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N° d’ordre : 4055

THÈSE Présentée à

UNIVERSITÉ BORDEAUX 1

ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES

Par El-Farouck MOUSTOIFA

DOCTEUR SPÉCIALITÉ : CHIMIE ORGANIQUE

NOUVEAUX OUTILS MOLÉCULAIRES DE DIAGNOSTIC DES ETAPES INVASIVES DES CANCERS.

Soutenue le 17 septembre 2010

Après avis de :

MME CAVELIER Florine Directrice de Recherche Rapporteur MME VIAUD-MASSUARD Marie-Claude Professeur à l’Université Tours Rapporteur

Devant la commission d'examen formée de

M. BRISSON Alain Professeur à l'Université Bordeaux 1 Examinateur MME CAVELIER Florine Directrice de Recherche CNRS Rapporteur M. DELERIS Gérard Professeur à l'Université Bordeaux 2 Examinateur MME FERY-FORGUES Suzanne Directrice de recherche CNRS Examinateur MME VIAUD-MASSUARD Marie-Claude Professeur à l'Université Tours Rapporteur

-2010-

Je dédie cette thèse à ma mère, Mme Zalihati ABDOU , qui a fait beaucoup de

sacrifices pour que son fils réussisse ses études. Egalement à Mme Zaharat BACARI qui

m’a acceuilli et soutenu durant mes études à l’île de la Réunion. Une pensée pour mon défun

oncle qui m’a toujours soutenu malgré la distance.

A ma famille, mon père, mes sœurs, Farianti, Naki, Asma, Satiz à Khayal et Raissa à

qui je souhaite la même réussite dans leur études respectives. A ma chérie Raya, merci pour

ton soutien dans la vie de tous les jours. A Fathema pour son amitié plus que durable. Merci à

ma tante Nadhufa pour avoir fait le déplacement pour ma soutenance. Merci à Rébecca et à

ma Juju. Petites dédicasses à tous mes petits de Bordeaux et à leurs parents. A mes cousins et

cousines, Tonton Ayé, Tonton Abdou, Tonton Soifiyoudine et à ma tante Zoubéda.

Je tiens à exprimer mes profonds remerciements et ma gratitude, aux membres du jury

qui m’ont fait l’honneur de juger mon travail. Je remercie également le Laboratoire de RMSB,

en la personne du Dr. Pierre VOISIN et du Dr. Philippe MELLET pour leur aide en

enzymologie.

Au Professeur Gérard DELERIS pour m’avoir accueillie au sein du Laboratoire de

Chimie Bio-organique UMR CNRS 5084 CNAB, ce fut pour moi un véritable plaisir de

travailler à ses côtés. Merci aux anciens membres du laboratoire, Karine, Victor, Nini, Cyril

P., Katia, Sébastien, Stéphanie (alias Speedy), Anne-Laure, Razia, Saidou, Yan, Mario, Marc,

Thomas, Asma, Emilie, Aurelie, Sandra M., Magali, Jacques. Aux nouveaux et actuels

membres Jean, Stéphane, Solène, Isabelle, Mireille, Carlos, Cyril R., Annie-Claude, à mon

poto Anis sans qui la vie au laboratoire serait triste, sans oublier Dominique.

A Sandra RUBIO qui m’a entourée, soutenue durant cette fin de thèse. Son

engagement m’a permis d’avancer efficacement et dans la bonne direction. Un grand merci à

Monsieur Arnaud, à qui j’ai peu de mot pour lui témoigner mon admiration.

Dédicasse à tous mes amis, de la Réunion, de Mayotte de France et du monde. Grand

merci à ceux qui se sont déplacé pour ma soutenance. A Edith, Karima, Tiavina, Alexandrine,

Emmanuelle, Gaelle, Mélanie, Célia, Paul, Souraya, Siti, Ibrahim, Iman, Shakila, Glad,

Kénédi, Chamra … Spéciale dédicasse à my Men, Titi l’imbécile, Firmin, Tristan « pbmf »,

Yves et à toute les donneuses de PES, on est ensemble.

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Abréviations ............................................................................................................................................ 9 INTRODUCTION GÉNÉRALE ........................................................................................................... 12 PARTIE 1 : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE ........................................................................................ 15

1. Le cancer. .................................................................................................................................. 16 2. Les différentes étapes de la progression tumorale : d’une cellule saine à une tumeur .............. 17

2.1. L’initiation ......................................................................................................................... 18 2.2. La promotion ..................................................................................................................... 18 2.3. La progression tumorale : Développement de la tumeur primaire. ................................... 19

2.3.1. La perte d’adhérence ................................................................................................. 20 2.3.2. L’invasion .................................................................................................................. 21 2.3.3. La prolifération .......................................................................................................... 21 2.3.4. L’angiogenèse tumorale ............................................................................................ 22 2.3.5. L’intravasation, l’extravasation et l’émission de métastases ..................................... 24

3. Le micro environnement tumoral. ............................................................................................. 28 3.1. Les composants cellulaires de l’environnement tumoral................................................... 29

3.1.1. La composante non-inflammatoire : Les fibroblastes tumoraux. .............................. 29 3.1.2. La composante inflammatoire de l’environnement tumoral ...................................... 30

3.1.2.1. Les macrophages associés aux tumeurs (MAT) .................................................... 30 3.1.2.2. Rôle des neutrophiles infiltrant la tumeur ............................................................. 31 3.1.2.3. Les lymphocytes intra-tumoraux ........................................................................... 32

3.2. La matrice extracellulaire (MEC) ...................................................................................... 34 3.2.1. Description des composants majeurs de la MEC. ..................................................... 34

3.2.1.1. Le collagène .......................................................................................................... 34 3.2.1.2. L’élastine ............................................................................................................... 39 3.2.1.3. La fibronectine ...................................................................................................... 40 3.2.1.4. La laminine ............................................................................................................ 41

3.2.2. Les protéoglycanes .................................................................................................... 41 3.3. Interaction de la matrice avec les cellules tumorales......................................................... 44

4. Les métalloprotéases (MMPs) : généralités .............................................................................. 48 4.1. Structures et fonctions biologiques des MMPs. ................................................................ 48

4.1.1. Le peptide signal........................................................................................................ 50 4.1.2. Le prodomaine et la séquence de coupure par la furine. ........................................... 50 4.1.3. Le domaine catalytique .............................................................................................. 52 4.1.4. La charnière ............................................................................................................... 53 4.1.5. Le domaine C-terminal de type hémopexine ............................................................. 53

4.2. Les différents groupes de MMPs ....................................................................................... 53 4.2.1. Les matrilysines ......................................................................................................... 53 4.2.2. Les collagénases interstitielles .................................................................................. 54 4.2.3. Les stromélysines ...................................................................................................... 54 4.2.4. Les gélatinases ........................................................................................................... 55 4.2.5. Les MMPs transmembranaires (MT-MMP) .............................................................. 55 4.2.6. Le groupe hétérogène ................................................................................................ 56

4.3. Fonction physiologique des MMPs. .................................................................................. 57 4.3.1. Régulation transcriptionnelle ..................................................................................... 57 4.3.2. Régulation post-transcriptionnelle ............................................................................. 58 4.3.3. Activation du zymogène. ........................................................................................... 58 4.3.4. Inhibition des MMPs ................................................................................................. 60

4.4. Expression des MMPs dans les processus tumoraux ......................................................... 62

sur 240

4.5. Rôle des MMPs. ................................................................................................................ 64 4.5.1. Dualité fonctionnelle des MMPs dans le développement et la survie des cellules cancéreuses ................................................................................................................................ 66 4.5.2. Dualité fonctionnelle des MMPs dans l’angiogenèse tumorale ................................ 67 4.5.3. Dualité fonctionnelle des MMPs dans l’émission de métastases et la différenciation cellulaire. ................................................................................................................................... 69 4.5.4. Dualité fonctionnelle des MMPs lors de la réponse du système immunitaire ........... 70

5. Les méthodes de détections de l’activité des MMPs. ................................................................ 73 5.1. Elaboration de nouveau substrat, plus sensible et plus sélectifs des MMPs...................... 75 5.2. Stratégie pour augmenter la stabilité et la spécificité des substrats fluorescents. .............. 79 5.3. Utilisation des substrats de métalloprotéases dans des systèmes de DRUG DELIVERY. 81

6. Conclusions. .............................................................................................................................. 85 Références ............................................................................................................................................. 87 PARTIE 2 : RÉSULTATS .................................................................................................................. 104

1. Synthèses. ................................................................................................................................ 108 1.1. Synthèse des acides aminés modifiés .............................................................................. 108

1.1.1. Synthèse des sondes fluorescentes. ......................................................................... 108 1.1.2. Synthèse des lysines modifiées ............................................................................... 109

1.2. Utilisation des acides aminés modifiés en synthèse peptidique en phase solide (SPPS)....... ......................................................................................................................................... 112

1.2.1. Synthèse des substrats linéaires. .............................................................................. 112 1.2.2. Synthèse des substrats cycliques. ............................................................................ 114

1.2.2.1. Cyclisation sur support solide. ............................................................................ 117 1.2.2.2. Cyclisation en solution. ....................................................................................... 122

2. Tests enzymatiques. ................................................................................................................. 126 2.1. Clivage des substrats linéaires. ........................................................................................ 128 2.2. Clivage des substrats cycliques. ...................................................................................... 136 2.3. Evaluation de la stabilité des peptides en présence d’un échantillon plasmatique. ......... 140

3. Etudes préliminaires pour la conception de systèmes supramoléculaire de libération contrôlée. 145

3.1. Synthèse des dérivés de la DAC et de la MC. ................................................................. 149 3.2. Détermination des propriétés physico-chimiques des complexes d’inclusion. ............... 151

3.2.1. Détermination de la stœchiométrie des complexes. ................................................ 152 3.2.1.1. Etude de la stœchiométrie de complexation des composés 7 et 8 par la RMN. .. 155 3.2.1.2. Etude de la stœchiométrie de complexation des composés pDAC et pMC par RMN. ............................................................................................................................. 161 3.2.1.3. Etude de la stœchiométrie de complexation du composé 10 et du peptide S1. ... 164

3.2.2. Détermination de la constante d’association par : approche de Benesi-Hildebrand. ..... ................................................................................................................................. 167

3.2.2.1. Détermination par RMN des constantes d’association, sur les modèles comprenant une seule coumarine. ........................................................................................................... 169 3.2.2.2. Détermination par RMN des constantes d’association du composé 10 et du peptide S1. 172 3.2.2.3. Détermination de la stœchiométrie de complexation par fluorescence. .............. 176 3.2.2.4. Détermination par fluorescence des constantes d’association sur les modèles comprenant une seule coumarine. ....................................................................................... 177 3.2.2.5. Détermination par fluorescence des constantes d’association des composés 10 et S1. ............................................................................................................................. 181

sur 240

3.2.2.6. Détermination par fluorescence des constantes d’association des peptides linéaires S2, S9 et des peptides cycliques Sc1, Sc2 et Sc9. ............................................................... 184

CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES .......................................................................... 190 Références. .......................................................................................................................................... 193 PARTIE EXPERIMENTALE ............................................................................................................. 196 ANNEXE ............................................................................................................................................ 240

sur 240

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Abréviations

Abz Acide o-aminobenzoique ACE Angiotensin-Converting Enzyme ADAMT A Disintegrin and Metalloproteinase with Thrombospondin motifs ADN Acide DésoxyriboNucléique APMA Aminophenyl Mercurique Acid ARNm Acide RiboNucléique messager bFGF basic Fibroblast Growth Factor BMP1 Bone Morphogenetic Protein-1 Boc tert-butyloxycarbonyl CA-MMP Cystein-Array Matrix Metalloporteinase CD Cyclodextrine CD4 Cluster de Différentiation 4 Cdk Cyclin dependent kinases CE Cellule endothéliale COSY COrrélation SpectroscopY CS Chondroïtine Sulfate CXC Chimiokines Dabcyl Acide 4-(4’-diméthylaminophénylaza) benzoique DAC 7-diéthylaminocoumarine DCC N, N’-dicyclohexylcarbodiimide DCM Dichlorométhane DCU Dicyclohexylurée DIEA N,N-Diisopropylethylamine DMC (6,7-diméthoxycoumarin-4-yl) acétyle DMF N, N’-diméthylformamide DMSO Diméthylsulfoxyde Dnp Dinitrophényle Dns Dansyle Dpa N-3-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropyle DS Dermatane Sulfate EDANS Acide 5-(2’-aminométhyl) naphtalène sulfonique EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide EDTA 2K Ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium salt EGF Epidermal Growth Factor EMMPRIN Extracellular Matrix MetalloPRoteinase INducer EMT Epidermal to Mesenchymal Transition ERBB4 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 ESI Electrospray Ionisation FACITs Fibril-Associated Collagens with Interrupted Triples -Helices FITC Fluorescéine IsoThioCyanate Fmoc Fluorenylmethyloxycarbonyl

sur 240

FRET Fluorescence Resonance Energy Tranfer GAGs Glycosaminoglycanes G-CSF Granulocyte Colony-Stimulating Factor GM-CSF Granulocyte MacrophageColony-Stimulating Factor HA Hyaluronique Acide HB-EGF Heparin Binding Epidermal Growth Factor

HBTU 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate

HGF/SF Hepatocyte Growth factor Stimulating Factor HIV Human immunodeficiency virus HMPB-BHA Acide 4-hydroxyméthyl-3-méthoxyphénoxybutanoïque HOBt N-hydroxy-benzotriazole HP Héparine HPLC High-Pressure Liquid Chromatography HS Héparane Sulfate HSP47 Heat-Shock Protein 47 HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HTLV Human T-lymphotropic virus Hz Hertz IFN Interféron IGF II Insulin-like Growth Factor II IGFBP-3 Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 IL-X Interleukin X IR Infrarouge Kcat Constante catalytique KGF Keranocyte Growth Factor Km Constante de Michaelis-Menten KO Knock-Out KS Kératane Sulfate MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight MAT Macrophages Associés aux Tumeurs MC 7-méthoxy-coumarin Mca (7-méthoxycoumarin-4-yl) acétyle MCP-3 Monocyte Chemoattractant Proteine MEC Matrice extracellulaire MMP Matrix Metalloporteinase MT-MMP Membrane-Type Matrix Metalloporteinase NBD Acide 6-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino hexanoique NEP Neprilysin NGF Nerve Growth factor NK Natural Killer NMM N-méthyl morpholine NMP N-méthyl-2-pyrrolidone OtBu tertiobutyl ester PACE Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme PGE2 Prostaglandine E2

sur 240

PPh3 Triphénylphosphine RECK Reversion inducing Cysteine-rich protein with Kazal motifs RET Resonance Energy Tranfer RGD Arginine Glycine acide Aspartique RMN Résonance magnétique nucléaire RP-HPLC Reversed Phase High Pressure Liquid Chromatography SPPS Synthèses Peptidiques en Phase Solide TA Température Ambiante TAM Tumor-Associated Macrophages TEG Tétraéthylène glycol TFA Acide trifluoroacétique TGF-β Transforming Growth Factor TIMP Tissue Inhibitors of Metalloproteinases TIS Triisopropylsilane TMS Tétraméthylsilane TNF-α Tumor Necrosis Factor TRIS Trishydroxyméthylaminométhane UV Ultra Violet VEGF Vascular Endothelial Growth Factor Vmax Vitesse maximale

INTRODUCTION GÉNÉRALE

sur 240



sur 240

Les thérapies anticancéreuses actuelles sont extrêmement lourdes pour les patients. En

général, après ablation du tissu lésé, une chimiothérapie est nécessaire afin de tenter

d’éliminer les dernières cellules malignes. Malheureusement, les traitements sont peu sélectifs

et engendrent des effets secondaires néfastes sur les tissus sains environnants. Afin

d’améliorer la lutte contre le cancer, deux stratégies peuvent être envisagées : rendre les

traitements plus sélectifs ou diagnostiquer à des stades plus précoces l’apparition d’un cancer.

Ceci implique une thérapie ciblée sur des étapes clés de la progression tumorale et aussi le

développement d’outils pour imager certaines de ces étapes comme la formation de nouveaux

vaisseaux sanguins permettant le développement des tumeurs, la néoangiogenèse.

Notre travail a été réalisé dans l’UMR CNRS 5084 CNAB et plus particulièrement au

sein du Groupe de Chimie Bioorganique, implanté à l’Université Victor Segalen Bordeaux 2.

L’activité du Laboratoire de Chimie Bioorganique a pour axe principal la synthèse de

molécules originales à finalité thérapeutique ainsi que la conception et l’évaluation de

systèmes permettant d’imager l’angiogenèse tumorale et d’autres étapes de la progression

tumorale.

Les travaux que nous présentons dans ce mémoire portent sur la synthèse et

l’évaluation de molécules originales capables de détecter l’activité d’une famille d’enzymes

protéolytiques fortement impliqués dans les étapes invasives du cancer. La finalité de ce

travail est d’utiliser ces substrats afin de réaliser des systèmes macromoléculaires capables de

libérer in situ des principes actifs. La libération sera initiée par une activation protéolytique.

Dans une première partie, nous présenterons une étude bibliographique sur le cancer,

les métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMPs) et leur implication dans les

processus tumoraux. Les différents substrats naturels et artificiels seront envisagés. Nous

discuterons aussi de l’utilisation des substrats dans des systèmes de libération contrôlée de

principes actifs.

Ces informations nous permettront de présenter notre approche dans une deuxième

partie.

Celle-ci se divise en 3 chapitres :

Le premier chapitre est consacré à la synthèse des molécules originales que nous avons

conçues.


sur 240

Le deuxième chapitre porte sur l’étude de leur comportement in-vitro vis-à-vis des

enzymes concernés.

Le troisième et dernier chapitre sera consacré à une étude préliminaire sur la

conception de systèmes supramoléculaires de libération contrôlée de principes actifs.

Puis nous présenterons nos conclusions et les ouvertures que nos résultats permettent

d’envisager.

PARTIE 1 : ÉTUDE BIBLIOGRAPHIQUE

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1. Le cancer.

"Cancer" est un terme général appliqué à un grand groupe de maladies qui peuvent

toucher n'importe quelle partie de l'organisme. Les termes de tumeurs malignes ou de

néoplasmes malins sont aussi souvent employés. L'un des traits caractéristiques du cancer est

la prolifération rapide de cellules anormales qui, au-delà de leur délimitation normale,

peuvent envahir des parties du corps adjacentes et essaimer dans d'autres organes formant des

métastases.

Les données statistiques présentées ici recouvrent l’ensemble du territoire national sur

la période 1970-2005. Le nombre de nouveaux cas de cancer était estimé à près de 180 000

chez les hommes et 140 000 chez les femmes. En 2005, les 3 cancers les plus fréquents chez

l’homme étaient le cancer de la prostate, du poumon et du colon-rectum avec respectivement

62 000, 24 000 et 20 000 nouveaux cas. Chez la femme, les 3 cancers les plus fréquents

étaient le cancer du sein, du colon-rectum et du poumon avec respectivement 50 000, 17 500

et 7 000 nouveaux cas.

Le nombre de décès par cancer en 2005 a été estimé à 146 000, traduisant une

augmentation de 13% depuis 1980. Cette augmentation de la mortalité n’est liée qu’aux

changements démographiques (augmentation et vieillissement de la population française), et

le risque de mort par cancer a en réalité diminué entre 1980 et 2005, en moyenne de -1,1% par

an chez l’homme et -0,9% chez la femme. La diminution est encore plus marquée ces 5

dernières années, respectivement -2,5% et -1,2%.

Ces valeurs statistiques ont beaucoup évolué. Les méthodes de dépistages et de

traitements évoluent grâce à une meilleure compréhension de la pathologie.

Le Tableau 1 résume l’analyse de l’ensemble des données épidémiologiques

disponibles permettant de relier les fractions de l’ensemble des cancers apparus en France, en

2000, aux différents cancérogènes avérés1, 2.

Chez les hommes, le tabac et l’alcool restent, malgré les progrès effectués, les

principales causes, même si la baisse de leur consommation a réduit l’incidence de plusieurs

cancers. La mortalité par cancer du poumon a diminué de plus de 12 % depuis 1990.


sur 240

Tableau 1. Nombre de cas de cancer (N) et pourcentage de tous les cancers (%) attribués aux

différents facteurs en France en 2000 (attention ces chiffres ne peuvent pas s’additionner)

Facteurs de risque a

Homme Femme Deux sexes

N % N % N %

Tabac 43466 27 7095 6,1 50562 18,2

Alcool 17398 10,8 5272 4,5 22670 8,1

Agents infectieux 4206 2,6 4871 4,2 9077 3,3

Obésité et surpoids 2293 1,4 3936 3,4 6229 2,2

Insuffisance activité physique 780 0,5 5058 4,3 5838 2,1

Exposition aux UV 2380 1,5 3234 2,8 5614 2

Traitement hormonaux - - 5159 4,4 5159 1,9

Professionnel 4012 2,5 316 0,3 4328 1,6

Facteurs de reproduction § - - 2260 1,9 2260 0,8

Polluants b 243 0,1 174 0,1 217 0,1

a Classé selon le nombre de cas de cancer dans les deux sexes – § Variation concernant les facteurs liés à la

reproduction entre 1980 et 2000. b En ne tenant compte que des agents cancérogènes reconnus (classe I). Si

l’effet cancérogène de la pollution atmosphérique, notamment celui de particules fines qui est actuellement

fortement suspecté, était confirmé et si 50 % des français y étaient exposés avec une augmentation du risque de

cancer du poumon de 7 %, ce pourcentage atteindrait 0,83 % chez les hommes et 0,4 % chez les femmes. Soit

près de 1 %.

Chez les femmes, le cancer du poumon est actuellement la deuxième cause de

mortalité par cancer, derrière le cancer du sein mais avant les cancers colorectaux. Par contre,

son incidence a fortement crû avec la hausse du tabagisme féminin. Elle est favorisée par les

bronchites chroniques 3.

2. Les différentes étapes de la progression tumorale : d’une cellule saine à une

tumeur

Une cellule saine se caractérise par son organisation et son intégration au sein d’un

tissu. Chaque unité est en étroite relation avec la cellule voisine et avec le milieu environnant,

ce qui permet aux tissus de remplir correctement leurs fonctions. Nous allons ici détailler les

différentes étapes conduisant à l’état pathologique. L’initiation et la promotion sont les deux


sur 240

étapes clés avant la progression tumorale. Elles permettent le passage de la cellule saine

"sous contrôle" à une cellule cancéreuse qui évoluera par la suite en tumeur.

2.1. L’initiation

Elle est due à l’altération du génome rendant les cellules capables de se diviser en

l’absence d’une stimulation venue du tissu. Ces altérations de l’ADN peuvent être causées par

un génotoxique d’origine endogène ou encore exogène. Certaines Espèces Réactives de

l’Oxygène qui se forment lors du métabolisme sont des agents d’oxydation extrêmement

puissants 4-11. Ils attaquent les constituants cellulaires 12 et provoquent chaque jour dans

chaque cellule de très nombreuses lésions de l’ADN dont quelques une très graves telles que

des cassures double-brins ou des pontages intra- ou interbrins 13.

Les génotoxiques exogènes tel que les UV peuvent aussi provoquer ces dégradations.

Une stimulation de la prolifération peut entraîner un accroissement de la fréquence des

mutations 14-16. Des erreurs peuvent survenir pendant la réplication de l’ADN et la mitose.

L’initiation est un événement relativement fréquent contre lequel existent des

protections cellulaires multiples et puissantes. L’efficacité de ces défenses est un facteur

essentiel. Quand le nombre de lésions est faible, des mécanismes de réparation de l’ADN se

mettent en place. Des exonucléases et endonucléase vont couper l’ADN muté, ensuite l’ADN

polymérase et l’ADN ligase vont se charger de resynthétiser la zone éliminée. Quand le

nombre de lésions est trop important, ces systèmes enzymatiques de réparation de l’ADN 17

ne peuvent pas fonctionner correctement. Ceci se produit lorsque le génotoxique est présent

de manière répétée et à forte concentration. Tant que fonctionnent les mécanismes de

régulation de l’homéostasie cellulaire, ces cellules initiées (possédant de l’ADN muté)

peuvent encore rester sous contrôle. En effet cet équilibre cellulaire dynamique assure

l’intégrité de la cellule en compensant les dysfonctionnements liés aux mutations. Lorsque cet

équilibre est rompu, la cellule peut rentrer dans une phase de mort cellulaire programmée

(apoptose) ou bien poursuivre son évolution.

2.2. La promotion

Celle-ci est liée à l’induction d’une prolifération cellulaire qui provoque l’expansion

clonale de la cellule initiée, soit que ce clone soit plus sensible que les cellules saines aux

facteurs de croissance présents, soit que l’apoptose y soit diminuée.


sur 240

La plupart des agents de promotion stimulent la prolifération, mais souvent de façon

temporaire ou réversible. L’irritation mécanique prolongée 18 et l’inflammation 19 sont des

promoteurs puissants. Les génotoxiques, à côté de leur effet mutagène, peuvent constituer des

agents de promotion car, administrés en quantité importante, ils provoquent des lésions

irréversibles conduisant à la mort d’une proportion élevée de cellules. L’intensité des

événements dépend de la dose des agents de promotion, car ces derniers fonctionnent par effet

seuil. Les lésions causées peuvent être réversibles quand l’exposition est faible. Par contre la

présence chronique ou itérative de l’agent promoteur pendant cette phase peut conduire à des

lésions précancéreuses qui persistent ou continuent à croitre malgré l’interruption de

l’exposition. Elle devient autonome. La deuxième phase de la cancérogenèse a alors été

accomplie. Celle-ci se termine quand un clone de cellules initiées est devenu capable

d’échapper au contrôle tissulaire pour entrer dans la troisième phase : la progression tumorale.

2.3. La progression tumorale : Développement de la tumeur primaire.

Les deux premières étapes (initiation et promotion) concernent la cancérogenèse, c’est

à dire l’apparition de la malignité au sein même de la cellule. L’accumulation des lésions de

l’ADN conduisent à une instabilité génétique des cellules cancéreuses qui permet la

génération et la survie de cellules mutantes présentant des avantages sélectifs de prolifération

et d’immortalité. A partir cette transformation, sept étapes peuvent être distinguées dans le

processus tumoral : la perte d’adhérence, l’invasion, la prolifération, l’angiogenèse,

l’intravasation, l’extravasation et l’émission de métastases à partir de la tumeur primaire

(Fig. 1).


sur 240

Figure 1. Les différentes étapes de la progression tumorale 20

2.3.1. La perte d’adhérence

Ayant acquis la capacité d’échapper à tout contrôle tissulaire, la cellule mutée débute

sa prolifération. Celle-ci commence par une déstructuration du tissu environnant. Des

protéases sont alors exprimées afin de digérer les protéines responsables de l’adhérence

intercellulaire et de permettre ainsi de dissocier les épithéliums. Ces enzymes, par leur action

de dégradation, vont aussi stimuler l’expression de gènes promoteurs du cancer. La digestion

de la ε-cadhérine (protéine intercellulaire) va provoquer l’activation de la β-caténine (proteine

intracellulaire) et sa migration vers le noyau où elle va promouvoir la division cellulaire 21, 22.

La β-caténine et la ε-cadhérine font partie des protéines d’adhésion cellulaire qui participent

au comportement de la cellule et notamment au phénomène d’inhibition de contact (Fig. 2).

Ce processus empêche la cellule de proliférer lorsqu’elle est en contact avec une autre cellule.

Cette perte d’adhérence cellulaire prépare alors le tissu pour l’invasion.


sur 240

Figure 2. La β-caténine et la ε-cadhérine dans l’adhésion cellulaire

2.3.2. L’invasion

La destruction du tissu sain environnant passe aussi par la dégradation du support qui

en assure l’intégrité : la membrane basale de la matrice extracellulaire (MEC). Tous les tissus

épithéliaux reposent sur une membrane basale qui les sépare du tissu conjonctif sous-jacent.

Elle sert de moyen d'ancrage aux cellules épithéliales, de filtre pour leur nutrition grâce à sa

perméabilité et représente de surcroît une barrière physiologique extrêmement importante

dans la progression tumorale. Les protéases nécessaires à cette invasion sont souvent

produites non pas par les cellules tumorales mais par les cellules du stroma (cellules saines se

trouvant à la périphérie de la tumeur naissante) stimulées spécifiquement par les cellules

cancéreuses 23-27. Après dégradation des constituants de la matrice extracellulaire, les cellules

malignes peuvent alors proliférer.

2.3.3. La prolifération

Les mécanismes à l’origine de cet effet impliquent tout d’abord plusieurs facteurs de

croissance, mais aussi des cytokines et leurs récepteurs. Ces facteurs sont sécrétés par les

cellules tumorales et ainsi libérés lors de la protéolyse engagée dans les étapes précédentes.

Plusieurs protéases telles que les métalloprotéases, sont capables de digérer des protéines

extracellulaires qui séquestrent les facteurs de croissance. C’est le cas de l’IGFBP-3 (insulin-

like growth factor binding protein 3) qui se lie à l’IGF II (insulin-like growth factor II) ou du

perlécan qui séquestre le bFGF (basic fibroblast growth factor). Ces facteurs quiescents, ainsi


sur 240

libérés, associés aux facteurs sécrétés, peuvent interagir avec leurs cibles (récepteurs,

enzymes…) et déclencher des voies de signalisation cellulaire ou des voies métaboliques

intervenant dans ce processus de prolifération. L’expansion de la tumeur primaire devient

alors possible. Celle-ci serait néanmoins très limitée si elle ne s’accompagnait d’une extension

du réseau vasculaire, appelé angiogenèse.

2.3.4. L’angiogenèse tumorale

L’angiogenèse est un processus dynamique grâce auquel de nouveaux capillaires

sanguins sont formés par excroissance ou bourgeonnement de vaisseaux préexistants. Ce

phénomène diffère de la vasculogenèse, qui résulte de la différenciation des angioblastes

pendant l’embryogenèse pour former les vaisseaux sanguins primitifs. Le terme

néovascularisation s’applique aux deux processus. L’angiogenèse (ou néoangiogenèse)

comprend plusieurs étapes (Fig. 3):

� L’activation de cellules endothéliales (CE) par différents médiateurs (cytokines

ou encore VEGF (Vascular endothelial growth factor))28.

� L’hyperperméabilité des vaisseaux accompagnant l’angiogenèse.

� La pénétration par les CE de la membrane basale grâce à des enzymes

protéolytiques (collagénase, activateur tissulaire du plasminogène,etc.).

� La prolifération des CE.

� La migration des CE vers la source du stimulus angiogénique (chimiotactisme).

� La sécrétion de composants de la membrane basale menant à terme à la

formation du nouveau réseau capillaire.


sur 240

Figure 3. Différentes étapes d’activation du processus angiogénique 29.

Les cellules endothéliales sont quiescentes chez l’adulte, leur renouvellement peut

excéder 1 000 jours : 0,01 % d’entre elles sont en division à un instant donné. La

néovascularisation physiologique (régénération de la muqueuse utérine, formation du corps

jaune et du placenta, embryogenèse, réparation tissulaire lors de blessures et en cas

d’ischémie cardiaque et périphérique) est finement régulée et le processus est autolimité. Les

CE prolifèrent avec un temps de renouvellement réduit à cinq jours 30. Au cours de

l’angiogenèse pathologique, l’activation est prolongée dans le temps, comme résultat d’une

perturbation de l’équilibre entre facteurs angiogéniques et angio-inhibiteurs (Tableau 2).


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Tableau 2. Exemple de facteurs modulant l’angiogenèse (Extrait de 29)

Facteurs Angio-inhibiteurs Facteur angiogéniques

Acide hyaluronique de haut poids moléculaire Acide hyaluronique de bas poids moléculaire

Acide rétinoïque Angiogénine

Angiostatine Angiopoéïtine

Endostatine Chimiokines C-X-C

Fragments de l’EGF(Epidermal growth factor) EGF (Epidermal growth factor)

TIMP (Inhibiteur tissulaire des métalloproteases) Métalloprotéases matricielles

Thrombospondine I Prostaglandines E

Prolactine VEGF (vascular endothelial growth factor)

Héparines et polysaccharides extraits de l’héparine TGF-β (transforming growth factor)

TNF-α TNF-α (tumor necrosis factor)

Ce processus physiologique est extrêmement important car au cours de la progression

tumorale, les tissus cancéreux sont soumis à une hypoxie profonde, dès qu’ils sont distants de

100 à 200 µm d’un vaisseau 31 et qu’ils atteignent une certaine taille (2 à 3 mm3). Cette

situation induit des facteurs de transcription responsables de la production d’enzymes

(aldolase A, lactate déshydrogénase A, phosphofructokinase L, phosphoglycérate kinase-1 et

pyruvate kinase M), ainsi que du VEGF 32-34. Il s’en suit un développement cellulaire puis un

bourgeonnement des CE vers la zone de production de ces facteurs pro-angiogénique,

aboutissant à la formation de nouveaux capillaires. Ces capillaires vont représenter une voie

d’approvisionnement en nutriment pour le développement de la tumeur primaire mais surtout

un accès au système vasculaire pour les cellules cancéreuses dans la colonisation du reste de

l’organisme.

2.3.5. L’intravasation, l’extravasation et l’émission de métastases

L’intravasation, c'est-à-dire la pénétration de cellules tumorales dans les vaisseaux

sanguins (Fig. 4), est une étape importante dans la formation des métastases. Elle commence

par une migration des cellules tumorales vers la paroi des vaisseaux. Des macrophages

associés aux tumeurs (TAM : Tumor-Associated Macrophages) vont générer un gradient de


sur 240

facteurs comme l’EGF, de la tumeur vers les vaisseaux et ainsi promouvoir le passage de la

paroi de l’endothélium vasculaire 35-37.

Figure 4. Voyage des cellules tumorales de la zone tumorale primaire au site métastatique 35.

Comme pour l’étape d’invasion des protéases sont libérées dans le but de digérer la

MEC et la membrane basale. Les cellules tumorales atteignent alors les cellules endothéliales

et pénètrent dans le système sanguin. Il a aussi été démontré que certaines cellules tumorales

mimaient les cellules endothéliales en formant une paroi et pouvaient ainsi entrer dans le

système vasculaire 38.

Des millions de cellules tumorales sont libérées par jour dans la circulation sanguine.

Ces cellules sont pour la plupart fragmentées et détruites dès leurs entrée dans les vaisseaux

sanguins par les forces de frottement (sheer force) liées à la circulation sanguine et par le

phénomène d’anoikis (déclenchement de l’apoptose suite à la perte de contact de la cellule

avec la matrice extracellulaire 39-41). Seule une faible proportion de cellules tumorales va

survivre dans le système vasculaire. Ceci démontre que l’étape d’intravasation n’est pas

l’étape limitante contrairement à la survie des cellules dans le système vasculaire 36, 42, 43.

Une fois arrivée au lieu de résidence secondaire, la cellule va s’accrocher à la paroi de

l’endothélium vasculaire et interagir avec les plaquettes se protégeant ainsi du phénomène

d’anoikis et des forces de frottement. Elle synthétise alors de l’angiopoeitin-like 4 (une

protéine multifonctionnelle) qui va fragiliser l’endothélium vasculaire et faciliter

l’extravasation (la traversée de la cellule tumorale vers le tissu). Cette protéine, en se fixant à


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son récepteur, participe au détachement des cellules musculaires lisses de la matrice

extracellulaire et facilite ainsi la migration des cellules endothéliales 44. Cette étape intervient

quelques heures après l’attachement, elle dépend de l’intégrine αvβ3 (récepteur de l’adhésion

cellulaire) 45, 46 et de l’ezrine (protéine reliant la membrane plasmique au cytosquelette) qui

serait responsable de la suppression du phénomène d’anoikis 47. Des leucocytes sont recrutés

et seraient les premières cellules à pénétrer la paroi 48. Arrivée au site secondaire une grande

proportion de cellules entre en apoptose dans les 24 heures49, 50. Les survivantes vont soit

entrer dans une phase de latence (Dormant) 51-56 ou bien proliférer jusqu’à former une

nouvelle croissance tumorale à distance du site primaire : la métastase 49 (Fig. 5).

Figure 5. Evolution d’une métastase

Cette dernière étape obéit aux mêmes lois que la progression de la tumeur primaire

(invasion, prolifération etc.). Le lieu de résidence secondaire dépend préférentiellement du

type de cancer :

- cancer du sein : os, foie, poumons et cerveau

- cancer de la prostate : os

- cancer colorectal : foie

Ce processus métastatique est une étape lente dans la progression tumorale57, 58. Une

faible proportion de cellules libérées dans le sang va atteindre un site de développement

secondaire et le temps de croissance est similaire à celui de la tumeur primaire.


sur 240

Dans toutes les étapes de l’évolution d’une cellule tumorale unique à une tumeur

et ses métastases, l’environnement de la cellule tumorale est crucial pour sa survie et sa

croissance. A ce titre le microenvironnement tumoral est devenu une cible privilégiée

pour la détection mais aussi pour le traitement des cancers. Il devient alors important

d’en étudier les différents éléments et leurs implications dans la survie et l’évolution de

la tumeur.


sur 240

3. Le micro environnement tumoral.

Environnement, microenvironnement ou stroma sont des termes utilisés de manière

indifférenciée dans la littérature. Nous utiliserons ces termes sans distinction sémantique pour

nous référer aux éléments de la tumeur à l’exclusion des cellules tumorales elles-mêmes, ce

qui inclut :

� les cellules non-cancéreuses présentes au niveau de la tumeur (cellules

endothéliales, fibroblastes et cellules inflammatoires)

� les éléments acellulaires de la matrice extracellulaire

� les médiateurs solubles de cet environnement (enzymes et facteurs de

croissance)

L’environnement tumoral fait partie intégrante de la néoformation tumorale dont il

représente la partie non épithéliale. Il se constitue d’une composante cellulaire (fibroblastes,

cellules immunes et vaisseaux) et d’une composante extracellulaire comprenant des protéines

et des carbohydrates ainsi que des protéoglycanes (Fig.6). Tous ces éléments interagissent

entre eux via les facteurs de croissance, les cytokines et les molécules d’adhésion. Les

interactions dynamiques entre les cellules épithéliales et stromales représentent un point clé

dans des processus aussi différents que l’adhésion, la prolifération, la différentiation et la

migration cellulaire.


sur 240

Figure 6. Le microenvironnement tumoral

3.1. Les composants cellulaires de l’environnement tumoral.

Le microenvironnement est un milieu complexe par sa composition mais aussi par son

rôle. La grande majorité des éléments présents sont synthétisés par les cellules non-

inflammatoires : les fibroblastes. D’autres cellules dites inflammatoires sont impliquées dans

la réponse immunitaire et la croissance tumorale.

3.1.1. La composante non-inflammatoire : Les fibroblastes tumoraux.

Ils constituent la composante cellulaire la plus importante du microenvironnement

tumoral.

Ils sont inclus dans la matrice extracellulaire et sont en grande partie responsables de

la synthèse de celle-ci. Les fibroblastes synthétisent les composants de la matrice

extracellulaire comme les collagènes (type I, III, V) et la fibronectine. Ils contribuent

également à la synthèse des membranes basales en secrétant la laminine et le collagène IV.

Les fibroblastes sont impliqués dans le contrôle de la différenciation épithéliale, la régulation

de l’inflammation locale et dans les processus de remodelage tissulaire 59, 60. Ils sont une

source importante de métalloprotéases, qui sont responsables du remaniement de la matrice


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extracellulaire, processus impliqué dans le développement tissulaire normal 61 mais aussi dans

la cancérogenèse 62, 63.

Le stroma normal contient un nombre réduit de fibroblastes. Le stroma réactionnel des

tumeurs contient un nombre plus élevé de ces cellules 64, 65. Ces fibroblastes sont dénommés

myofibroblastes car ils expriment l'actine alpha des muscles lisses. Ils ont un phénotype

anormal, une sécrétion de facteurs de croissance spécifiques, une motilité anormale et un taux

de prolifération plus élevé 66-69. Ces fibroblastes anormaux jouent un rôle dans les processus

d'invasion et de métastase. Il a été démontré que le développement de cellules tumorales était

favorisé par la présence de ces myofibroblastes. Lorsque ces myofibroblastes étaient

remplacés par des fibroblastes sains le développement était moins important 70. Ceci indique

que les fibroblastes normaux sont nécessaire au maintien de l’homéostasie (l’équilibre

physiologique) épithéliale tandis que les fibroblastes tumoraux (ou « seulement » anormaux)

ont le pouvoir d’initier et de promouvoir les altérations qui aboutiront à la formation de

tumeurs par les cellules épithéliales. Ils permettent l’acquisition d’un phénotype invasif à des

cellules tumorales 71.

3.1.2. La composante inflammatoire de l’environnement tumoral

Le microenvironnement tumoral comprend également des cellules inflammatoires

pouvant avoir une action pro-tumorale ou anti-tumorale. Ces cellules sont issus de la lignée

myéloïde (neutrophiles, macrophages, cellules dendritiques, mastocytes et éosinophiles) ainsi

que de la lignée lymphoïde (lymphocytes) 72.

3.1.2.1. Les macrophages associés aux tumeurs (MAT)

Les macrophages sont des cellules infiltrant les tissus. Ils proviennent de la

différenciation de leucocytes sanguins, les monocytes. Les monocytes et les macrophages sont

des phagocytes (cellules capables d’engloutir, d’absorber des éléments). Leur rôle est

d’absorber les débris cellulaires et les pathogènes. Les macrophages tissulaires ont des

fonctions cytotoxiques et participent au remodelage tissulaire. Ils secrètent également un

éventail large de cytokines, de facteurs de croissance et de protéases.

Le processus inflammatoire est initié par les macrophages résidant dans les tissus en

réponse à une stimulation locale bactérienne, chimique ou mécanique. Les macrophages, par

leurs fonctions cytotoxiques peuvent intervenir dans l’immunité anti-tumorale. Néanmoins,


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pour que ces cellules deviennent cytotoxiques, elles ont besoin d’être activées. La toxicité des

macrophages peut être obtenue directement ou être médiée par les anticorps. Malgré tout, les

cellules tumorales étant initialement des cellules du « soi », l’immunogénicité reste modeste.

Les tumeurs sont capables de modifier le profil de cytokines sécrétées par les

macrophages, de diminuer leur sécrétion de cytokines cytotoxiques ou de cytokines induisant

l’apparition de macrophages ayant un effet suppresseur 73. Ainsi, la sécrétion de l’IL-10 et de

prostaglandine E2 (PGE2) participe à la suppression de la réponse immune anti tumorale 73.

Ce type cellulaire est très important pour la croissance des cellules cancéreuses 74.

Les macrophages soutiennent la croissance tumorale par leur capacité d’intervenir

dans le remodelage tissulaire, la production de facteurs de croissance et de facteurs

proangiogéniques 19. Dans les étapes initiales de la tumorogenèse, ils sont retrouvés au niveau

de la membrane basale dans les zones de discontinuité de celle-ci. Leur présence dans les

tumeurs avancées au niveau du front d’invasion a été démontrée 74. Ceci suggère que les

tumeurs exploitent les capacités des macrophages à dégrader la matrice extracellulaire,

augmentant ainsi les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales 75-77. Les

macrophages facilitent l’exode des cellules cancéreuses de la tumeur primitive, la pénétration

dans les vaisseaux (étape intravasation)77 et contrôlent la migration et l’extravasation des

cellules tumorales 75.

Les macrophages sont également impliqués dans le processus d’angiogenèse. Les

études sur les tumeurs humaines montrent qu’il existe une association entre la densité

macrophagique locale et l’angiogenèse quantifiée par la densité micro-vasculaire 78, 79. Dans

certains modèles de cancer du sein la déplétion en macrophages réduit le switch angiogénique

et le remodelage vasculaire 74. Les macrophages produisent des facteurs angiogéniques

comme le VEGF, l’endothéline-2, l’activateur du plasminogène (uPA) 76, 80-82 et des facteurs

inducteurs comme l’IL-1 qui stimulent la transcription du VEGF 83. Les signaux dérivés de la

tumeur semblent recruter une population macrophagique particulière (exprimant le marqueur

endothelial Tie2) qui est responsable du processus d’angiogenèse. La déplétion de cette

population réduit l’angiogenèse et génère une régression tumorale 84.

3.1.2.2. Rôle des neutrophiles infiltrant la tumeur

Les neutrophiles représentent une autre population cellulaire qui est recrutée

précocement dans le processus inflammatoire. Ils ont une fonction cytotoxique importante


sur 240

(notamment dans les processus de rejet de greffe) et sont considérés comme des effecteurs

importants de l’immunité innée anti-tumorale.

Les neutrophiles ont néanmoins été associés au processus d’instabilité génétique des

tumeurs 85. Dans les modèles animaux, l’élimination des neutrophiles par un anticorps

monoclonal freine la croissance tumorale suggérant une action pro-tumorale de cette

population 86. Cette action pro-tumorale serait médiée par le recrutement actif de neutrophiles

par la tumeur via des chimiokines (CXC) 87 et l’inhibition de leur apoptose par l’intermédiaire

des facteurs de croissance hématopoïétiques (G-CSF et GM-CSF) produits par la cellule

tumorale 88. Ces neutrophiles produisent des facteurs de croissance (comme le HGF/SF) qui

augmentent la capacité de migration (et d’invasion locale) des cellules tumorales. Ils

participent aussi au processus d’angiogenèse par la production de VEGF et d’IL-8 89 et par

l’activation des métalloprotéases 90.

Malgré ces éléments, d’autres études montrent que les neutrophiles interviennent dans

la réponse anti-tumorale. Ainsi la déplétion des neutrophiles augmente l’efficacité des

carcinogènes chimiques 91 et le recrutement de neutrophiles par G-CSF induit plutôt une

diminution du pouvoir métastatique 92 ou réduit la tumorigénicité de certaines lignées

tumorales 93. Globalement, le neutrophile est vu aujourd’hui comme un effecteur anti-tumoral

important 94.

3.1.2.3. Les lymphocytes intra-tumoraux

Le système immun a pour rôle la reconnaissance du « non-soi » et permet aussi la

destruction rapide des cellules/organismes qui ne répondent pas à cette définition. Ce système

est composé en général de cellules qui capturent et assurent le traitement des antigènes afin de

les présenter ensuite aux cellules effectrices. Ces cellules, (lymphocytes T et B) subissent un

processus de sélection et de maturation, sous l’influence des cellules présentatrices d’antigène

et de facteurs solubles (cytokines). L’activation de ces cellules devrait permettre une réponse

efficace aboutissant à l’élimination de l’élément anormal, dans notre cas la cellule tumorale.

Deux obstacles majeurs réduisent l’efficacité de la réponse immune adaptative contre

les tumeurs. Premièrement il est nécessaire que les tumeurs expriment à leur surface un

antigène qui puisse être reconnu. L’apparition de ce type de néoantigène n’est pas

systématique, de plus ils sont faiblement immunogènes (pas assez différents du « soi »). Le


sur 240

deuxième point concerne l’environnement tumoral qui diminue le développement d’une

réponse immunitaire efficace via la sécrétion de cytokines pro-tumorales.

Il existe au niveau tumoral, des mécanismes inducteurs de la tolérance immune qui

diminuent ou même abolissent la réponse anti-tumorale. La faible immunogénicité des

cellules tumorales entraîne un défaut d’induction ou de maintien de la réponse immunitaire ou

même l’apparition d’une tolérance. En effet, au niveau de certaines tumeurs la présence des

lymphocytes immuno-régulateurs CD4+ et CD25+ (dits T régulateurs naturels) représentent

jusqu'à 30% de l’infiltrat leucocytaire intra-tumoral 95. Par ailleurs, des cytokines ayant des

effets inhibiteurs sur la réponse immune (comme le Transforming growth factor beta- TGFβ

ou l’IL-10) peuvent également être produites localement par les cellules tumorales et par le

stroma tumoral. Cet environnement peut alors favoriser la différenciation des lymphocytes en

lymphocytes T sécréteurs de cytokines anti-inflammatoires ou encore en lymphocytes à

fonction régulatrice 96.

