UNIVERSITE de CAEN/BASSE-NORMANDIE U.F.R. : Institut de Biologie Fondamentale et Applique Ecole Doctorale Normande Chimie-Biologie THESE prsente par Melle Estelle LE BIHAN et soutenuele 20 novembre 2006 en vue de l'obtention du DOCTORAT de l`UNIVERSITE de CAEN Spcialit : Sciences Agronomiques, Biotechnologies Alimentaires (Arrt du 25 Avril 22) Jalorisation des co-produits issus de la pche des cphalopodes : applications la seicheSepia officinalis Membres du jury : M. BOLETZKYDirecteur de RechercheCNRS, Observatoire ocanologique de Banyuls(Rapporteur) M. GUERRADirecteur de RechercheInstituto de Investigaciones Marinas de Vigo(Rapporteur) Mme. GUERARDMaitre de ConfrencesUniversit de Bretagne Occidentale M. LEBELProfesseurUniversit de Caen M. MATHIEUProfesseurUniversit de Caen M. KOUETAMatre de Confrences HDRUniversit de Caen (Directeur de thse) Avant propos }c.ovnviccnc.icnonvic.cvvcn.c,^on.icv)ov..inc)ovcv,^vicvc.on{ccn.c, 1I)vvni.c.icvc(vcn,vvovovnv.oi{vivc.ov.ic..cnvoovc.ccvonvincvcv c.nc.nc. 1n.vic, ov nv.oi cn.vvcc vcvi. vn., vv v.c. vc .vc non oivoic, vi. cn I1/ c cnn.c.c..on.ci.,.on.ovicnc.v.on{ivn.con.onivc.vvcvi.vionvc.cv.vi./v..i,]c .ovnvicqviov.ci.i,c_c..ionvcnc.cnc.icncn.c.v..in.c.cccnoinvcvcnv vivvc. }c .vi. c.onnvi..vnc v ^on.icv ^i.nc ^vnicv, Iic.cv vv vovoic, ov nv.oi v..vcii vv.cinvvvovoicvciooiccioc.nnooic.^vinc.,+^)1001{cnc,Tn,.iooicc 1.on,.iooic vc. ^ov.qvc. ^vin. vc vni.c.ic vc (vcn, ov .on .on.ov. v non .onic vc iovc c ov .v vi.ivion v .c ]v, vc n.c. Qvc^on.icvivv(onoc:[,,Iic.cvvcc.nc.ncvv())vO.c.voic O.cvnooiqvcvcvn,v.,vovoic/vo,c,oi.cni.inc.v..i{.cnc.icncn.ovnv.oi{vi nonncv vv..cc vc ]vc .c v.vi cn cvn vocv vc .cc n.c. }ccnc.ic.i.cncn^on.icv/ncvcv,Iic.cvvcc.nc.ncv1n.ivovc 1n.c.iv.ionc. ^vinv. vc (io, ov v.oi v..cc vc ]vc .c v.vi cn vn qvc vocv.}c.ovvvi.cnc.ic^vvvncIvicnncvcvv,^vicvc.on{ccn.c.vvni.c.icvccvnc O..ivcnvc, ov v.oi v..cc vc ]vc .c v.vi c vc vi.ic vv ]v, vc nv n.c.}cvc.icc_incovcnvc.c.vcv.cc.onnvi..vn.cv^on.icv}cvn^v.cc,To{c..cvv vni.c.ic vc (vcn, ov nv.oi cni. vc. .ovovion. v.c. c ^v.c To{c..ionnc 1_oivion vc. )c..ov.c.(i.vnc.(ic.,ovv.oi.onivcvvncvicvcnc.c.nc.nc.vv.ov.vcnoc .ovovion.on.cnvnvc.nc.ncvcnoc.vc.iov.i.c.vvn.c.cn.ivc.,ov.vvnvc vi.oniiic c ov v.oi v..cc vc ]vc non v.vi vc n.c.}c.ovnviccnc.ic1qvicvc)c.nc.nccnTn,.i.o(niniccioc.nnooic.,1+Icnic (niniqvccnic vc. 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(c. vnncc. v..cc. cn.cnc. .con inovivc. vc v c. v.cnvc. qvc nov. v.on. .c.vc. : c. .oic. v. ov noin. no.vnc. v v c.nc.nc, v. ov noin. {v.vcv.c, vc .c vninv v .ci.nc civ o{{i.invi., c.vnvc vc. .c. nonvnvc. vvn. c.oi vc ov.c c. vc. vc vi.in. noi. , v {vi.vionccvn.ovi.vicncn.vi..vncovovnvcnc.,.v.,cccncnvvvc. cicic../.c. ^on.icv cnvnc Iovc, v.vccncn cvvivn cn n.c vv vovoic, qvc vc .ncnin nov. v.on.v.ovvvcvi.2vn..)o.noncv.c..ovovion..vc.vvvii{.vincnvic.cvi..v..ion. vi.c.c.nonccc.icv.c..on.ovicnnov,c.nniqvcc..icni{iqvcvin.iqvc.onvniicnoncc vvnc vivc inovnc. Qvi ov.c i.i c_c..ion vc non vniic v v. .in.c. }v.c vnc .no.c cnvnc : v v. 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(/1() vc vni.c.ic vc (vcn,, .oi v..vc vc non in{inic vivvc ov .on vivc c..cnicc v ocnion vv {invn.cncn vc .c v.vi c vv o]c 1T21 , nvi. vv..i ov .on v..onvncncn vv .ov. vc .c. vcnic. vnncc. vv_ noncv.c. cn.onc. v.c. c. invv.ic. c vv_ .onic. vc iovc vv o]c 1T21. c. .on.ci. v.i.c., .c. cn.ovvcncn. c .v vnvc vi.oniiic oncni.vcoc.cv.viicnvvvcvvv.vvcvvvovoic./v..i,]c.ovnvicqviov.ci.i c_c..ion vc ovc nv c.onnvi..vn.c c c cnoinvc vc non vniic. }cicn.vcnc.ic.in.cncn^on.icvvvcnToin,Iic.cvvcin.vvcvvcv..c)onvnvic,c^vvvnc^vincvvvv.non,(nvcvv{{vic.vcO.co/)(/)(/cn.c)vionvc (/oi.vion vc v )c.nc.nc), ov inc qvi. on oc v .c v.vi vin.i qvc ov cv. vi.ivion. c{{i.v.c. c .on.v.i.c. vv .ov. vc. vi.c. .onic. vc iovc vv o]c 1T21.+n vnv nc.i v ^vvcnoi.cc /nnc onic ^vinc:, ^vic vc .on{ccn.c. v vni.c.ic vc (vcn, ovvivcvvcvv.ionvc.cv.vicov.c.noncv_.on.ci.c.vic../v..i,]c.ovnvicqvcc ov.c i.i c_c..ion vc ovc nv c.onnvi..vn.c. Qvc^on.icv)oc(ivnvc.v,.nc.ncvivvicv1n.ivovc(i.ic.vc^vvcv.conc, c,oi.c nc. cnc.icncn. ov nv.oi c,vc vvn. .on vovoic.}vvc..cnc.cnc.icncn.v^vvvnc^vicTvvc(ni.nc,c^on.icvIvn.[c.o,, c.c.i.cncnvn.icnncIic.i.ccv.vcIic.cvvv(cncvc)c.nc.nccn1n.ionncncn(ic (()1() vc v. .v ^c, ov nv.oi cni. vvii.c c. vncnvcncn. nc.c..vic. v nc. cc.vc..}cicn.vcnc.iccn.cncvvc.onncc.nniqvcvv(cncvc)c.nc.nccn1n.ionncncn (ic vc v. .v nc ov c. nvic. inc.cnion. qvc nc.c..icn c. cc.vc. c cv ni.c cn v.c. Qvc^vvvncvnvvinvvn,Ic.nni.icnncvvvovoic,ov.onvivcc.icv.cc.vonnc nvncv, ov.c i.i c_c..ion vc nv .,nvnic.Qvc ^on.icv (ni.onc )oc, Ic.nni.icn vv vovoic, .oi cnc.ic ov .on .ovicn c.nniqvc. }c.ovvvi.cnc.ic(cincvvnvonnccvnvcInonv.,Ic.nni.icn.cnvviooc.ionvcv .v.vc1^O1)1vcvni.c.icvc(vcnovcvv..vci.on.i.ivccv.on.cicncncvc vviooc.ion.^c.i v ^on.icv Ivn.i. O.vin c v ^vvvnc (oivc 1vvc., ^vic vc .on{ccn.c. v vni.c.ic vc (vcn, ov cv cnic..c c ov nv.oi cni. vc {vic vc. .v.vion. cn ni.ooic vninvc vin.i qvcn n,.iooic vninvc.^c.i v ^vvcnoi.cc (ni.cc c.c., 1ncnicv nviion.vnc, qvcc ov.c i.i c_c..ion vc non vniic ov .v onnc nvncv, .v vi.oniiic, .v onvc vniic c ov nv.oi v.i.cncn vivc vvn. v cvv.ion vc .cc n.c.}c icn. v cnc.ic ^vvcnoi.cc }vicc )o,c, /I1) v vni.c.ic vc (vcn, ov .c. .on.ci. .v vii.vion vv oi.ic )vionv 1n.vncn (i.ion /..i.vn .0. v .ovovion vc.cocc v.c. ^on.icv (ni.onc Icv,, v.vccncn cn n.c vv vovoic, vcc.{v.vcv.cc.,nvniqvc.c..onccn.c.c.onv.nvncncnnov.oncni.vocnivc. c.vv. icn vvvcv vc nc. c.cvn.c.. Qvi .oi v..vc vc non vniic.}ccnc.ic^on.icv}cvn.c.ovi.,)c.on.vcvv.c.i.ciooiqvcc^on.icvIcvci. 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Icvnno,, Iic.cv c.nniqvc, ov v.oi v..cc vc {viqvc vc. c.cic. vcn.ivc. vc .ci.nc vvn. .on cnci.c c ov inc oc v .c v.vi.}cicn.vcnc.icc..ncv.o.vv_ccnvi.vic^c..icv.vic(vn.ic),vcnon, vn.ic),(nv,v(vn.ic),c.onv(Tocnc..in),Ic.nvc(Ovi.cnvn),(v,c(Iov.ic)qvi noncni.vocnicnvvnv.icv..vi.on.vc..ci.nc..i.vnc.,invi.cn.vc.,nvi.vv.onicn vi{{i.ic v ocni, ov v cvi.vion vc .c v.vi.}c icn. v cnc.ic cn.cnc vv c.onnc vv vovoic ov .c. vcvc. vnncc. v..cc. cn.cnc.}ccnc.ic^vvcnoi.cc(ni.cc/.c.,^vvcnoi.cc1.vccvvov,,^on.icv)i.ov. vinvoc,^on.icv}vicn(cc.inc,cvvivn.vvvovoicvcTn,.iooicvv(onocncnvc. (cnvoovc., ov c. noncv_ c.nvnc. .on.cnvn c. .cnvoovc..Qvcc.cvvivn.,^c.vcnoi.cc./inc(ovon,v.ic^vic,/nc.^c.on,/vcic^on.vi, 1cnc (ivv c ^c..icv. Inonv. o,c, coc. v{i, cn]vnin Inonv., ^vnicv Iio, qvc ]vi c,v. cn .vc, c,oi.cn ov. nc. cnc.icncn. ov inncn.c vivc qvi. non voc vv vovoic .onnc .v c cvin.}c cnc.ic .i.cncn ov. c. cvvivn. v.vc c v..c vv vovoic qvi on vninc vv qvoivicn .c. noncv.c.vnncc..}cicn.cnvi.vicvcnc.ic/vn,/nvnvinc,/ninc,/nnc(voinc,/ncc, /vvc,cnoi,i.c,(ni.onc,Icovn,1ncinc,1niic,1niic,cvvinc,1c.c,}vicc,}vio, )vinc, vvcn.c, cnvnc, Inonv. ov c. noncv.c. vv.c. .v{c c vi..v..ion vvcc.. 1n{in,]cicn.vcnc.icnv{vnicccnvi.viccv.icnvv.oi.vcnnoicvcnv.oi .ovcnvc vv .ov. vc .c. onvc. vnncc. vcvvc.. Cette tude a t co- finance par l`Instrument Financier pour l`Orientation de la Pche (IFOP) Cette tude a fait l`objet d`une Etape de Pr- Incubation et Innovation (EP2I) finance par le Fonds Europens de Dveloppement Rgional (FEDER) et la Rgion Basse Normandie. Cette tude a fait l`objet d`un dpt de brevet. Instrument Financier pour l`Orientation de la PcheInstrument Financier pour l`Orientation de la Pche Publications : 1.PerrinA.,LeBihanE.,KouetaN.,(2004).ExperimentalstudyoIenrichedIrozendieton digestiveenzymesandgrowthoIjuvenilecuttleIishSepiaofficinalisL.(Mollusca Cephalopoda). Journal of Experimental Marine Biologv and Ecologv. 311: 267-285. 2.LeBihanE.,PerrinA.,KouetaN.,(2004).DevelopmentoIabioassayIromisolated digestiveglandcellsoIcuttleIishSepiaofficinalisL.:eIIectoIZn,CuandAgondigestive enzyme activities. Journal of Experimental Marine Biologv and Ecologv. 309: 47-66. 3.Le Bihan, E., Zatylny C., Perrin, A., Koueta N. (2006). Studies oI post-mortem evolution oI cuttleIishvisceraduringtheirstorageattwodiIIerenttemperatures.Foodchemistrv.98:39-51. 4.LeBihanE.,PerrinA.,KouetaN.,(2006).InIluenceoIdietpeptidecontainonsurvival, growth and digestive enzymes activities oI juvenile cuttleIish Sepia officinalis. Jie et Milieu- Life and Environment. 56 (2): 139-145. 5.LeBihanE.,PerrinA.,KouetaN.,(2006).EIIectoIdiIIerenttreatmentsonthequalityoI cuttleIish (Sepia officinalis L.) viscera. Food chemistrv. Acceptee. 6.FroulS.,LeBihanE.,KouetaN.,DrapaniotisO.,PhamD.,Nicolas1.L.,(2006).How commercialmicrobialpreparationsbasedonLactobacillicanaIIectdigestivemetabolismoI seabass(Dicentrarchuslabrax)juveniles?JournalofMolecularMicrobiologvand Biotechnologv. Acceptee. 7.LeBihan,E.,Gimazane,1.P.,Lebel,1.M.,KouetaN.,(soumise).EIIectsoIIood supplementationwithdiIIerentpercentageoIsilageonsurvivalandgrowthinexperimental rearing oI post-larvae shrimps Penaeus faponicus. Aquaculture. 8.LeBihan,E.,Froul,S.,Gimazane,1.P.,Serpentini,A.,Lebel,1.M.,Nicolas,1.L., KouetaN.,(enpreparation).ImpactoIlysatesupplementationindietwhenIedtojuvenile sea bass Dicentrarchus labrax. Aquaculture. 9.Le Bihan E., Corroler, D., Barillier, D., Koueta N., (en prparation). Used oI silage as cell culture medium Ior bacteria.. Current Microbiologv. 10.Fleury, C., Le Bihan E. (co-authors), Froul, S., Serpentini, A., Lebel, 1. M., Koueta N., (enprparation).EIIectoIsilagesupplementationoncellculturemediumhemocytes.Fish and shellfish immunologv. 11.LeBihanE.,Froul,S.,Serpentini,A.,Gimazane1.P.,Lebel,1.M.,Nicolas1.L., KouetaN.,(enprparation).ModulationoIdigestiveandimmunitysystemsontogenyby dietsupplementationintheseabassDicentrarchuslabrax.PhvsiologicalandBiochemical Zoologv. Sommaire : INTRODUCTION GENERALE1 IDESCRIPTION DE L`ESPECE ETUDIEE : SEPIA OFFICINALIS (LINNE, 1758)3 Generalites ........................................................................................................... 3 1.ClassiIication3 2.Habitat et mode de vie3 3.Exploitation de la seiche en Manche4 Anatomie et physiologie de la seiche Sepia officinalis........................................ 5 1.Le cephalopodium5 2.Le visceropallium6 3.L`appareil reproducteur6 4.L`appareil digestiI7 IICONTEXTE GENERAL DE L`ETUDE8 IIIBUT DE L`ETUDE9 CHAPITRE 1 : ETUDE DU MATERIEL BIOLOGIQUE11 IINTRODUCTION13 A.Contexte economique.............................................................................. 13 1.Les produits de la pche13 2.La seiche13 B.Voies de valorisation de la masse viscerale de la seiche ........................ 14 1.Les enzymes14 2.Les huiles15 3.Les lysats15 IIETUDE DE LA QUALITE BIOCHIMIQUE DES VISCERES17 A.Etude de l`evolution post-mortem des visceres de seiche ...................... 17 1.Introduction19 2.Materials and methods20 a.Biological material ........................................................................ 20 b.En:vme extraction.......................................................................... 