Thème La sélection des souches des bactéries lactiques ...

UNIVERSITE KASDI MERBAH OUARGLA

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Biologique

Mémoire En vue de l’obtention du diplôme de

MASTER ACADEMIQUE

Domaine : Science de la Nature et de la Vie

Filière : Biologie

Spécialité : Microbiologie Appliquée

Présenté par : ZERGOUNE Fatma

Thème

La sélection des souches des bactéries lactiques protéolytiques

isolées à partir d’un produit laitier fermenté artisanale a basse

de lait de vache « j’ben »

Soutenu publiquement

Le : 10 /06/2015

Devant le jury :

Année universitaire : 2014/2015

UKM Ouargla Présidente M.C.B Mme

Ouled ElHadj Khelil Aminata

UKM Ouargla Examinateur M.A.A Mr.BANSACI.Messaoud Bachagha

UKM Ouargla Encadreur M.A.A Mr

.BOURICHA M‘hamed

REMERCIEMENTS

J’adresse en premier lieu ma reconnaissance à notre DIEU tout puissant, de

m’avoir permis d’en arriver là, car sans lui rien n’est possible.

Au terme de ce travail, il est agréable de présenter mes remerciements les plus

sincères à Monsieur Bouricha M’hamed., pour m’avoir proposé ce sujet si

intéressant et m’avoir accepté d’encadrer et d’orienter tout au long de mon

travail avec leur judicieux conseils et sa constante disponibilité, c’est grâce à sa

compétence et indulgence que ce travail a pu être réalisé

Je tiens à remercier Monsieur Bensassi Messouad Bachagha. Responsable de la

spécialité de microbiologie d’avoir acceptée d’examiner mon mémoire.

Je remercie également Madame Ouled ElHadj Kheil Aminata. d’avoir acceptée

la présidence du jury de mon travail,

C’est également un grand honneur pour moi d’être jugé par vous «Soyez

profondément remercié».

Je remercie aussi l’ensemble du personnel travaillant au laboratoire du

département de Biologie.

Mes remerciements vont également à mes enseignants qui m’ont accompagné

pendant mon cursus universitaire.

Je tiens à remercier tous le personnel de l’Université de Kasdi Merbah de

m’avoir aidé à réaliser ce projet. Merci infiniment pour les efforts fournis.

Mes plus vifs remerciements à mes parents, ma famille, et mes amies.

DEDICACE

Spécialement à mon père

À qui je dois énormément, qui a cru en moi et qui m’a donné les moyens d’aller

aussi loin. Ce travail est le fruit de tes sacrifices que tu as consentis pour mon

éducation et ma formation.

A ma très chère mère

Affable, honorable, aimable : Tu représentes pour moi le Symbole de la bonté

par excellence, la source de tendresse et l’exemple du dévouement qui n’a pas

cessé de m’encourager et de prier pour moi. Ta prière et ta bénédiction m’ont

été d’un grand secours pour mener à bien mes études.

A mes très chères sœurs :rym ,chaherazed les mots ne suffisent guère pour

exprimer l’attachement, l’amour et l’affection que je porte pour vous.

A mes très chères frères :elhachmi ,fadal Je vous dédie ce travail avec tous mes

voeux de bonheur, de santé et de réussite.

A mes oncles : nourdine,selimane,rahmoun,toufik,faride

Ames tantes.

A mes cousins :khaiera ,khalida ,douaa,yasmine,iman, khadidja,houda, warda,

nawal ,manoubya

A mes cousins :charafedine ,rafik,mouneaam,abdou,hicham

A tous les membres de ma famille zergoune, petits et grands

Qui n’a cessé de me soutenir pendant tout mon parcours. Je leur exprime toute

ma gratitude pour leur soutien financier et moral, ce qui m’a permis d’être à ce

niveau. Puisse ce diplôme nous réserver a tous des lendemains meilleurs.

Pour finir j’adresse mes remerciements à mes très chers amis qui sont devenus

des frères et sœurs pour

moi :djamila,madjeda,khadidja,lila,ahlame,hayat,zouhera,iman,zineb,farahe,

amine,khadera ,saberina et autres, pour leurs conseils et leurs soutiens sans

faille.