Actuellement, le système immun adaptatif, à l’exclusion de cellules régulatrices, est

connu comme ayant un rôle dans la limitation de la progression tumorale. Dans les années 50,

Burnet propose le concept d’immunosurveillance 97. Selon cette théorie, le système immun est

capable de reconnaître et de détruire les clones cellulaires anormaux qui sont produits

continuellement dans l’organisme. Bien que cette théorie ait reçu certains arguments

expérimentaux pour la soutenir 98, elle reste encore controversée.

Plusieurs éléments expérimentaux soutiennent l’effet positif de l’immunité adaptative

dans la réponse anti-tumorale. In vitro, les lymphocytes CD8+ sont capables d’avoir un effet

cytotoxique en reconnaissant les antigènes tumoraux via le MHC de classe I et tuent les

cellules tumorales par lyse cellulaire. Les CD4+ peuvent également avoir une action anti-

angiogénique, par le biais de l'IL-4 et de l'Interféron (IFN)-γ 99. De multiples modèles

animaux ont montré qu’une manipulation de la réaction immune (injection de cellules

dendritiques stimulées par l’antigène tumoral, injection de cytokines stimulant la réponse

immune – IL2, IL12, ou le 31 transfert passif de cellules T effectrices) peut être efficace voire

avoir un effet curatif en tant que thérapie anticancéreuse. Enfin, en clinique, la présence de

leucocytes intratumoraux est associée, dans certaines localisations, avec un meilleur pronostic

tumoral 100-106.


sur 240

3.2. La matrice extracellulaire (MEC)

La matrice extracellulaire forme des réseaux tridimensionnels de bio-macromolécules

organisés autour des cellules. Bien que la MEC ait été considérée pendant longtemps comme

une structure inerte, ses activités sont multiples. Elle isole les compartiments tissulaires,

détermine l’architecture tissulaire et assure le support et la communication cellulaires.

Différents types de MEC ont été décrits d’après leur composition, leur fonction et leur

localisation : tissu conjonctif, membrane basale, cartilage, ou encore os. En dépit

d’importantes différences selon sa localisation, elle est principalement constituée de 3 types

de molécules :

• les fibres constituées de collagène ou d’élastine

• de glycoprotéines (moins abondantes que les fibres) jouant un rôle important

dans l’adhérence cellulaire (comme fibronectine, laminine, …)

• des polysaccharides très hydratés représentant le gel de remplissage de la

matrice

3.2.1. Description des composants majeurs de la MEC.

3.2.1.1. Le collagène

C’est une glycoprotéine fibreuse dont le rôle peut être comparé à celui d’une armature.

Il existe 27 types de collagènes qui sont classés en deux groupes : les collagènes fibrillaires et

les collagènes non-fibrillaires. Une unité de collagène est composée de trois chaînes

polypeptidiques appelées chaînes α (Fig. 7). Il existe à ce jour près de 34 chaînes α différentes 107, chacune contient environ 1000 résidus d’acides aminés et est caractérisée par la répétition

d’une séquence peptidique (Glycine-X-Y). Un résidu glycine est requis en position 1, car sa

petite taille permet le repliement spécifique en triple hélice. Les positions X et Y peuvent être

occupées par divers acides aminés, toutefois, la proline (Pro) en position X et une

hydroxyproline (OH-Pro) en position Y sont souvent retrouvées. Ces deux derniers acides

aminés constituent 1/6 des acides aminés de la séquence, la glycine 1/3. Donc la moitié de la

séquence est constituée d’autres acides aminés. Cette composition et cette distribution

caractéristiques sont requises pour la stabilité de la triple hélice. La structure ainsi formée

peut-être homo ou hétérotrimérique. Le collagène joue un rôle important dans la résistance à


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la tension des tissus. Cette glycoprotéine est présente surtout chez les animaux (25% de toutes

les protéines chez les mammifères), c'est le principal constituant de la peau et des os.

� Les collagènes fibrillaires sont les collagènes de type I, II, III, V, XI, XXIV et

XXVII. Les collagènes V, XI, XXIV et XXVII sont considérés comme des collagènes

mineurs car ils sont moins abondants que les trois autres types. Le collagène de type I est de

loin le plus répandu. Il est habituellement distribué avec le collagène de type III dans la

plupart des tissus conjonctifs interstitiels, excepté dans le cartilage, où se trouvent

spécifiquement du collagène de types II et XI. Le collagène de type V est un constituant

mineur de nombreux tissus non cartilagineux. L’association en triple hélice des chaînes α de

collagène a lieu dans le réticulum endoplasmique. Elle commence après le pro-peptide C-

terminal et s’arrête avant le pro-peptide N-terminal (Fig. 7) en présence de chaperons comme

la heat-shock protein 47 (HSP47). La composition en chaîne α des collagènes I, III et V est

présentée Fig. 8. Des liens disulfures sont formés entre les propeptides C de chaque chaîne α

afin de stabiliser la structure. La triple hélice flanquée de ses extrémités globulaires amino- et

carboxy-terminales est sécrétée dans l’espace extracellulaire. Des endoprotéases spécifiques,

les aminoprocollagène peptidases (ADAMTS2, 3 et 14) et les carboxyprocollagène peptidases

(BMP1/tolloid-like), excisent les pro-peptides terminaux, ne laissant de part et d'autre du

domaine en triple hélice que deux courtes séquences globulaires, les télopeptides. Les triples

hélices s’agencent ensuite de façon parallèle et décalée, avec des zones de superposition et des

trous (Fig.7 et 8), pour former des fibrilles hétérotypiques (composées de différentes

séquences de collagène) (Fig. 8).


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Figure 7. Assemblage du collagène fibrillaire 108.

Sous l'activité des lysyl-oxydases 109 extracellulaires, certains résidus lysyl et

hydroxylysyl des télopeptides sont oxydés en aldéhydes réactionnels qui forment des liaisons

croisées avec des groupements amines présents sur une autre chaîne ou une autre molécule.

Ceci permet la formation de liaisons covalentes qui, en collaboration avec l'établissement

d'interactions complexes avec d'autres protéines ou molécules présentes dans la matrice

extracellulaire, confèrent aux fibres de collagène les propriétés de résistance mécanique

adéquates.


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Figure 8. Exemple de structure et d’assemblage des collagènes. Les différents domaines N- et C-propeptidiques sont représentés en rouge et en bleu respectivement110. Le domaine thrombospondine-like, permet de lier la thrombospondine (glycoprotéine extracellulaire impliquée dans l’adhésion et la communication entre la matrice et la cellule). Le domaine Von Willebrand sert à la liaison avec la glycoproteine plasmatique du même nom lors d’une blessure (implication dans l’adhésion des plaquettes au niveau site de coupure). Le domaine Kunitz est une région semblable à celui d’un inhibiteur de sérine protéase (type Kunitz).


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� Les collagènes non-fibrillaires sont appelés ainsi car les triple hélices ne

s’associent pas de façon parallèle et décalée, comme les collagènes vus dans le paragraphe

précédent. Ils sont au nombre de 22. Les collagènes de type XII XIV et XVI font partie des

collagènes associés aux fibrilles avec des triple hélices interrompues ou FACITs (Fibril-

Associated Collagens with Interrupted Triple helices) (Fig.8). Ils sont constitués de trois

parties :

- une région qui permet l’interaction et l’adhésion avec les fibrilles

- une seconde région en triple hélice séparée de la première par un domaine qui

sert de bras rigide

- une région sans triple hélice qui forme une protubérance hors de la fibrille

grâce à la région précédente et interagit avec d’autres éléments de la matrice ou

des récepteurs membranaires.

D’après les structures observées dans le cartilage, les collagènes XII et XIV pourraient

se loger dans les trous des fibrilles grâce à la première région et permettraient grâce à la

troisième région une stabilisation et/ou une modulation des fibrilles par les cellules

environnantes.

Le collagène de type VI est le constituant principal des filaments perlés, ou

microfibrilles riches en fibrilline (une protéine extracellulaire présente dans les tissus

élastique et non-élastique 111). Il est présent dans le tissu conjonctif et est impliqué dans

l'élasticité tissulaire (Figure 8). Autre exemple le collagène de type IV est un élément de la

membrane basale synthétisé par les cellules endothéliales. Associé à d’autres molécules

comme l’entactine (glycoprotéine structurale de la membrane basale), le perlecan (membre

des protéoglycanes) et la laminine (glycoprotéine d’adhésion aux cellules), il forme des

feuillets ou des réseaux. Le collagène de type IV contient plusieurs domaines de triple hélices

interrompus. Ces molécules s’agrègent en feuillets grâce à l’interaction de leur région N-

terminale, le domaine 7S présentant une structure de triple hélice. Les chaînes α s’assemblent

en tétramère par leur 7S ce qui donne une structure en toile d’araignée (Fig. 9).


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Figure 9. Structure en feuillet de la membrane basale 112.

3.2.1.2. L’élastine

Contrairement au collagène l’élastine assure l'élasticité du tissu conjonctif. Elle est liée

au collagène pour éviter l'étirement et le déchirement des tissus. C’est une protéine fibreuse

riche en proline. Elle est abondante dans les tissus soumis à des contraintes et déformables

(paroi des vaisseaux, derme, poumon, vessie…). Cette élasticité permet un retour à l’état

initial (Fig.10) lors d’un étirement.

Figure 10. Elasticité des fibres d'élastine


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3.2.1.3. La fibronectine

Alors qu’elle n’est codée que par un seul gène, la fibronectine existe sous différentes

formes obtenues par épissage alternatif de la molécule précurseur d’ARNm. La fibronectine

est une protéine de haut poids moléculaire (500 kDa), synthétisée par les cellules

endothéliales et les fibroblastes. Elle est présente dans le stroma des tissus conjonctifs et dans

le plasma circulant. C’est un dimère. Les deux monomères sont reliés par deux ponts

disulfures à leur extrémité C-terminale. Chaque monomère est composé de trois types de

modules (Type I, II et III). Les modules I et II sont liés par un pont disulfure intra-chaîne

formant une structure rigide alors que le module III est libre. L’absence de pont disulfure dans

ce dernier module confère une certaine flexibilité à la fibronectine. Les domaines rigides

représentent les sites d’interaction avec les autres composantes de la matrice extracellulaire

(collagène, protéoglycanes…). Les molécules de fibronectines s’assemblent en polymères et

forment des agrégats fibrillaires 113. Elle peuvent également se lier aux intégrines par deux

séquences RGD (Arginine,Glycine, acide Aspartique).

Figure 11. Les différents modules de la fibronectine ainsi que les domaines de liaisons.

La fibronectine joue un rôle clé dans les processus d’adhésion cellulaire et de

migration cellulaire. Elle participe à l’organisation de la matrice grâce à sa forme en réseau

fibrillaire qui favorise l’adhérence et l’agencement des protéines matricielles entre elles. Cette

protéine est surtout localisée dans les tissus en cours de remaniements liés à la morphogenèse

ou à des processus pathologiques, dans les lames basales embryonnaires et les tissus

conjonctifs lâches.


sur 240

3.2.1.4. La laminine

Il s’agit d’une glycoprotéine faite d’un hétérotrimère de 3 chaînes : α, β, γ (Fig.12). A

ce jour, 5 chaînes α, 4 chaînes β et 3 chaînes γ ont été décrites 114. La laminine-1 (α1, β1, γ1)

s’organise en réseau, en association avec le collagène de type IV et d’autres molécules pour

composer la membrane basale. La laminine-2 (α2, β1, γ1), aussi appelée mérosine, est

présente dans le muscle strié squelettique et le rein. Les laminine-5 (α3, β3, γ2), laminine-6

(α3, β1, γ1), laminine-7 (α3, β2, γ1) sont des molécules d’adhésion aux cellules épithéliales et

assurent la jonction dermo-épidermique 107. La laminine-5 (α3, β3, γ2) ou kalinine/nicéine se

retrouve au niveau des hémidesmosomes (jonction d’ancrage entre la membrane basale et la

cellule) (Fig.12).

Figure 12. a) Les différentes chaînes de la laminine 115. b) Représentation de la laminine-5 dans un hémidesmosome

3.2.2. Les protéoglycanes

Les protéoglycanes sont une famille hétérogène de macromolécules qui comportent

une chaîne protéique sur laquelle est greffée au moins une chaîne glycanique. Le nombre et la

structure de ces chaines latérales glycaniques sont variables d’une molécule à l’autre mais

parfois aussi d’un tissu à l’autre ou d’une situation pathologique à une autre au sein d’une

même molécule. Dans certains cas physiologiques et/ou pathologiques, la chaîne glycanique

peut manquer. Ils sont appelé protéoglycanes « part time », car ils ne reçoivent une chaine

latérale que de manière facultative.


sur 240

Il existe des protéoglycanes extracellulaires présents dans la matrice extracellulaire,

des protéoglycanes ancrés dans les membranes cellulaires mais aussi, plus rarement, des

protéoglycanes intracellulaires. Parfois ces protéoglycanes sont retrouvés aussi dans la

circulation. La longueur de la chaine protéique d’un protéoglycane peut varier de 1 à plus de

500 kD. D’un point de vue structural, la chaîne glycanique est composée d’un "linker" (unité

d’encrage dans la protéine composée de quatre monosaccharides xylose - galactose -

galactose – acide glucuronique) suivi de la répétition de deux monosaccharides (une

hexosamine et un acide uronique) dont le type définit les sous familles de protéoglycanes. Il

existe quatre types principaux de glycosaminoglycanes (GAGs): l'acide hyaluronique (HA),

l'héparane sulfate (HS) et l'héparine (HP), le chondroïtine sulfate (CS) ou le dermatane sulfate

(DS) et le kératane sulfate (KS) (Fig. 13) 116.

Figure 13. Les différents types de glycosaminoglycanes (GAGs) entrant dans la composition des protéoglycanes 115 ; Ici n représente le nombre de chaînes disaccharidiques pour chaque type de glycosaminoglycanes.

La diversité des protéoglycanes est assurée, non seulement par la structure de la chaîne

protéique, mais aussi par la chaîne glycanique latérale. Cette dernière peut avoir une longueur

et des motifs de sulfatation variables en fonction des molécules. Un exemple d’arrangement

est présenté Fig. 14. La diversité structurale et fonctionnelle des chaînes glycaniques est

obtenue par plusieurs mécanismes :


sur 240

� la succession des différents résidus osidiques n’est pas uniforme sur toute la

longueur de la chaîne glycanique.

� le degré de sulfatation de chaque résidu est variable (de zéro à trois résidus

sulfate).

� le degré de sulfatation n’est pas uniforme sur la longueur de la chaîne

glycanique, avec des zones non sulfatées et des zones hypersulfatées.

Les fonctions de ces molécules et la régulation de leur structure sont encore mal

connues. La succession des différents résidus osidiques et le degré variable de sulfatation

créent au niveau des chaînes glycaniques des motifs spécifiques qui permettent la fixation des

protéines basiques comme les facteurs de croissance, les cytokines ou les chimiokines. Leur

fixation sur le glycane joue un rôle dans l’effet biologique de ces molécules 117. Ainsi, certains

protéoglycanes ont un rôle de corécepteur, favorisant la stabilisation du complexe facteur de

croissance - récepteur. Ils permettent, en outre, l’immobilisation des facteurs de croissance au

niveau du stroma, créant ainsi un pool de stockage qui peut être libéré lors d’agressions

(libération induite par exemple par l’activation des enzymes protéolytiques comme les

metalloprotéases et les glycosidases) 118. Ils peuvent aussi avoir un rôle de protection de ces

facteurs contre la dégradation protéolytique 119. Les protéoglycanes peuvent également lier

certaines molécules d’adhérence, comme les intégrines. Ils interviennent dans la stabilisation

de la paroi vasculaire, la prolifération, la migration des cellules endothéliales et l’angiogenèse 120, 121.

Figure 14. Structure d’un agrégat de protéoglycane dans le cartilage 115, 122


sur 240

3.3. Interaction de la matrice avec les cellules tumorales

Le rôle des protéoglycanes ne se limite pas à l’interaction avec les facteurs de

croissance et à la fonction de soutien. En tant que composantes de la matrice extracellulaire,

ils interagissent avec les autres molécules de cette structure et avec les molécules de la surface

cellulaire. En effet, les protéoglycanes peuvent également lier certaines molécules

d’adhérence, comme les intégrines.

Les intégrines sont à la fois des glycoprotéines transmembranaires impliquées dans

l’adhésion cellulaire et des récepteurs capables de transduire un signal de la cellule à la

matrice extracellulaire et vice-versa. Elles sont exprimées dans toutes les cellules et sont

formées de deux sous-unités α et β liées de façon non covalente 123. En tout, 18 sous-unités α

et 8 sous-unités β ont été identifiées à ce jour. De ces monomères, 24 paires (hétérodimères)

ont été décrites Fig.15. Un exemple de structure est montré Fig. 16. Cette diversité dans la

composition des sous-unités contribue à la capacité des intégrines à reconnaitre un large

spectre de ligands dans la matrice extracellulaire mais aussi au niveau cellulaire.

Figure 15. Les 24 hétérodimères d’intégrines 124: Chaque trait correspond à l’association de deux monomères (α et β) pour former un des 24 hétérodimères d’intégrine. Les traits rouges symbolisent les hétérodimères exprimés par les cellules immunitaires. (* domaine αI commun)


sur 240

Figure 16. Intégrine lié à la fibronectine

La spécificité des différentes familles d’intégrines pour des molécules précises,

présentes dans la MEC constitutivement ou à des moments précis, leur confère une fonction

de détecteur des modifications du microenvironnement, susceptible de provoquer une

adaptation fonctionnelle du programme cellulaire (signalisation de l’extérieur vers l’intérieur

« outside-in »).

Les intégrines peuvent transmettre des signaux externes vers la cellule par

l’intermédiaire de la queue intracytoplasmique de la chaîne beta. L’activation des cascades de

signalisation intracellulaire génère une modification des gènes exprimés, une réorganisation

du cytosquelette, modifie l’adhésion et la survie des cellules 125. Les intégrines interviennent

dans l’attachement de cellules aux membranes basales ou aux autres cellules. Mais elles

peuvent également influencer l’entrée ou la sortie du cycle cellulaire 126 ou la motilité

cellulaire après avoir fixé différents ligands présents dans la matrice extracellulaire 127. Elles

ont un rôle dans les maladies inflammatoires (intervention dans la migration leucocytaire)

mais aussi dans le cancer 128-130.

Il existe de nombreuses anomalies de l’expression des intégrines au niveau des cancers 131, 132. L’intégrine αvβ3 sert de récepteur aux protéines extracellulaires contenant une

séquence RGD (Arg-Gly-Asp), incluant la fibronectine, la vitronectine, la laminine, le facteur

von Willebrand, le fibrinogène et le collagène dénaturé. In vivo, αvβ3 est peu exprimée par

les cellules au repos, mais son expression est fortement augmentée au niveau des cellules

endothéliales activées lors de l’angiogenèse. Lors d’un cancer, elle est actuellement

considérée comme un marqueur des mélanomes invasifs 133, 134 car son expression par les

cellules endothéliales augmente le potentiel métastatique des cellules mélanomateuses 135. La

surexpression de l’intégrine β4 induit un arrêt de la croissance cellulaire par l’intermédiaire de


sur 240

la surexpression d’inhibiteurs des « cyclin dependent kinases » (Cdk) 136. L’expression de

l’intégrine α2β1 dans des cellules de cancer du sein faiblement différenciées induit un arrêt de

la croissance cellulaire et la réversibilité du phénotype tumoral 137. Les intégrines notamment

l’ α5β2, ont été également impliquées dans le contrôle de la formation de la matrice

extracellulaire 138.

Les intégrines transmettent également des signaux nécessaires à la survie cellulaire 125.

L’inhibition des interactions des intégrines avec leurs ligands inhibe la croissance cellulaire

tumorale et peuve induire une apoptose 40, 139-141.

Les changements conformationnels induits par des signaux intracellulaires peuvent

aussi avoir des conséquences sur le comportement de la cellule par rapport à son

environnement, la MEC. Ce phénomène dénommé « insideout signaling » consiste à réguler

sur la membrane, le nombre, la densité des intégrines ainsi que l’affinité des intégrines pour

leurs ligands extracellulaires en fonction de l’état intracellulaire et ainsi réguler la migration et

l’invasivité des cellules 142. Les intégrines de type αvβ3 et α6β4 sont impliquées dans ce

processus 143 aboutissant à l’activation de protéases qui agiront sur la matrice extracellulaire.

Le microenvironnement tumoral, par ses composantes cellulaires et moléculaires,

est un élément important dans la progression tumorale. Cet environnement est le siège

d’une forte activité protéolytique primordiale pour :

� la colonisation des tissus (étape d’invasion et de prolifération)

� l’angiogenèse tumorale

� l’intravasation

� l’extravasation

� le développement des métastases

Cette activité protéolytique est assurée par une grande famille de

métalloprotéases, les MMPs, qui sont devenue une cible thérapeutique privilégiée 23, 63,

144-151 pour l’étude et le traitement des pathologies cancéreuses mais aussi d’autres


sur 240

pathologies telle que l’athérosclérose, les maladies pulmonaires (ex : l’asthme) ou encore

la polyarthrite rhumatoïde.


sur 240

4. Les métalloprotéases (MMPs) : généralités

Le terme « métalloprotéase » regroupe l’ensemble des enzymes dont l’activité

catalytique nécessite un ion métallique, le plus souvent un atome de zinc. Ainsi, chez

l’Homme, 186 gènes codant pour des protéases à zinc ont été identifiés. Ce nombre surpasse

celui des gènes codant respectivement pour des protéases à sérine (176) et des protéases à

cystéine (143) 152, 153. Parmi les familles qui constituent le groupe des métalloprotéases à zinc,

la moitié possède un motif consensus HEXXH (X peut correspondre à différents a.a.) au

niveau de leurs séquences primaire: ce sont les zincines. Les deux histidines de cette séquence

constituent les deux premiers ligands de l’atome de zinc, alors que le glutamate polarise la

molécule d’eau impliquée dans l’hydrolyse de la liaison peptidique 154 ( développée plus loin

Fig. 18).

Les zincines sont divisées en sous-famille selon la nature du troisième ligand de

l’atome de zinc ; pour la famille des gluzincines, comme la thermolysine, l’ACE (angiotensin-

converting enzyme) et la NEP (neprilysin), le troisième ligand est un glutamate porté par une

séquence conservée NEXXSD. La famille des metzincines 63, 155, 156 regroupe les protéases

dont le troisième ligand de l’atome de zinc est un résidu histidine, le motif consensus étant

alors étendu à la séquence suivante : HEXGHXXGXX H.

Les metzincines présentent par ailleurs dans leur séquence un résidu méthionine situé

sur une séquence structurée en un coude de type β-1,4, appelé Metturn. Dans cette structure,

la chaîne latérale de la méthionine pointe vers l’atome de zinc catalytique. Cette topologie

particulière du résidu méthionine a permis sur des bases structurales le regroupement en sous-

famille des metzincines.

4.1. Structures et fonctions biologiques des MMPs.

Les MMPs connues sont au nombre de 23, elles sont classées en 6 groupes sur la base

de leur structure primaire (voir Tableau 3) et de leur spécificité vis-à-vis de certains substrats 62, 153. Il faut cependant différencier les MMPs secrétées (matrilysines, collagénases,

gélatinases, stromélysines et autres), des MMPs membranaires (MT-MMP, « Membrane-Type

MMP »). En effet, les MMPs sont excrétées sous forme d’enzyme inactive ou zymogène

ensuite elles sont activées par les protéases de la matrice extracellulaire alors que les MT-

MMPs sont actives lors de leur localisation membranaire 157, 158.


sur 240

Tableau 3. Organisation en domaines (décrits dans les paragraphes suivants) des MMPs humaines.


sur 240

Les 6 familles de métalloprotéases sont les suivantes :

- Les matrilysines

- les collagénases interstitielles

- les gélatinases

- les stromélysines

- les métalloprotéases membranaires (MT-MMPs)

- les autres (non classées)

Chaque MMP est constituée d’un peptide signal, d’un prodomaine et d’un domaine

catalytique. Collectivement ces métalloprotéases sont capables de dégrader tous les éléments

de la matrice extracellulaire.

4.1.1. Le peptide signal

La séquence des MMPs commence par une vingtaine de résidus, généralement

hydrophobes, permettant de diriger le polypeptide synthétisé vers les voies de sécrétion.

Toutes les MMPs possèdent cette séquence dite « signal », sauf la MMP-23. Cette observation

suggère l’existence d’une voie de sécrétion alternative pour cette MMP 159.

4.1.2. Le prodomaine et la séquence de coupure par la furine.

Le prodomaine est composé d’environ 80 aminoacides, et est caractérisé par la

présence d’une séquence PRCG(V/N)PD strictement conservée dans la plupart des MMPs.

Cette séquence contient le résidu cystéine du « cystein switch » décrit en 1990 par Van Wart

et Birkedal-Hansen 160, dont l’atome de soufre interagit directement avec l’atome de zinc

catalytique, maintenant les proMMPs sous forme inactive comme l’illustre la Fig. 17.


sur 240

Figure 17. Représentation tridimensionnelle de l’interaction entre la boucle du prodomaine (en jaune) et le zinc (en rose) du domaine catalytique (en gris) de la proMMP-2 ; le domaine fibronectine est représenté en bleu en arrière-plan.

Seule la MMP-23 ne possède pas cette séquence 161. Par ailleurs, dans le prodomaine

de quelques MMPs (MMP-11, MT-MMP, MMP-21, MMP-23 et MMP-28), une séquence

RX(K/R)R a été observée. Elle se situe en C terminal du prodomaine, et est typique d’un site

de clivage par la furine 162, 163. La furine est une pro-protéine convertase, aussi connue sous le

nom de PACE (Paired basic Amino acid Cleaving Enzyme). C’est une protéase

intracellulaire, responsable de l’activation de plusieurs protéines dont les MMPs

membranaires et la MMP-23. Elle reconnait et clive une séquence basique « Arg-Arg-Lys-

Arg » 164, 165.


sur 240

4.1.3. Le domaine catalytique

Le domaine catalytique, composé d’environ 170 résidus, est caractérisé par un site de

liaison de l’atome de zinc catalytique HEXGHXXGXX H. Dans la famille des

métalloprotéases à zinc, c’est le domaine le plus petit par le nombre de résidus entrant dans sa

composition. Cette remarque suggère que ce domaine pourrait représenter un ancêtre commun

à de nombreuses protéases à zinc modernes. Cet argument est renforcé par la conservation de

structures secondaires, observées chez les MMPs, dans d’autres protéases de plus grande

taille. Outre l’atome de zinc du site catalytique, le domaine catalytique possède plusieurs ions

métalliques structuraux : un atome de zinc non-échangeable et deux ou trois atomes de

calcium, nécessaires à la stabilité et à l’activité de l’enzyme 166. De façon remarquable, une

insertion longue de 175 résidus est observée dans le domaine catalytique des MMP-2 et -9 (les

Gélatinases A et B). Cette séquence possède trois motifs répétitifs proches en structure du

domaine de type II de la fibronectine. La présence de ces domaines particuliers dans ces deux

MMPs est responsable de leur spécificité à dégrader la gélatine (hydrolysat partiel du

collagène)167.

L’activité des MMPs est essentiellement assurée par ce domaine catalytique dont le

mécanisme est représenté Fig. 18. 168, 169. Le glutamate déprotone la molécule d’eau, formant

ainsi un hydroxyle qui va effectuer une attaque nucléophile sur le carbonyle de la liaison

amide du substrat Fig. 18 (A). Le proton issu de la molécule d’eau est ensuite transféré sur le

NH de cette liaison Fig. 18 (B). Après réarrangement Fig. 18 (C), l’enzyme libère les

produits, et une molécule d’eau s’introduit au niveau du site catalytique pour régénérer

l’activité protéolytique.

Glu

CO O

HOH

Zn2+

HCP1

C

O

A

Glu

CO O

HN

HCP1'

HCP1

C

O

OB C

Zn2+

O

H

Ala

O

H

Ala

O

HN

HCP1'

Ala

O

Glu

CO O

H3N

HCP1'

Ala

HO

HCP1

C

O

Zn2+

HO

HCP1

C

O

Glu

CO O

H

NHCP1'

Zn2+

NN

NHis

His

HisN

NN

HisHis

His NN

NHis

His

His

NN

NHis

His

His

Figure 18. Mécanisme catalytique de l’hydrolyse enzymatique 169.


sur 240

4.1.4. La charnière

Cette séquence permet de relier le domaine catalytique des MMPs à leur domaine

C-terminal, excepté dans le cas des matrilysines (MMP-7 et MMP-26), dont les structures

primaires ne sont constituées que du prodomaine et du domaine catalytique. La MMP-23 est

une autre exception dans laquelle le peptide charnière est remplacé par une région riche en

cystéines CX6CX8CX10CX3CX2C. Cette région est très variable en taille, de 16 à 65 résidus et

très flexible 170. La taille de cette région intervient certainement dans des interactions

intermoléculaires engagées par les MMPs qui impliquent à la fois le domaine catalytique et le

domaine hémopexine.

4.1.5. Le domaine C-terminal de type hémopexine

La plupart des MMPs présentent en C-terminal du peptide charnière un domaine

constitué de 210 résidus. Ce domaine, en forme de disque ellipsoïdal, est fortement similaire

aux membres de la famille des hémopexines. Il ressemble à une hélice à 4 pales, dont chaque

pale est formée de 4 brins β antiparallèles et d’une hélice α 171, 172. Ce domaine est absolument

nécessaire aux collagénases pour la dégradation de la triple hélice de collagène interstitiel 173.

De plus, il apparaît essentiel dans l’activation de la proMMP-2 par la MMP-14 à la surface de

la cellule 163, 167. Dans le cas de la MMP-23, le domaine hémopexine est remplacé par des

motifs similaires à ceux trouvés dans la séquence du récepteur à l’IL-1, caractéristiques d’un

repliement de type immunoglobuline C2 174.

Dans le cas des MT-MMP, le domaine hémopexine est suivi soit d’un domaine

transmembranaire (MT1-MMP, MT2-MMP, MT3-MMP et MT5-MMP), soit d’un

groupement inositolphosphate (MT4-MMP et MT6-MMP), permettant l’ancrage

membranaire de l’enzyme à la surface de la cellule 167.

4.2. Les différents groupes de MMPs

4.2.1. Les matrilysines

Les matrilysines (MMP-7 et MMP-26) sont structurellement les plus simples, car elles

ne possèdent que le peptide signal, le prodomaine et le domaine catalytique. Ces MMPs sont


sur 240

spécifiquement exprimées par les cellules cancéreuses d’origine épithéliale; leurs spectres

protéolytiques sont partiellement divergents mais incluent la fibronectine et la gélatine.

La MMP-7 est surexprimée dans les métastases du foie liées à un cancer colorectal175.

La MMP-7 est aussi impliquée dans le phénomène d’invasion lors de la progression tumorale 20, 163. Elle interviendrait également dans la maturation des défensines (peptides cationiques de

3.5-6 kD impliqués dans la défense antimicrobienne) au niveau du tissu intestinal 176. La

MMP-26 est très peu décrite dans la littérature.

4.2.2. Les collagénases interstitielles

Les collagénases interstitielles (MMP-1, MMP-8, MMP-13) forment un second groupe

de MMPs. Elles interviennent dans la dégradation du collagène fibrillaire, incluant les

collagènes de type I, II, III et VI. Le clivage protéolytique du collagène fibrillaire par ces

enzymes entraîne la formation de gélatine (collagène dénaturé), qui peut ensuite être dégradée

par les gélatinases. La MMP-13 (collagénase-3) est caractérisée par un spectre enzymatique

plus large et est essentiellement exprimée dans des zones nécessitant un remaniement rapide

de la matrice extracellulaire, telles que le tissu osseux fœtal en développement ou les sites

d’inflammation chronique. Plusieurs carcinomes et sarcomes ont aussi été associés à une

hyperactivité de la MMP-13 20.

La MMP-1 est spécialisée dans la dégradation du collagène de type I. Par conséquent

elle se retrouve dans quasiment tous les processus physiologiques et pathologiques de

remodelage de la MEC 177. Elle a été décrite dans des pathologies telles que le cancer

colorectal178, de la vessie 179 ou encore les rejets d’implants 180. Dans le processus

métastatique, elle est exprimée par les fibroblastes au niveau du front invasif de la tumeur 62.

La MMP-8 est exprimée dans les maladies cardiovasculaires, mais aussi dans les cas

de parodontite où sa concentration dans le sang est très élevée 181.

4.2.3. Les stromélysines

Le troisième groupe de MMPs est composé des stromélysines (MMP-3, MMP-10 et

MMP-11). Les MMP-3 (stromélysine 1) et MMP-10 (stromélysine 2) sont principalement

produites par les cellules épithéliales saines, mais ont aussi été décrites dans certains

carcinomes. Leur spectre protéolytique relativement étendu inclut de nombreuses


sur 240

glycoprotéines et des protéoglycanes 20. Le gène de la MMP-11 (stromélysine 3) a été

caractérisé, la première fois, comme un des principaux gènes s’exprimant dans les cancers du

sein. Son expression dans différentes tumeurs est associée à un mauvais pronostic pour la

survie du patient 182. La MMP-11 semble jouer un rôle mineur dans la dégradation de la

matrice extracellulaire, par contre les inhibiteurs de protéases à sérine du type α1-PI (α1-

Proteinase Inhibitor) et la protéine de liaison au facteur de croissance de type insuline

(IGFBP) ont été proposés comme des substrats physiologiques potentiels de la MMP-11 20.

4.2.4. Les gélatinases

Ce quatrième groupe est constitué des gélatinases (MMP-2 et MMP-9). Leur activité

protéolytique principale est dirigée contre la gélatine (collagène interstitiel dégradé par les

collagénases interstitielles) et les collagènes de type IV et V de la membrane basale. Une

caractéristique structurelle des gélatinases est la présence, au sein de la séquence du domaine

catalytique, de trois séquences peptidiques répétitives analogues aux motifs de type II de la

fibronectine. Ces derniers forment un domaine à part entière hors du domaine catalytique et

n’altèrent pas la structure globale du domaine catalytique. Les motifs fibronectine permettent

la liaison à la gélatine, les collagènes et la laminine. La gélatine A (MMP-2) est

physiologiquement exprimée par les cellules du stroma de la plupart des tissus. De plus, des

mutations de la MMP-2 chez l’Homme, bloquant l’activité de l’enzyme, entrainent une forme

d’ostéoporose. Il semble donc que, chez l’Homme, la MMP-2 jouerait un rôle important dans

l’ostéogenèse. En revanche, l’expression de la gélatinase B (MMP-9) est faible ou absente

dans les tissus normaux et limitée aux monocytes et aux macrophages. Toutefois, elle peut

être induite en cas de remaniement tissulaire comme le développement embryonnaire, la

cicatrisation des plaies ou l’invasion tumorale ; dans ce cas, elle est produite par les cellules

stromales ou par les cellules malignes 20, 163.

4.2.5. Les MMPs transmembranaires (MT-MMP)

Les MMPs transmembranaires (MMP-14, -15, -16, -17, -24 & -25 aussi dénommées

MT1-MMP à MT6-MMP) sont liées à la membrane plasmique soit par l’intermédiaire d’un

domaine hydrophobe transmembranaire situé en C-terminal, soit par un pont inositolphoshate.

Ces six MT-MMPs sont capables de dégrader de nombreux composants de la matrice

extracellulaire. De plus, certaines ont pour substrats des facteurs de croissance. La MT1-

MMP, possède une activité vis-à-vis des collagènes de type I, II et III, et joue aussi un rôle


sur 240

dans l’angiogenèse ; la MT5-MMP est spécifique de la région cérébrale et est principalement

exprimée dans le cervelet. La MT6-MMP est exclusivement exprimée par les leucocytes

sanguins, dans les glioblastomes et les astrocytomes anaplastiques 163. Outre un rôle dans la

dégradation directe de la matrice extracellulaire, ces enzymes interviennent de manière

séquentielle dans l’activation protéolytique des MMPs, en particulier la MT1-MMP qui

apparaît être l’un des principaux activateurs de la MMP-2 167.

4.2.6. Le groupe hétérogène

Enfin, plusieurs MMPs (MMP-12, MMP-19, MMP-20, MMP-21, MMP-23, MMP-27,

MMP-28), plus récemment découvertes, forment un sixième groupe hétérogène. La MMP-12

ou métalloélastase, dont le substrat principal est l’élastine, est surtout sécrétée par les

macrophages et est essentielle pour leur migration 183-185.

La MMP-19 est exprimée dans les cellules mammaires humaines et les cellules

épithéliales de la peau dans les conditions physiologiques normales. Celle-ci est sous-

exprimée dans le cas de carcinomes invasifs 186, alors qu’elle est capable de dégrader les

composants de la membrane basale, tels que la laminine et le collagène de type IV, les tissus

conjonctifs (fibronectine et gélatine) et le cartilage.

L’énamélysine (MMP-20), qui a pour substrat spécifique l’amélogénine (protéine

principale de l’émail dentaire), semble réguler la sécrétion de la matrice amélaire et sa

minéralisation (formation de l’émail dentaire). Elle est principalement exprimée dans les

améloblastes, et transitoirement dans les odontoblastes. L’expression de son principal

substrat, l’amélogénine précède toujours celle de la MMP-20 suggérant une régulation

séquentielle dépendante des stades de développement. L’amélogenèse imparfaite, un

dérèglement génétique provoquant la formation d’émail défectueux, est due à des mutations

au niveau des sites de coupure de la MMP-20 187, 188.

La MMP-21 est exprimée lors de l’embryogenèse et tout particulièrement dans les

cellules neuronales 162.

La MMP-23, aussi appelée Cystein-Array MMP ou CA-MMP, est principalement

exprimée dans les tissus génitaux. Cette MMP est la seule à ne pas posséder le « cystein-

switch » dans son prodomaine ; à la place du domaine hémopexine, la MMP-23 présente en

C-terminal un domaine riche en cystéines suivi d’un domaine de type immunoglobuline.


sur 240

La MMP-27 n’a pas été sujette à des études poussées jusqu’à présent. Un taux

d’expression élevé de l’ARN messager correspondant à la MMP-27 dans le cartilage humain

semble indiquer une forte implication dans l’ostéogenèse 189. Bien sûr, il est essentiel de

rappeler que l’observation des ARN messagers ne permet pas de conclure de manière

quantitative sur l’activité de la MMP-27.

La MMP-28 ou épilysine est particulièrement exprimée dans les kératinocytes.

L’expression de cette MMP, aussi bien dans les tissus cutanés intacts que blessés, suggère que

la MMP-28 doit jouer un rôle dans l’hémostase et la cicatrisation des blessures 163.

4.3. Fonction physiologique des MMPs.

Le niveau d’expression des MMPs dans les tissus sains est très bas 190, et peut être

induit par des stimuli externes comme les cytokines, les facteurs de croissance, un stress

physique, une transformation oncogénique 191, une modification de l’interaction

cellule/matrice ou une interaction cellule/cellule 192. La croissance de l’embryon et la

morphogenèse des tissus sont des événements fondamentaux qui requièrent la dégradation de

la matrice extracellulaire donc une forte concentration en métalloprotéases, afin de permettre

la migration des cellules et le remodelage du microenvironnement matriciel. Les principaux

modes de régulation de leur expression sont décrits ci-dessous.

4.3.1. Régulation transcriptionnelle

Le premier niveau de contrôle de leur activité est transcriptionnel, en jouant

directement sur la quantité de MMPs produites. Toutes les MMPs, à l’exception de la

MMP-2, font appel à ce mécanisme de contrôle. L’expression ou non de leur gène est induite

par différents stimulis externes 193, tels que les cytokines et les facteurs de croissance,

(interleukines, interférons, facteur de croissance de l’épithélium (EGF, "Epithelium Growth

Factor"), facteur de croissance des Kératinocytes (KGF, "Keranocyte Growth Factor"), facteur

de croissance du système nerveux (NGF "Nerve Growth factor"), VEGF 34, facteur de

transformation β (TGF-β "Transforming Growth Factor β"), inducteur extracellulaire des

MMPs matricielles (EMMPRIN "Extracellular Matrix MetalloPRoteinase INducer") 194-196.


sur 240

4.3.2. Régulation post-transcriptionnelle

Elle intervient dans un premier temps directement sur l’ARNm en augmentant ou en

diminuant sa stabilité 197. En effet, le messager (ARNm) qui vient d’être transcrit est toujours

plus long que le messager retrouvé dans le cytosol. Le passage de l’un à l’autre constitue la

maturation. Une série de mécanismes intervenant au niveau de cette maturation mais aussi au

niveau du stockage de ces messagers, permettent de réguler de manière qualitative et

quantitative l’expression finale de la protéine. Elle permet donc de réguler la quantité ou le

type de MMPs "traduites".

4.3.3. Activation du zymogène.

Les MMPs, comme beaucoup de protéases, sont synthétisées sous forme de

zymogènes, inactifs, impliquant dans le cas des MMPs la présence d’une séquence de 80

résidus en N-terminal de la protéine. Outre le rôle de ce prodomaine dans l’inactivation de

l’enzyme, celui-ci intervient aussi dans l’expression correcte de ces enzymes par la cellule. Le

clivage du prodomaine est un évènement déclenché soit par une réaction chimique modifiant

l’atome de soufre de la séquence hautement conservée PRCGXPD du prodomaine (exemple

de l’aminophenyl mercurique acid APMA, utilisé pour activer les MMPs in-vitro), soit par

une coupure protéolytique. L’activation des MMPs répond à une régulation complexe, des

enzymes appartenant aux différentes classes de protéases (protéases à sérine et à cystéine et

métalloprotéases à zinc) ont été décrites comme capables d’activer les MMPs in vitro,

renforçant la notion que l’activation in vivo des MMPs pouvait être réalisée dans le contexte

de cascade protéolytique.

Le mécanisme d’activation de la proforme de la MMP-2 illustre bien cette complexité

(Fig. 19). Il fait intervenir la MMP-14 (MT1-MMP) ancrée à la membrane, la proMMP-2 et

un inhibiteur tissulaire naturel des MMPs de type protéique : TIMP-2 165, 198-200. C’est l’un des

rares exemples de la littérature où un inhibiteur naturel d’une protéase intervient dans

l’activation de celle-ci. Ce mécanisme repose sur la présence dans les TIMP de deux

domaines, N-terminal et C-terminal, capables d’interagir respectivement avec le domaine

catalytique des MMPs (domaine N- terminal) et le domaine hémopexine (domaine C-

terminal). Ce caractère «bivalent» du TIMP-2 lui permet d’engager d’une part une interaction

avec le domaine catalytique d’une MT1-MMP et d’autre part d’interagir avec le domaine

hémopexine de la proMMP-2 à activer. Il se forme alors un complexe trimérique à la surface


sur 240

de la cellule. Lorsque les concentrations de TIMP-2 à cette interface sont insuffisantes, les

quelques molécules de MT1- MMP restées sous forme active sont capables de cliver le

prodomaine de la proMMP-2, déjà complexée avec une autre molécule de MT1-MMP. La

localisation membranaire de la MT1-MMP est essentielle à la réalisation de ce processus

d’activation de la proMMP-2.

Figure 19. Mécanisme d'activation de la MMP-2.

Pour les MMPs membranaires (MT-MMP), l’activation se déroule au niveau

intracellulaire, dans l’appareil de Golgi, par des protéases reconnaissant la séquence de type

furine 201.


sur 240

4.3.4. Inhibition des MMPs

Les MMPs sécrétées étant souvent des protéines diffusibles, il existe des inhibiteurs

plasmatiques comme l’α-macroglobuline et des inhibiteurs tissulaires, les TIMPs (Tissue

Inhibitors of Metalloproteinases) 202. Ils forment une famille de 4 protéines, TIMP-1 à

TIMP-4. L’interaction entre les TIMPs et les MMPs implique au niveau du site actif les 5

premiers résidus en N-terminal de TIMP (Fig. 20). Ces cinq résidus ont une position identique

dans le site actif à celle d’un substrat 203.

Figure 20. Représentation tridimensionnelle de l’interaction entre le domaine catalytique de la MMP-13 (en gris) et des 5 résidus (en jaune) du domaine N-terminal du TIMP-2 (en bleu) se positionnant de façon identique dans le site actif à celle d’un substrat. L’atome de zinc catalytique est représenté en rose.

Outre la présence des cinq résidus en N-terminal des TIMP dans le site actif des

MMPs, plusieurs boucles situées en surface du TIMP-2 projettent des résidus venant en

contact avec une grande partie de la surface du domaine catalytique. Ce type de complexe

implique donc un très grand nombre de résidus de ces deux protéines, cette multiplicité

d’interactions étant en accord avec la très grande affinité des TIMP envers les MMPs

(Fig. 21). Les constantes de dissociation de ce type sont de l’ordre du picomolaire.

L’association se fait en deux temps, tout d’abord la TIMP se lie à la MMP via des résidus

extérieurs au site catalytique puis l’assemblage avec le zinc du site actif a lieu. La spécificité

d’interaction entre les couples MMP/TIMP est étroitement liée à la connexité engagée au


sur 240

niveau des boucles des TIMP, modulée par la nature des résidus des MMPs participant à cette

interaction.

Figure 21. Illustration du mécanisme d’interaction entre un TIMP et une MMP; les constantes de dissociation de ce type d’interaction en deux temps sont de l’ordre du picomolaire

Il est à noter qu’un inhibiteur membranaire a été isolé : la protéine RECK (Reversion

inducing Cysteine-rich protein with Kazal motifs) 204. Cette glycoprotéine inhibe la sécrétion

et l’activité de la MMP-9 mais aussi l’activité de la MMP-2 et MT1-MMP. L’α-

macroglobuline, un inhibiteur plasmatique de protéases est aussi connu pour inhiber l’activité

des MMPs 205, 206.

L’activation et l’inhibition des MMPs sont donc fortement régulées que ce soit lors les

phénomènes physiologiques ou pathologiques. Ces processus régissent la quantité de

protéases actives et donc leurs effets sont complexes. Dans le chapitre suivant, nous allons

décrire l’implication des MMPs dans le développement tumoral dans le but de mieux

appréhender leur rôle, et surtout comment les utiliser pour lutter contre le cancer.


sur 240

4.4. Expression des MMPs dans les processus tumoraux

Compte tenu de la capacité des MMPs à pouvoir dégrader l’ensemble des protéines de

la matrice extracellulaire et de la membrane basale, leur possible implication dans les

processus cancéreux a pendant longtemps été proposée. Afin de mieux préciser l’importance

physiologique des différentes MMPs, des lignées de souris, dans lesquelles un gène de MMP

a été invalidé, ont été produites. De façon inattendue, la plupart de ces souris transgéniques ne

présentent pas de phénotypes particuliers, à l’exception des souris KO (knock-out : ne

possédant pas le gène) pour la MT1-MMP. Bien entendu, le rôle d’une MMP particulière peut

être difficile à déterminer si, après invalidation du gène, d’autres MMPs sont capables de

prendre le relais de la MMP manquante. Ainsi, aujourd’hui, seules les souris MMP-14 -/- (ne

possédant pas le gène) présentent un phénotype sévère : nanisme, ostéoporose, arthrite et

synovite, accompagnée de fibrose du synovium. La déficience en MMP-14 chez les souris

engendre des défauts dans les tissus conjonctifs et au niveau du squelette. L’ensemble de ces

observations suggère une implication de la MMP-14 dans le métabolisme du collagène. De

plus, cette déficience serait responsable d’une angiogenèse défectueuse, conduisant à une

mort prématurée 207, 208.