21 c.En:vmatic assavs............................................................................ 21 d.pH. ................................................................................................. 22 e.TCA soluble protein and protein content ....................................... 22 f.Molecular weight of proteins and peptides .................................... 22 g.Statistical analvsis ......................................................................... 23 3.Results and discussion23 a.Intracellular en:vme specific activitv change................................ 23 b.Extracellular en:vmes specific activitv change ............................. 26 c.pH changes..................................................................................... 34 d.TCA soluble protein changes......................................................... 34 e.Molecular weight of proteins and peptides changes...................... 34 4.Conclusion35 B.Etude de diIIerents traitements sur la qualite des visceres de seiche...... 38 1.Introduction40 2.Material and methods41 a.Biological material ........................................................................ 41 b.Analvsis.......................................................................................... 42 c.Statistical analvsis.......................................................................... 45 3.Results and discussion45 a.pH................................................................................................... 45 b.TCA soluble proteins ..................................................................... 46 c.Molecular weight of proteins and peptides.................................... 47 d.Extracellular en:vme specific activitv. .......................................... 48 e.Specific activitv of intracellular en:vmes....................................... 49 f.Fattv acid composition ................................................................... 50 g.Biochemical composition............................................................... 52 4.Conclusion52 IIIPREPARATION D`ENSILAGES ET EFFET DU STOCKAGE54 A.Introduction............................................................................................. 54 B.Materiel et methodes............................................................................... 54 1.Materiel biologique54 2.Fabrication des ensilages54 3.Analyses55 a.pH................................................................................................... 55 b.QuantitedeproteinesTCA(acidetrichloroacetique)solubles et de proteines....................................................................................... 55 c.Poids moleculaire des proteines et peptides.................................. 55 d.Contenu en acides amines.............................................................. 55 e.Digestibilite des proteines in vitro................................................. 55 f.Extraction des en:vmes et dosages................................................. 56 Resultats............................................................................................................. 57 Discussion.......................................................................................................... 63 IVCONCLUSION69 CHAPITRE 2 : VALORISATION DES ENSILAGES EN TANT QUE MILIEUDECULTUREPOURMICRO-ORGANISMES :TESTSIA JI1RO.71 IINTRODUCTION73 A.Les micro-organismes ............................................................................. 73 B.La culture des micro-organismes ............................................................ 74 C.Choix et presentation des micro-organismes .......................................... 76 1.Pseudomonas aeruginosa76 2.Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae76 3.Escherichia coli77 4.Proteus mirabilis et Proteus vulgaris77 5.Lactococcus lactis subsp lactis77 6.Bacillus subtilis subsp subtilis78 7.Saccharomvces cerevisiae78 IIMATERIEL ET METHODES79 A.Micro-organismes ................................................................................... 79 B.Milieux de culture ................................................................................... 80 C.Conditions de culture .............................................................................. 80 1.Tests preliminaires80 2.Cinetique de croissance80 D.Analyses statistiques ............................................................................... 83 IIIRESULTATS83 A. Etudes preliminaires...................................................................................... 83 B. Comparaison de la cinetique de croissance des diIIerentes bacteries........... 83 1.Peptone LBBMA2583 2.Peptone de caseine84 3.Peptone de soja85 4.Peptone de viande86 C. Cinetique de croissance des micro-organismes sur diIIerents milieux de culture................................................................................................................. 87 1.Pseudomonas aeruginosa87 2.Klebsiella pneumoniae subsp pneumoniae88 3.Escherichia coli89 4.Proteus mirabilis et Proteus vulgaris89 5.Lactococcus lactis subsp lactis90 6.Bacillus subtilis subsp subtilis91 7.Saccharomvces cerevisiae92 IVDISCUSSION93 VCONCLUSION97 CHAPITRE3 :VALORISATIONDESENSILAGESEN NUTRITION ANIMALE : TESTS IA JIJO.101 IINTRODUCTION103 IIMOLLUSQUES104 A.Introduction........................................................................................... 106 B.Material and methods............................................................................ 107 1.Enrichment characteristic and prey enrichment107 2.Rearing108 3.Growth parameters108 4.Assays108 a.Extraction..................................................................................... 108 b.En:vmatic assavs ......................................................................... 109 c.Molecular weight of proteins and peptides.................................. 109 d.Protein contents ........................................................................... 110 e.Prev composition.......................................................................... 110 5. Statistical analysis111 C.Results................................................................................................... 111 1.Molecular weight oI proteins on silage111 2.Growth parameter111 3.Enzymatic activity113 4.Preys composition113 D.Discussion............................................................................................. 114 E. Conclusion................................................................................................... 116 IIICRUSTACES120 A.Introduction........................................................................................... 122 B.Materials and methods .......................................................................... 124 1.Biological material124 2.Rearing method124 3.Diet 124 4.Statistical analysis125 C.Results................................................................................................... 125 D.Discussion............................................................................................. 128 IVPOISSONS134 A.Introduction........................................................................................... 134 B.Materiel et methodes............................................................................. 137 1. Materiel biologique137 2. Methode d`elevage138 a.Experimentation 1........................................................................ 138 b.Experimentation2......................................................................... 138 c.Experimentation 3........................................................................ 139 3. Suivi zootechniques139 4. Mesure des indices de condition140 a.Facteur de condition FC.............................................................. 140 b.Indice Hepato-Somatique IHS ..................................................... 140 c.Indice Jiscero-Somatique IJS ..................................................... 140 d.Observation des malformations................................................... 140 5. Analyse de la qualite biochimique de la chair141 6. Analyses statistiques141 C.Resultats ................................................................................................ 141 1. Suivis zootechniques141 a.Experimentation 1........................................................................ 142 b.Experimentation 2........................................................................ 144 c.Experimentation 3........................................................................ 146 2. Mesure des indices de condition149 a.Experimentation 1........................................................................ 149 b.Experimentation 2........................................................................ 149 c.Experimentation 3........................................................................ 149 3. Analyse de la qualite biochimique de la chair150 D.Discussion............................................................................................. 150 VCONCLUSION156 CHAPITRE4 :RECHERCHEDEMOLECULESBIO-ACTIVES DANS LES ENSILAGES159 IINTRODUCTION161 IIRECHERCHE DE MOLECULES IMPLIQUEES DANS LA CROISSANCE162 A.Introduction........................................................................................... 162 B.Materiel et methodes............................................................................. 163 1. Materiel biologique163 2. Isolation des cellules de la glande digestive164 3. Mesure de la viabilite des cellules165 4. Dosage des activites enzymatiques165 5.Dosagede l`incorporation de la leucine 3H, des acides amines 3H et de la thymidine 3H166 6. Analyses statistiques167 C.Resultats ................................................................................................ 167 1.Mesure de la viabilite des cellules167 2.Dosage des activites enzymatiques168 3.Dosage de l`incorporation de la leucine 3H, des acides amines 3H et de la thymidine 3H170 D. Discussion ................................................................................................... 171 IIIRECHERCHE DE MOLECULES IMPLIQUEES DANS LA DIGESTION176 A.Introduction........................................................................................... 176 B.Utilisationd`unbio-essai"Artemie"pourlacaracterisationde molecules a activites secretagogue .................................................................. 177 1. Introduction177 2. Materiel et methodes178 a.Materiel biologique...................................................................... 178 b.Analvses en:vmologiques............................................................. 180 c.Techniques separatives et preparation des produits et fractions a tester................................................................................................. 