole décritprécédemment (§ 2.2.3). Des activités nitritante et nitratante potentielles ont été calculéespour chaque répliquat à partir des dosages de NH4

+, NO2- et NO3

-. Un coefficient devariabilité de la méthode a été calculé.

2.2.5 Estimation de l'évolution des communautés nitritante et nitratante au coursde l'incubation

L’objectif est ici de déterminer si nous avons des variations significatives d'effectif descommunautés nitritante et nitratante au cours des incubations, susceptibles de causer un biaisdans l'estimation des activités potentielles.Des aliquotes de 10 ml ont été prélevées aux temps 0, 24, 48, 72 et 96 h dans les erlenmeyersservant aux incubations pour les mesures d'activités potentielles. À partir de chaque aliquote,5 ml ont été utilisés pour la préparation de suspensions-dilutions pour un dénombrement parMPN-Griess des communautés nitritante et nitratante (12), les 5 autres étant réservés pour unemesure de poids sec.La technique de MPN-Griess a été adaptée de la méthode de Schmidt et Belser (Schmidt etBelser, 1994) et réalisée en microplaques 24 puits (Falcon). Les milieux autotrophes utiliséssont les suivants :

- milieu de Schmidt et Belser (1994) (avec NH4+ 7.6 mM) pour les nitritants

(annexe 5)- milieu de Bock et al. (1983), (concentration en NO2

- ajustée à 5 mM) pour lesnitratants (annexe 5).Ces milieux (1.6 ml par puits) sont inoculés avec des suspensions-dilutions de sédiment au1/10e (0.4 ml par puits). Cinq répétitions sont réalisées par niveau de dilution.Les incubations sont effectuées à 28°C pendant 9 semaines (cf chapitre V).Les nombres les plus probables et leurs intervalles de confiance à 95 % sont calculés à l'aidedes tables statistiques de Cochran (Alexander, 1965).

(12) Nous parlerons par la suite de "MPN nitritants" et de "MPN nitratants".


2.3 RESULTATS

2.3.1 Interactions des inhibiteurs sur les dosages

Seul le dosage de la forme NO3- en présence de chlorate présente un biais significatif par

rapport au témoin sans inhibiteur. La concentration en nitrate est surestimée : + 59 % dans lecas d'une solution à 20 mg/l N-NO3

- à + 116 % dans le cas d'une solution à 2 mg/l N-NO3-

(figure III-1).

Figure III - 1 : Effet de la présence des inhibiteurs allylthiourée (ATU) et chlorate sur les dosages des

sels azotés. Les barres horizontales représentent les concentrations réelles des solutions (6 et 60

mg/l de N-NH4+, 2 et 20 mg/l de N-NO2

- et N-NO3-). Les barres d'histogrammes représentent les

concentrations mesurées (moyennes de triplicats ± écarts-types).

2.3.2 Mesures de nitrification potentielle sur le sédiment de la Chalaronne

La linéarité des vitesses de consommation ou production des sels azotés entre 48 et 96 heuresd'incubation a été vérifiée (annexe 3).

Figure III - 2 : Activités nitrifiante, nitritante et nitratante potentielles dans le sédiment de la

Chalaronne : évolution des composés azotés. Les concentrations en sels azotés (moyennes de

triplicats ± écarts-types) ont été ramenées à 1 g de sédiment sec. ↓ : ajout d'inhibiteur.

té m o in sa n s in h ib i te u r :

n i tri fica tio n g lo b a le

0

200

400

600

800

1000

0 48 96

durée d'incubation (h)

N-N

H4+

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

0

100

200

300

400

500

600

N-N

O2

- , N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

N-NH4+

N-NO 2-

N-NO 3-

a ve c ch lo ra te :

m e su re n i tri ta tio n

0

200

400

600

800

1000

0 48 96


N-N

H4

+

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

0

50

100

150

200

N-N

O2

- , N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

a ve c AT U :

m e su re n i tra ta tio n

0

200

400

600

800

1000

0 48 96


N-N

H4

+

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

0

50

100

150

200

N-N

O2

- , N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

60

20

0

10

20

30

40

50

60

70

témoin ATU chlorate[N

-] (

mg

/l)

N-NH4+

N-NO2-

N-NO3-

6

2

0

1

2

3

4

5

6

7

témoin ATU chlorate

[N-]

(m

g/l

)


La production de NO2-, plus faible en présence de chlorate que dans les incubations témoin,

montre que la nitritation est partiellement inhibée en présence de chlorate (figure III-2).

2.3.3 Bilans en azote au cours des incubations

Pendant les deux phases de mesures (0-48 h et 48-96 h), le bilan en azote n'est pas équilibré :ni entre ses formes (figure III-3), ni en terme de bilan global (figure III-4).

Figure III - 3 : Dynamique de l’azote au cours des incubations pour les mesures d'activités

potentielles. Les valeurs sont des moyennes de triplicats. La valeur 0 signifie qu’il n’y a pas de

variation. * : Les mesures de NO3- en présence de chlorate présentent un biais et ne sont pas prises

en compte.

Figure III - 4 : Bilans en azote au cours des incubations pour les mesures d'activités potentielles :

évolution de la somme des teneur en sels azotés dissous (moyennes de triplicats ± écarts-types).

-210

-562

-203

-196

483

-34

303

-62

71

74

72

79

41

12

40

41

-800 -600 -400 -200 0 200 400 600 800

évolution des form es azotées (µg N/g séd sec )

N-NH4+

N-NO2-

N-NO3-

tém oin : 0-48 h

+ ATU : 0-48 h

tém oin : 48-96 h

+ ATU : 48-96 h

+ chlorate : 0-48 h

+ chlorate : 48-96 h *

apparit ion disparition

650

700

750

800

850

900

950

1000

0 48 96


N-N

H4

+ +

N-N

O2

- + N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

se

c)

tém oin

+ A TU

+ chlorate


� Phase 0-48 h :

Moins de N-(NO2-+NO3

-) apparaît que de N-NH4+ disparaît (figure III-3), et nous perdons

environ 100 µg de N-(NH4++NO2

-+NO3-)/g sédiment sec (figure III-4), ce qui nous conduit à

émettre plusieurs hypothèses :- Une partie du N-NH4

+ qui disparaît entre t0h et t48h n'est pas nitrifiée, mais :- soit est partiellement adsorbée sur les particules de sédiment (fractionargilo-limoneuse)- soit est partiellement assimilée par des microorganismes nonnitrifiants.

- Une partie du N-(NO2-+NO3

-) produit par nitrification n'apparaît pas dans le bilan carelle est dénitrifiée dès sa formation (bien que le test se déroule en conditions aérées).

� Phase 48-96 h :

� Incubations "témoins":Plus de N-(NO2

-+NO3-) apparaît que de N-NH4

+ disparaît (figure III-3), et la concentration deN inorganique dissous augmente : la valeur à t96h dépasse celle de la concentration initiale (t0h)de plus de 100 µg N/g séd sec (figure III-4).Nous proposons une nouvelle hypothèse : La quantité de N-NH4+ disparue est sous-estimée,car : - du N-NH4

+ adsorbé pendant la phase 0-48 h est désorbé pendant cette deuxièmephase (compatible avec la diminution de pH pendant cette phase de nitrification intense) etn'apparaît pas dans le bilan car cette fraction est immédiatement nitrifiée.

- du N-NH4+ est produit par des bactéries hétérotrophes par ammonification de la

matière organique durant l'incubation et est immédiatement nitrifié. Si tel était le cas, cetteproduction de N-NH4

+ devrait apparaître dans les incubations en présence d'ATU. Or nous nenotons qu'une très faible augmentation de 3.2 µg N/g séd sec en moyenne entre t48h et t96h

(non visible sur la figure III-3), qui ne peut, à elle seule, expliquer la différence entre lesvariations de concentrations en N-NH4

+ et N-(NO2-+NO3

-).

� Incubations avec ajout d'ATU :Du NH4

+ apparaît en très faible concentration : 3.2 µg N/g séd sec (non visible sur la figureIII-3) ; il pourrait avoir deux origines :

- comme dans le cas des témoins, une désorption du NH4+ adsorbé, mais nous

n'observons pas de baisse de pH ici, car l'activité nitritante est bloquée ; nous ne sommes doncpas dans des conditions particulièrement favorables à la désorption du NH4

+.- une production biologique par ammonification.

L'augmentation de la concentration de N-NO3- ne compense pas la perte de N-NO2

-. Unepartie du NO3

- produit par nitratation serait "perdue" par réduction (dénitrification,assimilation ou dissimilation).

� Incubations avec ajout de chlorate :Du NO2

- est produit par nitritation à partir du NH4+. La diminution de la concentration en N-

NH4+ dans la phase dissoute ne compense pas tout à fait la production de N-NO2

-.


Ceci peut être à relier à une possible désorption, entre t48h et t96h, d'une partie du NH4+ adsorbé

pendant la phase 0-48h, en raison d'une légère baisse de pH (beaucoup moins importante quedans les incubations "témoin" : quelques dixièmes d'unité pH) pendant cette seconde phase.L'évolution de la concentration de N-NO3

- n'est pas à prendre en compte ici, puisque lamesure à t96h est biaisée par la présence de chlorate. Nous savons que cette mesure acertainement été surestimée à t96h (§ 2.3.1), et par conséquent la perte de N-NO3

- dans lafraction dissoute entre t48h et t96h sous-estimée. Il y a donc vraisemblablement une disparitiondu NO3

- au cours de l'incubation. Encore une fois, il pourrait notamment s'agir dedénitrification.

2.3.4 Variabilité de la méthode

La variabilité la plus faible a été obtenue pour les activités déterminées à partir des mesuresde NO2

- : le coefficient de variation est de 5.7 % pour la nitritation et de 6.7 % pour lanitratation (tableau III-2). Ces valeurs traduisent une répétabilité satisfaisante de la méthode.

Tableau III - 2 : Variabilité de la méthode de mesure de la nitrification potentielle : coefficients de

variations exprimés en %, à partir de mesures réalisées en triplicats avec le sédiment de la

Chalaronne.

mesure de la consommation ou production de :

NH4+ NO2

- NO3-

nitritation 12.2 5.7 -

nitratation - 6.7 19.8

2.3.5 Evolution des MPN au cours de l'incubation

L'évolution des MPN nitritants et nitratants au cours d'une incubation dans les conditions demesures des activités potentielles est représentée sur la figure III-5.

Figure III - 5 : Évolution des MPN nitritants et nitratants dans le sédiment au cours d'une incubation

pour une mesure d'activité potentielle. ↓ : introduction des inhibiteurs. Les intervalles de confiance à

95 % sont figurés.

M P N n itri ta n ts

1,0E + 04

1,0E + 05

1,0E + 06

1,0E + 07

1,0E + 08

1,0E + 09

1,0E + 10

0 24 48 72 96

inc ubat ion ac tivité (h)

M P N n itra ta n ts

1,0E + 04

1,0E + 05

1,0E + 06

1,0E + 07

1,0E + 08

1,0E + 09

1,0E + 10

0 24 48 72 96

inc ubat ion ac tivité (h)

tém oin

A TU

c hlorate


Pendant la période d'acclimatation du test (0 à 48 h), nous ne notons pas de changementsignificatif concernant les MPN nitritants, alors que nous observons une tendance à ladiminution des valeurs moyennes des MPN nitratants : une seule série sur 3 présente un MPNnitratants significativement différent à 0 et 48 h.Au cours de la période 48 à 96 h, dans l'incubation témoin sans inhibiteur, le MPN nitritantsaugmente de une unité log, tandis que le MPN nitratants est relativement stable. La présenced'ATU provoque, comme nous pouvions nous y attendre en raison de son mode d'action (auniveau de l'ammonium monooxygénase) et du principe de la méthode MPN (détection d'uneactivité), une chute du MPN nitritants. Celle-ci n'intervient cependant qu'entre la 72ème et la96ème heure d'incubation (2.4 unités log de différence entre l'incubation sans inhibiteur et celleavec ATU). La présence de chlorate entraîne une légère baisse du MPN nitratants, quiintervient entre la 48ème et la 72ème heure. Dans ces conditions, une baisse sensible estégalement observée pour le MPN nitritants, mais celui-ci atteint le niveau du témoin après 96h d'incubation.Globalement, pendant la durée du test, nous observons :

- Dans le cas des incubations sans inhibiteur, une augmentation du MPN nitritants(environ une unité log) et une tendance à la diminution du MPN nitratants (différence nonsignificative entre 0 et 96 h). Cette évolution des communautés est liée aux conditions du test(modification du taux d'humidité du sédiment, apport de substrat, changement de température,de conditions de pH et d'oxygène…), indépendamment de l'effet des inhibiteurs.

- Un effet de chacun des deux inhibiteurs sur la communauté cible, mais également surla communauté non cible dans le cas du chlorate. Cet effet "croisé" du chlorate sur lacommunauté nitritante semble transitoire.

2.4 DISCUSSION : AVANTAGES ET LIMITES DE LA METHODE

La méthode retenue offre la possibilité de distinguer les 2 étapes de la nitrification et demesurer simplement les 2 activités associées. Elle présente cependant des biais dont il fauttenir compte dans l'interprétation des mesures.

Inhibition partielle de la nitritation en présence de chlorate :Nos résultats montrent une inhibition partielle de la nitritation en présence de chlorate. Ceci adéjà été observé à plusieurs reprises dans la littérature (Hynes et Knowles, 1983 ; Wissmar etal., 1985). L'effet inhibiteur serait dû à la forme chlorite (ClO2

-) produite par réduction de laforme chlorate (ClO3

-) par, notamment, les bactéries nitratantes (Hynes et Knowles, 1983).Mais le chlorate est à ce jour le seul inhibiteur reconnu comme "spécifique" de la nitratation.D’après l’évolution du MPN nitritants au cours de l’incubation en présence de chlorate, l’effetde cet inhibiteur sur la communauté semble transitoire. La synthèse rapide de nouvellesenzymes Amo pourrait compenser cette inhibition entre la 72ème et la 96ème heure.


Manque de linéarité des activités potentielles entre le début et la fin du test :Il est visible sur les témoins de nitrification globale. Ceci est à mettre en relation avec lesmodifications d'effectifs des communautés nitritantes et nitratantes au cours du test,notamment avec l'augmentation du MPN nitritants. Malgré le long temps de génération desbactéries nitrifiantes, celles-ci semblent capables de s'adapter rapidement aux nouvellesconditions qui leur sont imposées (apport de substrat, température…). Une augmentation de 1log du MPN nitritants est vraisemblablement liée à la coexistence de deux phénomènes :croissance de la communauté et augmentation du taux de bactéries actives, les bactéries endormance étant stimulées par les conditions favorables de l'incubation pendant le test.Cependant, pendant la phase de mesure proprement dite (48-96 h), les vitesses deconsommation ou de production des composés azotés sont quasiment linéaires (annexe 3).

N.B. : L'accumulation de NO2- dans les incubations témoin n'est pas liée à une inhibition des

bactéries nitratantes par de l'ammonium libre, car la concentration d'ammonium libre, estimée,en fonction de la concentration en NH4

+, du pH et de la température, d'après la formule deBarnabe (Smith et al., 1997) est inférieure au seuil toxique de 1 mg/l (Anthonisen et al., 1976)tout au long des incubations. De la même façon, une inhibition de la nitratation par laformation d'acide nitreux (Anthonisen et al., 1976) est également peu probable.

Bilan en azote non équilibré :Des successions d'"adsorption-désorption" du NH4

+ pendant la période d'incubation semblentnon négligeables :- Phase 0-48h : Une grande quantité de NH4

+ est ajoutée dans le milieu d'incubation.L'agitation provoque une augmentation de la surface spécifique du sédiment (fractionnementdes agrégats) et des contacts entre les particules et les ions NH4

+, ce qui favorise l'adsorptiondu NH4

+ sur la fraction argilo-limoneuse.- Phase 48-96h : Le sédiment est saturé en NH4

+. L'activité nitrifiante provoque uneacidification du milieu : perte de plus de 1.5 unité pH (résultats non montrés) dans certains casmalgré la présence de NaHCO3 pour tamponner le milieu d'incubation. Les protons H+ entrenten compétition avec les ions NH4

+ pour la fixation sur les particules. Des ions NH4+ sont

désorbés et libérés dans le milieu, ce qui expliquerait que la consommation "apparente" de N-NH4

+ ne compense pas la production de N-(NO2-+NO3

-).Cette hypothèse de désorption du NH4

+ entre t48h et t96h due à l'acidification du milieuconcorde avec l'absence d'apparition importante de NH4

+ dans le cas des incubations enprésence d'ATU, pour lesquelles le pH ne diminue pas de façon notable pendant l'incubation.

Dans tous les cas, le bilan en azote n'est pas équilibré. Il est difficile d'en expliquer les causes,car, outre de la nitrification, pour laquelle les conditions d'incubation sont ajustées, il coexistede multiples autres processus biologiques (ammonification, assimilation, dénitrification…) etphysico-chimiques (adsorption-désorption) que nous n'avons pas quantifiés.Le nitrite, en tant qu'intermédiaire de la nitrification, et peu impliqué dans les autres processuspré-cités, apparaît comme le meilleur indicateur de chacune des deux activités potentielles.


) En conclusion :Nous avons établi un protocole distinguant les deux étapes de la nitrification en sédiment(figure III-6).L’utilisation des variations de concentration en nitrite uniquement pour les mesures d'activitésnitritantes et nitratantes potentielles sera maintenue dans la suite de nos travaux, pourplusieurs raisons :

- Le nitrite est impliqué dans les deux étapes qui nous intéressent. Le seuil de détectionlié à la méthode analytique est ainsi le même pour les deux activités étudiées. De plus, ledosage du nitrate présente un biais en présence de chlorate.

- Pour ces deux étapes, les mesures des activités potentielles par la production ou laconsommation de nitrite sont celles qui présentent la variabilité la plus faible.Ce choix de mesure des activités nitritante et nitratante potentielles par un suivi de la seuleforme nitrite a déjà été retenu par Fosset et Bianchi (1995).En raison du long temps d’incubation et du biais associé (évolution des communautés pendantla durée du test, coexistence de processus physico-chimiques et biologiques autres que lanitrification), cette méthode ne permettra pas de réaliser des mesures en valeurs absolues,mais elle offre la possibilité d’effectuer des comparaisons relatives inter-sites ou au sein d’unmême sédiment soumis à différentes conditions par exemple.

Figure III - 6 : Protocole de mesure des activités nitritante et nitratante potentielles.

sédiment : 12.5 gsolution (NH4)2SO4 (56 mg N-NH4

+/l) : 12.5 mlH2O milliQ : 100 ml

témoin nitritation nitratation

28°Cagitation (100 rpm)

obscurité

t0 : 0 h

t2 : 96 h

t1 : 48 h

[NO2-]

aliquote

+ 1.25 mlchlorate 939 mM

+ 1.25 mlATU 172 mM

96 h0 48

[NO

2- ]

0 48 96 h

[NO

2- ]

0 48 96 h

[NO

2- ]


3 2EME PARTIE : ÉTUDE EN MICROCOSMES


3.1.1 Microcosmes

3.1.1.1 Sédiment

Le sédiment provient de la rivière Chalaronne (Ain), en amont de la station d'épuration deChâtillon/Chalaronne. Il a été prélevé à la drague à main, sur une épaisseur d'environ 5centimètres, tamisé à 2 mm puis 500 µm, et homogénéisé avant les analyses de caractérisation(tableau III-3) et la répartition dans les microcosmes.

Tableau III - 3 : Caractéristiques du sédiment (phase solide) de la Chalaronne. (Les séries n°1, 2 et 3

correspondent aux expérimentations décrites en 3.1.2.2.)

Texture (%) M.O. Corg Norg C/N

500-200 µm 200-50 µm 50-0 µm (% poids sec)

série n°1 64.6 28.4 7.0 0.52 0.1 0.018 5.6

séries n°2 et 3 12.3 32.2 55.5 8.25 3.15 0.25 12.6

Les différences entre les séries reflètent la variabilité des sédiments en milieu naturel.

3.1.1.2 Effluents

Ils proviennent de la station d'épuration de Saint Fons (Rhône). Ce sont des effluents ayantsubi un traitement classique par boues activées, prélevés en amont et en aval du traitementtertiaire de nitrification (Biostyr). Ils sont tamisés à 50 µm et conservés au laboratoire à+4°C.

3.1.1.3 Eau de rivière

L'eau dite "de rivière" est issue d'un mésocosme de 600 litres permettant de reconstituer uneeau dont les caractéristiques sont proches de celles d'une rivière oligotrophe.

3.1.1.4 Réacteurs

Il s'agit d'enceintes thermostatées à double paroi, équipées d’un trop-plein, de volume utile 5.7litres, contenant une phase sédimentaire (1 litre) et une phase liquide (4.7 litres) (figure III-7).

Figure III - 7 : Schématisation d’un réacteur (microcosme).

thermostatisation


3.1.2 Démarche expérimentale

3.1.2.1 Estimation de la variabilité intra- et inter-réacteurs

Préalablement à notre étude sur l'impact des effluents sur la nitrification dans le sédiment, ilétait nécessaire de vérifier au moins deux points :

- Existe-t-il une homogénéité spatiale à l'intérieur d'un réacteur ? (étude de lavariabilité intra-réacteurs)

- Les variations entre réacteurs sont-elles susceptibles de masquer des variations duesaux conditions imposées par les expériences (un apport d'effluent dans notre cas) ? (étude dela variabilité inter-réacteurs)

Trois réacteurs indépendants, remplis avec un échantillon homogénéisé du sédiment de laChalaronne (1 litre/réacteur), et alimentés en continu avec de l'eau du mésocosme, ont étésoumis à des conditions identiques (débit de l'eau, éclairement, température : 20°C) pendantune semaine. Trois prélèvements (mini-carottes) ont été effectués au hasard dans chaqueréacteur. Sur chacun des 9 sous-échantillons ont été mesurés :

- les activités nitritante et nitratante potentielles par la méthode décrite dans la 1ère

partie (§ 2.2.3)- la densité de bactéries nitritantes et nitratantes par la méthode du MPN décrite

ultérieurement (§ 3.1.3.1).

3.1.2.2 Impact des effluents

• Cinq réacteurs (microcosmes) simulent une rivière soumise à différentes conditions(figure III-8 ; photographie en annexe 4) :

- une situation "amont" (R0)- 4 situations "aval" :

- absence de rejet de station d’épuration (R1)- rejet de station d’épuration représentant 20 % du débit aval de la rivière (R2)- rejet de station d’épuration représentant 40 % du débit aval de la rivière (R3)- rejet de station d’épuration représentant 80 % du débit aval de la rivière (R4)

Les réacteurs sont remplis avec un litre de sédiment et alimentés en continu en eau de rivièreet effluent par des pompes péristaltiques dont le débit est vérifié quotidiennement, de mêmeque le temps de séjour du mélange eau/effluent à l'intérieur des réacteurs est maintenu àenviron 24 heures. L'oxygénation est maintenue à saturation par bullage.


Figure III - 8 : Schématisation du dispositif expérimental pour les études en microcosmes.

• Trois séries d'expériences sont réalisées successivement :- série n°1 : avec un effluent dit "non nitrifié"- série n°2 : avec un effluent dit "nitrifié"- série n°3 : avec un mélange effluent "non nitrifié" (75 %) et effluent "nitrifié" (25 %) (13)

• Chaque série d'expériences dure 35 jours :- jour 0 à jour 7 : stabilisation du système, apport d'eau de rivière uniquement- jour 7 : "état initial" ("Ti") : échantillonnage dans chaque réacteur (50 ml de sédimenthumide) et analyses- jour 7 à jour 35 : apport en continu de différents ratios eau de rivière/effluent- jour 35 : "état final" ("Tf") : échantillonnage dans chaque réacteur (50 ml de sédimenthumide) et analyses

• Chaque échantillon de sédiment est homogénéisé et traité comme suit pour l'étude descommunautés et activités nitritantes et nitratantes :

- 1 g pour le dénombrement des bactéries nitritantes et nitratantes- 1 g pour le dénombrement de la microflore totale- 3 × 12.5 g pour les mesures d'activités nitritante et nitratante potentielles- 10 g pour une mesure de poids sec

3.1.3 Analyses

3.1.3.1 Dénombrements bactériens

• Microflore totale (méthode au DAPI)

Il s'agit de comptages directs en microscopie par épifluorescence. Les échantillons desédiment subissent des dilutions et sont filtrés avant une coloration avec du 4,6 di-amidino-2-phenyl-indole (DAPI) selon la méthode de Rebillard et Torre (1993) (protocole en annexe 7).

(13) Le mélange d’effluents a été réalisé à partir d’un échantillonnage des 2 types d’effluents indépendant desséries 1 et 2.


L’échantillon pur ou la dilution correspondant à l’observation de 10 à 30 bactéries par champoptique est retenu, et 300 bactéries sont comptées (30 à 10 champs), ce qui permet uneprécision de l'ordre de 10 % sur la numération (Trousselier et al., 1985).

• Bactéries nitritantes et nitratantes (MPN-Griess)

La technique de MPN-Griess (§ 2.2.5) a été appliquée à des suspensions-dilutions desédiment réalisées à partir de 1 gramme de sédiment frais plus 9 ml de tampon Phosphate1 mM agités au Whirlimixer pendant 5 minutes.

• Sérotypes du genre Nitrobacter (immunofluorescence)

La technique d'immunofluorescence est détaillée dans le chapitre IV (§ 3.1.3.1).

3.1.3.2 Activités nitritante et nitratante potentielles

Le protocole a été précédemment décrit (§ 2.2.3).

3.1.3.3 Suivi des réacteurs : bilans entrée/sortie

Aux jours 7 (Ti) et 35 (Tf) des expériences, les concentrations en ammonium, nitrite et nitratesont mesurées en entrée (mélange eau de rivière/effluent entrant) et en sortie (évacuation) desréacteurs (les mesures n'ont pas pu être effectuées pour la série n°1).Les dosages des sels azotés sont effectués avec un auto-analyseur Technicon.

3.1.4 Analyse de données

Les tests statistiques ont été réalisés à l'aide du logiciel Statview 4, les régressions avec Excel,et l'analyse en composante principale avec ADE-4 (version W1.0) (Chessel et Dolédec, 1992).


3.2 RESULTATS

3.2.1 Variabilité intra- et inter-réacteurs

La variabilité intra-réacteurs (figure III-9) est considérée comme faible, vue la nature desparamètres mesurés et la précision des méthodes employées pour caractériser ces paramètres.

Figure III - 9 : Variabilité intra et inter-réacteurs. Chaque barre d'histogramme représente la moyenne

de 3 sous-échantillons par réacteur. Les écarts-types (variabilité intra-réacteurs) sont figurés (barres),

ainsi que les coefficients de variation (valeurs en % au dessus des histogrammes).

Étant donné le petit nombre d'échantillons (9), un test non paramétrique (Kruskal-Wallis) aété effectué (Scherrer, 1984), de façon à déterminer si la variabilité inter-réacteurs est plusélevée que la variabilité intra-réacteurs (tableau III-4).

Tableau III - 4 : Variabilité intra et inter-réacteurs : test de Kruskal-Wallis.

descripteur valeur de Pnitritation 0.2521nitratation 0.8752

MPN nitritants 0.4298MPN nitratants 0.0665

Au seuil de significativité α = 0.05, et concernant les paramètres étudiés, il n’y a pas dedifférence entre les trois réacteurs.

Nous pouvons donc regrouper les résultats obtenus sur les trois réacteurs et résumer lavariabilité intra-réacteurs à une seule valeur par paramètre (tableau III-5).

va ria b i li té in tra e t in te r-ré a cte urs :

a ctiv ité s pote ntie lle s

27

19

22

7815

0

10

20

30

40

50

nit ritat ion nit ratation

ac

tivi

té p

ote

nti

elle

(µg

N/g

sé

d s

ec

/j)

réac teur 1

réac teur 2

réac teur 3

va ria b i li té in tra e t in te r-ré a cte urs :

M P N ba cté rie s n i tr ifia nte s

6233 1150 1348

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

1,0E + 05

1,0E + 06

M P N nitritants M P N nitratantsMP

N b

ac

téri

es

nit

rifia

nte

s

(ba

ct/

g s

éd

se

c)


Tableau III - 5 : Variabilité intra-réacteurs.

moy * écart-type C.V. (%)nitritation 33,5 5,1 15,3nitratation 38,3 6,2 16,2

MPN nitritants 4,5.105 2,1.105 46,3MPN nitratants 2,4.105 1,4.105 56,8* activités en µg N/g séd. sec/j et populations en bact./g séd. sec

Pour les MPN et les mesures d’activités, la variabilité liée à la méthodologie a également étéprise en compte.Un intervalle de confiance à 95 % sur le MPN peut être calculé à partir de tables tenantcompte du facteur de dilution et du nombre de réplicats par dilution (Alexander, 1965).Le coefficient de variation des mesures d’activités a été précédemment déterminé (§ 2.3.4) :

- nitritation : 5.7 %- nitratation : 6.7 %

Dans notre cas d’étude, la variabilité liée à la méthode MPN est plus grande que celle due àl’hétérogénéité intra-réacteurs, et pour les mesures d’activités, la tendance est inversée (figureIII-10).

Figure III - 10 : Variabilité liée à la méthode de mesure () et variabilité intra-réacteurs () des

communautés et activités nitritante et nitratante (intervalles de confiance à 95 %).

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

a b

R1

c a b

R2

c a b

R3

c

MP

N n

itri

tan

ts (

ba

ct/g

sé

d s

ec

)

1 ,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

a b

R1

c a b

R2

c a b

R3

c

MP

N n

itri

tan

ts (

ba

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sé

d s

ec

)

0

1

2

3

4

a b

R1

c a b

R2

c a b

R3

c

nit

rita

tio

n p

ote

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elle

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ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

0

1

2

3

4

a b

R1

c a b

R2

c a b

R3

c

nit

rata

tio

n p

ote

nti

elle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)


Pour nos essais ultérieurs :- nous considérerons que la variabilité inter-réacteurs n’est pas significative, et donc que

les variations "naturelles" entre les réacteurs ne risquent pas de masquer d’éventuellesvariations dues aux conditions imposées par les expériences (apport d’effluent).

- nous tiendrons compte de la variabilité la plus élevée dans la détermination des densitésbactériennes et activités potentielles : - variabilité liée à la méthode MPN

- variabilité intra-réacteurs pour les mesures d’activitéspotentielles.

La variabilité intra-réacteurs ne pourra pas être déterminée pour chaque essai, en raison de lalourdeur de mise en œuvre du suivi des paramètres choisis et du nombre de microcosmes.Nous utiliserons donc les résultats obtenus dans cet essai préliminaire : pour chaque réacteur,les mesures d’activités potentielles seront effectuées sur un homogénéisat (50 ml de sédimenthumide) de 9 échantillons prélevés au hasard dans le réacteur, cet homogénéisat étantconsidéré comme la moyenne des 9 échantillons. La valeur d’activité mesurée sera encadréepar un intervalle de confiance (α=0.05) calculé, au moyen du coefficient de variationdéterminé au cours du présent essai, de la façon suivante :

50.9)9

StxP(

x /2 =×± α

avec : x : activité moyenne de 9 échantillons prélevés dans chaque réacteurtα/2 : 2.306 (pour ν = 9-1 degrés de liberté)Sx : écart-type de l'activité des 9 échantillons

3.2.2 Effet des effluents sur les communautés et activités nitrifiantes

Le couple de réacteurs R0-R1 représente un tronçon de cours d’eau non pollué, ne recevantpas d’effluent. Les couples de réacteurs R0-R2, R0-R3 et R0-R4 représentent des situationsamont-aval d’un rejet de station d’épuration.Deux microcosmes, ou le même microcosme à Ti et Tf, sont considérés commesignificativement différents pour un paramètre donné, lorsque les intervalles de confiancepour le paramètre considéré ne se chevauchent pas.

3.2.2.1 Observations préliminaires

Les intervalles de confiance à 95 % pour les dénombrements MPN étant relativement largesen raison de la méthode "statistique" de calcul, ils rendent la plupart des valeurs de MPNnitritants ou nitratants non significativement différentes entre elles d’une série à une autre àTi.Cependant, dans les trois séries, la communauté autochtone initiale dans le sédiment sembledifférer légèrement du point de vue quantitatif. Nos résultats ne permettent pas de discuter del’aspect qualitatif des communautés au départ des expériences. L'approche de la diversité despopulations de nitratants du genre Nitrobacter grâce à une différenciation de 3 sérotypes (X14,AG, LL) par immunofluorescence a échoué, faute de détection de ces sérotypes dans lesédiment et les effluents étudiés.


Les MPN sont globalement plus élevés dans les séries 2 et 3 que dans la série 1 (il y a jusqu’à1 unité log de différence entre les valeurs MPN à Ti pour les différentes séries) (figures III-12, III-14, III-16). La microflore totale est également plus abondante dans le cas des séries 2et 3. Les proportions MPN nitritants/microflore totale et MPN nitratants/microflore totale sontdonc sensiblement identiques entre les différentes séries (figures III-13, III-15, III-17).Les différents niveaux d’activités potentielles mesurés dans les 3 séries sont à mettre enrelation avec les différentes densités initiales en bactéries nitrifiantes : la nitritation potentiellefait plus que doubler dans les séries 2 et 3 par rapport à la série 1, cette tendance est moinsmarquée pour la nitratation potentielle.Ces observations sont vraisemblablement liées à la répartition granulométrique du sédimentutilisé pour les 3 séries d’expériences. Le sédiment utilisé pour les séries 2 et 3, bien queprélevé dans le même secteur que le sédiment de la série 1, comporte une fraction argilo-limoneuse très abondante (tableau III-3).En effet, les travaux de Montuelle et al. (soumis) montrent que :

- la fraction fine des sédiments (limons + argiles) abrite proportionnellement plus debactéries nitrifiantes que les fractions de taille supérieure

- aux communautés nitrifiantes plus denses dans ces fractions fines sont associées desactivités potentielles plus élevées.