Il est intéressant de noter que lorsqu’elles ont été étudiées dans un contexte

« pathologique », les différentes souris KO pour une MMP ont permis de suggérer un rôle

particulier pour ces MMPs dans le développement de la maladie. Par exemple, les souris

MMP-12 -/-, contrairement aux souris MMP-12 +/+ (possédant le gène), ne développent pas

d’emphysème après une longue exposition à la fumée de cigarette 183. De plus, il apparaît un

phénomène primordial chez ces souris MMP-12 -/- : les macrophages sont incapables de

franchir la membrane basale 209. Les souris MMP-3 -/- apparaissent plus susceptibles que les

souris contrôles dans des modèles d’arthrite induit par le collagène. Cette observation semble

étonnante dans la mesure où l’Homme atteint de cette maladie présente une surexpression de

la MMP-3 210.

Dans tous les modèles de progression tumorale, le recours aux animaux transgéniques

pour les MMPs ont conduit à la conclusion que les MMPs favorisent le développement des

tumeurs, à l’exception de la MMP-8 dont l’absence provoque chez ces animaux des tumeurs

plus importantes, suggérant ainsi que la MMP-8 participerait à la défense de l’hôte contre la

progression tumorale 211.


sur 240

Les quelques exemples discutés ci-dessus, illustrent le fait que la vision unitaire sur le

rôle des MMPs, impliquées dans la dégradation de protéines de la matrice extracellulaire, doit

être modifiée pour intégrer de nouvelles données. Parmi celles-ci, figure la notion selon

laquelle les MMPs pourraient jouer des rôles opposés dans les phénomènes physiologiques ou

pathologiques. Dans une même pathologie, comme le cancer, cette notion s’applique même

pour des MMPs possédant des spécificités biochimiques proches, comme les différentes

collagénases. Les MMPs semblent être mobilisées tout au long des phases initiales de la

progression tumorale (prolifération, survie, angiogenèse, invasion et réponse immunitaire),

comme l’illustre la Fig. 22. Une MMP peut avoir dans un même processus une activité pro-

tumorale ou anti-tumorale selon le substrat clivé et donc la cascade enclenchée 153, 212.

Globalement, elles seraient ainsi impliquées dans la régulation de la croissance de la tumeur

en libérant des facteurs de prolifération cellulaire, tels que le facteur de croissance de type

insuline (IGF) 213. Elles pourraient aussi activer les précurseurs de facteurs de croissance liés à

la membrane cytoplasmique ou présents dans la matrice extracellulaire péritumorale 214.

Figure 22. Dualité fonctionnelle des MMPs au cours de la progression tumorale. Le symbole bleu indique une activité pro-tumorale, alors que le symbole rouge indique un effet anti-tumoral 212.


sur 240

L’expression des MMPs se fait au niveau du front invasif de la tumeur (Fig. 23) 62.

Les cellules inflammatoires en périphérie secrètent en grande majorité la MMP-9. Les autres

MMPs sont plutôt exprimées par les fibroblastes et les cellules tumorales. Il en résulte une

forte concentration des MMPs au niveau de la zone invasive des tumeurs.

La dualité d’action (pro et anti-tumorale) des MMPs lors des différentes étapes de la

progression tumorale ainsi que la variabilité de leur expression selon les cellules, rendent la

compréhension du rôle des MMPs très difficile. Par contre l’analyse des différents substrats

clivés et des produits formés peut nous apporter des informations essentielles dans la

compréhension de leurs actions.

Figure 23. Expression des MMPs et de leurs inhibiteurs (les TIMPs) au niveau d’une tumeur du sein 62.

4.5. Rôle des MMPs.

Les MMPs sont impliquées dans la dégradation de nombreuses protéines de la matrice

extracellulaire mais aussi non matricielles 62, 149. Un nombre important de candidats ont été

testés et identifiés comme substrats in vitro. Seuls quelques substrats ont été clairement

identifiés in vivo. Une liste de molécules pouvant être clivées par les MMPs, est présentée sur


sur 240

le Tableau 4. Certains de ces composés matriciels et bioactifs sont en relation avec une étape

particulière de la progression tumorale.

Tableau 4. Récapitulatif des substrats bioactifs et matriciels des MMPs 188, 212

MMP

MMP-1 (Collagénase 1 ou collagénase interstitielle)

pro-TNFα IGFPB-2,-3 ,-5 MCP-1,-2 ,-3

L-1β

α2-macroglobuline L-sélecine

α1-antichymotrypsine

Collagènes I, II,III,VII & X Gélatines Entactine

Caséine Aggrécane

Protéine de liaison au cartilage

MMP-2 (Gélatinase A)

pro-TNFα IGFPB-3 ,-5

Endotheline-1 SDF-1

α2-macroglobuline MCP-3 α1-PI

Pro-TGFβ

Collagènes I, IV,V,VII & XI Gélatines

Fibronectine Grande ténascine C

Lamine Aggrécane

Elastine

MMP-3 (Stromélysine 1)

pro-TNFα IGFPB-3

E-cadherine SDF-1 α1-PI

α2-macroglobuline MCP-1,-2 ,-3 ,-4

Endostatine Plasminogène

Antithrombine III

Collagènes III, IV,IX & X Gélatines

Fibronectine

Lamine Aggrécane

Grande ténascine C

MMP-7 (Matrilysine)

FasL Pro-TNFα

E-cadhérine Pro-α-défensine

α1-PI α2-macroglobuline


Aggrécane Fibronectine

Elastine Laminine

Gélatines Collagène IV

Entactine

MMP-8 (Collagénase 2 ou collagénase neutrophile)

Pro-TNFα MCP-1 IGFPB

α1-PI α2-macroglobuline α2-antiplasmine

Collagènes I, II & III Caséine

Aggrécane

MMP-9 Gélatinase B

L-1β L-2Rα

proIL-8 pro-TNFα pro-TGFβ

IFN-β

α1-PI α2-macroglobuline


Tumstatine Substance P

Gélatines Aggrécane Entactine

Elastine Collagène III, IV, V & XIV

MMP-10 (Stromélysine 2)Aggrécane

Fibronectine Lamine

Collagènes III, IV & V

MMP-11 (Stromélysine 3)α1-antitrypsine

IGFBP-1α1-PI

α2-macroglobuline Caséine

MMP-12 (Métalloélastase)pro-TNFα

Endostatineα1-PI

PlasminogèneElastine

Collagène I & IVκ-élastine Gélatine

MMP-13 (Collagénase 3)

pro-TNFα SDF-1 MCP-3

α1-antichimotrypsine Endostatine

Collagènes I, II, III, IV, VI, IX, X & XIV

Gélatines

Aggrécane Perlécane

Fibronectine

MMP-14 (MT1-MMP)

pro-TNFα SDF-1 MCP-3

Intégrine ανβ3 syndécanes

CD-44 Transglutaminase tissulaire

α1-PI α2-macroglobuline KiSS-1/méstatine

Collagènes I & III Frobronectine

Ténascine

Nidogène Aggrécane Perlécane

MMP-15 (MT2-MMP) pro-TNFα Tranglutaminase tissulaireFribronectine

Ténascine Laminine

Nidogène Aggrécane Perlécane

MMP-16 (MT3-MMP)pro-TNFα

syndécanes Transglutaminase tissulaire

KiSS-1/méstatine

Collagènes I, II & III Gélatine I Vitrnectine

Fibronectine Lamine

MMP-17 (MT4-MMP) pro-TNFα α2-macroglobuline Gélatines

MMP-19

Gélatines Caséine

Fibronectine Collagène IV

Lamine Nidogène

Fibrinogène Fibrine

MMP-20 ( Enamélysine)

Amélogénine Aggrécane

MMP-21

MMP-23 Gélatines

MMP-24 (MT5-MMP) KiSS-1/méstatineGélatines

Collagène IFribronectine

Laminine

MMP-25 (MT6-MMP) α1-PI Collagènes IV

GélatineFibronectine

MMP-26 (Matrilysnine 2 ou endométase)

IGFBP-1 α1-PI Collagènes IV

GélatineFibronectine

MMP-27

MMP-28 (Epilysine) Epilysine Caséine

Substrats bioactifs Substrats matriciels


sur 240

L’hydrolyse de ces substrats par les MMPs peut conduire à différentes voies de

signalisation qui peuvent soit inhiber la progression tumorale ou bien la promouvoir.

Quelques fois des clivages du même substrat peuvent conduire à des effets opposés.

Différents processus sont concernés par cette dualité fonctionnelle des MMPs (Fig. 24) :

� Le développement des cellules tumorales

� La survie des cellules cancéreuses

� L’angiogenèse tumorale

� La régulation de l’invasion cellulaire

� La différenciation cellulaire

� La réponse immunitaire

4.5.1. Dualité fonctionnelle des MMPs dans le développement et la survie des

cellules cancéreuses

Au niveau des souris déficientes en MMP-9, la prolifération des cellules tumorales est

diminuée 215, 216. Ce qui suggère que la MMP-9 doit par son action libérer des signaux de

croissance. Le clivage d’un précurseur membranaire de TGF-α (Transforming Growth Factor

α) par les MMPs, libère le TGF-α induisant ainsi la prolifération cellulaire 217 (Fig. 24a). Le

même effet est obtenu par le clivage des précurseurs de facteurs de croissance quiescents de la

matrice extracellulaire tel que le IGF (Insulin Growth Factor) 218, 219 issu de l’hydrolyse de

l’IGF-BP (BP : Binding Protein) (Fig. 24a,b). La liaison de l’IGF aux intégrines va induire

des signaux de survie cellulaire. La liaison des produits de dégradation de la matrice

extracellulaire aux intégrines participe aussi à cette prolifération. La MMP-7 peut avoir un

effet anti-apoptotique en clivant la pro-HB-EGF (pro-Heparin Binding Epidermal Growth

Factor) 220. Le facteur libéré, l’HB-EGF va se lier à un récepteur de type tyrosine kinase

(ERBB4) permettant la survie de la cellule tumorale.


sur 240

Figure 24. Les MMPs dans le développement et la survie des cellules tumorales 62.

L’action des MMPs peut aussi réguler négativement ces divisions cellulaires. La

dégradation des intégrines peut abolir les signaux de survie. La libération du TGF-β latent de

la MEC, peut contrairement au TGF-α, induire l’apoptose 221. Cet effet pro-apoptotique peut

avoir lieu par la libération de certaines molécules tels que le ligand FAS (FASL) ou encore le

TNF-α. Ces deux molécules appartiennent à la grande famille des Tumor Necrosis Factor, des

cytokines impliquées dans la mort cellulaire 222, 223. Le précurseur du ligand FAS est

membranaire. La forme libre induite par l’action de la MMP-7 va provoquer l’apoptose de

cellules environnantes 223 ou bien diminuer la prolifération des cellules tumorales 222 selon la

voie de signalisation impliquée. Le ligand FAS peut à son tour être clivé par les MMPs

diminuant ainsi son action et permettant à la tumeur d’échapper à la mort cellulaire

programmée.

4.5.2. Dualité fonctionnelle des MMPs dans l’angiogenèse tumorale

L’angiogenèse, l’étape la plus importante de la progression tumorale, est en partie

régulée par l’action des MMPs (Fig. 25). Les tests d’invalidation de gène ou encore de

régulation de l’expression des MMPs, ont démontré que l’absence des MMP-2 224, 225et

MMP-9 226 réduisait le processus angiogénique et donc la progression tumorale . La MMP-2

par son action sur le collagène de type IV par exemple, va libérer un site de liaison à

l’intégrine αvβ3. Ce site va induire la migration des cellules endothéliales 227. La MMP-9


sur 240

augmente la biodisponibilité du VEGF 215 via l’hydrolyse des molécules d’héparine sulfate 228. Une autre métalloprotéase, la MMP-14, a été décrite comme ayant une action pro-

angiogénique. Des études ont montré que l’utilisation d’anticorps dirigés contre le site actif de

la MMP-14, pouvait conduire à une inhibition de la migration des cellules endothéliales. La

MMP-14 agirait sur une protéine filamenteuse entourant les parois des vaisseaux sanguins : la

fibrine. Cette protéine est issue du fibrinogène, une glycoprotéine plasmatique impliquée dans

les processus de coagulation. L’hydrolyse de la fibrine permet aux cellules endothéliales

d’envahir le tissu tumoral 229. Le clivage du collagène de type I, le constituant majoritaire de

la MEC, est aussi une étape importante dans la migration des cellules endothéliales 230.

Figure 25. Les MMPs dans l'angiogenèse tumorale

A l’opposé, l’hydrolyse des éléments de la MEC peut aboutir à la libération de

fragments ayant un effet anti-angiogénique. L’action des MMP-2,-3,-7,-9 et -12, produit de

l’angiostatine 231-233 de même que l’hydrolyse du collagène de type XVIII (constituant de la

membrane basale) libère de l’endostatine 234. Ces deux fragments inhibent le processus

d’invasion des cellules endothéliales. Le clivage de certains récepteurs comme l’Urokinase-

Type Plasminogen-Activator par la MMP-12 peut inhiber l’angiogenèse 235. Ce récepteur est

indispensable pour l’invasion des cellules endothéliales à travers la fibrine.


sur 240

4.5.3. Dualité fonctionnelle des MMPs dans l’émission de métastases et la

différenciation cellulaire.

L’émission de métastases est elle aussi en partie régulée par l’action des MMPs. La

régulation négative de l’expression de la MMP-9 ou encore l’invalidation des gènes de la

MMP-2 et -9, réduisent le nombre de colonies métastatiques dans les modèles animaux 225, 236,

237. Dans les premières étapes de la migration de la cellule tumorale, le clivage de la

laminine-5 par la MMP-2 et la MMP-14 libère un site qui favorise la motilité cellulaire

(Fig. 26d) 127, 238. Une colocalisation entre la MMP-14 et la laminine-5 a même été observée 238.

Figure 26. Les MMPs dans l'émission de métastase et la différenciation cellulaire.

Cette motilité cellulaire peut être inhibée par l’action de la MMP-14 sur un récepteur à

l’acide hyaluronique, la protéine CD44 239. Ce récepteur peut lier la MMP-9, la confinant ainsi

à la surface de la cellule. Cette localisation est indispensable pour l’invasion tumorale et

l’angiogenèse 240. La mutation du site de clivage de la CD44 inhibe la migration cellulaire 239.

La surexpression d’une forme libre de CD44 inhibe l’invasivité des tumeurs in-vivo. Le

clivage de ce récepteur contribue par conséquent à la régulation de l’activité de la MMP-9 à la

surface de la cellule. La migration serait donc régulée non pas par une surexpression des

MMPs mais plutôt par un contrôle du cycle de l’activité des MMPs ou encore par une


sur 240

focalisation de l’activité. Autrement dit, elle serait liée à la concentration de l’activité des

MMPs à la surface de la cellule.

Des expériences visant à évaluer la capacité des cellules à envahir un gel matriciel in

vitro ont démontré qu’il n’existait aucune relation entre la surexpression de la MMP-2 et

l’aptitude des cellules à pénétrer le gel. Les cellules exprimant un taux moyen de MMP-2 ont

montré la plus grande activité de pénétration ce qui exclut la théorie qui tend à dire que plus

les MMPs seront exprimées et plus l’invasion sera grande. La plupart des cellules nécessitant

l’activité des MMPs présentent des prolongements cellulaires appelés invadopodes qui vont

recruter ces protéases 241. La MMP-9 peut ainsi être réquisitionnée par le récepteur CD44 242,

de même que la MMP-2 par la MMP-14 (MT1-MMP) ou bien par les intégrines 243.

L’action des MMPs peut aussi induire une différentiation cellulaire. Ainsi, le clivage

de la E-cadhérine par la MMP-3 et 7 244 peut augmenter la prolifération cellulaire mais aussi

induire la transition d’une cellule tumorale normale à une cellule tumorale dite

mésenchymateuse, plus agressive 245. Cette transition est dénommée EMT (Epidermal to

Mesenchymal Transition) 246, 247, la libération de TGF-β participerait à cette différenciation

(Fig. 26e), mais le mécanisme est encore méconnu.

4.5.4. Dualité fonctionnelle des MMPs lors de la réponse du système immunitaire

L’activité des MMPs permet aux cellules cancéreuses de lutter contre le système

immunitaire. Un des processus induisant la prolifération des lymphocytes T cytotoxiques peut

être inhibée par l’action de la MMP-9. En effet, ce processus est enclenché par la liaison de

l’interleukine-2 (IL-2) à son récepteur (IL-2Rα) (Fig. 27). Le clivage de ce récepteur, de

même que la libération de TGF-β, par la MMP-9 contribue à diminuer l’action des

lymphocytes T 214, 248.

Une autre population de cellules immunitaires, les NK (natural killer, tueuses

naturelles), peuvent être influencées par l’action des MMPs. Les NKs sont capables de lyser

des cellules étrangères à l'organisme de manière indépendante de l'antigène et sans activation

préalable, au contraire des lymphocytes T et B. Les NKs peuvent être recrutées par un

inhibiteur de protéases à sérine, la protéine α1-proteinase-Inhibitor. La sensibilité de ces

cellules peut être diminuée via l’hydrolyse de cet inhibiteur par la MMP-1 249.


sur 240

De nombreuses chimiokines sont reconnues et clivées par les MMPs. Les chimiokines

(cytokines chimioattractantes) sont une famille de petites protéines, majoritairement solubles,

de 8-14 kilodaltons. Leur fonction la plus étudiée est l'attraction (chimiotactisme) et le

contrôle de l'état d'activation des cellules du système immunitaire. Le clivage de

l’interleukine-8 (IL-8ou CXCL8, un chimioattractant de neutrophile) par la MMP-9 ou encore

le clivage de la protéine CCL7 (ou MCP-3, Monocyte Chemoattractant Proteine, un

chimioattractant de monocyte, la forme non évoluée du macrophage) par la MMP-2, limite le

recrutement de ces cellules et donc inhibe la réponse immunitaire 250. Les produits de

dégradation de MCP-3 sont aussi des antagonistes du récepteur de CCL7 amplifiant ainsi

l’inhibition du recrutement des monocytes.

Figure 27. Les MMPs dans la réponse immunitaire.

Certaines chimiokines, comme le ligand CXCL12, sont impliquées dans la migration

des cellules tumorales vers d’autres tissus lors de l’émission de métastases. Le ligand se lie à

son récepteur, la protéine CXCR4, exprimée par les cellules métastatiques. Ce récepteur est

surtout exprimé sur les leucocytes et permet leur recrutement vers les tissus exprimant le

ligand CXCL12. Le clivage de CXCL2 par les MMP-1,-3,-9,-13 et -14 permet donc de

réduire la formation de métastases 251.

L’activité des MMPs n’est pas limitée à la dégradation de la matrice

extracellulaire pour permettre aux cellules tumorales d’envahir les tissus sains et de

proliférer. Cette activité est au cœur des différents processus pro et anti-tumoraux, via la


sur 240

libération ou la destruction de facteur de croissance ou encore via la modulation de la

réponse tumorale. La dualité fonctionnelle des MMPs explique en grande partie les

échecs cliniques répétés des inhibiteurs synthétiques de MMPs. La plupart de ces

inhibiteurs ciblent plusieurs MMPs, ce qui rend leurs actions plus qu’aléatoire. Le

développement d’inhibiteurs plus spécifiques permettrait de cibler plus précisément

l’action d’un groupe de MMPs impliqué dans la progression tumorale. Ce groupe reste

encore à définir, vu le nombre impressionnant de substrats matriciels et bioactifs clivés

par les MMPs. Le développement d’un substrat spécifique d’une ou de plusieurs MMPs

est un enjeu capital pour la détection et la compréhension de l’activité de ces protéases

lors ces différents processus. Notre objectif est de synthétiser des substrats spécifiques

de l’activité enzymatique des MMPs afin de contruire des systèmes supramoléculaires

capables de libérer au sein de la tumeur des principes actifs anti-cancéreux.


sur 240

5. Les méthodes de détections de l’activité des MMPs.

La mesure de l’activité protéolytique des MMPs dans les milieux biologiques

représente un challenge important. Plusieurs méthodes de détections sont utilisées :

� La zymographie. Elle est basée sur l’électrophorèse de l’enzyme à étudier dans

un gel contenant ses substrats 252-262.

� L’électrophorèse en présence de colorants fluorescents est également utilisée 263. Les fragments obtenus après digestion sont déposés sur le gel

d’électrophorèse, puis séparés et détectés par fluorescence.

� Les procédures immunochimiques. Elles sont très rarement utilisées car elles

ne permettent pas de discriminer les formes zymogènes des formes actives 264.

� L’absorption UV-visible. L’incorporation d’un groupe dinitrophényle (Dnp) et

des méthodes de séparations (HPLC) peuvent donner accès à la mesure de leur

activité 265-268.

� La fluorescence : La fixation d’une sonde fluorescente FITC (Fluorescéine

IsoThioCyanate) 269 ou d’une sonde du type dansyle 270, 271 sur les substrats

permet, par des techniques de séparation comme l’HPLC, la détection de

l’activité des MMPs 272, 273.

� Le FRET ( Fluorescence or Förster Resonance Energy Transfer) 274. Ces

systèmes se composent d’un groupe donneur fluorescent et d’un groupe

accepteur non fluorescent (« quencher »). Lorsque le peptide est intègre, la

fluorescence du donneur est très fortement atténuée par la présence de

l’accepteur à sa proximité. Lors du clivage, la distance entre le donneur et

l’accepteur augmente, l’extinction de transfert d’énergie par résonance

diminue. Ceci se traduit par l’augmentation de l’intensité de fluorescence du

donneur, ce qui permet de mesurer l’activité enzymatique.

Les tests d’activité enzymatique sont généralement basés sur des protéines ou des

peptides synthétiques marqués par des sondes fluorescentes. Le phénomène biologique est

alors directement relié à une variation de fluorescence ou des variations de FRET. Ce

phénomène physique est de plus en plus utilisé en détection car il permet d’obtenir un nombre


sur 240

important d’informations. En effet, le FRET a l’avantage d’être d’une très grande sensibilité

et permet de diminuer les concentrations moléculaires nécessaires pour caractériser un

phénomène biochimique.

De nombreux couples donneur d’énergie/accepteur non fluorescent ont prouvé leur

utilité pour mesurer l’activité des MMPs 275-279(Tableau 5).

Tableau 5. Principaux couples donneur/accepteur non fluorescent utilisés.

Couple donneur/accepteur Donneur fluorescent Accepteur non fluorescent

W/Dnp W (Tryptophane) Dnp (2,4-dinitrophényle)

Abz/Dnp Abz (Acide o-aminobenzoique)

Dnp (2,4-dinitrophényle)

Mca/Dnp Mca ((7-méthoxycoumarin-4-yl) acétyle)

Dnp (2,4-dinitrophényle)

Mca/Dpa Mca ((7-méthoxycoumarin-4-yl) acétyle)

Dpa (N-3-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropyle)

W/Dns W (Tryptophane) Dns (dansyle)

Nma/Dnp Nma (Ne-méthylanthranoyle) Dnp (2,4-dinitrophényle)

DMC/NBD DMC (6,7-

diméthoxycoumarin-4-yl) acétyle)

NBD (Acide 6-N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) amino hexanoique)

EDANS/Dabcyl EDANS (Acide 5-(2’-

aminométhyl) naphtalène sulfonique)

Dabcyl (Acide 4-(4’-diméthylaminophénylaza) benzoique)

Actuellement, la majorité des essais de mesure d’activité des MMPs est réalisée avec

des peptides fluorescents en utilisant ces couples donneur/accepteur. Une liste non exhaustive

des différents substrats fluorescents des MMPs est présentée dans le Tableau 6.


sur 240

Tableau 6. Structure de quelques substrats fluorescents des MMPs. Les abréviations en gras représentent les accepteurs non fluorescents, celles en gras et en italique sont les donneurs fluorescents 280.

Structure du substrat fluorescent MMP ciblée

Dnp-P-L-G~L-W-A-D-R-NH B2B MMP-1,-2,-3,-7,-9

Dnp-P-béta-cyclohexyl-A-G~C(Me)-H-A-K(N-Me-Abz)-NH B2B MMP-2, -3, -7

Dnp-P-Q-G~I-A-G-W MMP-1,-2,-3,-8,-9

Mca-K-P-L-G~L-Dpa-A-R-NH B2B MMP-1, -8, -13, -14

Mca-R-P-K-P-Y-A~Nva-W-M-K(Dnp)NH B2B MMP-1,-2, -3, -9

Mca-R-P-K-P-V-E-Nva-W-R-K(Dnp)NH B2B MMP-3, -9

Dnp-P-Cha-G-C(Me)-H-A-K(Nma)-NH B2B MMP-1, -9

Dabcyl-Gaba-R-P-K-P-V-E-Nva-W-R-E(EDANS)-NH B2B MMP-1,-2, -3, -9

Dabcyl-Gaba-P-Q-G~L-E(EDANS)-A-K-NH B2B MMP-1,-2, -3, -9

La grande majorité de ces substrats synthétiques sont peu spécifiques et peuvent être

clivés par un grand nombre de protéases. Ils sont développés uniquement pour l’étude

cinétique de l’activité des MMPs en solution. La synthèse de ces substrats fait appel à une

fonctionnalisation finale du peptide synthétique à ses extrémités N et C terminales 277, 281.

Ceci rend la synthèse des substrats fastidieuse. Une autre méthodologie de synthèse fait appel

à une stratégie de protection orthogonale. Le peptide est synthétisé sous une forme protégée

(avec différents groupements protecteurs), puis les chromophores sont rajoutés par

déprotection de certains groupements. Il sera donc important de simplifier les méthodes de

synthèse, en diminuant notamment les étapes après la synthèse peptidique.

5.1. Elaboration de nouveaux substrats, plus sensibles et plus sélectifs des

MMPs.

Pour notre étude, nous voulons développer des systèmes peptidiques incorporant dans

un premier temps une séquence clivable naturelle de MMP. Les séquences des substrats

reconnus et clivés par les MMPs font l’objet de recherches intensives. Nous nous sommes

donc volontairement limités à celles qui ont été confirmées (Tableau 7). Pour ce premier

essai nous avons choisi de cibler trois métalloprotéases majeures :

� La MMP-1, pour son implication dans les processus métastasiques.


sur 240

� La MMP-2 et la MMP-9, pour leur implication dans différentes étapes clés de

la progression tumorale.

Tableau 7. Séquences de clivage connues des MMPs

Substrats Séquence clivable Référence MMP-1/MMP-8

Collagène I humain ( α1) Ala-Pro-Gln-Gly775

~Ile776

-Ala-Gly-Gln 282 Collagène I humain ( α2) Gly-Pro-Gln-Gly

775~Leu

776-Leu-Gly-Ala 282

Collagène II humain Gly-Pro-Gln-Gly775

~Leu776

-Ala-Gly-Gln 282 Collagène III humain Gly-Pro-Leu-Gly

775~Ile

776-Ala-Gly-Ile 282

Macroglobuline α2 humaine Gly-Pro-Glu-Gly679

~Leu680

-Arg-Val-Gly 205 Protéine humaine de

gestation Tyr-Glu-Ala-Gly

685~Leu

686-Gly-Val-Val 205

Inhibiteur de la protéase α1 Gly-Ala-Met-Phe352

~Leu353

-Glu-Ala-Ile 283 Agrrécane humaine Ile-Pro-Glu-Asn

341~Phe

342-Phe-Gly-Val 284

Agrrécane humaine Thr-Glu-Gly-Glu373

~Ala374

-Arg-Gly-Ser 284 Liaison au cartilage Arg-Ala-Ile-His

16~Ile

17-Gln-Ala-Glu 285

Protéine de liaison 3 à l’IGF Leu-Arg-Ala-Tyr99

~Leu100

-Leu-Pro-Ala 286 MMP-2

Agrrécane humaine Ile-Pro-Glu-Asn341

~Phe342

-Phe-Gly-Val 287 Galectine 3 humaine Pro-Pro-Gly-Ala

62~Tyr

63-His-Gly-Ala 288

Liaison au cartilage Arg-Ala-Ile-His16

~Ile17

-Gln-Ala-Glu 285 Liaison au cartilage Gly-Pro-His-Leu

25~Leu

26-Val-Glu-Ala 285


~Leu100

-Leu-Pro-Ala 286 MMP-3

Macroglobuline α2 humaine Gly-Pro-Glu-Gly679

~Leu680

-Arg-Val-Gly 206 Antichymotripsine α1

humaine Leu-Leu-Ser-Ala

360B~Leu

361-Val-Glu-Thr 289

Inhibiteur de la protéase α1 Glu-Ala-Ile-Pro357

~Met358

-Ser-Ile-Pro 289 Antithrombine 3 Ile-Ala-Gly-Arg

385~Ser

386-Leu-Asn-Pro 289

Agrrécane humaine Ile-Pro-Glu-Asn341

~Phe342

-Phe-Gly-Val 290 Substance P Lys-Pro-Gln-Gln

6~Phe

7-Phe-Gly-Leu 291

Pro-MMP-1 Asp-Val-Ala-Gln80

~Phe81

-Val-Leu-Thr 292 Pro-MMP-3 Asp-Thr-Leu-Glu

68~Val

69-Met-Arg-Lys 293

Pro-MMP-3 Asp-Val-Gly-His82

~Phe83

-Arg-Thr-Phe 293 Pro-MMP-8 Asp-Ser-Gly-Gly

78~Phe

79-Met-Leu-Thr 294

Pro-MMP-9 Arg-Val-Ala-Glu40

~Met41

-Arg-Gly-Glu 295 Fibronectine humaine Pro-Phe-Ser-Pro

589~Leu

590-Val-Ala-Thr 296


~Leu100

-Leu-Pro-Ala 286 Liaison au cartilage Arg-Ala-Ile-His

16~Ile

17-Gln-Ala-Glu 285

MMP-7 Agrrécane humaine Ile-Pro-Glu-Asn

341~Phe

342-Phe-Gly-Val 287

Liaison au cartilage Gly-Pro-His-Leu25

~Leu26

-Val-Glu-ala 285 Prourokinase humaine Pro-Pro-Glu-Glu

143~Leu

144-Lys-Phe-Gln 297

MMP-9 Collagène V humain ( α1) Gly-Pro-Pro-Gly

439~Val

440-Val-Gly-Pro 298

Collagène V humain ( α2) Gly-Pro-Pro-Gly445

~Leu446

-Arg-Gly-Glu 298 Collagène XI humain ( α1) Gly-Pro-Gly-Gly

439~Val

440-Val-Gly-Pro 298

Agrécane humaine Ile-Pro-Gln-Asn341

~Phe342

-Phe-Gly-Val 287 Galectine 3 humaine Pro-Pro-Gly-Ala

62~Tyr

63-His-Gly-Ala 288


~Ile17

-Gln-Ala-Glu 285 MMP-10


~Ile17

-Gln-Ala-Glu 285 Liaison au cartilage Gly-Pro-His-Leu

25~Leu

26-Val-Glu-Ala 285


sur 240

Ci-dessous les séquences choisies pour les différents MMPs.

Collagène I humain (α2) Gly-Pro-Gln-Gly775~Leu776-Leu-Gly-Ala MMP-1

Galectine 3 humaine Pro-Pro-Gly-Ala62~Tyr63-His-Gly-Ala MMP-2

Collagène XI humain (α1) Gly-Pro-Gly-Gly439~Val440-Val-Gly-Pro MMP-9

Afin de faciliter et de diminuer le temps de synthèse de peptides fluorescents, nous

avons envisagé la synthèse d’acides aminés modifiés (incorporant une sonde fluorescente),

directement utilisables en synthèse peptidique en phase solide (SPPS) 299, 300. Notre choix a

été dicté par plusieurs conditions :

� Les sondes doivent avoir des longueurs d’onde d’absorption et d’émission de

fluorescence en dehors de celles des protéines et des acides nucléiques.

� Les spectres d’absorption et de fluorescence des sondes doivent être

compatibles avec le phénomène de transfert d’énergie par résonance (FRET).

Le recouvrement entre le spectre d’émission de fluorescence de l’une et le

spectre d’absorption de l’autre doit être maximal.

� Les sondes doivent posséder un bon rendement quantique (nombre de photons

émis par rapport au nombre de photons absorbés) et être suffisamment stables

au photo-blanchiment. En effet, beaucoup de fluorophores ont une durée de vie

limitée et se détruisent rapidement lorsqu’ils sont irradiés.

� L’encombrement stérique des sondes doit être minimal afin de ne pas

provoquer de gêne lors de la reconnaissance du système par la cible

biologique.

� Ces sondes doivent être pourvues d’une fonction chimique facilement

fonctionnalisable afin de faciliter leur incorporation sur un acide aminé ou sur

la fonction libre d’un vecteur.

� Le produit final incorporant ces sondes doit être le plus neutre possible afin de

ne pas altérer l’affinité de liaison avec une enzyme ou un récepteur et de

permettre la pénétration dans les cellules.


sur 240

Nous avons porté notre attention sur les dérivés des coumarines (Fig. 28). En effet, ces

dernières sont connues pour posséder un très bon rendement quantique et une grande stabilité 301. Leurs applications sont nombreuses, en tant que colorants, sondes laser 302, 303…etc. Ces

sondes permettent aussi d’imager des cellules ex-vivo 304.

12

43

56

7

8O O1

2

43

56

7

8O O

Figure 28 : Structure de la coumarine.

Deux dérivés nous ont semblé plus particulièrement intéressants. Ils possèdent sur la

position 3 une fonction acide carboxylique permettant une fonctionnalisation ultérieure (Fig.

29). Leurs spectres d’absorption et de fluorescence donnent la possibilité de réaliser du FRET

entre ces deux sondes.

12

4

3

56

7

8

acide 7-diéthylaminocoumarin-3-carboxylique (2)acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique (1)

MC DAC

12

4

3

56

7

8O O

O

OH

O O

O

OH

ON1

2

4

3

56

7

8


MC DAC

12

4

3

56

7

8O O

O

OH

O O

O

OH

ON

Figure 29. Structure des sondes dérivant de la coumarine. DAC : λmax = 407 nm, ε = 32000 M−1 cm−1 ;

MC : λmax =335 nm, ε =19000 M−1 cm−1.

La particularité de cette association est que les deux molécules sont fluorescentes

contrairement aux autres couples Donneur/Accepteur où seul le donneur est fluorescent. Les

substrats ainsi obtenus pourront être détectés à deux longueurs d’ondes différentes.

Notre approche a été de synthétiser des substrats linéaires sur la base des séquences

choisies pour la MMP-1, MMP-2 et MMP-9. Ces peptides seront marqués via des acides

aminés modifiés qui comporteront les sondes fluorescentes DAC et MC.


sur 240

La finalité de ce travail est d’incorporer nos peptides dans des systèmes de DRUG

DELIVERY afin de cibler spécifiquement les zones d’intense activité des métalloprotéases.

Pour accomplir cette tache, nos substrats devront dans un premier temps être sélectifs mais

surtout stables dans un milieu biologique complexe. Ce dernier point est essentiel pour que la

libération d’un pharmaceutique se fasse de manière contrôlée.

5.2. Stratégie pour augmenter la stabilité et la spécificité des substrats

fluorescents.

Un grand nombre de peptides sont utilisés en clinique comme agents thérapeutiques.

Le Glucagon like peptide-1 et ses dérivés (antagoniste de l’insuline) sont utilisés pour soigner

le diabète. La somatostatine, une hormone endogène de 14 ou 24 acides aminés, impliquée

dans l’inhibition de la sécrétion d’autres hormones endogènes (l’hormone de croissance,

l’insuline, le glucagon, etc...) est utilisée dans le traitement des tumeurs gastro-intestinales.

Ces peptides de petite taille ont une durée de vie très courte dans le plasma et dans les tissus.

Ceci est avant tout lié à leur caractère hydrophile, qui augmente leur élimination rénale. Ces

peptides sont aussi dégradés rapidement par diverses protéases. Les principales sources de

protéases sont : le foie, les reins et le plasma. Ces protéases sont répertoriées dans la revue de

Werle et al.305 .

Plusieurs méthodes sont utilisées pour augmenter la durée de vie de ces peptides. Dans

le cas de la somatostatine, la séquence a été raccourcie de 14 à 8 acides aminés et certains

aminoacides L ont été remplacés par des acides aminés D. La durée de vie du dérivé obtenu,

l’octréotide, est passée de quelques minutes à une heure 305, 306. Pour des protéines de grande

taille (plus de 5kDa) la PEGylation (ajout d’une chaîne polyéthylène glycol) est adoptée afin

de bloquer les extrémités C et N-terminales, limitant ainsi l’action des exo protéases (enzymes

qui digèrent les protéines par ces extrémités). Quelques protéines natives comme l’interféron

α-2b (INF-α-2b), l’EGF, ou encore le TNF (Tumor Necrosis Factor) ont subi cette

modification. Ceci a augmenté considérablement leur durée de vie 307-309.

Enfin la cyclisation des peptides via ses deux extrémités donne aussi de bons résultats.

Les peptides cycliques sont connus pour être plus stables que les peptides linéaires 310-313. Ils

sont très peu accessibles pour les exo-protéases. La liaison des extrémités réduit aussi la

flexibilité des peptides et donc leur degré de liberté. Cette réduction rigidifie la structure et


sur 240

dans certains cas permet d’augmenter la spécificité du peptide pour un récepteur par exemple,

en réduisant le nombre de conformations du peptide 310. De plus, les cyclopeptides traversent

plus facilement la bicouche lipidique des cellules, du fait de cette absence de polarité des

extrémités N et C-terminales 314. Les peptides cycliques sont largement représentés dans la

nature 315-317. Certains comme la cyclosporine A 318 (un immunosuppresseur), la caspofongine 319 (un agent antifungique) ou encore la daptomycine 320(un antibiotique) sont couramment

utilisés comme agent thérapeutique en clinique.

Au niveau des substrats de métalloprotéases, le groupe de Fields 172, 299, 321 a développé

une structure mimétique de la triple hélice de collagène. Le but était d’intégrer sur une même

molécule trois séquences clivable de MMPs afin d’augmenter la stabilité thermodynamique

du substrat et de se rapprocher le plus possible de la forme en triple hélice du collagène

Fig. 30. Ce substrat d’au moins 80 acides aminés intègre la séquence Gly-Pro-Hyp

responsable de la structuration en hélice du collagène et la séquence clivable fluorogénique.

Figure 30. Substrat fluorescent de MMPs sous la forme d'une triple hélice (THP, Triple Helical Peptide) 299. En rouge est représentée la répétition de la séquence (Gly-Pro-Hyp) responsable de la structuration en triple hélice du collagène.

La conception de ce type de substrat est évidement lourde, et rend leur synthèse au

quotidien difficile. Il nous a semblé nécessaire d’orienter notre recherche de substrat stable

vers un modèle plus petit en nombre d’acides aminés, mais avec ce souci de conserver une

structure avec une conformation réduite proche de la structure en triple hélice du collagène.

Ainsi, au cours de notre travail, nous avons cherché à développer un substrat cyclique,

afin d’augmenter la sélectivité de nos substrats de métalloprotéases et leur stabilité. La

cyclisation directe d’un substrat fluorogène de MMPs ne permettant pas de visualiser une


sur 240

variation de la fluorescence du donneur lors du clivage enzymatique (Fig. 31a), un modèle

comportant deux zones clivables par les MMPs a été envisagé (Fig. 31b).

Figure 31. Cyclisation d’un substrat fluorogène de MMPs : a) La cyclisation directe ; b) La cyclisation de deux séquences clivables par les MMPs.

De plus, contrairement aux peptides linéaires, ces structures cycliques présentent une

rigidité pouvant se comparer à celle des triple hélices de collagène. Nous espérons augmenter

la spécificité de nos substrats par ce procédé.

5.3. Utilisation des substrats de métalloprotéases dans des systèmes de DRUG

DELIVERY.

La mise en place de méthodes de délivrance de médicaments est un enjeu capital dans

la lutte contre le cancer. La conception de produits pharmaceutiques ne ciblant que les cellules

tumorales est fastidieuse, dans le sens où il faut créer un médicament qui puisse agir contre les

cellules cancéreuses sans endommager le tissu sain environnant. La plupart des traitements

contre le cancer, la chimiothérapie, la radiothérapie ou encore l’immunothérapie, ne sont pas

spécifiques et engendrent beaucoup d’effets secondaires néfastes pour les tissus sains

environnants.

La délivrance de médicaments in-situ présente l’avantage de manœuvrer la bio-

distribution du pharmaceutique de manière à concentrer son action dans les zones cibles. Ces

systèmes d’adressage peuvent même dans certains cas augmenter la solubilité des molécules

permettant ainsi leur administration. Plusieurs systèmes ont été développés pour cibler les


sur 240

zones tumorales via l’activité des métalloprotéases. En effet, la forte activité des MMPs à la

périphérie des tumeurs en fait une cible thérapeutique privilégiée pour libérer in-situ des

molécules bioactives. De plus, la vasculature non structurée des régions tumorales, très dense

et surtout très perméable, rend ces nanosystèmes viables pour le traitement de cette

pathologie. Voici quelques exemples de nanosystèmes :

� Des polymères de Dextran 322, 323

� Des liposomes 324

� Des hydrogels matriciels 325-327 (Gel de poly (éthylène glycol) diacrylate)

Ces structures macromoléculaires vont incorporer les molécules bioactives de manière

covalente via une séquence peptidique clivable par les MMPs (Voir l’exemple des hydrogels

matriciels Fig. 32).

Figure 32. Exemples des hydrogels matriciels 325-327.

L’élaboration de ce type de système doit se faire en plusieurs étapes. En effet le couple

peptide-médicament doit être accessible aux MMPs. Dans le cas des liposomes, le peptide

doit être couplé à une chaine aliphatique pour ensuite être incorporé dans le liposome. Enfin

pour les hydrogels matriciels, la liaison avec le peptide se fait via une polymérisation en

présence de persulfate d’ammonium et de N,N,N’,N’-tetraméthyléthylènediamine. Une fois

l’hydrogel lavé, il est associé au cisplatine qui servira d’agent thérapeutique (toxique pour les

cellules). L’inconvénient dans ce cas est la réversibilité spontanée de la réaction avec le

cisplatine, même si le relargage est plus important en présence de MMPs 325-327. Pour que ce

type d’adressage soit plus efficace, il faudrait que le phénomène de relargage du


sur 240

pharmaceutique soit mieux contrôlé par l’activité des MMPs. Ce qui implique une séquence

clivable très spécifique aux MMPs.

La complexité de l’élaboration de ces systèmes de vectorisation nous a poussée à

envisager une autre approche pour l’obtention de ces produits. Notre réflexion s’est portée sur

l’intégration non covalente du substrat avec le véhicule.

Certaines structures comme les polymères de cyclodextrines ou encore de dextran

peuvent piéger des molécules hydrophobes. Ces deux types de polymères sont biocompatibles

et peuvent donc être utilisés comme nano-vecteur. Plusieurs études réalisées par l’équipe du

Pr.Patrick Couvreur 328-330, ont démontré que des molécules hydrophobes telles que le

tamoxifen pouvaient être incluses dans des systèmes de nano-gels de cyclodextrines auto-

assemblés. Leurs procédés ne nécessitent aucune étape de lavage, donc le nano-gel pourrait

être directement injecté in-vivo.

Les cyclodextrines ne sont pas toxiques 331, elles sont hydrolysées lentement par

l’organisme en libérant des unités de glucose. L’administration orale de βCD à des rats ou des

chiens n’est pas toxique en dessous d’un seuil de 3% de la ration alimentaire journalière. Chez

l’homme la prise journalière ne doit pas excéder 5mg/kg 331. La structure macrocyclique, la

distribution spécifique des différents groupements fonctionnels le long des surfaces interne

(hydrophobe) et externe (hydrophile), permettent aux CDs de se combiner avec des molécules

très diverses, afin de donner des complexes d’inclusion de types hôte-invité « Host-Guest ».

Les cyclodextrines naturelles présentent de nombreux avantages. Elles possèdent :

• plusieurs sites de modifications chimiques

• des cavités de taille variable

• une faible toxicité par voie orale

• une faible activité biologique qui dépend de la modification chimique.

• une solubilité correcte dans les milieux biologiques

• et une bonne biodisponibilité des molécules actives par relargage différé 332.

Ainsi les CDs peuvent être considérées comme des capsules vides de taille variable

pouvant accueillir des molécules actives. Lors de la formation du complexe d’inclusion,


sur 240

aucune liaison covalente n’est formée. L’équilibre entre les constituants du complexe en

solution est caractérisé par une constante d’équilibre (entre les deux phénomènes association-

dissociation). Les interactions mises en œuvre entre l’hôte et l’invité peuvent être de

différentes natures. Il peut s’agir d’interactions coulombiennes (charge électrique /charge

électrique), dipolaires, de Van der Waals ou des liaisons hydrogènes. Par contre, si l’invité

interagit avec l’hôte à l’extérieur de la cavité, il s’agit d’un complexe d’association. De par

cette capacité à accueillir partiellement ou entièrement un très grand nombre de substrats, les

CDs sont aussi appelées molécules « cages » ou molécules « refuges ». En général, de par sa

taille et sa rigidité, la βCD est la plus utilisée. En effet l’αCD est trop petite pour accueillir des

molécules cycliques et la γCD est trop grande pour que des interactions stables se fassent

entre l’hôte et l’invité. Quelques exemples de molécules pouvant être inclues dans la βCD

sont présentés Fig. 33.

acide ursodeoxycholique (UDCA) acide lithocholique (LCA) (+)- menthole

1-adamantanole acide 1-adamantane carboxylique

7-amino-4-methoxycoumarine coumarine 481 (C-481)

COOH COOH

CF3

COOH

OH

H

HOH OH

H

OH

O ONH2 N O O

OH

acide ursodeoxycholique (UDCA) acide lithocholique (LCA) (+)- menthole

1-adamantanole acide 1-adamantane carboxylique

7-amino-4-methoxycoumarine coumarine 481 (C-481)

COOH COOH

CF3

COOH

OH

H

HOH OH

H

OH

O ONH2 N O O

OH

Figure 33. Quelques molécules pouvant se complexer avec la βCD

Les coumarines étant des molécules hydrophobes, elles peuvent être complexées par la

βCD. Nous voulons donc utiliser cette affinité afin de former un nanogel de cyclodextrines

incluant nos substrats de métalloprotéases couplés à un agent pharmaceutique.

Afin de maîtriser cette complexation, nous avons entrepris l’étude des constantes

d’association de la DAC et de la MC, vis-à-vis de la βCD. Le but est de déterminer si la


sur 240

formation d’un complexe βCD substrat fluorogène de métalloprotéases est assez stable en

solution.

6. Conclusions.

La progression tumorale est un processus multi-étapes résultant d’une

prolifération cellulaire anarchique pouvant aboutir à la mort du sujet hôte. La détection

précoce de son apparition permettrait un meilleur diagnostic et assurément une

meilleure chance de survie par un traitement plus précoce. Il est donc nécessaire de

développer des outils spécifiques et sélectifs pour imager ces processus.

Il a été clairement démontré que les métalloprotéases de la matrice extracellulaire

(MMPs) jouent un rôle important à tous les stades du développement tumoral. En effet,

elles permettent la prolifération des cellules cancéreuses en dégradant la matrice

extracellulaire et en « activant » divers médiateurs quiescents. Elles participent aussi

activement à l’angiogenèse tumorale, qui permet une néo-vascularisation du tissu

pathologique et donc la croissance de la tumeur. Elles sont aussi impliquées dans les

processus métastasiques, en favorisant l’accès des cellules tumorales au compartiment

sanguin puis à d’autres tissus. Leurs implications dans plusieurs processus comme la

survie cellulaire, la déviation de la réponse immunitaire ont été abordées. Elles nous sont

donc apparues comme une cible biologique de choix pour imager les processus

tumoraux.

Dans le travail présenté, nous souhaitons développer de nouveaux substrats qui

permettraient de suivre l’activité protéolytique des MMPs. La fluorescence nous est

apparue comme le moyen le plus rapide et le plus efficace pour suivre cette activité en

laboratoire.