181 d.Extraction..................................................................................... 181 e.Digestion des proteines................................................................ 181 f.Separation des proteines en fonction de leur poids moleculaire.. 181 g.Analvses statistiques .................................................................... 181 3. Resultats181 a.Effet dose des ensilages ou molecules testees sur lactivite des en:vmes digestives .............................................................................. 181 b.Caracterisationdesmoleculesimpliqueesdanslastimulation de lactivite des en:vmes digestives.................................................... 183 c.Caracterisationdesfractionsproteiquesimpliqueesdansla stimulation de la secretion des en:vmes digestives ............................ 184 4. Discussion187 C.Etudeexperimentaledelaregulationdeladigestionchezles juveniles de bars Dicentrarchus labrax........................................................... 192 1. Introduction192 2. Materiel et methodes192 a.Materiel biologique...................................................................... 192 b.Analvses en:vmologiques............................................................. 193 c.Histologie et microscopie electronique........................................ 193 d.Analvses statistiques .................................................................... 195 3. Resultats195 a.Analvses en:vmologiques............................................................. 195 b.Histologie et microscopie electronique ....................................... 197 4. Discussion203 D. Conclusion .................................................................................................. 211 IVRECHERCHEDEMOLECULESBIOACTIVESSURLESYSTEME IMMUNITAIRE212 A. Introduction................................................................................................. 212 B.Actiondel`enrichissementLBBMA25surlesystemeimmunitairede juveniles de bars Dicentrarchus labrax........................................................... 214 1. Introduction214 2. Materiel et methodes217 a.Materiel biologique...................................................................... 217 b.Histologie..................................................................................... 217 c.Dosages des activites immunitaires ............................................. 217 c. Analvses statistiques ....................................................................... 219 3. Resultats219 4. Discussion224 C.Recherched`eIIetsbiologiquesdesensilagessurdeshemocytes d`ormeaux Haliotis tuberculata....................................................................... 230 1. Introduction230 2. Materiel et methodes232 a.Materiel biologique...................................................................... 232 b.Les cultures primaires ................................................................. 232 c.Preparation des echantillons ....................................................... 233 d.Histologie..................................................................................... 233 e.Mesuredessurfacescvtoplasmiquesetdelaproportiondes differents tvpes dhemocvtes ............................................................... 234 f.Analvses des activites immunitaires ............................................. 234 g.Analvses statistiques .................................................................... 235 3. Resultats235 4. Discussion249 D. Conclusion .................................................................................................. 255 V.CONCLUSION256 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES259 BIBLIOGRAPHIE267 Abrviations : ADN: Acide DesoxyriboNucleique ADP: Adenosine Di Phosphate ANOVA: ANalasis OI VAriance between groups ARN: Acide RiboNucleique ARNm: Acide RiboNucleique Messager ATCase: Aspartate TransCarbamylase BAPNA: Benzoyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide BES: Bis(2 hydroxyethyl)-2 -aminoEthaneSulIonic BSA: Bovine Serum Albumin CCK: CholeCystoKinine CIP: Collection de l`Institut PasteurCREC: Centre de Recherche en Environnement Ctier DMSO: DiMethyl SulIOxide DO: Densite Optique EDTA: EthyleneDiamine-Tetraacetique Acid EGF: Epidermal Growth Factor FAME: Fatty Acids Methylated ExtractFC: Facteur de ConditionGRAS: Generally Regarded As SaIe IFOP: Instrument Financier pour l`Orientation des Pches IGF: Insuline Growth Factor IHS: Indice Hepato-Somatique IVS: Indice Viscero-Somatique LDH: Lactate DesHydrogenase L-DOPA: L-DihydrOxyPhenylAlanineMET: Microscopie ElecTronique MTT: 3- 4, 5- diMeThylthiazol- 2- yl- 2, 5- diphenyl Tetrazolium NADH: Nicotinamide Adenine Dinucleotide reduced Iorm OD: Optic Density PCB: PolyChloroBiphenyle PEP: PhosphoEnolPyruvate SD: Standard DeviationSDS PAGE: Sodium Dodecyl SulIate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis TCA: Trichloroacetic acid TSB: Tryptic Soy Broth UMIP: Collection des Champignons de l`Institut Pasteur Index des figures : Figure 1: Cycle de migration de Sepia officinalis (Boucaud-Camou and Boismery, 1991).4 Figure2:Debarquements(entonnes)deseichesenMancheparpaysexploitantentre1996et 2003 (Anonyme, 2005).5 Figure3:SectiontransvervaledeSepiaofficinalismontrantlesstructuresetorganesqui constituent le visceropallium (modiIiee d`apres Mangold et al., 1989).6 Figure4:Vueventraledel`appareilgenitalIemelledeSepiaofficinalis(modiIieed`apres Mangold et al., 1989).7 Figure5:Schemadu systeme digestiI de Sepia officinalis (modiIie d'apres Mangold et Bidder, 1989).8 Figure6:MethodedetransIormationdelaseicheselonlamethodeitalienne.Ex.Cooperative Granvilmer (Basse Normandie, France).14 Figure 7: Systeme Iabrication de Iarines, autolysats, ensilages ou hydrolysats.15 Figure8:CathepsinspeciIicactivityincrudeextractsoI cuttleIish digestive viscera during the Iirst 24 hours oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).24 Figure9:CathepsinspeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestivevisceraduring4 months oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).24 Figure 10: Total acid proteases speciIic activity in crude extracts oI cuttleIish digestive viscera during the Iirst 24 hours oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).26 Figure 11: Total acid proteases speciIic activity in crude extracts oI cuttleIish digestive viscera during 4 months oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).26 Figure12:TotalalkalineproteasesspeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestive visceraduringtheIirst24hoursoIstorage(oImaximalactivity)attwodiIIerent temperatures(-4Cor--25C).Pointsnotbearingthesamesuperscriptletterare signiIicantly diIIerent (p 0.05).27 Figure13:TotalalkalineproteasesspeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestive viscera during 4 months oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).28 Figure14:TryspinspeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestivevisceraduringthe Iirst 24 hours oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).29 Figure15:TryspinspeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestivevisceraduring4 months oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).29 Figure 16: Chymotrypsin speciIic activity in crude extracts oI cuttleIish digestive viscera during the Iirst 24 hours oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or --25C).PointsnotbearingthesamesuperscriptletteraresigniIicantlydiIIerent(p 0.05).30 Figure 17: Chymotrypsin speciIic activity in crude extracts oI cuttleIish digestive viscera during 4monthsoIstorage(oImaximalactivity)attwodiIIerenttemperatures(-4Cor-- 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).31 Figure18:LipasespeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestivevisceraduringthe Iirst 24 hours oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).31 Figure19:LipasespeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestivevisceraduring4 months oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).32 Figure 20: Amylase speciIic activity in crude extracts oI cuttleIish digestive viscera during the Iirst 24 hours oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).33 Figure21:AmylasespeciIicactivityincrudeextractsoIcuttleIishdigestivevisceraduring4 months oI storage ( oI maximal activity) at two diIIerent temperatures (- 4C or - - 25C). Points not bearing the same superscript letter are signiIicantly diIIerent (p 0.05).33 Figure 22: a) Calibration graph oI molecular weight Ior Pharmacia G25M PD 10 Sephadex. b) EIIectoIstoragetemperatureonmolecularweightoIpeptidesandproteinsbetweenthe cuttleIish death to 24 hours.0 minutes, 24 hours at 4C, - - 24 hours at 25C.35 Figure23:SchemaexplicatiIdesresultatsobtenusconcernantl`evolutionpost-mortemdela qualite des visceres de seiches.37 Figure 24: a) Calibration graph oI molecular weight Ior Pharmacia G25M PD 10 Sephadex. b) ElutionproIileoIpeptidesandproteinsinvisceraIromlivecuttleIish.,visceraIrom auction - - -, viscera Irom Iactories ..47 Figure 25: Elution proIile oI peptides and proteins in viscera (absorbance at 280 nm).48 Figure26:SchemaexplicatiIdesresultatsobtenusconcernantl`impactdustockageetdela transIormation sur la qualite des visceres de seiches.53 Figure 27: a) Calibration de la colonne Pharmacia G25M PD 10 Sephadex. b) Poids moleculaire des proteines et peptides dans les ensilages Iabriques a 4C a 0 jours:, 2 mois: , 8 mois: ou 12 mois: apres production.58 Figure28:PoidsmoleculairedesproteinesetpeptidesdanslesensilagesIabriquesa25Ca0 jours: , 2 mois: , 8 mois: ou 12 mois: apres production.58 Figure29:SchemaexplicatiIdesresultatsobtenusconcernantlaIabricationdesensilagesde visceres de seiches.68 Figure 30: Structure typique d`une bacterie (Purves et al., 2006).73 Figure 31: Schema d`une levure (Guery and Mcirdi, 2006).74 Figure 32: Table d`agitation permettant la culture des micro-organismes.81 Figure 33: Technique turbidimetrique de la mesure de la biomasse (Delignette-Muller, 1995).82 Figure 34: Schema d`une cinetique theorique simpliIiee de croissance d`un micro-organisme.82 Figure 35: Cinetique de croissance des bacteries sur le milieu de culture peptone de LBBMA25.84 Figure 36: Cinetique de croissance des bacteries sur le milieu de culture peptone de caseine.85 Figure 37: Cinetique de croissance des bacteries sur le milieu de culture peptone de soja.86 Figure 38: Cinetique de croissance des bacteries sur le milieu de culture peptone de viande.87 Figure39 :CinetiquedecroissancedelabacteriePseudomonasaeruginosasurdiIIerents milieux de culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.88 Figure 40 : Cinetique de croissance de la bacterie Klebsiella pneumoniae sur diIIerents milieux de culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.88 