Bien que les valeurs MPN nitritants et nitratants soient très voisines à Ti pour une sériedonnée, les activités potentielles associées diffèrent entre elles, la nitratation étant toujoursinférieure à la nitritation (d'au moins 50 % dans tous les cas). Cette tendance est confirméepar les travaux de Bianchi et al. (1994), Feliatra et Bianchi (1993), Gerards et al. (1998),Montuelle et al. (soumis). Bien que les études en cultures pures donnent globalement desplages de valeurs d'activités nitritantes et nitratantes spécifiques très voisines, elles montrentégalement que différentes espèces au sein d'un même genre peuvent exprimer des activitésspécifiques différentes. In situ, en milieu complexe, ces différences peuvent être accentuées.

A Tinitial, dans chacune des trois séries d’expériences individuellement, les communautésnitritantes et nitratantes, ne sont pas significativement différentes dans les réacteurs R0 à R4(figures III-12, III-14, III-16). Quant aux activités nitritantes et nitratantes potentielles, ellesdiffèrent assez peu entre les 5 réacteurs de chaque série (4 réacteurs pour la série 3) : lecoefficient de variation le plus élevé est de 43.8 % pour la nitratation au cours du Ti de lasérie 2.

) Afin d’évaluer les éventuels effets de l’apport d’effluent de station d’épuration dans nosréacteurs, nous avons adopté la démarche suivante :• analyse du comportement du tronçon témoin "non perturbé" R0-R1• analyse du comportement des réacteurs soumis à différents types d’effluents :

- comparaison des communautés et activités potentielles à Tfinal par rapport à Tinitialdans les différents réacteurs "avals" R1 à R4- comparaison, à Tf, des différentes situations "avals perturbés" (R2 à R4) par rapport àla situation "aval non perturbé" (R1)- comparaison des "avals perturbés" (R2 à R4) entre eux.


3.2.2.2 Comportement du tronçon témoin “non perturbé” R0-R1

Ce tronçon représente l'évolution "naturelle" du sédiment.Quelle que soit la série, entre Ti et Tf, les nombres de nitritants et nitratants ne diffèrent pasde façon significative dans chacun des réacteurs R0 et R1 (figures III-12, III-14, III-16).A Ti comme à Tf, les communautés nitrifiantes dans R0 et R1 ne sont pas, quantitativement,significativement différentes.) Il n’y a pas d’effet "distance" marqué sur l'abondance des bactéries nitrifiantes entre R0

et R1.

Les intervalles de confiance plus "étroits" des activités potentielles permettent de discriminerde faibles variations de la nitritation ou de la nitratation. Ainsi, alors qu’à Ti les couples deréacteurs R0-R1 présentent des activités potentielles non significativement différentes ou trèspeu différentes, le tronçon témoin présente une évolution entre Ti et Tf différente selon lesséries d’expériences (figures III-12, III-14, III-16). Dans la série 1, la nitritation ne diffère pasde Tf à Ti, alors que la nitratation est divisée par 2. Dans les séries 2 et 3, il y a peud’évolution dans R0, mais les 2 activités doublent quasiment entre Ti et Tf dans R1.Tandis que la baisse d’activité nitratante potentielle à Tf dans la série 1 peut être expliquéepar une possible diminution de l’apport de substrat, le doublement des activités potentiellesdans le R1 des séries 2 et 3 peut être associé à un apport de substrat par R0, et par R1 lui-même : relargage de NH4

+ par le sédiment et production de NH4

+ par dégradation de la matièreorganique, dont le taux dans le sédiment des séries 2 et 3 est très supérieur à celui du sédimentde la série 1 (tableau III-3).) Le comportement légèrement différent du tronçon témoin dans les 3 séries est à mettre enrelation avec les caractéristiques physico-chimiques des sédiments (texture, matièreorganique, rapport C/N, …).

3.2.2.3 Effet "global" des effluents

L'utilisation de l’analyse en composante principale (ACP) comme approche préliminaire apermis de visualiser l’ensemble de nos données et de déterminer si d'éventuelles tendances sedétachent concernant l’évolution de nos réacteurs.Cette méthode descriptive permet de représenter, dans un espace à deux dimensions, lesvariables quantitatives caractérisant nos différents réacteurs, en prenant en compte unmaximum de leur variabilité.

L’ACP (figure III-11) fournit, à l'aide des 2 axes F1 et F2 qui expliquent plus de 87 % de lavariabilité totale de notre jeu de données, plusieurs informations :

- À Tinitial, nous avons deux groupes de microcosmes assez homogènes. Cette faibledispersion des points "Ti" sur l'ACP confirme que les microcosmes peuvent être considéréscomme des réplicats avant l'apport d'effluent. L'état initial diffère quelque peu entre les deuxséries d'expériences ; les causes ont été évoquées précédemment (§ 3.2.2.1).


- À Tfinal, la réponse des variables biologiques pour les microcosmes ayant reçu del'effluent est différente de celle des microcosmes à Tinitial. L'éloignement par rapport à lasituation initiale est d'autant plus important que le ratio effluent/eau de rivière est élevé, ce quitraduit un effet "dose" des effluents.

- Les réponses des microcosmes sont différentes selon le type d'effluent apporté :- l'effluent non nitrifié (RTf) semble influencer fortement le MPN nitratants, et

dans une moindre mesure, les autres variables mesurées.- l'effluent nitrifié (MTf) présente un effet marqué sur le MPN nitritants et sur

les deux activités potentielles.

Figure III - 11 : Analyse en composante principale des données relatives aux expériences en

microcosmes avec effluent non nitrifié (R) et effluent nitrifié (M), à Tinitial (Ti) et Tfinal (Tf).

L'étude de l'effet individuel de chaque type d'effluent permettra de déterminer si les tendancesobservées dans l'analyse globale se retrouvent et si les différences de réponses sontsignificatives et quantifiables dans les analyses individuelles.

R4Tf

R1Ti

R2Ti

R3TiR4Ti

R1Tf

R2Tf

R3Tf

M1Ti

M2Ti

M3TiM4Ti

M1TfM2Tf

M3Tf

M4Tf

MPN nitratants

nitratation

nitritation

MPN nitritantsF1

F2

F1

F2

59,06

28,22

10,422,29

010203040506070

F1 F2 F3 F4

axes

iner

tie d

es a

xes

(%)

gradient d’effluent nitrifié

grad

ient

d’e

fflue

nt n

on n

itrifi

é


3.2.2.4 Effet d’un effluent non nitrifié

Les caractéristiques de l’effluent non nitrifié sont résumées dans le tableau III-6.

Tableau III - 6 : Caractéristiques de l'effluent non nitrifié. (Pour les

MPN, l'intervalle de confiance à 95 % est indiqué.)

NH4

+ 17.00/ 25.50

NO2

- mg N/l 0.06 / 0.22

NO3

- <0.05 / 0.07

MPN nitritants 1200 [350 ; 3800]

MPN nitratants(bact/ml)

5 [1.5 ; 17]

nitritation potentielle 548

nitratation potentielle(nmol N/ml/j)

2

Communautés et activités nitritantes :L’abondance des bactéries nitritantes à Tf dans R2, R3 et R4 est significativement différentede celle de R1, avec des densités supérieures, mais R2, R3 et R4 ne sont pas significativementdifférents entre eux pour cette variable (figure III-12 A). Alors que la microflore totalen’évolue pas entre Ti et Tf, les MPN nitritants ont tendance à augmenter (figure III-13), maisseul celui du R4 est significativement différent à Tf par rapport à Ti.À Tf, les 3 réacteurs soumis à l’effluent présentent des activités potentielles significativementdifférentes, mais seules celles de R3 et R4 sont significativement différentes de celle de R1,avec une diminution (figure III-12 C). De même que pour le MPN, seule l’activité dans R4 estsignificativement différente à Tf par rapport à Ti.

Communautés et activités nitratantes :L’évolution des MPN nitratants est très comparable à celle des MPN nitritants (figureIII-12 B).Quant aux activités potentielles, la tendance est inversée par rapport à la nitritation : à Tf, R2,R3 et R4 sont significativement différents de R1 et le sont aussi entre eux. Seul R2 n'évoluepas de façon significative entre Ti et Tf (figure III-12 D). Entre R2 et R4, la nitratationpotentielle croît parallèlement à l’augmentation du rapport effluent/eau de rivière.


Figure III - 12 : Communautés nitritantes (A) et nitratantes (B) et activités nitritantes (C) et nitratantes

(D) potentielles dans le sédiment soumis à un effluent non nitrifié. Les intervalles de confiance à 95 %

sont représentés.

Figure III - 13 : Rapports MPN nitritants/microflore totale (A) et MPN nitratants/microflore totale (B)

dans le cas du sédiment soumis à l’effluent non nitrifié.

) Les 3 réacteurs soumis à l’apport d’effluent (R2, R3 et R4) ont un comportement différentdu réacteur simulant un "aval non perturbé" (R1), tant pour les communautés que pour lesactivités nitrifiantes. Cet "effet rejet" n’est significatif pour toutes les variables étudiées quedans le cas de R4. Ainsi, nous pouvons dire que, dans nos conditions d’expérience, l’effluentnon nitrifié perturbe la nitrification dans le compartiment sédimentaire de façon marquéelorsqu’il est supérieur à 40 % du débit du cours d’eau.

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

1,0E + 05

1,0E + 06

1,0E + 07

R0 R1 R2 R3 R4

MP

N n

itra

tan

ts (

ba

ct/

g s

éd

se

c)

init ial

fina l

0

1

2

3

4

5

6

R0 R1 R2 R3 R4

nit

rita

tio

n p

ote

nti

elle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

A B

C D

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

R0 R1 R2 R3 R4

MP

N n

itrita

nts

(b

ac

t/g

sé

d s

ec

)

0

1

2

3

4

5

6

R0 R1 R2 R3 R4n

itri

tati

on

po

ten

tie

lle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

init ial

fina l

0,00%

0,20%

0,40%

0,60%

0,80%

1,00%

1,20%

R0 R1 R2 R3 R4

0,00%

0,20%

0,40%

0,60%

0,80%

1,00%

1,20%

R0 R1 R2 R3 R4

initial

final

A B


3.2.2.5 Effet d’un effluent nitrifié

Les caractéristiques de l’effluent nitrifié sont résumées dans le tableau III-7.

Tableau III - 7 : Caractéristiques de l'effluent nitrifié. (Pour les MPN,

l'intervalle de confiance à 95 % est indiqué.)

NH4

+ 2.70

NO2

- mg N/l 0.60

NO3

- 21.20

MPN nitritants 12000 [3500 ; 38000]


58 [17 ; 190]



14

Communautés et activités nitritantes :Alors que la microflore totale augmente très peu entre Ti et Tf (dans le cas le plus marqué,elle ne fait que tripler), et que cette évolution est identique dans tous les réacteurs, le MPNnitritants augmente de façon significative dans les 3 réacteurs ayant reçu de l’effluent : R2, R3et R4 (figures III-14 A et III-15). Cependant, à Tf, seul le MPN dans le sédiment de R4 estsignificativement différent de celui obtenu dans R1.Quant à l’activité potentielle, même si elle double entre Ti et Tf pour les réacteurs R2 à R4,elle est à Tf non significativement différente de celle mesurée dans R1 (figure III-14 C).


(D) potentielles dans le sédiment soumis à l'effluent nitrifié. Les intervalles de confiance à 95 % sont

représentés.

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

R0 R1 R2 R3 R4

MP

N n

itra

tan

ts (

ba

ct/

g s

éd

se

c)

init ial

final

0

4

8

12

16

20

R0 R1 R2 R3 R4

nit

rita

tio

n p

ote

nti

elle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

0

2

4

6

8

10

R0 R1 R2 R3 R4

nit

rita

tio

n p

ote

nti

elle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

init ial

final

A B

C D

1,0E+00

1,0E+01

1,0E+02

1,0E+03

1,0E+04

1,0E+05

1,0E+06

1,0E+07

1,0E+08

R0 R1 R2 R3 R4

MP

N n

itri

tan

ts (

ba

ct/

g s

éd

se

c)


Communautés et activités nitratantes :A Ti comme à Tf, les MPN sont identiques dans tous les réacteurs (figure III-14 B).Par contre, les activités potentielles à Tf sont, dans les réacteurs R2 à R4, significativementdifférentes de celles mesurées dans R1, et elles sont 4 à 6 fois supérieures à celles mesurées àTi (figure III-14 D).

Figure III - 15 : Rapports MPN nitritants/microflore totale (A) et MPN nitratants/microflore totale (B)

dans le cas du sédiment soumis à l'effluent nitrifié.

) Seules 2 des 4 variables étudiées évoluent de façon significative en présence d’effluentnitrifié : le MPN nitritants et l’activité nitratante potentielle. Cet effet n’est significatif quedans le cas de R4, exceptée une augmentation sensible de la nitratation potentielle quel quesoit le pourcentage d’effluent apporté. Encore une fois, l’effet le plus marqué de cet effluentnitrifié concerne, dans nos conditions, le sédiment soumis à un apport de 40 à 80 % du débitdu cours d’eau.

3.2.2.6 Effet d’un mélange d’effluents nitrifié et non nitrifié

Le tableau III-8 regroupe les caractéristiques du mélange d’effluents.

Tableau III - 8 : Caractéristiques du mélange d'effluents (75 % non

nitrifié, 25 % nitrifié). (Pour les MPN, l'intervalle de confiance à

95 % est indiqué.)

NH4

+ 30.00

NO2

- mg N/l 0.03

NO3

- 0.02

MPN nitritants 300 [91 ; 990]


430 [130 ; 1400]



9

0,00%

0,05%

0,10%

0,15%

0,20%

0,25%

0,30%

0,35%

0,40%

R0 R1 R2 R3 R4

0,00%

0,05%

0,10%

0,15%

0,20%

0,25%

0,30%

0,35%

0,40%

R0 R1 R2 R3 R4

initial

final

A B


Communautés et activités nitritantes :Alors que R2 se comporte de façon strictement identique à R1, R3 diffère fortement de R1 ence qui concerne la densité de nitritants : celle-ci augmente considérablement entre Ti et Tf(×250), la microflore totale ne faisant au maximum que tripler (figures III-16 et III-17).Il n’y a pas d’effet marqué sur l’activité potentielle : l’augmentation entre Ti et Tf n’est quelégèrement plus forte dans R3 (×3) par rapport à R1 et R2 (×2).

Communautés et activités nitratantes :A Ti comme à Tf, il n’y a aucune différence significative entre les MPN dans les différentsréacteurs.A Tf, l’activité potentielle dans R2 et R3 est différente de celle mesurée dans R1 : elle doublepar rapport à Ti, mais cette évolution reste dans les mêmes proportions que celle qui seproduit dans R1. Il n’y a donc pas de différence marquée entre les situations "aval nonperturbé" et "avals perturbés".


(D) potentielles dans le sédiment soumis au mélange d'effluents. Les intervalles de confiance à 95 %

sont représentés.

) Les tendances sont très semblables à celles observées dans le cas de l’apport d’effluentnitrifié, excepté l’évolution de la communauté nitritante. Dans nos conditions expérimentales,l’apport de 20 % de mélange d’effluents n’entraîne pas de modifications notables desparamètres étudiés. L’apport de 40 % de ce mélange cause une augmentation significative dela densité de bactéries nitritantes.

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

1,0E + 05

1,0E + 06

1,0E + 07

1,0E + 08

R0 R1 R2 R3 R4

MP

N n

itra

tan

ts (

ba

ct/

g s

éd

se

c)

init ial

fina l

0

4

8

12

16

20

R0 R1 R2 R3 R4

nit

rita

tio

n p

ote

nti

elle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

0

2

4

6

8

10

R0 R1 R2 R3 R4

nit

rita

tio

n p

ote

nti

elle

(µm

ol

N/g

sé

d s

ec

/j)

init ial

fina l

A B

C D

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

1,0E + 05

1,0E + 06

1,0E + 07

1,0E + 08

1,0E + 09

R0 R1 R2 R3 R4

MP

N n

itri

tan

ts (

ba

ct/

g s

éd

se

c)


Figure III - 17 : Rapports MPN nitritants/microflore totale et MPN nitratants/microflore totale dans le

cas du sédiment soumis au mélange d'effluents.

3.2.2.7 Effet inoculum des effluents

Connaissant : - la concentration de bactéries nitritantes et nitratantes dans chaque typed'effluent

- la quantité d'effluent apportée à chaque réacteur pendant la durée del'expérience (débit, volume des réacteurs, temps de séjour)

- le volume, la teneur en eau et la densité du sédiment,il est possible d'estimer par le calcul la quantité de bactéries nitrifiantes ayant potentiellementpu s'implanter dans le sédiment (tableau III-9). On suppose dans ce cas que le temps de séjourde 24 heures et les conditions "hydrauliques" au sein des réacteurs sont satisfaisants pourpermettre à l'essentiel des particules de l'effluent et aux bactéries associées de sédimenter.

Tableau III - 9 : Estimation de la quantité de bactéries nitrifiantes apportées à chaque réacteur par les

effluents en 28 jours. Les quantités de bactéries (MPN) sont exprimées par gramme de sédiment sec.

L'intervalle de confiance à 95 % est indiqué entre crochets.

effluent non nitrifié effluent nitrifié mélange d'effluentsnitritants nitratants nitritants nitratants nitritants nitratants

R2 2.6.104[7.9.103 ; 8.6.104]

1.1.102[3.3.101 ; 3.6.102]

2.6.105[7.9.104 ; 8.6.105]

1.3.103[3.8.102 ; 4.2.103]

6.5.103[2.0.103 ; 2.1.104]

1.3.103[3.8.102 ; 4.2.103]

R3 5.2.104[1.6.104 ; 1.7.105]

2.2.102[6.6.101 ; 7.2.102]

5.2.105[1.6.105 ; 1.7.106]

2.5.103[7.6.102 ; 8.3.103]

1.3.104[3.9.103 ; 4.3.104]

2.3.103[7.9.102 ; 8.6.103]

R4 1.0.105[3.2.104 ; 3.4.105]

4.3.102[1.3.102 ; 1.4.103]

1.0.106[3.2.105 ; 3.4.106]

5.0.103[1.5.103 ; 1.7.104]

- -

Globalement, les effluents non nitrifié et nitrifié apportent des bactéries nitritantes etnitratantes dans les mêmes proportions : une très grande majorité de nitritants contre quelquesnitratants (rapport supérieur à 200/1). Cependant, l'effluent nitrifié véhicule 10 fois plus debactéries nitrifiantes que l'effluent non nitrifié.

1,11%

0,00%

0,05%

0,10%

0,15%

0,20%

0,25%

0,30%

0,35%

0,40%

R0 R1 R2 R3 R4

0,00%

0,05%

0,10%

0,15%

0,20%

0,25%

0,30%

0,35%

0,40%

R0 R1 R2 R3 R4

initial

final

A B


Dans les séries 1 et 2, en 28 jours, l'effluent apporte potentiellement au sédiment une quantitéde bactéries nitritantes voisine de celle que celui-ci contient à Ti (le cas extrême est celui duR4 dans la série 2, où l'apport potentiel est près de 10 fois plus élevé que la quantité initiale).Dans les 2 séries, et quel que soit le rapport effluent/eau de rivière alimentant les réacteurs,cet inoculum de nitritants représente environ 10 % de la densité dans le sédiment à Tf.L'apport potentiel en nitratants est très faible par rapport à la densité dans le sédiment à Ti(environ 1/103 dans la série 1 et 1/102 dans la série 2). Dans la série 1, cet écart est d'autantplus marqué à Tf, qu'il y a eu croissance de la communauté nitratante entre Ti et Tf.

3.2.2.8 Bilan entrée/sortie des réacteurs (cas de l'effluent nitrifié)

L'importance de la perte en sels azotés entre l'entrée et la sortie des réacteurs croîtparallèlement à l'augmentation du rapport effluent/eau de rivière (figure III-18). Ceci est trèsnet dans le cas du NH4

+ et du NO2

-, directement impliqués dans la nitrification en tant quesubstrats énergétiques pour la microflore nitrifiante, et est à relier aux augmentations de tailledes communautés (pour la communautés nitritante) et d'intensité des activités potentielles(§ 3.2.2.5). Le pourcentage d'azote éliminé n'est pas proportionnel au pourcentage d'effluentapporté.

Figure III - 18 : Perte (valeur absolue) en azote dans la phase liquide entre l'entrée

et la sortie des réacteurs soumis à l'effluent nitrifié à Tf. Le rendement

d’abattement est indiqué (en %) au dessus des barres d'histogrammes. R1, R2,

R3, R4 : réacteurs soumis à l’apport de 0, 20, 40, 80 % d’effluent.

Bien que l'effluent contienne plus de 20 mg N-NO3

-/l et que le NO3

- soit le produit final de lanitrification, l'abattement (différence de concentration "entrée réacteur – sortie réacteur") pource sel augmente en présence d'effluent. L'"effet effluent" ne se traduit donc pas seulement parune stimulation de la nitrification ; il y aurait également une augmentation des processus deréduction du NO3

- : dénitrification, réductions dissimilative en ammonium ("DNRA") ouassimilative, bien que les deux derniers requièrent des conditions particulières (Binnerup etal., 1992) et qu'ils soient très probablement absents dans notre sédiment (Brohon, comm.pers.). Cependant, si l'abattement en NO3

- est du même ordre de grandeur, en valeur absolue,

0 84

-14

7964

1184

67 6

90

54

20

-1

0

1

2

3

N-NH4+ N-NO2- N-NO3-

diff

ére

nc

e e

ntr

ée

-so

rtie

(m

g/l

)

R1 R2 R3 R4


que celui du NH4+ et du NO2

-, il est, en terme de pourcentage d'azote éliminé entre l'entrée etla sortie des réacteurs, nettement inférieur.

3.2.2.9 Bilan global des 3 séries

Dans nos conditions expérimentales, et pour les 3 types d’effluents testés, il y a un effet de laprésence d’effluent sur la nitrification (communautés et activités) (tableau III-10). Cet effet neconcerne pas forcément tous les paramètres suivis, et n’est dans certains cas significatif quepour un rapport effluent/eau de rivière élevé (80 %).En aucun cas nous avons observé une perte de densité de bactéries nitrifiantes, celle-ci étantsoit inchangée, soit augmentée. Les activités potentielles sont, quant à elles, soit inchangées,soit inhibées, ou au contraire, stimulées.

Tableau III - 10 : Récapitulatif des tendances observées à Tfinal des expériences : évolution de R2

(20 % effluent), R3 (40 % effluent) et R4 (80 % effluent) par rapport à R1 (0 % effluent).

nitritation nitratationdensité

communautéactivité potentielle

densitécommunauté

activité potentielle

Ê Ê Ê Æ Ì Ì Ê Ê Ê Ê Ê Êsérie 1

R2 R3 R4 R2 R3 R4 R2 R3 R4 R2 R3 R4

Æ Ê Ê Æ Æ Æ Æ Æ Æ Ê Ê Êsérie 2

R2 R3 R4 R2 R3 R4 R2 R3 R4 R2 R3 R4

Æ Ê Æ Æ Æ Æ Ê Êsérie 3

R2 R3 R2 R3 R2 R3 R2 R3

Dans la plupart des cas, entre Ti et Tf, les changements d’activité potentielle ont uneamplitude inférieure à celle des changements de MPN, ce qui indiquerait à une perted’activité potentielle spécifique.Ceci ne concerne pas la nitratation dans le cas de l’apport d’effluent nitrifié et de mélanged’effluents, où l’augmentation d’activité potentielle spécifique est très faible comparée à ladiminution dans tous les autres cas.

En raison des intervalles de confiance relativement grands pour les mesures d’activitéspotentielles et surtout pour les MPN, il reste cependant délicat de calculer des activitéspotentielles spécifiques.


3.3 DISCUSSION

3.3.1 Effet "substrat" et effet "inoculum" des effluents de station d'épuration

En supposant que l'on retrouve au niveau du sédiment toutes les bactéries nitrifiantesvéhiculées par l'effluent pendant la durée de chaque expérience (28 jours), cet apportentraînerait, au maximum (dans les réacteurs recevant 80 % d'effluent) :

- dans le cas de l'effluent non nitrifié, un doublement de la densité des bactériesnitritantes, et une très faible augmentation des bactéries nitratantes

- dans le cas de l'effluent nitrifié, le gain d'environ une unité log en bactériesnitritantes, et de peu de bactéries nitratantes.Or les variations de densité de bactéries nitrifiantes observées entre Ti et Tf dans la phasesédimentaire des réacteurs soumis à l'apport d'effluent sont de plus grande amplitude, et nepeuvent pas être expliquées uniquement par la quantité de bactéries véhiculées par leseffluents. Dans le sédiment, il y a donc croissance, soit de la communauté autochtone, soit dela communauté allochtone qui se serait alors implantée, soit des deux communautés.

) Pouvons-nous préciser l'origine de ces variations de densité de bactériesnitrifiantes et de l'activité potentielle associée dans le sédiment ?

3.3.1.1 Cas de l'effluent non nitrifié

� Alors que la communauté nitritante globale détectée par MPN-Griess augmente entre Ti etTf, notamment lorsque l'apport en effluent est important, l'activité nitritante potentielle atendance à décroître, dans une moindre mesure.Si nous considérons les taux de croissance des nitritants en culture fournis par la littérature (cftableau II-5), et même si ce taux doit être minimisé dans nos microcosmes, une augmentationde la densité des nitritants autochtones de plus de 1 log (cas du R4 entre Ti et Tf) est possible.Or l'activité potentielle mesurée décroît.

� La diminution de l’activité nitritante potentielle en présence d’effluent peut-elle êtreliée à une toxicité du NH3 libre ?Connaissant la concentration en NH4

+ de l’effluent, le volume qui transite dans chaquemicrocosme, le pH et la température de la phase liquide, nous avons estimé (en lemaximisant) l’apport journalier en NH3 dans chaque réacteur grâce à la formule de Barnabe,citée par Smith et al. (1997) :

avec T : température du liquide (°C)

pH)0.033T(10.0684

3 101

][NH][NH −−

+

+=


Dans R4, l’apport en NH3 est au maximum de 0.96 mg N/l/24 h (en prenant en compte latempérature de 20°C et un pH de 8.0, alors que le pH était toujours compris entre 7.5 et 8.0dans les réacteurs). Cette concentration est environ 5 fois inférieure au seuil au dessus duquella forme NH3 affecte le genre Nitrosomonas (Anthonisen et al., 1976 ; Smith et al., 1997).Même en considérant que les formes NH4

+ et NH3 s’accumulent au niveau du sédiment, il estdifficile d’affirmer que la diminution de l’activité nitritante potentielle est due à la présencede NH3 en concentration sub-toxique. Cette toxicité ne peut expliquer que très partiellementl’inhibition observée, d'autant que l'activité de la communauté nitratante, dont le seuil desensibilité à la forme NH3 est 10 à 100 fois inférieur à celui de la communauté nitritante(Anthonisen et al., 1976 ; Smith et al., 1997), ne semble pas affectée.

� Une seconde hypothèse est l'implantation dans le sédiment de tout ou partie de lacommunauté nitritante issue de l'effluent. En effet, sur la durée de l'essai (28 jours), l'effluentapporte potentiellement au sédiment une quantité de bactéries nitritantes voisine de celle quele sédiment contient à Ti. Cet inoculum représente environ 10 % de la quantité de bactériesnitritantes contenues dans le sédiment à Tf. La croissance de la communauté dans le sédimententre Ti et Tf peut donc résulter de l'implantation des bactéries de l'effluent. Il est connu queces bactéries sont fixées aux particules ; il est donc logique de les retrouver dans la phasesédimentaire.Dans ces deux hypothèses, les populations nitritantes bénéficient de l'apport de NH4

+ parl'effluent pour se maintenir ou croître.Le fait que l'activité nitritante potentielle n'augmente pas conjointement à l'augmentation de lataille de la communauté nitritante appuie notre deuxième hypothèse : en présence d'effluent, ily aurait sélection essentiellement des souches provenant de l'effluent, plus compétitives queles souches autochtones. Ces souches issues de l'effluent présenteraient alors une activitéspécifique inférieure à celle des souches autochtones. La figure III-19 montre une relationétroite entre l'augmentation du MPN nitritants (liée au pourcentage d'effluent) et la diminutionde l'activité nitritante potentielle.

Figure III - 19 : Relations entre le pourcentage d'effluent non nitrifié et la densité de bactéries

nitritantes ou la nitritation potentielle (A), et entre la densité de bactéries nitritantes et l'activité

nitritante potentielle (B) (les intervalles de confiance à 95 % sont représentés). * : R significatif pour

α=0.05.

y = -2E-06x + 3,7635

R2 = 0,9426 *

0

1

2

3

4

5

1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06 1,E+07

MPN nitr itants (bac t/g s éd sec )

nitr

itatio

n p

ote

ntie

lle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

y = -0,0273x + 3,7052

R2 = 0,9319 *

y = 12476x + 24175

R2 = 0,9990 *

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

0 20 40 60 80 100

% ef f luent

MP

N n

itrita

nts

(ba

ct/

g s

éd

se

c)

0

1

2

3

4

5

nitr

itatio

n p

ote

ntie

lle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

A B


Les souches nitrifiantes de l'effluent auraient une activité spécifique 30 fois inférieure à celledes bactéries nitrifiantes autochtones. Les valeurs extrêmes d'activités potentielles spécifiquesde souches différentes de nitrifiants relatées dans la littérature confirment cet écart (cf chapitreII, tableau II-5).

) Il est par conséquent tout à fait envisageable que ce que nous observons soit la résultantede ces deux types de comportements :

- croissance de la communauté nitritante autochtone grâce à l'apport de substrat parl'effluent

- implantation de populations nitritantes issues de l'effluent.

� Quant à l'étape de nitratation, communauté et activité potentielle évoluent de façonsimilaire : toutes deux augmentent de façon significative en présence d'une forte proportiond'effluent (figure III-20).

Figure III - 20 : Relations entre le pourcentage d'effluent non nitrifié et la densité de bactéries

nitratantes ou la nitratation potentielle (A), et entre la densité de bactéries nitratantes et l'activité

nitratante potentielle (B) (les intervalles de confiance à 95 % sont représentés). * : R significatif pour

α=0.05.

Le maintien et la croissance de la communauté sont à relier à la production de NO2- par les

bactéries nitritantes qui bénéficient d'un apport continu en NH4+.

Nous pouvons ici aussi nous demander s'il y a eu croissance des populations autochtones ouimplantation des souches de l'effluent. L'effluent apporte en 28 jours très peu de bactériesnitratantes par rapport à ce que le sédiment contient à Ti (environ 1/103). L'implantation desbactéries de l'effluent ne peut vraisemblablement pas être la composante majeure del'accroissement que nous observons.

) Le fait que l'activité potentielle augmente dans des proportions inférieures àl'augmentation du nombre de bactéries détectées peut être expliqué par une baisse del'activité spécifique des bactéries lorsque leur environnement global change, ou dans unemoindre mesure, par un changement de la diversité au sein de la communauté.

y = 4E-06x + 0,5682

R2 = 0,9996 *

0

1

2

3

4

5

6

1,E+03 1,E+04 1,E+05 1,E+06 1,E+07

MPN nitratants (bact/ g séd sec)

nitr

ata

tion

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

y = 0,0554x + 0,3011

R2 = 0,9655 *

y = 13393x - 65902

R2 = 0,9721 *

1,E+03

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

0 20 40 60 80 100

% ef f luent

MP

N n

itra

tan

ts

(ba

ct/

g s

éd

se

c)

0

1

2

3

4

5

6

nitr

ata

tion

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

A B


3.3.1.2 Cas de l'effluent nitrifié

� Lors de l'étape de nitritation, nous observons de nouveau un découplage entre l'évolution dela communauté mesurée par MPN-Griess et celle de l'activité potentielle (figure III-21). Demême que dans le cas d'un effluent non nitrifié, nous pouvons émettre deux hypothèses.

� La première est la croissance des populations autochtones, grâce notamment àl'apport de NH4

+ par l'effluent, qui serait suffisant pour stimuler ces populations. L'apport dematière organique véhiculée par l'effluent peut aussi stimuler ces populations (croissancemixotrophe ou hétérotrophe).

� Notre deuxième hypothèse se base sur l'apport potentiel en bactéries nitritantesreprésenté par l'effluent. Cet inoculum est un peu plus dense que la communauté initialementprésente dans le sédiment (le cas extrême est celui du réacteur R4, pour lequel l'effluentapporte près de 10 fois plus de nitritants que la quantité présente dans le sédiment à Ti). Cetinoculum représente environ 10 % de la densité dans le sédiment à Tf, et il a pu s'avérer pluscompétitif que la communauté autochtone.

Figure III - 21 : Relations entre le pourcentage d'effluent nitrifié et la densité de bactéries nitritantes ou

la nitritation potentielle (A), et entre la densité de bactéries nitritantes et l'activité nitritante potentielle

(B) (les intervalles de confiance à 95 % sont représentés). * : R significatif pour α=0.05.