Les substrats fluorescents actuels sont basés, en grande majorité, sur

l’incorporation d’une sonde fluorescente et d’un groupe extincteur de fluorescence (un

quencher) après synthèse en phase solide du peptide. Afin de faciliter leur obtention,

nous envisageons une incorporation directe des acides aminés modifiés portant un

groupement fluorescent pendant la synthèse peptidique en phase solide. Notre système

de détection sera composé de deux sondes fluorescentes, dérivées de la coumarine (Fig.

1). Il devrait nous permettre de suivre une activité enzymatique via le mécanisme de

FRET. Nous envisageons la conception de deux types de substrats :


sur 240

des substrats linéaires issus de séquences naturelles spécifiques de MMPs.

des substrats cycliques, dérivés des substrats linéaires et qui comportent 2

séquences clivables par les MMPs.

Les propriétés biologiques de ces peptides vis-à-vis des MMPs seront étudiées.

Nous déterminerons les constantes cinétiques de quelques MMPs vis-à-vis de ces

substrats et nous testerons la stabilité relative de ces composés en présence d’un

échantillon biologique.

Nous avons démontré au cours de cette bibliographie que ces substrats pouvaient

être utilisés dans des systèmes de Drug Delivery. Nous évaluerons la faisabilité de

l’inclusion de nos peptides dans ce type de système. Cette évaluation passera par des

études de complexation entre les coumarines et la βCD.

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sur 240

PARTIE 2 : RÉSULTATS

sur 240



sur 240

L’objectif de notre travail est de développer des systèmes capables de détecter

l’activité des métalloprotéases. Notre choix s’est porté sur un système incorporant des sondes

fluorescentes de type coumarinique. L’observation de l’activité des métalloprotéases, via des

substrats fluorescents devrait nous permettre de mieux préciser leur implication dans ces

pathologies, mais aussi de cibler des zones d’intense activité pour réaliser de l’imagerie ou

bien de la libération contrôlée. Les peptides que nous allons développer dans cette partie

intègrent un système de FRET. Le transfert d’énergie non radiatif ou résonant (en anglais

RET), découvert par Förster dans les années 50, est le phénomène qui permet d’étudier les

interactions entre 2 fluorophores proches dans l’espace. Dans la plupart des articles,

l’expression FRET est la plus utilisée, un acronyme pour « Fluorescence ou Förster

Resonance Energy Transfer ». Nous utiliserons ce dernier terme pour nous référer au transfert

d’énergie.

Il est important de faire la distinction entre transfert radiatif et transfert non radiatif, ou

résonant. Le transfert radiatif ne donne pas accès à des informations comme la distance entre

les fluorophores, leur orientation, et. , qui peuvent être des données essentielles pour

comprendre ou caractériser les systèmes étudiés.

Le transfert radiatif est un processus en 2 étapes. Tout d’abord, un photon est émis par

un donneur D, ensuite de ce photon est absorbé par un accepteur chimiquement différent (A)

ou identique (D) :

1ére étape : D* → D + hν

2ème étape : hν + A → A* ou hν + D → D*

Ce transfert dépend du recouvrement spectral des espèces et de la concentration. Le

donneur émet une lumière qui peut être captée par un accepteur environnant, mais pas

forcement présent sur la même molécule.

Le transfert non radiatif de l’énergie d’excitation nécessite une interaction entre un

donneur et un accepteur, en plus du recouvrement spectral. Il doit exister une correspondance

en énergie entre les transitions vibroniques du donneur et les transitions vibroniques de

l’accepteur. De telles transitions sont couplées (Fig. 34), c'est-à-dire en résonance. Nous

avons une interaction de type dipôle-dipôle.


sur 240

Figure 34. Illustration du recouvrement spectral entre le spectre d’émission du donneur et le spectre d’absorption de l’accepteur. Diagramme d’énergie montrant les transitions résonantes

La théorie de Förster repose sur le transfert d’énergie non radiatif par interaction

dipôle-dipôle. Ce phénomène physique se déroule sur très courte distance et il est

couramment utilisé pour estimer des distances supramoléculaires de 10 à 100 Å. Un des

paramètres importants en FRET est l’efficacité de transfert d’énergie E. E est proportionnel à

1/R06. R0 est la distance critique ou rayon de Förster où l’efficacité de transfert E vaut 50% de

la quantité d’énergie engagée, pour un couple donneur/accepteur donné dans un milieu

particulier. R0 dépend du facteur d’orientation κ2, du rendement quantique du donneur en

absence de transfert ΦD, de l’indice de réfraction moyen du milieu dans la région de

recouvrement spectral et de l’intégrale de recouvrement entre le spectre d’émission du

donneur et celui du spectre d’absorption de l’accepteur (Eq. 1).

Equation 1 : 6

1

0

442

0)()(2108,0

= ∫

∞− λλλ λεφκ dADD InR

avec ∫∞

=0

1)( λλ dI D


sur 240

εA, coefficient d’extinction molaire de l’accepteur ; ID Intensité de fluorescence du

donneur ; κ2 représente la capacité des fluorophores à s’orienter librement dans l’espace.

Lorsque la vitesse d’orientation est plus grande que la vitesse de désexcitation du donneur

(comme c’est le cas dans un milieu non rigide), κ2 est équivalent à 2/3 (moyenne dynamique

isotrope). Les sondes devront avoir un haut dégrée de liberté au sein de la molécule afin de

favoriser le plus possible le FRET. Le transfert d’énergie n’est pas forcement suivi par

émission de fluorescence de l’accepteur. La plupart du temps les accepteurs de fluorescence

comme le Dnp (2,4-dinitrophényle), ou encore le Dpa (N-3-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-

diaminopropyle) ne sont pas des molécules fluorescentes.

Les coumarines que nous allons utiliser lors de notre travail sont l’acide 7-méthoxy-

coumarin-3-carboxylique (MC) et l’acide 7-diéthylaminocoumarin-3-carboxylique, présentés

ci-dessous (Fig. 35).

12

4

3

56

7

8


MC DAC

12

4

3

56

7

8O O

O

OH

O O

O

OH

ON1

2

4

3

56

7

8


MC DAC

12

4

3

56

7

8O O

O

OH

O O

O

OH

ON

Figure 35. Les coumarines DAC et MC.

L’incorporation de ces sondes dans une chaine polypeptidique doit passer par la

conception d’acides aminés modifiés qui permettront d’introduire ces fluorophores pendant la

synthèse peptidique en phase solide. Pour la synthèse de nos acides aminés fluorescents

originaux, notre choix s’est porté sur la lysine 1, pour les raisons suivantes :

� la fonction ε amine permet la formation d’une liaison amide plus stable qu’une

liaison ester.

� la chaîne latérale de la lysine est constituée de quatre CH2, assurant une grande

liberté de mouvement ; nous obtiendrons ainsi un facteur d’orientation

aléatoire des sondes (κ2) équivalent aux 2/3 nécessaires au bon déroulement du

FRET.


sur 240

Nous allons dans un premier temps présenter la synthèse de la DAC et de la MC, puis

des deux acides aminés modifiés intégrant ces coumarines (Fig. 36). Nous nous intéresserons

ensuite à la synthèse des peptides linéaires et cycliques incorporant ces deux acides aminés

pour former un système de FRET. Nous testerons enfin ces peptides in-vitro, afin d’évaluer la

spécificité et la sélectivité de ces substrats vis-à-vis des MMPs.

N-α-fluorenylméthoxycarbonyl-N-ε-[7-diéthylaminocoumarin-3-carboxylamide]-L-lysine

N-α-fluorenylméthoxycarbonyl-N-ε-[7-méthoxycoumarin-3-carboxylamide]-L-lysine

Fmoc-Lys(DAC)-OHFmoc-Lys(MC)-OH

O

O

NH

O

OH

NH

O

O

OO O O

O

NH

O

OH

NH

O

O

N

N-α-fluorenylméthoxycarbonyl-N-ε-[7-diéthylaminocoumarin-3-carboxylamide]-L-lysine

N-α-fluorenylméthoxycarbonyl-N-ε-[7-méthoxycoumarin-3-carboxylamide]-L-lysine

Fmoc-Lys(DAC)-OHFmoc-Lys(MC)-OH

O

O

NH

O

OH

NH

O

O

OO O O

O

NH

O

OH

NH

O

O

N

Figure 36. Acides aminés fluorescents directement utilisables en SPPS.

1. Synthèses.

1.1. Synthèse des acides aminés modifiés

1.1.1. Synthèse des sondes fluorescentes.

La synthèse des deux coumarines a été réalisée par deux voies différentes. La DAC (1)

est obtenue en une seule étape grâce à une condensation de type Knoevenagel 2 entre le

4-diéthylamino-salycylaldéhyde et l’acide de Meldrum en présence d’acétate de pipéridinium

(Fig. 37). Celui-ci joue le rôle de catalyseur basique et permet de déprotoner le carbone en α

des carbonyles de l’acide de Meldrum. Après une attaque nucléophile de ce dernier sur

l’aldhéhyde, la réaction passe par un intermédiaire qui se cyclise alors spontanément au reflux

de l’éthanol. Cette cyclisation s’accompagne d’un réarrangement intramoléculaire, avec

libération d’acétone pour conduire à la DAC. Il précipite spontanément dans le mélange

réactionnel à température ambiante, ce qui permet de l’isoler directement avec une grande

pureté. Le rendement obtenu est de 65%.


sur 240

65 %

Acétate de pipéridinium

Ethanol 80°C

4-diéthylamino-salycylaldhéhyde

Acide de Meldrum

Intermédiaire

Acide 7-diéthylamino-coumarin-3-carboxylique (DAC)

O

H

OHN O

OO

O O

OH

O

ONN OH

O

OO

Oc

+

65 %

Acétate de pipéridinium

Ethanol 80°C

4-diéthylamino-salycylaldhéhyde

Acide de Meldrum

Intermédiaire

Acide 7-diéthylamino-coumarin-3-carboxylique (DAC)

O

H

OHN O

OO

O O

OH

O

ONN OH

O

OO

Oc

+

Figure 37. Synthèse de la DAC (1)2

Cette voie de synthèse n’a pas fonctionné dans le cas de la MC (2). Les rendements

obtenus avec l’utilisation de l’acide de Meldrum sont faible (<40%). En remplaçant ce dernier

par le malonate de diéthyle, la MC peut être obtenue en deux étapes avec un meilleur

rendement (Fig. 38).

75 %

NaOH (20%)

Malonate de diéthyle

4-méthoxy-salycylaldhéhyde

Acide acétique/pipéridine

Ethanol 80°C

Acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique (MC)

OO

O

O

O

H

OHO O O

O

O

OO O

OH

O

O

+

75 %

NaOH (20%)

Malonate de diéthyle

4-méthoxy-salycylaldhéhyde

Acide acétique/pipéridine

Ethanol 80°C

Acide 7-méthoxycoumarin-3-carboxylique (MC)

OO

O

O

O

H

OHO O O

O

O

OO O

OH

O

O

+

Figure 38. Synthèse de la MC (2)

Lors de la première étape, un ester d’éthyle est obtenu. Après saponification, la MC est

obtenue par précipitation lorsque le pH de la solution réactionnelle est amené à pH acide. Le

rendement global de la solution est de 75%.

L’état de pureté avec lequel les produits sont obtenus nous a permis de les utiliser sans

purification ultérieure.

1.1.2. Synthèse des lysines modifiées

Au sein de notre Laboratoire, la synthèse des dérivés lysines de la DAC et de la MC se

faisait auparavant 1 en deux étapes. Dans un premier temps, un ester de succinimide était

formé puis isolé. Ensuite, cet ester était mis à réagir sur une lysine protégée par un

groupement fluorénylméthoxy (Fmoc) sur l’amine de la chaîne principale (Fig 39). La Fmoc-

Lys(DAC)-OH (3) et la Fmoc-Lys(MC)-OH (4) étaient obtenues avec des rendements

respectifs de 50 % et 64 %.


sur 240

R: N(CH2CH3)2= DAC(1)R: OCH3=MC (2)

Fmoc-Lys-OH

Ester de succinimide

Fmoc-Lys(DAC)-OH (3) 50 %Fmoc-Lys(MC)-OH (4) 64 %

DCC

DMF

DMFO

OH

O

OR O O

O

O

O

O

R

ONH

NH2

O

OH

O

ONH

NH

O OO

R

O

OH

O

NOH

O

O

+


Fmoc-Lys-OH

Ester de succinimide


DCC

DMF

DMFO

OH

O

OR O O

O

O

O

O

R

ONH

NH2

O

OH

O

ONH

NH

O OO

R

O

OH

O

NOH

O

O

+

Figure 39. Voie de synthèse n°1 de la Fmoc-Lys(DAC)-OH et de la Fmoc-Lys(MC)-OH

Néanmoins, ces rendements étaient très variables, en particulier pour l’obtention de

l’ester de succinimide. Ces esters sont obtenus par précipitation dans un mélange

isopropanol/hexane. La variation de température pouvait influencer cette étape de

précipitation, entrainant ainsi une grande variation des rendements. Ces esters sont également

instables, facilement hydrolysables. Dans le but d’améliorer nos rendements, nous avons

développé une seconde méthode pour l’obtention des dérivés 3 et 4 (Fig. 40).

DMF


1.DCC/HOBt2.Fmoc-Lys-OH


O O

OH

O

R

ONH

NH

O O

R

O

O

OH

O

DMF


1.DCC/HOBt2.Fmoc-Lys-OH


O O

OH

O

R

ONH

NH

O O

R

O

O

OH

O

Figure 40. Voie de synthèse n°2 de la Fmoc-Lys(DAC)-OH (3) et de la Fmoc-Lys(MC)-OH (4)

Cette nouvelle voie de synthèse consiste, dans un premier temps, à activer les

coumarines en présence d’HOBt (N-hydroxy-benzotriazole) et de DCC (N, N’-

dicyclohexylcarbodiimide) dans du DMF (N, N’-diméthylformamide). La Fmoc-Lysine-OH

est ensuite ajoutée au mélange réactionnel. Les produits (3) et (4) sont obtenus avec des

rendements respectifs de 71% et 83%. La Fmoc-Lys-OH (soluble dans un milieu acide 2N)

ainsi que les agents de couplage sont éliminés par des lavages.

Les spectres de fluorescence des deux sondes (3 et 4) sont représentés Fig. 41.

L’utilisation des deux sondes en tant que couple donneur (MC) et accepteur (DAC) est

possible. Les spectres d’absorption et de fluorescence sont compatibles avec le phénomène de


sur 240

FRET. Le recouvrement entre le spectre d’émission de fluorescence de la MC et le spectre

d’absorption de la DAC est maximal (Fig. 42).

Figure 41. Spectres d’absorption et de fluorescence des sondes, tampon TRIS 0,1 M pH=7. (4): DAC: λ abs max = 431 nm, λ fluo max = 480 nm ; (3): MC: λ abs max = 350 nm, λ fluo max = 402 nm.

Figure 42. Recouvrement spectral des sondes.

La présence des deux sondes sur une séquence clivable devrait donc permettre de

suivre l’hydrolyse enzymatique.


sur 240

1.2. Utilisation des acides aminés modifiés en synthèse peptidique en phase

solide (SPPS).

Les séquences choisies pour ces synthèses peptidiques (développé Partie 1, § 5.1.) sont

donc issues de séquences reconnues dans la littérature comme étant clivées par une seule

MMP 3. La séquence primaire de ces peptides est rappelée dans le Tableau 8.

Tableau 8. Séquences étudiées 3

MMP ciblé Séquence Origine

MMP-1 G-P-Q-G~L-L-G-A Collagène I humain (α2)

MMP-2 P-P-G-A~Y-H-G-A Galectine 3 humaine

MMP-9 G-P-P-G~V-V-G-P Collagène V humain (α1)

1.2.1. Synthèse des substrats linéaires.

La synthèse a été réalisée à partir d’une résine Fmoc-Ala-Wang (Fig. 43), en présence

de pipéridine, d’agents de couplage (HBTU/HOBT, DIEA ou DCC/HOBt) et des acides

aminés. Nous avons effectué des synthèses à 0,25 mmol, sans capping avec une déprotection

finale de la partie N-terminale. Suite à la synthèse de la chaîne peptidique par un automate de

synthèse, les peptides sont décrochés de la résine et libérés de leurs protections latérales avec

un mélange TFA/TIS/H2O (acide trifluoroacétique/triisopropylsilane/eau) (95/2,5/2,5).

Chaque peptide est ensuite purifié par HPLC sur une colonne C18 en phase inverse.


sur 240

S1 S9H-K(DAC)-GPQGLLGA-K(MC)A-OH H-K(DAC)-GPGGVVGP-K(MC)A-OH

TFA/H2O/TIS (95/2.5/2.5) TA, 2h

Synthèse en phase solide

H-K(DAC)-PPGAWHGA-K(MC)A-OH

S2

OAlaK(MC)(XX)nH-K(DAC)

OAlaFmoc

Figure 43. Synthèse des substrats linéaires.

La présence des deux chromophores facilite l’analyse et la purification de ces produits.

Ils peuvent être identifiés à trois longueurs d’ondes : 214, 350 et 430 nm, caractérisant

respectivement l’absorption de la liaison peptidique, de la MC et de la DAC. A titre

d’exemple, une cartographie d’absorption de l’élution de S1 est présentée (Fig. 44), ainsi que

le profil d’élution (Fig.45).

Figure 44. Carte d’absorption d’un échantillon de S1 par rapport au temps d’élution.


sur 240

Figure 45. Chromatogramme HPLC du substrat S1 avec le profil d’élution à 213 nm et le spectre d’absorption du pic à 18,22 min.

Les peptides S1, S2, et S9 sont obtenus avec des rendements respectifs de 27%, 46%

et 42%. La séquence primaire des substrats obtenus est résumée dans le Tableau 9.

Tableau 9. Bilan de la synthèse des substrats linéaires.

Peptide Séquence Rendements

S1 H-K(DAC)GPQGLLGAK(MC)A-OH 27 %

S2 H-K(DAC)PPGAYHGAK(MC)A-OH 46 %

S9 H-K(DAC)GPGGVVGPK(MC)A-OH 42 %

1.2.2. Synthèse des substrats cycliques.

Les peptides que nous avons développés ici, sont issus d’une réflexion sur la

conception de substrats mimant la structure hélicoïdale de la triple hélice de collagène. Le but

n’est pas de recréer cette structure mais plutôt d’élaborer un substrat dont la conformation

serait aussi rigide que celle du collagène. Notre choix s’est porté sur les peptides cycliques

(cf. Partie 1, §5.2.). La cyclisation des peptides apporte une certaine rigidité à la chaîne

peptidique par rapport à la structure linéaire. Cette diminution de la flexibilité

conformationnelle de la chaîne peptidique devrait permettre d’augmenter de manière

significative la sélectivité du peptide 4-6, son activité biologique, ainsi que sa résistance

in-vivo 7, 8. En effet dans le plasma, il existe beaucoup de protéases aspécifiques qui peuvent


sur 240

dégrader facilement nos modèles linéaires. La conception de dérivés cycliques permettra

assurément d’augmenter la résistance de nos substrats dans le plasma. Les peptides cycliques

représentent aussi dans de nombreux cas des outils de choix pour étudier les interactions

ligand-récepteur ou encore les relations structure-activité 9, 10.

Ces substrats de MMPs d’un nouveau genre se caractérisent donc par le doublement

de la séquence clivable, afin de pouvoir mesurer une évolution de la fluorescence lorsque le

peptide est clivé. En effet, si la cyclisation est réalisée directement sur les substrats linéaires,

l’éloignement des coumarines ne pourra pas avoir lieu lors de la coupure.

Les peptides cycliques peuvent être classés en 2 grandes familles : les homodétiques et

les hétérodétiques. Pour les premiers, la cyclisation est réalisée par la formation d’une liaison

amide entre les fonctions amine et carboxylique de la chaine principale. Pour les

hétérodétiques, la cyclisation fait intervenir d’autres types de liaisons sur les chaines latérales

comme des lactones, des éthers, des thioéthers ou des ponts disulfures. Dans notre cas, la

formation d’une liaison amide a été privilégiée. Une stratégie doit être déterminée selon le

type de cyclopeptide à synthétiser. Quelle que soit la stratégie de cyclisation, le peptide

linéaire est produit par SPPS. Le choix de la résine est conditionné par la méthode de

cyclisation employée, à savoir la cyclisation en phase liquide ou sur support.

La formation d’un cyclopeptide homodétique implique que les fonctions des chaînes

latérales du peptide aient toutes conservé leur groupe protecteur de façon à ce qu’il n’y ait pas

de réaction secondaire. Il est donc nécessaire d’utiliser une résine permettant de garder ces

protections après le relargage du peptide. Pour la stratégie de synthèse Fmoc, ceci est rendu

possible par l’utilisation de supports solides dont le bras espaceur est extrêmement sensible

aux acidolyses. Les bras les plus souvent utilisés sont le 2-chlorotrityl (2-ClTrt) 11 et l’acide 4-

hydroxyméthyl-3-méthoxyphénoxybutanoïque (HMPB-BHA) 12 (Fig. 46).


sur 240

O

Cl

O

R

NHFmoc

1 2

NH

O

OO

O

O

NH

R

Fmoc

Figure 46. Résines utilisées pour l’obtention des peptides protégés sur leurs chaines latérales après libération de la résine. (1) la résine 2-Chlorotrityl et (2) la résine HMPB-BHA.

Le clivage du peptide de la résine s’effectue par traitement avec des acides dilués de

type AcOH/TFE/DCM (2/2/6, v/v/v) ou 0.5 à 5% de TFA dans du DCM.

Dans le cas de la cyclisation en solution, pour favoriser la formation de la liaison

amide intramoléculaire, il est indispensable d’effectuer cette réaction dans des conditions de

haute dilution (Cmax= 1mg/ml). Les réactions indésirables, comme la cyclo-dimérisation et la

cyclo-oligomérisation, qui peuvent se produire malgré le contrôle de la dilution, peuvent

entraîner une diminution du rendement global et compliquer la purification du peptide final 12.

Il a été montré que l’étape de cyclisation peut être effectuée alors que le peptide est

toujours accroché au support solide. Cette méthodologie permet d’utiliser l’effet de pseudo

dilution dû au support favorisant ainsi les réactions intramoléculaires pr rapport aux réactions

intermoléculaires. Cette cyclisation dite sur résine présente certains avantages :

� Les conditions de haute dilution sont atteintes grâce à un faible taux de

substitution par le premier acide aminé.

� La cyclisation intramoléculaire est favorisée par de grandes distances entre les

chaînes peptidiques fixées sur le support solide.

� La réaction est menée à son terme grâce à l’utilisation d’un excès de réactifs de

couplage qui peuvent être séparés par simple filtration et lavage.

� Cette étape réactionnelle peut être automatisée.

La cyclisation par les deux extrémités dite « head-to-tail » nécessite un ancrage du

premier acide aminé sur la résine par sa chaîne latérale. L’utilisation de cette méthode se

limite aux séquences contenant au moins un des acides aminés suivants : Asn/Asp, Gln/Glu,


sur 240

Lys, His, Ser, Thr, Arg et Tyr. La réussite de ce mode de cyclisation repose également sur la

combinaison de groupes protecteurs orthogonaux entre la fonction amine en α, la fonction

carboxyle terminale et les chaînes latérales. Le greffage d’un acide aminé via le COOH étant

plus commun, l’utilisation de l’acide glutamique semble évident car le COOH de sa chaîne

latérale possède un degré de liberté supérieur à celui de l’acide aspartique. La synthèse sur

support solide se faisant de la partie C vers la partie N-terminale du peptide, l’acide

glutamique doit être protégé sur le carboxyle de la chaine principale et ceci de manière

orthogonale aux autres groupements protecteurs du peptide. Cette protection orthogonale

devra donc être déprotégée sélectivement afin d’effectuer la cyclisation sur la résine.

L’utilisation de l’acide glutamique apportera également un site de fonctionnalisation,

intéressant pour l’utilisation de ces peptides.

1.2.2.1. Cyclisation sur support solide.

Cette voie de synthèse nécessite que la résine possède un faible taux de greffage du

premier acide aminé afin de limiter les réactions intermoléculaires lors de l’étape de

cyclisation. L’acide aminé choisi est l’acide Fmoc-Glu-OAllyl dont le COOH de la chaîne

principale est protégé par un groupement allyl. Nous avons réalisé nos synthèses sur une

résine de type 2-chlorotrityl. Le choix de cette résine a été dicté par la nécessité de garder les

protections des chaines latérales après libération de la résine, afin de pouvoir réaliser des

couplages supplémentaires sur le peptide cyclique.

Le greffage de la résine a été effectué avec un léger excès d’acide aminé en présence

de DIEA (Fig. 47). Le taux de greffage de la résine est baissé de 1,3 mmol/g à 0,2 mmol/g.


sur 240


Fmoc-Glu-OAllDCM/DIEA

Pd(P(Ph3))4, CHCl3/AcOH/N-methylmorpholine

TA, 2 h

Pipéridine/NMP

TFA/H2O/TIS (95/2.5/2.5) TA, 2h

PyBOP, HOBt, DIEADMF, TA, 48 h

peptide cyclique déprotégé

Déprotection du OAllyl

Déprotection de la partieN-terminale

Cyclisation sur résine

Clivage du peptide de la résineet déprotection totale

Greffage de la résine

Glu(XX)n-K(MC)K(DAC)(XX)nFmoc

OAllyl

CFmoc-Glu

Cl

Allyl-O + CCl

Cl

Glu(XX)n-K(MC)K(DAC)(XX)nFmoc

COOH Glu(XX)n-K(MC)K(DAC)(XX)n

H2N COOH

Glu(XX)n-K(MC)K(DAC)(XX)nCONH

Glu(XX)n-K(MC)K(DAC)(XX)n

CONH

Figure 47. Synthèse d'un peptide cyclique via une cyclisation sur résine.

Après le prolongement de la chaîne peptidique par un automate de synthèse, le

groupement allyl est enlevé en présence de tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0). Ensuite

la partie N-terminale est déprotégée pour réaliser la cyclisation par formation d’une liaison

entre les deux extrémités N et C-terminales du peptide. Le peptide est alors entièrement

déprotégé et clivé de la résine.

Pour la synthèse du substrat cyclique 1 (Sc1), le chromatogramme obtenu lors de

l’observation du mélange réactionnel met bien en évidence un pic présentant les trois

longueurs d’ondes caractéristiques du peptide attendu (Fig. 48).


sur 240

M i n u t e s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5

mA

U

- 1 0 0

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

mA

U

- 1 0 0

0

0 0

D A D - 2 1 1 n mE M 2 6 6 a n a 2 a c y 1 0 0 3 0 9

Figure 48. Chromatogramme du peptide brut Sc1 avec le mélange A et B. En haut la cartographie d’absorption et en bas le profil d’élution à 211 nm avec le spectre UV du pic à 16,08 min.

Néanmoins de nombreux autres pics sont également présents. Une purification de ce

pic n’étant pas possible dans ces conditions, nous avons développé une autre méthode de

purification fondée sur l’emploi d’un autre éluant. La méthode a consisté à diminuer la

polarité du mélange A, en le remplaçant par un mélange C comportant 25% isopropanol,

75 % d’eau et 0,1 % de TFA. Le profil HPLC obtenu en utilisant le couple Mélange B et C est

plus exploitable pour la purification du peptide d’intérêt (Fig. 49). Sc1 est bien isolé du

massif. Le profil obtenu après HPLC préparative est présenté Fig. 50.

nm

200 300 400

mA

U

0

200

400

mA

U

0

200

40016.08 MinEM266 ana2 acy 100309


sur 240

M in u te s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5

Vol

ts

0 ,0 0

0 ,0 2

0 ,0 4

0 ,0 6

Figure 49. Chromatogramme HPLC du brut de Sc1 en utilisant le couple mélange B et C. Le pic d'intérêt est observé à 13,8 min.

M i n u t e s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

mA

U

- 2 0 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

mA

U

- 2 0 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

D A D - 2 1 5 n mS c y l M M P 1 E M 2 6 6 f r f i n a l 2 4 0 3 0 9

Figure 50. Chromatogramme du substrat cyclique Sc1 après purification ainsi que le spectre d’absorption du pic à 15,51. Les conditions d’élutions sont les mêmes que pour la Fig.11, avec les mélanges A et B.

Le peptide cyclique Sc1 est obtenu avec un rendement de 3%, ce qui semble être en

accord avec le profil analytique du brut réactionnel, la grande proportion de peptide étant

probablement sous une forme oligomérique (Fig. 49).

nm

200 300 400

mA

U

0

500

1000

mA

U0

500

100015.51 MinScyl MMP1 EM266 fr final 240309


sur 240

Le même type de profil HPLC a été observé avec le peptide Sc9 (Fig. 51), le peptide

d’intérêt se retrouve dans un massif impossible à purifier. La même méthode de purification a

été employée. Le peptide Sc9 a été obtenu avec un rendement de 6%.

Figure 51. Chromatogramme du peptide brut Sc9 avec le mélange A et B. En haut la cartographie d’absorption et en bas le profil d’élution à 214 nm avec le spectre UV du pic à 11 min.

Dans le cas du peptide Sc2, le peptide d’intérêt n’a pas pu être identifié quelle que soit

la technique employée. Tous les peptides semblent s’être oligomérisés (Fig. 52).

Contrairement aux autres synthèses, ici le massif absorbe dans les trois longueurs d’onde ce

qui rend difficile l’identification.


sur 240

Figure 52. Chromatogramme du peptide brut Sc2, (cyclisation sur résine) avec le mélange A et B. En haut la cartographie d’absorption et en bas le profil d’élution à 214 nm avec le spectre UV du pic à 17 min.

Les rendements obtenus par la cyclisation sur résine sont très faibles en comparaison

de ceux obtenus lors de la synthèse des peptides linéaires. Un facteur 10 de différence est

observé. La réduction du taux de greffage de la résine n’a pas permis d’augmenter le

pourcentage de peptide désiré. Dans le cas du substrat cyclique de la MMP-2, le peptide n’a

pas été isolé. Et pour les deux autres peptides Sc1 et Sc9, la quantité de produit obtenu est

faible. Ceci nous a conduit à envisager une autre méthode cyclisation, la cyclisation en

solution.

1.2.2.2. Cyclisation en solution.

Contrairement à la voie de cyclisation sur résine, le taux de greffage importe peu et le

premier acide aminé n’a pas besoin d’être greffé via la chaine latérale. Le peptide étant clivé

de la résine avant l’étape de cyclisation, il faut vérifier que la protection de la chaine latérale

de l’acide glutamique, ainsi que toutes les autres protections résistent à l’étape de clivage du

peptide de la résine. Cette étape doit donc être réalisée dans des conditions douces. Nous

avons choisi ici encore la résine 2-chlorotrityl, pour pouvoir libérer le peptide dans des

conditions très douces et garder la protection sur les chaînes latérales.


sur 240

Le premier acide aminé greffé est l’acide glutamique protégé sur sa chaine latérale par

un groupement OtBu (tertiobutyl ester) (Fig. 53), avec un taux de greffage final de la résine

de 0,76 mmol/g. Contrairement à la méthode de cyclisation sur résine, où la résine était

greffée à 0,2 mmol/g, nous avons privilégié ici un fort taux de greffage pour avoir une

quantité maximale de peptide linéaire. Une fois le peptide synthétisé et clivé de la résine, la

cyclisation en solution est réalisée avec une concentration en peptide de 10-3 M.


Fmoc-Glu(OtBu)-COOHDCM/DIEA

TFA/H2O/TIS (95/2.5/2.5) TA, 1h30

EDC, HOBtDCM, TA, 48 h

Peptide cyclique déprotégé

Glu(OtBu)(XX)n-Lys(MC)Lys(DAC)(XX)n

HN CO

Cyclisation en solution

DCM avec 1% de TFA

Greffage sur la résine

C

Cl

Fmoc-Glu(OtBu)

Glu(OtBu)(XX)n-Lys(MC)Lys(DAC)(XX)nH2N Glu(OtBu) COOH(XX)n-Lys(MC)Lys(DAC)(XX)nH2N

Glu(XX)n-Lys(MC)Lys(DAC)(XX)nHN CO

Clivage de la resine

Déprotection totale

+ CCl

Cl

Figure 53. Synthèse des peptides cycliques via une cyclisation en solution.

Les profils HPLC des trois synthèses sont convenables avec les mélanges A et B

(Fig.54), ainsi les peptides attendus ont pu être facilement purifiés. Le peptide Sc2 a été

obtenu avec un rendement de 23%, le rendement du peptide Sc9 a été pratiquement multiplié

par deux (11% au lieu de 5,8%), par contre pour le substrat Sc1 le rendement reste toujours

très faible (3,5%). Les trois peptides étant synthétisés dans les mêmes conditions, la seule

différence réside dans leur séquence. La différence de rendement provient donc

vraisemblablement de l’influence de la séquence lors de l’étape de cyclisation en solution. En


sur 240

effet les peptides possédant le plus de fonctions latérales protégées donc plus hydrophobes (le

peptide Sc2) se solubilisent plus facilement dans le DCM que les autres peptides. Ceci semble

influencer considérablement le rendement des peptides cycliques obtenus. Le Tableau 10

résume les rendements des synthèses pour les deux méthodes employées lors de la cyclisation

de nos peptides.

Figure 54. Chromatogramme du peptide brut Sc9, (cyclisation en solution) avec le mélange A et B. En haut la cartographie d’absorption et en bas le profil d’élution à 214 nm avec le spectre UV du pic à 21 min.


sur 240

Tableau 10. Bilan des deux méthodes de synthèses, I:cyclisation sur résine et II: cyclisation en solution.

Peptide Séquence Rendements %

I II

Sc1 Cyclo[GPQGLLGAK(DAC)GPQGLLGAK(MC)E] 2,6 3,5

Sc2 Cyclo[PPGAYHGAK(DAC)PPGAYHGAK(MC)E] - 23

Sc9 Cyclo[GPGGVVGPK(DAC)GPGGVVGPK(MC)E] 5,8 11

La cyclisation sur résine présente l’avantage de faciliter les différentes étapes

d’élimination des réactifs de synthèse. L’étape de cyclisation est certainement plus

avantageuse mais elle est dépendante du taux de greffage de la résine. En théorie la

cyclisation sur résine semble plus avantageuse à condition d’être à un très faible taux de

greffage. En contrepartie, la quantité de produit final est moins importante.

Les résultats que nous avons obtenus indiquent que la cyclisation en solution

permet d’obtenir les meilleurs rendements. Cette méthode présente cependant quelques

points négatifs.

� Le nombre d’étapes est plus important que pour une cyclisation sur résine.

� Le peptide, après synthèse sur l’automate doit être isolé des réactifs

utilisés à chaque étape pour éviter toute réaction secondaire.

� L’étape de cyclisation est dépendante de la séquence du peptide

La quantité de produit obtenue est plus importante par cyclisation en solution ce

qui représente un avantage non-négligeable par rapport à la cyclisation sur résine.

En conclusion, malgré des étapes supplémentaires, et un traitement plus lourd,

nous privilégions la cyclisation en solution pour la synthèse de nos peptides car les

rendements sont supérieurs et la quantité de produit est plus importante.


sur 240

2. Tests enzymatiques.

Nous avons cherché dans ce chapitre à évaluer le comportement de nos substrats en

présences d’enzymes essentielles dans la carcinogenèse, les MMPs. Ces expériences ont pour

but de déterminer la spécificité de ces peptides vis-à-vis des trois MMPs étudiées. Nous allons

donc réaliser des tests croisés entre ces différentes métalloprotéases afin d’évaluer leur

affinité et leur capacité de coupure vis-à-vis de nos substrats. Les résultats obtenus sur l’étude

enzymatique des substrats S1, S2, S9 et de leurs dérivés cycliques Sc1, Sc2 et Sc9 seront

discutés dans ce chapitre. Enfin, la stabilité de ces substrats sera évaluée en présence d’un

échantillon plasmatique pour estimer leur aptitude à être utilisés in-vivo.

Les MMPs sont des enzymes qui obéissent à une cinétique Michaëlienne à un substrat

et une enzyme. Les constantes cinétiques de l’enzyme vis-à-vis de son substrat découlent des

équations suivantes 13, 14 :

E + S ES E + Pk2

k1

k-1

E + S ES E + Pk2

k1

k-1

Equation de Michaëlis-Menten :

[ ][ ]SK

SVV

m

mi +

= *

avec 1

21

k

kkKm

+= −

et [ ]tm EkV *2=

Ici E représente l’enzyme, S le substrat, ES le complexe enzyme substrat, P le produit,

k1, k-1, k2 les constantes cinétiques, Km la constante de Michaëlis et Vm la vitesse initiale

maximale et [E]t la concentration en enzyme totale. Il est à noter que la constante k2 est aussi

appelée constante catalytique kcat.

• kcat : Constante catalytique, traduit le nombre de molécules clivées par unité de

temps (normalement en s-1). Le terme « turnover » est souvent employé.

• Km : Constante de Michaelis-Menten, traduit la concentration en substrat pour

laquelle la vitesse initiale de la réaction est à la moitié de la vitesse initiale

maximale. Cette constante permet de mesurer l’affinité de l’enzyme pour le

substrat. Plus le Km est petit, plus l’enzyme est spécifique du substrat. Il est


sur 240

important de ne pas assimiler le Km et le Kd car Kd=k-1/k1. En effet, le Kd

s’applique dans le cas de la fixation d’un ligand sur un site. Il représente la

concentration de ligand pour laquelle les sites de liaisons sont pour moitié

occupés.

• kcat/Km : donne une idée sur l’efficacité globale de l’enzyme : plus ce rapport

est grand, plus l’enzyme est à la fois efficace et rapide. Le rapport k2/Km

dépend de k1, k-1, k2 :

( )21

1

21

212

1

*

kk

k

kk

kk

K

k

m ++=

+=

−− < 1k

La limite de ce rapport est donc k1, c'est-à-dire le taux de formation du complexe ES.

Ce taux est lui-même limité à 108-109 M-1s-1 par la diffusion qui permet la rencontre de

l’enzyme avec le substrat.

Dans des conditions où la quantité initiale de substrat [S]0 est très supérieure à la

quantité initiale d’enzyme [E]0 ([S]0 >> [E]0), la pente de la courbe de variation de la

fluorescence en fonction du temps donne la vitesse initiale de la réaction (Vi) (Fig. 55 A). La

variation de Vi en fonction de la concentration en substrat permet de déterminer le Km et le

Vmax (Fig. 55 B).

Figure 55. Détermination des constantes cinétique Vmax et Km.


sur 240

La mesure d’une activité enzymatique est rendue possible lorsqu’un paramètre du

milieu étudié varie en présence de l’enzyme. Dans notre cas, il s’agit d’une variation de

fluorescence liée à l’éloignement des sondes lorsque le peptide contenant le couple donneur et

accepteur d’énergie est clivé (Fig. 56).

Figure 56. Suivi de l'activité enzymatique via le mécanisme de FRET. Augmentation de la fluoerescence du donneur.

Lorsque le peptide est intègre, la fluorescence du donneur est transférée à l’accepteur

via le mécanisme de FRET. L’énergie peut être absorbée sans émission de fluorescence ou

bien convertie en fluorescence. Nous verrons par la suite la différence de fluorescence entre

nos peptides linéaires ou cycliques (comportant les deux fluorophores) et un peptide ne

comportant que le donneur MC.

Une fois le peptide clivé, la distance entre les deux chromophores devient trop grande

pour que le transfert d’énergie ait lieu. La fluorescence du donneur augmente alors au cours

du temps. Ceci permet de mesurer l’activité enzymatique 15 et de déterminer l’affinité de

l’enzyme pour le substrat indiquée par le Km et l’efficacité catalytique représentée par le

Kcat/Km.

2.1. Clivage des substrats linéaires.

L’association des deux coumarines sur un même peptide a provoqué une diminution

de la fluorescence du donneur (MC). La fluorescence du peptide S1 par exemple, est


sur 240

quasiment nulle, en comparaison avec un peptide (pMC) ayant la même séquence mais sans

l’accepteur de fluorescence (Fig. 57). Le phénomène de FRET se caractérise ici par une

absorption de la fluorescence de la MC par la DAC, suivi d’une émission de fluorescence de

la DAC. La quantité de photons émise par la MC seule est beaucoup plus importante que la

quantité de photons émise par la DAC. Ceci s’explique par le fait que l’énergie transportée

par les rayonnements est plus importante aux faibles longueurs d’onde. Ainsi la quantité de

photon absorbée par la MC est plus importante que celle absorbée par la DAC. Ceci ce traduit

dans notre cas par une faible fluorescence de l’accepteur. Le phénomène majeur que nous

observons ici est donc l’inhibition de la fluorescence de la MC, aussi appelé quenching.

Wavelength (nm)

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Flu

ores

cenc

e In

tens

ity (

IF)

0

200

400

600

800

1000pMCS1

Wavelength (nm)

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Flu

ores

cenc

e In

tens

ity (

IF)

0

10

20

30

40

50

Figure 57. Spectre de fluorescence du peptide S1 à une concentration de 1µM et du dérivé de S1 sans

la coumarine DAC (pMC) à une concentration de 1µM. Excitation à 350 nm

En présence de l’enzyme MMP-1, une variation de la fluorescence de MC est

observée. Le substrat étant coupé, l’éloignement des deux fluorophores abolit le phénomène

de quenching et par conséquent la fluorescence du donneur augmente (Fig. 58).


sur 240

Temps (min)

0 200 400 600 800 1000

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

(IF

)

0

100

200

300

400

500

600

Figure 58. Variation de la fluorescence du donneur (Excitation: 350 nm; Emission: 401 nm), en

présence de l’enzyme MMP-1 à 2 nM avec 4 µM de S1.

La concentration optimale d’enzyme à utiliser pour réaliser nos essais a été

déterminée. A une concentration fixe en substrat MMP-1, nous avons fait varier la

concentration en enzyme. La mesure de l’activité enzymatique dans les 20 premières minutes

a permis de vérifier que la variation de la fluorescence en début de réaction est linéaire, même

lors de la variation de la concentration enzymatique (Fig. 59 A). Nous avons ainsi démontré

que la variation de la vitesse initiale était linéaire entre 0,5 et 4 nM d’enzyme (Fig. 59 B). Par

conséquent, nos mesures d’activité enzymatique seront réalisées à une valeur moyenne en

concentration d’enzyme de 2 nM.

Temps en min

0 5 10 15 20

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

20

40

60

80

1,5 nM2 nM3 nM4 nM

(A)

[E1] en nM

0 1 2 3 4 5

IF/m

in

0

1

2

3

4 (B)

Figure 59. Variation de la fluorescence à 401 nm, en fonction du temps et en fonction de la concentration en enzyme (A). Variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration d’enzyme

MMP-1 (Excitation à 350 nm).


sur 240

La gamme de concentration en substrat a aussi été déterminée. La variation de la

fluorescence de la MC à 401 nm en fonction de la concentration en substrat S1 n’est pas

linéaire au delà de 4 µM (Fig. 60). Ce phénomène, aussi appelé « effet de filtre interne »,

survient à des fortes concentrations en substrat. L’intensité du faisceau est atténuée par les

molécules présentes avant la zone de mesure (Fig. 61). De manière similaire, l’intensité de la

fluorescence émise est elle aussi en partie absorbée. Il en résulte une atténuation de la

fluorescence à des fortes concentrations. Les tests devront donc être effectués pour des

concentrations où la variation de fluorescence est linéaire pour éviter tout effet de filtre

interne. La zone de concentration sera donc comprise entre 1 et 4 µM. Chaque peptide a été

traité avec 2 nM d’enzyme (MMP-1, MMP-2, et MMP-9). Ces enzymes sont tout d’abord

activées trois heures avec une solution d’acétate d’aminophényl-mercurique (APMA).

[C] en µM

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

0

20

40

60

80

100

120

140

Figure 60. Variation de la fluorescence de MC à 401 nm (Excitation à 350 nm) en fonction de la concentration en substrat S1.


sur 240

Figure 61. Effet de filtre interne. A faible concentration le faisceau d’excitation et d’émission ne sont pas atténués. A forte concentration, leurs intensités diminuent.

Les constantes (kcat, et Km) ont été déterminées en utilisant la représentation en double

inverse (l’inverse de la vitesse Vi en fonction de l’inverse de la concentration en substrat). Le

point d’intersection de la droite obtenue avec l’axe des ordonnés permet de mesurer l’inverse

de la vitesse maximale (1/Vmax), le point d’intersection avec l’axe des abscisses représente

l’inverse du Km (1/Km). Il est possible de déduire kcat sachant que Vmax=kcat*[E] t (Et,

concentration en enzyme totale). Les courbes obtenues pour le substrat de la MMP-1, S1, sont

représentées Fig. 28. Les résultats pour les autres substrats sont résumés au niveau du

Tableau 4.


sur 240

1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1. m

in)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Test 1Test 2

kcat = 1.57 s-1 ± 0.008Km = 6.3 µM ± 0.21

kcat /Km = 250.492 M-1.S-1

Clivage par la MMP-1

1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1. m

in)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Test 1Test 2

kcat = 15.8 s-1 ± 5.4Km = 3.1 µM ± 1.3

kcat /Km = 5.052.647 M-1.S-1


1/S (µM-1)

0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1. m

in)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Test 1Test 2

kcat = 17.6 s-1 ± 1.2Km = 5.1 µM ± 0.1

kcat /Km = 3,430,651 M-1.S-1


Figure 62. Clivage du substrat S1 par la MMP-1, MMP-2 et la MMP-9.

Les mesures ont révélé que la séquence ciblant la MMP-1 était mieux reconnue par la

MMP-2 et la MMP-9 (Fig. 28 et Tableau 4). Le rapport est de 20 pour la MMP-2 et

pratiquement de 14 pour la MMP-9. La spécificité observée n’est pas celle attendue

notamment vis-à-vis de la MMP-1. A notre connaissance, ces valeurs font de S1 un substrat

très spécifique des gélatinases (MMP-2 et -9) 16. Nous avons reporté quelques valeurs de

Kcat/Km, pour des substrats déjà décrits précédemment (Tableau 5). Il apparaît clairement que

ce peptide est largement plus sensible à l’activité gélatinase que les substrats décrits dans ce

tableau. Son utilisation pourrait donc permettre de mieux exploiter l’activité de la MMP-9 et

de la MMP-2 in vitro et in vivo. Dans un système de libération contrôlée, il pourrait permettre

de mieux cibler des étapes clés du cancer tel que l’angiogenèse où les gélatinases sont

surexprimées.


sur 240

Pour S2 et S9, Tableau 11, les valeurs de Kcat/Km sont beaucoup plus faibles que

celles observées pour S1. S2 est 10 fois mieux reconnu par la MMP-2 et la MMP-9, en

comparaison avec S9. Par contre ces deux substrats ne sont pas reconnus par la MMP-1. Leur

affinité est 10 fois plus grande pour la MMP-2 que pour la MMP-9.

Tableau 11. Clivage des substrats linéaires. (N.S.C : no significant clivage)

Substrat kcat (s-1)

Km

(µM) kcat/Km (M-1.s-1)

MMP-1 S1 1.57 6.3 2.5*105 S2 N.S.C N.S.C N.S.C S9 N.S.C N.S.C N.S.C

MMP-2 S1 15.8 3.1 5,0*106 S2 2.84 4.6 6.1*105 S9 0.29 4.7 6.2*104

MMP-9 S1 17.6 5.1 3.4*106 S2 0.96 4.9 1.9*105 S9 0.43 11.3 3.8*104


sur 240

Tableau 12. Quelques valeurs de constantes de la littérature 16 (ND : Non Déterminée).