Figure41 :CinetiquedecroissancedelabacterieEscherichiacolisurdiIIerentsmilieuxde culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.89 Figure42 :CinetiquedecroissancedelabacterieProteusmirabilissurdiIIerentsmilieuxde culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.90 Figure43 :CinetiquedecroissancedelabacterieProteusvulgarissurdiIIerentsmilieuxde culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.90 Figure44 :CinetiquedecroissancedelabacterieLactococcuslactissurdiIIerentsmilieuxde culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.91 Figure45 :CinetiquedecroissancedelabacterieBacillussubtilissurdiIIerentsmilieuxde culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.92 Figure 46 : Cinetique de croissance de la levure Saccharomvces cerevisi sur diIIerents milieux de culture. LBBMA25 Caseine SojaViande.92 Figure47:Synthesedesresultatsobtenusconcernantl`utilisationdesensilagesentantque peptones pour micro-organismes.99 Figure48-CalibrationgraphoImolecularweightIorPharmaciaG25MPD10Sephadex.b) ShrimpsproteinsmolecularweightrepartitionusinggelIiltration.:SimpleIrozen shrimps, :Frozen shrimps enriched with LBBMA4, - -: Frozen shrimps enriched with silage LBBMA25, 'clear grey bar: LBBMA4, 'dark grey bar :LBBMA25.112 Figure 49- Weight (g) and conversion rate () oI cuttleIish according to their diets. Weight oI cuttleIishIedwithsimpleIed:'whitebar,withIedenrichedwithLBBMA4:'cleargrey bar,withIedenrichedwithLBBMA25:'darkgreybar.:RationoIcuttleIishIedwith simpleIed,:withIedenrichedwithLBBMA4,--:withIedenrichedwith LBBMA25. *: SigniIicantly diIIerent Irom control (p 0.05).112 Figure 50 : Structures d`elevage des juveniles de seiches du CREC de Luc sur Mer.118 Figure51 :SchemaexplicatiIdesresultatsobtenusconcernantl`utilisationdesensilagesde visceresdeseichesenenrichissementdel`alimentationdejuvenilesdeseichesSepia officinalis.119 Figure 52 : Weight oI shrimp post-larvae according to their diet (mg) during rearing. A ) Diet A: , Diet 4-1:, Diet 4-2: , Diet 4-5: Diet 4-10: . B ) Diet A : , Diet 25-1: , Diet 25-2:, Diet 25-5: , Diet 25-10: `: SigniIicantly diIIerent Irom control diet (p0.05).127 Figure 53: Weight oI shrimp post-larvae according to their diet (mg) aIter 60 days oI rearing. A )DietenrichedwithLBBMA4.B)DietenrichedwithLBBMA25.*:SigniIicantly diIIerent Irom control diet (p 0.05).128 Figure54 :PhotodescrevettesPenaeusfaponicusapres60joursd`elevageenIonctionde l`aliment reu.132 Figure55 :SchemaexplicatiIdesresultatsobtenusconcernantl`utilisationdesensilagesde visceres de seiches en enrichissement de l`alimentation de post larves de crevette Penaeus faponicus.133 Figure 56 : Les diIIerents stades biologiques de l`elevage du bar Dicentrarchus labrax.136 Figure 57 : Photos de la structure d`elevage des juveniles de bars.138 Figure58:a)Illustrationdesmesuresdelongueur(Lt)etdelargeur(l)eIIectueessurles juveniles de bars. b) Mesure de la longueur totale (It) l`intestin apres dissection Cp : Caeca pyloriques, E : estomac, Ia : Intestin anterieur, Ip : Intestin posterieur.140 Figure59:TypesdemalIormations.A)ventrale(obesite).B)dorsale(spinose).C)operculaire (opercule absent).141 Figure 60: Correspondance poids/ge entre les 3 elevages. Elevage 1 : , elevage 2 : , elevage 3 : .142 Figure61:Evolutiondupoidsdesjuveniles(g)aucoursdel`elevage1enIonctiondes diIIerentsaliments.Temoin,LBBMA410,LBBMA2510.* : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).142 Figure 62: Photo des juveniles de bars en Iin de l`experience 1.144 Figure63:Evolutiondupoidsdesjuveniles(g)aucoursdel`elevage2enIonctiondes diIIerents aliments. Temoin,Gabolysat , PC60 ,LBBMA25 5. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).145 Figure 64: Photo des juveniles de bars en Iin de l`experience 2.146 Figure65:Evolutiondupoidsdesjuveniles(g)aucoursdel`elevage3enIonctiondes diIIerents aliments. Temoin,LBBMA25 2. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).147 Figure 66: Photo des juveniles de bars en Iin de l`experience 3.148 Figure 67: Synthese des resultats obtenus concernant l`utilisation des ensilages en complement alimentaire des juveniles de bars Dicentrarchus labrax.155 Figure68:Principedubio-essaidecellulesisoleesdeglandedigestivedeseiche(LeBihanet al., 2004).165 Figure 69: Schema de synthese de l`etude de l`eIIet des ensilages ou Iacteurs de croissance sur les cellules isolees de la glande digestive de seiche.175 Figure 70: Principe du bio-essai d`Artemia salina (Frouel et al., 2005).179 Figure71:DiIIerentsstadesdenaupliid`Artemiasalinaaucoursdesondeveloppement (Sorgeloss, 2006).180 Figure 72: a) Activite de la trypsine en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA4 teste. b) Activite de la trypsine en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA25 teste. c) Activite del`amylaseenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA4teste.d)Activitede l`amylase en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA25 teste.184 Figure 73: Repartition en poids moleculaire des proteines en Ionction de la Iraction.185 Figure 74: a) Activite de la trypsine en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA4 teste encomparaisonautemoin.b)ActivitedelatrypsineenIonctiondelaIractionde l`ensilageLBBMA25..testeencomparaisonautemoin.c)Activitede l`amylase en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA4teste en comparaison au temoin.d)Activitedel`amylaseenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA25 teste en comparaison au temoin.186 Figure 75: Schema de synthese de l`etude de l`eIIet des ensilages ou hormones sur la secretion d`enzymes digestives chez l`artemie.191 Figure 76: Illustration des segments de decoupe des juveniles de bars. T : Segment Tte , P : Segment Pancreatique (Cour, Estomac, Foie), I : Segment Intestin et Q : Segment Queue . (D`apres Cahu et al., 1994).193 Figure 77: Anatomie generale du tractus digestiI de Dicentrarchus labrax. A : Anus, Cp : Caeca pyloriques,E :estomac,F :Foie,Ia :Intestinanterieur,Ip :Intestinposterieur,O : usophage, R : Repli intestinal, V : Vessie natatoire.194 Figure 78: Calcul de la proportion relative de cellules a mucus (M) par rapport au nombre total d`enterocytes (E).195 Figure 79: Structure histologique des villosites intestinales au niveau des caeca pyloriques apres 42 jours d`elevage (x40). a) segments Y des bars temoins. b) segments Z des bars temoins. c) segments Y des bars LBBMA25. d) segments Y des bars LBBMA25. e) segments Y des barsGabolysat.I)segmentsYdesbarsGabolysat.g)segmentsYdesbarsPC60.h) segments Z des bars PC60. L : Lumiere intestinale ; Lb : Lame basale ; : Cellule a mucus ou caliciIorme ; : Noyau enterocytaire ; Vi : Villosite intestinale.199 Figure80:Ultrastructureintestinalea56joursd`elevage.a)poissonstemoinsb)poissons LBBMA25c)poissonsGabolysatd)poissonsPC60.B :Bordureenbrosse ;Ce :Canal excreteurdemucus ;Gm :Grainsdemucine ;L :Lumiereintestinale ;Ly :Lysosomes secondaires ;Mu :CelluleamucusoucaliciIorme ;Pt :Plateauterminal ; :Jonctions intercellulaires.200 Figure81:Ultrastructureintestinalea103joursd`elevage.a)poissonstemoinsb)poissons LBBMA25c)poissonsGabolysatd)poissonsPC60.B :Bordureenbrosse ;Cd : Chromatinedecondensee ;Ce :Canalexcreteurdemucus ;Gm :Grainsdemucine ;L : Lumiereintestinale ;Ly :Lysosomessecondaires ;Mt :Mitochondriesacrtetubulaire ; Mu : Cellule a mucus ou caliciIorme ; N : Noyau cellulaire ; Ve : Vesicules d`endocytose ; Pt : Plateau terminal ;: Jonctions intercellulaires.201 Figure82:Ultrastructureintestinaledespoissonsa56joursd`elevage.Mesuredelalongueur desmicrovillosites.a)Animauxrecevantl`aliment temoin.b)Animauxrecevantl`aliment PC60.c)Animauxrecevantl`alimentGabolysat.d)Animauxrecevantl`aliment LBBMA25.202 Figure83:Taillesdemicrovillosites(m)desjuvenilesdebarsapres56joursd`elevageen Ionction de l`alimentation reue. * : signiIicativement diIIerents du temoin (p~0,05).202 Figure84:Schemadesynthesedel`etudedel`eIIetdesensilagessurlacapacitedigestiveet l`ontogenese du systeme digestiI de juveniles de bars.210 Figure 85 : Schema des reins ainsi que les principales veines renales, chez le bar Dicentrarchus labrax (Grassi Milano et al., 1997).215 Figure86:IllustrationdelamethodedediIIusionsuragarpourlaquantiIicationdesactivites anti-microbiennes.SisurIaced`inhibition(mm).LesIlechesindiquentladiIIusiona travers la gelose (Frouel, 2006).218 Figure87 :Morphogenesedureincephaliquechezlesjuvenilesdebarsayantreusdivers aliments(*40).a)Animauxtemoinsapres8joursd`elevage(ge :68jours).b)Animaux temoinsapres23joursd`elevage(ge :83jours).c)Animauxtemoinsapres72jours d`elevage(ge :132jours).d)AnimauxLBBMA255apres8joursd`elevage(ge :68 jours).e)AnimauxLBBMA255apres23joursd`elevage(ge :83jours).I)Animaux LBBMA255apres72joursd`elevage(ge :132jours).h :tissuhematopoetique ; me :melano-macrophages ; tu : tubules renaux ; vc : veine cardinale.220 Figure88 :Morphogenesedureincephaliquechezlesjuvenilesdebarsayantreusdivers aliments (*40). a) Animaux temoins apres 92 jours d`elevage (ge : 152 jours). b) Animaux temoinsapres103joursd`elevage(ge :163jours).c)AnimauxLBBMA255apres92 joursd`elevage(ge :152jours).d)AnimauxLBBMA255apres103joursd`elevage (ge :163jours).h :tissuhematopoetique ;me :melano-macrophages ;tu :tubules renaux ; vc : veine cardinale.221 Figure89 :Activitelysozymaledetecteedansleserumdejuvenilesdebarsayantreus diIIerents aliments apres 28 jours (ge : 103 jours)..ou 56 jours d`elevage (ge : 131 jours).222 Figure90:Activitephenoloxydasedetecteedansleserumdejuvenilesdebarsayantreus diIIerents aliments apres 28 jours (ge : 103 jours) ..ou 56 jours d`elevage (ge : 131 jours). * : signiIicativement diIIerent du temoin.223 Figure91:Activiteanti-proteasedetecteedansleserumdejuvenilesdebarsayantreus diIIerents aliments apres 28 jours (ge : 103 jours)..ou 56 jours d`elevage (ge : 131 jours). * : signiIicativement diIIerent du temoin.223 Figure92 :Synthesedesresultatsobtenusconcernantl`actiond`enrichissementsurlesysteme immunitaire de juveniles de bars Dicentrarchus labrax.229 Figure 93: Haliotis tuberculata (source Haliotis-tuberculata..Ir).230 Figure 94: Morphologie des hemocytes en culture primaire. a) Cellules a aspect Iibroblaste-like. b) Cellules a aspect epitheliale-like.231 Figure 95: Principe du bio-essai d`hemocytes d`ormeau Haliotis tuberculata (Giard, 1996).233 Figure 96 : Photos des hemocytes apres 72 heures de culture selon diIIerentes mises en culture (*40). a) Mise en culture classique en presence d`hemolymphe. b) Mise en culture classique enpresenced`hemolympheetenpresencedel`ensilageLBBMA4a1mg/ml.c)Miseen cultureclassiqueenpresenced`hemolympheetenpresencedel`ensilageLBBMA25a 1mg/ml.. d) Mise en culture modiIiee. e) Mise en culture modiIiee en presence de l`ensilage LBBMA4a1mg/ml.I)MiseenculturemodiIieeenpresencedel`ensilageLBBMA25a 1mg/ml.236 Figure97:Photosd`agregatshemocytaires.a)MiseenculturemodiIieeenpresence d`hemolymphe. b) Mise en culture modiIiee en presence d`hemolymphe et en presence de l`ensilageLBBMA4 a 1mg/ml. c) Mise en culture modiIiee en presence d`hemolymphe et en presence de l`ensilage LBBMA25 a 1mg/ml..237 Figure98:ActivitelysozymaleenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA4(endu temoin). Temoin Ensilage . * : signiIicativement diIIerents du temoin (p~0,05).238 Figure99:ActivitelysozymaleenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA25(endu temoin). Temoin Ensilage . * : signiIicativement diIIerents du temoin (p~0,05).239 Figure 100: Activite phenoloxydase en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA4 (en du temoin). Temoin Ensilage . * : signiIicativement diIIerents du temoin (p~0,05).240 Figure 101: Activite phenoloxydase en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA25 (en du temoin). Temoin Ensilage . * : signiIicativement diIIerents du temoin (p~0,05).240 Figure102:Activiteanti-proteasiqueenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA4(en d`inhibition).TemoinEnsilage.