) Encore une fois, cette hypothèse d'une modification de la structure de la communauténitritante, conséquence de l'implantation des bactéries du rejet, permet d'expliquer ledécouplage entre l'évolution de la communauté (mesurée par MPN-Griess) et celle del'activité potentielle, en présence d'effluent. Les bactéries nitritantes de l'effluent auraientalors une activité spécifique inférieure à celle des bactéries autochtones.

� Alors que la communauté nitratante détectée par MPN-Griess est stable, l'activitépotentielle associée a tendance à augmenter en présence d'effluent (figure III-22).L'effluent apporte très peu de nitratants en 28 jours, comparé à la quantité initialementprésente dans le sédiment. La stabilité des communautés nitratantes entre Ti et Tf enl'absence ou en la présence d'effluent indique qu'il n'y a pas d'effet inoculum significatif, ni decroissance de la communauté autochtone. Nous observions par ailleurs une croissance de la

y = -1E-07x + 17,867

R2 = 0,6050

0

5

10

15

20

1,E+04 1,E+05 1,E+06 1,E+07 1,E+08

MPN nitr itants (bac t/g s éd sec )

nitr

itatio

n p

ote

ntie

lle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

y = -0,0285x + 17,723

R2 = 0,5066

y = 12476x + 24175

R2 = 0,9990 *

1,E+04

1,E+05

1,E+06

1,E+07

1,E+08

0 20 40 60 80 100

% ef f luent

MP

N n

itrita

nts

(ba

ct/

g s

éd

se

c)

0

5

10

15

20

nitr

itatio

n p

ote

ntie

lle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

A B


communauté nitratante dans le cas d'un effluent non nitrifié ; les observations de cettedeuxième série d'expériences tendent à confirmer l'hypothèse, dans le cas d'un effluent nonnitrifié, de la croissance de la communauté autochtone grâce à une production continue de sonsubstrat NO2

- par les nitritants. Dans le cas de l'effluent nitrifié, nous pouvons supposer que lacommunauté nitratante ne bénéficie pas d'une production de NO2

- suffisamment importante(en raison notamment d'une concentration en ammonium plus faible dans les réacteurs) pourqu'elle puisse en tirer l’énergie nécessaire à sa croissance.

Figure III - 22 : Relations entre le pourcentage d'effluent nitrifié et la densité de bactéries nitratantes

ou la nitratation potentielle (A), et entre la densité de bactéries nitratantes et l'activité nitratante

potentielle (B) (les intervalles de confiance à 95 % sont représentés). * : R significatif pour α=0.05.

) L'augmentation de l'activité nitratante potentielle serait alors liée à une augmentation del'activité spécifique moyenne de la communauté (qui peut masquer un changement dediversité), due à la modification des conditions environnementales entre Ti et Tf.

3.3.1.3 Discussion générale

• Importance de la qualité des effluentsIl est logique de retrouver des tendances identiques dans les cas d'effluents non nitrifiés etnitrifiés, car les bactéries nitrifiantes présentes au niveau du traitement tertiaire de nitrificationsont celles qui sont issues de la filière d'épuration (boues activées), et qui colonisentnaturellement les surfaces du biofiltre tertiaire. Les bactéries rencontrées dans l'effluentnitrifié sont donc les mêmes que celles de l'effluent non nitrifié, avec peut-être sélection dequelques souches, et sûrement une augmentation de leur densité. Ces bactéries nitrifiantesprésentent logiquement un caractère plus compétitif que les bactéries du sédiment, car, au seinde la station d'épuration, elles se sont maintenues malgré une forte pression des hétérotrophes.Une différence plus marquée dans la qualité des effluents utilisés, notamment une charge enbactéries nitrifiantes supérieure dans l'effluent nitrifié, aurait permis des conditionsexpérimentales plus tranchées. Mais le traitement tertiaire de nitrification est un système àculture fixée, avec peu de matières en suspension en sortie, donc peu de bactéries nitrifiantes,celles-ci étant majoritairement fixées. Brion (1997) a d'ailleurs montré, pour différentes

y = 1E-06x + 4,6184

R2 = 0,0005

0

2

4

6

8

10

1,E+04 1,E+05 1,E+06

MPN nitratants (bact/ g séd sec)

nitr

ata

tion

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

se

c)

y = 0,0581x + 2,7954

R2 = 0,8601

y = 107,51x + 202170

R2 = 0,0066

1,E+04

1,E+05

1,E+06

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BA


stations d'épuration de la région parisienne, que la biomasse nitrifiante est paradoxalementplus abondante dans les eaux usées non traitées que dans les effluents de stations d'épuration,y compris ceux qui ont subi un traitement de nitrification.

• Effet inoculum des effluents ?Ne connaissant pas la structure fine des communautés nitritante et nitratante dans les effluentset dans le sédiment (à Ti et Tf), il est difficile de déterminer si la croissance des communautésdans le sédiment est liée à un effet inoculum des effluents, ou à l'apport en substrat qu'ilsengendrent, favorisant la croissance des bactéries autochtones. Les deux processus coexistentvraisemblablement, et le suivi des activités potentielles conjointement aux dénombrementspar MPN-Griess nous oriente vers l'hypothèse de changements de structure des communautés,avec implantation dans le sédiment de souches compétitives issues de l'effluent. Troisarguments confortent cette hypothèse :

- Des bactéries nitrifiantes issues de rejets de station d'épuration sont capables decoloniser du sédiment (Bonnet et al., 1997).

- Différentes populations au sein des communautés nitritante et nitratante peuventprésenter des activités spécifiques différentes (cf tableau II-5), et celles-ci peuvent varier enfonction des conditions environnementales (Both et al., 1992).

- Des modifications des conditions environnementales (concentration en substrat, pHet teneur en oxygène dissous notamment) peuvent en outre induire des modifications de lastructure des communautés nitrifiantes (Princic et al., 1998). Ces changements peuventconcerner les bactéries nitrifiantes autochtones.

• Effet substrat des effluents ?Même si la plupart des bactéries nitrifiantes sont capables d'activités non obligatoires (co-métabolisme, dénitrification, …) (Bock et al., 1995 ; Freitag et al., 1987), l'efficacité de leurcroissance demeure essentiellement dépendante de conditions environnementales favorableset de la présence de leurs substrats énergétiques NH4

+ et NO2-. Or des concentrations

importantes en NH4+ sont apportées par l'effluent non nitrifié, et dans une moindre mesure par

l'effluent dit "nitrifié", ce qui contrôle le maintien d'une partie des populations autochtones etl'implantation durable d'une partie des populations de l'effluent. Ceci correspond égalementaux situations de terrain, où il est rare que des stations d'épuration possèdent un traitement denitrification complet pour la totalité du volume des eaux à traiter. Souvent, une partieseulement des effluents subit un traitement tertiaire (coûteux), ce qui permet de relarguer dansle milieu naturel à la fois du NH4

+ et des bactéries nitrifiantes.

3.3.2 Pertinence des paramètres étudiés

3.3.2.1 Communautés et populations nitrifiantes

� La méthode MPN présente des inconvénients bien connus (cf chapitre V). En l'occurrence,son manque de précision et ses larges intervalles de confiance ne permettent de discriminer de


façon fiable que des situations très différentes. Ainsi, dans le travail de Montuelle et al.(soumis), cette technique n'a pas permis de discriminer des densités de communautésnitritantes et nitratantes dans différentes situations amont/aval (excepté dans le cas desituations très tranchées et pour des tailles de particules inférieures à 50 µm), alors que lesactivités potentielles montraient des différences significatives.Il s'agit cependant de la seule méthode qui permet de prendre en compte l'ensemble de lacommunauté nitritante ou nitratante, et donc d'associer des densités bactériennes aux mesuresd'activités potentielles. De plus, le fait que cette technique ne soit pas trop lourde à mettre enœuvre permet de multiplier le nombre d'échantillons traités, ce qui est un avantage pour lesétudes de terrain qui engendrent souvent de multiples prélèvements.

� L'absence de détection par immunofluorescence des sérotypes du genre Nitrobacterrecherchés (X14, AG, LL) peut avoir deux origines :

- le seuil de détection relativement élevé de cette méthode en milieu complexe qui a pumasquer leur présence (cf chapitre V).

- l'absence de ces sérotypes dans les milieux étudiés. Dans ce travail, seuls 3 sérotypesdu genre ont été recherchés, alors que le genre compte au moins une douzaine de sérogroupesdéjà isolés (Navarro, 1992). Ces 3 sérotypes (X14, AG, LL) ont pourtant été détectés en milieunaturel par Bonnet et al. (1997), Botermans et Admiraal (1989), Montuelle et al. (1996) dansdes effluents de stations d'épuration et des biofilms épilithiques. De plus, le genre Nitrobacter,longtemps considéré comme dominant parmi les nitratants dans les milieux naturels, n'estvraisemblablement pas aussi répandu qu'on le pensait encore il y a quelques années (Hovanecet DeLong, 1996 ; Wagner et al., 1996).

) Le besoin de techniques précises et fiables de dénombrement des communautés nitritantesou nitratantes globales, ainsi que de populations spécifiques, dans les études écologiques dela nitrification, apparaît très clairement.

3.3.2.2 Activité nitrifiante

Les activités potentielles rendent compte du potentiel enzymatique présent à un instant t ;elles prennent en compte les bactéries actives ou "rapidement activables". Les mesuresd'activités potentielles sont donc un moyen de caractériser les communautés et leur étatphysiologique dans le milieu à un instant donné.En complément, des mesures d'activités réelles sur le terrain renseigneraient sur lesconséquences directes des modifications quantitatives des communautés nitrifiantes à l'avaldes rejets de stations d'épuration. Mais de telles mesures ne permettent pas de dissocier les 2étapes de la nitrification.


3.3.2.3 Activité potentielle en tant que mesure de taille de communauté ?

Les activités potentielles peuvent également être utilisées pour estimer la taille descommunautés nitritantes et nitratantes (Belser et Mays, 1982 ; Sandén et al., 1996). Il s'agitd'une méthode indirecte de mesure de la taille des communautés in situ. À partir de mesuresd'activités nitritantes et nitratantes potentielles et de mesures d'activités potentiellesspécifiques pour les bactéries nitritantes et nitratantes, il nous est possible de déduire parcalcul, des densités de bactéries dans nos sédiments. Ainsi, pour chacun de nos microcosmes,nous avons déduit un intervalle pour la taille des communautés nitritante et nitratante, d'aprèsnos mesures d'activités potentielles et les valeurs minimum et maximum d'activitéspotentielles spécifiques relevées dans la littérature (figure III-23).

Les tailles de communautés déduites des activités potentielles sont, dans la plupart de nosmicrocosmes, très supérieures à celles déterminées par la technique du MPN-Griess, ce qui estégalement observé par d'autres auteurs (Belser et Mays, 1982).

Figure III - 23 : Communautés nitritantes et nitratantes déterminées par la technique du MPN-Griess

( ) et déduites des mesures d'activités potentielles ( ). Valeurs d'activités potentielles spécifiques

utilisées (fmol N produit.cellule-1.h-1) : nitritants maxi : 23, nitritants mini : 0.9 - nitratants maxi : 42,

nitratants mini : 5.1 (Prosser, 1989).

NIT RITANT S - e fflue nt no n ni tr ifié

1,0E+ 00

1,0E+ 01

1,0E+ 021,0E+ 03

1,0E+ 04

1,0E+ 05

1,0E+ 061,0E+ 07

1,0E+ 08

1,0E+ 09

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NIT RITANT S - e fflue nt n i tri fié

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1,0E+ 01

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1,0E+ 06

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R1 R2 R3 R4

R1 R2 R3 R4


Si notre hypothèse de modification de la structure des communautés en présence d'effluent estvérifiée, la mesure de l'activité potentielle n'est pas une technique adaptée pour mesurer lataille des communautés : un changement d'abondance relative des populations (chacune ayantune activité potentielle spécifique propre) au sein des communautés engendre unemodification de l'activité potentielle spécifique résultante de chaque communauté. De plus, siles conditions environnementales diffèrent, elles peuvent induire des changements dans lesparamètres de cinétique d'une souche (Both et al., 1992). Cette absence de corrélation entredénombrements par MPN et mesures d'activités potentielles a notamment été observée aucours d'études en sol (Both et al., 1992). Dans notre cas, les mesures par la technique duMPN-Griess, bien que peu précises et procurant de larges intervalles de confiance, permettentune meilleure discrimination des différentes situations aval à Tf que les estimations de taillesde communautés déduites des mesures d’activités potentielles (figure III-23).

) MPN-Griess et activités potentielles fournissent deux informations complémentaires.Une meilleure connaissance des populations constitutives des communautés permettraitd'affiner les relations densité-activité.

3.3.3 Travail en microcosmes

L'utilisation de microcosmes a été choisie ici pour simuler une rivière soumise à différentstypes de rejets de station d'épuration, dans des proportions (effluent/eau de rivière) variables.La simulation parfaite d'une situation naturelle en microcosmes n'est pas réalisable. Mais lavocation d'un microcosme n'est pas de reproduire fidèlement et de façon exhaustive toutes lescaractéristiques du terrain. Il s'agit plutôt de s'affranchir de certaines contraintes telles que lavariabilité spatiale et temporelle, difficilement intégrables à l'échelle de processus particulierscomme la nitrification, en simplifiant une situation complexe de terrain pour contrôler certainsparamètres susceptibles d'influencer ce processus.

Dans le cas présent, nous avons pu dissocier l'effet "effluent" de tous les autres paramètresenvironnementaux, grâce à :

- une homogénéisation du sédiment avant la répartition dans les microcosmes- un contrôle de la température, de l'oxygène, des débits et temps de séjour- un contrôle des apports en eau de rivière et effluents (pas de risques d'apports

"latéraux" : ruissellement, rejets ponctuels…)- un maintien pendant 4 semaines de conditions environnementales constantes et

"identiques" (excepté en ce qui concerne l'apport d'effluent) dans chacun des 5 réacteurs.Le seul biais notable est l'évolution de la qualité des effluents au cours de leur stockage. Maisla qualité d'un effluent de station d'épuration fluctue également sur site, y compris en fin detraitement.

) Outre la lourdeur de la mise en place et de la gestion au quotidien de tels microcosmes(maintien des débits et temps de séjour notamment), cette approche est un bon compromis


entre le terrain et toutes les interactions et la variabilité associées, et laboratoire qui simplifieà l'extrême les paramètres environnementaux.

3.3.4 Transposition au terrain des résultats en microcosmes

La simulation de rejets de station d'épuration lors d'études en microcosmes fournit une bonnereprésentativité de l'évolution des paramètres biologiques globaux du terrain (ex : microfloretotale, activité respiratoire, biodégradation de la matière organique, …) (Montuelle et al.,1997).Dans les milieux aquatiques, la dynamique de la colonne d'eau est beaucoup plus variable (àune petite échelle temporelle) que celle du sédiment. Le fait de travailler sur le compartimentsédimentaire, beaucoup plus intégrateur de "l'historique" du milieu que la colonne d'eau, nousautorise donc à penser que les tendances observées dans nos microcosmes sont extrapolables(avec prudence) au terrain. D'ailleurs, les ordres de grandeur pour les variables mesurées icisont comparables à ceux des mesures similaires effectuées sur des échantillons "de terrain"(sans traitement après leur prélèvement) (Montuelle et al., soumis). Il n'y a donc pas de"dérive" de nos microcosmes liée à un effet de confinement.

Nous pouvons supposer que nos résultats en microcosmes reflètent de façon non ou peubiaisée un comportement des communautés nitrifiantes dans des situations authentiques enmilieu naturel. Cependant, il serait risqué de transposer quantitativement nos résultats dulaboratoire vers le terrain, car malgré notre souci de réalisme par rapport au terrain dans laconception de nos microcosmes, il est impossible de prendre en compte certains paramètres(variations hydrauliques du cours d'eau et dynamique de la couche superficielle du sédiment,bioturbations, prédation des bactéries, …). Pour d'autres facteurs, les fluctuations temporellesont été extrêmement simplifiées, puisque nous avons essayé de maintenir des conditionsstables pendant toute la durée de l'expérience (température, oxygène, débit, …). Enfin, lecompromis entre notre souci d'authenticité et nos limites techniques nous a conduits à choisirun temps de séjour de 24 heures dans les réacteurs. En rivière, même dans les cas de faiblesvitesses de courant, ceci représente une assez longue distance. Ici, nous avons concentré dansun réacteur ce qui se passerait sur une distance de plusieurs kilomètres : concentration desapports chimiques dont NH4

+ et concentration des apports de particules et de biomassebactérienne (sur le terrain, il y a une sédimentation "décalée" des particules et des flocs enfonction de leur taille et des paramètres physiques de la rivière).

Au niveau de la colonne d'eau, les bilans entrée/sortie des réacteurs dans l'expérience avecl'effluent nitrifié montrent néanmoins que les modifications des processus au sein du sédiments'accompagnent d'une modification de la qualité de l'eau surnageante. Ils mettent en évidencela capacité d'auto-épuration du milieu soumis à la perturbation par ce type de rejet. Il faut, iciencore, tenir compte du temps de séjour dans les microcosmes et du changement d'échelles(spatiale et temporelle) entre nos réacteurs et les situations de terrain. En rivière, lamodification de la qualité de l'eau, très tranchée à l'aval immédiat d'un rejet, évolue ensuite defaçon très progressive sur une distance de plusieurs centaines de mètres à plusieurs


kilomètres. Sur un tel segment de cours d'eau, l'impact de l'effluent sur la qualité du milieupeut être partiellement compensé par la réponse auto-épuratoire de celui-ci, jusqu'au retour àun état d'équilibre (sauf si le milieu est soumis à une nouvelle perturbation).En ce qui concerne notre expérience, la capacité d'auto-épuration de l'azote est différente entreles réacteurs : elle a tendance à augmenter lorsque la proportion d'effluent augmente, mais ellen'est pas proportionnelle à la concentration des substrats azotés entrant dans le milieu. Laqualité "globale" de l'effluent, et non uniquement l'apport de substrat azoté, influencent doncla capacité d'auto-épuration de l'azote.


4 CONCLUSION

Globalement, nous avons observé un effet marqué des effluents lorsqu'ils représentent 40 à80 % du flux liquide, ce qui correspond, sur le terrain, à des situations d'étiage assezfréquentes.

Pouvons-nous dissocier un effet substrat et un effet inoculum ?À ce niveau du travail, en l'absence de données plus précises sur la structure descommunautés nitritantes et nitratantes dans nos milieux, il est difficile de déterminer si lacroissance des communautés est liée à un effet inoculum des effluents, ou à l'apport ensubstrat qu'ils engendrent, et qui favorise la croissance des bactéries autochtones. Les deuxprocessus coexistent vraisemblablement.Pour notre cas d'étude, nous pouvons dégager des hypothèses (figure III-24) :

- de changements de structure de la communauté, avec implantation dans le sédimentde souches compétitives issues de l'effluent. Ces communautés "mixtes" bénéficieraient del'ammonium apporté par l'effluent et interviendraient sur les pools d'azote nitrifiable.

- de variations d'activité spécifique des souches en présence d'effluent, donc demodifications des conditions environnementales.Dans tous les cas, le maintien de ces communautés dépend néanmoins d'une sourced'ammonium nitrifiable.

Figure III - 24 : Modèle d'impact de rejets nitrifiés et non nitrifiés sur les communautés

nitrifiantes autochtones et leur activité en sédiment (en pointillés : résultante des

modifications dues à l'effluent).

S t.Ep.

nitr itantsautochtones

communauténitr itante mixte

communauténitratante mixte

NH4+

NO3-NO2

-

bactér ies nitr itanteset nitratantesallochtones

NH4+

nitratantsautochtones


Pour confirmer notre hypothèse de modification de la structure et de l'origine descommunautés nitritante et nitratante en aval d'un rejet, il est nécessaire de disposer de moyensd'analyses plus précises des communautés. Les techniques de biologie moléculaire (PCR-RFLP, PCR in situ, hybridation in situ, …) permettront une analyse plus détaillée de lastructure des communautés (selon le type de sonde utilisé). Préalablement à leur application àce type d'étude, certaines de ces techniques nécessitent encore des mises au point pourl'utilisation en milieu complexe.Un autre moyen de vérifier notre hypothèse est de poursuivre notre travail en utilisant dessouches modèles en milieu simplifié (cf chapitre IV).

CHAPITRE IV

IMPACT DE REJETS DE STATIOND'EPURATION SUR LA NITRIFICATION EN

SEDIMENT DE RIVIERE :EVOLUTION ET COMPETITION DE

POPULATIONS NITRATANTES MODELES

CHAPITRE IV : COMPÉTITION DE SOUCHES NITRATANTES MODÈLES 104

IMPACT DE REJETS DE STATION D 'EPURATION SUR LA NITRIFICATIONEN SEDIMENT DE RIVIERE : EVOLUTION ET COMPETITION DE

POPULATIONS NITRATANTES MODELES

1 INTRODUCTION............................................................................................... 105

2 1ÈRE PARTIE : DÉTERMINATION DES CARACTÉRISTIQUES DE CROISSANCE

DES SOUCHES AG ET X14 EN CULTURES PURES................................................. 107

2.1 MATÉRIELS ET MÉTHODES................................................................................................ 107

2.1.1 Culture des bactéries nitratantes ........................................................................... 1072.1.2 Caractéristiques de croissance et d'utilisation du nitrite.......................................... 108

2.2 RÉSULTATS..................................................................................................................... 109

2.3 DISCUSSION.................................................................................................................... 110

3 2ÈME PARTIE : COMPÉTITION ENTRE SOUCHES MODÈLES EN BATCHES ................. 111


3.1.1 Batches................................................................................................................. 1113.1.1.1 Sédiment .......................................................................................................................1123.1.1.2 Eau de rivière et effluent ................................................................................................1123.1.1.3 Production de biomasse.................................................................................................1123.1.1.4 Inoculation des batches..................................................................................................112

3.1.2 Protocole d'étude .................................................................................................. 1133.1.3 Analyses ............................................................................................................... 113

3.1.3.1 Dénombrements bactériens ...........................................................................................1133.1.3.2 Mesure de l'activité nitratante potentielle.........................................................................1143.1.3.3 Mesure de l'activité nitratante réelle et suivi du taux de Carbone Organique Dissous .......1153.1.3.4 Détermination des paramètres de croissance et d'activité des sérotypes .........................115

3.2 RÉSULTATS..................................................................................................................... 117

3.2.1 Effet de la stérilisation par rayonnement gamma ................................................... 1173.2.1.1 Caractéristiques du sédiment, de l'eau de rivière et de l'effluent ......................................1173.2.1.2 Évolution des incubations témoins..................................................................................118

3.2.2 Caractérisation des inoculums............................................................................... 1183.2.3 Dynamique des 2 souches dans les différentes conditions d'incubation :

suivi par immunofluorescence ............................................................................... 1193.2.3.1 Densité de Nitrobacter et concentration en nitrite ............................................................1193.2.3.2 Comportement individuel de AG et X14 ...........................................................................1203.2.3.3 Comportement des souches AG et X14 co-inoculées .......................................................120

3.2.4 Activité nitratante................................................................................................... 1223.2.4.1 Activité réelle - Activité potentielle...................................................................................1223.2.4.2 Activité spécifique ..........................................................................................................123

3.2.5 Rendements de croissance ................................................................................... 1243.2.6 Bilan sur les 3 méthodes de mesure de taille des populations de Nitrobacter

utilisées................................................................................................................. 1253.3 DISCUSSION.................................................................................................................... 127

3.3.1 Aspects méthodologiques...................................................................................... 1273.3.1.1 Effets de la stérilisation par rayonnement γ sur les caractéristiques du sédiment..............1273.3.1.2 Pertinence des paramètres suivis, avantages et limites des techniques d'étude...............128

3.3.2 Dynamique des souches AG et X14 dans le sédiment ............................................ 1293.3.2.1 Implantation et évolution des sérotypes ..........................................................................1293.3.2.2 Activités réelles et potentielles - Relations nombre-activité ..............................................1313.3.2.3 Compétitivité des 2 sérotypes.........................................................................................1323.3.2.4 Bilan : Tendances générales de la dynamique des sérotypes AG et X14...........................134

3.4 CONCLUSION................................................................................................................... 135


1 INTRODUCTION

Les études d'impact d'effluents de stations d'épuration en sédiment de rivière, sur le terrain(Montuelle et al., soumis) et en microcosmes (cf chapitre précédent), montrent que lanitrification (densité de bactéries nitrifiantes et activité) apparaît globalement modifiée en avaldes rejets, que ceux-ci soient nitrifiés ou non.Le travail en microcosmes a permis de dégager des hypothèses sur le comportement desbactéries nitrifiantes soumises à une telle situation :

- des changements de structure des communautés et/ou l'implantation dans le sédimentde souches compétitives issues de l'effluent interviendraient

- des variations de l'activité spécifique des souches soumises à des modificationsenvironnementales se produiraient.Il est nécessaire d'apporter quelques éléments pour étayer ces hypothèses et préciser quelquesmécanismes susceptibles d'expliquer ces modifications de la nitrification. Or les techniquesd'étude in situ de l'écologie de la nitrification dont nous disposons ne permettent pas detravailler de façon à la fois qualitative et quantitative en milieu complexe. Cette limitationimpose de changer de démarche et d'échelle d'approche et de simplifier le milieu, de façonnotamment :

- à prendre en compte uniquement les facteurs directement liés à la présence oul'absence d'effluent (environnement "chimique" essentiellement)

- à disposer d'outils pertinents pour l'étude des communautés.Le travail en systèmes discontinus (ou "batches"), avec inoculation de souches bactériennesconnues, quantifiables et différentiables entre elles, répond à ce critère.Nous avons également choisi de nous focaliser sur une seule des 2 étapes de la nitrification :l'étape d'oxydation du nitrite en nitrate, dont la vitesse conditionne l'accumulation ou non deNO2

- (potentiellement toxique) dans le milieu. Le genre modèle de la nitratation estNitrobacter, très ubiquiste dans les environnements naturels (cf chapitre II). Il est nécessairede travailler, au sein de ce genre, avec des souches représentées dans les environnementsaquatiques, et dont nous connaissons les caractéristiques physiologiques au laboratoire. Lessérotypes AG (espèce agilis, rattachée à l'espèce winogradskyi (Watson et al., 1989)) et X14

(espèce hamburgensis) sont nos modèles. En effet, tous deux ont déjà été trouvés dansdifférents milieux aquatiques : dans des effluents de stations d'épuration (Bonnet et al., 1997 ;Montuelle et al., 1996), dans des biofilms épilithiques en amont et aval d'un rejet de stationd'épuration (Montuelle et al., 1996). Les connaissances sur leur physiologie et leur écologienous conduisent à leur attribuer, pour ces expériences, 2 habitats différents : le sérotype AG, àcaractère préférentiellement autotrophe, sera considéré comme notre souche "autochtone" dusédiment de rivière, et le sérotype X14, à caractère mixotrophe, voire hétérotrophe, sera notresouche "allochtone" apportée par l'effluent de station d'épuration. Dans une étude enmicrocosmes, ce sérotype X14 véhiculé par un effluent de station d'épuration s'est montrécapable de coloniser un sédiment de rivière (Bonnet et al., 1997), ce qui valide notre modèleexpérimental.


L'objectif de ce travail est triple :- caractériser un éventuel effet de stress (ou considéré comme tel) des populations aux

changements de conditions environnementales- évaluer la capacité d'inoculation dans le sédiment de la souche allochtone- étudier la compétition entre la souche du sédiment et la souche de l'effluent.

Dans un premier temps, nous préciserons les caractéristiques de croissance des sérotypes AGet X14 en cultures pures et nous déterminerons si la présence d'un mélange eau interstitielle desédiment/eau de rivière ou d'effluent de station d'épuration influence ces caractéristiques (1ère

partie).Nous étudierons ensuite, dans le compartiment sédimentaire de nos batches, le comportementdes 2 sérotypes inoculés (implantation, croissance, compétitivité, …), dans différentessituations de compétition ou non (2ème partie).


2 1ERE PARTIE : DETERMINATION DES CARACTERISTIQUES DE CROISSANCEDES SOUCHES AG ET X14 EN CULTURES PURES

Des cultures de chacune de nos 2 souches (14) modèles de Nitrobacter sont effectuées dans desmilieux classiquement utilisés, et parallèlement, dans des milieux préparés avec un mélangeeau de rivière/eau interstitielle de sédiment pour l'une et avec de l'effluent de stationd'épuration pour l'autre.Les caractéristiques de croissance de ces souches dans des milieux de culture "classiques" et"complexes" sont déterminées, afin de caractériser un éventuel effet de stress lié à la présencedu mélange eau de rivière / eau interstitielle ou de l'effluent.


2.1.1 Culture des bactéries nitratantes

Nitrobacter winogradskyi, sérotype AG (15), est cultivée dans le milieu autotrophe de Schmidtet al. (1973) avec du NaNO2 2 g.l-1. Nitrobacter hamburgensis, sérotype X14

(15), est cultivéedans le milieu mixotrophe de Bock et al. (1983) avec du NaNO2 2 g.l-1, de la bactopeptone 1.5g.l-1, de l'extrait de levure 1.5 g.l-1, du pyruvate de sodium 0.55 g.l-1. Les cultures sontincubées à 28°C, à l'obscurité, sous agitation (100 tr.min-1) en erlenmeyers de 250 ml : à 100ml de milieu stérile est ajouté 1 ml d'inoculum.Parallèlement à ces cultures "classiques", ont été réalisées des cultures d'acclimatation de nosdeux souches modèles à des milieux plus complexes :

- une culture de la souche AG dans le milieu autotrophe préparé avec un mélange eaude rivière stérile / eau interstitielle stérile (60 % / 40 %) remplaçant l'eau déminéralisée

- une culture de la souche X14 dans le milieu mixotrophe préparé avec de l'effluent destation d'épuration stérile remplaçant l'eau déminéralisée.L'eau de rivière provient du mésocosme du laboratoire, l'eau interstitielle a été extraite dusédiment de la Chalaronne (centrifugation 30 min. à 17000 g) et l'effluent a été prélevé enaval du traitement tertiaire de nitrification de la station d'épuration de St Fons. Leurstérilisation s'est déroulée en plusieurs étapes : pré-filtration sur 5.0 µm, filtration sur 0.2 µm,autoclavage puis nouvelle filtration sur 0.2 µm (pour éliminer les précipités suite àl'autoclavage).

(14) Par commodité, nous parlerons indifféremment de sérotypes ou de souches.(15) Les souches ont été fournies par le laboratoire d'Écologie Microbienne du Sol de l'université Lyon 1.


2.1.2 Caractéristiques de croissance et d'utilisation du nitrite

Les cultures ont systématiquement été réalisées en triplicats.Dans chaque culture, des aliquotes ont été prélevées stérilement à différents intervalles detemps pendant l'incubation des cultures, pour déterminer les concentrations en Nitrobacter eten nitrite, et pour vérifier la non contamination par des bactéries hétérotrophes (étalement surgélose nutritive).Les concentrations en Nitrobacter sont déterminées par une mesure de la densité optique de laculture à la longueur d'onde 580 nm, après un calibrage préalable de l'équivalence D.O.-concentration de chaque souche grâce à une numération par DAPI.Les concentrations en nitrite sont déterminées par la méthode de spectrométrie d'absorptionmoléculaire après filtration des échantillons sur 0.2 µm.

Plusieurs paramètres caractérisent alors chaque souche pendant la phase de croissanceexponentielle :

• le taux de croissance maximum :

avec : µmax : taux de croissance maximum, en h-1

Cb1 : concentration bactérienne à t1, en bact.ml-1


• le temps de génération :

avec : T : temps de génération, en hµmax : taux de croissance maximum, en h-1

• le rendement de croissance :

avec : Y : rendement de croissance, en bact.mol-1 N oxydéCb1 : concentration bactérienne à t1, en bact.ml-1


Cn1 : concentration en N-NO2- à t1, en mol.ml-1


• l'activité spécifique :

avec : AS : rendement de croissance, en mol N oxydé.bact-1.h-2





maxµ

2ln T =

21

12

CnCn

CbCbY

−−=

12

12max

tt

Cbln Cbln µ

−−

=

1212

12

tt

1

CbCb

CnCnAS

−×

−−=


2.2 RESULTATS

Les 2 souches AG et X14 présentent une croissance à peu près identique dans leur milieu deculture "classique" et dans le milieu "complexe" (figure IV-1). Alors que la concentration enAG atteint un plateau lorsque la totalité du nitrite a été oxydée, la population de X14 continueà croître lentement après l'épuisement en nitrite.

Figure IV - 1 : Croissance des souches AG et X14 en culture pure. m. auto : milieu autotrophe ; m. auto

EI + ER : milieu autotrophe préparé avec un mélange eau interstitielle/eau de rivière stérile ; m. mixo :

milieu mixotrophe ; m. mixo effluent : milieu mixotrophe préparé avec de l'effluent stérile.

Les caractéristiques de croissance de chaque population ont été déterminées pendant la phaseexponentielle de croissance (tableau IV-1).

Tableau IV - 1 : Caractéristiques de croissance des souches AG et X14 en culture, pendant la phase

de croissance exponentielle (moyennes de triplicats ± écarts-types).