Substrat kcat (s-1)

Km (µM)

kcat/Km (M-1.s-1)

MMP-1 Dnp-Pro-Gln-Gly~Ile-Ala-Gly-Trp ND ND 230

Dnp-Pro-Leu-Gly~Leu-Trp-Ala-D-Arg ND ND 827

Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Tyr-Ala~Nva-Trp-Met-Lys(Dnp) 0,15 142 1 060

Dnp-Pro-Leu-Gly~Leu-Trp-Ala-D-Arg-NH2 0,011 7.1 1 500

Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly~Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys ND ND 21 000 MMP-2

Dnp-Pro-Gln-Gly~Ile-Ala-Gly-Trp-NH2 ND ND 4 200


Dnp-Pro-Leu-Gly~Leu-Trp-Ala-D-Arg 0,32 2,6 122 000

Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly~Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys ND ND 619 000

Mca-Pro-Leu-Gly~Leu-Dpa-Ala-Arg ND ND 629 000

MMP-9

Dnp-Pro-Gln-Gly~Ile-Ala-Gly-Trp ND ND 1 200

Mca-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu~Nva-Trp-Arg-Lys(Dnp) 0,282 28 10 100


Dnp-Pro-Leu-Gly~Leu-Trp-Ala-D-Arg ND ND 69 400 Dabcyl-Gaba-Pro-Gln-Gly~Leu-Glu(Edans)-Ala-Lys ND ND 206 000

Dans les trois cas, S1, S2 et S9, les peptides ne sont pas spécifiques de la MMP ciblée.

La modification de la séquence, à l’origine spécifique d’une MMP, par l’ajout des deux

fluorophores a bouleversé l’affinité des enzymes pour ces séquences. Malgré tout, il est à

noter que tous les peptides ont un Km de l’ordre du µM (3 à 11 µM), ce qui traduit une bonne

affinité de nos peptides pour les MMPs. A titre de comparaison, nous avons reporté aussi sur

le Tableau 12 les valeurs de Km et de kcat pour quelques substrats de MMPs décris dans la

partie bibliographique. Les valeurs de Km et de kcat obtenues sont plus élevées que ceux de la

littérature. Les MMPs étudiées ont une affinité plus importante pour nos peptides.

Ces premiers résultats démontrent que nos substrats linéaires ont une spécificité

remarquable pour les MMPs étudiées. Le substrat S1 est par exemple très sensible à l’activité

des gélatinases, les valeurs de Kcat/Km sont largement supérieures à celles decrites dans la

littérature. Enfin, les Km mesurés, de l’ordre du µM, attestent de la bonne affinité des MMPs

vis-à-vis de nos substrats.


sur 240

Nous allons effectuer les mesures sur les substrats cycliques, afin de savoir si le

doublement de la séquence et la cyclisation des séquences étudiées permettront d’augmenter

l’affinité des MMPs pour nos peptides.

2.2. Clivage des substrats cycliques.

La formule du substrat Sc1 est représentée Fig. 63. Le spectre de fluorescence du

peptide Sc1 présente le même profil d’inhibition de la fluorescence de la MC par la DAC

(Fig. 64).

N

ON

C

H

O

HN

O

N HNH

O

O

N

C

H

O

NC

HO

N C

OH

N

CH

O

N

C

H

O

N

C

H

O

HN

H2NO

N

O

N

C

H

O

H N

O

N

C

H

O

NC

HO NC

O H

NC HO

N

C

H

O

N

C

H

O

NH2O

OH

O

O

O

O

N

OO

O

Figure 63. Formule du substrat cyclique Sc1.

Longueur d'onde en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

200

400

600

800

1000 pMCSc1

380 400 420 440 460 480 500 520 5400

10

20

30

40

50

Longueur d'onde en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

200

400

600

800

1000pMCS1

4 42 44 4 4 2 4

2

4

Figure 64. (A) Spectre de fluorescence du peptide Sc1 (concentration 1µM) et du dérivé de S1 sans la coumarine DAC (pMC) (concentration 1µM). (B) spectre de fluorescence du peptide S1 dans les

mêmes conditions. Excitation à 350 nm

(A) (B)


sur 240

En comparant les spectres de fluorescence de Sc1 (Fig. 64 A) et celui de S1 (Fig. 64

B), nous constatons que la fluorescence de la MC est un peu plus atténuée dans la forme

cyclique. Ceci traduit une augmentation du phénomène de FRET, lié sans doute à une

distance optimale des deux chromophores. En présence de l’enzyme MMP-1, l’augmentation

de la fluorescence du donneur est observée (Fig. 65), traduisant bien un éloignement des deux

chromophores, et donc une double coupure du substrat.

Temps en min

0 5 10 15 20

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

60

80

100

120

140

160

180

200

220

240 1 µM2 µM3 µM4 µM

Figure 65. Evolution de la fluorescence de MC à différentes concentrations en Sc1 en présence de la MMP-1. (Exc : 350 nm, Em : 401 nm)

L’évolution de la fluorescence est linéaire en début de réaction. Les vitesses initiales

ont pu être déterminées. Dans le cas de la MMP-1, nous avons effectué une représentation

directe de Vi par rapport à la concentration en substrat, ceci afin de bien démontrer que

malgré la présence de deux séquences clivables par la MMP-1, nous avons bien une cinétique

hyperbolique de type Michaëlienne à un substrat et une enzyme (Fig. 66). Pour les autres, la

représentation classique en double inverse a été employée.


sur 240


[S] (µM)

0 1 2 3 4

Flu

ores

cenc

e V

aria

tion

( F

I / m

in)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

kcat = 1.09 s-1 ± 0.26Km =6.3 µM ± 2.3

kcat /Km = 173.403 M-1.S-1


1/S (µM 1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I1 . m

in)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Test 1Test 2

kcat = 2.19 s-1 ± 0.17Km =3.39 µM ± 1.4

kcat /Km = 647,097 M-1.S-1


1/S ( µM 1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I1 . m

in)

0

20

40

60

80

100

Test 1Test 2

kcat = 5.11s-1 ± 0.64Km =7.4 µM ± 1.5

kcat /Km = 692,268 M-1.S-1

Figure 66. Clivage du substrat Sc1 par la MMP-1, MMP-2 et la MMP-9. Les résultats de la MMP-1 ont été représentés en représentation directe (Vi en fonction de la concentration en substrat).

Les résultats sont résumés dans le Tableau 13. Le peptide cyclique Sc1 est moins

reconnu par les gélatinases. Les valeurs de kcat/Km, ont chuté d’un facteur 8 pour la MMP-2 et

d’un facteur 5 pour la MMP-9. En revanche pour la MMP-1 aucune différence notable n’est

observée par rapport au peptide linéaire S1. Le doublement de la séquence et la cyclisation

ont permis de mieux cibler l’enzyme d’intérêt (MMP-1), car sa capacité de coupure et son

affinité restent les même. Ceci n’est pas le cas pour les deux autres MMPs. Car même si la

séquence est toujours mieux reconnue par les gélatinases, la spécificité reste quand même

affectée.

Contrairement à ce qui a été observé avec les peptides linéaires, la séquence utilisée

pour Sc9 est clivée par la MMP-1. Les trois enzymes ont d’ailleurs quasiment la même

activité pour ce substrat de l’ordre de 5*104M-1.s-1.


sur 240

Tableau 13. Résultats des clivages enzymatiques des substrats linéaires et cycliques par la MMP-1, -2 et -9.

Substrat kcat (s-1)

Km (µM)

kcat/Km (M -1.s-1) Substrat

kcat (s-1)

Km (µM)

kcat/Km (M -1.s-1)

MMP-1

S1 1,57 6,3 2,5*105 Sc1 1,09 6,3 1,7*105

S2 N.S.C N.S.C N.S.C Sc2 N.S.C N.S.C N.S.C

S9 N.S.C N.S.C N.S.C Sc9 0,28 5,4 5,2*104

MMP-2

S1 15,8 3,1 5,0*106 Sc1 2,19 3,39 6,5*105

S2 2,84 4,6 6,1*105 Sc2 N.S.C N.S.C N.S.C

S9 0,29 4,7 6,2*104 Sc9 0,8 3,1 5,6*104

MMP-9

S1 17,6 5,1 3,4*106 Sc1 5,11 7,4 6,9*105

S2 0,96 4,9 1,9*105 Sc2 0,95 10,2 9,3*104

S9 0,43 11,3 3,8*104 Sc9 0,33 6,8 4,9*104

Le résultat le plus surprenant a été observé pour le substrat cyclique Sc2. Pour le

dérivé linéaire S2, aucune activité n’a été mesurée en présence de la MMP-1 (cf. Tableau

13), mais par contre S2 était 10 fois mieux clivé par la MMP-2 que par la MMP-9. Ici, le

substrat cyclique n’est coupé que par la MMP-9. Aucune activité n’a été mesurée de l’enzyme

cible, la MMP-2. La cyclisation a eu pour effet d’annuler l’activité de la MMP-2 pour la

séquence, par contre l’activité de la MMP-9 est divisée par deux (1,9*105 à 9,3*104).

Nous n’avons pas réussi à cibler exclusivement les enzymes désirées, cependant les

modifications apportées à la séquence relative de la MMP-2 ont permis d’isoler un substrat

spécifique de la MMP-9. Un autre point important, les Km obtenus sont de l’ordre du µM

(3 à 11 µM), donc l’affinité des enzymes ayant une activité pour ces substrats est

sensiblement la même que pour les dérivés linéaires. L’efficacité catalytique des enzymes a

été modifiée. Dans le cas d’un peptide linéaire, une seule coupure est nécessaire pour

visualiser une évolution de la fluorescence. Pour les peptides cycliques, il faut deux coupures

pour observer une variation de la fluorescence de MC. Ceci peut expliquer la réduction de

l’efficacité catalytique de l’enzyme.

La conception de substrats fluorogènes avec deux coumarines nous a permis de

détecter l’activité des trois métalloprotéases ciblées. Les MMPs étudiées ont dans la plupart


sur 240

des cas une grande affinité pour les substrats développés. Les substrats linéaires ont un kcat/Km

supérieur aux peptides cycliques. Cette différence en fait de très bons substrats pour l’étude de

l’activité des MMPs in vitro. Le peptide S1, par sa grande spécificité pour les MMP-2 et -9,

pourrait être utilisé à de faible concentration car il est sensible à l’activité de ces enzymes. En

ce qui concerne les substrats cycliques, leur activité vis-à-vis des MMPs est certes moins

importante, mais les résultats obtenus prouvent que le concept de cyclisation d’une séquence

pour en augmenter l’affinité ou la spécificité est applicable dans notre quête d’un substrat

spécifique. Ce procédé nous a permis d’isoler le substrat Sc2. Dans les études que nous avons

menées sur la MMP-1, MMP-2 et la MMP-9, seule la MMP-9 a été capable de couper ce

peptide. Il nous a donc paru intéressant d’étudier la spécificité de ce substrat en présence d’un

échantillon biologique complexe comme le plasma. Ce type de test devrait nous permettre de

mesurer la résistance aux clivages protéolytiques aspécifiques des substrats cycliques par

rapport aux substrats linéaires, en prévision de leur utilisation in-vivo.

2.3. Evaluation de la stabilité des peptides en présence d’un échantillon

plasmatique.

Les principales sources de protéases sont le foie, le rein et le plasma 17. Certaines

enzymes comme les aminopeptidases ou les carboxypeptidases sont assez bien représentées

dans le plasma et constituent un groupe d’enzymes capable de digérer les peptides par leurs

extrémités C ou N terminale. D’autres enzymes comme les endopeptidases ont la capacité de

cliver les peptides à l’intérieur de la chaîne polypeptidique. Dans une optique de libération

contrôlée d’une molécule biologiquement active, il est nécessaire de vérifier si les peptides

que nous avons développés peuvent résister à une protéolyse aspécifique.

Le plasma étant un milieu très riche en protéines, nous avons décidé de réaliser nos

tests avec un échantillon dilué de plasma. Cette précaution a pour but de nous affranchir de

l’effet de filtre interne lié à la densité du milieu brut et de se placer dans des conditions

idéales pour pouvoir mesurer la dégradation des peptides dans un temps assez long (1h).

Notre crainte était que les peptides soient hydrolysés trop rapidement. Les tests ont donc été

réalisés avec 4 µl de plasma frais. Chaque peptide a été traité pendant 1h avec l’échantillon

plasmatique. Les résultats sont présentés Fig. 67 pour les différents substrats par couple

(linéaire vs cyclique).


sur 240

Dans les trois cas, les peptides cycliques ne sont quasiment pas dégradés,

contrairement aux peptides linéaires. Pour confirmer, cette résistance vis-à-vis du plasma,

nous avons ajouté 1 nM de MMP-9 dans les essais des substrats cycliques Sc1 et Sc9

(Fig. 68). Une augmentation de la fluorescence est alors observée. Cette augmentation est

plus élevée pour Sc1, qui est en effet plus sensible à l’activité de la MMP-9 (10 fois plus

sensible que Sc9 ici).

Temps en s

0 1000 2000 3000

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

50

100

150

200

250

300

350

S1 Sc1

Temps en s

0 1000 2000 3000

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

20

40

60

80

100

S2Sc2

Temps en s

0 1000 2000 3000

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

50

100

150

200

250

300

350

S9Sc9

Figure 67. Traitement des substrats avec un échantillon plasmatique.


sur 240

Temps en s

0 1000 2000 3000

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Sc1 + MMP-9Sc9 + MMP-9

Figure 68. Ajout de 1nM de MMP-9 aux essais de Sc1 et de Sc9, Fig. 33.

Dans le cas de Sc2, nous avons ajouté les trois métalloprotéases MMP-1, MMP-2 et

MMP-9, afin de vérifier la spécificité observée dans le chapitre précédent. Les résultats sont

présentés Fig. 69.

Temps en s

0 1000 2000 3000

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

10

20

30

40

50

S2Sc2Sc2 + MMP-1 Sc2 + MMP-2Sc2 + MMP-9

Figure 69. Ajout des différentes MMPs, pour confirmer la spécificité de Sc2. Dans chaque cas, le peptide est traité soit avec le plasma seul (Sc2 et S2) ou bien avec le plasma et une des MMPs sous la

forme active.


sur 240

La dégradation du peptide cyclique en présence de plasma est négligeable par rapport

à celle du peptide linéaire. En ajoutant de la MMP-1 ou de la MMP-2 activée, la variation de

la fluorescence reste la même. Par contre l’ajout de la MMP-9, augmente très fortement la

dégradation du peptide. Le substrat Sc2 est bien spécifique de la MMP-9. Son utilisation dans

un système de libération contrôlée permettrait de cibler des zones où l’activité de la MMP-9

est importante, telles que l’angiogenèse tumorale, ou encore l’émission de métastases.

Les MMPs jouent un rôle important dans différentes étapes clés de la progression

tumorale. La dualité fonctionnelle de ces enzymes dans la survie des cellules

cancéreuses, l’angiogenèse tumorale, l’émission de métastases ou encore lors de la

réponse immunitaire, nous a conduits à développer de nouveaux systèmes de type

peptidique capables de mettre en évidence l’activité de ces enzymes (in-vitro et plus tard

in-vivo) de manière spécifique. Nous souhaitons mettre cette activité à profit pour

concevoir des systèmes de libération contrôlée sensible à l’activité des MMPs. Pour que

ces systèmes soient efficaces, les substrats utilisés devront être capables de détecter

spécifiquement l’activité d’une MMP ou d’une famille de MMPs.

Dans cette optique, nous avons synthétisé des substrats sur la base de séquences

naturelles décrites comme clivées uniquement par une seule MMP. Un système de

détection de type FRET, composé de fluorophores de type coumarinique (la DAC et la

MC) a été développé. Nous nous sommes intéressés dans ces études préliminaires aux

séquences spécifiques de la MMP-1, la MMP-2, et la MMP-9. Les substrats linéaires

synthétisés (S1, S2 et S9) présentent une bonne affinité (de l’ordre du µM) pour les trois

MMPs étudiées. Les résultats ont montrés que nous n’avons pas parfaitement ciblés les

MMPs désirées. Cependant, pour le substrat S1, l’activité mesurée vis-à-vis des

gélatinases est tout à fait remarquable. Cette activité est en moyenne 16 fois supérieure à

celle mesurée pour l’enzyme cible, la MMP-1. Ceci fait de S1 un substrat très sensible à

l’activité des gélatinases, il suffira d’une faible quantité de produit pour détecter l’action

de ces enzymes.

Par la suite, nous avons aussi élaboré un nouveau type de substrat de MMPs, les

substrats cycliques. Le but était de développer un mime de la structure en triple hélice


sur 240

du collagène et augmenter la spécificité de nos substrats. Nous avons cherché à

synthétiser une structure rigide résistante à la protéolyse aspécifique des milieux

biologiques complexes, et bien-sûr sensible à l’activité des MMPs. Ce nouveau concept

de cyclisation de substrats de métalloprotéases se compose de deux séquences clivables

de MMPs incorporant un système de FRET. Les substrats Sc1, Sc2 et Sc9 synthétisés ont

été analysés. Les Km enregistrés pour les différents essais sont toujours de l’ordre du

µM. Les résultats ont montré que bien que Sc1 soit moins bien reconnu que S1 par les

gélatinases, l’activité de la MMP-1 sur ce substrat est identique. Le doublement de la

séquence et la cyclisation ont diminués l’efficacité catalytique des gélatinases. Ceci est

assurément lié à la nécessité d’une double coupure. Dans le cas de Sc9, la sélectivité de la

MMP-2 et la MMP-9 a été perdue car le substrat est aussi clivé par la MMP-1. Par

contre pour Sc2, seule un enzyme a été capable de cliver le peptide. Des substrats

spécifiques d’une MMP peuvent donc être élaborés par cette voie. Les essais réalisés en

présence d’échantillons plasmatiques ont confirmé cette sélectivité notamment vis-à-vis

des autres protéases. La résistance des substrats cycliques, par rapport aux substrats

linéaires a aussi été démontrée.

Ces résultats confortent la possibilité d’utilisation de substrats cycliques dans des

systèmes de libération contrôlée activables sous l’action des MMPs. Le substrat Sc2 fait

partie de cette classe de peptide, reconnu uniquement par une enzyme, ici la MMP-9.

Pour garder cette spécificité, nous avons cherché à coupler nos peptides de manière non

covalente avec les cyclodextrines via un système de type hôte-invité.


sur 240

3. Etudes préliminaires pour la conception de systèmes supramoléculaire de

libération contrôlée.

Plusieurs systèmes de libération contrôlée de pharmaceutiques utilisant les substrats de

métalloprotéases ont été décrits (Partie 1, §5.3). Ces macrostructures incluent de manière

covalente les substrats de métalloprotéases. Leur conception demande des efforts synthétiques

supplémentaires de couplages et de purifications avant d’arriver au produit final. Nous

voulons réduire ces étapes, en construisant un modèle basé sur l’incorporation de manière non

covalente de nos substrats dans ces systèmes. Nous souhaitons utiliser le pouvoir complexant

de la β-cyclodextrine afin d’inclure nos substrats coumariniques dans des nanoparticules de

cyclodextrines semblables à celles développées dans le cadre d’une collaboration avec

l’équipe du Pr. Patrick Couvreur 18-21. L’évaluation de l’interaction entre ces deux molécules

doit donc être réalisée afin d’estimer la viabilité de ce système.

Les cyclodextrines (CDs) sont des oligosaccharides cycliques approuvés, issus de la

dégradation enzymatique de l’amidon 22. Elles sont constituées par l’assemblage de 6 à 12

motifs de glucose reliés par des liaisons α-1,4. Ces molécules ont une forme torique,

tronconique. De façon très schématique, elles peuvent être représentées sous la forme d’un

cylindre conique (Fig. 70). Grace à la conformation de type chaise 4C1 adoptée par l’unité

α1-(+)-gluco-pyranose, tous les groupements hydroxyles secondaires sont situés sur l’un des

deux faces du cylindre, tandis que tous les groupements hydroxyles primaires sont sur la face

opposée.


sur 240

Figure 70. Représentation schématique des différentes formes de cyclodextrines.

Les paires d’électrons non liants de l’oxygène des ponts glucosidiques sont orientées

sur l’intérieur de la cavité, produisant une densité électronique élevée. Ceci confère aux

cyclodextrines des propriétés basiques (selon Lewis). Dans la molécule de cyclodextrine, une

ceinture secondaire complète est constituée par des liaisons hydrogène, de sorte que la βCD

possède une structure plutôt rigide expliquant probablement sa faible solubilité par rapport

aux autres CDs 23. Malgré cela, grâce à sa structure amphiphile, la cyclodextrine est soluble

dans l’eau et possède une cavité interne hydrophobe. Les protons H3 et H5 sont situés à

l’intérieur du cône, alors que les protons H1, H2 et H4 sont dirigés vers l’extérieur (Fig. 71).

Le Tableau 14 résume les différentes caractéristiques des CDs.

Figure 71. Disposition des protons au niveau de la cyclodextrine.


sur 240

Tableau 14. Caractéristiques des trois principales CDs 23, 24

Caractéristiques αCD βCD γCD

Nombre d'unités glucose 6 7 8

Masse molaire (g/mol) 972 1135 1297

Diamètre de la cavité (Å) 4,7-5,2 6,0-6,4 7,5-8,3

Hauteur de la cavité (Å) 7,9-8,0 7,9-8,0 7,9-8,0

Diamètre de la périphérie (Å) 14,2-15,0 15,0-15,8 17,1-17,9

Volume approximatif de la cavité (Å3) 174 262 427

Solubilité dans l'eau à 25°C (g/100ml) 14,5 1,85 23,2

Nombre de molécules d'eau retenues dans la cavité

6-7,6 11,0-12,0 13,3-17

L’ αCD est trop petite pour accueillir des cycles aromatiques. La γCD est trop grande

pour établir des liaisons stables avec des molécules invitées telles que les coumarines. Seule la

β-CD présente les caractéristiques nécessaires à l’accueil d’un cycle aromatique et à

l’établissement d’une interaction assez stable pour former des complexes d’inclusion.

L’évaluation des interactions entre la β-CD et des molécules hydrophobes peut se faire

par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire), ou encore par fluorescence. La complexation

est un processus dynamique, un échange entre les formes libres et la forme complexée

(Fig. 72). La formation du complexe engendre une modification de l’environnement des

protons H5 et H3 de la β-CD. Cette modification peut être suivie par RMN, car les

déplacements chimiques des protons de la β-CD mais aussi ceux du ligand vont être perturbés.

Figure 72. Exemple de la complexation du paraxylène avec la βCD, schématisation du changement d’environnement des protons H3 et H5 de la βCD 25.


sur 240

Dans le cas de molécules fluorescentes comme les coumarines, les propriétés

d’absorption et de fluorescence sont, elles aussi, modifiées par le changement

d’environnement. En général, lorsque le fluorophore est dans un milieu polaire la

fluorescence diminue. A l’inverse lorsque le milieu est apolaire, le fluorophore est stable et sa

fluorescence augmente.

Ces variations de fluorescence ou encore de déplacements chimiques en RMN sont des

paramètres qui peuvent être utilisés pour étudier le degré de complexation de la β-CD avec les

coumarines et notamment la détermination d’une constante d’association. Nos substrats étant

composés de deux fluorophores, il nous a fallu étudier séparément leurs propriétés. Le milieu

choisi est naturellement l’eau (ou l’eau deutérée pour la RMN). L’utilisation des coumarines

(DAC et MC) n’est pas envisageable pour ce solvant, puisque ces deux molécules sont très

peu solubles dans l’eau. Ceci implique dans un premier temps l’élaboration de modèles

simples, dérivés des coumarines, qui soient solubles dans l’eau. Nous avons choisi des dérivés

incorporant une chaîne tétraéthylène glycol (Fig. 73). Ce choix a été dicté par la nécessité de

concevoir un mime de peptides linéaires dans lequel les deux coumarines seraient éloignées

par une chaine neutre.

DAC-TEG-Succ-TEG-MC

DAC-TEG-NH2 MC-TEG-NH2

O

O ON

NH

OO

ONH

NO

OO

N

O

O OO

O

O

NH2

OO

ONH

O ON

O OOO

O

NO

OO

NH2

DAC-TEG-Succ-TEG-MC

DAC-TEG-NH2 MC-TEG-NH2

O

O ON

NH

OO

ONH

NO

OO

N

O

O OO

O

O

NH2

OO

ONH

O ON

O OOO

O

NO

OO

NH2

Figure 73. Dérivés de la DAC et de la MC.

La synthèse des dérivés DAC-TEG-NH2 (5), MC-TEG-NH2 (6) et DAC-TEG-Succ-

TEG-MC (7), sera détaillée dans ce chapitre. L’étude des constantes d’association entre les

différents dérivés et la β-CD sera réalisée par RMN et par fluorescence. Nous procéderons

ensuite à la détermination de ces constantes sur des dérivés du substrat S1, ne contenant que la

MC (pMC) ou bien que la DAC (pDAC) avant d’étudier les peptides linéaires et cycliques.


sur 240

3.1. Synthèse des dérivés de la DAC et de la MC.

Nous avons pour habitude d’utiliser dans notre Laboratoire des bras espaceurs de type

tétraéthylène glycol. Parmi ces bras espaceurs, le 1-amino-10-azido- 3,6,9-trioxaundecane

(NH2-TEG-N3) 26 a été utilisé pour lier, par exemple, une molécule d’intérêt à une surface de

nanoparticules de PVDF via une réaction de click chemistry (par le N3) et la formation d’une

liaison amide.

1-Amino-10-Azido- 3,6,9-Trioxaundecane (NH 2-TEG-N3)

NH2 OO

ON3

1-Amino-10-Azido- 3,6,9-Trioxaundecane (NH 2-TEG-N3)

NH2 OO

ON3

Dans notre cas, le groupement azide peut être converti en amine via une réduction, ce

qui permet de libérer un deuxième site réactif.

Nous avons choisi ce composé pour réaliser nos dérivés DAC-TEG-NH2, MC-TEG-

NH2 et DAC-TEG-Succ-TEG-MC.

La DAC ou la MC sont couplées par une liaison amide (Fig. 74) au composé N3-TEG-

NH2, pour donner la DAC-TEG-N3 (5) et la MC-TEG-N3 (6). Le rendement est quantitatif

pour le composé (5) et de 88 % pour le composé (6).

EDC/HOBtDCM

(5) DAC: R=N(CH 2CH3)2 100 %(6) MC: R=OCH3 88 %

N3

N3

O O

O

O

R

O

NH

OO

O

O

OR

NH2 OO

O

+ EDC/HOBtDCM

(5) DAC: R=N(CH 2CH3)2 100 %(6) MC: R=OCH3 88 %

N3

N3

O O

O

O

R

O

NH

OO

O

O

OR

NH2 OO

O

+

Figure 74. Synthèse des intermédiaires N3 de DAC-TEG-NH2 et MC-TEG-NH2

La réduction du groupement azide a été réalisée en présence de triphénylphosphine

dans le DCM (Fig. 75). Au terme de la réaction, l’intermédiaire formé (imino-

triphénylphosphine) est hydrolysé. Le composé DAC-TEG-NH2 (7) est obtenu avec un

rendement de 72 %, contre 12 % pour la MC-TEG-NH2 (8). Il semble que la MC n’a pas

résisté à la réduction par PPh3.


sur 240

(7) DAC R=N(CH2CH3)2 72 %(8) MC R=OCH3 12 %

(5) DAC R=N(CH2CH3)2

(6) MC R=OCH3

PPh3DCM

H2O

N3PPh3

O

NH

OO

ONH2

O

OR

O O

NH

OO

O

O

R O

NH

OO

ON

O

OR

(7) DAC R=N(CH2CH3)2 72 %(8) MC R=OCH3 12 %

(5) DAC R=N(CH2CH3)2

(6) MC R=OCH3

PPh3DCM

H2O

N3PPh3

O

NH

OO

ONH2

O

OR

O O

NH

OO

O

O

R O

NH

OO

ON

O

OR

Figure 75. Réduction du groupement azide.

Nous avons par la suite tenté une autre voie de synthèse pour le composé (8). Cette

voie, Fig. 76, consiste à protéger dans un premier temps l’amine de notre composé de départ

NH2-TEG-N3 par un groupement Boc (tert-butyloxycarbonyl). Le bras obtenu (Boc-TEG-N3),

est ensuite réduit par hydrogénation catalytique (Pd/C, H2), pour obtenir le composé Boc-

TEG-NH2. Après un couplage peptidique avec la MC, le dérivé Boc-TEG-MC (8a), est

obtenu. Après un traitement au TFA, le composé 8 est obtenu avec un rendement de 63 %.

Boc-TEG-NH 2

DCM

Boc-TEG-N 3

(8) 63%

TFA (20%)/DCM

MCEDC/HOBtDCM

Pd/C, H2

MéthanolBoc 2O

NH2-TEG-N3

(8a)

N3

N3

NH

OO

ONH

O

O

O

OO

ONH2 O

OO

NH

O

O

O

O

NH

OO

O

O

O NH

OO

ONH2

O

O

NH2 OO

O

Boc-TEG-NH 2

DCM

Boc-TEG-N 3

(8) 63%

TFA (20%)/DCM

MCEDC/HOBtDCM

Pd/C, H2

MéthanolBoc 2O

NH2-TEG-N3

(8a)

N3

N3

NH

OO

ONH

O

O

O

OO

ONH2 O

OO

NH

O

O

O

O

NH

OO

O

O

O NH

OO

ONH2

O

O

NH2 OO

O

Figure 76. Autre voie de synthèse du dérivé (8).

Cette voie de synthèse, nous a permis d’augmenter les rendements pour le dérivé (8),

nous sommes passés de 12 % à 63 %. Parallèlement, nous avons également effectué la

synthèse du dérivé (7) par cette voie. Le rendement obtenu a été de 91 %.

Nous avons ensuite cherché à coupler les deux dérivés (7) et (8). Pour cela, une

molécule possédant une courte chaîne carbonée et comportant deux groupements carboxyles

était nécessaire. L’utilisation de l’anhydride succinique nous a paru une solution intéressante.

Le mélange de (7) avec l’anhydride succinique a donc conduit à la formation du composé

DAC-TEG-Succ-COOH (9) (Fig. 77) avec un rendement de 80 %.


sur 240

DCM

Anhydridesuccinique

(7) DAC-TEG-Succ-COOH (9) 80 %

DCM(8)

EDC/HOBt

DAC-TEG-Succ-TEG-MC (10) 72 %

O

O ON

NH

OO

ONH

NO

OO

N

O

O OO

O

O

N O

O

NH

OO

ONH

OH O

O

O

O

O

ON O O

O

NH

OO

ONH2 + DCM

Anhydridesuccinique

(7) DAC-TEG-Succ-COOH (9) 80 %

DCM(8)

EDC/HOBt

DAC-TEG-Succ-TEG-MC (10) 72 %

O

O ON

NH

OO

ONH

NO

OO

N

O

O OO

O

O

N O

O

NH

OO

ONH

OH O

O

O

O

O

ON O O

O

NH

OO

ONH2 +

Figure 77. Couplage des deux coumarines via l’anhydride succinique.

Le dérivé DAC-TEG-Succ-TEG-MC (10) est finalement obtenu en couplant les

dérivés (8) et (9) avec un rendement de 72 %.

En ce qui concerne les dérivés du substrat S1, comportant uniquement la DAC

(pDAC) ou la MC (pMC), la synthèse a été réalisée dans les mêmes conditions que celles

utilisées pour la synthèse de substrats linéaires. Les acides aminés Fmoc-Lys(DAC)-COOH

ou encore Fmoc-Lys(MC)-COOH, ont été remplacés par la Fmoc-Lys(Boc)-COOH. Les

rendements sont de 28 % pour pDAC et de 37% pour pMC (Tableau 15).

Tableau 15. Séquence primaire des dérivés du substrat de la MMP-1, pMC et pDAC.

Peptide Séquence Rendement

pDAC H2N-K(DAC)-G-P-Q-G~L-L-G-A-K-A-CO2H 28 % pMC H2N-K-G-P-Q-G~L-L-G-A-K(MC)-A-CO2H 37 %

3.2. Détermination des propriétés physico-chimiques des complexes d’inclusion.

L’étude des propriétés physico-chimiques d’un complexe d’inclusion se fera en deux

étapes. La première étape consiste à déterminer la stœchiométrie du complexe formé. Ensuite,

il faut évaluer la constante d’association qui reflète la force d’interaction entre les deux

espèces moléculaires (molécule invitée-molécule cage) et permet de connaître la proportion

de la molécule complexée. Nous avons choisi d’utiliser la RMN et la fluorescence pour notre

étude.


sur 240

3.2.1. Détermination de la stœchiométrie des complexes.

La méthode des variations continues ou méthode de Job 27, 28 est utilisée pour

déterminer la stœchiométrie des complexes d’inclusion avec les cyclodextrines. La formation

d’un complexe d’inclusion impliquant une molécule du composé à inclure (G) et n

cyclodextrines (CD) sera décrite par :

nCD + G G:CD nnCD + G G:CD n

La constante d’association du complexe d’inclusion sera alors décrite par :

[ ][ ][ ]n

na

CDG

CDGK

:= (I)

Avec : [G : CDn] = concentration en complexe, [G] et [CD] concentrations en G et CD

libre dans le mélange.

En définissant [G]t et [CD]t comme étant les concentrations totales en G et CD dans

l’échantillon, nous pouvons écrire les relations suivantes :

[ ] [ ] [ ]nt CDGGG :−= (II)

[ ] [ ] [ ]nt CDGnCDCD :−= (III)

La méthode de Job impose 2 conditions :

� concentrations initiales des solutions mères utilisées identiques.

� mélange les deux solutions à volume constant.

Ceci se traduit par :

[ ] [ ] MCDG tt =+ (IV)

[ ][ ] [ ]tt

t

CDG

G

+ =r (V)


sur 240

Avec M = la concentration totale de mélange, et r = la proportion molaire de la

molécule invitée (0 < r < 1)

Les concentrations en espèces libres peuvent alors être déduites des relations

suivantes:

[ ] [ ]nCDGrMG :−= (VI)

[ ] [ ]nCDGrMCD :)1( −−= (VII)

La concentration en complexe [G:CDn] est donc une fonction de r et elle passe par un

maximum lorsque la dérivée d[G:CDn]/dr est nulle. La dérivation des équations (I), (VI) et

(VII) par rapport à r conduit aux relations suivantes :

[ ] [ ] [ ] [ ]0=+

dr

CDdGn

dr

GdCD (VIII)

[ ]M

dr

Gd = (IX)

[ ]M

dr

CDd −= (X)

Ces trois équations peuvent être combinées en une seule:

[ ] [ ]GnCD = (XI)

En utilisant les équations (VI), (VII) et (XI), nous parvenons à une solution unique et

la concentration maximale en complexe est obtenue pour :

nr

+=

1

1

Cette relation ne dépend ni de la constante d’association Ka, ni de la valeur de la

concentration M. Pour l’étude des complexes d’inclusion, nous sommes dans le cas d’un

échange rapide par rapport au temps d’observation. Nous pouvons écrire la relation suivante :


sur 240

( ) [ ] ( ) [ ] ( ) [ ]GPCDGPGP fGncGtobsG += : (XII)

Où Pobs, Pf et Pc représentent, respectivement, la valeur du paramètre observé et ses

valeurs à l’état libre et dans le complexe pur. Dans toutes les études suivantes, nous ne

considérerons que des variations de paramètres observés avec les conventions suivantes :

fobsobs PPP −=∆

fcc PPP −=∆

L’équation (XII) devient : ( ) [ ] ( ) [ ]tobsGncG GPCDGP ∆=∆ :

∆P(G)obs, étant proportionnel à [G :CDn], il est donc une fonction de r. Le tracé de la

fonction f(r) = ∆P(G)obs*[G] t doit alors passer par un maximum pour r = 1/(1 + n) et permettre

de déterminer n. La même démarche peut être effectuée pour le composé [CD] et confirmer

ainsi la stœchiométrie.

Cette méthode est appliquée en UV, en fluorescence, en RMN, où le paramètre P est

respectivement l’absorbance, l’intensité de fluorescence ou la variation de déplacement

chimique. En RMN, la détermination de n se fait par l’enregistrement d’une série des spectres

1H en 1D où il est possible de suivre les variations des déplacements chimiques des protons

de CD ou de la molécule invitée. Le déplacement chimique des protons doit varier en fonction

des concentrations de CD et de G.

Soient :

δl = le déplacement chimique d’un proton de la molécule invitée (ou de CD) libre.

δc = le déplacement chimique de ce même proton dans le mélange G :CD.

cobs δδδ −=∆ 1

Ainsi, en rapportant ∆obs*[G] 0 (ou [CD]0) en fonction de r, une courbe en forme de

cloche centrée sur une valeur rmax est obtenue. Avec :

[G]0 = Concentration initiale de la molécule incluse.


sur 240

[CD]0 = Concentration initiale de la cyclodextrine.

Par exemple, si 5,0max =r

5,01

1 =+

=n

r

Donc n=1. Nous pouvons dire qu’il y a formation d’un complexe d’inclusion de type

1 :1.

3.2.1.1. Etude de la stœchiométrie de complexation des composés 7 et 8 par la

RMN.

La βCD possède 7 unités glucosidiques identiques. L’attribution de ses protons est

largement décrite dans la littérature (Fig. 78) 29-33. Les protons anomériques H1 peuvent être

attribués sur le spectre 1H car il s’agit des plus déblindés. En utilisant les corrélations scalaires 1H-1H et 1H-13C (expériences COSY et HSQC), les autres protons peuvent aussi être

identifiés.

Figure 78. Spectre 1H de la βCD seule, à 5 mM dans le D2O.

Les protons H5 et H3 sont localisés à l’intérieur de la cavité de la βCD. Ils sont donc

fortement influencés par l’intégration d’un composé au sein de cette cavité. Le proton H3 est

le plus souvent exploité car il apparait sous forme de triplet et il est isolé des autres pics,

contrairement au proton H5 qui est confondu avec les protons H6.


sur 240

En ce qui concerne les dérivés des composés 7 et 8, les spectres 1H ont permis de

mettre en évidence que certains protons apparaissent dans la même zone que ceux de la βCD.

C’est le cas d’Hf de la DAC (Fig. 79) et d’He de la MC (Fig. 80).

Figure 79. Spectre 1H de la DAC-TEG-NH2 seule, à 5 mM dans le D2O.

Figure 80. Spectre 1H de la MC-TEG-NH2 seule, à 5 mM dans le D2O.

Pour réaliser les courbes de JOB, nous avons préparé deux solutions équimolaires de

βCD, et des composés 7 et 8 à (5 mM) dans le D2O. Les solutions des tubes RMN ont été

préparées en mélangeant la βCD et le composé 7, ou la βCD et le composé 8 en différentes


sur 240

proportions avec un volume total constant de 600 µl et donc une concentration totale

constante de 5 mM. Les spectres RMN 1H de ces différents échantillons ont été enregistrés

(Fig. 81 et 82).

Les protons Ha à Hf de la DAC (composé 7, Fig.81), ont subi un décalage de leur

déplacement chimique. Ce décalage est plus ou moins important selon le proton.

Figure 81. Spectre proton des différents mélanges (7)/βCD pour déterminer la courbe de JOB. Chaque acquisition a été réalisée en 128 scans, pour avoir la meilleure résolution.

Les protons Ha à He de la MC (composé 8, Fig.82), ont eux aussi subi un décalage.

Cependant il est moins important que pour la DAC.

Dans le cas de la βCD, seul les protons H3, H5 et H6 ont été décalés. Pour les protons

H3 et H5, leur position à l’intérieur de la cavité fait que leur déplacement chimique est

influencé par l’intégration du chromophore. Le décalage du proton H6 indique que ce dernier

est aussi en interaction avec le chromophore malgré son positionnement à l’extérieur de la

cavité. Les autres protons de la βCD ne subissent aucune modification spectrale, car non

impliqués dans la complexation. Il est important de noter que la valeur du décalage de H3 lors

de la complexation de la DAC est deux fois plus importante que la valeur observée pour la

MC. La DAC serait donc plus complexante que la MC.


sur 240

Les variations de déplacements chimiques du proton H3 de la cyclodextrine et des

protons aromatiques des composés 7 et 8 ont été reportées au niveau du Tableau 16.

Figure 82. Spectre proton des différents mélanges (8)/βCD pour déterminer la courbe de JOB.

Tableau 16. Valeurs de décalage spectral des protons. Les zones encadrées correspondent aux décalages les plus importants. Les protons subissant les modifications spectrales les plus importants seront utilisés pour faire la courbe de JOB.

∆H en ppm DAC-TEG-NH2 (7)

MC-TEG-NH2 (8)

Ha 0,073 0,063 Hb 0,075 0,065 Hc 0,180 0,118 Hd 0,351 0,056 He 0,168 … Hf 0,025 … H3 0,146 0,073

Les valeurs de décalage sont plus importantes pour la DAC, que pour la MC. Ces

valeurs semblent refléter une meilleure complexations de la DAC. En règle générale, la

détermination de la stœchiométrie doit se faire avec les protons ayant subi le plus grand

décalage. Dans le cas de la DAC, nous avons réalisé la courbe de JOB avec les protons Hc, Hd


sur 240

et He. Pour la MC, seul le proton Hc a un décalage important. Nous avons choisi le proton Hd

à titre de comparaison avec la DAC car l’He de MC n’est pas exploitable.

Le ∆obs*[G] 0 (ou [βCD]0) a été reporté en fonction du ratio r (proportion molaire de la

molécule concernée). Ici, [G]0 est égale à la concentration initiale de la molécule incluse

(composé 7 ou 8) et [βCD]0, la concentration initiale de la β-cyclodextrine. Nous avons

reporté les données relatives à l’expérience réalisée pour le composé 7 (Tableau 17).

Les courbes de Job des deux composés étudiés sont présentées Fig. 83 et 84.

Tableau 17. Données utilisées pour la courbe de Job du composé 7.

rDAC rβCD ∆Hc*[DAC] 0 ∆Hd*[DAC] 0 ∆He*[DAC] 0 ∆H3*[βCD]0

1 0 0 0 0 0

0,8 0,2 0,125 0,303 0,237 0,146

0,6 0,4 0,271 0,578 0,357 0,266

0,5 0,5 0,195 0,639 0,355 0,297

0,4 0,6 0,325 0,645 0,322 0,235

0,3 0,7 0,259 0,510 0,248 0,210

0,2 0,8 0,180 0,351 0,168 0,136 0 1 0 0 0 0

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆∆H* (

C) 0

0,0

0,2

0,4

0,6

Hc vs r DAC

Hd vs r DAC

He vs r DAC

H3 vs r ββCD

0,5

Figure 83. Courbe de JOB, DAC-TEG-NH2/βCD. Ici (C)0 représente la concentration initiale en DAC ou βCD, rDAC le ratio en DAC et rβCD le ratio en βCD, selon le proton étudié. En pointillé sont


sur 240

représentés les maximas des cloches. Les valeurs approximatives de rmax pour Hc, Hd, He et H3, sont respectivement de 0,45 ; 0,47 ; 0,53 ; 0,5. Les valeurs n sont égales à 1,2 ; 1,1 ; 0,9 et 1.

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆∆H* (

C) 0

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

H3 vs r βCD

Hc vs r MC

Hd vs r MC

He vs r MC

0,5

Figure 84. Courbe de JOB, MC-TEG-NH2/βCD. Ici (C)0 représente la concentration initiale en MC ou βCD, r le ratio en MC ou βCD, selon le proton étudié. En pointillé sont représentés les maximas des cloches. Les valeurs approximatives de rmax pour Hc, Hd, He et H3, sont respectivement de 0,52 ; 0,56 ; 0,5 ; 0,5. Les valeurs de n sont égale à 0,9 ; 0,8 ; 1 et 1.

La détermination du haut de la cloche, donc du rmax a été effectuée en traçant des

droites passant par les trois premiers points et les trois derniers points de la courbe.

Pour la formation d’un complexe d’inclusion de type :

nCD + G G:CD nnCD + G G:CD n

Où n représente le nombre de cyclodextrines.

En utilisant la formule suivante, nr

+=

1

1 , la valeur n peut être déterminée.

Pour la DAC-TEG-NH2, et pour la MC-TEG-NH2, la valeur n est de 1.

Sur ces modèles simples de composés de types coumariniques, les coumarines MC et

DAC forment un complexe de type 1 :1 avec la β-cyclodextrine.


sur 240

3.2.1.2. Etude de la stœchiométrie de complexation des composés pDAC et

pMC par RMN.

Pour pDAC et pMC la séquence des deux peptides présente la particularité de ne pas

avoir de groupement aromatique. Au niveau des spectres RMN des expériences de

complexation, Fig. 85 et 86, le proton H3, de la βCD est clairement identifiable.

Figure 85. Spectre 1H des différents mélanges pDAC/βCD pour déterminer la courbe de JOB.

Figure 86. Spectre 1H des différents mélanges pMC/βCD pour déterminer la courbe de JOB.

Les décalages du proton Hf de la DAC et du proton He de la MC n’ont pas pu être

suivis. Nous avons représenté sur le Tableau 18, les décalages observés pour les autres

protons.


sur 240

Pour pDAC, les décalages les plus importants sont observés pour les protons Ha et He,

contrairement à ce qui a été observé pour le composé 7. Les protons Hc et Hd, sont moins

influencés par la complexation. Les valeurs observées pour le proton He des deux molécules

sont très proches. Nous avons choisi de réaliser la courbe de JOB avec les données obtenues

pour les protons Ha et He (Fig. 87).

En revanche pour pMC, aucun changement n’a été constaté en comparaison avec le

composé 8. Le proton Hc est toujours le plus décalé, avec la même intensité. Nous avons

choisi de réaliser la courbe de JOB avec les données obtenues pour les protons Hc et Hd

(Fig. 88).

Pour la βCD, le H3 a subi sensiblement le même décalage en comparaison avec les

données obtenues pour les composés 7 et 8. La différence entre les valeurs de décalage est

toujours d’un facteur 2.

Tableau 18. Valeurs des déplacements chimiques des protons de pDAC et de pMC.

∆H en ppm pDAC pMC

Ha 0,173 0,088 Hb 0,063 0,079 Hc 0,008 0,127 Hd 0,068 0,079 He 0,167 … H3 0,148 0,057


sur 240

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆∆H* (

C) 0

0,0

0,2

0,4

0,6

Ha vs r pDAC

He vs r pDAC

H3 vs r ββCD

0,5

Figure 87. Courbe de JOB, pDAC/βCD. Les valeurs approximatives de rmax pour Ha, He et H3, sont respectivement de 0,61 ; 0,54 ; 0,5. Les valeurs de n sont égales à 0,6 ; 0,9 et 1.

Les résultats de la courbe de JOB montrent que pour He, la complexation est de type

1 :1 (DAC : βCD). Pour le proton Ha, il semblerait que nous soyons plutôt sur un complexe de

type 2 :1. Par contre pour le H3 de la βCD, la stœchiométrie est de type 1 :1. Nous pouvons

donc en conclure que la stœchiométrie de complexation entre le pDAC et la βCD est de type

1 :1. La différence avec Ha est sûrement liée à une mauvaise interaction du proton avec la

cyclodextrine.


sur 240

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆∆H* (

C) 0

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Hc vs r pMC

Hd vs r pMC

H3 vs r βCD

0,5

Figure 88. Courbe de JOB, pMC/βCD. Les valeurs approximatives de rmax pour Hc, Hd, et H3, sont respectivement de 0,5 ; 0,53 ; 0,5. Les valeurs de n sont égales à 1 ; 0,9 et 1.

Les résultats de la courbe de JOB, pour pMC montrent clairement que nous sommes

dans une stœchiométrie de type 1 :1 entre le pMC et la βCD.

Sur ces modèles n’intégrant qu’une seule coumarine, il est clairement établi que la

stœchiométrie de complexation est de type 1 : 1. La partie peptidique de la molécule ou le

bras polyéthylène glycol n’influencent pas la complexation. Il semblerait que la complexation

de la DAC soit plus forte que pour la MC. La détermination des constantes d’association

devrait certainement confirmer cette observation.