Sommaire

Sommaire

Remerciement

Dédicace

Liste d‘abréviation

Liste des tableaux

Liste des figures

Introduction 1

Généralités sur le lait

I.1.Définition du lait 2

I.2.Composition chimique du lait 2

I .3.Caractères physico –chimiques du lait: 6

I.4.La valeur nutritive du lait 7

II. Produits laitiers fermentés traditionnels 7

II.1.Exemples Produits laitières fermentés traditionnels Algériens 7

II.2.La microflore du lait fermenté 11

II.2.1.Les bactéries lactiques 11

II.2.1.1.Le genre Lactobacillus 12

II.2.1.2.Le genre Lactococcus 12

II.2.1.3Le genre Streptococcus 12

II.2.1.4.Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella 13

II.2.1.5.Le genre Enterococcus 13

II.2.1.6.Les genres Pediococcus et Tetragenococcus 13

II.2.1.7.Le genre Bifidobacterium 14

II.2.2.Les levures 14

II.2.3.Les moisissures 14

II.2.4.Les virus 15

II.3.Microflore de J‘ben 15

II.4.Composition biologique du lait 15

II.4.1.Flore originelle 15

II.4.2.Flore de contamination 16

II.4.3. Action de la flores microbienne 16

II.4.4.Acidification ou Fermentation acide 16

II.4.5.Le filage 17

II.4.6.L‘alcanisation du lait 17

II.4.7.Autres dégradation 17

II.4.8.La protéolyse 17

II.4.8.1.Activité protéolytique 18

II.4.8.2.Bactéries lactiques protéolytique 19

II.4.8.3.Intérêt de l‘activité protéolytique des bactéries lactiques 19

Matériel et méthodes

I.1.Matériel Biologique 21

I.1.1.Préparation de fromage frais (j‘ben) 21

II .Méthodes 24

II.1.Techniques de prélèvements et échantillonnages 24

II.2.Mesure de pH 24

II.3. Préparation des dilutions 24

II.3.1.Préparation de la dilution mère 24

II.3.2.Préparation des dilutions décimales 24

II.4. Isolement des bactéries lactiques 25

II.5.Purification 25

II.6.Conservation des souches 25

II.7. Identification des souches 25

II.7.1.Pré-identification des souches 26

II.7.1.1. Caractérisation phénotypique des souches 26

II.7.1.1.1. Étude morphologiques 26

A/L‘aspect macroscopique et microscopique 26

B/L‘aspect microscopique 26

II.7.1. 2. Production de la catalase 26

II.7.2. Testes physiologique et biochimique 27

II.7.2.1. Testes physiologique 27

II.7.2.1.1. Croissance dans les conditions hostiles 27

A/Croissance à différentes températures (4, 15, 37 et 45°C) 27

B/Croissance en présence de différentes concentrations de Na Cl 27

C/Croissance à pH 4 et 9,6 27

II.7.2.1.2. Thermorésistance 27

II.7.2.1.3Type fermentaire 28

II.7.2.1.4 Croissance sur lait bleu de Sherman 28

II.7.2.2. Test biochimique 28

II.7.2.2.1. Profile fermentaire 28

II.7.2.3.Tests technologiques 29

II.7.2.3.1. Test de citrate 29

II.7.2.3.2. Production de dextrane 30

II.7.2.3.3. La recherche l‘arginine dihydrolase (ADH) 30

II.8. Étude de l‘activité protéolytique des isolats 30

II.8.1. Activité protéolytique en milieu solide. 30

II.9. Cinétique d‘acidité 31

RESULTATS ET DISCUSSION

III.1.Mesure de pH 33

III.2.Isolement, purification 33

III.3.Pré-identification des souches 34

III.3.1.Caractérisation phénotypique des souches 34

III.3.1.1.Étude morphologiques 34

A/L‘aspect macroscopique 34

B/L‘aspect microscopique 35

III.3.2.Production de la catalase 36

III.4.Identification des souches 37

III.4.1.Testes physiologique et biochimique 37

III.4.1.1. Testes physiologiques 37

III.4.1.1.1.Croissance dans les conditions hostiles (en différents température, pH, NaCl 39