* :signiIicativementdiIIerentsdu temoin (p~0,05).241 Figure 103: Activite anti-proteasique en Ionction de la Iraction de l`ensilage LBBMA25 (en d`inhibition).TemoinEnsilage.* :signiIicativementdiIIerentsdutemoin (p~0,05).242 Figure104:SurIacedescellulesenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA4(endu temoin).TemoinEnsilage.* :signiIicativementdiIIerentsdutemoin (p~0,05).243 Figure105:SurIacedescellulesenIonctiondelaIractiondel`ensilageLBBMA25(endu temoin).TemoinEnsilage.* :signiIicativementdiIIerentsdutemoin (p~0,05).244 Figure106:ProportiondescellulesIibroblastes-likeenIonctiondelaIractiondel`ensilage LBBMA4 (en ). Temoin Ensilage . * : signiIicativement diIIerents du temoin (p~0,05).245 Figure107:ProportiondescellulesIibroblastes-likeenIonctiondelaIractiondel`ensilage LBBMA25(en).TemoinEnsilage.* :signiIicativementdiIIerentsdu temoin (p~0,05).245 Figure108 :GelSDS-PAGE.Lesechantillonscorrespondantachaquelignesont :A)Poids moleculaires standards (de 250 to 10 kDa). B) Tapis cellulaire de cellules temoins mises en culture modiIiee. C) Tapis cellulaire de cellules recevant de l`ensilage LBBMA4, mises en culture modiIiee. D) Tapis cellulaire de cellules recevant de l`ensilage LBBMA25, mises en culture modiIiee. E) Tapis cellulaire de cellules temoin mises en culture classique. F) Tapis cellulaire de cellules recevant de l`ensilage LBBMA4, mises en culture classique. G) Tapis cellulairedecellulesrecevantdel`ensilageLBBMA25,misesencultureclassique.H) Poids moleculaires standards (range 250 to 10 kDa).248 Figure109 :GelSDS-PAGE.Lesechantillonscorrespondantachaquelignesont :A)Poids moleculaires standards (de 250 to 10 kDa). B) Milieu de culture de cellules temoins mises enculturemodiIiee.C)Milieudeculturedecellulesrecevantdel`ensilageLBBMA4, misesenculturemodiIiee.D)Milieudeculturedecellulesrecevantdel`ensilage LBBMA25,misesenculturemodiIiee.E)Milieudeculturedecellulestemoinmisesen cultureclassique.F)Milieudeculturedecellulesrecevantdel`ensilageLBBMA4,mises encultureclassique.G)Milieudeculturedecellulesrecevantdel`ensilageLBBMA25, mises en culture classique. H) Poids moleculaires standards (range 250 to 10 kDa).248 Figure110 :Synthesedesresultatsobtenusconcernantlarecherchedanslesensilagesde molecules bio-actives sur le systeme immunitaire.254 Index des tableaux : Tableau 1: EIIect oI storage temperature on pH, TCA soluble proteins and molecular weight oI peptidesandproteins.PointsnotbearingthesamesuperscriptletteraresigniIicantly diIIerent (p 0.05).25 Tableau 2: EIIect oI diIIerent storage treatments on cuttleIish viscera. *: SigniIicantly diIIerent Irom viscera Irom live cuttleIish (p0.05).45 Tableau 3: Impact oI storage time and deIrosting temperature on cuttleIish viscera.46 Tableau 4: CuttleIish viscera oil composition ( oI total oil extracted). *: SigniIicantly diIIerent Irom viscera Irom live cuttleIish (p0.05).51 Tableau5:EvolutionbiochimiquedesensilagesaucoursdeleurIabrication.*:DiIIerences signiIicatives par rapport au jour 0 (p0,05).59 Tableau6:Compositiondesensilagesapreslyophilisation.*:DiIIerencessigniIicatives (p0,05).60 Tableau7:Stabilitedesensilagesdepuis0a12moisapreslaproduction.*:DiIIerences signiIicatives par rapport au jour 0 (p0,05).61 Tableau8:CompositionenacidesgrasdesvisceresissusdelatransIormationetdesensilages ().62 Tableau 9: Caracteristiques des diIIerents micro-organismes choisis.79 Tableau 10: Caracteristiques des peptones utilisees dans cette etude.80 Tableau 11- Short presentation oI the silages used in this study.107 Tableau12-SpeciIicactivity(Unity/mgoIproteins)oIdigestiveenzymesoIcuttleIish according to their diets.113 Tableau13-ShrimpscompositiononHMWcarbohydrates(g/goIdryweight),LMW carbohydrates(g/goIdryweight),totalcarbohydrates(g/100goIdryweight)proteins (g/100g oI dry weight) and lipids (mg/g oI dry weight)114 Tableau 14: Presentation oI the silages used in this study.125 Tableau 15: Composition oI the nine compound diets ().125 Tableau 16: Survival oI shrimp post- larvae according to their diet ().*: SigniIicantly diIIerent Irom control diet (p 0.05).126 Tableau 17: Weight oI shrimp post larvae according to diet ( oI control group) aIter 30 days oI rearing. ().*: SigniIicantly diIIerent Irom control diet (p 0.05).128 Tableau 18 : Composition des aliments ().137 Tableau19:Correspondancepoids/geettempsd`elevageentrelesdiIIerentes experimentations.141 Tableau 20: Parametres zootechniques des poissons au cours de l`elevage 1. *: signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).143 Tableau 21: Parametres zootechniques des poissons au cours de l`elevage 2. *: signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).146 Tableau 22: Parametres zootechniques des poissons au cours de l`elevage 3. *: signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).148 Tableau23:IndicesdeconditiondesjuvenilesalaIindel`experimentation1enIonctionde l`aliment reu. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).149 Tableau24:IndicesdeconditiondesjuvenilesalaIindel`experimentation2enIonctionde l`aliment reu. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).149 Tableau25:IndicesdeconditiondesjuvenilesalaIindel`experimentation3enIonctionde l`aliment reu. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).150 Tableau26:QualitedelachairdesjuvenilesalaIindel`experimentation1enIonctionde l`aliment reu. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).150 Tableau 27: InIluence de l`EGF, l`IGF-I ou de l`insuline sur le MTT, l`activite pyruvate Kinase, l`incorporation de la leucine 3H, l`incorporation des acides amines 3H, l`incorporation de la thymidine 3Hetdel`activitedel`ATCase(d`augmentationparrapportauxcellules temoins). *: signiIicativement diIIerents des cellules temoins (p0.05).169 Tableau28:InIluencedesensilagesLBBMA4ouLBBMA25surleMTT,l`activitepyruvate Kinase,l`incorporationdelaleucine 3H,l`incorporationdesacidesamines 3H, l`incorporationdelathymidine 3Hetdel`activitedel`ATCase(d`augmentationpar rapport aux cellules temoins). *: signiIicativement diIIerent des cellules temoins (p0.05).170 Tableau29:Activitedel`amylaseenpourcentagedel`activitedestemoinsenIonctionde diIIerentes concentrations en lysats. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).182 Tableau30:Activitedelatrypsineenpourcentagedel`activitedestemoinsenIonctionde diIIerentes concentrations en lysats. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).182 Tableau31:Activitedel`amylaseenpourcentagedel`activitedestemoinsenIonctionde diIIerentes concentrations en hormones. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).183 Tableau32:Activitedelatrypsineenpourcentagedel`activitedestemoinsenIonctionde diIIerentes concentrations en hormones. * : signiIicativement diIIerent du temoin (p0,05).183 Tableau33:ActivitespeciIiquedesphosphatasesacides(U*10-5)aucoursdutempseten Ionctiondestraitements.Dansunemmeligne,leslotsn`ayantaucunelettreencommun sont signiIicativement diIIerents (ANOVA p~0,05).196 Tableau34:ActivitespeciIiquedel`amylase(U*10-5)aucoursdutempsetenIonctiondes traitementsDansunemmeligne,leslotsn`ayantaucunelettreencommunsont signiIicativement diIIerents (ANOVA p~0,05).196 Tableau35:ActivitespeciIiquedelatrypsine(U*10-5)aucoursdutempsetenIonctiondes traitementsDansunemmeligne,leslotsn`ayantaucunelettreencommunsont signiIicativement diIIerents (ANOVA p~0,05).197 Tableau36:Resultatsd`histologiesemi-quantitative(decellulesamucusparmilescellules epitheliales)auniveaudessegmentsYetZdesjuvenilesdebars.* :signiIicativement diIIerents (p~0,05) du temoin.198 Tableau37 :Activiteanti-microbiennecontrelespathogenesJibriocarchariaeetJibrio amguillarum, detectee au niveau du serum de juveniles de bars recevant diIIerents aliments, a 28 ou 56 jours d`elevage. * : signiIicativement diIIerent du temoin.224 Tableau38 :ImpactdelamethodedemiseenculturedeshemocytessurdiIIerentesactivites impliquees dans l`immunite. * : signiIicativement diIIerent du temoin.242 Tableau 39 : SurIace d`inhibition du pathogene Jibrio carchariae en presence des ensilages ou de l`acide lactique apres 48 heures de mise en culture des bacteries.246 Tableau40 :surIaced`inhibitiondupathogeneJibriocarchariaeenpresencedumilieude cultureoudutapiscellulaired`hemocytes,ayantreuounondesensilagesLBBMA4ou LBBMA25 au cours de leur culture, apres 48 heures de mise en culture des bacteries.246 Tableau41:surIaced`inhibitiondupathogeneJibriocarchariaeenpresencedumilieude cultureoudutapiscellulaired`hemocytes,ayantreudiIIerentesIractionsdesensilages LBBMA4ouLBBMA25aucoursdeleurculture,apres48heuresdemiseenculturedes bacteries.247 1 Introduction generale 2Plan de l`introduction gnrale : I DESCRIPTION DE L`ESPECE ETUDIEE : SEPIA OFFICINALIS (LINNE, 1758) A. Generalites 1.ClassiIication 2.Habitat et mode de vie 3.Exploitation de la seiche en Manche B. Anatomie et physiologie de la seiche 1.Le cephalopodium 2.Le visceropallium 3.L`appareil reproducteur 4.L`appareil digestiI IICONTEXTE GENERAL DE L`ETUDE III BUT DE L`ETUDE Introduction generale 3IDescription de l`espce tudie : Sepia officinalis (Linn, 1758) Gnralits 1.Classification Embranchement : mollusques Classe: cephalopodes Ordre: coleodes Famille: sepiides Genre: Sepia Espece: officinalis Lescephalopodessontcaracterisesparlerattachementdespiedsalatte (cephalopodium). De plus, ils possedent une coquille, soit externe comme chez le nautile soit internecommechezlaseiche,lecalmaretlepoulpe.Cesanimauxsontparticulierement evoluesetrepresententlesommetdel`evolutionchezlesmollusques.Decettemaniere,ils sontdotesd`unsystemenerveuxdeveloppecontenudansuncartilagecephaliqueetsont capables d`apprentissage (Dickel et al., 2001; Agin et al., 2006). En consequence, mme si les cephalopodes ont garde des caracteristiques appartenant aux mollusques, certains mecanismes sontcomparablesaceuxdespoissons(Mangoldetal.,1989;Rochaetal.,2001;Perrin, 2004). De ce Iait, les cephalopodes sont etudies pour de nombreuses raisons commerciales et scientiIiques (Boletzky, 2003). 