3.2.1.3. Etude de la stœchiométrie de complexation du composé 10 et du

peptide S1.

Le composé 10 a été synthétisé dans le but d’avoir un modèle intégrant les deux

coumarines, soluble dans l’eau. Malheureusement, ce dernier s’avère insoluble dans du D2O à

la concentration désirée, c'est-à-dire 13,7 mg de produit dans 3 ml de D2O. Plusieurs

tentatives de solubilisation, notamment en présence de plus de 60 % de DMSO (D6), n’ont pas

permis de mettre en solution le produit. Des études préliminaires ont démontré qu’aucune

complexation n’avait lieu dans le DMSO (D6). Le manque de solubilité du composé 10 ne

nous a donc pas permis de réaliser une courbe de JOB. La stœchiométrie n’a pas été

déterminée pour ce produit.


sur 240

Nous avons tenté d’obtenir la courbe de JOB pour le substrat S1. Là encore, le peptide

est faiblement soluble dans du D2O. Il a fallu utiliser une solution à 20 % de DMSO (D6) pour

pouvoir effectuer la courbe de JOB. Les spectres RMN enregistrés sont présentés Fig. 89, et

les valeurs des décalages obtenus sont notés au niveau du Tableau 19.

Figure 89. Spectre proton des différents mélanges S1/βCD afin de déterminer la courbe de JOB. L’attribution des différents déplacements chimiques a été effectuée par une expérience NOESY. Les protons appartenant à la DAC sont notés HxD et ceux de la MC sont notés HxM, le x correspondant aux différents protons du chromophore.

Pour la cyclodextrine, l’évolution du proton H3 a été difficile à suivre, la valeur

rapportée est donc approximative. Le décalage observé est proche de ceux enregistrés pour la

complexation des deux dérivés de la MC (0,076 pour le composé 8, et 0,057 pour le pMC).

En ce qui concerne les protons des chromophores, ils ont tous subi un déplacement

chimique important, contrairement à ce qui a été observé précédemment pour les dérivés

simples. Nous avons par conséquent réalisé la courbe de JOB pour tous les protons des deux

fluorophores (Fig. 90).


sur 240

Tableau 19. Valeurs des shifts observées pour le peptide S1.

∆H en ppm DAC MC

Ha 0,167 0,170 Hb 0,131 0,139 Hc 0,095 0,137 Hd 0,122 0,208 He 0,116 … H3 0,066

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆H*(

C) 0

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

HaDHbDHcDHdDHeD

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆∆H

*(C

) 0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

HaMHbMHcMHdMH3

Figure 90. Courbe de JOB pour le peptide S1. HaD correspond au proton Ha de la DAC, et HaM le Ha de la MC. Pour la DAC et la MC le maximum est proche de 0,2. Pour la cyclodextrine, il est de 0,8. La stœchiométrie serait de 4 :1 (βCD : coumarine).

L’interprétation des deux courbes de JOB nous donne une stœchiométrie de type 4

cyclodextrines pour un peptide S1. La courbe étant incomplète, par manque de points entre 0

et 0,2 ou encore entre 0,8 et 1, il nous est difficile d’affirmer ce résultat. Nous avons par

ailleurs vérifié l’influence du DMSO (D6) dans cette étude. La stœchiométrie de complexation

du composé 7 a été réalisée dans les mêmes conditions expérimentales. Le résultat obtenu

(Fig. 91) est comparable à celui déjà reporté pour ce produit, avec une complexation de type

1 :1. Ainsi, le DMSO n’influence pas la courbe de JOB.

Si la courbe réalisée pour le peptide S1 est correcte, la complexation du peptide serait

de type 4 :1.


sur 240

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆∆H* (

C) 0

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4Hc

Hd

He

H3

Figure 91. Courbe de JOB pour le composé 7, avec 20 % de DMSO (D6).

3.2.2. Détermination de la constante d’association par : approche de Benesi-

Hildebrand.

La constante d’association du complexe d’inclusion peut être déterminée par

différentes méthodes. Dans ce chapitre, nous allons utiliser les deux techniques les plus

utilisées: la fluorimétrie et la RMN.

La constante d’association (Ka) est souvent déterminée par des méthodes graphiques

permettant d’obtenir une relation linéaire entre Pobs et Ka. Les différentes représentations

graphiques utilisées découlent de la même équation initiale, proposée par Benesi et

Hildebrand 34, 35. Cette approche permet de déterminer graphiquement Ka, dans le cas d’un

complexe de stœchiométrie 1 :1 et à condition que l’un des deux composés soit en très large

excès par rapport à l’autre, c’est-à-dire par exemple [G]t << [CD]t si G est observé.

Nous pouvons écrire :

CD + G G:CDCD + G G:CD

[ ][ ][ ]CDG

CDGKa

:=


sur 240

[ ] [ ]CDGGG t :−=

[ ] [ ] [ ]CDGCDCD t :−=

[ ] ( )

( )[ ]t

cG

obsG GP

PCDG

∆∆

=:

En combinant ces équations, nous obtenons :

( )[ ] ( )

[ ]tcGta

obsG CDKa

PCDKP

+∆

=∆1

Cette formule peut aussi s’écrire sous la forme :

( ) ( ) [ ] ( )cGtaobsG PCDKPP cG ∆+

∆=

∆1

*

11

Si la courbe 1/∆P(G)obs en fonction de 1/ [CD]t (souvent appelée courbe double

réciproque) est tracée, la pente de droite obtenue sera 1/(Ka* ∆P(G)c) et d’ordonnée à l’origine

1/(∆P(G)c).

Par RMN, trois types de paramètres peuvent être utilisés: le déplacement chimique, le

temps de relaxation et le coefficient de diffusion. La plupart des déterminations de constante

d’association d’un complexe d’inclusion se font à partir de la mesure des variations de

déplacement chimique. En effet, l’obtention de ce paramètre à partir d’un spectre RMN

proton est rapide et précise.

Mathur et al 36, Hanna et Ashbaugh 37 ont indépendamment appliqué l’équation de

Benesi-Hildebrand au paramètre RMN (déplacement chimique) pour obtenir l’équation:

[ ] ctaobs CDKc δδδ ∆+

∆=

∆1

**

11

La deuxième équation a été proposé par Foster et Fyfe 38, plus communément appelé

courbe de Scatchard:


sur 240

[ ] cobs aat

obs KKCD

δδδ ∆+∆−=∆*

Une troisième approche linéaire appliquée aux déplacements chimiques a été

introduite par Scott 39:

[ ] [ ]cc a

t

obs

t

K

CDCD

δδδ ∆+

∆=

∆ *

1

Dans notre cas, nous utiliserons cette dernière représentation pour déterminer le Ka.

C’est la représentation la plus utilisée dans la littérature pour la détermination du Ka par la

RMN. L’avantage est que le point d’intersection de la droite obtenue avec l’axe des abscisses

correspond à l’inverse du Ka, c'est-à-dire le Kd (la constante de dissociation).

3.2.2.1. Détermination par RMN des constantes d’association, sur les modèles

comprenant une seule coumarine.

La détermination de la stœchiométrie de complexation des composés 7, 8, pMC et

pDAC, nous a permis de conclure que l’association β-CD : DAC ou β-CD : MC était de type

1 :1. Nous avons également constaté que le décalage des déplacements chimique des protons

de la DAC était plus important que celui des protons de la MC. Il semble donc que

l’interaction entre la DAC et β-CD soit plus grande qu’avec la MC. L’établissement des

constantes d’association permettra de vérifier cette hypothèse.

L’obtention de ces constantes nécessite que l’un des partenaires soit à une

concentration très faible par rapport à l’autre. Les expériences ont consisté à maintenir la

concentration en molécule invitée à 0,5 mM, et à faire varier la concentration en βCD de 0 à

10 mM (voir exemple composé 7, Fig. 92). Les spectres obtenus sont de bonne qualité malgré

la faible concentration en produit.

Nous avons reporté les différents déplacements chimiques observés pour les composés

7 et 8 et les peptides pDAC et pMC dans le Tableau 20.


sur 240

Figure 92. Variation des déplacements chimiques des protons de la DAC-TEG-NH2 en présence de βCD.

Tableau 20. Déplacements chimiques maximum observés pour les différents protons.

∆H en ppm DAC-TEG-NH2

(7) MC-TEG-NH2

(8) pDAC pMC

Ha 0,019 0,054 0,031 0,041 Hb 0,066 0,003 0,052 0,006

Hc 0,114 0,115 0,153 0,102

Hd 0,258 0,031 0,218 0,031

He 0,154 …. 0,157 ….

Hf 0,041 …. 0,035 ….

Les décalages sont quasiment de la même intensité que lors de l’établissement de la

courbe de JOB. Les protons subissant les variations les plus importantes sont les mêmes au

niveau de la DAC, pour le composé 7 et le pDAC. La même observation peut être faite pour la

MC. Ceci montre que la complexation de la DAC ou de la MC se fait indépendamment de la

chaîne polyéthylène glycol ou encore peptidique. Nous avons sélectionné les protons Hc, Hd et

He pour la DAC et les protons Hc et Hd pour la MC.


sur 240

En utilisant la représentation de Scott, [ ]

obs

tCD

δ∆en fonction de [ ]tCD , les constantes

d’association peuvent être déterminées (Fig. 93 et 94).

[β−CD] µΜ

-4 -2 0 2 4 6 8 10 12

[β−C

D]/∆

δ

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Hc

Hd

He

DAC-TEG-NH2/βCD

[[[[β−β−CD]] µΜµΜ

-10 -5 0 5 10 15

[[ β−β−

CD

]/]/ ]/∆δ

]/∆δ

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

Hc

Hd

MC-TEG-NH2/βCD

Figure 93. Détermination du Ka, DAC-TEG-NH2/βCD et MC-TEG-NH2/βCD.

Pour le composé 7, les valeurs de Ka pour les protons Hc, Hd et He de la DAC, sont

respectivement de 4264 M-1, 4732 M-1 et 4363 M-1. En moyenne, le Ka est de 4453 M-1 ± 234,

pour la DAC-TEG-NH2.

En ce qui concerne le composé 8, les valeurs sont 20 fois plus faibles. Les valeurs de

Ka, pour les protons Hc et Hd de la MC sont respectivement de 180 M-1 et 189 M-1. En

moyenne le Ka est de 184 M-1 ± 24, pour la MC-TEG-NH2.

Ces premiers résultats démontrent clairement ce qui a été observé lors de

l’établissement de la stœchiométrie par la courbe de JOB, où le décalage du proton H3 de la

βCD était plus important lors d’une complexation avec la DAC. Ceci suggérait déjà une

meilleure inclusion de la DAC.

Si nous comparons ces résultats avec ceux obtenus pour les peptides, la même

remarque peut être faite. Les valeurs de Ka, pour les protons Hc, Hd et He de la DAC, sont

respectivement de 4024 M-1, 2726 M-1 et 2957 M-1. En moyenne le Ka est de 3236 M-1 ± 576,

pour le pDAC. Les valeurs de Ka, pour les protons Hc et Hd de la MC sont respectivement de

174 M-1 et 160 M-1. En moyenne, le Ka est de 167 M-1 ± 10, pour le pMC. Le rapport entre les

deux coumarines est toujours d’un facteur 20.


sur 240

pDAC/βCD

[ββ−CD] µΜ

-4 -2 0 2 4 6 8 10 12

[−β−

CD

/]/∆δ

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Hc

Hd

He

pMC/βCD

[β−CD] µΜµΜ

10 -5 0 5 10

[[ β−C

Dδ

]/∆δ

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Hc

Hd

Figure 94. Détermination du Ka, pDAC /βCD et pMC/βCD.

En conclusion, sur des modèles simples et des modèles peptidiques, la

coumarine MC s’intègre 20 fois moins dans la βCD que la DAC. La chaine polyéthylène

glycol et la séquence peptidique n’ont aucune influence sur la complexation.

3.2.2.2. Détermination par RMN des constantes d’association du composé 10

et du peptide S1.

Nous avions déterminé via les courbes de JOB que la stœchiométrie de complexation

de S1 serait plutôt de type 4 :1. Si nous tenons compte de ce résultat, il n’est donc pas possible

de déterminer des constantes d’association par l’approche de Benesi-Hildebrand car elle n’est

applicable que pour une complexation de type 1 :1. Cependant, sur les modèles simples, nous

avions démontré par RMN et par fluorescence que les coumarines DAC et MC formaient un

complexe de type 1 :1 avec la cyclodextrine et que les parties polyéthylène glycol et

peptidique n’étaient pas impliquées dans cette complexation. Il est donc difficile d’imaginer

que chacune des deux coumarines soit liée avec deux cyclodextrines, pour arriver à une

stœchiométrie de type 4 :1. En connaissance de cause, nous avons délibérément fait

l’hypothèse que chaque coumarine formait un complexe de type 1 :1 avec une cyclodextrine

afin d’appliquer l’approche de Benesi-Hildebrand. Lors de la représentation graphique des

données expérimentales, si les points sont alignés sur une droite cette hypothèse sera vérifiée.

Les spectres RMN des composés 10 et S1 sont présentés Fig. 95 et 96. Dans les deux

cas, les protons des coumarines subissent tous un décalage.


sur 240

Figure 95. Décalage des protons du composé 10. Les protons appartenant à la DAC sont nommés HxD et ceux correspondant à la MC, HxM.

Figure 96. Décalage des protons du composé S1. Les protons appartenant à la DAC sont nommés HxD et ceux correspondant à la MC, HxM.

Contrairement à ce qui a été observé sur les modèles simples (Tableau 20), les

intensités de décalage des différents protons sont élevées (Tableau 21). Par exemple pour le

composé 7, les valeurs pour la DAC variaient entre 0,019 et 0,258, alors qu’ici, pour le

composé 10, la fourchette est plutôt comprise entre 0,135 et 0,353. Même la hiérarchie au


sur 240

niveau des décalages maximums est modifiée. Ainsi pour la DAC, les protons Hc, Hd et He,

ont le décalage le plus faible alors que pour les protons Ha et Hb ont des valeurs beaucoup plus

élevées. Les valeurs ont été quasiment multipliées par 5. Nous avons par conséquent

déterminé les constantes d’association pour tous les protons (Fig. 97).

Tableau 21. Déplacements chimiques maximums observés pour les différents protons.

∆H en ppm

DAC-T-Su-T-MC (10) S1

DAC MC DAC MC

Ha 0,353 0,299 0,330 0,271

Hb 0,242 0,243 0,231 0,226

Hc 0,135 0,238 0,128 0,250

Hd 0,165 0,263 0,159 0,260

He 0,168 … 0,171 …

[ −β−CD] µΜ

10 5 0 5 10 15

[ ββ−C

D]

δ]/

∆δ

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4HaD

HbD

HcD

HdD

HeD

HaM

HbM

HcM

HdM

Figure 97. Représentation de Scott pour le composé 10

Pour le composé 10, nous obtenons des droites quel que soit le proton étudié. Cette

observation nous permet de déduire que nous avons une complexation de type 1 :1, c'est-à-

dire une coumarine pour une βCD. Dans le cas contraire, nous n’aurions pas de droite.

Globalement, nous avons donc deux cyclodextrines pour une molécule. Les droites ont

pratiquement toutes le même point d’intersection avec l’axe des abscisses. Donc, le Ka est


sur 240

très proche pour les deux coumarines. Les valeurs de Ka sont présentées au niveau du

Tableau 22.

Tableau 22. Valeurs de Ka pour le composé 10.

DAC MC

Ha Hb Hc Hd He Ha Hb Hc Hd Ka en M -1 288 337 309 342 289 349 273 128 288

Pour la DAC nous obtenons une moyenne de 313 M-1 ± 27. Le Ka moyen pour la MC

est lui de 259 M-1 ± 96. Pour le composé 10, la valeur est donc de 289 M-1 ± 66. Le résultat

pour la DAC est quasiment 20 fois inférieur à la valeur calculée pour les composés simples ne

comportant que cette dernière coumarine (composé 7 et pDAC). Il semblerait que la présence

des deux coumarines sur la même molécule diminue fortement l’affinité de la DAC pour la

cyclodextrine. Il reste maintenant à savoir si cette observation est la même pour la forme

peptidique comportant les deux coumarines.

Les résultats pour le peptide S1, sont présentés Fig. 98.

[β−CD] µΜ

-4 -2 0 2 4 6 8 10 12

[−β−

CD

/]/∆δ

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4 HaD

HbD

HcD

HdD

HeD

HaM

HbM

HcM

HdM

Figure 98. Représentation de Scott pour le peptide S1.


sur 240

Pour tous les protons, nous obtenons une droite. Ceci démontre clairement que la

stœchiométrie de complexation est de type 1 :1. C'est-à-dire une cyclodextrine pour un

chromophore. Donc globalement, le peptide S1 interagit avec deux βCD. Nous n’avons pas

une stœchiométrie de type 4 :1 (βCD : S1) comme annoncé avec la technique précédente.

Les valeurs de Ka pour les protons des coumarines sont assez proches (Tableau 23).

Pour la DAC, le Ka moyen est de 482 M-1 ± 65. Il est de 367 M-1 ± 119 pour la MC.

Globalement, nous avons un Ka de 431 M-1 ± 105. Cette valeur est certes plus élevée que pour

le composé 10, mais dans les deux cas, la coumarine DAC a perdu son affinité pour la βCD.

Tableau 23. Valeurs de Ka pour le peptide S1.

DAC MC Ha Hb Hc Hd He Ha Hb Hc Hd

Ka en M -1 428 497 526 555 403 467 389 194 416

L’établissement de la constante d’association et la détermination de la courbe de JOB

par RMN présentent un inconvénient. La quantité de produit nécessaire est très importante.

L’utilisation de la fluorescence pour déterminer ces valeurs pourrait nous permettre de réduire

considérablement la quantité de produits. Nous avons par conséquent employé cette méthode

pour confirmer les résultats obtenus par RMN.

3.2.2.3. Détermination de la stœchiométrie de complexation par fluorescence.

Pour réaliser les courbes de JOB, nous avons suivi la procédure employée pour RMN.

Deux solutions équimolaires de βCD et du composé 7 (concentration 5 µM) ont été réalisées

dans du D2O. Les différents essais ont été préparés en mélangeant la βCD et le composé 7 en

différentes proportions avec un volume total constant de 500 µl. La concentration totale en

produit (molécule hôte et molécule invitée) sera donc de 5 µM pour chaque essai. Les spectres

de fluorescence de ces différents essais ont été enregistrés (Fig.99 A).


sur 240

λ en nm

440 460 480 500 520 540 560 580 600

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

50

100

150

200

250

0/50,5/4,51/41,5/3,52/32,5/2,53/23,5/1,54/14,5/0,55/0

(7) /βCD(A)

r

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

∆F* (

C0)

0

50

100

150

200

250

EauββCD

(B)

Figure 99. La variation de la fluorescence pour les différents essais est présentée en (A). En (B) la courbe de JOB obtenue en présence et en absence de βCD. Les solutions initiales de cyclodextrine et de composé (7) étaient à une concentration de 5 μM. Solvant : eau

La variation de la fluorescence de la DAC est linéaire. La courbe de JOB relative à

cette étude est bien centrée sur 0,5. Donc le complexe formé serait de type 1 :1. Cependant

cette variation linéaire de la fluorescence soulève la question de l’influence de la

cyclodextrine sur la variation de la fluorescence. Autrement dit, quelle allure aurait la courbe

de JOB, si l’expérience était réalisée en absence de cyclodextrine. Sur la Fig. 99 B, nous

avons superposé la courbe obtenue en absence de βCD. Le résultat ne montre pas de

différence entre les deux courbes de JOB.

La stœchiométrie de complexation ne peut donc pas être déterminée par fluorescence.

La variation de la concentration en DAC masque l’influence de βCD, dans ces conditions

d’équimolarité. La détermination du Ka reste cependant envisageable, dans la mesure où la

concentration en cyclodextrine sera largement supérieure à celle de la molécule invitée.

3.2.2.4. Détermination par fluorescence des constantes d’association sur les

modèles comprenant une seule coumarine.

En fluorimétrie, la détermination du Ka est fondée sur la mesure de l’intensité de

fluorescence de la molécule invitée puisque les cyclodextrines ne sont pas fluorescentes. Le

traitement double réciproque de l’équation Benesi-Hildebrand est appliqué à la fluorescence

pour déterminer le Ka (le paramètre P est l’intensité de fluorescence):

[ ] ctaobs FCDKFF c ∆+

∆=

∆1

**

11


sur 240

Ici ∆Fobs sera égale à la différence de fluorescence observée en présence de

cyclodextrine (F) et en absence (F0) soit F-F0. C’est la représentation la plus employée dans la

littérature pour la détermination du Ka par la fluorescence.

Nous avons dans un premier temps évalué l’influence de la βCD sur le spectre

d’absorption des deux composés (Fig. 100). Lorsque la concentration en cyclodextrine

augmente, l’absorbance de la DAC diminue légèrement et son maximum se déplace vers les

faibles longueurs d’onde. Cet effet est surnommé blueshift, car il s’agit d’un décalage spectral

vers le « bleu ». La variation du spectre d’absorption de la MC est aléatoire en fonction de la

concentration en cyclodextrine. Aucun décalage n’a été observé. Il semble que la MC ne soit

pas influencée par la présence de βCD, contrairement à la DAC.

λ en nm

360 380 400 420 440 460 480 500

Abs

orba

nce

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0mM0,2mM0,4mM0,8mM1mM2mM3mM4mM5mM

(7)

λ en nm

260 280 300 320 340 360 380 400

Abs

orba

nce

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0mM5mM8mM10mM12mM14mM16mM18mM20mM

(8)

Figure 100. Spectre UV des composés 7 et 8 à 10 µM avec différentes concentrations de βCD.

La fluorescence des deux composés (Fig. 101) est influencée différemment par la

présence de cyclodextrine. La fluorescence de la DAC augmente alors que celle de la MC

diminue. Le maximum de fluorescence de la DAC subit lui aussi un décalage vers les faibles

longueurs d’onde. En représentant l’inverse de la différence de fluorescence en fonction de

l’inverse de la concentration, la valeur des constantes d’association a pu être déterminée

(Fig. 102).


sur 240

λλ en nm

440 460 480 500 520 540 560 580 600

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600


(7)

λλ en nm

380 400 420 440 460 480 500

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

0mM5mM8mM10mM12mM14mM16mM18mM20mM

(8)

Figure 101. Spectre de fluorescence des composés 7 (Excitation à 430 nm) et 8 (Excitation à 350 nm) à 10 µM, avec différentes concentrations de βCD.

Dans les deux cas, nous obtenons une droite. Ceci confirme que nous nous trouvons

bien en présence d’un complexe de type 1 :1. La valeur de Ka est de 5523 M-1 pour le

composé 7 et elle est de 150 M-1 pour le composé 8. Un facteur 37 de différence est donc

observé. Ces premiers résultats confirment bien les données de RMN. La DAC est plus

complexée que la MC.

1/[ββ-CD] en mM 1

0 1 2 3 4 5 6

1/(F

-F0)

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35(7)

1/[β-CD] en mM 1

0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22

1/(F

-F0)

0,008

0,010

0,012

0,014

0,016

0,018

0,020

0,022

0,024

0,026

0,028

0,030 (8)

Figure 102. Représentation en double inverse.

Dans l’étude des composés pDAC et pMC nous constatons que les spectres UV de

pDAC sont similaires à ceux du composé 7 (Fig. 103). Une diminution de la fluorescence et

un déplacement vers le bleu sont observés. L’absorption de pMC varie différemment de celle

du composé 8. Une diminution régulière de l’absorption est observée, par contre aucun

décalage de la fluorescence n’est visualisé (Fig. 104).


sur 240

λ en nm

360 380 400 420 440 460 480

Abs

orba

nce

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,140mM0,2mM0,4mM0,8mM1mM2mM3mM4mM5mM

(pDAC )

λ en nm

260 280 300 320 340 360 380 400

Abs

orba

nce

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10 0mM1mM2mM3mM4mM5mM6mM7mM8mM9mM10mM

(pMC)

Figure 103. Spectre UV de pDAC et de pMC à 10 µM, avec différentes concentrations de βCD.

L’intensité de la fluorescence de pDAC varie quasiment de manière aléatoire,

contrairement à ce qui a été noté pour le composé 7. Par contre, le maximum de fluorescence

subit un déplacement régulier vers les basses longueurs d’onde. Trois essais ont été réalisés

pour cette étude de complexation de pDAC. Et dans les trois cas, nous avons observé la même

évolution. Par conséquent, aucune valeur de Ka n’a pu être déterminée pour le pDAC, puisque

la représentation en double inverse n’est pas exploitable (Fig. 105). Les points ne forment pas

une droite. La première interprétation serait de dire que la complexation ne serait pas de type

1 :1, ce qui serait en contradiction avec les donnés obtenues par RMN, ceci reste néanmoins

possible. Cependant la variation de l’absorption en UV et le décalage de la fluorescence pour

le pDAC sont similaires à ce qui a été noté pour le composé 7. La complexation entre la DAC

et cyclodextrine a donc lieu. Actuellement, aucune explication n’a pu être apportée.

λ en nm

440 460 480 500 520 540 560 580 600

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600


(pDAC )

λλ en nm

350 400 450 500 550

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

0mM1mM2mM3mM4mM5mM6mM7mM8mM9mM10mM

(pMC)

Figure 104. Spectre de fluorescence de pDAC (Excitation à 430 nm) et de pMC (Excitation à 350 nm) à à 10 µM, avec différentes concentrations de βCD.


sur 240

Pour le peptide MC par contre, la fluorescence diminue régulièrement et aucun

décalage n’a été observé. Ceci est en accord avec ce qui nous avions noté pour le composé 8.

Ainsi, nous avons déterminé une valeur de Ka de 155 M-1, très proche de celle obtenue avec la

MC-TEG-NH2.

1/[β-CD]

0 1 2 3 4 5 6

1/(F

-F0)

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

(pDAC)

1/[β-CD]

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

1/(F

-F0)

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

(pMC)

Figure 105. Représentation en double inverse des études de complexation de pDAC et de pMC par la fluorescence.

Mis à part les résultats obtenus pour le pDAC, les valeurs enregistrées par fluorescence

pour les constantes d’associations des différents composés sont dans l’ensemble similaires à

celles obtenus par RMN. Il reste maintenant à déterminer si le comportement des composés

incluant les deux coumarines sera lui aussi identique.

3.2.2.5. Détermination par fluorescence des constantes d’association des

composés 10 et S1.

Le spectre UV du composé 10 et S1 est présenté Fig. 106. Dans les deux cas, le

maximum d’absorption de la DAC subit un décalage vers les faibles longueurs d’onde ainsi

qu’une augmentation de l’intensité du pic, alors que pour les composés simples (DAC)

l’intensité du spectre d’absorption diminuait en même temps que le décalage. Pour la MC, le

shift est moins évident mais présent et une légère diminution est constatée. Sur les composés

simples (MC), aucun décalage n’avait été constaté et nous avions là encore une diminution de

l’absorption maximale. Ces observations tendent à démontrer que la complexation de la MC

est sensiblement la même. Par contre pour la DAC, un autre phénomène semble avoir lieu.

Pour réaliser les spectres de fluorescence, nous avions le choix entre exciter les

chromophores à leur maxima d’absorption où bien se fixer une longueur d’onde d’excitation


sur 240

moyenne pour chaque fluorophore. Les deux cas de figure ont été exploités. L’excitation au

maximum ou encore à une longueur d’onde fixe conduit sensiblement aux mêmes résultats.

Nous avons par conséquent reporté les résultats obtenus en excitant au maximum d’absorption

de la DAC et de la MC Fig. 107.

λλ en nm

300 350 400 450 500

Abs

orba

nce

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0mM0,5mM0,8mM1mM2mM3mM4mM5mM8mM10mM12mM14mM16mM18mM20mM

(10)

λλ en nm

300 350 400 450 500

Abs

orba

nce

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12 0 mM2 mM5 mM8 mM10 mM14 mM16 mM18 mM20 mM

(S1)

Figure 106. Spectres UV du composé 10 et du peptide S1.

λ en nm

400 450 500 550 600

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

200

400

600

800


(10)

λλ en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600

7000 mM2 mM5 mM8 mM10 mM12 mM14 mM16 mM18 mM20 mM

(S1)

Figure 107. Spectres de fluorescence du composé 10 et du peptide S1 à 10 µM. L'excitation a été réalisée au maximum d'absorption de la MC.

En excitant au maximum d’absorption de la MC, le phénomène de FRET est quasi

inexistant pour le composé 10 en absence de cyclodextrine, contrairement au peptide S1.

L’augmentation de la concentration en cyclodextrine augmente le FRET dans les deux cas.

Par contre, la fluorescence de la MC varie peu au niveau du dérivé 10 et de manière

irrégulière, alors qu’elle a quasiment triplé pour S1. Le suivi de l’évolution de fluorescence de

MC pour le composé 10 n’a pas permis de calculer un Ka (Fig. 108). Par contre, le suivi du

maximum de fluorescence de la DAC a permis de calculer un Ka de 232 M-1. Pour le S1, la


sur 240

constante d’association est de 250 M-1 pour la MC et elle est de 233 M-1 pour la DAC. Ces

valeurs sont assez proches des résultats obtenus par RMN.

1/[β-CD]

0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

1/(F

-F0)

-0,02

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

Fluo MCFluo DAC

(10)

1/[ββ-CD]

0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

1/(F

-F0)

0,000

0,002

0,004

0,006

0,008

0,010

Fluo MCFluo DAC

(S1)

Figure 108. Représentation en double inverse des études de complexation de 10 et de S1 par la fluorescence. Pour S1 le Ka pour la MC est de 250 M-1, pour la DAC il est de 233 M-1. Le Ka de la DAC au niveau du composé 10 est lui de 232 M-1.

Nous avons par ailleurs déterminé le Ka en n’excitant que la DAC (Fig. 109). Dans les

deux cas, une augmentation de la fluorescence est observée avec un déplacement vers le bleu

comme pour le composé 7. Les Ka de la DAC, pour le dérivé 10 et le peptide S1, sont

respectivement de 250 M-1 et 261 M-1 (Fig. 110)

λλ en nm

440 460 480 500 520 540 560 580 600

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600


(10)

λλ en nm

440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600

700


(S1)

Figure 109. Spectre de fluorescence de S1 et 10 à 10 µM. Excitation au maximum d'absorption de la DAC.


sur 240

1/[β-CD]

0 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

1/(F

-F0)

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

(10)

1/[β-CD] en mM -1

0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6

1/(F

-F0)

0,000

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0,006

0,007

(S1)

Figure 110. Représentation en double inverse des études de complexation de 10 et de S1 par la fluorescence. Le Ka de la DAC est de 250 M-1 pour le dérivé 10 et de 261 M-1 pour le peptide S1.

Ces données sont comparables aux résultats obtenus en excitant la MC. Globalement,

nous avons une perte de l’affinité de la DAC pour la βCD, lorsque la MC est présente sur la

même molécule. Nous avons cherché à savoir si ce résultat était le même pour les deux autres

substrats linéaires S2, S9 et les substrats cycliques Sc1 et Sc2 et Sc9. La détermination des

constante Ka a été effectuée par fluorescence uniquement.

3.2.2.6. Détermination par fluorescence des constantes d’association des

peptides linéaires S2, S9 et des peptides cycliques Sc1, Sc2 et Sc9.

Les spectres UV obtenus pour ces différents peptides sont comparables, avec une

augmentation de l’absorption et un shift vers les faibles longueurs d’onde pour la DAC.

Tandis que pour la MC, une faible diminution de l’absorption est observée avec un shift

moins évident.

Nous avons reporté les spectres de fluorescence mesurés en excitant la MC et la DAC

à leur maximum d’absorption, pour les peptides linéaire S2 et S9 au niveau des Fig. 111 et

112. Comme pour le peptide S1, nous avons une augmentation de la fluorescence de la MC et

de la DAC lorsque la MC est excitée, et le maximum de fluorescence de la DAC se déplace

vers les faibles longueurs d’onde. Les Ka obtenus sont répertoriées au niveau du Tableau 24.


sur 240

λλ en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500 0 mM2 mM5 mM8 mM10 mM12 mM14 mM16 mM18 mM20 mM

(A)

λλ en nm

440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

200

400

600

800


(B)

Figure 111. Spectre de fluorescence du substrat S2. Excitation au maximum d'absorption de la MC (A) et de la DAC (B) à une concentration de 10 µM.

λ en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400


(A)

λ en nm

440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600


(B)

Figure 112. Spectre de fluorescence du substrat S9. Excitation au maximum d'absorption de la MC (A) et de la DAC (B) à une concentration de 10 µM.

Tableau 24. Valeurs de Ka pour les substrats S2 et S9, par excitation de la MC et de la DAC.

Excitation MC Excitation DAC

MC DAC DAC

Ka en M -1 S2 74 75 92 S9 172 131 179

Ces valeurs sont un peu plus faibles que celles obtenues pour S1. Elles sont même

inférieures à 100 M-1 pour S2. Nous avons rapporté les séquences des peptides linéaires au

niveau du Tableau 25. La présence de la tyrosine dans la séquence du peptide S2, peut

expliquer la diminution de l’affinité des coumarines pour les cyclodextrines. La conclusion

reste cependant la même pour S2 et S9, la présence des deux coumarines au sein de la même

molécule diminue l’affinité de la DAC pour la cyclodextrine.


sur 240

Tableau 25. Séquence primaire des différents peptides linéaires

Peptide Séquence

S1 H-K(DAC)-G-P-Q-G~L-L-G-A-K(MC)-A-OH S2 H-K(DAC)-P-P-G-A~Y-H-G-A-K(MC)-A-OH S9 H-K(DAC)-G-P-P-G~V-V-G-P K(MC)-A-OH

En ce qui concerne les peptides cycliques (Fig. 113, 114 et 115), nous avons dans

l’ensemble un meilleur FRET que pour les peptides linéaires. L’évolution de la fluorescence

de MC est moins importante contrairement à l’évolution de la DAC.

λ en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500

600


(A)

λ en nm

440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

200

400

600

800


(B)

Figure 113. Spectre de fluorescence du substrat Sc1. Excitation au maximum d'absorption de la MC (A) et de la DAC (B) à une concentration de 10 µM.

λ en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400


(A)

λ en nm

440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

200

400

600

800


(B)

Figure 114. Spectre de fluorescence du substrat Sc2. Excitation au maximum d'absorption de la MC (A) et de la DAC (B) à une concentration de 10 µM.


sur 240

λ en nm

380 400 420 440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

50

100

150

200

250

300


(A)

λ en nm

440 460 480 500 520 540

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

100

200

300

400

500


(B)

Figure 115. Spectre de fluorescence du substrat Sc9. Excitation au maximum d'absorption de MC (A) et de DAC (B) à une concentration de 10 µM.

La présence de cyclodextrine semble augmenter le phénomène de FRET entre les deux

chromophores. Le calcul des Ka (Tableau 26) a abouti à des valeurs proches de celles

reportées précédemment pour les peptides linéaires.

Tableau 26. Valeurs de Ka pour les substrats Sc1, Sc2 et Sc9, par excitation de la MC et de la DAC.

Excitation MC Excitation DAC

MC DAC DAC

Ka en M -1 Sc1 169 99 143 Sc2 64 76 77 Sc9 177 199 201

Les Ka sont toujours plus faibles pour le peptide avec la séquence de la MMP-2, Sc2.

La présence de la tyrosine et de l’histidine doivent sûrement influencer l’affinité des

coumarines pour les cyclodextrines (Fig. 116).


sur 240

N

N CH O

NC

HO

ON

HO

NH

H

NH

C O

N

C

H

O

O

O

N

O

N

NC HO

NC

HO

O N

OH

NH

H

NH

CO

N

C

H

O

N

C

H

O

HN

O

N

C

H

O

O

O

N

NH

O

NH

O

O

O

HO

NNH

O

OO

O

O

N

N

NH

Figure 116. Structure du substrat cyclique de la MMP-2, Sc2.

Il semble que la courte chaine aliphatique de la lysine ne soit pas suffisante pour

éloigner suffisamment les coumarines de la structure cyclique. Ce qui expliquerait en tout cas,

que les Ka des peptides cycliques soient légèrement inférieurs à ceux obtenus pour les

peptides linéaires. L’utilisation d’une chaine aliphatique plus longue augmenterait surement

l’affinité des coumarines pour les cyclodextrines. L’intégration d’une chaine tétraéthylène

glycol peut aussi être envisagée.

Nous avons effectué cette étude préliminaire afin d’évaluer la possibilité de lier

nos substrats coumariniques, de manière non covalente avec des cyclodextrines.

L’étude de la complexation entre les coumarines DAC et MC avec la

cyclodextrine a été réalisée par RMN et par fluorescence. La détermination de la

stœchiométrie de complexation des différents composés simples (n’intégrant qu’une

seule coumarine) par RMN a permis de conclure que la DAC et la MC formaient un

complexe d’inclusion de type 1 :1 avec la βCD. L’utilisation de la courbe de JOB pour

déterminer la stœchiométrie de complexation du substrat S1, nous a conduit à une

complexation de type 4 :1. Malheureusement, nous n’avons pas pu déterminer de valeur


sur 240

pour le modèle non peptidique incluant les deux coumarines par manque de solubilité

du produit.

L’approche de Benesi et Hildebrand a permis de déterminer que le Ka de la DAC

sur les modèles simples était en moyenne 20 fois supérieur à celui de la MC. Cette

approche a aussi permis indirectement de confirmer les stœchiométries pour ces

modèles. En ce qui concerne le peptide S1 et le modèle non peptidique, les valeurs de Ka

sont assez proches. Quand les deux coumarines sont présentes au sein de la même

molécule, le Ka de la DAC est divisé par 10 alors que celui de la MC reste constant. Par

cette approche, nous avons également démontré par RMN et par fluorescence que la

complexation entre le peptide S1 et la βCD ou encore entre le modèle non peptidique et

la βCD était de type 2 :1, c'est-à-dire deux cyclodextrines pour une molécule de substrat.

La détermination du Ka pour les différents substrats a révélé que la séquence du

peptide influençait la complexation. Ainsi, les coumarines sont moins complexées au

niveau du peptide S2 et Sc2 en comparaison avec les quatre autres peptides. Ceci est

sans doute lié à la présence de la tyrosine ou bien de la proximité des chromophores. La

chaîne aliphatique de la lysine ne semble pas suffisante pour éloigner suffisamment les

coumarines de la chaîne polypeptidique.

Ces premiers résultats nous montrent que la présence des deux coumarines au

sein de la même molécule diminue l’affinité de la DAC pour la cyclodextrine. Donc, la

formation d’un système macromoléculaire ne serait pas stable si les peptides intègrent

les deux coumarines. L’utilisation d’un peptide ne possédant que la coumarine DAC

peut être envisagée. Dans ce cas, la détection de l’activité via le suivi du phénomène de

FRET serait perdue, au profit d’un site supplémentaire de fonctionnalisation. Il sera

notamment important d’éloigner le plus possible la partie coumarinique du squelette

peptidique en utilisant par exemple un bras éthylène glycol. Ces modifications doivent

cependant être en accord avec une conservation de l’affinité des peptides pour les

MMPs.

CONCLUSION GÉNÉRALE ET PERSPECTIVES

sur 240



sur 240

Les travaux que nous avons réalisés au cours de cette thèse s’incluent dans la

démarche générale de l’équipe qui concerne la conception de systèmes ciblés permettant la

thérapie ou l’imagerie des tumeurs cancéreuses.

Nous avons dans un premier temps synthétisé des nanosystèmes permettant de tendre à

des substrats sélectifs de métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMP) qui sont des

enzymes clés de la croissance tumorale et de l’émission de métastases. Trois métalloprotéases

de la matrice extracellulaire, les MMP-1, MMP-2 et MMP-9 ont été sélectionnées car elles

sont représentatives du panorama biologique et pathologique.

Dans le but de pouvoir visualiser le comportement de ces substrats, nous les avons

fonctionnalisés avec des chromophores synthétisés au laboratoire qui forment un couple

accepteur et donneur de fluorescence, ils constituent un système de FRET.

Nous avons ensuite fait porter nos efforts sur la synthèse d’entités cyclopeptidiques

dont l’originalité réside dans la présence conjointe du couple de chromophores et de deux fois

une séquence clivable correspondant à l’enzyme ciblé.

Les tests de protéolyse effectués sur l’ensemble des dérivés synthétisés par les

différentes MMP ont permis de montrer que ces familles de dérivés présentent des sélectivités

qui peuvent être extrêmement élevés vis-à-vis des enzymes cibles.

Il est à noter qu’il n’existe aucune concordance entre les séquences décrites dans la

littérature et celles qui se montrent les plus spécifiques dans notre approche. Si ce phénomène

est lié à la présence des fluorophores coumariniques, ce comportement constitue sans aucun

doute une voie d’optimisation. Des tests de stabilité plasmatique nous ont permis de constater

que les dérivés cyclopeptidiques ne sont sensibles qu’aux MMPs qui leur sont spécifiques.

Nos résultats constituent donc d’ores et déjà une validation de la preuve de concept de

notre hypothèse de départ.

La finalité des recherches dans lesquelles s’insèrent nos travaux est la conception de

nanosystèmes ciblés de libération contrôlée d’agents de chimiothérapie ou d’imagerie.

La stratégie s’appuie sur l’élaboration d’assemblages supramoléculaire. Notre but

étant d’utiliser la complexation entre des entités aromatiques et des cyclodextrines, nous

avons dans un deuxième temps voulu déterminer quel type d’interaction existait entre les


sur 240

coumarines utilisées comme fluorophores et la β-cyclodextrine. Nous avons mis en œuvre des

approches utilisant la Résonance Magnétique Nucléaire et la fluorescence.

Nous avons pu ainsi démontrer que, lorsque les substrats ne comprennent qu’une seule

coumarine, la stœchiométrie d’insertion était mono moléculaire et que l’entité diéthylaminée

(DAC) était environ vingt fois plus affine que celle qui comporte un groupe méthoxy (MC).

La situation est beaucoup plus complexe dans le cas de substrats qui incorporent les

deux fluorophores.

Quoi qu’il en soit, cette complexation, au moins avec un seul résidu aromatique, ouvre

de larges perspectives dans la conception de nanosystèmes d’où les molécules seront libérées

au site des tumeurs sous l’effet des MMPs libérées lors de la néoangiogenèse tumorale.

Références

sur 240

Références.

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sur 240

PARTIE EXPERIMENTALE

sur 240



sur 240

Tous les solvants, réactifs et enzymes (MMP-1 MMP-2 et MMP-9) sont issus de

SIGMA ALDRICH. Les acides aminés et les résines Wang et 2-chlorotrityle proviennent

d’ADVANCED CHEMTECH.

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Bruker Advance

fonctionnant à 300,13 MHz pour le proton (1H) et 75,47 MHz pour le carbone (13C). Les

déplacements chimiques sont exprimés en ppm (partie par million) et les constantes de

couplages en Hertz (Hz). Le tétraméthylsilane (TMS) est pris comme référence. Nous

employons pour décrire les spectres les abréviations suivantes : s = singulet ; d = doublet ;

t = triplet ; q = quadruplet ; m = multiplet et br s = signal large.

Les spectres IR (Infrarouge) ont été réalisés sur un spectromètre Spectro-one (Perkin-

Elmer). Les spectres d’absorption UV/Visible ont été effectués sur un spectrophotomètre

Hitachi U-2010 (Hitachi instrument, USA) à 25°C.

Les spectres de Fluorescence ont été enregistrés sur un spectrofluorimètre LS55

(Perkin-Elmer) équipé d’une lampe Xénon flash (Xe). Le traitement des données a été réalisé

avec le programme SigmaPlot 11.

Les RP-HPLC (Reversed Phase High Pressure Liquid Chromatography) ont été

effectuées sur deux appareils. Pour la purification des produits à une longueur d’onde donnée,

nous avons utilisé un model Shimadzu, équipé d’un système de contrôle de type SCL-10

AVP, d’une pompe de type LC8A HPLC, d’un détecteur UV-Visible de type SPD-10 AVP et

d’une colonne C18 SATISFACTION RP18AB 5µm, 250 x 20 mm pour la préparative et 250

x 10 mm pour la semi-préparative. Des chromatogrammes analytiques ont également été

réalisés sur cet appareil lorsque la quantité de produit à analyser était trop faible. La pureté

des produits est déterminée sur un système Hitachi (VWR) LaChrom Elite équipé d’un

organiseur, d’un Diode Array Detector L-2450, d’un Autosampler L-2200, d’une pompe L-

2130 et d’une colonne analytique de type C18 SATISFACTION RP18AB 5µm, 250 x 4,6

mm. Les solvants suivants ont été utilisés comme éluant : mélange A (eau 100%, 0,1% de

TFA), mélange B (acétonitrile 70%, eau 30%, 0,1% de TFA) et mélange C (isopropanol 25

%, eau 75 %, 0,1 % de TFA). La vitesse d’élution est de 1 ml/min pour l’HPLC analytique, 4

ml/min pour l’HPLC semi-préparative et 15 ml/min pour la préparative.


sur 240

Spectrométrie de Masse (SM)

MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight) : les

spectres de masse en mode MALDI-TOF ont été enregistrés en mode positif à l’aide d’un

spectromètre Bruker Biflex III ou un sur Voyager (Applied Biosystems) au CESAMO

(Bordeaux) équipées d’un laser à azote pulsé (λ=337 nm, 3ns).

ESI (Electrospray Ionisation) : les spectres de masse en mode ESI ont été enregistrés

en mode positif à l’aide d’un spectromètre Qstar Elite (Applied Biosystems) au CESAMO. La

source ESI est constituée d’une aiguille maintenue à 5000 V, à température ambiante. Les

échantillons ont été introduits dans une boucle d’injection de 10 µl, avec un débit de 200

µl/min de méthanol à l’aide d’une pompe de chromatographie liquide.

Les Synthèses Peptidiques en Phase Solide (SPPS) ont été effectuées sur des

synthétiseurs peptidiques automatiques de type Applied Biosystems 431A et 433A, selon une

stratégie Fmoc sans capping et en simple couplage. Sur le model 431A, les agents de couplage

sont le HOBt et le DCC à 1M dans le DMF. Concernant l’appareil 433A, les produits

commerciaux, DIEA (2 M) dans la NMP d’une part et le couple HOBt/HBTU (0,5 M) dans la

NMP d’autre part, ont été utilisés.

Les activités enzymatiques ont été réalisées sur un spectromètre de fluorescence LS55

équipé d’un système contenant quatre positions de cuves, thermostatées à 37°C et sous

agitation magnétique. Ce système présente l’avantage de mesurer quatre activités

enzymatiques simultanément.


sur 240

A) Synthèses chimiques

MM = 261,10 g/molC14H15NO4

ON O

O

OH

MM = 261,10 g/molC14H15NO4

ON O

O

OH

2,89 g d'acide de Meldrum (20 mmol) et 58 mg d'acétate de piperidinium (0,4 mmol)

ont été ajoutés à 3,86 g de 4-diéthylamino-salycylaldéhyde (20 mmol) en solution dans 10 ml

d'éthanol. Le milieu réactionnel est agité pendant 20 min à température ambiante (TA), puis

amené au reflux de l'éthanol pendant 2h. La solution est ensuite ramenée à TA, puis plongée

une heure à 0°C afin de provoquer la précipitation du produit. Ce dernier est ensuite filtré sur

fritté puis lavé à l'éthanol et séché sous vide. 3,44 g de produit sous forme d’une poudre

cristalline orangée (rendement : 65%) sont ainsi obtenu.