III.4.1.1.2.Thermorisistance 39

III.4.1.1.3. Type fermentaire 39

III.4.1.1.4. Test de lait de Sherman 40

III.4.1.2. Test biochimique 41

III.4.1.2.1. Profile fermentaire 41

III.4.1.3. Tests technologiques 43

III.4.1.3.1. Test de citrate 43

III.4.1.3.2. La production de dextrane 44

III.4.1.3.3. Recherche de l‘Arginine dihydrolase (ADH) 45

III.5. Étude de l‘activité protéolytique des isolats 46

III.6. Cinétique d'acidité 48

Conclusion 52

Références bibliographiques

Annexes

Liste des abréviations

ADH Arginine Dihydrolase

DM Dilution Mére

MRS Mayeux, Sandine et Elliker

S19 Souche19

BL Bactéries Lactiques

Lb Lactobacillus

FAO Food and Agriculture Organization

ADH Arginine Di Hydrolase

Liste des figures

Photo Titres Pages

01 Schéma de la fabrication de fromage frais (j‘ben). 22

02 Schéma résumant la méthodologie utilisé pour l‘étude de Cinétique

d‘acidité

03 Des colonies des bactéries lactiques sur le milieu MRS 34

04 Des colonies des bactéries lactiques sur le milieu M17 34

05 L‘aspect macroscopique de la souche sur milieu MRS sur milieu

liquide 35

06 Aspect d‘une culture pure dans un milieu liquide 35

07 Observations microscopiques des bactéries lactiques avec un

grossissement (G : 10x100) 36

08 Résultat des tests physiologique (déférents pH et NaCL) 39

09 Type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche

de Durham. 40

10 Le test de lait de Sherman 41

11 Le profil fermentaires des isolats effectué sur plaque d‘Eliza 42

12 Résultat de la dégradation de citrate sur milieu KMK 44

13 Test de production des exopolysaccharides ( dextrane) 45

14 Résultats du test d‘hydrolase arginine 46

15 Etude de l‘activité protéolytique sur milieu YMA 48

16 Résultats de la cinétique d‘acidité 49

17 Variation de pH en fonction du temps chez la souche S19 50

18 Variation de l‘acidité exprimée en degrés Dornic en fonction du

temps chez la souche S19 51

Liste des tableaux

Tableaux Titres pages

I La composition moyenne du lait de vache (Charles et al., 2005) 4

II Caractéristiques physicochimiques du lait de vache (F.A.O,

1998). 6

III Résultats des tests physiologiques sur les souches étudiées 38

IV Profil fermentaire des souches isolées 42

V la variation de pH et de degré Dornic en fonction du temps chez

la souche S19

50

Introduction

Introduction

1

Introduction

Le lait est un liquide blanc mat, légèrement visqueux, dont la composition et les

caractéristiques physico-chimiques varient sensiblement selon les espèces animales, et même

selon les races. Ces caractéristiques varient également au cours de la période de lactation,

ainsi qu‘au cours de la traite.

Les laits fermentés sont des produits laitiers transformés par une fermentation essentiellement

lactique qui aboutit à l‘acidification et à la gélification du lait (Béal et Sodini, 2012).

Leur nature dépend du type de lait utilisé, le prétraitement, les conditions de fermentation et le

traitement ultérieur (Zamfir et al., 2006).

Les bactéries lactiques sont des micro-organismes de catégorie alimentaire qui jouent un rôle

essentiel dans la fermentation des matières premières animales et végétales. Elles occupent

des niches écologiques extrêmement variées. Leur capacité à fermenter les hydrates de

carbone et, à un moindre degré, de dégrader les protéines et les lipides mène à la synthèse

d'une large gamme de composés, tels que les acides organiques, les peptides, les composés

antimicrobiens et aromatiques et les exopolysaccharides. Ces métabolites peuvent contribuer

aux caractéristiques organoleptiques, technologiques et nutritionnelles des aliments fermentés

(Mozzi et al., 2010).

Une large gamme d‘activités métaboliques et propriétés sont recherchées chez ces

bactéries pour un usage industriel, telle que l‘acidification, la protéolyse, la production de

polysaccharides…etc.

Grâce à leur richesse en enzymes protéolytiques (protéinase de paroi, peptidases) ils

participent, avec d‘autres enzymes, à l‘hydrolyse des caséines, protéines essentielles du

lait, en petits peptides et acides aminés. Cette activité est d‘autant plus accrue grâce au

phénomène d‘autolyse bactérienne rendant plus accessible aux enzymes intracellulaires

libérés leurs substrats présents dans la matrice fromagère (Hassaine O.,2013).

Cette activité contribue de façon très significative dans l‘apparition des qualités

organoleptiques souhaitables et appréciées des fromages, telles que la texture et la flaveur.

Les peptides et acides aminés libérés sont en effet des précurseurs de nombreuses

molécules riches en saveurs et en arômes qui sont à la base du succès gastronomique des

fromages(Hassaine O.,2013).