Nitrobacter AG Nitrobacter X14

m. auto m. auto EI + ER m. mixo m. mixo effluent

µ max (h-1) 0.036 (± 0.004) 0.027 (± 0.003) 0.061 (± 0.001)

0.003 *

0.063 (± 0.001)

0.003 *

T (h) 19.4 (± 2.2) 25.7 (± 3.3) 11.3 (± 0.3)

259.9 *

11.0 (± 0.1)

209.6 *

rendement (bact.mol-1 N) 4.22×1011

(± 1.37×1011)

3.96×1011

(± 2.55×1010)

4.34×1011

(± 1.37×1011)

4.85×1011

(± 1.90×1010)

AS (fmol N.bact-1.h-1) 62.2 (± 17.7) 54.0 (± 4.7) 66.1 (± 5.9) 59.0 (± 2.3)

* : phase de croissance hétérotrophe

croissance A G

1,0E+ 04

1,0E+ 05

1,0E+ 06

1,0E+ 07

1,0E+ 08

0 100 200 300 400

temps (h)

Nit

rob

acte

r AG

(ba

ct/

ml)

0

10

20

30

40

N-N

O2

- (µ

mo

l/m

l)

AG m. auto AG m. auto E I+ER

NO2- m. auto NO2- m. auto E I+ER

croissance X 14

1,0E+ 04

1,0E+ 05

1,0E+ 06

1,0E+ 07

1,0E+ 08

0 100 200 300 400

temps (h)

Nit

rob

acte

r X

14

(ba

ct/

ml)

0

10

20

30

40

N-N

O2

- (µ

mo

l/m

l)

X14 m. m ixo X14 m. m ixo effluent

NO2- m. m ixo NO2- m. m ixo effluent


2.3 DISCUSSION

Les caractéristiques de croissance de la souche AG déterminées dans cette étude sont trèsproches de celles relatées dans la littérature pour cette souche, ou, plus globalement, pourl'espèce N. winogradskyi (tableau IV-2). Néanmoins, dans le cas présent, les activitésspécifiques sont supérieures à celles classiquement mentionnées. Ceci peut-être lié au fait queles cultures utilisées ont été préalablement entretenues dans un milieu riche en nitrite (NaNO2

2 g.l-1).Peu de travaux publiés concernent l'espèce N. hamburgensis cultivée en milieu discontinu.

Tableau IV - 2 : Caractéristiques de croissance de N. winogradskyi et N. hamburgensis en cultures

pures.

taux de croissance

(h-1)

temps de génération

(h)

activité spécifique

(fmol N/bact./h)

référence

N. winogradskyi : - - 9 à 42 (N. agilis) (Belser, 1979)

0.034 20 21 (Gay, 1983)

0.051 13.6 15.4 (Brion et Billen, 1998)

N. hamburgensis : 0.066 (Sundermeyer et Bock, 1981)

L'évolution de la densité de la souche X14 après l'épuisement du nitrite dans la culture enconditions mixotrophes confirme la capacité de croissance hétérotrophe de cette souche, bienque celle-ci soit environ 20 fois plus lente que la croissance mixotrophe.L'utilisation d'un milieu de culture "classique" ou "complexe" (davantage de matièreorganique) ne permet pas de mettre en évidence une croissance mixotrophe ou hétérotrophede la souche AG. La matière organique apportée par l'eau de rivière et l'eau interstitielle n'estpeut-être pas utilisable par la souche AG. La croissance mixotrophe, voire hétérotrophe, del'espèce N. winogradskyi est néanmoins connue en culture, mais elle est moins efficace que lacroissance autotrophe (Bock et al., 1991).

) La présence du mélange eau de rivière/eau interstitielle ou d'effluent dans le milieu deculture n'induit pas d'effet marqué de stress ou de stimulation sur les souches modèles.Cependant, afin de nous affranchir de tout biais dans le comportement des souches, lié à laprésence de sédiment, d'eau de rivière ou d'effluent, lors de l'inoculation de celles-ci dans nosbatches, nous utiliserons de telles cultures d'acclimatation.L'évolution des populations et de leur activité au cours des essais ultérieurs sera doncstrictement liée à leur comportement adaptatif ou compétitif.


3 2EME PARTIE : COMPETITION ENTRE SOUCHES MODELES EN BATCHES

Afin de simuler l'apport d'une souche de Nitrobacter par un effluent de station d'épuration(sérotype modèle : X14) dans un milieu déjà colonisé par une autre souche (sérotype modèle :AG), différentes situations seront étudiées dans le compartiment sédimentaire de systèmesexpérimentaux ("batches") :

- souche AG seule, en présence d'eau de rivière (cas d'une rivière ne recevant pas derejet de station d'épuration), pour observer le comportement de cette souche dans son milieu"naturel", sans perturbation

- souche AG seule, en présence d'un mélange eau de rivière/effluent (60 % / 40 %)(cas d'une rivière recevant un effluent de station d'épuration), sans la souche X14, de façon àobserver l'effet "global" (tous les paramètres, excepté la présence de X14) de l'effluent sur lasouche AG

- souche X14 seule, en présence d'un mélange eau de rivière/effluent, pour observer lecomportement de X14, acclimatée au milieu "effluent" et brusquement déversée dans unmilieu "sédiment"

- souches AG et X14, en présence d'un mélange eau de rivière/effluent, pour observerune éventuelle compétition entre les deux sérotypes.


3.1.1 Batches

Il s'agit de pots en polystyrène de volume 220 ml, contenant 15 g de sédiment humide (teneuren eau : 28.4 %) et une phase liquide de 50 ml (eau de rivière ou mélange eau derivière/effluent) (figure IV-2).

Figure IV - 2 : Schématisation d'un batch.

L’ensemble du matériel (pots, sédiment, eau de rivière, effluent) a été préalablement stérilisépar rayonnement gamma : dose de 40 kGy par une source de 60Co (Ionisos, Dagneux).

50 ml phase liquide

15 g sédiment humide

10 cm

5.5 cm


3.1.1.1 Sédiment

Le sédiment provient de la rivière Chalaronne (Ain), en amont de la station d'épuration deChâtillon/Chalaronne. Il a été prélevé à la drague à main, sur une épaisseur d'environ 5centimètres, tamisé à 2 mm puis 500 µm, et homogénéisé avant les analyses de caractérisationet la répartition dans les batches.

3.1.1.2 Eau de rivière et effluent

L'eau dite "de rivière" est issue d'un mésocosme de 600 litres simulant une rivièreoligotrophe.L’effluent a été prélevé en aval du traitement tertiaire de nitrification (Biostyr) de la stationd'épuration de Saint Fons (Rhône).L’eau et l’effluent ont été filtrés sur 0.2 µm avant la stérilisation par rayonnement γ.

3.1.1.3 Production de biomasse

Cinq litres de culture "d’acclimatation" de chaque souche ont été préparés (cf § 2.1.1). Lescultures ont été concentrées par centrifugation (12200 g, 4°C, 20 min.) dans des pots enpolycarbonate stériles (Nalgène). Les culots de bactéries ont été lavés avec du tamponphosphate stérile (2 mM, pH 7.3).La concentration en bactéries de chaque culture a été ajustée grâce à des numérations parcoloration au DAPI (cf chapitre III, § 3.1.3.1) de façon à obtenir environ 109 cellules par mld’inoculum de chaque souche.La proportion de bactéries viables dans chaque inoculum a été déterminée par un marquage auCTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) (Rodriguez et al., 1992) (protocole enannexe 8).

3.1.1.4 Inoculation des batches

Six séries de batches ont été réalisées (tableau IV-3) : les séries 1 à 4 en triplicats, les sériestémoins 5 et 6 en un seul exemplaire. Les apports d’inoculum, de la phase liquide et ducomplément en nitrite ont été effectués stérilement. Le complément en nitrite est une solutionde NaNO2 à 50 mg N/ml.


Tableau IV - 3 : Protocole d'inoculation des batches.

témoinssérie 1 série 2 série 3 série 4 série 5 série 6

sédiment 15 g humide 15 g humide 15 g humide 15 g humide 15 g humide 15 g humide

inoculum"sédiment"

1 ml AG 1 ml AG1 ml tamponphosphate

1 ml AG 1 ml tamponphosphate

1 ml tamponphosphate

phase liquide50 ml eau

rivière50 ml eau

riv./effluent50 ml eau



rivière50 ml eau

riv./effluent

inoculum"effluent"



1 ml X14 1 ml X141 ml tamponphosphate


apport NO2- 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

3.1.2 Protocole d'étude

Pour chacune des séries 1 à 4, 21 batches sont préparés afin de disposer d'un triplicat dechaque série à 7 différentes durées d'incubation (0, 3, 7, 14, 21, 28, 42 jours).Pour chacune des séries témoins (5 et 6), 7 batches sont préparés : un seul est sacrifié pardurée d'incubation.L'incubation a lieu dans une enceinte obscure, à 20°C (l'aération est assurée par diffusionpassive dans les batches non fermés hermétiquement).Pour chaque durée d'incubation, et pour chaque batch, sont effectués :

• phase liquide (prélevée à l'aide d'une seringue stérile) :- un suivi du NO2

-, NO3- et COD dans la phase liquide

• phase sédimentaire (homogénéisée manuellement après prélèvement de la phase liquide) :- un dénombrement par immunofluorecence du (ou des) sérotype(s) concerné(s)- un dénombrement par MPN de la fraction active de la (des) population(s) deNitrobacter (uniquement pour les incubations de 0, 14, 28 et 42 jours)- une mesure d’activité nitratante potentielle- une mesure de poids sec

3.1.3 Analyses

3.1.3.1 Dénombrements bactériens

• Immunofluorescence

Les bactéries sont d'abord désorbées du sédiment : 9 ml de tampon phosphate 2 mM stérilesont ajoutés à 1 g de sédiment et l'ensemble est agité 10 minutes au Whirlimixer, puis laissédécanter 5 minutes (sédimentation des particules grossières). Le surnageant subit alors desdilutions sérielles au dixième (dans un volume de 5 ml). La suspension bactérienne diluée estconcentrée sur un filtre Nuclépore noir de porosité 0.2 µm, qui subit ensuite une contre-


coloration à la gélatine-rhodamine (0.7 ml) pour diminuer l'adsorption non spécifique desanticorps à la surface du filtre et des particules minérales.Le procédé de marquage par immunofluorescence indirecte se déroule alors en deux étapes :- des anticorps de lapin, non fluorescents, spécifiques d'une souche de Nitrobacter (0.5 ml) sefixent sur un site antigénique de la paroi bactérienne. L'excès d'anticorps est éliminé parlavage (50 ml eau physiologique (NaCl 9 g/l) stérile puis 50 ml eau stérile).- un sérum de chèvre anti immunoglobulines de lapin, rendu fluorescent par couplage avec unfluorochrome : l'isothiocyanate de fluorescéine (ITCF), est appliqué (0.5 ml). L'excès estégalement éliminé par lavage.L’observation en immersion au microscope à épifluorescence (× 1000) (Nikon Labophot-2)permet de distinguer les bactéries marquées, par fluorescence de l’ITCF dans le vert, en tenantcompte de critères morphologiques.Une centaine de bactéries par échantillon est comptée, et la quantité de Nitrobacter pargramme de sédiment sec est déterminée selon la formule :

avec : Y: nombre de bactéries par gramme de sédiment secX: nombre moyen de bactéries comptées par champS: surface de filtration

D: facteur de dilutionS: surface d'un champ microscopiqueV: volume filtré

P: poids sec du sédiment

Les sérums correspondant aux sérotypes X14 (espèce Nitrobacter hamburgensis) et AG(espèce Nitrobacter winogradskyi) ont été produits par le Centre de BioexpérimentationValbex (Lyon, France).Le titrage préalable des sérums par immunofluorescence indirecte sur lame a permis de retenirla dilution 1/320ème pour les sérums spécifiques et 1/100ème pour le sérum de chèvre.

• MPN-Griess

Le protocole a été décrit dans le chapitre III (§ 3.1.3.1).

3.1.3.2 Mesure de l'activité nitratante potentielle

Le protocole est adapté de celui décrit dans le chapitre III. Au volume de sédiment humiderestant après les prélèvements pour les numérations (pesé précisément) sont ajoutés 50 mld'eau Milli-Q et 200 µl d'une solution de NaNO2 (50 mg N/ml). L'ensemble est incubé à 28°Cà l'obscurité et sous agitation pendant 24 h. Des aliquotes de 5 ml sont prélevées après 0, 4, 8et 24 h et centrifugées (17000 g, 20 min.) avant un dosage du NO2

- par la méthode manuellepar spectrométrie d'absorption moléculaire.

PVs

DSXY

××××=


3.1.3.3 Mesure de l'activité nitratante réelle et suivi du taux de Carbone Organique

Dissous

La phase liquide est filtrée sur une membrane Millipore de type GV de porosité 0.22 µmrincée avec 300 ml d'eau Milli-Q et recueillie dans un flacon en verre.Une fraction est acidifiée par de l'acide phosphorique (10 ml d'échantillon + 0.2 ml d'acide)(pH<0.2) et stockée à +4°C à l'obscurité avant dosage du Carbone Organique à l'aide d'unauto-analyseur de carbone Dohrmann-Xertes DC (Techmation).Le volume restant est utilisé dans les heures qui suivent pour le dosage des sels azotés : NH4

+,NO2

- et NO3-, à l'aide d'un auto-analyseur Technicon.

3.1.3.4 Détermination des paramètres de croissance et d'activité des sérotypes

À partir des dénombrements des sérotypes par immunofluorescence dans le compartimentsédimentaire et des concentrations en nitrite dans la phase liquide des batches au cours desincubations, différents paramètres peuvent être déterminés pour caractériser le comportementdes souches :

• taux de croissance : µ

avec : µ : taux de croissance, en h-1

Cb1 : concentration bactérienne à t1, en bact.g sec-1


• temps de génération : T

avec : T : temps de génération, en hµ : taux de croissance, en h-1

• rendement de croissance : Y

avec : Y : rendement de croissance, en bact.mol-1 N-NO2- oxydé



Cn1 : concentration en N-NO2- à t1, en mol ramenée à 1 g de sédiment sec


µ

2ln T =

21

12

CnCn

CbCbY

−−=

12

12

tt

Cbln Cbln µ

−−=


• activité réelle entre 2 points de mesures :

avec : AR[t1;t2] : activité réelle entre t1 et t2, en mol N-NO2- oxydé.g sec-1.j-1



t2 - t1 : intervalle de temps, en j

• activité réelle spécifique entre 2 points de mesures :

avec : ARS[t1;t2] : activité réelle spécifique, en mol N-NO2- oxydé.bact-1.j-1

AR[t1;t2] : activité réelle, en mol N-NO2- oxydé.g sec-1.j-1

Cb[t1;t2] : concentration bactérienne moyenne entre t1 et t2, en bact.g sec-1

• activité potentielle (à un temps de prélèvement donné) :

avec : APti : activité potentielle, en mol N-NO2- oxydé.g sec-1.j-1

Cn 0h : concentration en N-NO2- à t0h, en mol ramenée à 1 g de sédiment sec

Cn 24h : concentration en N-NO2- à t24h, en mol ramenée à 1 g de sédiment sec

• activité potentielle spécifique (à un temps de prélèvement donné) :

avec : APSti : activité potentielle spécifique à ti, en mol N-NO2- oxydé.bact-1.j-1

APti : activité potentielle à ti, en mol N-NO2- oxydé.g sec-1.j-1

Cbti : concentration bactérienne à ti, en bact.g sec-1

12

21]t;[t

tt

CnCnAR 21

−−=

]t;[t

]t;[t]t;[t

21

21

21

Cb

ARARS =

24h0ht Cn Cn APi −=

i

i

i

t

tt

Cb

APAPS =


3.2 RESULTATS

3.2.1 Effet de la stérilisation par rayonnement gamma

3.2.1.1 Caractéristiques du sédiment, de l'eau de rivière et de l'effluent

Alors que les caractéristiques de la fraction particulaire du sédiment n'apparaissent pasmodifiées par le traitement aux rayons γ (tableau IV-4), celles de l'eau interstitielle le sontfortement, avec une augmentation de tous les paramètres mesurés après stérilisation (tableauIV-5).

Tableau IV - 4 : Caractéristiques du sédiment (phase solide) de la Chalaronne.

texture (%) M.O. Corg Norg C/N

500-200 µm 200-50 µm 50-0 µm (% poids sec)

avant

stérilisation24.0 53.0 22.0 3.1 0.5 0.06 8.3

après

stérilisation23.0 52.0 24.0 3.0 0.5 0.06 8.3

Tableau IV - 5 : Caractéristiques du sédiment (eau interstitielle) de la Chalaronne.

COD Norg NH4+ NO2

- NO3-

(mg/l)

avant

stérilisation35 5.9 8.5 <0.01 <0.05

après

stérilisation452 51.9 28.1 0.07 0.45

Les caractéristiques de l'eau de rivière et de l'effluent avant leur stérilisation par rayonnementγ n'ont pas été déterminées. Nous pouvons cependant comparer les teneurs en COD, NH4

+,NO2

- et NO3- après traitement à celles déterminées dans les expériences du chapitre III dans

de l'eau de rivière et de l'effluent de même origine (tableau IV-6). La stérilisation induit uneforte augmentation des teneurs en nitrite et nitrate.


Tableau IV - 6 : Caractéristiques de l'eau de rivière et de l'effluent stériles.

COD Norg NH4+ NO2

- NO3- pH conductivité

(mg/l) µS.cm-2

eau rivière :

non stérile

stérile

1.73

1.85 0.21

0.04

0.04

0.01

1.20

1.22

9.90 7.8 415

effluent :

non stérile

stérile 4.70 0.41

2.70

0.04

0.60

6.60

21.20

145.00 7.3 995

3.2.1.2 Évolution des incubations témoins

Aucune détection des sérotypes AG et X14 à 0 et à 42 jours d'incubation n'a été obtenue dansle sédiment irradié. L'activité nitratante potentielle, quasiment nulle tout au long de la périoded'incubation, augmente cependant en fin d'incubation. Les concentrations en nitrite, nitrate etcarbone organique dissous dans la phase liquide évoluent de façon notable au cours del'incubation (tableau IV-7).

Tableau IV - 7 : Évolution des paramètres dans les séries témoins au cours de l'incubation.

durée d'incubation (j)

0 7 14 21 28 42

• Sédiment :

détection AG et/ou X14ab

nonnon

nonnon

nitratation potentielle(µmol N/g séd sec/j)

ab

00

11

00

00

12

4010

• Phase liquide :

N-NO2- a

b0.930.94

0.930.90

0.910.92

0.810.93

0.000.63

N-NO3- (mg/g séd sec)

*ab

0.050.30

0.140.05

0.00.0

0.300.25

0.950.35

CODab

0.190.19

0.200.27

0.280.32

0.340.37

0.400.47

a : série témoin avec l'eau de rivière seuleb : série témoin avec le mélange eau de rivière/effluent* : concentrations dans la phase liquide rapportées à 1 g de sédiment sec

3.2.2 Caractérisation des inoculums

La densité de l'inoculum de chacune des 2 souches est de 1,02.109 Nitrobacter/ml, soit9,60.107 Nitrobacter/g sédiment sec dans les batches.Le marquage au CTC des bactéries actives a révélé que, pour la souche AG, seuls 5 % desNitrobacter de l'inoculum (culture concentrée) sont actifs, contre 37 % pour la souche X14.


3.2.3 Dynamique des 2 souches dans les différentes conditions d'incubation : suivipar immunofluorescence

3.2.3.1 Densité de Nitrobacter et concentration en nitrite

Les concentrations en nitrite fluctuent de façon importante et rapide au cours des 6 semainesd'incubation (figure IV-3). L'implantation des 2 souches dans les différents milieux a étérapide, et en raison de la forte consommation de nitrite associée, nous avons choisi d'effectuerun second apport en nitrite le 15ème jour d'incubation.L'évolution des densités de Nitrobacter déterminées par immunofluorescence apparaîtdirectement influencée par la concentration en nitrite (figure IV-3) : après chaque phase decarence en nitrite (intervenant entre le 7ème et le 14ème jour, puis après le 21ème jour), lesdensités bactériennes diminuent dans la plupart des cas. Ce phénomène est plus marqué chezla souche AG (séries 1 et 2) que chez la souche X14. Chez cette dernière, il n'intervientqu'après la deuxième phase de carence en nitrite (série 3) et dès la première phase de carencedans le cas de la coexistence avec la souche AG (série 4).

Figure IV - 3 : Évolution des souches de Nitrobacter inoculées dans le sédiment et cinétique de

nitrification dans les batches (moyennes de triplicats ± écarts-types). (concentrations en NO2-, NO3

- et COD

déterminées dans la phase liquide et ramenées à 1 g séd. sec)

(série 1 : eau rivière, AG ; série 2 : eau riv./effl., AG ; série 3 : eau riv./effl., X14 ; série 4 : eau riv./effl., AG + X14)

série 2

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

Nitr

ob

ac

ter

AG

(.1

07/g

sé

d.

se

c)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

mg

N o

u C

/g s

éd

. se

csérie 3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

Nitr

ob

ac

ter

X1

4

(.1

07/g

sé

d.

se

c)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

mg

N o

u C

/g s

éd

. se

c

série 4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

Nitr

ob

ac

ter

AG

ou

X1

4

(.1

07/g

sé

d.

se

c)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

mg

N o

u C

/g s

éd

. se

c

Nitrobacter AG Nitrobacter X14 Nitrobacter totaux N-NO2- N-NO3- CO D

série 1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

Nitr

ob

ac

ter

AG

(.1

07/g

sé

d.

se

c)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

4,0

mg

N o

u C

/g s

éd

. se

c


3.2.3.2 Comportement individuel de AG et X14

• Comportement de AG en l'absence et en présence et d'effluent (séries 1 et 2)

L'évolution de la souche AG est très comparable dans les séries 1 ("milieu sédiment seul") et2 ("milieu sédiment + effluent"). Nitrobacter AG s'implante rapidement dans le sédiment : sadensité est multipliée par 10 environ en 14 jours (figure IV-3 séries 1 et 2), et son taux decroissance est élevé pendant les phases où la concentration en nitrite n'est pas limitante (figureIV-4 séries 1 et 2).Les densités de AG sont, pour chaque durée d'incubation, très voisines d'une série à l'autre(figure IV-3 séries 1 et 2). Cependant, l'implantation semble plus rapide (croissance entre 0 et7 jours) dans la série 2, et la population de AG à tendance à décroître plus lentement danscette même série lors de la deuxième (et plus longue) phase de carence en nitrite.

• Comportement de AG seul et X14 seul en présence et d'effluent (séries 2 et 3)

Alors que la croissance de la souche AG est affectée par la 1ère carence en nitrite (stabilisationou diminution de la densité bactérienne entre le 14ème et le 21ème jour), celle de X14 ne semblepas l'être (figure IV-3 séries 2 et 3). Le taux de croissance de X14 diminue cependant de façonassez régulière au cours de l'incubation (figure IV-4 série 3). Ceci peut traduire un épuisementdu milieu en substances nutritives ou énergétiques, mais aussi une implantation plus difficilede la souche X14 par rapport à la souche AG. Alors que la concentration en nitrite dans laphase liquide est nulle dans les séries 2 et 3, les densités de AG et X14 sont stables entre le28ème et le 42ème jour d'incubation, ce qui montre la capacité des 2 souches (de façon plus nettechez X14 néanmoins) à se maintenir (pendant une période de 2 semaines) lorsque leurprincipale source d'énergie est absente du milieu. La légère diminution de la concentration ennitrate entre le 28ème et le 42ème jour dans la série 3 pourrait s'expliquer par une activité dedénitrification de la souche X14 en l'absence de nitrite.La densité maximale de X14 supérieure à celle de AG, ainsi que la consommation du stockinitial de nitrite plus rapide dans la série 3 que dans la série 2, sont à relier au niveaud'inoculation plus élevé pour X14 que pour AG.

3.2.3.3 Comportement des souches AG et X14 co-inoculées

(observations sur série 4 puis comparaison avec les séries 2 et 3)Le comportement des souches AG et X14 co-inoculées (série 4) est différent de celui dechacune des 2 souches individuellement dans un milieu semblable (séries 2 et 3) :

- La souche AG dans la série 4 présente une évolution de moindre grande amplitudeque dans la série 2 (figure IV-3 séries 2 et 4). Son taux de croissance pendant les 14 premiersjours diminue de 40 % environ entre la série 2 (AG seul) et la série 4 (AG + X14). Les minimaet maxima de son taux de croissance se produisent néanmoins aux mêmes périodes desincubations (figure IV-4 série 2 et série 4 : AG). Une différence notable entre ces deux sériesest la poursuite de la croissance de AG entre le 28ème et le 42ème jour dans la série 4.


- La souche X14 montre également dans la série 4 une évolution de plus faibleamplitude que dans la série 3 (figure IV-3 séries 3 et 4). Il y a un effet plus marqué de la 1ère

carence en nitrite (baisse du taux de croissance), alors que, lors de la 2ème carence, pendantlaquelle nous notons un maintien de cette souche (avec un taux de croissance nul) dans lasérie 3, la population continue à croître dans la série 4 (figure IV-4 séries 3 et 4 : X14).De même que dans la série 3, la diminution de la concentration de nitrate entre le 28ème et le42ème jour peut être due à une activité dénitrifiante de l'une des souches, voire des deux.La densité maximale de Nitrobacter totaux (AG+X14), atteinte au 42ème jour d'incubation,dépasse celle des séries 2 et 3, lorsqu'une seule souche est présente dans le milieu.

Figure IV - 4 : Taux de croissance de Nitrobacter au cours des incubations dans les batches. Les

temps de doublement (en jours) sont indiqués au-dessus des barres d'histogrammes.


) La présence d'effluent, en tant que modification chimique du milieu, interviendrait defaçon modérée sur Nitrobacter AG "acclimaté" au sédiment.

) Dans des conditions environnementales similaires, et en inoculation individuelle, les 2souches évoluent différemment, X14 semblant capable de mieux résister à une carencetransitoire en nitrite.

) Dans des conditions identiques, le comportement de chacune des 2 souches diffère selonqu'elles sont seules ou qu'elles coexistent : notamment, la répercussion des fluctuations de laconcentration en nitrite sur le taux de croissance de AG et X14 est opposée entre les situationsd'inoculations individuelles et de co-inoculation.

série 1

10,9

2,8

4,4

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

incubation (j)

tau

x d

e c

rois

san

ce

(j-1

)

-1 ,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 7 14 21 28 35 42

N-N

O2

- (m

g/g

sé

d s

ec

)

série 2

5,74,8

4,2

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

incubation (j)

tau

x d

e c

rois

san

ce

(j-1

)

-1 ,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 7 14 21 28 35 42

N-N

O2

- (m

g/g

sé

d s

ec

)

série 3

16,713,78,9

6,4

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

incubation (j)

tau

x d

e c

rois

san

ce

(j-1

)

-1 ,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 7 14 21 28 35 42

N-N

O2

- (m

g/g

sé

d s

ec

)

série 4 : AG

7,08,6

26,815,0 20,9 20,9

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

incubation (j)

tau

x d

e c

rois

san

ce

(j-1

)

-1 ,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 7 14 21 28 35 42 N-N

O2

- (m

g/g

sé

d s

ec

)

série 4 : X14

25,725,772,7

7,07,6

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

incubation (j)

tau

x d

e c

rois

san

ce

(j-1

)

-1 ,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 7 14 21 28 35 42 N-N

O2

- (m

g/g

sé

d s

ec

)

série 4 : Nitrobacter to taux

23,923,934,2

7,37,5

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

incubation (j)

tau

x d

e c

rois

san

ce

(j-1

)

-1 ,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 7 14 21 28 35 42 N-N

O2

- (m

g/g

sé

d s

ec

)

taux de croissance N-NO2-


3.2.4 Activité nitratante

3.2.4.1 Activité réelle - Activité potentielle

L'activité potentielle est toujours supérieure à l'activité réelle, indiquant une très grande"surcapacité" des bactéries par rapport à l'activité qu'elles expriment in situ (figure IV-5). Defaçon logique, la différence entre l'activité potentielle et l'activité réelle s'accroît lors desphases de carence en nitrite, puisque l'activité nitratante réelle est très diminuée, voireinexistante lorsque tout le nitrite du milieu est épuisé. Ceci signifie que les bactériessupportent une certaine carence en nitrite et qu'il n'y a pas de grande perte de capacité (aumoins pendant une durée de 2 semaines). Néanmoins, tout comme la densité de Nitrobacter,l'évolution de la nitratation potentielle apparaît globalement liée à la concentration de nitritedisponible dans le milieu.

Figure IV - 5 : Évolution des activités réelles (histogrammes) et potentielles (courbes) au cours des

incubations.


série 1

0

4

8

12

16

20

incubation (j)

ac

tivité

ré

elle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

0

40

80

120

160

200

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

série 2

0

4

8

12

16

20

incubation (j)

ac

tivité

ré

elle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

0

40

80

120

160

200

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

série 3

0

4

8

12

16

20

incubation (j)

ac

tivité

ré

elle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

0

40

80

120

160

200

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

série 4

0

4

8

12

16

20

incubation (j)

ac

tivité

ré

elle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

0

40

80

120

160

200

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

/g s

éd

. s

ec

/j)

activité réelle activité potentielle


3.2.4.2 Activité spécifique

Il n'existe pas de corrélation linéaire significative (excepté dans la série 2) entre l'activiténitratante potentielle et la densité de Nitrobacter (figure IV-6). En revanche, l'activitépotentielle spécifique (activité potentielle/densité de Nitrobacter déterminée parimmunofluorescence) évolue, au cours des incubations, en liaison avec la concentration denitrite dans la phase liquide des batches : elle diminue lorsque celle-ci est limitante (figureIV-7).

Figure IV - 6 : Relation entre la densité de Nitrobacter et l'activité nitratante potentielle (* : R significatif

au seuil α = 0.05). Le point 0/0 est un passage obligatoire de la droite de régression.


série 1

y = 3,8616x

R2 = 0,5797

0

50

100

150

200

0 20 40 60 80

N itrobac ter AG (.107/g séd sec )

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

-NO

2- /g

sé

d.

se

c/j)

série 2

y = 4,3691x

R2 = 0,8730 *

0

50

100

150

200

250

0 20 40 60 80

N itrobac ter AG (.107/g séd sec )

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

-NO

2- /g

sé

d.

se

c/j)

série 3

y = 1,5361x

R 2 = 0,3807

0

40

80

120

160

200

0 20 40 60 80

N itrobac ter X1 4 (.107/g séd sec )

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

-NO

2- /g

sé

d.

se

c/j)

série 4

y = 2,0151x

R 2 = 0,5282

0

40

80

120

160

200

0 20 40 60 80

N itrobac ter totaux (.107/g séd sec )

ac

tivité

po

ten

tielle

(µm

ol N

-NO

2- /g

sé

d.

se

c/j)


Figure IV - 7 : Évolution de l'activité nitratante réelle spécifique et de l'activité nitratante potentielle

spécifique (moyennes de triplicats ± écarts-types) au cours des incubations.


3.2.5 Rendements de croissance

Le rendement de croissance de chaque sérotype individuellement a été déterminé pour chaqueintervalle de temps dans les différentes séries d'incubations (tableau IV-8).Il est, dans tous les cas, supérieur à celui déterminé en culture (§ 2.2), et il semble augmenterlorsque la concentration en nitrite dans le milieu diminue (entre le 7ème et le 14ème jour, etentre le 21ème et le 28ème jour).

série 1

0

20

40

60

80

100

120

140a

ctiv

ité r

ée

lle s

pé

cifi

qu

e

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

t. s

pé

cifi

qu

e

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)

série 2

0

20

40

60

80

100

120

140

ac

tivité

ré

elle

sp

éc

ifiq

ue

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

t. s

pé

cifi

qu

e

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)

série 3

0

20

40

60

80

100

120

140

ac

tivité

ré

elle

sp

éc

ifiq

ue

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

t. s

pé

cifi

qu

e

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)série 4

0

20

40

60

80

100

120

140a

ctiv

ité r

ée

lle s

pé

cifi

qu

e

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0 7 14 21 28 35 42

ac

tivité

po

t. s

pé

cifi

qu

e

(fm

ol N

/ba

ct.