2.Habitat et mode de vie La repartition geographique de Sepia officinalis est etendue puisqu`elle occupe l`est de l`Atlantique, la mer Baltique jusqu`au nord de l`AIrique, ainsi que la Mediterranee et la zone desAores(Boletzky,1983;BoyleandBoletzky,1996;Guerra,2006).Sepiaofficinalisest uneespecenecto-benthiquepouvantvivrejusqu`adesproIondeursavoisinant200metres, avec une plus Iorte abondance aux alentours de 100 metres (Royer, 2002; Guerra, 2006).LaseicheeIIectuedesmigrationssaisonnierestresmarquees(Boucaud-Camouand Boismery, 1991). En Manche, les populations de seiches eIIectuent d`importantes migrations quileseloignentdesctesenhiver(Figure1).Enrevanche,lesseichessontpresentesala cte depuis avril jusqu`en octobre. Les animaux se reproduisent au printemps puis meurent. A Introduction generale 4partird`octobre,lesanimauxdel`anneeetceuxdel`anneeprecedenteeIIectuentunelente migration d`est en ouest le long de la Iosse centrale de la Manche. Au printemps la migration de retour a la cte semble au contraire tres rapide (Boucaud-Camou and Boismery, 1991). Migration automnale Migration hivernale Aires de ponte Figure 1: Cycle de migration de Sepia officinalis (Boucaud-Camou and Boismery, 1991). 3.Exploitation de la seiche en Manche Depuislesannees1960,uneprogressionnettedelaproductionmondialede cephalopodesaeteconstateeparallelementaudeclindesstocksdepoissonsdemersaux(qui vivent a proximite du Iond). Cette augmentation est liee a deux phenomenes : un intert accru pour cette ressource consideree comme une ressource alternative et un Iort accroissement de sonabondancesouventexpliqueparladiminutiondelaplupartdesespecesdepoissons exploitees (Royer, 2002).LescephalopodessontprincipalementpchespardeschalutiersenManche(Royer, 2002).Neanmoins,ilssontegalementpchesparlaplupartdesengins :Iilets,casiers, dragues. La pche de la seiche en Manche presente un schema saisonnier tres marque lie aux phenomenesdemigrationdel`especeetalasaisonnalitedel`abondance(DenisandRobin, 2001;Royer,2002).Enautomne,laseicheestintensementexploiteeparleschalutiers pendant leur migration vers les zones hauturieres d`hivernage. En hiver, les captures sont peu nombreuses tandis qu`au printemps les seiches sont a nouveau pchees par les chalutiers et les BoulogneDieppePort en BessinLe HavreGranvillePlymouthCherbourgPortland0N80KmBoulogneDieppePort en BessinLe HavreGranvillePlymouthCherbourgPortlandBoulogneDieppePort en BessinLe HavreGranvillePlymouthCherbourgPortland0N80KmIntroduction generale 5caseyeurs. Ces derniers sont surtout presents sur les ctes Iranaises et principalement la cte bas-normande.L`exploitationannuelledesseichespermetl`obtentionde2500a15000tonnesen Manche.CetteIortevariabiliteaplusieursorigines :uncycledevietrescourt,une reproductionsaisonniereetunemortaliteplusoumoinsimportantedelapopulationadulte apreslareproduction(BoyleandBoletzky,1996).Lepaysexploitantmajoritairementles cephalopodes en Manche est la France. Elle realise en moyenne 73,7 des debarquements de seiches (Figure 2). Figure2:Debarquements(entonnes)deseichesenMancheparpaysexploitantentre1996et2003 (Anonyme, 2005). Entermedevaleureconomique,laproductionmoyenne(1989-2002)decephalopodes representent10millionsd`eurospourlaFrance(Challier,2005).EnBasse-Normandie, premiere region Iranaise en ce qui concerne la production de seiches, cette espece se situe a ladeuxiemeplaceetcontribuejusqu`a35duchiIIred`aIIairesdeschalutiersctiersau printemps (Royer, 2002). Anatomie et physiologie de la seiche Sepia officinalis 1.Le cphalopodium Lecephalopodiumcomprendlatte,l`appareilbrachialetl`entonnoir.Chezles cephalopodes,lesganglionscerebrodes,palleo-viscerauxetpedieuxsontIusionnesenun 020004000600080001000012000140001600019961997 19981999 20002001 20022003Pays Basles Anglo-NormandesBelgiqueRoyaume-UniFranceIntroduction generale 6systeme nerveux central cephalise qui, sur un plan anatomique, est compose de 2 parties : le cerveauetleslobesoptiques(Bernay,2005).Lecartilagecephaliqueestunestructure complexe qui protege le cerveau et certains organes des sens. La couronne brachiale entoure la masse buccale (Mangold et al., 1989).2.Le viscropallium Levisceropalliumcomprendlacoquille,lemanteau,lesnageoires,lesorganesdela cavite palleale et la masse des visceres (Figure 3). Figure 3: Section transvervale de Sepia officinalis montrant les structures et organes qui constituent le visceropallium (modiIiee d`apres Mangold et al., 1989). Chez tous les cephalopodes, la cavite palleale ventrale est spacieuse, contenant la partie internedel`entonnoir,lesbranchies,l`anus,lesoriIicesrenauxetgenitaux(Mangoldetal., 1989).3.L`appareil reproducteur Chezlescephalopodes,lessexessontbienseparesetstables(Richard,1971).Chezle mle, le testicule debouche sur un gonoducte, implique dans la Iormation des spermatophores (Bernay, 2005). Apres leur elaboration, les spermatophores sont accumules dans la poche de Needham avant d`tre evacues par les contractions musculaires du penis. Un bras modiIie, le bras hectocotyle, assure le transIert des spermatophores a l`interieur de la poche sous buccale de la Iemelle lors de l`accouplement. ChezlaIemelle(Figure4),lesorganessexuelscomprennentl`ovaire,l`oviducte,la glande de l`oviducte, les glandes nidamentaires principales et accessoires (Bernay, 2005). Ces CoquilleAorte cephaliqueusophageGlande digestiveCartilage de la nageoire Cavite pallealeVeine cephaliqueGlande brachialeIntestinConduit de la poche du noirBranchieManteauIntroduction generale 7glandespeuventatteindredesdimensionsconsiderableschezlesanimauxmrs(Mangold, 1989). Figure 4: Vue ventrale de l`appareil genital Iemelle de Sepia officinalis (modiIiee d`apres Mangold et al., 1989). 4.L`appareil digestif LescephalopodessontdespredateursactiIsmacrophages.L`appareildigestiIest composedubulbebuccal,desglandesassocieesaubulbebuccal,dutubedigestiI,dela glandedigestiveetdesappendicesdescanauxdigestiIs(Figure5).Chezcesanimaux,les organes de digestion sont disposes en U.Ladigestiondebuteauniveaudubulbebuccalquisertadechiqueterlesproies mecaniquement mais aussi a l'aide d'enzymes secretees par les glandes salivaires posterieures (Boucaud-CamouandBoucher-Rodoni,1983;Koueta,1983;KouetaandBoucaud-Camou, 1986; Perrin, 2004). Ensuite, la nourriture transite par l'oesophage vers l'estomac et les debris nondigerablessontdirectementevacuesversl'intestin.L'estomac,tresmusculeux,broieles aliments qui vont aussi subir l'action des enzymes secretees par la glande digestive (digestion extracellulaire). Le bol alimentaire passe ensuite directement dans la glande digestive et dans lecaecumousepoursuitladigestionintracellulaire.L'absorptionsederouledanslaglande NerI visceralBranchiePore renal OviducteGlandes nidamentaires accessoiresGlandes nidamentaires principalesPoche du noirOvaireNerI visceralBranchiePore renal OviducteGlandes nidamentaires accessoiresGlandes nidamentaires principalesPoche du noirOvaireIntroduction generale 8digestive,lesappendicesdelaglandedigestiveetlecaecum.EneIIet,l`intestindes invertebres, contrairement a celui des vertebres ne possede pas de proprietes d`absorption. Les residus issus de la digestion intracellulaire Iorment des corps bruns dans la glande digestive, qui sont evacues par l'intestin. Figure 5: Schema du systeme digestiI de Sepia officinalis (modiIie d'apres Mangold et Bidder, 1989). IIContexte gnral de l`tude LaFranceestlepremierproducteureuropeendeseiches(5emerangmondial)avec12 300 tonnes en 2001. En Basse-Normandie, les debarques de cephalopodes constituent une part majeuredelapche.LaseicherepresentelaressourcequiproduitleplusimportantchiIIre d`aIIaires avec la coquille Saint-jacques et le bulot.Masse buccaleGlande salivaire posterieureGlande digestiveusophageIntestinAppendice des canaux de la glande digestiveCanal de la glande digestiveEstomacCaecumMasse buccaleGlande salivaire posterieureGlande digestiveusophageIntestinAppendice des canaux de la glande digestiveCanal de la glande digestiveEstomacCaecumIntroduction generale 9L`exploitationcroissantedescephalopodesentranel`installationprogressivedes industries de transIormation dans la region car l`exportation de la seiche se Iait de plus en plus sousIormecongelee,peleeetevisceree.Cemoded`exportationactuelgenereunegrande quantitededechetsavecdescotsd`enlevementconsiderables.Lesco-produitsdelapche descephalopodessontdoncdesmatierespremieresobtenuesengrandequantiteetqui represententunechargeimportantepourlesentreprisestransIormatrices.Apporterdes solutionsdevalorisationdecesco-produitspermettraitalorsdediminuerlescotsliesala transIormation des seiches et repondrait a une attente Iorte des industriels regionaux. Les co-produitsdelapchedescephalopodessontdoncdesmatierespremiereslargement disponiblesenBasse-Normandieetpourlesquelsdenombreusesvalorisationssont envisageablestantenalimentationanimaleouhumaine,encosmetiquequ`enmedecine. Ainsi,lesproduitsdelamersontdeplusenplusutilisesenmedecine,cosmetologieet nutrition.Ilssontpresentsdanslesaliments,lesproduitsdietetiques,lescomplements alimentaires, certains medicaments ou encore des produits cosmetiques. Des procedes tels que l`hydrolyseoul`autolysesontutilisespourvaloriserlesdechetsdepoissons.EneIIet, l`industriealimentaire,pourelargirsagammedeproduitsetIabriquerdesproduitsde remplacement,abesoindedisposerdetoutessortesd`additiIsoud`ingredients(Bourgeois andLeroux,1982).Cettedemandes`exprimeentermesIonctionnels,c`estadirequeces composesdoiventrepondreauneIonctionprecise(croissance,survie,qualite, metabolisme.). IIIBut de l`tude Ce travail a pour but d`etudier la qualite des co-produits issus de la transIormation de la seiche,etsurcettebasededevelopperetproposerdesmethodesdevalorisationdecesco-produits. Dans un premier temps, nous allons explorer la qualite biochimique et enzymatique desco-produitsissusdelatransIormationdelaseicheSepiaofficinalisaIindeconnatreles voies de valorisation envisageables.NousprospecteronslesdiIIerentesvoiesd`utilisationdesproduitsdeveloppes,in vitropuisinvivo.Nouschercheronsd`abordaconnatrel`eIIicacitedesproduitsentant Introduction generale 10milieu de culture pour micro-organismes. Puis, nous etudierons l`impact de ces ingredients en tantqu`enrichissementsdel`alimentationdepost-larvesetdejuvenilesdecrustaces,de mollusques et de poissons.EnIin,certainesmoleculesbioactivespresentesdanslesproduitsdeveloppesseront recherchees via l`utilisation de diIIerents bio-essais. L`organisation de ce manuscrit repose sur des articles intercales dans le texte et dont les pagesontetere-numerotepourIaciliteraulecteur,l`accesauxillustrations.AIind`eviterla conIusionentreIiguresettableauxdutexteetdeceuxdesarticles,ceuxciontetere-numerotes. 