Introduction

2

Pour ces multiples raison nous avons étudié le pouvoir protéolytique des bactéries lactiques,

isolées à partir d‘un produit laitier fermenté traditionnel (J‘ben), en se basant sur les deux

essentiels étapes :

Isolement et identification des bactéries lactiques à partir d‘un produit laitier fermenté

traditionnellement (j‘ben) ;

Rechercher des souches des bactéries lactiques responsables de l‘activité protéolytique

présente dans le j‘ben.

Synthèse

bibliographique

Synthèse bibliographiques

3

I. Généralités sur le lait

I.1.Définition du lait

Le lait destiné à l‘alimentation humaine a été défini en 1909 par le Congrès international

de la répression des fraudes comme suit :

« Le lait est produit intégral de la traite et ininterrompue d‘une femelle laitière bien

portante, bien nourrie et non surmenée .II doit recueilli proprement et ne pas contenir de

colostrum » (larpant, 1997).

Le lait sans indication de l‘espèce animal de provenance correspond au lait de vache

(larpant, 1997).

I.2.composition chimique du lait :

Le lait est un substrat très riche fournissant à l‘homme, et aux jeunes mammifères un

aliment presque complet. Protides, lipides, sels minéraux, et vitamines sont présents à des

concentrations tout à fait satisfaisantes, pour la croissance, et la multiplication cellulaire

(LARPENT, 1991).

Le tableau I résume la composition chimique moyenne d‘un litre de lait de vache.


4

Tableau I : La composition moyenne du lait de vache (Charles et al., 2005)

Constituants

majeurs

Composition

(%)

Etat physique des

composants Caractéristiques

Eau 87 Eau liber : 87.5%

Eau liée : 10%

C‘est le solvant du lactose et des sels.

Retenue par des substances en émulsion et en suspension

Glucides

<< lactose >> 40 Solution Un solide blanchâtre , avec un pouvoir sucrant 4 fois plus faible que le saccharose.

Lipides :

Triglycérides

Phospholipides

Fraction

insaponifiable

35

98

1

1

Les globules gras

sont en émulsion

de type huile dans

l‘eau

Se trouvent aux centres des globules gras.

Constituent l‘enveloppe des globules gras .

Rassemblent :les carotènes et les stérols (d‘où dévirent les A et B )

Protides :

*Caséine

*Protéines du sérum

*Substances azotées non

protéiques

34

80

20

1.2

Suspension

micellaire de

Phospho-

caseinate de

Ca++

Solution

colloïdale

Solution varie

Sont principalement : αs1,αs2,β et κ

Les deux principales sont la β-lactoglobuline et α-lactalbumine

Sont principalement :protéase, peptone.

Constituants mineurs Composition Etat physique des

composants Caractéristiques

Minéraux :

*Potassium

*Calcium

*Chlorure

Traces

1500(mg/kg)

1180(mg/kg)

958(mg/kg)

/ Cette composition varie selon la saison et l‘alimentation de l‘animal.


5

Vitamines :

*Hydrosolubles

A

D

E

K

*Liposolubles

B6, B1

B2 (Riboflavine)

Traces

40µg/100ml

2.4µg/100ml

100µg/100ml

5µg/100ml

50.45mg/100ml

175µg/100ml

/

Participant comme cofacteurs dans les échanges à l‘échelle des membranes cellulaire.

Enzymes :

*Hydrolases

Estérases

Protéases

*Diastases

*Oxygénases

Traces

/

Leurs substrats spécifiques sont les Triglycérides, esters phosphoriques.

Enzymes spécifiques pour les parois cellulaires microbiennes et caséine.

Enzymes spécifiques aux protéines, peptides et bases puriques.

Le substrat est les composés réducteurs H2O2


6

I .3.caractères physico –chimiques du lait:

Le lait est un liquide opaque blanc mat, plus ou moins jaunâtre selon la teneur de la

matière grasse en béta carotène Tableau II (Bourgeois et al ; 1996).

Tableau II : Caractéristiques physicochimiques du lait de vache (F.A.O, 1998).

Constantes Moyennes Valeurs extrêmes

Energies

(Keal/Litre)

(MJ /Litre)

701

2930

587-876

2454-3662

Densité du lait entier à20°c 1.031 1.028-1.033

Densité du lait écrémé - 1.036

Densité du la matière grasse - 0.954-0.96

pH à 20°c 6.6 6.6-6.8

Acidité titrable (Dornic) 16 15-17

Point de congélation (°c) (-0.520)-(-0.550)

Viscosité du lait entier à 20°c

(centipoises)

2.2 -

Viscosité du lait entièr à 25°c

(centipoises)

1.8 1.6-2.1

Viscosité du lait écrémé à 20°c

(centipoises)

1.9 -

Point d‘ébullition - 100.17-100.15


7

I.4.La valeur nutritive du lait

Le lait un substrat très fournissant à l‘homme et aux jeunes mammifères un aliment

presque complet, protides glucides lipides sels minéraux et vitamines sont présents à des

concentrations tout à fait satisfaisantes pour la croissance et la multiplication cellulaire

(Bourgeois et al., 1996).