/j)activité réelle spéc ifique activité potentielle spécifique N-NO 2-

0,0

0,4

0,8

1,2

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

N-N

O2

-

(mg

/g s

éd

. se

c)

0,0

0,4

0,8

1,2

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

N-N

O2

-

(mg

/g s

éd

. se

c)

0,0

0,4

0,8

1,2

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

N-N

O2

-

(mg

/g s

éd

. se

c)

0,0

0,4

0,8

1,2

0 7 14 21 28 35 42

incubation (j)

N-N

O2

-

(mg

/g s

éd

. se

c)


Tableau IV - 8 : Rendement de croissance des sérotypes AG et X14 au cours

des incubations (moyennes de triplicats).

rendement de croissance

(bact./mol N-NO2- oxydé)

série 1 série 2 série 3

0-7 j 6,1.1011 3,1.1012 1,7.1012

7-14 j 3,5.1012 3,4.1012 1,6.1013

14-21 j - - 2,4.1012

21-28 j 4,4.1013 9,3.1013 2,0.1013

28-42 j - - -

3.2.6 Bilan sur les 3 méthodes de mesure de taille des populations de Nitrobacterutilisées

Figure IV - 8 : Dénombrement de Nitrobacter par 3 méthodes : immunofluorescence, mesure de

l'activité potentielle, MPN-Griess. Les moyennes ± écarts-types de triplicats (immunofluorescence et

activité potentielle) ou les valeurs encadrées par leur intervalle de confiance à 95 % (MPN-Griess)

sont représentés.


série 2

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

0 7 14 21 28 35 42

incubation ( j)

Nitr

ob

act

er

(.1

07/g

sé

d.

sec)

série 1

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

0 7 14 21 28 35 42

incubation ( j)

Nitr

ob

act

er

(.1

07/g

sé

d.

sec)

série 4

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

1,0E + 03

1,0E + 04

0 7 14 21 28 35 42

incubation ( j)

Nitr

ob

act

er

(.1

07/g

sé

d.

sec)

série 3

1,0E -03

1,0E -02

1,0E -01

1,0E + 00

1,0E + 01

1,0E + 02

0 7 14 21 28 35 42

incubation ( j)

Nitr

ob

act

er

(.1

07/g

sé

d.

sec)

im m unofluorescence (X14) im m unofluorescence (AG) activité potentielle MPN-Griess


L'estimation de la taille des populations par les mesures d'activité potentielle prend en comptel'activité potentielle spécifique de chaque souche déterminée dans les cultures d'acclimatation.Parmi les 3 méthodes de mesure directe ou indirecte de la densité de Nitrobacter utilisées,l'immunofluorescence est la plus sensible aux variations de taille des populations (figure IV-8). Elle fournit, comme la mesure d'activité potentielle, un résultat assez précis (faibles écarts-types sur des triplicats). Le MPN-Griess procure, outre une faible précision, une trèsimportante sous-estimation de la taille de la population de X14, alors qu'il indique, pourquelques points des cinétiques de la souche AG, une taille de population supérieure à celleindiquée par les 2 autres méthodes.


3.3 DISCUSSION

3.3.1 Aspects méthodologiques

3.3.1.1 Effets de la stérilisation par rayonnement γ sur les caractéristiques du sédiment

L'irradiation γ induit deux effets létaux sur les microorganismes : elle provoque des lésionsempêchant la prolifération des cellules, et avec l'eau intra- ou extracellulaire, il y a créationd'agents toxiques (peroxydes) (Jackson et al., 1967).Il s'agit de la méthode de stérilisation qui perturbe le moins les propriétés du milieu (Wolf etal., 1989). Néanmoins, elle engendre des modifications significatives des concentrations encarbone et azote dans la solution du sol (Lensi et al., 1991) et dans l'eau interstitielle dusédiment (ce travail).Immédiatement après la stérilisation, l'augmentation de la teneur en carbone organiquedissous peut être due à la lyse des cellules tuées par le rayonnement γ, et à la dégradation de lamatière organique de la phase particulaire du sédiment. Cette dernière hypothèse n'est pasvérifiable : la variation de la teneur en carbone organique dans la phase particulaire dusédiment parallèlement à celle de la teneur en carbone organique dissous dans l'eauinterstitielle peut être masquée par la différence de sensibilité des appareils de mesure.L'évolution du nitrite et du nitrate doit davantage être expliquée par des processus biologiquesque par des processus chimiques, ces derniers intervenant classiquement durant les premièresheures suivant l'irradiation. Ainsi, au cours des 42 jours d'incubation, la lente diminution de laconcentration en nitrite, qui s'accélère pendant les 2 dernières semaines, parallèlement àl'augmentation de la concentration en nitrate, pourrait être due à la persistance d'enzymesnitrifiantes dans le sédiment, car certaines enzymes (intracellulaires notamment) résistent auxradiations (Lensi et al., 1991). Une partie des enzymes nitratantes, protégée notamment parles cytomembranes des cellules pourrait ainsi être préservée. L'évolution de l'activiténitratante potentielle dans le sédiment, quasiment nulle durant les 28 premiers joursd'incubation, puis plus élevée le 42ème jour, soutient cette hypothèse. L'évolution de laconcentration en nitrate (baisse vers le 14ème jour) reflète probablement une activitédénitrifiante résiduelle (Lensi et al., 1991), peu importante car les conditions d'aération dusédiment sont à priori assez satisfaisantes (le rapport surface/volume dans les batches estfavorable à la diffusion de l'oxygène).Il faudra tenir compte de l'évolution de ces séries témoins, en particulier des valeurs d'activitépotentielle au 42ème jour, dans l'interprétation des résultats des séries avec inoculation deNitrobacter.


3.3.1.2 Pertinence des paramètres suivis, avantages et limites des techniques d'étude


Il s'agit, parmi les techniques de dénombrement ou d'estimation de taille de populationdirectement applicables dont nous disposons, de celle qui est la mieux adaptée à ce typed'expérience, où seules des souches caractérisées immunologiquement et contre lesquellesnous disposons d'un sérum sont inoculées en concentration élevée dans un milieu stérile. Cecipermet de s'affranchir des problèmes liés à la limite de détection de l'immunofluorescence ensédiment (cf chapitre V).La densité de Nitrobacter X14 détectée par immunofluorescence dans le sédiment au t0 desincubations est identique à la densité de l'inoculum. À l'inverse, la densité de Nitrobacter AGdétectée dans les mêmes conditions ne représente que 27 % environ de la densité del'inoculum. Ce rendement relativement faible peut être expliqué par la petite taille desNitrobacter AG (comparée à celle des X14), qui peuvent être masqués à l'observation par desparticules de sédiment. Le rendement d'extraction des bactéries n'est vraisemblablement pasen cause, car le dénombrement à t0 intervient seulement quelques heures après l'inoculation,donc l'attachement des bactéries est présumé faible. À t0, une fraction des Nitrobacter AGpeut également être lysée (donc non détectée par immunofluorescence), car la caractérisationpar CTC de l'inoculum a révélé que seulement 5 % des bactéries étaient actives.Les fluctuations des dénombrements par immunofluorescence de chacune des 2 souches aucours des incubations sont la résultante des variations de densités de bactéries vivantes(actives ou non) et de bactéries mortes non encore lysées. Il s'agit du principal biais que cettetechnique est susceptible d'engendrer dans ce type d'expérience.

• MPN-Griess

La différence de rendement de détection entre la souche AG et la souche X14 (le niveau dedétection de AG étant très supérieur à celui de X14) met de nouveau en évidence la sélectivitédu milieu d'incubation employé dans la technique du MPN-Griess. Le milieu autotropheutilisé ici est celui classiquement choisi pour les dénombrements de nitratants dans deséchantillons naturels. Au sein des communautés nitratantes, il engendre manifestement uneimportante sous-estimation de la taille des populations mixotrophes.

• Activité potentielle

♦ Utilisation de l'activité potentielle pour estimer la taille des populations de Nitrobacter :Dans le cas de la souche AG, les estimations de la taille de la population déduites de mesuresd'activité potentielle "concordent" avec les dénombrements par immunofluorescence.Dans le cas de la souche X14, les mesures d'activité potentielle engendrent systématiquementune sous-estimation de la taille de la population par rapport à l'immunofluorescence. Cettesous-estimation s'accentue au cours de l'incubation. Le long temps d'adaptation de cettesouche mixotrophe ou hétérotrophe aux conditions plutôt autotrophes des incubations pour les


mesures d'activité potentielle (pas d'ajout de matière organique directement assimilable dansles incubations, seule la matière organique originaire du sédiment est un substratpotentiellement utilisable) pourrait être en cause (Woldendorp et Laanbroek, 1989). En effet,le maintien et la croissance de la souche X14 au cours des 42 jours d'incubation requièrentvraisemblablement qu'elle passe d'un métabolisme mixotrophe à un métabolismehétérotrophe.Il est donc nécessaire d'utiliser avec prudence les résultats que procure cette méthode pour desmesures de taille de communauté nitratante dans des milieux plus complexes (cf chapitre III)ou sur le terrain, car différentes souches présentent différentes activités potentiellesspécifiques et réagissent plus ou moins rapidement à l'apport de nitrite pour favoriser leurmétabolisme auto- ou mixotrophe.

♦ Utilisation de l'activité potentielle pour en déduire l'activité réelle in situ :Les activités réelles et potentielles n'évoluent pas de façon parallèle ou proportionnelle aucours des incubations. Il semble donc difficile d'utiliser des mesures d'activité potentielle pouren déduire des valeurs d'activité réelle in situ, en prenant en compte des paramètresenvironnementaux comme le proposent certains auteurs (Cooper, 1984).

3.3.2 Dynamique des souches AG et X14 dans le sédiment

3.3.2.1 Implantation et évolution des sérotypes

• Évolution globale

Les caractéristiques (chimiques) du milieu évoluent au cours des incubations. Ceci concerneparticulièrement la concentration en nitrite, qui fluctue au rythme des apports et de laconsommation par Nitrobacter. Les bactéries sont ainsi soumises successivement à desconditions plutôt mixotrophes (périodes où le nitrite n'est pas limitant) et à des conditionsplutôt hétérotrophes (périodes de carence en nitrite).Dans les conditions de notre expérience, les 2 souches se sont montrées capables de coloniserle milieu sédiment. Ce comportement est cohérent, car ces souches ont déjà été détectées enmilieu naturel d'eau douce (Montuelle et al., 1996). Le temps de doublement de chaquesouche est cependant considérablement allongé par rapport aux temps déterminés en culturespures : plusieurs jours ici contre moins de 24 heures en cultures.La définition d'un indice de productivité globale sur les 42 jours d'incubation (nombre decellules à t0 / nombre de cellules à t42) permet de comparer l'évolution, en terme de densité,des souches AG et X14 dans les différentes situations. Cet indice représente la résultante detoutes les phases d'incubation pendant 42 jours. Ainsi, en inoculation individuelle comme enco-inoculation, X14 présente un indice de productivité inférieur de 50 % environ à celui de AG(tableau IV-9).Globalement, sur la durée de l'expérience, le sérotype AG s'implante mieux que le sérotypeX14 dans le sédiment.


Tableau IV - 9 : Indice de productivité des sérotypes AG et X14 dans les différentes incubations.

série 1 série 2 série 3 série 4AG AG X14 AG X14 AG + X14

14 15 7 9 5 6

Il faut de plus tenir compte de la fraction de cellules actives déterminée par un marquage desinoculums au CTC au t0 des incubations. Cette fraction était, chez la souche AG, 7 foisinférieure à celle de l'inoculum de la souche X14. Ceci confirme la plus grande capacitéd'implantation de la souche AG par rapport à la souche X14 dans nos conditions d'expérience.

• Comportement pendant les différentes phases des incubations

Taille des populations et concentration en nitrite :Chacune des 2 souches est, dans des proportions différentes, affectée par les carences ennitrite. Cet effet du nitrite apparaît "retardé" sur les densités de populations (et sur les activitépotentielles). Ce retard apparent peut être dû à notre intervalle de temps entre 2 mesures, quimasque sans doute des variations plus marquées des densités de populations. Il est aussi àrelier au temps de latence avant que les populations répondent aux changementsenvironnementaux.D'une manière générale, le sérotype AG, au métabolisme préférentiellement autotrophe, estsensible aux variations de concentration en nitrite dans le milieu.Le sérotype X14 quant à lui n'est affecté par la carence en nitrite que lorsque celle-ci seprolonge pendant plusieurs jours. Sa capacité à croître hétérotrophiquement et son aptitude àdénitrifier (Freitag et al., 1987) lui permettent vraisemblablement de s'adapter rapidement àdes conditions transitoires de limitation en nitrite. Dans la série 3, la perte de nitrite entre le7ème et le 14ème jour non compensée par la production de nitrate étaye cette hypothèse.Lorsque l'absence de nitrite est prolongée, cette disparition de nitrate intervient également,confirmant le relais de l'activité nitratante par une activité dénitrifiante permettant,partiellement ou totalement, le maintien de la densité de la population de X14. Cette activitédénitrifiante, si elle existe, serait localisée dans la zone inférieure du sédiment, où l'oxygènediffuse sans doute un peu moins.

Taille des populations et conditions environnementales globales :La modification des conditions environnementales (absence ou présence d'effluent) a uneinfluence (modérée) sur le sérotype AG, notre modèle de souche autochtone du sédiment : letaux de croissance pendant les 7 premiers jours d'incubation est plus élevé en présence qu'enabsence d'effluent, et surtout, la population semble capable de mieux résister (tout du moinsde résister plus longtemps, car nous ne connaissons pas l'évolution au-delà de 42 jours) à unecarence en nitrite dans le milieu contenant de l'effluent. La matière organique apportée parl'effluent, qualitativement différente de celle procurée par le sédiment, pourrait en être lacause. La présence de cette matière organique (peut-être plus facilement assimilable après un


traitement aux rayons γ) pourrait favoriser le maintien d'une plus grande densité de AG grâceà une croissance mixotrophique, voire hétérotrophique (Bock, 1976).

3.3.2.2 Activités réelles et potentielles - Relations nombre-activité

Adaptation des sérotypes à leur environnement ?

L'activité réelle spécifique n'est pas constante pour une série donnée. Ceci est logique,puisque les concentrations en nitrite évoluent en permanence, et le milieu passe rapidementd'une situation où le nitrite n'est pas limitant à une situation où il est totalement absent.Les activités réelles spécifiques mesurées dans cette expérience sont légèrement supérieures àcelles déterminées par Degrange et al. (1997) pour 3 sérotypes de Nitrobacter (AG, LL etX14) inoculés en sol. Une meilleure diffusion du nitrite au sein du sédiment par rapport au solpourrait expliquer cette différence.

La mesure de l'activité potentielle est effectuée, contrairement à la mesure d'activité réelle,dans des conditions standardisées. Compte tenu des numérations par immunofluorescenceobtenues par ailleurs, une activité potentielle spécifique est calculée. Celle-ci n'est pasconstante au cours des incubations ; son évolution est en relation, avec un décalage temporelde quelques jours, avec la concentration en nitrite disponible dans le milieu.Deux hypothèses peuvent être émises :

- Parmi l'ensemble des bactéries marquées par immunofluorescence, la proportion debactéries mortes (à membrane cellulaire intacte) est variable au cours des incubations. Pluscette proportion augmente, plus l'activité potentielle spécifique est sous-estimée. Ce serait lecas lors des phases de carence en nitrite, pour la souche AG notamment.

- L'activité potentielle spécifique des bactéries actives n'est pas constante au cours desincubations. Ainsi, si nous considérons que l'activité potentielle spécifique est directementliée au taux d'enzyme Nor synthétisée, d'après nos résultats, la synthèse de Nor chez lesérotype AG serait plus importante dans les conditions de milieu plutôt mixotrophes, enprésence de nitrite non limitant, que dans les conditions plutôt hétérotrophes carencées ennitrite. Ceci illustre le caractère inductible de l'enzyme par le nitrite (Bock et al., 1986).Alors que la densité de X14 est très peu sensible à la première carence en nitrite (hormis unelégère diminution du taux de croissance), l'activité potentielle associée à cette populationdécroît de façon significative lors de chacun des 2 épisodes de limitation en nitrite. Lepotentiel nitratant du sérotype X14 s'affaiblirait donc rapidement lorsque le milieu s'appauvriten nitrite, car dans le sédiment, la croissance hétérotrophe de X14 relaierait la croissancemixotrophe. Ceci est cohérent avec les observations en culture montrant que :

- la quantité de Nor chez l'espèce N. hamburgensis dépend des conditions decroissance (Aamand et al., 1996)

- des cellules ayant une croissance hétérotrophe possèdent un niveau plus faible deNor (Steinmüller et Bock, 1977) (observations sur N. agilis)

- il faut 3 à 4 semaines d'induction pour qu'elles soient capables de reprendre unecroissance autotrophe (Bock, 1976) (observations sur N. agilis).


3.3.2.3 Compétitivité des 2 sérotypes

En culture pure, les valeurs de Km (constante de demi-saturation) pour l'oxydation du nitritesont significativement inférieures chez N. winogradskyi (sérotype AG) par rapport à N.hamburgensis (sérotype X14) (Laanbroek et al., 1994 ; Laanbroek et Gerards, 1993), ce quitraduit une plus grande affinité du sérotype AG pour le nitrite. L'issue de la compétition pourle nitrite entre ces 2 espèces peut être prévue en déterminant le ratio Vmax/Km, utilisé commeindicateur de l'efficacité d'une réaction enzymatique (Healy, 1980). Ainsi, en culture, enconditions autotrophes comme en conditions mixotrophes, N. winogradskyi est un meilleurcompétiteur que N. hamburgensis pour le nitrite (Both et al., 1992).La croissance hétérotrophique a été montrée en culture pour les 2 souches (Prosser, 1989).Néanmoins, in situ, N. hamburgensis, malgré son faible taux de croissance, utilise plusefficacement la matière organique notamment dans des conditions de limitation en oxygène(Laanbroek et al., 1994), ce qui le rend plus compétitif lorsque le nitrite est limitant(Degrange et al., 1997).

Qu'en est-il dans nos batches ?

Malgré un niveau d'inoculation de chacune des 2 souches identique dans les incubationsindividuelles ou en mélange, leur indice de productivité est plus faible lorsqu'elles sont co-inoculées que lorsqu'elles sont inoculées individuellement (tableau IV-9). Dans la série 4, lessouches doivent en effet coexister avec une source d'énergie qui n'a pas augmentéquantitativement par rapport aux incubations individuelles, et leur comportement est modifiépar rapport aux situations où elles sont seules.Les différences de dynamique des souches entre les séries 2 et 3 d'une part, et la série 4d'autre part, ne peuvent être dues qu'aux interactions entre les 2 souches et à leur aptitude àréagir aux variations rapides de la concentration en nitrite. Dans l'évaluation de lacompétitivité des souches dans les batches, il est donc nécessaire de distinguer les phasespendant lesquelles du nitrite est présent en concentration non limitante, et les phases decarence en nitrite (tableau IV-10).

• Phases de non limitation en nitrite :- 1ère phase (globalement, entre t0 et t14) : Les 2 souches montrent un taux de croissancesensiblement équivalent ; aucune relation de dominance n'apparaît.- 2ème phase (entre t21 et t28) : Le taux de croissance de la souche AG est 5 fois supérieur àcelui de la souche X14. La croissance de la souche redémarre plus rapidement que celle de lasouche X14 après une période de carence en nitrite. Tout le nitrite (ou une grande partie) estutilisé par AG avant que X14 ait le temps de synthétiser de nouvelles enzymes Nor. En tenantcompte du rendement cellulaire (nombre de bactéries formées/quantité de nitrite consommée)déterminé en culture (§ 2.2), les 0.9 mg de nitrite consommé entre t15 (ajout de nitritequelques heures après le point t14) et t21 devraient engendrer la production d'environ 3.107

Nitrobacter AG. Or la population de Nitrobacter AG augmente seulement d'environ 107

bactéries pendant cet intervalle de temps. Plusieurs hypothèses peuvent être formulées :


- tout le nitrite est utilisé par AG, et le rendement cellulaire est inférieur dans ce milieucomplexe par rapport aux cultures pures. Ceci semble peu probable car dans les incubationsavec AG ou X14 seul, le rendement de croissance est supérieur à celui déterminé en culturespures.

- tout le nitrite est utilisé par AG, et la densité de la population de AG entre t14 et t21a d'abord diminué pendant quelques heures à quelques jours, suite à la carence en nitrite, puisa de nouveau augmenté, stimulée par l'apport de nitrite.

- une partie du nitrite est utilisée par X14, dont la densité a chuté après t14 davantageque ce que nous observons.

• Phases de carence en nitrite :- 1ère phase (entre t14 et t21) : Chez chacune des 2 souches AG et X14, le taux de croissanceest, dans la série 4, l'opposé de celui observé dans les séries 2 et 3 respectivement. Ensituation de compétition, la souche AG présente un taux de croissance moindre par rapportaux 14 premiers jours de l'incubation, mais néanmoins positif. La souche X14 présente quant àelle une décroissance, alors que sa densité continue à augmenter lorsque, dans des conditionssimilaires, elle est seule dans le batch.- 2ème phase (entre t28 et t42) : Là où les 2 souches présentent une densité stable, voirediminuant légèrement, lorsqu'elles sont inoculées individuellement, chacune montre un tauxde croissance positif sensiblement équivalent en condition de compétition.La croissance des souches pendant ces 2 phases est à associer à leur capacité d'hétérotrophie.La souche AG, qui ne montrait pas de croissance hétérotrophe en culture pure dans le milieucontenant de l'eau de rivière et de l'eau interstitielle du sédiment, trouve peut-être ici unequalité de matière organique apportée par l'effluent plus favorable à ce type de croissance.

Tableau IV - 10 : Dynamique des souches AG et X14 en situation de compétition ou non, dans un

milieu non limité ou carencé en nitrite.

NO2- dans les batches :

non limitant 1ère carence non limitant 2ème carence

inoculations individuelles :

AG seul (série 2) ++++ - - +++ -

X14 seul (série 3) +++ ++ ++ -

ª évolution plus régulière de X14, meilleure adaptation de X14 à la limitation en nitrite

co-inoculation :

AG (avec X14) (série 4) +++ ++ ++(+) ++

X14 (avec AG) (série 4) +++ - - + ++

ª évolution plus régulière de AG, meilleure adaptation de AG à la limitation en nitrite+ :

++ :+++ :

++++ :

maintiencroissance lentecroissance rapidecroissance très rapide

- :- - :

décroissance faibledécroissance marquée


3.3.2.4 Bilan : Tendances générales de la dynamique des sérotypes AG et X14

Pour un sérotype donné, le taux de croissance et l'activité potentielle spécifique varient enfonction des conditions environnementales.En présence de nitrite, le sérotype X14, préférentiellement mixo- ou hétérotrophe, se montrepeu compétitif face au sérotype AG, préférentiellement autotrophe.

En conditions hétérotrophes, et sans limitation en oxygène, les 2 sérotypes affichent descaractéristiques de croissance à peu près équivalentes.À terme, dans des conditions d'incubation avec des fluctuations de la concentration en nitrite,la densité de la souche AG devrait finir par dépasser celle de la souche X14, sous réserve quela carence en nitrite ne se prolonge pas ; en effet, en sol, la croissance mixo- hétérotrophiquede AG ne se poursuit pas au delà d'une semaine, alors que celle de X14 continue pendantplusieurs semaines (Degrange et al., 1997).


3.4 CONCLUSION

Pouvons-nous étayer nos hypothèses émises d'après les résultats des expérimentations enmicrocosmes (chapitre III) ?

Au niveau du sédiment, un rejet de station d'épuration entraîne notamment :- un changement de l'environnement chimique pour les souches autochtones- un apport de bactéries issues de la station.

L'étude en batches a mis en évidence, pour nos souches modèles :- l'absence de stress significatif lié au changement d'environnement "chimique" de la

population autochtone- l'implantation dans le sédiment de la souche allochtone.

La survie des souches autochtone et allochtone à l'aval du rejet implique que celles-ci entrenten compétition entre elles pour le substrat. Leur comportement est donc modifié par rapportaux situations où elles sont seules dans le milieu.

Ceci soutient notre hypothèse de changement de structure des communautés nitrifiantes (toutau moins des communautés nitratantes) dans le sédiment à l'aval d'un rejet de stationd'épuration. La coexistence au niveau du sédiment de souches de nitrifiants autochtones etallochtones issus d'un effluent de station d'épuration, ayant des caractéristiques de cinétiquedifférentes en milieu complexe, entraîne des variations dans les relations nombre-activité desnitrifiants.

Quelles sont les conséquences sur le terrain ?

• La structure de la communauté nitratante dans le compartiment sédimentaire est très liéeaux conditions environnementales. La souche la plus compétitive est celle qui a la plus forteaffinité pour le nitrite quand il n'est pas limitant, et qui est capable de s'adapter rapidementaux changements de conditions de substrat en utilisant la matière organique comme sourced'énergie et de carbone (le sérotype AG dans notre cas d'étude).Or nous n'observons pas de disparition rapide de l'un et l'autre des 2 sérotypes du genreNitrobacter étudiés. En cas de carence transitoire en nitrite, les populations se maintiennent àcertain niveau et elles sont capables d'être de nouveau actives (plus ou moins rapidement)lorsque leur substrat énergétique est de nouveau présent dans le milieu (Tappe et al., 1999).Ceci est en accord avec le concept de stratégie de développement de type "K" des bactériesnitrifiantes qui compensent un temps de génération long par une grande pérennité dans lesmilieux. Elles sont en effet capables de survivre pendant de longues périodes à des conditionsadverses telles un manque de substrat ou d'oxygène (Hagopian et Riley, 1998).Néanmoins, nous avons pu mettre en évidence le rôle structurant de la concentration en nitritedisponible et en matière organique utilisable pour les communautés nitratantes en sédiment.Cet effet a déjà été montré en sol (Degrange et al., 1997). Dans le cas de sédiments de rivièresoumis à des rejets de station d'épuration, ces facteurs revêtent une grande importance. Il fauty ajouter la baisse de la teneur en oxygène dissous à l'aval de ces rejets (facteur non pris en


compte dans notre expérience), qui pourrait également gouverner des changements dans lastructure des communautés nitratantes. Des changements qualitatifs et quantitatifs depopulations de Nitrobacter ont déjà été observés en rivière, dans des biofilms épilithiquessitués en aval d'un rejet de station d'épuration (Montuelle et al., 1996).

• La relation nombre-activité n'est pas constante chez les nitratants du genre Nitrobacteren sédiment : elle varie selon les souches, et au sein d'une même souche, elle évolue avec laconcentration de nitrite disponible. Les relations nombre-activité ne peuvent donc êtreétablies que pour une situation précise, dans des conditions et à un instant donnés. Ainsi, lestravaux in situ de Montuelle et al. (soumis) en amont et en aval de rejets de stationsd'épuration en rivière montrent qu'il n'existe pas de corrélation entre la taille descommunautés nitritantes et nitratantes et leur activité potentielle. Des observations semblablesont été effectuées en lac, où en début d'été, période de nitrification active dans la colonned'eau, les densités de nitritants et nitratants ne changent pas significativement par rapport aureste de l'année alors que les activités nitritante et nitratante potentielles augmentent fortement(Takahashi et al., 1982). De même, Both (1990, thèse, cité par Both et al. (1992)), lors d'uneétude des variations spatio-temporelles de la nitratation en sol, ne trouve pas de corrélationentre le nombre de nitratants et la nitratation potentielle. Il met en cause des changements desparamètres de cinétique des souches (Vmax et Km variant dans l'espace et dans le temps) oudes changements dans la structure de la communauté.

L'évolution de la taille des populations et celle des activités réelle et potentielle associées sontà prendre en compte pour caractériser le comportement de souches en milieu complexe.La complémentarité des informations apportées par ces différents paramètres a apporté deséléments d'explication sur les mécanismes induisant des modifications de l'activité nitrifianteen sédiment entre l'amont et l'aval d'un rejet de station d'épuration, telles que cellesobservées dans notre étude en microcosmes (cf figure III-24).

CHAPITRE V

ÉTUDE DE COMMUNAUTES NITRIFIANTESEN SEDIMENT :

MISES AU POINT ET ADAPTATIONSMETHODOLOGIQUES POUR LEDENOMBREMENT DU GENRE

NITROBACTER

CHAPITRE V : DENOMBREMENT DU GENRE NITROBACTER 138

ÉTUDE DE COMMUNAUTES NITRIFIANTES EN SEDIMENT :MISES AU POINT ET ADAPTATIONS METHODOLOGIQUES POUR LE

DENOMBREMENT DU GENRE NITROBACTER

1 INTRODUCTION............................................................................................... 140

2 1ÈRE PARTIE : TRAITEMENT DES ÉCHANTILLONS BRUTS ...................................... 142

2.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 142


2.2.1 Sédiments ................................................................................................................. 1422.2.2 Traitement des sédiments.......................................................................................... 1432.2.3 Numération de la microflore totale par la méthode au DAPI ....................................... 1442.2.4 Détermination du rendement des pré-traitements....................................................... 144

2.3 RÉSULTATS : RÉCUPÉRATION DES BACTÉRIES ET EXTRACTION DE L 'ADN............................. 144

2.4 DISCUSSION.................................................................................................................... 145

2.5 CONCLUSION................................................................................................................... 146

3 2ÈME PARTIE : DOSAGE DE L'ADN PAR FLUORIMÉTRIE – RENDEMENT

DE PURIFICATION DE L'ADN............................................................................. 147

3.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 147


3.2.1 Dosage de l'ADN par fluorimétrie............................................................................... 1483.2.1.1 Mises au point préliminaires ...........................................................................................1483.2.1.2 Gammes étalons............................................................................................................148

3.2.2 Purification de l'ADN.................................................................................................. 1483.2.2.1 Utilisation des colonnes Elutip-d

...................................................................................148

3.2.2.2 Rendement de récupération de l'ADN après purification..................................................149

3.3 RÉSULTATS..................................................................................................................... 149

3.3.1 Etablissement de gammes étalons dans différents tampons ...................................... 1493.3.2 Rendement de récupération de l'ADN lors de sa purification sur colonne Elutip-d ...... 150

3.4 DISCUSSION.................................................................................................................... 151

3.4.1 Dosage de l'ADN....................................................................................................... 1513.4.2 Rendement de récupération de l'ADN lors de sa purification sur colonne Elutip-d ...... 152

3.5 CONCLUSION................................................................................................................... 153

4 3ÈME PARTIE : RENDEMENT GLOBAL DE LA MÉTHODE MPN-PCR – COMPARAISON AVEC LES MÉTHODES MPN-GRIESS ET IMMUNOFLUORESCENCE .. 154

4.1 INTRODUCTION ................................................................................................................ 154


4.2.1 Dénombrement de Nitrobacter par MPN-PCR............................................................ 1544.2.2 Dénombrement de Nitrobacter par MPN-Griess......................................................... 1554.2.3 Dénombrement de Nitrobacter par immunofluorescence indirecte.............................. 1564.2.4 Rendement et seuil de détection des méthodes MPN-PCR, MPN-Griess et immunofluorescence ............................................................................................. 156

4.2.4.1 Inoculation du sédiment ................................................................................................. 1574.2.4.2 Calculs des rendements et seuils de détection................................................................157


4.3 RÉSULTATS..................................................................................................................... 158

4.3.1 Rendement global et seuil de détection de chaque technique .................................... 1584.3.1.1 MPN-PCR .....................................................................................................................1584.3.1.2 MPN-Griess...................................................................................................................1604.3.1.3 Immunofluorescence...................................................................................................... 160

4.4 DISCUSSION.................................................................................................................... 161

4.4.1 Évaluation de la méthode MPN-PCR......................................................................... 1614.4.2 Quelle(s) méthode(s) pour des études in situ ? .......................................................... 1624.4.3 Vers des méthodes moléculaires discriminantes très performantes............................ 165

4.4.3.1 Avancées techniques..................................................................................................... 1654.4.3.2 Amélioration de la spécificité de la cible moléculaire .......................................................166

4.5 CONCLUSION................................................................................................................... 167


1 INTRODUCTION

La présence de bactéries nitrifiantes dans l'environnement est souvent déduite de profilschimiques et de mesures d'activités (Admiraal et Botermans, 1989 ; Henriksen et al., 1993 ;Scott et Abumoghli, 1995), mais est rarement déterminée directement. La concentration ensubstrat, la température, la lumière, la présence de composés inhibiteurs ou de bactérieshétérotrophes... peuvent faire varier la relation entre le taux de nitrification et la présence denitrifiants, car l'activité spécifique d'une souche donnée peut être modifiée en fonction desconditions environnementales (cf chapitre IV).L'une des difficultés pour l'évaluation du processus de nitrification en rivière est donc lamauvaise connaissance du nombre total réel de nitrifiants, entraînant une impossibilité àétablir précisément in situ une relation nombre-activité. Afin d'appréhender la distribution etle rôle des populations de nitrifiants en milieu aquatique, il est donc indispensable de posséderau préalable une méthode fiable de détection et de dénombrement des genres concernés.Dans les environnements aquatiques, l'activité nitrifiante, et les bactéries nitrifiantes étantlocalisées essentiellement au niveau des particules en suspension et des sédiments(Abeliovich, 1992 ; Admiraal et Botermans, 1989 ; Bonnet et al., 1997 ; Gresikowski et al.,1996), il est nécessaire de développer une méthode d'étude de ces populations adaptée à cetype de substratum.

Jusqu’à ces toutes dernières années, les procédés classiques de numération des bactériesnitrifiantes étaient limités par les caractéristiques physiologiques des genres recherchés, enparticulier des temps de génération très longs, qui impliquent des durées d’incubation deplusieurs semaines pour la technique du nombre le plus probable (Cochran, 1950), basée surle développement des bactéries et le suivi de leur activité dans un milieu électif (Schmidt etBelser, 1994).Par ailleurs, l’immunofluorescence, technique développée dans les années 1970 (Fliermans etal., 1974 ; Schmidt, 1974), a permis de détecter des sérotypes des genres Nitrosomonas etNitrobacter contre lesquels on dispose d’un sérum. Cependant, étant donné que toutes lessouches de ces genres ne sont vraisemblablement pas caractérisées, nous ne détenons pasencore d’anticorps couvrant totalement la diversité de ces deux genres ; l’inconvénient majeurde cette méthode étant qu’elle requiert l’isolement et la culture des souches bactériennes pourproduire des anticorps. Or, dans les systèmes naturels, l’enrichissement et la culture ne sontpas toujours possibles. De nombreuses cellules bactériennes présentes dans les peuplementsnaturels sont viables mais ne peuvent être cultivées par les procédés classiques.