11 LEBIHANE.,ZATYLNYC.,PERRINA.,KOUETAN.,(2006).StudiesoIpost-mortem evolution oI cuttleIish viscera during their storage at two diIIerent temperatures. Food chemistrv. 98: 39-51 LE BIHAN E., PERRIN A., KOUETA N., (2006) EIIect oI diIIerent storage treatments, period oIIreezinganddeIrostingtemperatureonqualityoIcuttleIish(SepiaofficinalisL.)viscera.Food chemistrv.(accepted). Chapitre 1 12Plan du chapitre 1 : IINTRODUCTION A. Contexte economique 1.Les produits de la pche 2.La seiche B. Voies de valorisation de la masse viscerale de la seiche 1.Les enzymes 2.Les huiles 3.Les lysats IIETUDE DE LA QUALITE BIOCHIMIQUE DES VISCERES A. Etude de l`evolution post-mortem des visceres de seiche 1.Introduction 2.Materials and methods 3.Results and discussion 4.Conclusion B. Etude de diIIerents traitements sur la qualite des visceres de seiche 1.Introduction 2.Material and methods 3.Results and discussion 4.Conclusion III PREPARATION D`ENSILAGES ET EFFET DU STOCKAGEA. Introduction B. Materiel et methodes 1.Materiel biologique 2.Fabrication des ensilages 3.Analyses C. Resultats D. Discussion IV CONCLUSION Chapitre 1 13IIntroduction A. Contexte conomique 1.Les produits de la pche L`industriedetransIormationdesproduitsdelamerelaboredesproduitsdestinesa l`alimentationhumaineapartirdediIIerentesvarietesdepoissons,coquillages,crustaceset mollusques. En 2004, 209 entreprises de transIormation et une quarantaine de mareyeurs, ayant egalement une activite de transIormation, ont ete recenses en France.LaIilieredesco-produitsesttrespeudeveloppeeenFrance.Deplus,depuisquelques annees,lesdiIIicultesapparuesdanslesIilieresanimalesconcernantl`Encephalopathie SpongiIormeBovineetlesdioxines,n`ontpasIaciliteceprocessusdevalorisationdesco-produitsissusdesindustriesdetransIormationanimales.EnFrance,ilestimportantdesavoir quelesproducteurs(mareyeurs,saurisseurs, conserveurs.) produisent environ 150 000 tonnes de co-produits par an (visceres, ttes, artes et peaux) a partir de 320 000 tonnes de poissons.La transIormation des produits de la mer entrane donc, pour les usines de transIormation, laproductiond`unequantiteimportantededechets.L`evacuationdecesdechetsrepresenteun cot annuel eleve.2.La seiche DiversdechetssontobtenusaucoursdelatransIormationdelaseiche:lesvisceres,les yeux,lebec,l`osetlapeau.EnFrance,lesseichesnesontjamaistransIormeesaborddes bateaux, ni mme congelees, elles sont simplement glacees entieres et stockees independamment du reste de la pche, pour eviter les salissures dues a l`encre. Une Iois a terre, elles sont achetees parlesmareyeursetlesusinesdetransIormationsouslacriee,puiscongeleesentieresennoir (non lavees) et en blocs. Les blocs de seiches congelees d`origine Iranaise sont destines a tre transIormes en Italie, en Espagne et en France. La methode de transIormation italienne (Figure 6) conduit a l`obtention de plusieurs types dedechets.D`abordlapeauetlebec,ensuitel`osdeseiche,enIinlesvisceresetlesyeux.La peau et les becs constituent environ 8, l`os environ 7 et la masse viscerale et les yeux plus de 20dupoidstotaldel`animal(Richard,2001).Cettederniereestconstitueeparlesysteme reproducteur, le systeme digestiI, l`appareil cardio-respiratoire et l`appareil excreteur. La masse visceraleestparticulierementricheenenzymes,enproteinesetenacidesgraspoly-insatures. Nousavonschoisidetravaillersurlavalorisationdesco-produitsdelaseicheetenparticulier Chapitre 1 14sursamasseviscerale.EneIIet,cettedernierepossedeunIortpotentielencequiconcernesa composition biochimique et n`a pour l`instant encore aucun debouche de valorisation. Figure 6: Methode de transIormation de la seiche selon la methode italienne. Ex. Cooperative Granvilmer (Basse Normandie, France). B. Voies de valorisation de la masse viscrale de la seiche Plusieurs voies de valorisation de la masse viscerale de la seiche peuvent tre envisagees.1.Les enzymes Laglandedigestivedelaseicheestlesieged`unegrandeactiviteenzymatique.Danscet organe il y a des enzymes de types amylasiques, lipasiques ou encore proteolytiques (Boucaud-Camou,1974;Boucaud-Camou,1982;Perrin,2004).Parmilesproteases,ilya2principaux types,lesserinesproteases(trypsineetchymotrypsine)etlescathepsines.Ellepossededeplus des esterases ainsi que des phosphatases.Lesenzymesd`originemarinepresententdenombreuxavantagesparrapportacelles d`origine bacterienne, vegetale ou animale, couramment utilisees dans l`industrie. En eIIet, elles DecongelationLavageEviscerationPelageLavage dans eau de merSurgelationGlazurageConditionnementStockage negatiIExpeditionLavage bullageDechets humidesEquarissageSeiches Iraches: represente 5 de la quantite transIormee a GranvilmerSeiches congelees en blocs de 25Kg: represente 95 de la quantite transIormee a GranvilmerDecongelationLavageEviscerationPelageLavage dans eau de merSurgelationGlazurageConditionnementStockage negatiIExpeditionLavage bullageDecongelationLavageEviscerationPelageLavage dans eau de merSurgelationGlazurageConditionnementStockage negatiIExpeditionLavage bullageDechets humidesEquarissageDechets humidesEquarissageSeiches Iraches: represente 5 de la quantite transIormee a GranvilmerSeiches congelees en blocs de 25Kg: represente 95 de la quantite transIormee a GranvilmerChapitre 1 15sedistinguentparleursconditionsoptimalesd`activite :ellessontIonctionnellesdansdes solutions Iortement salines, sont generalement multiIonctionnelles et surtout possedent une Iorte activite catalytique a basse temperature.2.Les huiles La teneurenlipidesdesvisceres est de plus de 10 (Boucaud-Camou, 1973). Ces huiles d`origines marines sont particulierement riches en acides gras poly-insatures. Leur utilisation en dietetique et en pharmaceutique est beneIique a la sante humaine (Richard, 2001).EIIectivement,desetudesontmontrequelesacidesgraspoly-insaturesparticipentala preventiondel`atherosclerosegrcealeursactionsanti-oxydantes.Ilsjouentunrlede prevention du vieillissement. EnIin, ils Iavorisent une bonne croissance et un bon developpement du Iotus et du nourrisson.3.Les lysats Il existe un intert croissant concernant les bioprocedes de valorisation des dechets marins (Figure 7). En eIIet, les co-produits peuvent simplement tre broyes puis seches conduisant alors al`obtentiond`uneIarineoubiensubirunelysepermettantl`obtentiondelysats(autolysat, ensilage ou hydrolysat). Figure 7: Systeme Iabrication de Iarines, autolysats, ensilages ou hydrolysats. Il existe diverses methodes pour lyser les tissus. Classiquement, la methode de production d`autolysatdepoissonexploitelesenzymesendogenespresentesdanslesvisceres. Co-produitsFarine Hydrolysat Ensilage AutolysatSchage Schage Schage SchageBroyageIncubation (autolyse)Ajout enzymes exognesIncubation (hydrolyse)Incubation (autolyse)Ajout acide vite le dveloppement bactrien, favorise l`autolyseCo-produitsFarine Hydrolysat Ensilage AutolysatSchage Schage Schage SchageBroyageIncubation (autolyse)Ajout enzymes exognesIncubation (hydrolyse)Incubation (autolyse)Ajout acide vite le dveloppement bactrien, favorise l`autolyseChapitre 1 16EIIectivement,lesvisceressontconnuspourleurcontenueleveenenzymes(Gildbergand Almas,1986).Cetteautolysecorrespondauneevolutionpost-mortemdontoncontrlela temperature et le temps d`incubation (Pour revue : Mukundan, 1986). Au cours de cette digestion enzymatique,lesbacteriesvontjouerunrleimportant(apportdematerielenzymatique)en contribuantaladigestion(Mukundanetal.,1986).Lesmicroorganismesvontcrotreetse multiplieravecl`autolysedutissuquicontienttouslesnutrimentsnecessairesacela.Dans certains cas, on place mme les tissus dans des conditions Iavorisant le developpement bacterien aIindebeneIicierdesenzymesbacteriennes(Iermentation,ajoutdesel,ajoutdesucre..) (Amano, 1961; Gildberg and Almas, 1986).UnensilageestdecritcommeetantunproduitliqueIieIabriqueapartird`unanimalou bien d`une partie d`un animal, et d`acide. La liqueIaction est provoquee par l`action des enzymes presentesdanslestissusetaccelereeparl`ajoutd`acide.Cetacidepermetdecreerlesbonnes conditionsdepHpourl`actiondesenzymes,Iavoriseladigestiondestissusetlimitela croissancebacterienne(Vizcarra-Maganaetal.,1999).Diversacidespeuventtreutilises,tels que des acides inorganiques (acide chlorhydrique, acide sulIurique.) ou des acides organiques (acidesIormique,acidepropionique.).Lesacidessontgeneralementapportesdansdes proportionsde1a5(volume/poids)auxtissusbroyes(RaaandGildberg,1976;Raaand Gildberg, 1982).L`hydrolyse consiste en l`inactivation des enzymes endogenes et a l`utilisation d`enzymes commerciales(Clemente,2000).L`hydrolyseestunetechniqueobligatoiresiletissuconcerne necontientpassuIIisammentd`enzymesendogenesoubiensicesenzymesnepermettentpas l`obtentiond`unproduitconvenable.CeshydrolysespeuventseIaireenconditionacideou basique (Mackie, 1982). Pourl`ensembledecestechniques,lestempsd`incubationsonthautementvariables, pouvant s`etendre de quelques heures a plusieurs mois. De la mme Iaon, la temperature (de 4 a 50C) et le pH (acide, neutre ou alcalin) de lyse peuvent varier. Ces parametres sont Ionction du tissu, de l`animal et du produit Iinal que l`on desire obtenir (degres de lyse). En conclusion, sous cestermesgeneriquesd`autolysat,hydrolysatouensilageonenglobedesnombreuxproduits hautementdiIIerentslesunsdesautrescarchacunestIonctiond`unnombreelevede parametres :Matiere premiere : un groupe d`especes, une espece precise, un ensemble d`organe, un seul organe.. Condition de lyse : a pH acide, neutre ou basique ; a temperatures tres variables. Chapitre 1 17Niveau de lyse : lyse complete ou partielle des tissus. Enzymes : endogenes, bacteriennes, exogenes. Conditionnement : liquide, concentre, lyophilise.. Lesrichessesenzymatiquesetproteiques,exceptionnellesauniveaudesvisceresdela seiche,permettentl`accesadessubstancespossedantdesproprietesextrmementinteressante pour les secteurs de la dietetique, de la cosmetologie, du medical et de l`elevage (agriculture et aquaculture). Neanmoins, un probleme subsiste et concerne la degradation et les alterations que peuventsubirlesmatierespremieres(co-produits)aucoursdeleurstockageetdeleur transIormation. Ainsi, les diIIerents traitements subis peuvent alterer la qualite des co-produits et mme empcher leur utilisation via une degradation trop importante des enzymes endogenes, des acidesgrasetdetouteslesmoleculespresentes.PourcesdiIIerentesraisons,l`objetdece premierchapitreseradecaracteriserlecontenuenzymatiqueetbiochimiquedesvisceresde seiche, mais aussi de connatre l`impact de diIIerents traitements sur la qualite des co-produits. IIEtude de la qualit biochimique des viscres A. Etude de l`volution post-mortem des viscres de seiche Rsum : Pour obtenir des donnees sur l`autolyse des visceres de la seiche Sepia officinalis, l`etude del`evolutionpost-mortemdecesco-produitsaeterealisee.Lesvisceresdeseichesontete stockesa4ou25Cetdesprelevementsreguliers ont ete eIIectues