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 12,32 (1H, s, COOH); 8,64 (1H, s, CHAr); 7,44 (1H, d, J = 8,9 Hz,

CHAr); 6,69 (1H, dd, J = 2,0 et 8,9 Hz, CHAr); 6,52 (1H, s, CHAr); 3,48 (4H, q, J=7,3 Hz, 2

CH3CH2) ; 1,25 (6H, t, J=7,0 Hz, 2 CH3CH2).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 165,6 (COOH) ; 164,5 (OCO); 158,0 (CArOCO); 153,8 (NCAr);

150,2 (CHAr); 132,0 (CHAr); 111,0 (CAr); 108,5 (CArCO); 105,2 (CHAr); 96,7 (CHAr); 45,4

(2C, (CH3CH2)2); 12,4 (2C, (CH3CH2)2)

IR (cm-1) : 1083 (C-O-C); 1738 (C=O); 2802-3165 (C-H, O-H).

Spectrométrie de Masse : m/e [M+H]+ = 262,099

Acide 7-diéthylamino-coumarin-3-carboxylique (DAC) (1)


sur 240

MM = 220,04 g/molC11H8O5

OO

O

OH

O MM = 220,04 g/molC11H8O5

OO

O

OH

O

a) Synthèse du 7-méthoxy-coumarin-3-méthanoate d’éthyle

4,16g de malonate de diéthyle (26 mmol) en présence de 0,5 ml de pipéridine et de 0,5

ml d’acide acétique sont ajoutés à 3,04 g de 2-hydroxy-4-méthoxybenzaldéhyde (20 mmol) en

solution dans 150 ml d’éthanol absolu. Le milieu réactionnel est ensuite amené au reflux de

l’éthanol (79°C) pendant 24h puis plongé à 0°C dans un bain de glace afin d’amorcer la

précipitation du dérivé attendu. Le produit solide, de couleur blanche, est isolé par filtration

sur fritté puis séché sous vide.

b) Réaction de saponification

L’ester éthylique est mis en solution dans 50 ml de NaOH à 20% (20 g dans 100 ml

d’eau distillée). Le milieu réactionnel est ensuite amené au reflux (100°C) pendant deux

heures avant d’être ramener à température ambiante puis à 0°C à l’aide d’un bain de glace.

Sous agitation magnétique, la solution est ensuite acidifiée au moyen d’une solution HCl à

37%. Le précipité formé est alors filtré sur fritté puis rincé à l’éther. 3,26 g de produit pur,

sous forme de poudre beige, sont ainsi obtenus (Rendement global : 75%).

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 12,24 (1H, s, COOH); 8,88 (1H, s, CHAr); 7,67 (1H, d, J = 8,7 Hz,

CHAr); 7,04 (1H, dd, J = 8,6 Hz, CHAr); 6,95 (1H, s, CHAr); 3,97 (3H, s, CH3).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 166,3 (COOH) ; 166,2 (OCO); 159,1 (CArOCO); 158,6 (OCAr);

150,3 (CHAr); 133,2 (CHAr); 116,5 (CAr); 115,0 (CHAr); 113,5 (CArCO); 102,1 (CHAr); 58,0

( CH3).

IR (cm-1) : 1131 (C-O-C); 1732 (C=O); 2893-3129 (C-H, O-H).


Acide 7-méthoxy-coumarin-3-carboxylique (MC) (2)


sur 240

C35H37N3O7 MM= 611,26 g/mol

O

O

NH

NHO

O

O

OHON

C35H37N3O7 MM= 611,26 g/mol

O

O

NH

NHO

O

O

OHON

1,50 g de N-hydroxybenzotriazole (11 mmol) et 2,27 g de N, N’-dicyclohexyl-

carbodiimide (11 mmol) sont ajoutés à 6,11 g d’acide 7-diéthylamino-coumarin-3-

carboxylique (10 mmol) en solution dans 20 ml de DMF. L’ensemble est laissé sous agitation

magnétique pendant 12h à TA avant l’ajout de 4,05 g de monomère Fmoc-Lys-OH

(11 mmol). Après 12h de réaction, la N, N’-dicyclohexylurée (DCU) est éliminée par filtration

puis 40 ml de dichlorométhane sont ajoutés au milieu réactionnel. Ce dernier est alors

successivement lavé avec une solution de HCl 2N (3x20 ml) puis avec de l’eau milliQ+ (3x20

ml). Après extraction, la phase organique est séchée sur MgSO4 puis le solvant est évaporé

sous pression réduite. 4,34 g de produit sont obtenu sous forme d’une mousse de couleur

jaune. (Rendement global : 71%).

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 9,06 (1H, s, NHCH2); 8,72 (1H, s, CHAr); 7,76-7,31 (9H, m,

8CHAr(fmoc), CHAr(DAC)); 7,04 (1H, d, J = 8,6 Hz, CHAr); 6,95 (1H, s, CHAr); 4,83-4,54 (1H, br

s, NHCH), 4,51-4,08 (4H, m, CHα, CHCH2O, CHCH2O), 3,65-3,25 (6H, m, 2CH3CH2,

NHCH2CH2) ; 2,12-1,35 (6H, m, CH2(CH2)3CH), 1,22 (6H, t, J= 5,8 Hz, 2 CH3CH2).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 176,2 (COOH), 165,4 (OCO), 164,2 (CCONH), 158,9

(NHCOO), 157,7 (CArOCO), 154,0 (NCar), 149,9 (CHar), 145,4 (Car), 145,2 (2CarCHfmoc),

142,6 (2Car fmoc), 132,7 (CHar), 129,0 (CHar fmoc), 128,5 (2CHar fmoc), 126,7 (2CHar fmoc), 121,2

(2CHar fmoc), 111,4 (CHar), 110,8 (Car), 109,7 (Car), 97,8 (CHar), 68,4 (CHCH2O), 55,2 (CHα),

48,5 (CHfmoc), 46,4 (2CH3CH2), 40,4 (CH2), 32,9 (CH2), 30,5 (CH2), 23,7 (CH2), 13,8 (2CH3).

N-α-fluorenylméthoxycarbonyl-N-ε-[7-diéthylamino-coumarin-3-carboxylamide]-(L)-Lysine Fmoc-Lys(DAC)-OH (3)


sur 240

IR (cm-1) : 1131 (C-O-C); 1618 (C=O amide); 1698 (C=O); 2850-3000 (C-H); 3200-2400

(N-H, O-H).


C32H30N2O8

MM= 570,20 g/mol

O O

O

NH

NHO

O

O

OHO

C32H30N2O8

MM= 570,20 g/mol

O O

O

NH

NHO

O

O

OHO

1,50 g de N-hydroxybenzotriazole (11 mmol) et 2,27 g de N, N’-dicyclohexyl-

carbodiimide (11 mmol) sont ajoutés à 5,7 g d’acide 7-méthoxy-coumarin-3-carboxylique (10

mmol) en solution dans 20 ml de DMF. L’ensemble est laissé sous agitation magnétique

pendant 5 h avant l’ajout de 4,05 g de monomère Fmoc-Lys-OH (11 mmol). Après 5 h de

réaction, la N, N’-dicyclohexylurée (DCU) est éliminée par filtration puis 40 ml de

dichlorométhane sont ajoutés au milieu réactionnel qui est alors successivement lavé avec une

solution de HCl 2N (3x20 ml) puis avec de l’eau milliQ+ (3x20 ml). Après extraction, la

phase organique est séchée sur MgSO4 puis le solvant est évaporé sous pression réduite. 4,73

g de produit final sont obtenus sous forme de poudre blanche (rendement : 83 %).

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 8,95 (1H, s, NHCH2); 8,83 (1H, s, CHAr); 7,79-7,31 (9H, m,

8CHAr(fmoc), CHAr(MC)); 6,83 (1H, d, J = 8,7 Hz, CHAr); 6,79 (1H, s, CHAr); 5,9-5,49 (1H, br s,

NHCH), 4,53-4,07 (4H, m, CHα, CHCH2O, CHCH2O), 3,87 (3H, CH3), 3,60-3,30 (2H, m,

NHCH2CH2) ; 2,12-1,08 (6H, m, CH2(CH2)3CH).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 176,4 (COOH), 166,3 (OCO), 164,2 (CCONH), 163,2

(NHCOO), 157,9 (CArOCO), 157,7 (NCar), 150,1 (CHar), 145,3 (Car), 145,2 (2CarCHfmoc),

142,6 (2Car fmoc), 132,4 (CHar), 129,0 (CHar fmoc), 128,5 (2CHar fmoc), 126,6 (2CHar fmoc), 121,3

N-α-fluorenylméthoxycarbonyl-N-ε-[7-méthoxy-coumarin-3-carboxylamide]-(L)-Lysine Fmoc-Lys(MC)-OH (4)


sur 240

(2CHar fmoc), 115,5 (CHar), 115,4 (Car), 113,7 (Car), 101,6 (CHar), 68,4 (CHCH2O), 57,4 (CHα),

55,1 (CHfmoc), 48,5 (OCH3), 40,6 (CH2), 32,9 (CH2), 30,4 (CH2), 23,7 (CH2).

IR (cm-1) : 1144 (C-O-C);1617 (C=O amide); 1709 (C=O); 2835-3000 (C-H, O-H,) 3200-

3386 (N-H, O-H).

Spectrométrie de Masse : m/e [M+H]+ : 571,2027.

C13H26N4O5

MM= 318,19 g/mol

OO

ONH

O

O

N3

C13H26N4O5

MM= 318,19 g/mol

OO

ONH

O

O

N3

840 mg de N3(CH2CH2O)3CH2CH2NH2 (4 mmol) sont mis en solution avec 1,05 g de

Boc2O (4,8 mmol) dans 10 ml de DCM. L’ensemble est laissé sous agitation magnétique

pendant 5 h. Après évaporation du solvant, 5 ml d’eau sont ajoutés au mélange pour faire

précipiter le Boc2O qui n’a pas réagit. Une extraction a ensuite été réalisée avec du DCM

(2*10 ml). Après évaporation de la phase organique, 1,07 g d’une huile claire sont récupérées

(Rendement de 84 %).

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 5,04 (1H, br s, CH2NHCO), 3,74-3,27 (16H, m,

(NH(CH2CH2O)3CH2CH2) ; 1,46 (9H, s, OC(CH3)3).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 157,4 (NHCOO), 80,6 (OC(CH3)3), 72,7-71,3 (CH2O

(CH2CH2O)2CH2), 52,0 (N3CH2), 41,7 (CH2NH), 29,8 (OC(CH3)3).

IR (cm-1) : 1060-1190 ( C-O-C); 1714 (C=O); 2023-2200 (-N3); 2806-3025 (C-H); 3260-

3480 (N-H).

Spectrométrie de Masse : m/e [M+Na]+ = 341,1810

N3-TEG-NH-Boc


sur 240

C13H28N2O5

MM= 292,19 g/mol

OO

ONH

O

O

NH2

C13H28N2O5

MM= 292,19 g/mol

OO

ONH

O

O

NH2

1,07 g de N3-TEG-NH-Boc (3,4 mmol) est mis en solution avec 100 mg de

palladium/charbon dans 10 ml de méthanol. L’ensemble est laissé sous agitation magnétique

pendant 12h, sous H2. Sur un fritté de porosité 3, dans lequel nous avons préalablement tassé

de la célite, le mélange réactionnel est filtré, le montage est rincé avec 300 ml de méthanol.

Le filtrat est ensuite évaporé sous pression réduite, puis séché sous vide. 980 mg d’une huile

claire sont obtenues. (Rendement quantitatif).

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 5,30 (1H, br s, CH2NHCO), 3,72-3,20 (14H, m,

(NH(CH2CH2O)3CH2), 2,86 (2H, s, CH2NH2), 1,43 (9H, s, OC(CH3)3).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 157,4 (NHCOO), 80,5 (OC(CH3)3), 72,3-66,6 (CH2O

(CH2CH2O)2CH2), 43,1 (H2NCH2), 41,7 (CH2NH), 29,8 (OC(CH3)3).

IR (cm-1) : 1060-1220 ( C-O-C); 1711 (C=O); 2788-3022 (C-H); 3260-3420 (N-H).


C22H31N5O6

MM= 461,23 g/mol

N3O

OO

NH

ON O

O

C22H31N5O6

MM= 461,23 g/mol

N3O

OO

NH

ON O

O

167 mg de H2N-TEG-N3 (H2N-(CH2CH2O)3-CH2CH2-N3) (0,76 mmol), 117 mg de

N-hydroxybenzotriazole (0,76 mmol) et 146 mg d’EDC (0,76 mmol) sont ajoutés à 100 mg

d’acide 7-diéthylamino-coumarin-3-carboxylique (0,38 mmol) en solution dans 10 ml de

DCM. L’ensemble est laissé sous agitation magnétique pendant 12 h. Après évaporation du

H2N-TEG-NH-Boc

DAC-TEG-N 3 (5)


sur 240

solvant, 5 ml d’un mélange acétonitrile/eau (70/30, 0,1% de TFA) sont ajoutés au milieu

réactionnel qui est alors purifié par HPLC sur colonne C18. Après lyophilisation des fractions,

176 mg de produit sont isolés (rendement quantitatif).

Chromatogramme du dérivé (5): Le profil HPLC et le spectre d’absorption : (Temps de rétention) Tr= 19,3

min.

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 9,29 (1H, s, NHCH2); 8,75 (1H, s, CHAr), 7,49 (1H, d, J = 8,9 Hz,

CHAr); 6,74 (1H, d, J = 8,9 Hz, CHAr); 6,58 (1H, s, CHAr); 3,8-3,61 (14H, m,

(NH(CH2CH2O)3CH2) ; 3,49 (4H, q, J=7,2 Hz, 2 CH3CH2) ; 3,415 (2H, t, J=5 Hz, CH2N3) ;

1,27 (6H, t, J=7,2 Hz, 2 CH3CH2).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 165,6 (OCO), 162,9 (CCONH), 157,6 (CArOCO), 153,5 (NCar),

149,1 (CHar), 131,9 (CHar), 110,6 (CHar), 108,4 (Car), 108,1 (Car), 96,8 (CHar), 70,0-65,8

(CH2O (CH2CH2O)2CH2), 45,3 (2CH3CH2), 51,2 (CH2N3), 39,4 (NHCH2), 12,6 (2CH3).

IR (cm-1) : 1060-1162 ( C-O-C); 1640-1780 (C=O); 2038-2190 (-N3); 2835-3000 (C-H);

3272-3380 (N-H).


sur 240

C27H41N3O8

MM= 535,29 g/mol

OO

ONH

O

O

NH

ON O

O

C27H41N3O8

MM= 535,29 g/mol

OO

ONH

O

O

NH

ON O

O

292,2 mg de H2N-TEG-NH-Boc (1 mmol), 229,5 mg de N-hydroxybenzotriazole

(1,5 mmol) et 233 mg d’EDC (1,5 mmol) sont ajoutés à 261,3 mg d’acide 7-diéthylamino-

coumarin-3-carboxylique (1 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. L’ensemble est laissé

sous agitation magnétique pendant 12 h. 5 ml d’eau sont ajouté au mélange réactionnel afin

d’éliminer l’EDC et l’HOBt. La phase organique est récupérée. Après évaporation du solvant,

le produit est alors purifié par HPLC sur colonne C18. Après lyophilisation des fractions,

432 mg de produit sont isolés (rendement 80 %).

Chromatogramme du dérivé 7(A): Le profil HPLC et le spectre d’absorption : Tr= 19,3 min.

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 9,03 (1H, s, CONHCH2); 8,70 (1H, s, CHAr), 7,43 (1H, d, J = 8,9

Hz, CHAr); 6,65 (1H, d, J = 8,9 Hz, CHAr); 6,50 (1H, s, CHAr); 5,20-5,05 (1H, br s,

NHCOOC), 3,80-3,20 (20H, m, NH(CH2CH2O)3CH2CH2NH2, 2 CH3CH2) ; 1,43 (6H,

C(CH3)3), 1,24 (6H, t, J=7 Hz, 2 CH3CH2).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 163,4 (OCO), 162,7 (CCONH), 157,8 (CArOCO), 157,8

(NHCOOC), 152,6 (NCar), 148,2 (CHar), 131,3 (CHar), 110,4 (Car), 110,1 (CHar), 108,5 (Car),

96,7 (CHar), 79,3 (C(CH3)3), 71,3-69,4 (CH2O (CH2CH2O)2CH2), 45,3 (2CH3CH2), 40,3

(CH2NH), 39,6 (NHCH2),28,6 (C(CH3)3), 12,6 (2CH2CH3).

IR (cm-1) : 1053-1162 ( C-O-C); 1659-1780 (C=O); 2788-3022 (C-H); 3200-3380 (N-H).

DAC-TEG-NH-Boc (7a)


sur 240

Spectrométrie de Masse : m/e [M+Na]+ = 558,2784

C22H33N3O6

MM= 435,23 g/mol

OO

ONH2N

H

N O O

O

C22H33N3O6

MM= 435,23 g/mol

OO

ONH2N

H

N O O

O

Méthode 1 : 200 mg de triphénylphosphine (0,76 mmol) sont ajoutés à 176 mg de

dérivé DAC-TEG-N3 (0,38 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. L’ensemble est laissé

sous agitation magnétique pendant 12h, puis le milieu réactionnel est hydrolysé par l’ajout de

5 ml d’eau distillée pendant 1h sous agitation. Après évaporation de la phase organique, les

dérivés de triphénylphosphine (OPPh3 et PPh3) insolubles dans l’eau sont éliminés par

filtration. Après lyophilisation, le brut de réaction est purifié par HPLC. 120 mg de dérivé

attendu sont ainsi isolés (rendement : 72 %).

Méthode 2 : 432 mg de 7a (0,99 mmol) sont déprotégés avec un mélange contenant 3

ml de DCM et 1,5 ml de TFA pendant 4h à TA. 15 ml de DCM et 5 ml d’eau sont ensuite

ajouté au mélange réactionnel. Sous agitation lente, le TFA est neutralisé avec une solution de

NaHCO3 poudre. Après filtration sur un frité de porosité 3, des extractions sont réalisés. La

phase organique est enfin évaporée et le produit est purifié par HPLC. 395 mg du dérivé

attendu sont isolés (rendement : 91 %).

Chromatogramme du dérivé (7) : Le profil HPLC et le spectre d’absorption : Tr=16,7 min

DAC-TEG-NH 2 (7)


sur 240

RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 9,30 (1H, s, CONHCH2); 8,68 (1H, s, CHAr), 7,98-7,60 (2H, br s,

CH2NH2), 7,50 (1H, d, J = 8,8 Hz, CHAr); 6,71 (1H, d, J = 8,8 Hz, CHAr); 6,53 (1H, s, CHAr);

4,01-3,58 (14H, m, (NH(CH2CH2O)3CH2) ; 3,49 (4H, q, J=6,9 Hz, 2 CH3CH2) ; 3,415 (2H, s,

CH2NH2) ; 1,27 (6H, t, J=6,7 Hz, 2 CH3CH2).



(CH2O (CH2CH2O)2CH2), 45,3 (2CH3CH2), 40,3 (CH2NH2), 39,7 (NHCH2), 12,4 (2CH3).

IR (cm-1) : 1053-1162 ( C-O-C); 1659-1780 (C=O); 2835-3000 (C-H); 3272-3386 (N-H).

Spectrométrie de Masse Haute Résolution : m/e [M+2H]+ = 437,2439

C19H24N4O7

MM= 420,16 g/mol

N3O

OO

NH

O O O

O

C19H24N4O7

MM= 420,16 g/mol

N3O

OO

NH

O O O

O

198 mg de H2N-TEG-N3 (0,91 mmol), 139 mg de N-hydroxybenzotriazole (0,91

mmol) et 173 mg d’EDC (0,91 mmol) sont ajoutés à 100 mg d’acide 7-méthoxy-coumarin-3-

carboxylique (0,45 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. L’ensemble est laissé sous

agitation magnétique pendant 4 h. Après évaporation du solvant, 7 ml d’un mélange

acétonitrile/eau (70/30, 0,1% de TFA) sont ajoutés au milieu réactionnel, puis l’ensemble est

purifié par HPLC sur colonne C18. Après lyophilisation, 169 mg de solide blanc sont isolés

(rendement : 88 %).

MC-TEG-N 3 (6)


sur 240

Chromatogramme du composé (6) : Le profil HPLC et le spectre d’absorption : Tr = 17,5 min.


Hz, CHAr); 6,96 (1H, dd, J = 8,7 et 2,3 Hz, CHAr); 6,88 (1H, d, J = 2,4 Hz CHAr); 3,93 (3H,

OCH3) 3,76-3,65 (14H, m, (NHCH2CH2O(CH2CH2O)2CH2) ; 3,42 (2H, t, J = 5,2 Hz,

CH2N3).



(CH2O (CH2CH2O)2CH2), 57,5 (CH3O), 47,1 (CH2N3), 41,1 (NHCH2).

IR (cm-1) : 1053-1162 ( C-O-C); 1659-1780 (C=O); 2038-2190 (-N3); 2835-3000 (C-H);

3272-3380 (N-H). .

C24H34N2O9

MM= 494,23 g/mol

OO

ONH

O

O

NH

O O O

O

C24H34N2O9

MM= 494,23 g/mol

OO

ONH

O

O

NH

O O O

O

292,2 mg de H2N-TEG-NH-Boc (1 mmol), 229,5 mg de N-hydroxybenzotriazole (1,5

mmol) et 233 mg d’EDC (1,5 mmol) sont ajoutés à 220 mg d’acide 7-méthoxy-coumarin-3-

carboxylique (1 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. L’ensemble est laissé sous agitation

magnétique pendant 12 h. 5 ml d’eau sont ajouté au mélange réactionnel afin d’éliminer

l’EDC et l’HOBt. La phase organique est récupérée. Après évaporation du solvant, le produit

MC-TEG-NH-Boc (8a)


sur 240

est alors purifié par HPLC sur colonne C18. Après lyophilisation des fractions, 420 mg de

produit sont isolés (rendement 85 %).

Chromatogramme du composé (8a) : Le profil HPLC et le spectre d’absorption : Tr = 17,7 min.


Hz, CHAr); 6,95 (1H, d, J = 8,5 Hz, CHAr); 6,87 (1H, s, CHAr); 5,20-5,06 (1H,br s, CH2NH)

3,93 (3H, OCH3) 3,78-3,47 (14H, m, (NHCH2CH2O(CH2CH2O)2CH2) ; 3,32 (2H, s,

CH2NH), 1,44 (9H, s, C(CH3)3).


(CH3OCar), 157,2 (NHCOOC), 150,0 (CHar), 132,5 (CHar), 115,5 (CHar), 113,7 (Car), 113,3

(Car), 102,0 (CHar), 78,8 (C(CH3)3), 70,8-68,3 (CH2O (CH2CH2O)2CH2), 57,6 (CH3O), 40,7

(CH2NH), 39,2 (NHCH2), 28,4 (C(CH3)3).

IR (cm-1) : 1053-1162 (C-O-C); 1659-1780 (C=O); 2788-3022 (C-H); 3200-3380 (N-H).

Spectrométrie de Masse Haute Résolution : m/e [M+Na]+ = 517,2150

C19H26N2O7

MM= 394,17 g/mol

OO

ONH2N

H

OO O

O

C19H26N2O7

MM= 394,17 g/mol

OO

ONH2N

H

OO O

O

Méthode 1 : 210 mg de-triphénylphosphine (0,80 mmol) sont ajoutés à 169 mg de

dérivé MC-TEG-N3 (0,40 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. L’ensemble est laissé sous

MC-TEG-NH 2 (8)


sur 240

agitation magnétique pendant 12h, puis le milieu réactionnel est hydrolysé avec 5 ml d’eau

distillée pendant 1h sous agitation. Après évaporation de la phase organique, les dérivés de

triphénylphosphine (OPPh3 et PPh3) insolubles dans l’eau sont éliminés par filtration. Après

lyophilisation de la phase aqueuse et purification par HPLC, 30 mg du dérivé attendu sont

isolés (rendement : 19 %).

Méthode 2 : 420 mg de 8a (0,85 mmol) sont déprotégés avec un mélange contenant

3 ml de DCM et 1,5 ml de TFA pendant 4h à TA. 15 ml de DCM et 5 ml d’eau sont ensuite

ajouté au mélange réactionnel. Sous agitation lente, le TFA est neutralisé avec une solution de

NaHCO3 poudre. Après filtration sur un frité de porosité 3, des extractions sont réalisés. La

phase organique est enfin évaporée et le produit est purifié par HPLC. 248 mg du dérivé

attendu sont isolés (rendement : 63 %).

Chromatogramme du composé (8) : Le profil HPLC et le spectre d’absorption : Tr = 13,8 min.


Hz, CHAr); 6,97 (1H, d, J = 8,8 Hz, CHAr); 6,89 (1H, s, CHAr); 6,74-6,44 (2H, br s, CH2NH2),

3,93 (3H, OCH3) 3,91-3,55 (14H, m, (NH(CH2CH2O)3CH2) ; 3,31 (2H, s, CH2NH2).


(CH3OCar), 150,6 (CHar), 132,7 (CHar), 115,7 (CHar), 115,2 (Car), 113,7 (Car), 101,7 (CHar),

71,8-68,4 (CH2O (CH2CH2O)2CH2), 57,5 (CH3O), 41,6 (CH2NH2), 41,0 (NHCH2).

IR (cm-1) : 1053-1162 (C-O-C); 1659-1780 (C=O); 2835-3000 (C-H); 3272-3386 (N-H).

Spectrométrie de Masse Haute Résolution : m/e [M+H]+ = 395,1825


sur 240

C26H37N3O9

MM= 535,25 g/mol

O

O

OHNH

OO

ONH

ON O

O

C26H37N3O9

MM= 535,25 g/mol

O

O

OHNH

OO

ONH

ON O

O

120 mg de DAC-TEG-NH2 (0,3 mmol) sont ajoutés à 60 mg d’anhydride succinique

(0,6 mmol) en solution dans 10 ml de DCM. 0,5 ml de triéthylamine est rajoutée au bout d’1h

de réaction. L’ensemble est laissé sous agitation magnétique pendant 12 h. Après évaporation

du solvant, le produit est alors purifié par HPLC sur colonne C18. Après lyophilisation des

fractions, 130 mg de produit sont isolés (rendement 80 %).



Hz, CHAr); 6,68 (1H, d, J = 8,8 Hz, CHAr); 6,51 (1H, s, CHAr); 5,37-4,97 (1H, br s,

NHCOCH2), 3,80-3,37 (20H, m, NH(CH2CH2O)3CH2CH2NH2, 2 CH3CH2) ; 2,77-2,53 (4H,

m, COCH2CH2CO), 1,24 (6H, t, J=6,4 Hz, 2 CH3CH2).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 175,7 (CH2COOH), 175,2 (NHCOCH2), 165,4 (OCO), 164,2

(CCONH), 159,1 (CArOCO), 154,2 (NCar), 149,2 (CHar), 132,8 (CHar), 111,6 (Car), 110,6

(CHar), 109,7 (Car), 97,9 (CHar), 71,3-69,4 (CH2O (CH2CH2O)2CH2), 46,6 (2CH3CH2), 41,1

(CH2NH), 41,0 (NHCH2), 32,5 (COCH2CH2COOH), 32,2 (COCH2CH2COOH), 13,8

(2CH2CH3).

IR (cm-1) : 1053-1170 (C-O-C); 1680-1780 (C=O); 2800-3020 (C-H); 3200-3380 (N-H).

DAC-TEG-NH-Succ-COOH (9)


sur 240

Spectrométrie de Masse Haute Résolution : m/e [M+Na]+ = 558,2415.

C45H61N5O15

MM= 911,42 g/mol

O

O

NO

OO

N

O OO

O

NH

OO

ONH

N O O

O

C45H61N5O15

MM= 911,42 g/mol

O

O

NO

OO

N

O OO

O

NH

OO

ONH

N O O

O

130 mg de DAC-TEG-Succ-COOH (0,24 mmol), 153 mg de N-hydroxybenzotriazole

(1 mmol) et 233 mg d’EDC (1,5 mmol) sont ajoutés à 98,6 mg de MC-TEG-NH2 (0,25 mmol)

en solution dans 10 ml de DCM, avec 0,2 ml de triéthylamine. L’ensemble est laissé sous

agitation magnétique pendant 12 h. 5 ml d’eau sont ajouté au mélange réactionnel afin

d’éliminer l’EDC et l’HOBt. La phase organique est récupérée. Après évaporation du solvant,

le produit est alors purifié par HPLC sur colonne C18. Après lyophilisation des fractions, 420

mg de produit sont isolés (rendement 72 %).


RMN 1H (CDCl3) δ ppm: 9,30 (1H, s, CMCCONHCH2), 9,21 (1H, s, CDACCONHCH2); 8,86

(1H, s, CHAr MC) 8,71 (1H, s, CHAr DAC), 7,62 (1H, d, J = 8,6 Hz, CHAr MC), 7,46 (1H, d, J =

9,1 Hz, CHAr); 6,95 (1H, d, J = 8,6 Hz, CHAr MC); 6,88 (1H, s, CHAr MC), 6,67 (1H, d, J = 8,9

Hz, CHAr DAC); 6,49 (1H, s, CHAr DAC); 3,93 (1H, s, CH3O), 3,78-3,39 (36H, m, 2

DAC-TEG-NH-Succ-TEG-MC (10)


sur 240

(NH(CH2CH2O)3CH2CH2NH), 2 CH3CH2) ; 2,66 (4H, s, COCH2CH2CO), 1,25 (6H, t, J=7,2

Hz, 2 CH3CH2).

13C NMR (CDCl 3) δ ppm : 175,2 (CO(CH2)2CO), 166,5 (OCOMC), 165,7 (OCODAC), 164,3

(CMCCONH) 164,1 (CDACCONH), 163,5 (CAr MCOCO), 159,1 (CAr DACOCO), 158,1 (CH3OCAr

MC), 154,2 (NCar DAC), 150,3 (CHar MC), 150,0 (CHar DAC), 132,9 (CHar DAC), 132,6 (CHar MC),

115,6 (CHar MC), 115,4 (Car MC), 113,7 (Car MC), 111,7 (CHar DAC), 110,3 (Car DAC), 109,7 (Car

DAC), 101,7 (CHar MC), 97,9 (CHar DAC), 71,3-69,4 (2(CH2O (CH2CH2O)2CH2)), 57,5 (CH3O)

46,6 (2CH3CH2), 41,2 (4C, 2CH2NH, 2NHCH2), 32,7 (COCH2CH2CO), 13,8 (2CH2CH3).

IR (cm-1) : 1053-1170 (C-O-C);1636-1677 (C=O amide); 1680-1780 (C=O); 2788-3022 (C-

H); 3200-3380 (N-H).

Spectrométrie de Masse Haute Résolution : m/e [M+Na]+ = 934,4029


sur 240

B) Synthèse peptidique

a) Synthèse des substrats linéaires : S1 ; S2 ; S9 ; pDAC ; pMC

Pour les trois substrats linéaires S1, S2 et S9 ainsi que pour les deux dérivés de S1,

(pMC et pDAC) la synthèse sur support solide a été réalisée selon une stratégie Fmoc à partir

d’une résine Wang (p-benzyloxybenzyl alcohol resin) (100-200 mesh) préloadée avec le

monomère alanine (Fmoc-Ala-Wang, 0,72 mmol/g). Les synthèses ont été effectuées à

0,25 mmol (357 mg de résine), en simple couplage et sans capping. Les acides aminés Fmoc

protégés Gly, Leu, Pro, Gln(Trt), His(Trt), Tyr(tBu), Ala, Val, Lys(DAC) et Lys(MC) sont

préparés à 1 mmol, puis greffés via un automate de synthèse en utilisant comme agent de

couplage le couple HBTU/HOBt ou DCC/HOBt. En fin de synthèse le peptide est déprotégé à

l’extrémité N-terminale. Selon ce mode opératoire les quantités de résine obtenue varient

entre 800 mg et 1g.

Le peptide est ensuite clivé de la résine et entièrement déprotégé avec 15 ml d’un

mélange TFA/T.I.S/H2O (95/2,5/2,5) pendant 1h30 à température ambiante. Une fois filtrée,

la résine est rincée avec 10 ml de TFA puis le filtrat est évaporé jusqu’à un volume d’environ

2 ml. Le peptide est isolé par filtration après précipitation en présence d’éther à 0°C (30 ml).

Les séquences primaires, les spectres HPLC et les spectres de masse des cinq peptides

purifiés sont présentés ci-après :

Deux mélanges ont été utilisés pour l’analyse et la purification des produits :

Mélange A : Eau milliQ+ contenant 0,1 % de TFA

Mélange B : Acétonitrile/ Eau (70/30) contenant 0,1% de TFA


sur 240

C71H101N15O20

MM= 1483,73 g/mol

OH

O

NH

O

NH

O

O

O

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH2 O

NH

O

N

O

NH

O

NH

O

N

O

O

NH2

C71H101N15O20

MM= 1483,73 g/mol

OH

O

NH

O

NH

O

O

O

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH2 O

NH

O

N

O

NH

O

NH

O

N

O

O

NH2

100 mg de peptide S1 ont été isolés (rendement de 27 %).

Gradient d’élution

Time (min)

0 5 15 20 30

% B 50 50 60 100 100

Chromatogramme du substrat S1 de la MMP-1 : La fenêtre de droite représente le spectre d’absorption du peptide purifié. Dans les conditions d’élution utilisées, le temps de rétention observé est de 18,2 min.

512.0 902.8 1293.6 1684.4 2075.2 2466.0

Mass (m/z)

0

2384.7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 1484.6, 2385]

1484.70

1506.69

1522.67

1486.70

1508.70

1524.67

1528.69

1544.65

1546.671102.03 1439.47 1526.701109.98 1468.46 1562.651282.71917.84526.38

Spectre de masse du substrat S1 de la MMP-1 : Masse théorique : 1483,73 Da, MALDI-TOF m/e (M+H+) 1484,70 ; m/e (M+Na+) 1506,69 ; m/e (M+K+) 1522,67.

Substrat S1 de la MMP-1 : H2N-K(DAC)GPQG~LLGAK (MC)A -COOH


sur 240

C75H96N16O20

MM = 1540,69 g/mol

ONH

N N NH

NH

NH

O

H

NH

NNH

NH

NH

NH

NH O

O

O

O

NH

OH

OO

OOOOOOOOO

NH2

O

O

N

C75H96N16O20

MM = 1540,69 g/mol

ONH

N N NH

NH

NH

O

H

NH

NNH

NH

NH

NH

NH O

O

O

O

NH

OH

OO

OOOOOOOOO

NH2

O

O

N


Gradient d’élution

Time (min)

0 5 15 25 30 40

% B 40 40 50 70 100 100

Chromatogramme du substrat S2 de la MMP-2 : La fenêtre de droite représente le spectre d’absorption du peptide purifié. Dans les conditions d’élution utilisées le temps de rétention observé est de 15,4 min.

587 1138 1689 2240 2791 3342

Mass (m/z)

0

6093.9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 1541.5, 6094]

1541.5651

1563.5540

1579.5260

1544.5692

1513.5347

1566.57661206.26431485.5274

1170.4644

Spectre de masse du substrat S2 de la MMP-2: Masse théorique : 1540,69 Da, MALDI-TOF m/e (M+H+) 1541,5651; m/e (M+Na+) 1563,5540 ; m/e (M+K+) 1579,5260.

Substrat S2 de la MMP-2 : H2N-K(DAC)PPGA~YHGA K(MC)A -COOH


sur 240

C68H94N14O19

MM = 1410,68 g/mol

N

O

NH

NH

N NH

NH

NH

NH

NH

N NH

NH

O

O

O

O

NH

OH

OOOOOOOOOO

ONH2

O

O

C68H94N14O19

MM = 1410,68 g/mol

N

O

NH

NH

N NH

NH

NH

NH

NH

N NH

NH

O

O

O

O

NH

OH

OOOOOOOOOO

ONH2

O

O


Chromatogramme du substrat S9 de la MMP-9: La fenêtre de droite représente le spectre d’absorption du peptide purifié. Dans les conditions d’élution utilisées le temps de rétention observé est de 12,1 min.

399.0 919.4 1439.8 1960.2 2480.6 3001.0

Mass (m/z)

0

1.6E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 1411.6, 15995]

1411.65

1449.61

1414.66

1433.64

1383.611425.661209.63

517.21 1421.61

Spectre de masse du substrat S9 de la MMP-9: Masse théorique : 1410,68 Da, MALDI-TOF m/e (M+ H+) 1411,65, m/e (M+Na+) 1433,64, m/e (M+K+) 1449,61.

Substrat de la MMP-9 S9 : H2N-K(DAC)GPGG~VVGPK(MC)A -COOH

Time (min) 0 17 20 30

%B 50 65 100 100


sur 240

C60H95N15O16

MM = 1281,71g/mol

OH

O

NH

O

NH2

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH2 O

NH

O

N

O

NH

O

NH

N

O

O

O

NH2

C60H95N15O16

MM = 1281,71g/mol

OH

O

NH

O

NH2

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH2 O

NH

O

N

O

NH

O

NH

N

O

O

O

NH2

90 mg de peptide pDAC ont été isolés (rendement de 28 %).

Chromatogramme du du peptide pDAC: La fenêtre de droite représente le spectre d’absorption du peptide purifié. Dans les conditions d’élution utilisées le temps de rétention observé est de 14,16 min.

499.0 799.4 1099.8 1400.2 1700.6 2001.0

Mass (m/z)

0

9.9E+3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 1282.4, 9881]

1282.39

1284.38

1320.331254.34

1280.371226.33

1265.33 1342.29

pDAC : H2N-K(DAC)GPQGLLGAKA -COOH


sur 240

Spectre de masse du peptide pDAC: Masse théorique : 1281,71 Da, MALDI-TOF m/e (M+ H+) 1282,39.

C57H88N14O17

MM = 1240,64 g/mol

OH

O

NH

O

NH

O

O

O

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH2 O

NH

O

N

O

NH

O

NH2

NH2

C57H88N14O17

MM = 1240,64 g/mol

OH

O

NH

O

NH

O

O

O

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH

O

NH2 O

NH

O

N

O

NH

O

NH2

NH2

115 mg de peptide pMC ont été isolés (rendement de 37 %).

Chromatogramme du du peptide pMC: La fenêtre de droite représente le spectre d’absorption du peptide purifié. Dans les conditions d’élution utilisées le temps de rétention observé est de 12,44 min.

pMC : H2N-KGPQGLLGAK(MC)A -COOH


sur 240

512 849 1186 1523 1860 2197

Mass (m/z)

0

2.0E+4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 1241.9, 19733]

1241.86

1243.86

1263.861298.90

1245.871157.87 1300.91

1225.66

Spectre de masse du peptide pMC: Masse théorique : 1240,64 Da, MALDI-TOF m/e (M+ H+) 1241,86.


sur 240

b) Synthèse des substrats cycliques (Sc1) ; (Sc2) et (Sc9)

Méthode 1 : Cyclisation sur résine.

i. Préparation de la résine greffée.

1. Greffage de la résine.

Le monomère Fmoc-Glu-OAllyl (818 mg, 2 mmol) est solubilisé dans 10 ml de

dichlorométhane. 376 µl de diisopropyléthylamine (2,2 mmol) sont ajoutés à cette solution

puis après dix minutes l’ensemble est transféré dans un réacteur contenant 1g (1,3 mmol/g) de

résine 2-chlorotrityle. Le mélange est ensuite mis sous agitation pendant 5h à température

ambiante. La résine est ensuite filtrée, puis lavée successivement avec du DCM (3x10 ml), un

mélange DCM/méthanol/DIEA (34/4/2) (4x10 ml, 10 min d’agitation par lavage), du DMF

(3x10 ml, 5 min d’agitation par lavage) et du DCM (3x10 ml, 2 min d’agitation par lavage).

Après séchage de la résine, le taux de greffage est déterminé selon la méthode suivante :

2. Détermination du taux de greffage.

Le taux de greffage des résines est déterminé par mesure UV de la concentration en

dibenzofulvène libéré lors du clivage du groupement Fmoc en présence de pipéridine. Le

mode opératoire est le suivant : deux fioles jaugées de 50 ml sont préparés. Dans la première,

un volume de 0,5 ml d’une solution de DMF à 20% de pipéridine est additionné puis

complétée avec du DMF, pour obtenir 50 ml d’une solution qui servira de référence. Dans la

seconde, 5 mg de résine ont été pesés, puis 0,5 ml de la solution de pipéridine à 20% dans le

DMF est rajouté. Le mélange est alors agité pendant 8 min puis complété avec du DMF.

L’absorbance (à 301 nm) de la solution contenant la résine est mesurée en soustrayant celle de

la solution de référence.

En appliquant le rapport suivant :

(g) m 7800

V(ml) Abs greffage deTaux

××= Avec : Abs (Absorbance), V=50 ml et m (masse

résine en g)

Un taux de substitution de 0,23 mmol/g a été obtenu. La quantité de résine finale était

de 1,23 g de résine.


sur 240

ii. Synthèse et cyclisation sur support solide.

Les synthèses ont été effectuées à 0,1 mmol, soit 434 mg de résine, en simple couplage

et sans capping. Les acides aminés Fmoc protégés Gly, Leu, Pro, Gln(Trt), His(Trt), Tyr(tBu),

Ala, Val, Lys(DAC) et Lys(MC) sont préparés à 1 mmol , puis greffés via un automate de

synthèse en utilisant comme agent de couplage le couple DCC/HOBt sans déprotection de

l’extrémité N-terminale. 930 mg de résine sont obtenus.

Pour éliminer le groupement protecteur OAllyl, la résine est séchée sous vide pendant

4h, puis placée sous argon. Un mélange chloroforme/acide acétique/N-méthylmorpholine

(37/2/1) contenant 693 mg (0,6 mmol) de Pd (PPh3)4 est transféré dans le ballon contenant la

résine sous atmosphère inerte puis l’ensemble est mis sous faible agitation pendant 2h à

température ambiante. La résine peptidique est filtrée, puis lavée successivement avec 50 ml

de DMF, 50 ml d’une solution à 0.5% de DIEA dans le DMF (% en volume), 50 ml de DMF,

50 ml d’une solution à 0.5% de diéthyldithiocarbamate de sodium dans le DMF (% en masse),

50 ml de DMF.

La fonction N-terminale est déprotégée par 20 ml d’une solution à 50% de pipéridine

dans le DMF pendant 1h à température ambiante.

La réaction de cyclisation intramoléculaire est alors réalisée avec un mélange

contenant 260 mg (0,5 mmol) de PyBOP, 69 mg (0,5 mmol) de HOBt et 180 µl (1 mmol) de

DIEA en solution dans la NMP, sous agitation pendant 48h. La résine peptidique est ensuite

lavée avec 2 x 50 ml de méthanol, 50 ml de DCM, 50 ml de DMF et 50 ml de DCM, puis

séchée sous vide.

iii. Clivage et déprotection du cyclopeptide.

Le peptide est clivé de la résine et entièrement déprotégé par l’addition de 15 ml d’un

mélange TFA/T.I.S/H2O (95/2,5/2,5) pendant 1h30 à température ambiante. Une fois filtrée,

la résine est alors rincée avec 10 ml de TFA puis le filtrat est évaporé jusqu’à un volume

d’environ 2 ml. Le peptide est isolé par filtration après précipitation lors de l’ajout de 30 ml

d’éther diéthylique à 0°C.

Remarque : Seuls les substrats cycliques Sc1 et Sc9 des MMP-1 et MMP-9 ont pu être

obtenus par cette voie de synthèse.


sur 240

Deux mélanges ont été utilisés pour l’analyse et la purification des produits :

Mélange B : acétonitrile/eau (70/30) contenant 0,1% de TFA

Mélange C : isopropanol/eau (25/75) contenant 0,1% de TFA

N

ON

C

H

O

HN

O

N HNH

O

O

N

C

H

O

NC

HO

N C

OH

N

CH

O

N

C

H

O

N

C

H

O

HN

H2NO

N

O

N

C

H

O

H N

O

N

C

H

O

NC

HO NC

O H

NC HO

N

C

H

O

N

C

H

O

NH2O

OH

O

O

OO

N

OO

O

C104H152N24O30

MM = 2217,11 g/mol

6 mg de peptide Sc1 ont été isolés (rendement de 2,6 %).

M i n u t e s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

mA

U

- 2 0 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

mA

U

- 2 0 0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

D A D 2 1 5 n mS c y l M M P 1 E M 2 6 6 f r f i n a l 2 4 0 3 0 9

Chromatogramme du substrat cyclique Sc1 de la MMP-1 après purification : Dans les conditions précisées sur le chromatogramme avec le mélange A et B, le temps de rétention observé est de 15,51 min.

Substrat cyclique de la MMP-1 Sc1 : Cyclo-[GPQGLLGAK(DAC)GPQGLLGAK(MC)E]

nm

200 300 400

mA

U

0

500

1000

mA

U

0

500

100015.51 MinScyl MMP1 EM266 fr final 240309

Time (min) 0 20 30

%B 50 100 100


sur 240

Spectre de masse du substrat cyclique Sc1 de la MMP-1 : Masse théorique : 2218,46 Da, m/e (M+Na+) 2241,13, m/e (M+K+) 2257,11.

C98H138N22O28

MM = 2071,00 g/mol

N

O

NC

HO

N

O

N H

O

C O

N H

N

C

H

O

N C

H O

NC

OH

N

CH

O

N

C

H

O

N

C

H

ONH

O

O

OH

N

ON

C

H

O

N

O

N

C

H

O

NC

HO

NC

O H

NC H

O

N

C

H

O

O

N

O

HN

OO

O

O

12 mg de peptide Sc9 ont été isolés (rendement de 5,8 %).

Substrat cyclique Sc9 de la MMP-9 : Cyclo-[GPGGVVGPK(DAC)GPGGVVGPK(MC)E]


sur 240

M in u t e s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5

mA

U

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

mA

U

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

D A D -2 1 5 n mY L 1 8 7 f(f in a l )-A 2 3 5 5 0 a n a 3 -2 6 0 5 0 9

Chromatogramme du substrat cyclique Sc9 de la MMP-9 après purification: Selon les conditions d’élution mentionnées sur le chromatogramme avec le mélange B et C, le temps de rétention observé est de 14,37 min.

Spectre de masse du substrat cyclique Sc9 de la MMP-9 : Masse théorique : 2071,00 Da, m/e (M+H+) 2072,67, m/e (M+Na+) 2094,69, m/e (M+K+) 2110,66.

587.0 1165.6 1744.2 2322.8 2901.4 3480.0

Mass (m/z)

0

6701.4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

tens

ity

Voyager Spec #1[BP = 2094.7, 6701]

2094.69

2072.67

2110.66

2116.65

2132.63

2075.671828.62 2091.68

2179.62

nm

200 300 400

mA

U

0

500

1000

1500

mA

U

0

500

1000

150014.37 MinYL187f(final)-A23550 ana3-260509

Time (min) 0 5 20 25 35

%B 40 40 60 100 100


sur 240

Méthode 2 : Cyclisation en solution de Sc1, Sc2 et Sc9.

i. Préparation de la résine greffée.

Le monomère Fmoc-Glu(OtBu)-OH (850 mg, 2 mmol) est solubilisé dans 10 ml de

dichlorométhane. 376 µl de diisopropyléthylamine (2,2 mmol) sont ajoutés à cette solution

puis après dix minutes, l’ensemble est transféré dans un réacteur contenant 1g (1,3 mmol/g)

de résine 2-chlorotrityle. Le mélange est ensuite mis sous agitation pendant 5h à température

ambiante. La résine est ensuite filtrée, puis lavée successivement avec du DCM (3x10 ml), un

mélange DCM/méthanol/DIEA (34/4/2) (4x10 ml, 10 min d’agitation par lavage), du DMF

(3x10 ml, 5 min d’agitation par lavage) et du DCM (3x10 ml, 2 min d’agitation par lavage).

Après séchage de la résine, le taux de greffage déterminé est égal à 0.76 mmol/g.

ii. Synthèse et cyclisation en solution.