Pour les bactéries nitrifiantes chimioautotrophes, qui ont une croissance très lente, et dontl'isolement et la purification nécessitent des mois, voire des années, le développement deméthodes de détection permettant de s'affranchir de l'étape de culture paraît très avantageux.La technique de PCR permet d'amplifier spécifiquement une séquence cible de l'ADN pour larendre détectable. Elle permet la détection de bactéries responsables de la première étape de la


nitrification en milieu aquatique (Nejidat et Abeliovich, 1994 ; Voytek et Ward, 1995 ; Wardet al., 1997).Nous nous sommes intéressés à cette technique pour l'étude in situ du genre Nitrobacter,souvent étudié comme modèle de la deuxième étape de la nitrification.En 1995, Degrange et Bardin ont développé la méthode MPN-PCR dans le but d'améliorer ledénombrement du genre Nitrobacter en sol. Leur protocole utilise une extraction de l'ADN dela microflore du sol directement à partir d'échantillons bruts. Mais dans les milieuxaquatiques, les bactéries sont beaucoup moins protégées qu'en sol, et les procédés d'extractionemployés dans ce protocole semblent trop violents : l'ADN ainsi obtenu est susceptible d'êtretrès cassé, et une grande quantité perdue au cours de la purification.

Afin de tenter d'adapter cette technique de MPN-PCR pour le dénombrement du genreNitrobacter dans les sédiments d'eau douce, notre travail a été organisé selon le schéma ci-dessous :

- Le mode de traitement des échantillons avant la PCR a été modifié, de façon àséparer les bactéries de leur support avant d'en extraire l'ADN (1ère partie).

- La difficulté principale semblant se situer au niveau de la récupération de l'ADN,essentiellement lors de sa purification, un essai de quantification de la perte d'ADN lors del'étape de purification a donc également été effectué après l'adaptation d'une méthode dedosage de l'ADN (2ème partie).

- Enfin, le rendement global et la sensibilité de la méthode ont été déterminés, et unecomparaison avec des techniques plus classiques (MPN-Griess et immunofluorescence) a étéeffectuée (3ème partie).

échantillon brut↓

ADN total extrait↓

ADN total purifié↓

ADN de Nitrobacter amplifié↓

dénombrement de Nitrobacter

Traitement des échantillons1ère partie

Rendement de lapurification de l'ADN

2ème partie

Rendement global etsensibilité de la méthode

Comparaison avec leMPN-Griess et

l'immunofluorecence3ème partie


2 1ERE PARTIE : TRAITEMENT DES ECHANTILLONS BRUTS

2.1 INTRODUCTION

Pour tenter de simplifier le protocole d'application des techniques d'extraction, de purificationet d'amplification de l'ADN, nous avons cherché à adopter un protocole de traitement deséchantillons bruts commun pour les principaux types de matériaux rencontrés dans les milieuxaquatiques : l'eau et les particules en suspension, les sédiments et la biomasse de stationd'épuration.L'objectif était, selon le schéma ci-dessous, de séparer la biomasse bactérienne de la fractionparticulaire, puis de la concentrer avant d'en extraire l'ADN.

échantillon brut↓

DÉSORPTIONdes bactéries par broyage

↓SÉDIMENTATION

des particules grossières par centrifugation↓

surnageant contenant les bactéries↓

CONCENTRATIONdes bactéries par centrifugation

↓EXTRACTION ET PRÉCIPITATION DE L’ADN

Nous ne traiterons que des travaux effectués sur les sédiments, bien que nous ayons égalementtravaillé avec de la biomasse de station d'épuration (Féray, 1996).


2.2.1 Sédiments

Deux sédiments de nature différente ont été prélevés dans deux petites rivières situées à unecinquantaine de kilomètres au nord-est de Lyon (Ain) : le Neyrieux et la Chalaronne. Lepremier est sableux et contient peu de matière organique, le second est plus argileux etorganique (tableau V-1).

Tableau V - 1 : Caractéristiques physico-chimiques des sédiments du Neyrieux et de la Chalaronne.

Texture (%) M.O. Corg Norg C/N

500-200 µm 200-50 µm 50-0 µm (% poids sec)

Neyrieux 54.1 30.8 15.1 1.4 0.15 0.04 3.75

Chalaronne 12.3 32.2 55.5 - 5.5 0.55 10


2.2.2 Traitement des sédiments

Chaque échantillon est traité comme suit (adapté d'après Steffan et al. (1988)).

Désorption des bactéries :Il s'agit de séparer la fraction bactérienne de la plupart des particules minérales et organiques,susceptibles d'interférer avec l'amplification ultérieure de l'ADN.À 1 g de sédiment sont ajoutés 9 ml de tampon phosphate 0.1 M, pH 4.5 et 0.6 g de PVPP(polyvinylpolypyrrolidone). Le mélange est ensuite broyé au Waring blender pendant 3minutes à vitesse moyenne (3 fois 1 minute de broyage + 1 minute de refroidissement dans laglace), puis 60 µl de SDS (sodium dodecyl sulfate) à 20 % sont ajoutés, suivis de 5 secondesde broyage. Transféré dans un tube à centrifuger, le mélange subit ensuite une centrifugationde 10 minutes à 900 g et 10°C. Le surnageant (contenant les bactéries) est réservé et le culotest lavé avec 2 cycles de broyage-centrifugation identiques au précédent, mais sans ajout dePVPP ni de SDS.

Concentration des bactéries :Les 3 surnageants sont regroupés, et les bactéries sont concentrées par centrifugation : 30minutes à 10000 g et 10°C. Le surnageant est éliminé et le culot est lavé : 6 ml de solution"défloculante" (sodium hexamétaphosphate 0.1 %, sodium pyrophosphate 0.1 %) sont ajoutés,suivis d'une agitation à la main pendant 1 minute puis d'une centrifugation (30 minutes, 10000g, 10°C). Cette opération est réalisée 2 fois. Enfin, un dernier lavage du culot est effectué avec4.5 ml de tampon d'extraction (0.33 M Tris-HCl, 0.001 M EDTA, pH 8.0) et unecentrifugation identique aux 2 précédentes.

Extraction de l’ADN :Le culot de bactéries peut alors subir une lyse : il est remis en suspension dans 0.75 ml detampon d'extraction, auquel est ajouté du lysozyme en concentration finale 5 mg/ml, etl'ensemble est incubé pendant 2 heures à 37°C. La suspension est alors chauffée à 60°Cpendant 10 minutes, après l'ajout de SDS (concentration finale : 1 %), puis refroidie dans de laglace pendant 2 heures. Une centrifugation (20 minutes, 12000 g, 4°C) permet ensuite derécupérer un premier surnageant. Le culot est lavé avec 0.3 ml de tampon d'extraction, suivid'une centrifugation identique, et le second surnageant obtenu est regroupé avec le premier ;l'ensemble constitue le lysat contenant l'ADN.

Précipitation de l’ADN :Cette étape doit permettre d’obtenir un culot d’ADN exempt des résidus des cellulesbactériennes, qui sont dissous dans un solvant organique.L'ADN est précipité par de l'isopropanol : 1/10ème (vol/vol) de solution d'acétate de sodium (3M, pH 5.2) et 1 volume d'isopropanol sont ajoutés au lysat. L'ensemble est remuémanuellement délicatement et laissé 30 minutes à température ambiante, avant de subir unecentrifugation (30 minutes, 22000 g, 4°C). Le surnageant est écarté et le culot est lavé avec100 µl d'éthanol à 70°, suivi d'une centrifugation (10 minutes, 22000 g, 4°C). Le culot estséché (15 minutes sous vide ou une nuit à température ambiante), puis repris dans 50 µl detampon d'extraction et incubé 5 minutes à 37°C.


2.2.3 Numération de la microflore totale par la méthode au DAPI

Le protocole est adapté de celui de Rebillard et Torre (1993). Il a été décrit dans le chapitre III(§ 3.1.3.1) et il est détaillé en annexe 7.

2.2.4 Détermination du rendement des pré-traitements

Une numération de la microflore totale (DAPI) est effectuée sur l'échantillon brut ainsiqu'après chaque étape du protocole. Le nombre de bactéries totales à l'issue de chaque étapeest comparé au dénombrement suite à l'étape précédente. Pour l'étape de lyse, le nombre debactéries lysées est déduit du nombre de bactéries "non lysées" suite à cette étape.

2.3 RESULTATS : RECUPERATION DES BACTERIES ET EXTRACTION DE L 'ADN

Des expériences préliminaires ont montré que le taux de récupération de la fractionbactérienne est croissant en fonction du nombre de cycles de broyage-centrifugation appliqués(résultats non présentés), quel que soit le type de sédiment traité.A l'issue de ces 3 cycles de désorption, ce taux de récupération est supérieur concernant lesédiment sableux : 98.6 % par rapport à celui obtenu avec le sédiment limoneux : 79.6 %(figure V-1).Pour les deux sédiments, l'étape de concentration des bactéries s'avère très efficace, puisque99.5 % des bactéries désorbées sont concentrées par centrifugation.Le couplage lysozyme-SDS est très efficace ici, car plus de 97 % des bactéries concentréesdisparaissent. Nous considérons donc qu'elles libèrent leur ADN dans le milieu (figure V-1).Ainsi, à l'issue de ces trois étapes de pré-traitement des échantillons, l'ADN de plus de 97 et77 % des bactéries des sédiments sableux et limoneux respectivement est libéré (figure V-1).

Figure V - 1 : Rendement cumulé des étapes de pré-traitement (dénombrement

des bactéries totales par DAPI) : moyennes de triplicats et écarts-types.

100 98,6100 97,598,1

79,6 79,2 77,3

0

20

40

60

80

100

éc hantillon brut désorption désorption +

c onc entration

désorption +

c onc entration

+ ly s e

étapes de pré-traitem ents

ren

de

me

nt

(%)

Ney rieux Chalaronne


2.4 DISCUSSION

Nous savons que les limites d’utilisation des méthodes de caractérisation et d’estimation debiomasse basées sur l’analyse de l’ADN in situ ne viennent généralement pas de la méthodeanalytique elle-même, mais de la quantité de matériel contaminant qui peut être tolérée. Alorsqu'à l'époque où ce travail a été réalisé, la tendance était d'extraire directement l'ADNd'échantillons naturels (Moré et al., 1994 ; Purdy et al., 1996 ; Tsai et Olson, 1991 ; Zhou etal., 1996), nous avons choisi de revenir aux techniques un peu plus anciennes mettant enœuvre une désorption des bactéries de leur substratum avant leur lyse (Holben et al., 1988 ;Steffan et al., 1988). L’extraction préalable de la fraction bactérienne permet de s’affranchird’une partie des problèmes liés à ces contaminations et à la diversité des supports. La quantitéd'ADN ainsi récupérée est inférieure à celle obtenue par une lyse directe, mais l'ADN estmoins contaminé (Leff et al., 1995 ; Pickup, 1991).Différentes méthodes sont utilisées pour désorber les bactéries : agitation en présence ou nond’agents chimiques dispersants, ultrasonication "douce", broyage au Waring blender (pourrevue, voir Bakken et Lindahl (1995)).La comparaison de ces techniques sur sol a montré que le meilleur rendement est obtenu avecle Waring blender, et que ce procédé n’entraîne pas de lésions chez les bactéries indigènes(Lindahl et Bakken, 1995).Le broyage, effectué ici en présence de tampon phosphate, de SDS et de PVPP, à pH acide,est la méthode retenue par Steffan et al. (1988), qui ont obtenu (après 3 cycles de broyage-centrifugation) un rendement d’extraction de 32.2 % sur un sédiment beaucoup plus riche enmatière organique, limons et argiles (respectivement 6.6, 28 et 44 %) que ceux sur lesquelsnous avons travaillé. Ceci peut s'expliquer par le fait qu'une grande proportion desmicroorganismes reste attachée aux particules d’argiles, et n'est pas récupérée après broyage,même après plusieurs cycles d’extraction (Bakken, 1985).Les taux de récupération obtenus ici sont donc logiquement supérieurs à ceux mentionnés parSteffan et al. (1988) et suffisamment élevés pour se limiter à trois cycles de broyage-centrifugation ; ce nombre de cycles a été estimé correct lorsque les organismes à étudier sontprésents en au moins 104 exemplaires par gramme de sol (Holben et al., 1988). Cette densitéest cohérente avec les concentrations de bactéries nitrifiantes rencontrées dans les sédiments.La représentativité qualitative de l'extraction est d'autant meilleure que le rendementd’extraction est élevé ; pourtant, même un fort rendement présente un biais, car certainsgroupes de microorganismes sont fortement attachés au support : c’est le cas, par exemple,des bactéries méthanotrophes dans les tourbes, et des bactéries oxydant l’ammonium dans lessols argilo-terreux (Bakken et Lindahl, 1995). Ce biais est difficile à estimer pour un genreparticulier ; cependant, il est maintenant admis que Nitrobacter est généralement lié auxparticules (Bonnet et al., 1997 ; Gresikowski et al., 1996), sans toutefois connaître la force decette liaison.

Au cours de l'étape de lyse bactérienne, le couplage lysozyme-SDS permet une destructionnon sélective des cellules.Le rendement de lyse cellulaire, que nous avons utilisé comme indice de l’extraction del’ADN, est très élevé et se situe dans la même gamme que celui calculé par Steffan et al.


(1988), soit plus de 90 %. Il y a donc très peu de perte de matériel à ce niveau. De plus, lechoix d’une lyse "chimique" permet de s’affranchir en partie de la question des cassures del’ADN, qui sont beaucoup plus importantes avec des méthodes physiques tellesl’ultrasonication qui libère des petits fragments d’ADN de 500 paires de bases environ(Holben et al., 1988).

2.5 CONCLUSION

Ces pré-traitements sont donc efficaces, depuis la désorption des bactéries jusqu'à leur lyse.Si les rendements de ces pré-traitements sont élevés, il faut cependant tenir compte du faitque, dans un sédiment contenant environ 109 bactéries totales par gramme sec, un rendementde 95 % (sédiment sableux), considéré comme excellent, laisse 5.107 bactéries/g sec échapperà ces traitements ! Les membres minoritaires de la communauté bactérienne (telles lesbactéries nitrifiantes) sont donc susceptibles d'y échapper et d'être perdus pour la suite duprotocole. Afin d'évaluer la pertinence de la technique de PCR, il sera donc nécessaire d'enestimer le rendement global (depuis le traitement de l'échantillon brut jusqu'à la détection parPCR) vis à vis des nitratants du genre Nitrobacter en sédiment.


3 2EME PARTIE : DOSAGE DE L'ADN PAR FLUORIMETRIE – RENDEMENT DEPURIFICATION DE L'ADN

3.1 INTRODUCTION

La purification de l'ADN extrait de bactéries de l'environnement est un préalableindispensable à son amplification par PCR (Porteous et al., 1997 ; Tsai et Olson, 1992a ;Wilson, 1997). Parmi les différentes techniques de purification de l'ADN disponibles, notrechoix s'est porté sur la colonne échangeuse d'ions Elutip-d®, simple à mettre en œuvre, etayant fourni des rendements de purification et de récupération de l'ADN satisfaisants (Picardet al., 1992 ; Tsai et Olson, 1991). Néanmoins, dans nos échantillons, cette étape depurification semble être à l'origine d'une perte d'ADN non négligeable (Féray, 1996 ; Bonnet,données non publiées). Afin de quantifier cette perte, nous avons choisi d'utiliser une méthodede dosage de l'ADN par fluorimétrie. Cette méthode utilise le DAPI (4’,6-diamidino-2-phenylindole), qui réagit avec l’ADN pour former un complexe fluorescent, notammentlorsque se succèdent plusieurs paires de bases A-T en continu (ce complexe ne se forme pasavec l’ARN). La meilleure intensité de fluorescence a été obtenue pour un rapportADN/DAPI > 100 nucléotides/1 molécule de DAPI (Kapuscinski et Skoczylas, 1977). Laconcentration de DAPI à utiliser dépend donc de celle de la solution d’ADN à doser.

L'objectif de cette deuxième partie est donc double :- d'une part, définir un protocole de dosage de l’ADN dans 2 gammes de

concentrations (que nous sommes susceptibles de rencontrer dans les échantillons d'ADNextrait de sédiment) : 0 - 100 ng/ml et 0 - 1000 ng/ml. Pour cela, il faut au préalabledéterminer la concentration de DAPI à utiliser, puis effectuer des gammes étalons. Cesgammes seront établies en triplicats, de façon à tester si les valeurs obtenues en fluorescencesont très dispersées ou relativement proches pour une même concentration en ADN, c’est àdire pour savoir si une gamme est fiable ou non.Par ailleurs, ces gammes étalons seront réalisées à l’aide de différents tampons de dilution del’ADN, de manière à voir si des composés autres que l’ADN peuvent provoquer unefluorescence parasite ou absorber de la fluorescence (les tampons testés sont ceux utilisés lorsde la purification de l’ADN sur colonne Elutip-d).

- d'autre part, déterminer un rendement de récupération de l’ADN lors de l’étape depurification sur colonne Elutip-d. Après le dépôt d’ADN en concentration initiale connue surla colonne, sa présence sera recherchée, et sa concentration déterminée (à l’aide des gammesétalons précédemment établies) dans les différentes fractions recueillies lors du protocole depurification.



3.2.1 Dosage de l'ADN par fluorimétrie

3.2.1.1 Mises au point préliminaires

Le complexe DAPI-ADN est utilisé pour une estimation quantitative de l'ADN, au moyend'une mesure de la fluorescence émise par ce composé.A la solution d'ADN est ajouté du DAPI (solution stock : 1 mg/100 ml), de manière à obtenirune concentration finale de 0.2 µg/ml (Kapuscinski et Stoczylas, 1977). Des essaispréliminaires avec des concentrations de 0.02, 0.20 et 2.00 µg/ml ont confirmé cette valeurcomme étant celle présentant le moins de variabilité d’intensité de fluorescence. Leséchantillons sont déposés en microplaques Falcon 96 puits stériles et la mesure de laformation du complexe fluorescent s'effectue à l'aide d'un fluorimètre (CytoFluor 2300), auxlongueurs d'onde 360 et 460 nm, représentant respectivement les maxima d'excitation etd'émission.La fluorescence émise est considérée proportionnelle à la concentration d'ADN(proportionnalité dans certaines gammes de concentration seulement (Kapuscinski etSkoczylas, 1977). La concentration d'ADN est calculée par référence à une gamme étalonétablie avec de l'ADN de thymus de veau dilué dans le milieu adapté (eau ou tampon).

3.2.1.2 Gammes étalons

Les gammes d'ADN de thymus de veau sont établies à partir de la moyenne de triplicats pourchaque concentration en ADN et pour chaque milieu de dilution utilisé : tampon d'extraction(cf § 2.2.2), tampon d'extraction préparé avec de l’eau de Saône, tampons "Low Salt" (0.2 MNaCl, 20 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH 7.4) et "High Salt" (1.0 M NaCl, 20 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, pH 7.4) utilisés dans le protocole d'utilisation des colonnes Elutip-d®

pour la purification de l'ADN (cf § 2.2.2), eau de Saône.

3.2.2 Purification de l'ADN

3.2.2.1 Utilisation des colonnes Elutip-d

L’objectif est d’éliminer une grande partie des composés phénoliques et protéiquessusceptibles d’interférer avec l’amplification de l’ADN par PCR.

L'ADN est purifié sur colonne Elutip-d

(Schleicher & Schull), selon le protocole indiqué par

le fabriquant.L'ADN purifié est précipité avec de l'éthanol absolu, à 4°C, et laissé 1 heure à 4°C, avant unecentrifugation (1 heure, 22000 g, 4°C). Le culot d'ADN est enfin lavé à l'éthanol à 70°.


3.2.2.2 Rendement de récupération de l'ADN après purification

L’ADN est dosé dans chacune des fractions recueillies lors du protocole de purification, aussibien dans les fractions éliminées que dans les éluats sensés contenir de l’ADN. Aux valeursde fluorescence sont ôtées celles obtenues pour les fractions correspondantes après passagesur colonne Elutip des tampons sans ADN (à chaque fraction correspond son "blanc", savaleur témoin). En effet, les valeurs de fluorescence pour ces "blancs" après passage surcolonne sont différentes de celles obtenues sans ce passage sur colonne. Les colonnessemblent donc relarguer des substances qui interfèrent avec le dosage fluorimétrique del’ADN en provoquant une fluorescence parasite (la composition des colonnes n'est pasprécisée par le fabricant). Ces substances provoquent une augmentation de fluorescencevariable, atteignant plus de 20 % de la fluorescence réellement due à l’échantillon (calculseffectués avec différents milieux de dilution de l’ADN).Il est donc impératif de réaliser des "blancs" (sans ADN) avec chacun des milieux de dilutionde l’ADN, en effectuant le protocole complet de purification, et en mesurant l’intensité de lafluorescence dans les fractions recueillies lors des différentes étapes de ce protocole, pourprendre en compte cet "effet colonne".

3.3 RESULTATS

3.3.1 Etablissement de gammes étalons dans différents tampons

Gamme 0-100 ng/ml :Dans cette gamme de concentrations en ADN, les valeurs de fluorescence sont très disperséesautour de la moyenne pour une même concentration d’ADN. Les valeurs de fluorescence nesont absolument pas linéaires pour des concentrations croissantes en ADN ; la plupart desvaleurs sont même en dessous de la valeur zéro ("blanc").Aucune gamme étalon fiable n’a donc pu être établie pour de telles concentrations.

Gamme 0-1000 ng/ml :Les valeurs de fluorescence sont ici croissantes et linéaires pour des concentrations d’ADNcroissantes. Elles sont plus ou moins linéaires selon le tampon de dilution de l’ADN utilisé(R2 varie de 0.9841 à 0.8809).Pour une même concentration en ADN, la dispersion des valeurs de fluorescence autour de lamoyenne (triplicat pour chaque point) est plus ou moins grande selon le tampon utilisé, etcette dispersion varie également entre les points d’une même gamme, le cas extrême étantcelui de la dilution d'ADN dans de l'eau de Saône (figure V-2).


Figure V - 2 : Dosage de l'ADN : Gammes étalons dans différents milieux, pour des concentrations

d'ADN de thymus de veau variant de 0 à 1000 ng/ml (moyennes de triplicats ± écats-types).

3.3.2 Rendement de récupération de l'ADN lors de sa purification sur colonneElutip-d

Le rendement varie selon le milieu dans lequel est dilué l’ADN au départ (tableau V-2).Pour un même milieu, la purification d’une même quantité d’ADN a été réalisée en triplicat.Les rendements de récupération obtenus sont peu dispersés autour de la moyenne, ce quisignifie que, pour un même milieu, un même type et une même concentration d’ADN, dansles mêmes conditions de purification, l’ADN est retenu par la colonne en proportions trèsvoisines d’un essai à un autre. On note cependant une dispersion un peu plus élevée dans lecas d’ADN dilué dans de l’eau de Saône.

Tableau V - 2 : Rendements de récupération de l'ADN lors de sa purification sur colonne Elutip-d�.

taux de récupération de l’ADN(%)milieu de

dilution del’ADN

concentrationd’ADN avantpurification

(ng/ml)

concentrationd’ADN aprèspurification

(ng/ml)moyenne de

triplicat écart-typecoefficient de

variation

tampond'extraction

1380574639626

44.4 2.5 5.6

tampond'extraction

"Saône"850

104210861115

127.2 4.3 3.4

eau de Saône 889414253298

36.2 9.4 26.0

ta m po n d'e x tra ctio n

y = 0,0694x + 7,2207

R2 = 0,9841

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

[A D N] (ng/m l)

fluo

res

ce

nc

e (

u.f

.)

ta m po n d'e x tra ctio n "S a ôn e " (1)

y = 0,1634x - 13,531

R2 = 0,9765

0

40

80

120

160

200

0 200 400 600 800 1000

[A D N] (ng/m l)

fluo

res

ce

nc

e (

u.f

.)

ta m po n d'e x tra ctio n "S a ôn e " (2)

y = 0,0579x - 0,3141

R2 = 0,9381

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

[A D N] (ng/m l)

fluo

res

ce

nc

e (

u.f

.)

ta m po n "L ow S a l t"

y = 0,0684x + 0,5881

R2 = 0,9689

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

[A D N] (ng/m l)

fluo

res

ce

nc

e (

u.f

.)

ta m po n "Hig h S a l t"

y = 0,0571x - 0,5019

R2 = 0,9451

0

20

40

60

80

100

0 200 400 600 800 1000

[A D N] (ng/m l)

fluo

res

ce

nc

e (

u.f

.)

e a u de S a ô ne

y = 0,1649x + 5,4668

R2 = 0,8809

0

40

80

120

160

200

0 200 400 600 800 1000

[A D N] (ng/m l)

fluo

res

ce

nc

e (

u.f

.)


3.4 DISCUSSION

3.4.1 Dosage de l'ADN

La méthode classiquement utilisée pour le dosage de l’ADN et l'évaluation de sa pureté est laspectrophotométrie (annexe 9) (Holben et al., 1988 ; Steffan et al., 1988 ; Torsvik, 1980). Lalongueur d’onde 260 nm utilisée pour doser l'ADN correspond également au domained’absorbance d’autres molécules (Torsvik, 1980). Si elle est efficace en culture pure, cetteméthode le devient donc beaucoup moins en milieu complexe où une multitude de composéspeut interférer avec le dosage. De plus, l’évaluation de la pureté de l’ADN est très subjective,car certains composés de l'environnement n’absorbent pas à une longueur d’onde spécifique,mais possèdent un domaine d’absorption très large. C’est le cas en particulier des composéshumiques, que l’on trouve en abondance dans les sédiments, et de composéspolyhydroxyaromatiques.Nous avons tenté d'estimer l'efficacité de la purification sur colonne Elutip-d®, ainsi que laperte d'ADN au cours de cette étape à l'aide de dosages spectrophotométriques. Les faiblesquantités d'ADN présentes en sédiments et le manque de sensibilité de la méthode employéepour les dosages, n'ont pas permis de réaliser des mesures significatives des taux derécupération et de purification de l'ADN extrait du sédiment.Le dosage de l’ADN par fluorimétrie est une alternative intéressante, car le fluorochromemarque spécifiquement l’ADN en s’intercalant préférentiellement au niveau des paires A-T.Le risque d’interférence avec la mesure est donc moindre, si ce n’est que l’intensité de lafluorescence décroît lorsqu’il s’agit d’ADN endommagé (Kapuscinski et Skoczylas, 1977).En revanche, des mises au point préliminaires étaient nécessaires, notamment concernant laconcentration de DAPI à utiliser.

La concentration optimale de DAPI déterminée ici (0.20 µg/ml) correspond à celle utilisée parKapuscinski et Skoczylas (1977), pour des concentrations d'ADN de 50 à 1000 ng/ml(Johnson (1994) mentionne 0.1 µg/ml pour des concentrations d'ADN du même ordre).Il est important de déterminer avec soin cette concentration optimale de DAPI, celle-ci étanttrès liée à la gamme de concentration de l'ADN à doser, car le DAPI non lié possède unegrande autofluorescence (Paul et Myers, 1982) qui peut se traduire par des "blancs" élevés.

Gamme 0 - 100 ng/ml :Il y a trop de variabilité dans la fluorescence mesurée pour pouvoir établir une gamme étalon.Ceci peut être dû : - soit à la sensibilité de lecture du fluorimètre

- soit aux variations dans les concentrations d’ADN dues aux erreurs depipetage : faibles volumes et mauvaise homogénéisation de la solution d’ADN avant pipetage(compromis entre mélanger suffisamment pour homogénéiser l’échantillon, et pas trop pourne pas casser l’ADN).


Gamme 0 - 1000 ng/ml :La linéarité de l’intensité de fluorescence pour des concentrations croissantes en ADN permetd’utiliser les gammes ainsi établies pour un dosage de l’ADN.Cependant, pour une concentration d’ADN donnée, l’intensité de fluorescence diffère selon letampon de dilution utilisé. Pour chaque dosage, il est donc nécessaire d’établir une gammeétalon avec de l’ADN dilué dans le tampon dans lequel la présence et la quantité d’ADNseront recherchées ; cette gamme doit être réalisée à l’aide de dosages en triplicats auminimum, car la variabilité dans la fluorescence émise pour une même concentration d’ADNest plus ou moins grande.De plus, selon le milieu de dilution, plusieurs facteurs sont susceptibles d’influencerl’intensité de la fluorescence (Kapuscinski et Skoczylas, 1977) :

- la concentration saline : une augmentation des forces ioniques entraîne une diminutionde la fluorescence des complexes ADN-DAPI ; par exemple la présence d’ions Mg2+

provoque une forte baisse de fluorescence. Cependant, la fluorescence augmentesignificativement en présence d’ions Cl-.

- la structure de l’ADN : l’intensité de la fluorescence est la plus importante lorsque leDAPI est complexé avec de l’ADN natif "hautement polymérisé", et diminue quand il estcomplexé avec de l’ADN dégradé ou dénaturé.

- le pH : l’intensité de la fluorescence du complexe ADN-DAPI n’est pas affectée par desvariations de pH dans une gamme de 5.0 à 10.0. Néanmoins, des tampons à pH 7.0 donnentune meilleure précision.Par ailleurs, l’utilisation d’ADN de thymus de veau (très fréquemment utilisé commestandard) pour établir les gammes étalons de dosage de l’ADN d’une espèce différente peutêtre la cause d’un biais dans la mesure. En effet, le DAPI est un fluorochrome ayant uneaffinité particulière pour les paires de bases A-T. Pour une même concentration d’ADN,l’intensité de fluorescence sera plus ou moins élevée selon la proportion de bases A-T.L’ADN de thymus de veau contient 50 mol% de paires A-T (McCoy et Olson, 1985). L’ADNde Nitrobacter en contient 38 à 40 % selon les espèces (Watson et al., 1989). La quantitéd’ADN de Nitrobacter déterminée par cette méthode peut donc être de ce fait légèrementsous-estimée. Faute de disposer d'une quantité suffisante d'ADN pur de Nitrobacter, nousn'avons pas pu réaliser des essais de quantification de la perte de notre ADN cible causée parla purification.

3.4.2 Rendement de récupération de l'ADN lors de sa purification sur colonneElutip-d®

Le rendement de récupération de l'ADN lors de sa purification sur colonne Elutip-d® estsupérieur à 90 % selon le fabricant. Mais la présence de détergent (ici le SDS (cf protocole depré-traitement des échantillons)) peut interférer avec l'adsorption des acides nucléiques sur lacolonne.

Les rendements de récupération de l’ADN obtenus sur nos échantillons sont différents deceux mentionnés par la littérature : supérieur à 95 % lorsqu'il s'agit de petits fragments d'ADN


(100 à 500 pb) selon Picard et al. (1992), 60 % selon Tsai et Olson (1991). Nos résultats sontpeu variables pour un même type d’échantillon, et pour des expérimentations réalisées lemême jour, mais présentent une grande variabilité entre les différents milieux de dilution del’ADN utilisés.La valeur de 127.2 % obtenue avec l’ADN dilué dans le tampon d'extraction préparé avec del’eau de Saône est inexpliquée, la fluorescence parasite due à l’"effet colonne" ayant étésoustraite aux valeurs mesurées.

Les taux de récupération d'ADN que nous avons déterminés par la technique de fluorimétriesont faibles, et inférieurs aux 60 % obtenus par Tsai et Olson (1991) sur sol et sédiment, par lamême méthode de purification. Ces faibles taux peuvent s’expliquer en partie par le fait que lerendement de récupération de l’ADN après purification sur une colonne Elutip-d® diminuefortement lorsque de l’ADN de grande taille est élué (Picard et al., 1992), ou lorsque desmatériaux humiques interfèrent avec l’adsorption de l’ADN sur la colonne de purification (casde l'ADN extrait des sédiments) (Zhou et al., 1996).

3.5 CONCLUSION

Une grande quantité de matériel est perdue lors de la purification de l'ADN. L'estimation decette perte est délicate, par manque de méthode fiable et sensible de dosage de l'ADN enmilieu complexe. La technique plus récente de dosage de l'ADN par densitométrie sur geld'électrophorèse, à l'aide d'un analyseur d'image, pourrait aujourd'hui être une alternativeintéressante.Le rendement de récupération de l'ADN après purification sur colonne Elutip-d® est moinssatisfaisant que dans la littérature. Il existe d'autres méthodes de purification de l'ADN, parmilesquelles : les colonnes de Sephadex G-200 (Tsai et Olson, 1992b), différents types de mini-colonnes échangeuses d'ions (Tebbe et Vahjen, 1993 ; Zhou et al., 1996), la séparation parélectrophorèse sur gel d'agarose (Zhou et al., 1996) ou par gradient de chlorure de césium(Bruce et al., 1992 ; Lovell et Piceno, 1994)… Cependant, la purification sur colonneElutip-d® est une méthode facilement utilisable au laboratoire, ne nécessitant pas de matérielspécifique et applicable à des études en routine. Par ailleurs, nous ne pouvons pas nousaffranchir de cette étape, sans laquelle la présence de contaminants en quantité importanteinhibe toute réaction de polymérisation de l'ADN par PCR (Nejidat et Abeliovich, 1994 ;Wilson, 1997).