pendant 4 mois. Larupture des lysosomes entrane un relarguage rapide des proteases totales acides et des cathepsines dans lemilieuextracellulaire.Ladestructiondesvesiculesazymogeneintervient2heuresapresla mortdel`animalentranantuneaugmentationdel`activitetotaledesproteasesalcalines,dela trypsine,delachymotrypsineetdel`-amylase.Apres10joursd`incubation,aucuneactivite enzymatiqueendogenen`estplusdetectee.Deplus,lepHdesvisceresstockesa25Cdevient alcalin tandis qu`il augmente plus lentement pour ceux stockees a 4C. Le taux de proteines TCA solubles decrot rapidement a partir de 50 jours a cause de la degradation et de l`agregation des proteines.EnIin,l`autolyseentraneunediminutionsigniIicativedupoidsmoleculairedes proteines.Chapitre 1 18Laseiche,Sepiaofficinalis,estconnuepouravoiruncycledeviecourt,elleest caracteriseeparuntauxdecroissanceeleve(MangoldandBoletzky,1973;Mangold,1983; Clarke et al., 1989; Le GoII and Daguzan, 1991). Cette croissance rapide et leur metabolisme a predominanceprotequeimpliquentunIortrenouvellementproteiqueetparconsequentdes activites proteolytiques importantes. De plus, des etudes anterieures ont demontre la presence de nombreusesenzymesdansletractusdigestiIdelaseicheSepiaofficinalis(Perrinetal.,2004). Danslebutdeconnatrelesmecanismesintervenantaucoursdel`autolyse,nousavonsetudie l`evolution post-mortem des co-produits en relation avec les activites enzymatiques des visceres de seiche.L`etudedesproprietesdesenzymespresentesdanslesvisceresestparticulierement importante.Ainsi,ellepermetlabonnecomprehensiondesmecanismesdedegradationdes proteines et des lipides et Iournit des inIormations essentielles a la production d`ensilage a base visceres de seiches. Les lysats sont couramment utilises dans l`alimentation des animaux eleves danslesIermesetlesaquacultures(HaalandandNjaa,1989).Neanmoins,laqualite nutritionnelle des ensilages depend largement du degre d`autolyse des tissus et du produit Iorme. Haaland et Njaa (1989) ont demontre que la temperature de Iabrication des ensilages inIluence a la Iois le degre d`autolyse obtenu apres stockage et le degre d`hydrolyse des liaisons des groupes amide. De plus, la Iraction insoluble, qui est toujours presente dans un autolysat, est plus Iaible lorsquelatemperaturedestockageestsuperieurea2C(HaalandandNjaa,1989).La liqueIactiond`unensilageestconsiderablementIavoriseeparunpHacideetunetemperature prochedelatemperatureambiante(RaaandGildberg,1976).Unhautdegred`hydrolyseest observependantlespremiersjours.Lesresultatsobtenusdemontrentqu`ilexistedeux phenomenesdistinctsaucoursdel`evolutionpost-mortemdesvisceresdeseiche.D`aborddes phenomenesrapidesquiinterviennentquelquesheuresapreslamortdel`animal.Ces evenementssontrapidesetincontrlables.Ensuite,desphenomeneslentsquisederoulent plusieursjoursapreslamortdel`animal.Cesderniersimpliquentuneautolysequipeuttre matriseeparlecontrledelatemperature,dupH.Auvudesresultatsobtenus,pourla Iabricationdelysatsdevisceresdeseiche, l`autolyse ne doit pas depasser 50 jours puisque au-dela de ce temps les proteines natives sont denaturees et s`agregent. Un acide doit tre ajoute aux tissus de maniere a obtenir le pH optimum aux activites enzymatiques, a accelerer l`autolyse et a stopperledeveloppementbacterien(GildbergandAlmas,1986).EnIin,concernantla temperaturedeIabricationdesensilagesnosresultatssontinsuIIisantspourstatuerentre4ou 25C. Chapitre 1 19Post-mortem changes in viscera of cuttlefish Sepia officinalis L. during storage at two different temperatures: Estelle Le Bihan, Celine Zatvlnv, Armelle Perrin, Noussithe Koueta Laboratoire de Biologie et Biotechnologies Marines, Universite de Caen, 14032 Caen cedex, France Corresponding authors. Estelle Le Bihan. tel.. (33) 231565295, fax. (33) 231565346, estlebihanvahoo.fr Abstract: We observed the post-mortem changes in viscera oI cuttleIish Sepia officinalis in order to applythedatatoautolysateproduction.CuttleIishviscerawerestoredat4Cor25Cand sampledregularlyover4months.Ourresultsshowedthattotalacidproteasesandcathepsins wererapidlyreleasedtotheextracellularmediumduetothebreakdownoIlysosomes.Total alkalineproteaseactivityincreased2hoursaIterdeathduetothebreakdownoIzymogene vesicles.ThesamepatternswereIoundwithtrypsin,chymotrypsinand-amylaseactivities. AIter10daysoIincubation,noendogenousenzymaticactivitywasIound.AIter50daysoI storage,theTCAsolubleproteinlevelsdecreasedrapidlytoapproximately30duetoprotein degradationandaggregation.AIter10days,thepHoIviscerastoredat25Cwasalkaline, whereasintheviscerastoredat4CthepHincreasedmoreslowly.AssigniIicantreductionin the protein molecular weight due to autolysis, was also observed.Keywords:Digestiveenzymes,Molecularweight,pH,Post-mortem,SepiaofficinalisL. (Mollusca Cephalopoda), TCA soluble proteins, Viscera. 1. Introduction The cuttleIish, Sepia officinalis, is known to have a short liIe cycle and is characterized by ahighgrowthrate(MangoldandBoletzky, 1973; Mangold, 1983; Clarke et al., 1989; Le GoII andDaguzan,1991). Such rapid growth must involve a high rate oI body protein turnover, and thus, intense activity oI the proteolytic enzymes. Previous studies have examined the occurrence oI digestive enzymes along the digestive tract oI the cuttleIish Sepia officinalis. In recent studies, Perrinetal.(2004)measureddigestiveenzymessuchastrypsin,acidphosphatases,totalacid proteasesandchymotrypsininthejuvenilecuttleIish.Moreover,LeBihanetal.(2004b)have characterized cuttleIish cathepsins. The lysosomal system (Volkman et al., 1989; Villalba et al., 1993;Villalbaetal.,1993;Carajavilleetal.,1995;Likholatetal.,2000;Sidermann,2000; Pihan,2001),whichcontainscathepsinshasbeenimplicatedinnumerousmechanismsoI Chapitre 1 20intracellular digestion. Lysosomes are cytoplasmic granules that contain several acid hydrolases withinthelysosomalmembrane(DeDuveetal.,1955).Thesehydrolases,suchascatheptic enzymes, are considered to be the main cause oI post mortem tissue soItening (Ono, 1971; Eino and Stanley, 1973; Penny, 1980).ThecephalopodsareanimportanteconomicresourceIorglobalIisheries.Basse- NormandieistheIoremostCephalopod-producingregioninFrance.CuttleIisharemainly exported in Irozen Iorm to the Mediterranean countries and to Japan; France is the second most importantexporteroIIrozencuttleIishintheEuropeanUnion.Thevalorisationcanpermitto increasethevalueoIviscera.Traditionally,viscerahavebeenconsideredaswasteandutilized only to a minor extent (Gildberg and Almas, 1986). Nevertheless, the cuttleIish viscera represent animportantpartoIthecuttleIishmass(15to25).So,theirwasterepresentsanimportant commercialloss.Moreover,thedigestivegland,whichcorrespondto10to15oIviscera, containsabout10oIlipidsrichinpolyunsaturatedIattyacids(Boucaud-Camou,1973).So, becauseoItheirbiochemicalcomposition,visceracouldbethebasisoImarineautolysatesIor useasIeedinaquaculturediets.InordertorevealmechanismsoIautolysis,itisessentialto studythepost-mortemprocessinrelationtotheactivitiesoIhydrolyticenzymesinviscera. DiIIerentparametersinIluencethevisceraautolysissuchasendogenousenzymes,which determinetheautolysatequality;pH,whichisanessentialparametertoenzymaticactivity; temperature, which inIluences both the degree oI autolysis reached aIter storage and the degree oI hydrolysis oI the amide groups (Haaland and Njaa, 1989). So, we assayed enzymatic activity, pH,theTCA(trichloroaceticacid)solubleproteinlevel,becauseitreIlectsthedegreeoI hydrolysis oI peptide bonding and the molecular weight oI proteins and peptides.2. Materials and methods a.Biological material CuttleIishSepiaofficinaliswerecaughtintheEnglishChannelduringSpring2004. Individuals (mature animals; dorsal length 20-25 cm) were placed in tanks Ior 72 hours at 15C, inthemarinestationinLuc-sur-Mer(France),toensurethatthecuttleIishusedwerenot stressed. The animals were Ied with live crab (Carninus maenas) during one week. The viscera wereremovedIromanaesthetizedlivecuttleIishandimmediatelydisruptedusingaliquidizer. Theviscera(40litters)were placedinto two treatments in acid resistant plastic containers:one wasstoredat4Candthesecondgroupat25C,Ior4months.Tissuesamplesweretakenat regular intervals (0, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 8h, 24h, 48h, . 4 months), Irozen in liquid nitrogen and stored at 80C until analyzed. Chapitre 1 21b.Enzyme extraction Foracidproteaseandcathepsinassays,theIrozenviscerawerehomogenizedin2.5 volumeoItheextractionbuIIer(1KClcontaining1mMoIEDTA)(LeBihanetal.,2004). ThehomogenatewascentriIugedIor60minutesat10000gat4C.Thesupernatantliquidwas usedIortheassays.Forthealkalineproteases,trypsin,chymotrypsin,lipasesandamylase assays,theIrozenviscerawereextractedinbuIIer(1mloIbuIIerper60mgoIsample) containing:0.09MTRIS-base,0.08Mboricacid,3mMEDTA,0,5mMmercapto-ethanol, glycerol10,pH8,3(Koueta,1983).ThecrudeextractwascentriIugedIor30minutesat 10000g at 4C, and the supernatant used Ior assays.c.Enzymatic assays TotalacidandalkalineproteaseactivitiesweremeasuredaccordingtoCharneyand Tomarelli(1947)andVanWormhoudtandSellos(1980).ThesubstratewascaseinYellow 0,005inaphosphatebuIIer(0,096M,KH2P04,0,004M,NaH2PO4),pH2Iortheacid proteasesandpH10Ioralkalineproteases.0.5mlwasusedIoreach0.1mloIsupernatant (CharneyandTomarelli,1947;VanWormhoudtandSellos,1980).Theincubationwascarried outIor1hourat37C,andtheintensityoItheyellowcolorationwasestimatedat442nm. Enzyme activity was expressed as speciIic activity (U.mg-1 protein), where one unit is the variation oI one unit oI O.D. min1. Cathepsin activity was measured according to Bonete et al. (1984). The assay mixture was composed oI 0.1ml oI sample (containing catheptic activity), 0.05ml oI 0.4M acetate buIIer (pH 4.0),and0.05mloI2(w/v)haemoglobinsolution(Boneteetal.,1984).Themixturewas incubated at 37C Ior 60 minutes. The reaction was stopped by the addition oI 1ml oI 3 (w/v) trichloroacetic acid. AIter ten minutes, the assay was centriIuged at 4000rpm Ior 10 minutes. An aliquotwasusedIortheestimationoIthereleasedproteolyticendproduct.Appropriateblanks wereused,andtheproductswereevaluatedbyusingtheFolin-Lowryreaction,accordingto Barrett(1977),employingtyrosineasstandard(BarrettandKirschke,1981).Theactivitywas expressedasspeciIicactivity(U.mg-1protein)whereoneenzymaticunitcorrespondstoone micromole oI tyrosine.mg-1 protein. TrypsinactivitywasmeasuredaccordingtoTsunematsuetal.(1985)using1mMN-benzoyl-Arg-p-nitroanilideassubstrateina0.1MTRISbuIIer,pH9,andchymotrypsin accordingtoDelmaretal.(1979)using1.142mMBenzoyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide (BAAPNA) as substrate in a buIIer oI 0.1M TRIS-base, 0.01M CaCl2, pH 11 (Tsunematsu et al., 1985).Then,Iorbothassays,0.1mloIsupernatantwasaddedto0.5mloIsubstrate.Time incubationwas30minutesat37CIorchymotrypsinand1hourat25CIortrypsin.TheIinal Chapitre 1 22absorbance was recorded at 410nm. Enzyme activity was expressed as s