Les synthèses ont été effectuées à 0,25 mmol, soit 330 mg de résine, en simple

couplage et sans capping. Les acides aminés Fmoc protégés Gly, Leu, Pro, Gln(Trt), His(Trt),

Tyr(tBu), Ala, Val, Lys(DAC) et Lys(MC) sont préparés à 1 mmol, puis greffés via un

automate de synthèse en utilisant comme agent de couplage le couple DCC/HOBt. La

synthèse peptidique est finalisée avec une déprotection de l’extrémité N-terminale. 992 mg de

résine sont ainsi obtenu.

Afin de préserver la présence des groupements protecteurs des chaînes latérales, le

peptide est clivé de la résine avec une solution de DCM contenant 0.62% de TFA (1 ml de

TFA/160 ml de DCM). Lors de cette opération, la résine est mise en présence de 10 ml du

mélange sous vive agitation pendant 10 secondes (16x10 ml), puis filtrée rapidement. Les

filtrats sont recueilli dans une solution de DCM contenant 10% de pyridine (2 ml de

pyridine/20 ml de DCM). Après évaporation de la solution globale, le peptide est isolé par

filtration après précipitation lors de l’ajout de 40 ml d’eau milliQ+ à 0°C.

Remarque : En raison du peu de groupements protecteurs hydrophobes au sein du

peptide précurseur de Sc9, l’addition d’eau n’a pas entraînée une précipitation de ce dernier.

Dans cette situation, la solution est juste évaporée au maximum puis rincée avec 20 ml d’eau

milliQ+. La formation d’une pate jaune est observé au fond du ballon avec une légère

coloration jaune de la phase aqueuse. L’analyse par HPLC de cette solution a révélée une

faible quantité de peptide linéaire.


sur 240

Les peptides précurseurs sont ensuite solubilisés dans 500 ml de DCM en présence

d’EDC (230 mg; 1,2 mmol) et de HOBt (183,6 mg; 1,2 mmol). Le milieu réactionnel est

laissé sous agitation magnétique pendant 48 heures. La réaction de cyclisation

intramoléculaire est suivie par HPLC en prélevant 2 ml de brut. Ce prélèvement est évaporé

puis traité avec 5ml de mélange TFA/T.I.S/H2O (95/2,5/2,5) pendant 30 min, puis évaporé à

nouveau. L’échantillon brut obtenu est analysé par HPLC après l’ajout de 1 ml de mélange B.

Remarque : Concernant la cyclisation de Sc9, le résidu pâteux correspondant est

préalablement solubilisée dans 3 ml de DMSO puis cette solution est ajoutée goutte à goutte

dans 500 ml de DCM en présence d’EDC (230 mg; 1,2 mmol) et de HOBt (183,6 mg;

1,2 mmol).

En fin de réaction, le DCM est évaporé puis 40 ml d’eau sont ajoutés afin de faire

précipiter le cyclopeptide attendu.

Remarque : Comme précédemment, dans ces conditions le peptide Sc9 ne précipite

pas et une pate se forme. Afin d’éliminer les agents de couplage hydrosolubles le brut

réactionnel est cependant rincé avec la phase aqueuse qui sera éliminée

Chaque peptide est ensuite totalement déprotégé avec 15 ml d’un mélange

TFA/T.I.S/H2O (95/2,5/2,5) pendant 1h30 à température ambiante. Après évaporation de la

solution, le macrocycle est précipité par l’ajout de 30 ml d’éther froid.

Le peptide Sc2 a pu être purifié avec le mélange A et B.


sur 240

C112H142N26O30

MM = 2331,03 g/mol

N

N CH O

NC

HO

ON

HO

NH

H

NH

C O

N

C

H

O

O

O

N

O

N

NC HO

NC

HO

O N

OH

NH

H

NH

CO

N

C

H

O

N

C

H

O

HN

O

N

C

H

O

O

O

N

NH

O

NH

O

O

O

HO

NNH

O

OO

O

O

N

N

NH

135 mg de peptide Sc2 ont été isolée (rendement de 23 %).

M i n u t e s

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0

mA

U

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

mA

U0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

D A D 2 1 5 n mE M 2 9 1 b 3 f r p r e p 1 e t 2 2 9 0 7 0 9

Chromatogramme du substrat cyclique Sc2 de la MMP-2 : Dans les conditions d’élution décrites sur le chromatogramme avec le mélange A et B, le temps de rétention observé est de 28,09 min.

Substrat cyclique Sc2 de la MMP-2 : Cyclo-[PPGAYHGAK(DAC)PPGAYHGAK(MC)E]

nm

200 300 400

mA

U

0

1000

2000

mA

U

0

1000

200028 .09 M inEM 291b3 fr prep1 e t 2 290709

Time (min) 0 5 25 30 40

%B 30 30 60 100 100


sur 240

Spectre de masse du substrat cyclique Sc2 de la MMP-2 : Masse théorique : 2331,03 Da, m/e (M+H+) 2332,00.

Par la méthode de cyclisation en solution les peptides Sc1 et Sc9 ont été obtenus

respectivement avec des rendements de 3,5 % et 11 % (la masse de produit est de 18 mg pour

Sc1 et 61 mg pour Sc9).


sur 240

C) Tests enzymatiques.

Tout les essais ont été réalisés dans un tampon composé de : 0,1 M TRIS, 0,1 M NaCl,

10 mM CaCl2, 0,05 % d’igépal (CA-630), pH=7,4.

Les spectres de fluorescence comparant les peptides linéaires ou cycliques avec le

dérivé pMC ont été réalisés à l’aide d’une cuve de 1cm de trajet optique, dans un volume total

de 2 ml, avec des largeurs de fente de 3,4 nm en émission et 12 nm en excitation.

La concentration des solutions peptidiques a été déterminée en utilisant le coefficient

d’extinction molaire de la MC et de la DAC sur un peptide. Les valeurs sont les suivantes :

Sur un peptide linéaire :

λ360 nm (MC)= 18500 M-1.cm-1

λ436 nm (DAC)= 26300 M-1.cm-1

Sur un peptide cyclique :

λ360 nm (MC)= 10714 M-1.cm-1

λ436 nm (DAC)= 19291 M-1.cm-1

Les enzymes commerciales MMP-1, MMP-2 et MMP-9 ont été mises sous forme

d’aliquotes pour être conservées à -80 °C (20 µl d’enzyme à une concentration de 220 nM

dans un tampon contenant 50% de tampon TRIS pH=7,4 et 50 % de glycérol bi-distillé).

Chaque aliquote est ensuite activé avec 2µl d’une solution d’acétate

d’aminophénylmercurique (APMA) à 10 µM pendant 3 h à 37 °C. La solution d’APMA doit

être réalisée dans un tampon TRIS 0,1 M à pH=9. Le volume de la solution d’APMA doit être

à un ratio 1/10 par rapport au volume total de la solution d’activation de l’enzyme.

3 mg de peptides linéaires ou cycliques sont solubilisés dans 200 µl de DMSO pur

pour constituer les solutions mères des substrats. La solution finale de substrat doit être

réalisée pour chaque essai, et la concentration doit être calculée par UV avec les coefficients

d’extinction molaire de la MC et de la DAC présentés précédemment.

Tous les essais sont réalisés à une concentration d’enzyme activée de 2 nM. Après

ajout de l’enzyme activée pour initier la réaction, la variation de la fluorescence de MC est


sur 240

mesurée à 401 nm (Excitation à 350 nm) pendant 20 min. La vitesse initiale est déterminée

puis les constantes Kcat et Km sont calculées en utilisant une représentation en double

inverse.

a. Clivage enzymatique des différents peptides.

Substrat MMP-1: S1.

1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1. m

in)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

Test 1Test 2

kcat = 1.57 s-1 ± 0.008Km = 6.3 µM ± 0.21

kcat /Km = 250.492 M-1.S-1


1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1. m

in)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Test 1Test 2

kcat = 15.8 s-1 ± 5.4Km = 3.1 µM ± 1.3

kcat /Km = 5.052.647 M-1.S-1


1/S (µM-1)

0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1. m

in)

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Test 1Test 2

kcat = 17.6 s-1 ± 1.2Km = 5.1 µM ± 0.1

kcat /Km = 3,430,651 M-1.S-1


Représentation en double inverse. Clivage de S1 par la MMP-1, la MMP-2 et la MMP-9 (largeur des fentes : émission 12 nm; excitation 5 nm)


sur 240

Substrat MMP-2: S2.

Temps (min)

0 5 10 15 20

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

50

100

150

200

250

300

350

1 µM2 µM3 µM4 µM


Variation de la fluorescence en fonction du temps: Clivage de S2 par la MMP-1 (largeur de fente en émission 6 nm et en excitation 10 nm).


1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I-1.m

in)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

Test 1Test 2

kcat = 2.85 s-1 ± 0.64Km = 4.6 µM ± 1.7

kcat /Km = 613,558 M-1.S-1


1/S (µM 1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I1 . m

in)

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

Test 1Test 2

kcat = 0.96 s-1 ± 0.01Km = 4.9 µM ± 0.1

kcat /Km = 193,128 M-1.S-1

Représentation en double inverse. Clivage de S2 par la MMP-2 et la MMP-9 (Largeur des fentes en émission 6 nm et en excitation 10 nm).


sur 240

Substrat MMP-9: S9.


Temps (min)

0 5 10 15 20

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

100

150

200

250

300

350

400

450


Variation de la fluorescence en fonction du temps: Clivage de S9 par la MMP-1 (largeur de fente en émission 6 nm et en excitation 10 nm).


1/S (µM 1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I1 . m

in)

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Test 1Test 2

kcat = 0.29 s-1 ± 0.002Km = 4.7 µM ± 0.3

kcat/Km = 47,757 M-1.S-1


1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I-1 .

min

)

0

1

2

3

4

5

Test 1Test 2

kcat = 0.43 s-1 ± 0.09Km = 11.3 µM ± 0.1

kcat /Km = 38,291 M-1.S-1

Représentation en double inverse. Clivage de S9 par la MMP-2 et la MMP-9 (Largeur des fentes en émission 6 nm et en excitation 10 nm).


sur 240

Substrat cyclique MMP-1: Sc1.


[S] (µM)

0 1 2 3 4

Var

iatio

n de

la fl

uore

scen

ce e

n IF

/min

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

kcat = 1.09 s-1 ± 0.26Km =6.3 µM ± 2.3

kcat /Km = 173.403 M-1.S-1


1/S (µM -1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I-1 .

min

)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Test 1Test 2

kcat = 2.19 s-1 ± 0.17Km =3.39 µM ± 1.4

kcat /Km = 647,097 M-1.S-1


1/S ( µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1 .

min

)

0

20

40

60

80

100

Test 1Test 2

kcat = 5.11s-1 ± 0.64Km =7.4 µM ± 1.5

kcat /Km = 692,268 M-1.S-1

Représentation en double inverse. Clivage de Sc1 par la MMP-2 et la MMP-9. Pour le clivage par la MMP-1, nous avons utilisé une représentation directe. (Largeur des fentes en émission 5 nm et en excitation 12 nm).


sur 240



Temps en s

0 200 400 600 800 1000 1200

Inte

nsité

de

fluor

esce

nce

IF

0

10

20

30

40

50

60



Temps (s)

0 200 400 600 800 1000 1200

Inte

nsité

de

la fl

uore

scen

ce IF

0

10

20

30

40

50

60


Variation de la fluorescence au cours du temps : Clivage de Sc2 par MMP-1, MMP-2 ( Largeur des fentes en émission 6 et en excitation 10)


1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I-1 .

min

)

0

200

400

600

800

1000

Test 1Test 2

kcat = 0.95 s-1 ± 0.13Km = 10.25 µM ± 2.34

kcat /Km = 92,850 M-1.S-1

Représentation en double inverse. Clivage de Sc2 par la MMP-9 (Largeur des fentes en émission 6 nm et en excitation 10 nm).


sur 240



1/S (µM-1)

0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I-1 .

min

)

0

1

2

3

4

5

6

Test 1Test 2

kcat = 0.28 s-1 ± 0.01Km = 5.4 µM ± 0.8

kcat /Km = 52,487 M-1.S-1


1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

(F

I-1 .

min

)

0

50

100

150

200

250

300

Test 1Test 2

kcat = 0.18 s-1 ± 0.02Km = 3.1 µM ± 0.5

kcat /Km = 56,343 M-1.S-1


1/S (µM-1)

-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2

1/V

( F

I-1 .

min

)

0

50

100

150

200

250

300

Test 1Test 2

kcat = 0.33 s-1 ± 0.02Km = 6.8 µM ± 0.2

kcat /Km = 49,031 M-1.S-1

Représentation en double inverse. Clivage de Sc9 par la MMP-1, la MMP-2 et la MMP-9 (largeur des fentes : émission 6 nm; excitation 10 nm).


sur 240

b. Digestion par un échantillon plasmatique

Les échantillons de sang proviennent de « l’Etablissement Français du Sang de

Bordeaux ». Ils ont été collectés sur des patients volontaires, négatifs aux les tests contre le

HIV-1 et 2, l’Hepatite B et C, le virus HTLV-I et II et la syphilis. Le sang frais (moins de 48

h) contenant 1,8 mg d’EDTA 2K (sel de potasium d’acide d’éthylene diamine tétraacetique)

est centrifugé pendant 15 min à 1300 * g. Le plasma est collecté et concervé à +4°C.

Les essais ont été effectués dans un tampon TRIS pH=7,4, avec un volume total de

2 ml. La concentration en peptide est de 4 µM. Après ajout de 4 µl du plasma isolé,

l’évolution de la fluorescence de la MC est mesurée à 401 nm (Excitation 350 nm) pendant

1h. Les tests en présence des enzymes activées de la MMP-1, -2 et -9 ont été réalisés à une

concentration enzymatique de 1 nM.

D) Etude de complexation

a. Détermination de la courbe de JOB par RMN.

3 ml d’une solution à une concentration de 5 mM du composé X à analyser et 3 ml

d’une solution à une concentration de 5 mM de β-Cyclodextrine sont réalisés. Dans un tube

RMN de 507 PP (correspond à la qualité du tube), le mélange des deux solutions est réalisé

avec une concentration totale fixe de 5 mM et un volume final constant de 600 µl. Nous avons

reporté ci-dessous un tableau récapitulant la proportion des deux solutions par essai.

[X]

en mM

Volume de la Solution de X à

5 mM en µl

Volume de la Solution de β-CD

à 5 mM en µl

[β-CD] en mM

Tube 1 5 600 0 0 Tube 2 4 480 120 1 Tube 3 3 360 240 2 Tube 4 2,5 300 300 2,5 Tube 5 2 240 360 3 Tube 6 1,5 180 420 3,5 Tube 7 1 120 480 4 Tube 8 0 0 600 5


sur 240

Les différents essais sont ensuite bien mélangés et laissés à température ambiante

pendant 30 min afin que les protons NH s’échangent.

Les spectres RMN sont réalisés à 128 scans. Les déplacements chimiques sont ensuite

déterminés manuellement sur le logiciel NMR Notebook, car la détermination automatique

des déplacements n’est pas fiable et conduit souvent à des erreurs.

b. Détermination du Ka par RMN.

10 ml d’une solution à une concentration de 0,5 mM du composé X à analyser est

réalisé. 56,7 mg de β-CD sont solubilisés avec 5 ml de la solution du composé X (soit une

solution à 10 mM de cyclodextrine et 0,5 mM de X). Le tableau ci-dessous récapitule les

concentrations de cyclodextrine ainsi que le volume de solution à prélever pour chaque essai.

[β-CD]

en mM

Volume de la solution de β-CD

en μl

Volume de la solution de X

en μl

Tube 1 0 0 600 Tube 2 1 60 540 Tube 3 2 120 480 Tube 4 4 240 360 Tube 5 5 300 300 Tube 6 6 360 240 Tube 7 8 480 120 Tube 8 10 600 0

c. Détermination du Ka par Fluorescence.

La méthode est la même que par RMN. La concentration de la solution de composé X

est à 10 µM. Selon le composé à analyser, lorsque la gamme de concentration en

cyclodextrine variait entre 0 à 10 mM, nous avons réalisé une solution mère à une

concentration de 10 mM de cyclodextrine. Lorsque la gamme de concentration variait entre 0

et 20 mM, nous avons réalisé deux solutions mères : une à 10 mM et une à 20 mM.

ANNEXE

sur 240

ANNEXE

RESEARCH PAPER

Novel Cyclopeptides for the Design of MMP Directed DeliveryDevices: A Novel Smart Delivery Paradigm

El Farouck Moustoifa & Mohamed Anis Alouini & Arnaud Salaün & Thomas Berthelot & Aghleb Bartegi & Sandra Albenque Rubio &

Gérard Déléris

Received: 23 February 2010 /Accepted: 19 April 2010# Springer Science+Business Media, LLC 2010

ABSTRACTPurpose Matrix metalloproteinases (MMP) are a family ofproteolytic enzymes, the expression of which in a key step oftumor progression has been better defined recently. Thestudies highlighted the ongoing need for very specific inhibitors,substrates or release devices designed to be selective for oneor at least very few MMPs.Methods This report deals with the design, synthesis and invitro evaluation of linear and especially novel cyclic peptidicmoieties, embodying MMP cleavable sequences designed toanswer these questions. FRET (fluorescence resonance energytransfer) labelling via chromophore modified amino acids wasused to give access to enzyme kinetics.Results Evaluation of these peptides showed that cyclisationgives rise to high specificity for certain MMP, suggesting thatthis approach could provide very specific MMP substrate.Moreover, cyclic structures present a very good plasmastability.

Conclusions These original derivatives could allow the designof MMP controlled delivery devices, the specificity of which willbe retained in complex biological media and in vivo.

KEY WORDS cancer . cyclic peptide . delivery device .fluorescent substrate . MMP

ABBREVIATIONSACN acetonitrileAPMA 4 aminophenylmercuric acetateDAC 7 diethylamino coumarin 3 carboxylic acidDCM methylene chlorideDIEA N,N′ diisopropyldiethylamineDMF N,N dimethylformamideDMSO dimethylsulfoxideEDC 1 ethyl 3 (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide

hydrochlorideECM extracellular matrixEt2O diethyl etherFmoc (9H fluoren 9 ylmethoxycarbonyl)FRET fluorescence resonance energy transferHBTU N [1H benzotriazol 1 yl)dimethylamino)methylene]

N methylmethanaminium hexafluorophosphateN oxide

HOBt N hydroxybenzotriazoleHPLC high performance liquid chromatographyMALDITOF

matrix assisted laser desorption/ionization timeof flight

MC 7 methoxy coumarin 3 carboxylic acidMMP Matrix metalloproteaseMMPI MMP inhibitorMS mass spectrometryNMM N methylmorpholinePyBOP benzotriazol 1 yl oxy tris pyrrolidinophosphoniumtBu t butyl

E. F. Moustoifa :M. A. Alouini : A. Salaün : S. Albenque Rubio :G. Déléris (*)Université Victor Segalen Bordeaux 2CNRS UMR 5084 Bio Organic Chemistry Group146 rue Léo SaignatF 33076 Bordeaux Cedex, Francee mail: gerard.deleris@u bordeaux2.fr

M. A. Alouini : T. BerthelotCEA, IRAMIS, LSI Irradiated Polymers GroupUMR 7642 CEA/CNRS/Ecole PolytechniqueF 91128 Palaiseau Cedex, France

M. A. Alouini : A. BartegiUnité de Recherche 02/UR/09 01 Biochimie des Protéineset Interactions MoléculairesAvenue Taher Hadda, BP 74, Monastir 5000, Tunisie

Pharm ResDOI 10.1007/s11095 010 0164 0

TFA Trifluoroacetic acidTHF tetrahydrofuranTIS triisopropylsilaneTRIS tris(hydroxymethyl)aminomethaneTrt tritylSPPS solid phase peptide synthesis

INTRODUCTION

Matrix Metalloproteinases (MMPs) are a family of Zincmetalloenzymes involved in the catabolism of extracellularmatrix (ECM). The tissue remodelling occurs in normalphysiological processes such as development and morphogenesis but also during the course of diseases such asarthritis, cardiovascular diseases and cancer. MMPs displaya large set of ECM and non ECM substrates. Suchenzymes have long been associated with many types andstages of cancer and were thought to be essential butlimited to basement membrane penetration during tumorprogression and metastasis (1–3). The relationship betweenspecific MMP overexpression and tumor progression hasbeen very recently highlighted (4,5). It has been shown thatdramatic tumor escaping from antiangiogenic chemotherapies is correlated with MMP 2 and MMP 9 over expressionconcomitant with MMP 1 downregulation. MMP monitoring could thus be envisaged as providing tools for diagnosisor prognosis. MMP expression profile can be considered asa tumor fingerprint. Matrix metalloproteinase are presentglobally in very low concentration, but concentrated on thesurface of cells in tumor areas in high concentrated andactivated form (6). For that reason, research for MMPinhibitors was very intensive about a decade ago. SeveralMMP inhibitor (MMPI) drugs advanced up to phase IIIclinical trials in patients with advanced cancer, but the trialsfailed mainly because of muscle and joint pains whichprevented reaching their end points of increased survival(7–10).

These results highlight the fact that previous MMPIdevelopment programs were initiated without adequatetarget validation and without identifying in vivo MMPsubstrates or their physiological roles. As previously pointedout, MMPs promote tumor progression not only throughsingle ECM degradation, but also through a number ofsignaling functions (11–14). They are submitted to highlyspecific over expression in dramatic phenomena linked toinvasive phenotypic changes following anti angiogenictherapies (4). The complexity of MMP over expressionand activities highlights their important role in metastaticdiseases, especially in highly aggressive late stage tumorswith poor clinical outcome (15–18) and in dramaticsituations when chemotherapy escaping occurs. Therefore,

the development of specific and selective substrate and/orinhibitors for one or a group of MMPs still remains of highinterest for tumor targeting via mediation by MMP.

MMP activities have been previously addressed withsynthetic fluorogenic derivatives both as biochemical andpharmacological tools, as well as for the design of targeteddelivery systems. They are most often FRET basedsubstrates which were designed from natural collagenidentified sequences cleaved by MMPs while assumingadditive thermodynamic contributions of different aminoacids. Experimental conclusions highlight that this rationaleis not fully convenient. To overcome this drawback,selectivity was addressed by G.B. Fields and coworkerswith the synthesis of homotrimeric, fluorogenic triplehelical peptide (THP) models which include MMP cleavagesites (19).

Moreover, several delivery devices have also beendesigned, using polymeric vehicles (20,21), hydrogel matrix(22) or liposomal devices functionalized with peptidicmoieties embodying MMP cleavage sequences. Theseprevious studies confirmed that MMP based release devicesoffer opportunities even if they present poor specificity(23,24). Moreover, as soon as peptidic structures areinvolved, requiring collagen mimicking helicoidal entities,large numbers of amino acids are included. Specificdelivery at tumor areas upon MMP activation obviouslyremains a crucial challenge for the design of targetedanticancer therapies or imaging. It requires that reasonablesize molecules, designed as MMP cleavable devices, presenta high level of selectivity for a very small number of selectedMMP as well as high plasma stability.

One of the most frequently used approaches to improvepeptide stability in biological medium is the cyclization oflinear peptides, which prevents unspecific degradation byproteases. But direct cyclization of linear fluorogenicFRET based peptides is not an acceptable approach, asthe hydrolysis of sequence does not result in significantchange of donor/acceptor proximity and thus does notallow enzymatic cleavage to be measured.

For these reasons, we herein propose a novel approachbased on the design of cyclic peptides which incorporatetwo MMP substrate sequences. In order to test them, eachfluorescent amino acid of a FRET probes pair wasintroduced between the substrate sequences. When hydrolyzed, the cyclic peptide releases fluorescent probes, andchange in FRET signal provides access to cleavage kinetics.In order to validate the proof of concept for this approach,linear and cyclic MMP substrate peptides were synthesizedand evaluated both in vitro and in plasmatic medium. Wefocused our attention on MMP 1 for its implication inmetastatic process (15,25,26) and MMP 2 and MMP 9 fortheir over expression in numerous steps of tumor progression (27).

Moustoifa et al.

MATERIALS AND METHODS

General Methods

All standard chemicals and solvents were of analytical gradeand purchased from Sigma Aldrich. 2 Chloro chlorotrityl resinand all Fmoc amino acids were purchased fromNovabiochem.

Absorption spectra were recorded on a U 2010 Hitachispectrophotometer (Hitachi instruments, USA). Enzymaticassays were recorded on a Luminescence Spectrometermodel LS55 with a 4 position automatic cell changerincluding water thermostatting and strirring for eachsample position. Solid Phase Peptide Synthesis was carriedout on an Applied Biosystems 433A automated peptidesynthesizer. Reverse phase HPLC was performed on aHitachi LaChrom Elite equipped with an Organizer, DiodeArray detector L 2450, Autosampler L 2200, pump L 2130with a SATISFACTION RP18AB 5 µm 250×4.6 mm C18column for analytical session. Preparative HPLC wasperformed on a Shimadzu instrument equipped with aSCL 10 AVP system controller, LC8A HPLC pumps andSPD 10 AVP UV vis detector probing at 214 nm on aSATISFACTION RP18AB 5 µm 250×20 mm C18column (C.L.I Cluzeau) for preparation. The followingsolvent systems were used for the elution in a lineargradient mode at a flow rate of 1 or 15 ml/min (foranalytical and preparative HPLC respectively): (A) 0.1%aqueous trifluoroacetic acid (TFA) and (B) 0.1% TFA in70% aqueous acetonitrile (ACN). MALDI TOF massspectrometry was performed on a BRUKER BIFLEX IIImass spectrometer (CESAMO, Bordeaux, France)equipped with a nitrogen laser (337 nm, 3 ns pulse width).

Fluorescent Probes

Fluorescent amino acids, Nε (7 methoxycoumarin 3 carboxyl) L Fmoc lysine (i.e. Fmoc Lys(MC) OH) and Nε (7diethylamninocoumarin 3 carboxyl) L Fmoc lysine (i.e.Fmoc Lys(DAC) OH) were synthesized as previouslydescribed by Berthelot et al. (28).

Peptide Synthesis (Table I)

Synthesis of S1, S2 and S9

S1, S2 and S9 were synthesized using Fmoc strategy. Apreloaded resin Fmoc Ala Wang Resin (0.72 mmol/g) wasused for the synthesis (0,25 mmol; 350 mg). Nα Fmocamino acids (Gly, Leu, Pro, Gln(Trt), His(Trt), Tyr(tBu),Ala, Val, Lys(DAC), Lys(MC)) were used in a four foldexcess using HBTU in the presence of HOBt and DIEA.The synthesis was performed without capping, giving Ndeprotected peptide bound resin.

Peptides were cleaved from the resin by treatment withTFA/H2O/TIS (95:2.5:2.5) mixture for 1 h 30 at roomtemperature. The resin was removed by filtration and washedwith TFA (10 mL). The filtrate was evaporated under reducedpressure. The product was precipitated with cold diethyl ether.The crude peptides were collected by filtration and purified bypreparative HPLC (C18) to yield S1 (55 mg) MALDI TOFm/e (M+H+) 1484.64 (theoretical:1483.73 Da), S2 (96 mg)MALDI TOF m/e (M+H+) 1541.56 (theoretical:1540.69 Da)and S9 (102 mg) MALDI TOF m/e (M+H+) 1411.65(theoretical:1410.68 Da).

Synthesis of Sc1, Sc2 and Sc9 by on Resin Cyclisation

Sc1, Sc2 and Sc9 were synthesized on a 0.2 mmol scaleusing Fmoc strategy. Fmoc Glu OAllyl (818 mg, 2 mmol)was dissolved in dry DCM (10 mL). After completedissolution, DIEA (367 µL, 2.2 mmol) was added. After10 min, 2 chloro chlorotrityl resin (1 g, 1.3 mmol/g) wasadded. The resulting suspension was stirred at roomtemperature for 5 h. The resin was filtered off andsuccessively washed with DCM (3×10 mL), DCM/methanol/DIEA (17/2/1) (4×10 mL), DMF (2×10 mL) andDCM (3×10 mL). Resin was dried under high vacuumover KOH. 0.23 mmol/g substitution level was estimatedby UV determination of the concentration of liberateddibenzofulvene after Fmoc group cleavage with piperidine.The Fmoc Glu OAllyl trityl resin was packed in thereaction column of the automatic peptide synthesizer(437 mg, 0.1 mmol). Nα Fmoc amino acids (Gly, Leu, Pro,Gln(Trt), Ala, Val, Lys(DAC), Lys(MC)) were used in afour fold excess using HBTU in the presence of HOBt andDIEA. The synthesis was performed without capping,giving N protected peptide bound resin. This peptidyl resinwas dried at 40°C under high vacuum for 4 h and thenflushed with a stream of argon. Pd(PPh3)4 (693 mg,0.6 mmol) was dissolved by bubbling a stream of Ar in amixture of chloroform/acetic acid/N methylmorpholine(8 mL, 37:2:1). Then, this mixture was transferred intoreaction column containing the resin and was occasionallystirred with gentle agitation for 2 h at room temperature.Resin was filtered off and washed consecutively with 0.5%DIEA in DMF (3×10 mL) and sodium diethyldithiocarbamate (0.5% w/w) in DMF (3×10 mL) to remove thecatalyst. Resin was successively washed with DMF (2×10 mL) and DCM (3×10 mL). After removal of Fmocprotecting group, resin was washed with 1 M HOBt inDMF. Peptidyl resin was mixed with a solution of PyBOP(260 mg, 0.5 mmol), HOBt (69 mg, 0.5 mmol) and DIEA(180 µL, 1 mmol) in N methylpyrrolidone (10 mL). Mixturewas swelled at room temperature for 48 h. Peptidyl resinwas washed with DMF (2×10 mL) and DCM (3×10 mL).Peptides were cleaved from the resin by treatment with

Novel Cyclopeptides as MMP Directed Delivery Devices

TFA/H2O/TIS (95:2.5:2.5) mixture for 1 h 30 at roomtemperature. Crude peptide was collected by filtration andpurified by HPLC (C18). Preparative HPLC yielded Sc1(6 mg) MALDI TOF m/e (M+Na+) 2240.13 (theoretical:2217.11 Da) and Sc9 (12 mg) MALDI TOF m/e (M+H+)2072.67 (theoretical: 2071.005 Da) .

Synthesis of Sc1, Sc2 and Sc9 by Cyclisation in Solution

Sc1 , Sc2 and Sc9 were synthesized on a 0.25 mmol scaleusing Fmoc strategy. Fmoc Glu(OtBu) OH (850 mg,2 mmol) was dissolved in dry DCM (10 mL). After completedissolution, DIEA (367 µL, 2.2 mmol) was added. After10 min, 2 chloro chlorotrityl resin (1 g, 1.3 mmol/g) wasadded. The resulting suspension was stirred at roomtemperature for 5 h. The resin was filtered off andsuccessively washed with DCM (3×10 mL), DCM/methanol/DIEA (17/2/1) (4×10 mL), DMF (2×10 mL) andDCM (3×10 mL). Resin was then dried under highvacuum over KOH. 0.76 mmol/g substitution level forthis preloaded resin was estimated by UV determinationof the concentration of liberated dibenzofulvene, after thecleavage of the Fmoc group with piperidine. Fmoc Glu(OtBu) trityl resin (329 mg) was packed into the reactioncolumn of the automatic peptide synthesizer. Nα Fmocamino acids (Gly, Leu, Pro, Gln(Trt), His(Trt), Tyr(tBu),Ala, Val, Lys(DAC), Lys(MC)) were used in a four foldexcess using HBTU in the presence of HOBt and DIEA.Synthesis was performed without capping, giving N deprotected peptide bound resin. Repetitive treatment of peptidyl resin with a 0.6% TFA solution in dichloromethane(16×10 mL) was carried out in a sealable sintered glassfunnel (1 min per treatment). Resin was filtered into a flaskcontaining 10% of pyridine in DCM (2 mL of pyridine in20 mL of DCM). After evaporation under reducedpressure, 40 mL of water were added and the mixturecooled with ice to aid precipitation of the product. In thecase of Sc9, the crude peptide was washed with 30 mLwater without adding organic solvent. Resulting productwas dried overnight.

In order to perform cyclization, crude peptide (0.25 mmol)was mixed with 500 mL DCM, EDC (1 ethyl 3 (3 dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride) (230 mg,1.2 mmol) and HOBt (183.6 mg, 1.2 mmol) for 48 h. Thefinal estimated concentration of peptide was close to 0.5 mM.After evaporation under reduced pressure to around 10 mL,20 mL were added to wash the organic solution. Afterextraction and total evaporation of DCM, the sample wastriturated and filtered with cold diethyl ether to reduce thepresence of HOBt. Peptides were fully deprotected bytreatment with TFA/H2O/TIS (95:2.5:2.5) mixture for 1 hat room temperature. TFA was evaporated under reducedpressure, and the product was precipitated with cold diethylether. Crude peptide was collected by filtration and purifiedby preparative HPLC (C18) to yield Sc1 (18 mg) MALDITOF m/e (M+Na+) 2240.13 (theoretical: 2217.11 Da), Sc2(135 mg) MALDI TOF m/e (M+H+) 2332.00 (theoretical:2331.038 Da) and Sc9 (61 mg) MALDI TOF m/e (M+H+)2072.67 (theoretical: 2071.005 Da).

Fluorescence Spectra

All spectra were carried out in a total 2 mL volume. Slitwidth was 3.4 for emission and 12 for the excitation.Spectra were recorded in 0.1 M TRIS, 0.1 M NaCl,10 mM CaCl2, 0.05% of Igepal(CA 630), pH=7.4. Peptideconcentrations were calculated using the molar extinctioncoefficient of MC and DAC in peptide: λ360nm (MC)=18,500 M 1cm 1 and λ436nm (DAC)=26,300 M 1cm 1 forlinear peptide. This coefficient is different in cyclic peptide,λ360nm (MC)=10,714 M 1cm 1 and λ436nm (DAC)=19,291 M 1cm 1.

Enzyme Assays

MMP assays were performed in the same buffer describedbelow. 20 µL aliquot of 220 nM commercial MMP 1,MMP 2 and MMP 9 as zymogen form were activated with10 µM solution of 4 aminophenylmercuric acetate (APMA)(2 µL, Buffer TRIS 0,1 M pH=9) at 37°C for 3 h. Stock

Table I Structure of Linear (S1, S2, S9) and Cyclic (Sc1, Sc2, Sc9) Peptides

Peptide Structure

S1 H2N Lys(DAC).Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Lys(MC) Ala COOH

S2 H2N Lys(DAC) Pro Pro Gly Ala Tyr His Gly Ala Lys(MC) Ala COOH

S9 H2N Lys(DAC) Gly Pro Gly Gly Val Val Gly Pro Lys(MC) Ala COOH

Sc1 Cyclo(Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Lys (DAC) Gly Pro Gln Gly Leu Leu Gly Ala Lys(MC) Glu)

Sc2 Cyclo(Pro Pro Gly Ala Tyr His Gly Ala Lys(DAC) Pro Pro Gly Ala Tyr His Gly Ala Lys(MC) Glu)

Sc9 Cyclo(Gly Pro Gly Gly Val Val Gly Pro Lys( DAC) Gly Pro Gly Gly Val Val Gly Pro Lys(MC) Glu)

Moustoifa et al.

peptide solutions were prepared in DMSO (3 mg peptide in200 µL pure DMSO). For each measurement, peptideconcentration was calculated using the molar extinctioncoefficient previously described. All assays were carried outin a total 2 mL volume with 2 nM activated MMP. Afteraddition of enzyme to initiate reaction, the initial rate ofsubstrate hydrolysis was determined by monitoring theincrease in 401 nm fluorescence emission using a 350 nmexcitation wavelength. Initial velocities were calculated inorder to fit a Lineweaver Burk plot for determination ofkinetics parameter Kcat and Km.

Plasma Assays

Blood was collected from voluntary donor at “Etablissement Français du Sang” (Bordeaux Site). Donors weretested and determined negative for HIV 1 and HIV 2,Hepatitis B and C HTLV I/II viruses, and syphilis.Freshly collected plasma (immediately after control)containing 1.8 mg/ml EDTA 2 K (ethylene diaminetetraacetic acid dipotassium salt) were centrifuged 15 minat 1300 x g. Plasma was then isolated. For everyexperiment, plasma tubes coming from three donorswere pooled. All assays were carried out in a total 2 mLvolume with 4 µl of crude plasma and 4 µM substrateadded. The increase in fluorescence emission wasmonitored during 1 h at 401 nm using a 350 nmexcitation wavelength. For the corresponding assays,activated MMP (1, 2 or 9) was subsequently added tothe solution, and the fluorescence emission was monitored as described above again for 1 h.

RESULTS AND DISCUSSION

Novel FRET peptidic substrates were obtained by incorporation of fluorescent amino acids, Nε (7 methoxycoumarin 3 carboxyl) L Fmoc lysine (Fmoc Lys(MC) OH) asthe donor and Nε (7 diethylamninocoumarin 3 carboxyl) LFmoc lysine (Fmoc Lys(DAC) OH) as acceptor (28). Theseprobes appear to be attractive due to their extendedspectral range, high emission quantum yields, photostability, good solubility in the safest solvents and easy incorporation in a peptide sequence through solid phase peptidesynthesis (SPPS) (29). These moieties previously allowed us

to monitor MMP activity (29). For that purpose, oursubstrates were designed from described sequences arisingfrom Nagase et al. (30), which were described as MMPnatural cleavage sites (Table II).

Peptide Synthesis

Fluorogenic amino acids were introduced as any otheramino acid in the sequence, by solid phase synthesis, inorder to provide the corresponding FRET peptide (Fig. 1).Linear fluorogenic substrates S1, S2 and S9 were obtainedin satisfactory yields (Table III).

As tridimensional structural requirements are important for proteolytic activity and selectivity of MMPs, thedesign of conformationnally constrained derivatives wasan obvious target in our strategy. We herein report thefirst study involving conformationally restrained peptidesafter cyclization.

Cyclic moieties were first synthesized through a“head to tail” on resin cyclization. This synthetic approach is based upon the anchoring of the peptide to theresin through a side chain. Glutamic acid was used,protected with allyl group as an orthogonal α carboxylprotection (34–36). Solid phase synthesis of this cyclopeptide was performed on 2 chloro chlorotrityl resin.Loading of the resin was achieved to yield a low loadedresin (0.23 mmol/g) in order to improve intramolecularcyclization. Unfortunately, only cyclopeptides Sc1, Sc9were obtained in poor yields (Table IV) after a trickyHPLC purification step.

Because of the poor yields obtained from on resincyclisations, we prepared cyclic peptide through insolution cyclisations. Fmoc Glu(OtBu) OH was loaded ona 2 chloro chlorotrityl resin. After automatic solid phasepeptide synthesis, the fully protected peptide was removedfrom resin with diluted TFA (1%) on DCM. Cyclisationwas then performed at 0.5 mM of peptide in presence ofEDC and HOBt during 48 h in DCM (Fig. 2). Nooligomeric fraction was observed in these conditions, andcyclic peptides were obtained with better yield after classicalpurification with water and acetonitrile/water (70/30)mixtures in presence of 0.1% TFA (Table IV). Even ifpeptide cyclization appeared to be more efficient insolution, cyclization step appeared here again to be stronglydependent on peptide sequence.

Sequence Natural substrate MMP Ref

Gly Pro Gln Gly775∼Leu776 Leu Gly Ala α2 chain Human collagen I MMP 1,−8 (31)

Pro Pro Gly Ala62∼Tyr63 His Gly Ala Human galectin 3 MMP 2 (32)

Gly Pro Gly Gly439∼Val440 Val Gly Pro α1 chain Human collagen XI MMP 9 (33)

Table II Natural MMP CleavageSites


Enzymatic Assays

Linear peptide embodying Lys (DAC) and Lys (MC) at Nand C terminus revealed to be slightly hydrophobic. A stocksolution of peptide in DMSO had yet to be achieved. Finalconcentration of DMSO (0.04–0.01% v/v) in the assaysolution should not interfere with enzyme performance(37).

Peptides were treated with 2 nM of each activatedenzyme (MMP 1, MMP 2 and MMP 9). Initial rates ofhydrolysis were determined at various peptide concentrations. Data were used to construct Lineweaver Burk plots inorder to calculate kcat and Km (Fig. 3).

The second order rate constant, kcat/Km, was determined for each enzyme and each substrate (Table V).

Suprisingly, S1 from collagenase 1 natural substratesequence exhibited a high affinity for gelatinases MMP2and MMP 9. kcat/Km values were, respectively, 5.0*106

M 1.s 1 and 3.4*106M 1.s 1 for MMP 2 and MMP 9.This represents a 20 fold increased ratio for MMP 2 and14 fold for MMP 9 with regard to MMP 1 (2.5*105M 1.s 1). S2 did not undergo significant cleavage when treatedwith MMP 1. As expected, S2 is three times morerecognized by MMP 2 with respective values 6.1*105M 1.s 1 and 1.9*105M 1.s 1 for MMP 2 and MMP 9. Similar

to S2, S9 did not undergo significant cleavage when treatedwith MMP 1, while there is no significant differencebetween MMP 2 and MMP 9 (respectively, 6.2*104M 1.s 1 and 3.8*104M 1.s 1). Thus, S2 and S9 exhibited a verygood selectivity for gelatinase family (MMP 2 and MMP 9),and S2 offers a good specificity for MMP 2. The use ofcoumarin modified amino acids seems to play a key role inthe affinity of these peptides to the enzyme catalytic site.

When focusing on cyclic peptides, we could observe thatSc1 cleavage properties versus MMP 1 were roughlyunchanged compared with S1 (1.7*105M 1.s 1). However,interestingly, MMP 2 and MMP 9 activities on this derivative were notably decreased with respect to kcat/Km

6.1*105M 1.s 1 and 6.9*105M 1.s 1.While almost no selectivity could be observed between

the three MMP towards Sc9, cyclic peptide Sc2 was onlyrecognized by MMP 9.

Indeed, no significant cleavage was observed either withMMP 1 or MMP 2, while kcat/Km ( 9.3*105M 1.s 1) isonly two times less than the value of linear form versus thisenzyme.

Table IV Cyclic Substrates Yields from On Resin (A) and In Solution (B)Cyclisations

Compound Sequence Yield %

A B

Sc1 Cyclo[GPQGLLGAK(DAC)GPQGLLGAK(MC)E]

2.6 3.5

Sc2 Cyclo[PPGAYHGAK(DAC)PPGAYHGAK(MC)E]

23

Sc9 Cyclo[GPGGVVGPK(DAC)GPGGVVGPK(MC)E]

5.8 11

Fig. 1 Synthesis of linear MMP 1,MMP 2 and MMP 9 substrates.Fmoc Ala Wang preloaded resinwas used for synthesis.

Table III Sequences of Novel Substrates

Compounds Sequences Yields

S1 H2N K(DAC)GPQG∼LLGAK(MC)A COOH 27%

S2 H2N K(DAC)PPGA∼YHGAK(MC)A COOH 46%

S9 H2N K(DAC)GPGG∼VVGPK(MC)A COOH 42%

Moustoifa et al.

These results highlight that reasonably sized novelmodified structures can reach a very high level of selectivitytowards one specific MMP.

Plasma Stability

The use of our substrate in a drug delivery system implies arelatively good stability in biological sample in order toavoid non specific release.

Fig. 2 Cyclopeptides synthesisvia in solution cyclization. 2chloro chlorotrityl resin was usedfor synthesis.

Fig. 3 Lineweaver Burk analysis of S1 hydrolysis by activated MMP 1(2 nM). Fluorometric assay monitoring at 37°C, and substrate concentration range 1 4 µM.

Table V Kinetic Parameters of Enzyme (N.S.C: No Significant Cleavage)

Substrate kcat (s1) Km (µM) kcat/Km (M 1.s 1)

MMP-1

S1 1.57 6.3 2.5*105

S2 N.S.C N.S.C N.S.C

S9 N.S.C N.S.C N.S.C

Sc1 1.09 6.3 1.7*105

Sc2 N.S.C N.S.C N.S.C

Sc9 0.28 5.4 5.2*104

MMP-2

S1 15.8 3.1 5,0*106

S2 2.84 4.6 6.1*105

S9 0.29 4.7 6.2*104

Sc1 2.19 3.39 6.5*105

Sc2 N.S.C N.S.C N.S.C

Sc9 0.18 3.1 5.6*104

MMP-9

S1 17.6 5.1 3.4*106

S2 0.96 4.9 1.9*105

S9 0.43 11.3 3.8*104

Sc1 5.11 7.4 6.9*105

Sc2 0.95 10.2 9.3*104

Sc9 0.33 6.8 4.9*104


In order to evaluate the stability, substrates were treatedwith plasma for 1 h (Fig. 4).

While linear compounds underwent rapid cleavage fromaspecific plasma proteases, cleavage kinetics for Sc1 andSc9, respectively, decreased by a 10 and 13 factor. Sc2 didnot significantly cleave during the time of assays.

Addition of activated MMP 9 (1nM) into the previousassays led to a dramatic increase in cyclic peptide hydrolysis(Fig. 5). Results correlate with the ones obtained with pureenzymes, i.e Sc1 is more sensitive than Sc2 or Sc9 to thepresence of activated MMP 9.

Results presented in Fig. 6 clearly demonstrated that,while linear S2 is immediately proteolyzed within plasma,MMP addition highlights a very specific cleavage of Sc2 byonly one MMP, MMP 9 here.

When activated MMP 1 or MMP 2 were added to themixture, peptide cleavage remained very limited. On thecontrary, hydrolysis of this specific substrate increasedsubstantially upon addition of activated MMP 9.

CONCLUSION

Proposed design of original chemical moieties highlights anovel paradigm for specific delivery at tumor areas.Original reasonably sized cyclo peptidic derivatives provedto be specifically cleaved by only one or at least selectivelyby one MMP. It has been proved that selective MMP overexpression is correlated with crucial stages or tumorprogression. Therefore, these derivatives could behave assmart delivery devices at the zone of MMP expressionunder MMP activity itself, due to their plasma stability.Our results show that other proteolytic enzymes could betargeted after optimization.

Design of delivery devices will involve either covalentbinding through glutamic acid side chain or via supramolecular design. Indeed, we have data (not published)proving that coumarine aromatic part may play an essentialrole in device stabilization through host guest interactions.

ACKNOWLEDGMENTS

Authors wish to warmly thank Dr. Pierre Voisin and Dr.Philippe Mellet for helpful discussions, Collectivité Départementale de Mayotte, Conseil Régional d’Aquitaine andLigue Contre le Cancer for financial support.

Fig. 4 Substrates digestion in plasma. Peptides were treated for 1 h with4 µl crude plasma.

Fig. 5 Addition of 1nM activated MMP 9 to assay described Fig. 5. After1 h digestion with plasma, activated MMP 9 was added to Sc1 and Sc9plasmatic assay.

Fig. 6 Stability of S2 and Sc2 in plasma and subsequent treatment withMMP 1, MMP 2 or MMP 9. After 1 h plasma digestion, activated MMP 1,MMP 2 or MMP 9 was added to Sc2 assay.

Moustoifa et al.

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Les métalloprotéases de la matrice extracellulaire (MMPs) sont une famille

d’enzymes responsables de la dégradation de la matrice extracellulaire. Elles jouent

un rôle important à tous les stades du développement tumoral, de la prolifération des

cellules cancéreuses à l’émission de métastases. Elles sont donc une cible biologique

de choix pour contrôler ou imager les processus tumoraux. Dans le travail présenté,

nous avons développé de nouveaux substrats fluorescents sélectifs et spécifiques des

MMPs, qui ont permis de suivre l’activité protéolytique de ces enzymes. Ces substrats

sont stables en présence de plasma. Nous avons entrepris des études de complexation

afin d’intégrer ces substrats d’un nouveau genre dans des systèmes supramoléculaire

de libération contrôlée de principe actif.

Mots clés : MMP, métalloprotéases, matrice extracellulaire, MEC, substrat,

fluorescent, FRET, coumarine, cyclodextrine, complexation, peptide cyclique

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