4 3EME PARTIE : RENDEMENT GLOBAL DE LA METHODE MPN-PCR –COMPARAISON AVEC LES METHODES MPN-GRIESS ETIMMUNOFLUORESCENCE

4.1 INTRODUCTION

La détection de Nitrobacter par MPN-PCR, après les pré-traitements précédemment évoqués,a été obtenue en sédiment et en boue de station d'épuration.L'objectif de cette troisième partie est de valider cette méthode de dénombrement deNitrobacter en milieu aquatique.Nous avons choisi, dans un premier temps, de travailler essentiellement sur du sédiment, sièged'une part importante de la nitrification en eau douce (Admiraal et Botermans, 1989 ;Gresikowski et al., 1996), pour déterminer :

- le seuil de détection de la méthode- le rendement global de la méthode- la reproductibilité de la méthode (variabilité sur des triplicats)

Afin de répondre à ces questions, nous procèderons par inoculation d'une souche deNitrobacter, en concentration connue, dans un sédiment oligotrophe "de référence".La souche Nitrobacter X14 (correspondant à l'espèce Nitrobacter hamburgensis) sera iciutilisée comme modèle, car elle est relativement ubiquiste en milieu aquatique (Montuelle etal., 1996), et assez facilement cultivable (en raison de son caractère mixotrophe).

En parallèle, une comparaison avec des dénombrements de Nitrobacter par MPN-Griess etpar immunofluorescence sera effectuée.


4.2.1 Dénombrement de Nitrobacter par MPN-PCR

Suite aux pré-traitements des échantillons de sédiment, un protocole d'amplification d'uneséquence spécifique et unique de l'ADNr 16S de Nitrobacter, par PCR de type "booster", estappliqué à l’ADN purifié.

Amplification de l’ADN :

Les oligonucléotides amorces sont les suivants : 5’ TTTTTTGAGATTTGCTAG 3’(FGPS1269’) et 5’ CTAAAACTCAAAGGAATTGA 3’ (FGPS872) (synthèse : Eurogentec,Belgique). La spécificité des amorces a été vérifiée sur les voisins phylogénétiques deNitrobacter (Degrange et Bardin, 1995).


Le protocole suivi est adapté de celui proposé par Degrange et Bardin (1995) :Un microlitre de chaque dilution d’ADN est ajouté à la solution d’amplification, composée,pour chacun des tubes Eppendorf de 0.5 ml, de la manière suivante :

- 5 µl de tampon d’amplification 10X (Tris-HCl 200 mM pH 8.4, KCl 500 mM)(Gibco BRL)

- 1.5 µl MgCl2 50 mM (Gibco BRL)- 2.5 µl 1 % W-1 (Gibco BRL)- 5 µl de mélange des 4 désoxynucléosides triphosphate (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)à la concentration 200 µM (Ultrapure dNTP Set - Pharmacia)- 5 µl de chacune des 2 amorces à la concentration 5.10-3 µM- 0.5 µl de Taq polymérase soit 2.5 U (Gibco BRL)- H2O ultra pure q.s.p. 50 µl

L’amplification, de type "booster", est programmée sur un thermocycleur (CETUS-PerkinElmer 9600) comme suit : pré-dénaturation (3 min à 95°C), 10 cycles de dénaturation (45 s à95 °C) - hybridation (30 s à 50°C) - élongation (1 min à 72°C), et une élongation finale (3 minà 72°C). 2.5 µl de chacune des 2 amorces à la dilution 10 µM sont alors ajoutés à chaque tubeet 60 cycles de dénaturation-hybridation-élongation, suivis d’une élongation finale, sontlancés.

Révélation :

La présence d’ADN est vérifiée préalablement à l’amplification par une électrophorèse sur ungel d’agarose à 0.8 % dans du tampon TBE 1X (Tris-borate 89 mM, acide borique 89 mM, 2mM EDTA, pH 8) révélée sous une lumière U.V. après incubation dans une solution debromure d’éthidium (0.4 mg/l). La présence de séquences amplifiées est visualisée de lamême façon, sous forme d'une bande spécifique, sur un gel d’agarose à 2 %.

Détermination du MPN :

Des dilutions sérielles d'ADN, au 1/10ème, établies en triplicats, subissent un traitementd'amplification. Les amplifiats de PCR sont déposés sur gel d'électrophorèse ; pour chaquedilution, le nombre de signaux d'amplification (0, 1, 2 ou 3 parmi les 3 amplifiats déposés) estnoté et constitue le nombre caractéristique. Le nombre de séquences cibles par grammed'échantillon est déterminé à l'aide de la table de Cochran (Cochran, 1950). Sachant queNitrobacter possède un seul opéron ribosomique, et donc une seule séquence cible par cellule,la densité de Nitrobacter dans l'échantillon de sédiment initial peut être déduite.Un témoin positif de PCR est constitué d'ADN extrait d'une culture pure de Nitrobacter(Degrange et Bardin, 1995). (principe du MPN-PCR en annexe 10)

4.2.2 Dénombrement de Nitrobacter par MPN-Griess

Cette technique vise à déterminer le nombre total de bactéries nitratantes viables et activesdans un échantillon complexe. Le genre Nitrobacter étant, dans notre cas (inoculation d'uneculture pure), donné comme dominant parmi ces germes, le nombre calculé est considéré


comme représentatif de ce genre. Après incubation de triplicats (16) de suspensions-dilutionsd’un échantillon dans un milieu électif liquide contenant de l’azote sous la forme nitrite,l’activité, et donc la présence, des bactéries nitratantes est détectée par décoloration du réactifde Griess rose en incolore (correspondant à la disparition du nitrite). L’abondance du genreNitrobacter est estimée par la lecture de la dilution la plus élevée pour laquelle le nitrite a étéconsommé, le nombre le plus probable étant donné par la table de Cochran (Cochran, 1950).Le protocole est adapté de celui de Schmidt et Belser (1994).Le milieu autotrophe utilisé est celui de Bock et al. (1983) dans lequel la concentration enNaNO2 est modifiée : 5.0 mM.L’incubation se fait en microplaques (Falcon, 24 puits) et dure 15 semaines (Montuelle et al.,1996). Des lectures sont effectuées toutes les deux semaines dès la 5ème semaine pour s'assurerque l'activité est stabilisée lors de la lecture finale.Un test ("spot test") à la diphénylamine (2 mg diphénylamine.ml-1 H2SO4 concentré, révélantla présence de NO3

-) dans les puits positifs permet de s'assurer que le NO2- disparu a bien été

transformé en NO3- et non dénitrifié.

4.2.3 Dénombrement de Nitrobacter par immunofluorescence indirecte

Le but est de marquer exclusivement certains sérotypes du genre Nitrobacter.La méthode, bien connue, a été décrite par ailleurs (Fliermans et al., 1974 ; Gay, 1983 ;Josserand, 1983) (principe en annexe 6).Deux techniques sont proposées : sur lame et sur filtre. La méthode sur filtre a été retenue. Leprotocole est décrit dans le chapitre IV (§ 3.1.3.1). Seul le sérum correspondant au sérotypeX14 du genre Nitrobacter a été utilisé ici.

4.2.4 Rendement et seuil de détection des méthodes MPN-PCR, MPN-Griess etimmunofluorescence

À partir de sédiment inoculé avec différentes concentrations de bactéries du genreNitrobacter, les 3 techniques de numération de Nitrobacter (MPN-PCR, MPN-Griess etimmunofluorescence) sont appliquées en triplicats (figure V-3).

(16) Nous avons limité le nombre de répétitions à 3 pour le MPN-Griess de façon à garder la même précisionstatistique que dans le cas de la technique de MPN-PCR.


Figure V - 3 : Traitement du sédiment pour la détermination des seuils de détection

et rendements des trois méthodes de dénombrement de Nitrobacter.

4.2.4.1 Inoculation du sédiment

Le sédiment utilisé provient de la rivière Le Neyrieux (Ain). Ce sédiment a été retenu car ilcontient peu de nitrifiants intrinsèquement et n'est pas toxique (études préalables).Une culture pure de Nitrobacter hamburgensis X14 en phase exponentielle de croissance estcentrifugée à 22000 g pendant 30 minutes, et le culot de bactéries est lavé 3 fois avec dutampon phosphate stérile (2 mM, pH 7.3). Les densités d’inoculum sont ajustées optiquementà 580 nm et affinées par un dénombrement au DAPI. Le volume d’inoculum est de 400 µl pargramme de sédiment sec.

4.2.4.2 Calculs des rendements et seuils de détection

Le rendement global (nombre de bactéries détectées par rapport au nombre de bactériesinoculées) et seuil de détection des méthodes MPN-PCR, MPN-Griess et IF ont étédéterminés avec le sédiment du Neyrieux inoculé avec Nitrobacter sérotype X14, à différentesconcentrations (103 à 5×106 Nitrobacter/g sédiment sec pour les techniques MPN-Griess etimmunofluorescence, et 104 à 7×107 Nitrobacter/g sédiment sec pour la technique MPN-PCR), et avec le sédiment non inoculé (témoin).Aucune stérilisation du sédiment n’a été réalisée, pour éviter la destruction de la structure etles possibles modifications de composés potentiellement inhibiteurs de la PCR.Les 3 techniques ont été testées en triplicat pour chaque niveau d’inoculation.

10 g de sédiment 10 g de sédiment 10 g de sédiment 10 g de sédiment

témoin+

107 X14 / g sec+

106 X14 / g sec+

105 X14 / g sec

incubation une nuit à 28°C

sédiment naturel

3 × 1 g 3 × 1 g 3 × 1 g

MPN-PCR

× 3

MPN-Griess

× 3

immunofluorescence

× 3


4.3 RESULTATS

4.3.1 Rendement global et seuil de détection de chaque technique

4.3.1.1 MPN-PCR

Des produits d’amplification de l’ADN ont été systématiquement obtenus avec le sédimentfortement inoculé (7.13×107 Nb/g séd sec) (figure V-4). Dans les sédiments plus faiblementinoculés, la détection de Nitrobacter n’a eu lieu qu’une seule fois sur 6 essais. Le seuil dedétection de Nitrobacter par cette technique est donc très élevé. Le rendement de détectionpar rapport à la quantité inoculée est très faible : seulement 0.7 % dans le cas d’une forteinoculation.

Figure V - 4 : Détection de Nitrobacter par MPN-PCR (gel d'électrophorèse).

1 : échelle 1 kb2 : témoin négatif sans ADN3 : témoin positif avec ADN pur de N. hamburgensis4-18 : amplification de l'ADN extrait du sédiment fortement inoculé, dilutions au 1/10e (10-1 à 10-5),3 replicats par dilution.

Les rendements obtenus avec notre protocole étant relativement faibles et le seuil de détectionélevé (tableau V-3), nous avons testé, sur notre sédiment fortement inoculé (≈ 107 Nb/g sec),un second protocole d’extraction et de purification de l’ADN utilisant une extraction parcryobroyage et un autre kit de purification de l’ADN (DNeasyTM, QIAGEN). Aucuneamélioration du rendement ou abaissement du seuil de détection n'ont été obtenus par cettetechnique (annexe 11).

397 pb →

10-1 10-3 10-4 10-5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1810-2


Tableau V - 3 : Dénombrement de Nitrobacter par les 3 techniques dans le sédiment du Neyrieux

inoculé. Le rendement est déterminé par le rapport entre la quantité de Nitrobacter détectée et celle

inoculée. Le temps d’incubation pour la technique MPN-Griess est de 15 semaines.

inoculation(Nb/g séd. sec)

détectionrendement

(%)nombre de

détections/nombred’essais

moyenne(Nb/g séd. sec)

± EcT

coefficient devariation (%)

MPN-PCR0 (témoin) 0/3 0

± 0

1.43×104 1/3 1.63×101

± 2.83×101173.2 0.1

1.09×105 0/3 0± 0

0.0 0.0

7.13×107 3/3 4.88×105

± 4.57×10593.6 0.7

MPN-Griess0 (témoin) 0/3 0

± 0

1.09×103 2/3 2.03×102

± 1.76×10286.7 18.6

1.07×104 3/3 1.17×103

± 7.69×10265.7 10.9

1.09×105 3/3 1.36×104

± 6.11×10344.9 12.5

1.08×106 3/3 8.31×104

± 8.61×104103.6 7.7

5.36×106 3/3 1.64×105

± 1.30×10579.3 3.1

Immunofluorescence0 (témoin) 0/3 0

± 0

1.07×104 colmatage des filtres

1.09×105 3/3 2.28×104

± 2.5×10311.0 20.9

1.08×106 3/3 1.24×105

± 2.0×10416.1 11.5

5.36×106 3/3 1.14×106

± 2.82×10524.7 21.3


4.3.1.2 MPN-Griess

• Évaluation de la techniqueLe seuil de détection par cette technique est inférieur ou égal à 103 Nitrobacter/g séd sec(niveau d’inoculation le plus faible dans notre travail) (tableau V-3). Cependant, plusl’inoculum est faible, plus la détection est tardive au cours de l’incubation : jusqu’à 7semaines pour le sédiment inoculé avec 103 Nitrobacter/g séd sec (figure V-5). Globalement,le rendement bactéries détectées/bactéries inoculées dépend de la durée de l’incubation et dela concentration de l’inoculum : il est corrélé négativement avec le niveau d’inoculation (3.1 à18.6 %). Quelle que soit la concentration de l’inoculum, la variabilité est élevée (44.9 à103.6 %) (tableau V-3).

• Détermination de la durée d’incubation nécessaire pour la technique MPN-GriessLe nombre de bactéries nitratantes détectées augmente fortement pendant les 9 premièressemaines d’incubation, puis ne gagne au maximum, selon l’inoculum initial, qu’une unité logentre la 9ème et la 15ème semaine, alors que la variabilité augmente. Après 15 semainesd’incubation, les barres d’erreur se chevauchent, alors qu’entre 9 et 11 semaines, il est encorepossible de discriminer quantitativement les différents niveaux d’inoculation (figure V-5).

Figure V - 5 : Évolution du nombre de bactéries nitratantes détectées avec la

méthode MPN-Griess au cours du temps d'incubation. Chaque point

représente une moyenne de triplicat. Les écarts-types sont figurés.

4.3.1.3 Immunofluorescence

Cette méthode a fourni le rendement de détection le plus élevé (11.5 à 21.3 %) et lescoefficients de variation les plus faibles (<25 %). Le seuil de détection est cependantrelativement élevé (105 Nitrobacter/g sédiment sec) (tableau V-3).

1,0E+ 00

1,0E+ 01

1,0E+ 02

1,0E+ 03

1,0E+ 04

1,0E+ 05

1,0E+ 06

5 7 9 11 13 15

durée d'incubation (sem aines )

ba

cté

rie

s n

itra

tan

tes

dé

tec

tée

s

(no

mb

re/g

sé

d.

se

c)

5,36 E+06

1,08 E+06

1,09 E+05

1,07 E+04

1,09 E+03

inoculum

(bact./g séd. sec) :


4.4 DISCUSSION

4.4.1 Évaluation de la méthode MPN-PCR

En résumé, depuis le début du protocole, nous avons obtenu :- des rendements de désorption des bactéries et d'extraction de l'ADN satisfaisants

(cf partie 1)- une perte non négligeable de matériel lors de l'étape de purification de l'ADN

(cf partie 2).- un très faible rendement de détection de Nitrobacter par la technique globale, associé

à un seuil de détection élevé, ce qui traduit notamment un faible rendement pour l'étape dePCR.Or, le protocole de PCR, ainsi que les amorces utilisées, sont ceux employés par Degrange etBardin (1995) qui obtiennent, après amplification d'ADN directement extrait d'un sol, unrendement supérieur à 60 %, et un seuil de détection de 102 Nitrobacter/g de sol. Outre uneperte de matériel lors des étapes de pré-traitements (à priori, essentiellement au niveau de lapurification et de la précipitation de l'ADN), il semble donc que l'environnement "sédiment"présente des interactions avec la PCR et que la réaction d'amplification de l'ADN ne soit pasoptimale, malgré l'application d'un protocole de "booster", méthode biphasique au cours delaquelle les amorces sont d'abord fortement diluées pendant 10 cycles pour éviter la formationde dimères d'amorces, puis plus concentrées pour les 60 cycles suivants, lorsque la réactionest bien entamée (Ruano et al., 1989).Des substances inhibitrices présentes dans le sédiment (composés humiques entre autres), quisubsistent après la purification de l'ADN, peuvent être la cause du faible rendement de la PCR(Tebbe et Vahjen, 1993 ; Tsai et Olson, 1992a et 1992b ; Wilson, 1997). L'ADN a égalementpu être abîmé lors de l'extraction, et l'ADN endommagé n'est pas amplifié par PCR (Sykes etal., 1992).

) Dans le cas de l'utilisation de la PCR pour quantifier le genre Nitrobacter en sédiment, lesprotocoles de purification-précipitation et d'amplification de l'ADN sont donc à améliorer.

L'utilisation de techniques moléculaires nécessite des adaptations pour chaque milieu exploré.Ainsi, par exemple, Malhautier et al. (1998) travaillant sur les populations de Nitrobacterdans des colonnes de charbon actif et de tourbe, ont modifié le protocole de Degrange etBardin (1995) de façon à séparer la biomasse du support de charbon actif avant l'extraction del'ADN, car ces matériaux sont très adsorbants. Néanmoins, le rendement global de détectionde Nitrobacter par la méthode de désorption des bactéries, extraction, purification etamplification de l'ADN est très faible par rapport à un dénombrement parimmunofluorescence. Les étapes limitantes seraient dans ce cas la désorption des bactéries deleur substratum et la purification de l'ADN sur colonne Elutip-d®.

Dans certains cas, c'est la technique d'amplification de l'ADN elle-même qui est à adapter.Lorsque la PCR "directe" ne permet pas de détecter les microorganismes cibles, certains


auteurs proposent de procéder à une PCR en deux étapes ("nested" PCR) (Deni et Penninckx,1996 ; Voytek et Ward, 1995) : une séquence plus longue que la séquence cible est d'abordamplifiée à l'aide d'amorces universelles, puis le produit de cette première amplification subitun deuxième cycle de PCR en présence d'amorces spécifiques de la cible qui est incluse dansle premier amplifiat. En utilisant cette technique, qui diminue la proportion d'ADN compétitif(non cible) par rapport à l'ADN cible, Deni et Penninckx (1996) ont obtenu la détection deNitrobacter en sol. Plus récemment, Berthe et al. (1999) ont utilisé une technique de PCRcompétitive (amplification en présence d'un ADN compétiteur utilisé pour établir une gammeinterne d'amplification) pour détecter et quantifier les Nitrobacter (de l'ordre de 106/litre)associés aux particules en suspension dans l'estuaire de la Seine.

) La méthode PCR s'avère être un outil de détection, voire de quantification, apportant uneréponse rapide, si la quantité de Nitrobacter est importante, mais pas pour des quantités"naturellement" présentes dans la plupart des environnements aquatiques.

Par contre, elle permet la détection et l'estimation rapide de la quantité de Nitrobacter enstation d'épuration, où les quantités sont supérieures à celles rencontrées en sédiment. De telsessais ont d'ailleurs déjà été réalisés avec succès en utilisant le protocole établi en sédimentsur de la biomasse de station d'épuration (résultats non présentés).Cependant, si la PCR offre l'avantage d'apporter une réponse rapide (quelques jours comparésà quelques semaines pour le MPN-Griess), elle présente aussi l'inconvénient d'être lourde etonéreuse à mettre en œuvre. Elle est donc davantage un moyen de vérification ponctuellequ'un outil de routine, qui nécessiterait de pouvoir multiplier les échantillons pour des étudesin situ.

4.4.2 Quelle(s) méthode(s) pour des études in situ ?

Le principe de chacune des 3 méthodes (PCR, IF et Griess) repose sur un niveau différent dela diversité de la communauté nitratante :

- type sérologique (sérotype), pour l'immunofluorescence- genre pour la PCR (dans le cas présent)- communauté nitratante autotrophe globale (fraction rendue active) pour le MPN-

Griess.Ces 3 méthodes procurent donc des informations différentes sur la structure de lacommunauté. La méthode PCR semble la mieux adaptée pour ce que l'on rechercheinitialement : quantifier le genre Nitrobacter, mais nous avons montré que des mises au pointsont nécessaires pour affiner la méthode avant de la considérer comme un outil fiable dedénombrement.


) Qu'en est-il des méthodes plus classiques (MPN-Griess et immunofluorescence ) ?

• MPN-Griess

La méthode MPN-Griess est encore actuellement la plus fréquemment employée pourdénombrer les bactéries du genre Nitrobacter (en fait les bactéries nitratantes) in situ. Cetteméthode est reconnue pour sous-estimer la communauté nitratante (Both et al., 1990a ;Rennie et Schmidt, 1977). Belser et Mays (1982), par exemple, estiment l'efficience du MPNà moins de 5 % de la population estimée par une mesure d'activité.Nos résultats confirment ces observations antérieures. A l'issue d'une période d'incubation de11 semaines, la quantité de Nitrobacter détectée est faible par rapport à la quantité inoculée.Plusieurs phénomènes peuvent expliquer le faible rendement de détection ainsi obtenu :

1- la sélectivité du milieu de culture :Beaucoup de facteurs abiotiques tels que le pH et la concentration en nitrite influencentfortement la croissance des cellules, et donc le résultat final du MPN. Par exemple, toutes lespopulations n'ont pas la même cinétique d'oxydation du nitrite et n'en nécessitent pas la mêmeconcentration (Both et al., 1990a et 1990b ; Laanbroek et Schotman, 1991 ; Stienstra et al.,1993). Ainsi, étant donné que les populations évoluent, la concentration en nitrite ne peut êtreoptimisée que pour une certaine période (Both et al., 1991). Pour obtenir une estimation dunombre de nitratants la plus précise possible, il est donc recommandé de réaliser desincubations des dilutions avec différentes concentrations en nitrite. Sur une durée maximaled'incubation, ceci permet non seulement de déterminer l'abondance de la communauténitratante, mais aussi de recueillir des informations sur la structure fonctionnelle de cettecommunauté (Both et Laanbroek, 1991 ; Laanbroek et Schotman, 1991).Des essais d'incubations de nos dilutions en milieu autotrophe avec une concentration initialeen NaNO2 de 0.5 mM n'ont cependant abouti à aucune détection de nitratant à l'issue d'unepériode de 11 semaines (résultats non montrés).La souche inoculée pour nos travaux, Nitrobacter hamburgensis, montre, en culture, unemeilleure croissance en conditions mixotrophiques qu'autotrophiques. Nous avons donceffectué des essais préliminaires d'incubations en milieu mixotrophe (présence de NO2

- et decarbone organique). L'évolution des cupules au test de Griess (résultats non montrés) estcomparable à celle obtenue en milieu autotrophe.

2- le principe de détection de l'activité nitratante par colorimétrie :Dans le cas du milieu mixotrophe, la disparition de NO2

- n'est pas liée à une apparition deNO3

-, ce qui laisse penser qu'une dénitrification a pu avoir lieu, en raison des conditionsd'oxygénation relativement restreintes (cupules calfeutrées pour éviter une dessiccationtotale). En effet, il est connu que, dans des conditions limitantes en oxygène et en présence decarbone organique, le recyclage du NO3

- par l'oxydation du NO2- en NO3

- et la réductionsimultanée du NO3

- en NO2- puis N2O par Nitrobacter hamburgensis peut avoir lieu

(Laanbroek et al., 1994).

3- la présence d'agrégats de cellules ("clusters") et de cellules en dormance ("restingcells") qui sont difficiles à réactiver, et souvent plus d'une cellule est nécessaire pourengendrer une croissance (Laanbroek et Schotman, 1991 ; Sandén et al., 1996).


Un autre inconvénient du MPN-Griess est la longue période d'incubation nécessaire pourl'obtention d'une estimation maximale et stable de la quantité de nitratants. Cette périodevarie, selon les auteurs, de plusieurs semaines à plusieurs mois (Matulewich et al., 1975) (ellene peut pas être prolongée au delà de quelques mois, sous peine de complète évaporation descupules lors d'incubations en microplaques).

Néanmoins, le MPN-Griess demeure très utilisé car il présente l'avantage d'être simple àmettre en œuvre et peu coûteux pour des études en routine.


Alors que les méthodes MPN-PCR et MPN-Griess reposent sur des évaluations statistiques(existence de biais...), l'immunofluorescence est la seule méthode de comptage "direct".Une comparaison préliminaire des techniques d'immunofluorescence sur lame (décrite parJosserand (1983)) et sur filtre nous a conduits à retenir la méthode sur filtre, car elle fournitles résultats présentant la plus faible variabilité (homogénéité de l'échantillon par rapport àl'hétérogénéité due à la rétractation des gouttes de suspensions d'échantillons sur lames...) et lameilleure qualité de lecture (contre-coloration à la gélatine-rhodamine).Le seuil de détection théorique, basé sur le fait que l'observation d'un nombre moyen de unebactérie par champ microscopique est nécessaire pour avoir un comptage fiable (lecture de100 champs environ), est de 1,6.104 Nitrobacter par gramme de sédiment sec. Cependant, ilfaut tenir compte du fait qu'une dilution minimum au 10ème est indispensable pour éviter uncolmatage des filtres et pour permettre de distinguer les cellules parmi les particules (quiprésentent une forte autofluorescence) lors de l'observation microscopique (figure V-6).Celle-ci doit de plus être rapide en raison d'un fading (17) important et rapide. Le seuil dedénombrement réel (1,6.105 Nitrobacter/g séd sec) est donc nécessairement plus élevé que leseuil théorique.

Les rendements de récupération (par rapport à la quantité inoculée) obtenus ici sont prochesde ceux mentionnés par Josserand (1983) : 25 % et (Degrange, 1996) : 20 % (pour le sérotypeX14), en sol.

L'intérêt de cette technique, outre le fait qu'elle procure une réponse rapide, est qu'elleprésente peu de réactions croisées (Fliermans et al., 1974), ce qui permet de ne prendre encompte que la population spécifique souhaitée. En revanche, lorsqu'il s'agit d'étudierl'ensemble du genre Nitrobacter, son utilisation devient moins pertinente, en raison de sonmanque d'exhaustivité. Ainsi, en sommant les dénombrement obtenus avec 5 sérums, Bonnetet al. (1997) atteignent 7 à 10 % du MPN-Griess sur du floc de station d'épuration, etMontuelle et al. (1996) arrivent à 15 % en utilisant 6 sérums dans un effluent de stationd'épuration.

(17) diminution de la fluorescence


Figure V - 6 : Détection de Nitrobacter par immunofluorescence : observations au microscope à

épifluorescence d'une culture pure (A), de sédiment stérile réinoculé avec une culture pure (B), d'un

sédiment naturel (C) (taille moyenne de Nitrobacter : environ 2 µm) .

4.4.3 Vers des méthodes moléculaires discriminantes très performantes

À l'époque où nous avons engagé notre travail sur la méthode de dénombrement deNitrobacter en sédiment par PCR (1996), aucune méthode moléculaire de détection desbactéries nitratantes, exceptée celle de Degrange et Bardin (1995), n'avait été développée.Depuis, des travaux ont été entrepris concernant à la fois des mises au point techniques quiaméliorent essentiellement le seuil de détection, et la recherche de nouvelles ciblesmoléculaires pour augmenter la spécificité et/ou l'exhaustivité de cette détection.

4.4.3.1 Avancées techniques

Ces améliorations techniques se rapportent d'une part à la séparation des bactéries de lamatrice, avec, par exemple, la centrifugation sur Nycodenz (Bakken et Lindahl, 1995).Elles concernent d'autre part des méthodes d'amplification de l'ADN plus spécifiques, parmilesquelles la PCR compétitive s'avère capable de quantifier les bactéries du genre Nitrobacternaturellement présentes en milieu aquatique (Berthe et al., 1999). Cette technique repose surle principe d'une co-amplification, avec le même couple d'amorces dans le mélangeréactionnel, de la séquence d'ADN recherchée et d'une autre séquence : l'ADN compétiteur,qui sert de gamme interne d'amplification.Par ailleurs, des techniques de détection "in vivo" ont été développées, permettant d'étudier lescellules dans leur micro-habitat naturel, en analysant leur abondance et leur distributionspatiale in situ. Il s'agit d'une part de l'hybridation in situ (FISH), qui permet la détectionspécifique d’ADN à l'intérieur de cellules morphologiquement intactes, à l'aide

A B C


d'oligonucléotides rendus fluorescents par couplage à un fluorochrome (Mobarry et al., 1996 ;Schramm et al., 1999 ; Schramm et al., 1996 ; Wagner et al., 1995 ; Wagner et al., 1996).D'autre part, la PCR in situ (PI-PCR) implique l'amplification, à l'intérieur des cellules, deséquences cibles d'ADN, suivie de leur détection par fluorescence (FISH), en microscopie(Hodson et al., 1995). Cette technique, applicable sur les bactéries nitratantes en culturespures, nécessite encore des adaptations en vue de son utilisation en milieux complexes(Degrange, comm. pers.).

4.4.3.2 Amélioration de la spécificité de la cible moléculaire

Deux types de cibles moléculaires peuvent être considérées : les acides nucléiques et lesprotéines.Parmi les avancées intéressant le dénombrement des bactéries nitrifiantes au moyen del'ADN, deux voies sont à explorer. L'une concerne l'amélioration de la spécificité de ladétection au niveau du genre, grâce à l'utilisation de séquences de l'ADNr 23S plutôt que deséquences de l'ADNr 16S, classiquement utilisé car séquencé plus précocemment, mais quiest très conservé chez Nitrobacter et ses voisins phylogénétiques (Orso et al., 1994). Laseconde voie est liée à l'étude des communautés fonctionnelles et passe par la détection desgènes de fonction pour prendre en compte de façon spécifique et exhaustive la communauténitritante ou nitratante globale. Le gène amoA, qui code pour le site actif de l'enzymeammonium monooxygénase, a d'ores et déjà été séquencé (Mc Tavish et al., 1993) et utilisécomme cible (Rotthauwe et al., 1997). Le séquençage du gène norA, codant pour la sous-unité catalytique de l'enzyme nitrite oxydoréductase, est en cours (Degrange, comm. pers.).Enfin, une autre façon d'aborder les communautés fonctionnelles est de détecter directementles protéines impliquées dans la fonction étudiée de façon à prendre en compte la fractionactive de ces communautés. La détection de la protéine Nor par chimiofluorescence et parimmunofluorescence à l'aide d'anticorps polyclonaux (18) a déjà été réalisée sur des solsenrichis en nitrite dans le but de quantifier les bactéries ayant synthétisé la Nor, et dedéterminer la quantité d'enzyme synthétisée par cellule (thèse C. Cœur, comm. pers.). Desanticorps monoclonaux (19), reconnaissant l'ensemble des systèmes enzymatiques réalisantl'oxydation du nitrite chez les divers genres nitratants décrits jusqu'à présent, peuventégalement être produits (Bartosch et al., 1999).

) Ces nouvelles méthodes d'étude des communautés totales et fonctionnelles offrent desperspectives prometteuses pour l'étude écologique de la nitrification.

(18) Les anticorps polyclonaux (produits par un animal auquel une culture de bactéries a été injectée) sontdirigés contre de multiples déterminants antigéniques.(19) Les anticorps monoclonaux (produits par un clone unique de lymphocytes fusionnés avec des cellules demyélome pour former un hybridome) sont dirigés contre un déterminant antigénique unique.


4.5 CONCLUSION

L'originalité de ce travail a été de :- chercher à connaître le rendement de chaque étape du protocole de MPN-PCR pour

quantifier le genre Nitrobacter.- travailler sur du sédiment dont la structure et les caractéristiques sont celles du

terrain (pas de stérilisation pour ne pas détruire la structure et ne pas modifier les éventuelsinhibiteurs de la PCR).

- comparer plusieurs méthodes de dénombrement de Nitrobacter in situ reposant surdes principes différents.

Notre objectif était d'évaluer la pertinence de ces différentes méthodes pour des études deterrain sur le sédiment.Dans ce cadre, nous avons testé l'applicabilité d'une méthode de dénombrement deNitrobacter par un protocole utilisant la PCR, pour une meilleure spécificité de la détection.Le seuil de détection est très élevé (supérieur aux densités de Nitrobacter rencontréescouramment en milieu aquatique) et la reproductibilité est faible. Cette méthode n'est doncpas applicable à notre milieu sans de nouvelles mises au point. Elle peut cependant êtreutilisée comme moyen de détection dans les milieux riches (boues de stations d'épuration parexemple).Il apparaît qu'aucune des techniques disponibles actuellement ne permet un dénombrementsans biais du genre Nitrobacter en sédiment. Chacune des trois techniques évoquées permetd'aborder un niveau différent des populations de Nitrobacter, et les limites de chacune d'entreelles impliquent une utilisation bien ciblée de ces trois méthodes en fonction de ce que l'onrecherche :

- détection spécifique de Nitrobacter en milieu riche pour la PCR- suivi d'une population sérotypique (visualisation en milieu inoculé notamment) pour

l'immunofluorescence- évaluation de la communauté nitratante "activable", avec la possibilité de traiter un

grand nombre d'échantillons, pour le MPN-Griess.Utilisées en complémentarité les unes des autres, et accompagnées de mesures d'activité, cestechniques devraient permettre de mieux appréhender les relations nombre-activité in situ.

CHAPITRE VI

CONCLUSION GENERALEET PERSPECTIVES

CHAPITRE VI : CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES 169

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

1 CONCLUSION GENERALE

Les bactéries nitrifiantes sont relativement ubiquistes dans les milieux aquatiques etreprésentent un maillon important du cycle biogéochimique de l'azote. L'étude de leurécologie se heurte généralement à deux de leurs caractéristiques physiologiques et depeuplement : leur long temps de génération, qui rend leur culture délicate, et leur densité assezfaible en milieu naturel. Le manque de techniques fiables et précises pour les dénombrer enmilieu complexe complique leur étude in situ.Notre approche "multi-échelles" en microcosmes et batches a permis de contournerpartiellement ces difficultés en exploitant la complémentarité des outils disponibles pourl'étude des communautés nitrifiantes.Dans le cadre de l'étude de ces communautés en sédiment de rivière soumise à un rejet destation d'épuration, nous avons pu, par l'utilisation de milieux simplifiés, dissocier l'impactstrictement lié au rejet, de l'impact lié au changement de conditions environnementalesglobales entre une situation amont et une situation aval "perturbée".Cette approche a mis en évidence une modification de la dynamique des communautésnitrifiantes dans le sédiment entre l'amont et l'aval de l'effluent (tableau V-1).Globalement, un effluent de station d'épuration domestique urbaine fournit au milieurécepteur à la fois un inoculum en bactéries nitrifiantes capables de s'implanter dans lesédiment et un apport de substrat nitrifiable ; les proportions de ces deux types d'apportsvarient suivant l'existence ou l'absence d'un traitement tertiaire de nitrification de l'effluent.Nous avons montré que, dans le sédiment à l'aval du rejet, s'ensuivent des modifications de ladensité de communauté et de l'intensité de l'activité potentielle de chacune des deux étapes dela nitrification, ces réponses étant généralement intensifiées avec le gradient d'effluent :

- les densités de nitritants et de nitratants sont stables ou augmentent (jusqu'à un gainde 2 unités log dans le cas extrême d'un apport d'effluent non nitrifié contribuant à 80 % dudébit aval)

- les activités potentielles présentent une évolution plus variable (depuis une baisse de56 % de la nitritation jusqu'à une augmentation de 666 % de la nitratation dans la situationpré-citée).Dans tous les cas, des modifications de la relation densité de communauté-activité potentielleont été observées.D'après ces résultats, nous avons proposé deux hypothèses sur la dynamique descommunautés globales, et les avons étayées par une étude au niveau de populations modèles :

- les souches issues de l'effluent sont de potentielles colonisatrices du sédiment. Leurniveau d'implantation résulte d'une compétition avec les souches autochtones, les souchesayant le métabolisme le plus versatile étant vraisemblablement les meilleures compétitrices.Les conséquences sont des modifications dans la structure des communautés.


L'augmentation de densité des communautés est par ailleurs à relier à l'apport de substrat parl'effluent.

- ces modifications de structure des communautés s'accompagnent de modifications del'activité potentielle de chaque étape car les différentes souches en compétition peuventprésenter des activités spécifiques différentes. De plus, au sein d'une même souche, l'activitéspécifique varie en fonction des conditions environnementales.

À l'échelle réelle du terrain, dans des rivières de taille moyenne, cette dynamique desbactéries nitrifiantes à l'aval immédiat d'un rejet de station d'épuration est perceptible dansl'activité nitrifiante potentielle (Montuelle et al., soumis). Dans les grands fleuves, l'effet peutêtre marqué plusieurs centaines de kilomètres à l'aval du rejet, distance au long de laquelle lesbactéries issues de l'effluent sont transportées par les particules en suspension et ont le tempsde se développer avant de séjourner dans les zones estuariennes de nitrification intense(Brion, 1997).

Outre un approfondissement de la connaissance de l'écologie de la nitrification en sédiment derivière, ce travail nous a également permis d'aborder les avantages et limites des études enmilieux simplifiés (microcosmes et batches) et de dresser un bilan sur les outils d'étude descommunautés nitrifiantes in situ. Le dénombrement du genre Nitrobacter par MPN-PCR avecle protocole utilisé s'avère peu sensible (seuil de détection élevé et faible rendement). Lestechniques moléculaires offrent néanmoins des perspectives prometteuses à court terme pourle dénombrement et l'approche de la diversité des bactéries nitrifiantes. Les techniques"classiques" (MPN-Griess et immunofluorescence) demeurent des outils informatifs, àcondition d'en connaître les limites et de les utiliser dans un contexte adapté.

La multiplicité des niveaux d'études et des techniques mises en œuvre (systèmesexpérimentaux et outils), contribuent à l'originalité de ce travail. Celui-ci s'inscrit dans laproblématique de la capacité d'auto-restauration du milieu en aval d'un rejet anthropique,encore peu abordée en ce qui concerne la nitrification. En effet, de nombreux travaux sontdéveloppés sur les communautés nitrifiantes à l'intérieur même des stations d'épuration, auniveau des systèmes de traitement tertiaire, dans le but d'améliorer le rendement d'éliminationde l'azote avant le rejet dans le milieu. Or les petites stations d'épuration, rejetant leur effluentdans des rivières de taille moyenne, ne peuvent généralement pas être équipées de cessystèmes de nitrification ou de nitrification-dénitrification (question de coût), et l'éliminationdu NH4

+ au sein de l'installation est donc partielle. Dans ce cas, il faut se focaliser sur leseffets des rejets sur le milieu récepteur et envisager les aménagements possibles des coursd'eau pour favoriser l'élimination de l'azote.


Tableau VI - 1 : Différents niveaux d'approche abordés et apports à l'écologie des bactéries nitrifiantes

en sédiment de rivière soumis à un rejet de station d'épuration (les niveaux directement abordés dans ce travail

sont encadrés en gras).

QUESTIONNEMENT ECOLOGIQUE QUESTIONNEMENT TECHNIQUE

OBSERVATIONS QUESTIONS REPONSES

terr

ain

com

mun

auté

s fo

nctio

nnel

les - perturbation des

cyclesbiogéochimiques parrejets de stationsd'épuration

- localisation desnitrifiants au niveaudu sédiment et desparticules ensuspension

- Quel est l'impactd'un rejet de Step surla capacité nitrifianteglobale(communautés etactivités) ensédiment de rivière ?

- modificationssignificatives desactivités potentiellesà l'aval

- réponse descommunautés liée àl'environnementglobal (effluent +site)

OBSERVATIONS QUESTIONS REPONSES OBSERVATIONS QUESTIONS REPONSES

mic

roco

sme

s

com

mun

auté

s fo

nctio

nnel

les - Les effluents de

Step contiennent duNH4

+ et des bactériesnitrifiantes.

- Les bactéries dugenre Nitrobacterissues d'une Stepsurvivent à l'aval durejet.

- Au niveau dusédiment aval, peut-on différencier uneffet substrat (NH4

+)et un effet inoculum(bactériesnitrifiantes) desrejets de Step ?

- Quels sont ceseffets sur les 2étapes de lanitrification ?

Pour les 2 étapes :

- effet substrat eteffet inoculumdifficilementdissociables

- modification desrelations densité decommunauté-activitépotentielle

Quel que soit leniveau d'approche, ilmanque destechniques fiables,précises et rapidesde détection et dedénombrement insitu descommunautésfonctionnelles,globales ou actives,et des populations denitrifiants

- Quels sont lesoutils pertinentspour la détection etle dénombrementdes bactériesnitrifiantes in situ ?

- Les outils existantsont-ils applicablesou adaptables auxmilieux aquatiques ?

- technique de MPN-PCR utilisablecomme moyen dedétection deNitrobacter dans lesmilieux riches

- techniquesclassiques MPN etIF utilisables dansdes contextesadaptés

HYPOTHESES QUESTIONS REPONSES

batc

hes

popu

latio

ns

- implantation dansle sédiment desouches issues del'effluent(modification desstructures descommunautésnitritante etnitratante)

- variation del'activité spécifiquedes souchesautochtones

- Existe-t-il descompétitions entresouches autochtoneset souches issues del'effluent ?

- Des modificationsde structure descommunautésengendrent-elles desvariationsd'activité ?

- modification ducomportement dessouches seules ou encompétition et selonles conditionsenvironnementales

- variation del'activité spécifiquesuivant laconcentration desubstrat disponible


2 PERSPECTIVES DE RECHERCHE

Notre travail offre des perspectives de recherches dans deux directions : vers une recherche"amont" sur les bactéries nitrifiantes et le processus de nitrification, et vers une rechercheintégrée à la gestion des milieux aquatiques. Ces perspectives concernent les différenteséchelles d'étude abordées ici, et portent sur les concepts écologiques et des développementstechniques (tableau VI-2).

2.1 QUESTIONNEMENT TECHNIQUE

Notre étude a mis en évidence quelques lacunes techniques auxquelles nous nous sommesheurtés pour les mesures de taille de communautés ou de populations et les mesuresd'activités. Les développements techniques sont donc une priorité, car de nombreusesquestions d'ordre écologique sur la nitrification ne peuvent pas être résolues à l'heure actuellefaute d'outils adaptés pour l'étude des communautés impliquées. Un certain nombre de cesoutils sera applicable au niveau du compartiment sédimentaire à court ou moyen terme.

• Communautés et populations nitrifiantesLa poursuite de travaux en biologie moléculaire pour la détermination de densités depopulations (chapitre V) devrait permettre, à terme, de dénombrer les bactéries appartenantaux différents genres et espèces de nitrifiants. Parallèlement, l'utilisation comme ciblesmoléculaires des gènes de l'ammonium monooxygénase et de la nitrite oxydo-réductase,permettra de prendre en compte les communautés fonctionnelles dans leur globalité. Il faudraégalement pouvoir estimer la proportion de bactéries qui expriment leur potentiel nitrifiant.L'utilisation de marqueurs pour les enzymes Amo ou Nor (anticorps dirigés contre cesprotéines) est en cours de validation (Degrange, comm. pers.).Comme nous l'avons vu au cours de notre travail en batches (chapitre IV), le marquage descellules par immunofluorescence prend en compte les bactéries vivantes et les bactériesmortes dont la paroi cellulaire n'est pas lésée. La distinction en microscopie des bactériesvivantes et des bactéries mortes est désormais possible (technique LIVE/DEAD® BacLightTM

(Boulos et al., 1999)). Le couplage de cette technique au marquage spécifique parimmunofluorescence devrait permettre de lever certaines incertitudes quant à la proportion debactéries viables dans les dénombrements de souches et donc également sur les mesuresd'activité spécifique.

• Activité nitrifianteNotre protocole de mesure des activités potentielles est à optimiser : l'utilisation de techniquesayant un seuil de détection bas et une sensibilité plus élevée pour la mesure des sels azotés(chromatographie ionique par exemple) permettrait de diminuer les durées d'incubation. Cecilimiterait l'évolution des communautés au cours des incubations. Le blocage des synthèsesenzymatiques par du chloramphénicol peut également être envisagé pour éviter lasurestimation des activités potentielles.


La possibilité de mesure in situ d'activités réelles distinguant les deux étapes de la nitrificationpermettrait de lier une fonctionnalité effective à une potentialité pour chacune descommunautés nitritante et nitratante.

• Développement de biotestsL'activité nitrifiante peut être utilisée, en complément d'autres critères d'évaluation desbiocénoses à différents niveaux trophiques, comme indicateur écologique de l'intégritébiologique des cours d'eau. À ce titre, elle pourrait être intégrée dans le diagnostic de qualitédes cours d'eau ("S.E.Q. Bio" des Agences de l'Eau par exemple (Agences de l'Eau, 1999)).

• Stratégies d'étude in situL'estimation statistique de la variabilité spatio-temporelle de la nitrification en rivière etl'élaboration d'une stratégie d'échantillonnage sont des préalables indispensables aux étudesde terrain. Pour le gestionnaire, ces études de terrain seront notamment axées sur la capacitéd'auto-épuration de l'azote sur des tronçons de grande longueur et sur l'effet d'aménagementsde cours d'eau sur les séquences nitrification/dénitrification.

2.2 QUESTIONNEMENT ECOLOGIQUE

• Recherche "amont"Notre étude, en complément d'autres travaux effectués sur le terrain, a permis de progresserdans la compréhension des mécanismes qui régissent la dynamique des communautésnitrifiantes en sédiment dans un milieu perturbé.Il faudra valider nos hypothèses avec des études plus précises de l'écologie particulière desbactéries nitrifiantes (en raison de la diversité de leurs types métaboliques et de leurscapacités d'adaptation). Ceci nécessite d'approfondir, en systèmes simplifiés, lesconnaissances sur le déterminisme de l'activité et de la versatilité métabolique des bactériesnitrifiantes. Ce travail devra être réalisé avec des souches isolées du terrain et caractérisées.

• Gestion des milieuxNous avons montré que les nitrifiants rejetés par les stations d'épuration sont capables des'implanter à l'aval, et qu'ils sont potentiellement actifs, même si ce potentiel peut être réduitpar rapport à l'amont. Il reste à connaître l'impact des rejets sur la nitrification réelle au niveaude l'interface sédiment-eau dans les rivières de taille moyenne.Il faut également s'interroger sur les conséquences de la dynamique de la nitrification à l'avald'une perturbation anthropique sur le fonctionnement plus global de l'écosystème. Cecipassera notamment par le couplage de l'étude de la nitrification à celle d'autres processus telsque l'ammonification et la dénitrification, pour suivre l'ensemble du processus d'auto-épuration de l'azote.

À plus long terme, l'intégration des outils d'étude des communautés globales et fonctionnelleset de mesure des activités dans une approche de terrain multi-sites et multi-paramètrespermettra de définir les critères du milieu à prendre en compte pour prévoir la réponse de la


nitrification en sédiments de rivière soumis à une perturbation anthropique. Le couplage descaractéristiques physiques et chimiques des sites (proportion sédiments/galets, naturegéologique (qui influence notamment le pH), vitesse du courant et oxygénation de l'eau et dusédiment…) et du type de perturbation pourra être intégré dans des modèles defonctionnement local (directement en aval d'une perturbation) ou global de l'écosystème.

Tableau VI - 2 : Principales perspectives de recherches fondamentales et appliquées sur la

nitrification dans les sédiments d'eau douce et cours d'eau.

RECHERCHE "AMONT"physiologie bactérienne et processus

GESTION DES MILIEUX

fonctionnement écosystème

- mesure des activités nitritante et nitratante réelle in situ

- détection et dénombrement des communautésnitritante et nitratante globales

- détection et dénombrement des nitrifiantsactifs

- détermination du niveau d'activité par cellule

- accès à la diversité in situ

- capacité nitrifiante sur grands tronçons decours d'eau → stratégie d'échantillonnage ?

- effet d'aménagements de cours d'eau

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- variabilité spatiale de la nitrification in situ (statistique)

- développement de biotests basés sur l'activité nitrifiante en sédiment

syst

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una

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/po

pula

tion

s - versatilité du métabolisme et adaptabilité desbactéries nitrifiantes à leur environnement

- déterminisme de la nitrification → facteurs impliqués → expression des gènes de fonction

- isolement et caractérisation de souchesautochtones du sédiment et des effluents

- Les caractéristiques de chaque site influencent-elles la dynamique de la nitrification en avald'une perturbation anthropique ? (partiellement abordé)

- La modification de la dynamique de la nitrification en aval d'un rejet de station d'épurationinfluence-t-elle le fonctionnement de l'écosystème ?

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→ activité réelle ?→ lien avec la dénitrification ?→ lien avec les autres cycles biogéochimiques ?→ accumulation ou apparition transitoire de formes potentiellementtoxiques ?→ consommation d'oxygène ?

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 176

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ANNEXES

ANNEXES 191

ANNEXE 1 : ÉTAPES POUR L'ELABORATION DU PROTOCOLE DE MESURE DEL'ACTIVITE NITRIFIANTE POTENTIELLE

Essais sur le sédiment de la Chalaronne, prélevé à l'amont de la station d'épuration de Châtillon/Chalaronne (01)

I – Bibliographie : choix d'une méthode de "slurry" et des inhibiteurs spécifiques (ainsi que leur concentration) :Allylthiourée : concentration finale : 1.7 mMChlorate : concentration finale : 9.3 mM

II - Expérimentations

II.1 - Choix des méthodes de dosage des formes de l'azote

• Etablissement de gammes étalons :- dans de l'eau Milli-Q- dans un "milieu sédiment" (ajouts dosés de solutions de NH4CL, NaNO2, KNO3 dans des sédiments,

extraction de l'eau interstitielle, dosage des formes NH4+, NO2

-, NO3-)

→ validation des méthodes :NH4

+ : méthode spectrophotométrique au bleu d’indophénol. Norme française homologuée NF T90-015.NO2

- : méthode par spectrométrie d’absorption moléculaire. Norme internationale ISO 6777-1984(F).NO3

- : méthode spectrométrique au diméthyl-2,6 phénol. Norme internationale ISO 7890/1-1986(F)

II.2 - Essais d'incubations en tubes

15 g sédiment humide + 15 ml NH4Cl (1 mM), 28°C, agitation, obscuritéajout des inhibiteurs à t=0 et dosage des sels azotés à t=0, 4, 24, 48, 72 heures

→ évolution marquée du NO2- à partir de 24h

perte de NO3- en présence d'ATU (dénitrification ?)

interférence avec le chlorate pour le dosage du NO3-

II.3 - Essais d'incubation en "slurry" en erlenmeyers de 1 litre

50 g sédiment humide + 450 ml solution (NH4)2SO4 (20 mM), température ambiante, agitation par barreauaimanté, obscuritéajout des inhibiteurs à t=0 et dosage des sels azotés à t=0, 4, 24, 48, 72 heures

→ problèmes techniques d'agitation (surchauffe et abrasion)inhibition partielle de la nitritation par le chlorate

II.3 - Essais d'incubation en "slurry" en erlenmeyers de 1 litre et 250 ml

50 g (/12.5 g) sédiment humide + 450 ml (/112.5 ml) solution (NH4)2SO4 (20 mM), température ambiante,agitation par plateaux agitateurs, obscuritéajout des inhibiteurs à t=0 et dosage des sels azotés à t=0, 4, 24, 48, 72 heures

→ variations des concentrations de NH4+, NO2

- et NO3- significatives entre 24 et 48 h

pas suffisamment de NO2- à t=0 pour mesurer la deuxième étape avec l'ATU

inhibition partielle de la nitritation par le chlorate

II.4 - Essais d'incubation en "slurry" en erlenmeyers de 1 litre et 250 ml

50 g (/12.5 g) sédiment humide + 450 ml (/112.5 ml) solution (NH4)2SO4 (20 mM), température ambiante,agitation par plateaux agitateurs, obscuritéajout des inhibiteurs à t=48 h et dosage des sels azotés à t=0, 24, 48, 72, 96 heuresentre t=48 et t=96 h, le NO2

- n'est pas limitant (grâce à la production "naturelle" entre t=0 et t=48 h)

ª protocole retenu :incubations en "slurry" en erlenmeyers de 250 ml, pendant 96 hajout des inhibiteurs à t=48 hdosage des sels azotés à t=0, 48, 96 h

ANNEXES 192

ANNEXE 2 : DOSAGE SPECTROPHOTOMETRIQUE DES SELS AZOTES

1 DOSAGE DE L'AMMONIUM

4 ml d'échantillon

+ 0.2 ml de solution de phénol et nitroprussiate

→ agitation

+ 0.2 ml de solution alcaline

→ agitation

→ incubation 6 heures à l'obscurité, à température ambiante

→ lecture au spectrophotomètre, cuves de 10 mm, λ = 630 nm

Réactifs (stockage à l'obscurité, à +4°C) :

• solution de phénol et nitroprussiate : phénol 7 g(stabilité 3 mois) nitroprussiate de sodium 0.08 g

H2O Milli-Q q.s.p. 200 ml

• solution alcaline : hydroxyde de sodium 4 g

(stabilité 3 mois) Citrate trisodique 76 gH2O Milli-Q ≈ 80 ml→ ébullition douce pendant 20 min. et refroidissement

sel de sodium de l'acide dichloroisocyanurique 0.8 gH2O Milli-Q q.s.p. 200 ml

2 DOSAGE DU NITRITE

4 ml d'échantillon

+ 0.1 ml de réactif coloré

→ agitation

+ 0.9 ml d'H2O Milli-Q

→ agitation (le pH doit être < 2)

→ incubation 30 min. à l'obscurité, à température ambiante


Réactifs (stockage à l'obscurité, à +4°C) :

• réactif coloré : acide orthophosphorique 10 ml(stabilité 1 mois) H2O Milli-Q 50 ml

amino-4-benzène sulfonamide 4 g→ dissolutiondichlorhydrate de N-(naphtyl-1) diamino-1,2 éthane 0.2 g

→ dissolutionH2O Milli-Q q.s.p. 100 ml

ANNEXES 193

3 DOSAGE DU NITRATE

3.5 ml de mélange acide

+ 0.5 ml d'échantillon

→ agitation

+ 0.5 ml de solution de diméthyl-2,6 phénol

→ agitation

→ incubation 30 min. à l'obscurité, à température ambiante


Réactifs (stockage à l'obscurité, à température ambiante) :

• mélange acide : acide sulfurique 500 ml(stabilité longue) acide orthophosphorique 500 ml

acide amidosulfonique 0.040 g

• solution de diméthyl-2,6 phénol : acide acétique glacial 100 ml

(stabilité 1 semaine) diméthy-2,6 phénol 0.12 g

ANNEXES 194

ANNEXE 3 : ACTIVITES NITRIFIANTE, NITRITANTE ET NITRATANTE POTENTIELLESDANS LE SEDIMENT DE LA CHALARONNE

Évolution des composés azotés au cours des 96 heures d'incubation pour les mesures d'activités

potentielles.

tém oin sans inhibiteur :

nitrification globale

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96

durée d'inc ubation (h)

N-N

H4

+

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

0

100

200

300

400

500

600

N-N

O2

- , N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

N-NH4+

N-NO2-

N-NO3-

inhibiteur chlorate :

m esure nitritat ion

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96


N-N

H4

+

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

0

50

100

150

200

N-N

O2

- , N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

inhibiteur ATU :

m esure nitratat ion

0

200

400

600

800

1000

0 24 48 72 96


N-N

H4

+

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

0

50

100

150

200

N-N

O2

- , N

-NO

3-

(µg

/g s

éd

. s

ec

)

ANNEXES 195

ANNEXE 4 : PHOTOGRAPHIE DES MICROCOSMES

réacteur R0

réacteurs R1, R2, R3, R4

pompe péristaltiqueréserve effluent

réserve eau

de rivière

ANNEXES 196

ANNEXE 5 : MILIEUX POUR LA CULTURE DES BACTERIES NITRIFIANTES

1 MILIEU POUR NITRITANTS (Schmidt et Belser, 1994)

concentrationde la solution stock

(g.100 ml-1)

quantité de solutionstock pour 1 litre de

milieu (ml)

(NH4)2SO4 5.0 10.0CaCl2, 2 H2O 1.34 1.0

MgSO4, 7 H2O 4.0 1.0bleu de bromothymol 0.04 5.0KH2PO4 (0.2 M) 2.72 7.5

• solution fer-EDTA : 1.0FeSO4, 7 H2O 0.246EDTA 0.331

• solution d'éléments traces : 1.0Na2MoO4, 2 H2O 0.01MnCl2 0.02

CoCl2, 6 H2O 0.0002ZnSO4, 7 H2O 0.01CuSO4, 5 H2O 0.002

2 MILIEU POUR NITRATANTS (Schmidt et al., 1973 ; Bock et al., 1983)

milieu autotrophe(pour 1 litre)

milieu mixotrophe(pour 1 litre)

NaNO2 2 g0.345 g pour MPN-Griess

2 g

Na2HPO4 5 g 5 g

KH2PO4 0.5 g 0.5 gsolution fer-EDTA 5 ml 5 mlsolution A 1 ml 1 ml

solution B 10 ml 10 mlextrait de levure 1.5 gbactopeptone 1.5 g

pyruvate de sodium 0.55 g

solution fer-EDTA : FeSO4, 7 H2O 77 mgEDTA 103 mgH2O q.s.p. 50 ml

solution A : ZnSO4, 7 H2O 2 mgCuSO4, 5 H2O 2 mg

Na2Mo4, 2 H2O 2 mgH2O q.s.p. 100 ml

solution B : MgSO4, 7 H2O 0.20 %

ANNEXES 197

ANNEXE 6 : PRINCIPE DE L'IMMUNOFLUORESCENCE INDIRECTE

Une souche bactérienne isolée, puis purifiée et concentrée, est injectée à un animal(généralement un lapin) qui fabrique alors des anticorps spécifiques. Lorsque ces anticorpssont mis en présence de la bactérie ayant servi d'antigène, ils se fixent sur la paroi bactérienne

antigène-anticorps. Pour visualiser cette réaction, un second type d'anticorpsréagissant avec les anticorps de l'animal est utilisé. Ce deuxième anticorps est couplé à unfluorochrome qui, soumis à un rayonnement d'une certaine longueur d'onde, émet de lafluorescence. Avec un dispositif microscopique approprié, les bactéries marquées apparaissentdonc fluorescentes.

injectionconcentration

ponction

culture pure

anticorps

observation

anticorps+ fluorochrome

isolement

Nitrobacter

échantillonde terrain

ANNEXES 198

ANNEXE 7 : PROTOCOLE DE DENOMBREMENT DE LA MICROFLORE TOTALE

(EN SEDIMENT) PAR LA METHODE AU DAPI

Principe :

Le DAPI (4’6-diamidino-2-phenylindole) est un fluorochrome spécifique de l’ADN (Porter etFeig, 1980). Le complexe ADN-DAPI excité sous lumière UV à faible longueur d’onde (340nm) émet une lumière bleue dans une longueur d’onde supérieure (380 nm), tandis que leDAPI libre, ou lié à du matériel autre que l’ADN, fluoresce en jaune. Par une observation enimmersion au microscope à épifluorescence, il est ainsi possible de distinguer des formescellulaires particulièrement ténues (< 0.5 µm), sans être capable, toutefois, d’en observer demanière fine la morphologie (Rebillard et Torre, 1993), ou de différencier les cellules vivantesdes cellules mortes non lysées.

Protocole utilis é :

• Suspension-dilution :1 g sédiment humide + 1 ml formaldéhyde (concentration finale : 4 %) + 8 ml eau Milli-Qstérile filtrée→ agitation 5 min. au Whirlimixer→ dilutions sérielles au 1/10ème dans de l'eau stérile

• Filtration :filtration sous vide de 5 ml de suspension de sédiment dilué, sur filtre polycarbonate, de porosité 0.2 µm

• Coloration-incubation :dépôt sur le filtre de 800 µl de DAPI (solution stock : 1 mg/100 ml d'eau stérile, +4°C)incubation 5 min. à température ambiante

• Rinçage-séchagerinçage du filtre avec de l'eau stérileséchage sous hotte

• Montage :montage du filtre entre lame et lamelle, entre 2 gouttes de glycérine tamponnée à pH 7.6

• Observation :observation au microscope à épifluorescence (Nikon Labophot-2), en immersion, ×1000(lampe UV1a, λ excitation : 365 nm, λ émission : 450-480 nm)

ANNEXES 199

ANNEXE 8 : PROTOCOLE DE DENOMBREMENT DE LA MICROFLORE ACTIVE

PAR LA METHODE AU CTC

Principe :

Le CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) est un colorant rédox qui produit, lorsqu'ilest réduit chimiquement ou biologiquement, un formazan (CTF) qui fluoresce en rouge sousune excitation U.V. (λ > 350 nm).

Protocole utilis é :

• Marquage au CTC :2 ml suspension bactérienne (culture) + 0.2 ml de CTC (50 mM)

• Incubation :2 heures, à l'obscurité, sous agitation (100 tr.min-1), à température ambiante

• Arrêt de la réaction :ajout de 0.2 ml de formaldéhyde à 37 %

• Dilution :dilutions sérielles au 1/10ème dans de l'eau stérile (dans un volume de 5 ml)

• Filtration :filtration sous vide de 5 ml de dilution, sur filtre Nuclépore noir en polycarbonate, de porosité

• Montage :montage du filtre entre lame et lamelle, entre 2 gouttes de glycérine tamponnée à pH 7.6

• Observation :observation au microscope à épifluorescence (Nikon Labophot-2), en immersion, ×1000(lampe B-2A, λ excitation : 450-490 nm, λ émission : 630 nm)

ANNEXES 200

ANNEXE 9 : DOSAGE ET EVALUATION DE LA PURETE DE L 'ADN PARSPECTROPHOTOMETRIE

Dosage spectrophotométrique

L’ADN pur a un maximum d’absorbance à la longueur d’onde 260 nm. À l’aide d’une gammeétalon, il est donc possible de déterminer la concentration d’ADN extrait et éventuellement laquantité perdue lors de sa purification.Pour le dosage, une gamme étalon a été établie avec de l’ADN purifié de thymus de veau(Sigma) dilué dans du tampon d'extraction. Les échantillons sont placés dans une cuve enquartz et les lectures sont effectuées au spectrophotomètre (Kontron Uvikon 860).

Pureté de l’ADN

La pureté de l’ADN est estimée par la mesure des absorbances à 230 nm : A230

(caractéristique des acides phénoliques) et à 280 nm : A280 (caractéristique des protéines) et ladétermination des rapports A260/A280 et A260/A230 (Steffan et al., 1988) :

- A260/A280 > 1.7 signifie que l’ADN est pur, tandis qu’une faible valeur indique unecontamination par des protéines.

- A260/A230 > 2.0 est également indicateur de pureté de l’ADN, alors qu’une faiblevaleur est le signe d’une contamination par des acides phénoliques.

Le pourcentage de pureté de l’ADN est calculé de la manière suivante (d’après (Torsvik,1980))

A

A

ADN

total

260

260100×

où A260 ADN est la concentration déterminée en fluorimétrie par le DAPI et convertie en unitésd’absorption en utilisant la gamme étalon du dosage spectrophotométrique de l’ADN, etA260 total est l’absorption à 260 nm mesurée au spectrophotomètre.

ANNEXES 201

ANNEXE 10 : PRINCIPE DU MPN-PCR

5'3'

3'5'

5' 3'

5'

5'

3'

3'

5' 3'

5'3'

5' 3'

5'3'

3' 5'

dénaturation (95°C)

hybridation des amorces (50°C)

élongation (72°C)

séquence d'ADN cible (16S RNA)

n cycles

nombre de cyclesco

ncen

trat

ion

AD

N c

ible

397 pb

10-1témoin+

100 10-2 10-3

nombrecaractéristique

311

312313320321

MPN

7.5

12169.315

migration de l’ADN amplifiésur gel d’électrophorèse

amplification par PCRde l’ADN dilué

dilutions au 10ème (triplicats)de l’ADN purifié

tablestatistique

ANNEXES 202

ANNEXE 11 : EXTRACTION DE L'ADN DU SEDIMENT PAR CRYOBROYAGE

inoculation(Nb/g séd. sec)

détectionrendement

(%)nombre de

détections/nombred’essais

moyenne(Nb/g séd. sec)

± EcT

coefficient devariation (%)

0 (témoin) 0/3 0± 0

1.43×104 0/3 0± 0

0 0.0

1.09×105 0/3 0± 0

0 0.0

9.14×106 1/3 4.27×103

± 7.39×103173.2 0.05

Dénombrement de Nitrobacter par MPN-PCR avec extraction de l'ADN par la méthode

"cryobroyage", dans le sédiment du Neyrieux inoculé. Le rendement est déterminé par le

rapport entre la quantité de Nitrobacter détectée et celle inoculée.

NITRIFICATION EN SEDIMENT D'EAU DOUCE : INCIDENCE DE REJETS DE STATIOND'EPURATION SUR LA DYNAMIQUE DE COMMUNAUTES NITRIFIANTES

RESUME

Dans les milieux aquatiques, la nitrification (oxydation biologique de l'ammonium en nitrate)est localisée essentiellement dans le compartiment sédimentaire ou liée aux particules ensuspension.Les rejets de stations d'épuration dans les rivières peuvent perturber la nitrification dans lessédiments par des apports en azote (notamment sous forme NH4

+ et azote organique) ou enbactéries nitrifiantes. L'étude de cette perturbation de la nitrification par une approche "multi-échelles" (des communautés globales aux populations) a été abordée par l'utilisation desystèmes simplifiés continus (microcosmes) ou statiques (batches).Dans un premier temps, nous avons tenté de dissocier l'effet "substrat" (apport de NH4

+) etl'effet "inoculum" (apport de bactéries nitrifiantes) des effluents sur les communautésnitrifiantes d'un sédiment. Les 2 étapes de la nitrification (nitritation et nitratation) ont étéétudiées par MPN (most probable number) et par des mesures d'activités potentielles. Enprésence d'effluent, les modifications des relations densité de communauté-intensité del'activité potentielle observées conduisent aux hypothèses de l'implantation dans le sédimentde souches compétitives issues des effluents, avec des modifications dans la structure descommunautés et/ou de la variation de l'activité spécifique des souches autochtones.Puis le comportement de 2 souches du genre Nitrobacter (utilisé comme modèle de lanitratation) a été étudié dans différentes conditions environnementales. Celles-ci (laconcentration en substrat notamment) induisent un changement de compétitivité des souches,lié à la versatilité de leur métabolisme.Parallèlement, des mises au point ont été réalisées sur une technique de dénombrement ensédiment du genre Nitrobacter, impliquant l'amplification par PCR (polymerase chainreaction) d'une séquence d'ADN spécifique du genre. Le seuil de détection par cette méthodereste élevé pour ces bactéries dont la densité dans les milieux naturels est relativement faible.Le rendement de détection est inférieur à celui des techniques plus classiques de MPN etd'immunofluorescence, qui demeurent informatives dans des contextes adaptés.

SPECIALITE

Écologie Microbienne

MOTS-CLES

nitrification / Nitrobacter / sédiment / effluent de station d'épuration / dénombrement /activité / MPN-Griess / immunofluorescence / MPN-PCR

LABORATOIRE DE RECHERCHE

Cemagref, Laboratoire ÉcoDynamique des Sédiments3 bis quai Chauveau, CP 220, 69336 LYON cedex 09

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