II. produits laitiers fermentés traditionnels

Les produits laitiers fermentés ont été produits pour prolonger la durée de conservation

du lait. Ces aliments traditionnels ont persisté au cours des siècles et ils ont souvent évolué

d‗un niveau artisanal et traditionnel à la fabrication à grande échelle industrielle avec

production utilisant des cultures spécifiques (starter) et équipements modernes (Cogan, 1996;

Oberman, 1998).

II.1.Exemples Produits laitières fermentés traditionnels Algériens

II.1.1.L’ben

L'origine de ce produit remonte à des temps immémoriaux, probablement à l'époque

où l'homme a commencé à domestiquer les espèces laitières et à utiliser leurs laits. Sa

fermentation lactique lui donne son arôme naturel et sa saveur inimitable. Sa préparation

artisanale est simple, le lait est abandonné à lui-même jusqu'à sa coagulation. Celle-ci se fait à

température ambiante et dure 24 à 48 h selon la saison. Le barattage qui lui succède dure 30 à

40 minutes. A la fin du barattage, on ajoute généralement un certain volume d'eau (environ 10

% du volume du lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener

la température de l'ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de beurre

(Ouadghiri, 2009 ; Benkerroum et Tamime, 2004).

II.1.2. Raïb

Le Raïb fait partie des produits laitiers fermentés populaires en Algérie, en plus du

L‘ben (lait écrémé fermenté). Le Raïb a une très ancienne tradition en Algérie; il est fabriqué

à partir du lait cru de vache ou de chèvre. La fermentation du lait, comme de nombreux

procédés traditionnels de fermentation, est spontanée et incontrôlée et pourrait être une source

précieuse des bactéries lactiques autochtones (Mechai et Kirane, 2008).


8

II.1.3.Bouhezza

Ce type de fromage est répandu dans le territoire de l'Aurès (zone Chaouia). Il est

fabriqué à partir de lait de chèvre, de vache ou de brebis baratté et écrémé (lben) (Touati,

1990 et Hallal, 2001).

Le salage, l'égouttage et l'affinage sont réalisés simultanément dans une outre

perméable (Chekoua) avec incorporation de poudre du piment rouge (figure 4), la fabrication

de bouhezza dure plusieurs semaines à plusieurs mois, il a un goût acidulé fort caractérisé au

fromage (Zaidi, 2002).

II.1.4.Klila

La klila est préparée à partir du lben chauffé sur feu doux pendant 12 minutes environ

pour favoriser la séparation du caillé et du lactosérum et accélérer le processus d'égouttage.

Le lait caillé est égoutté dans un tissu fin. La klila peut être consommée à l'état frais ou

additionnée à certains plats traditionnels après avoir été coupé en petits cubes et séchés au

soleil (Touati, 1990).

II.1.5.Takammart

D'après (Hellal, 2001), c'est un fromage du Hoggar, il est fabriqué par introduction

d'un bout de caillette de jeunes chevreaux dans le lait, après quelques heures, le caillé est

retiré à l'aide d'une louche et déposé en petits tas sur une natte et sera ensuite pétri pour

évacuer le sérum puis déposé sur une autre natte faite de tige de fenouil sauvage qui lui donne

de l'arome. Les nattes sont ensuite placées à l'ombre jusqu'à durcissement du fromage. Le

fromage peut subir un affinage durant un mois (Gast et coll., 1969 cité par Abd Elaziz et Ait

Kasi, 1992).

II.1.6.Aoules

Il est fabriqué à partir du lait de chèvre qui est extrêmement aigre. Après une

coagulation intense, le fromage obtenu a une pâte dure (matière sèche représente 92%).

L'égouttage se fait dans une paille ensuite, il est reformé sous forme des boules plates séchées

au soleil, il peut être consommé en mélange avec les dates (Abdelaziz et aitkaci, 1992).


9

II.1.7.Lebaa

La matière première est le colostrum, parfois il est mélangé avec des oeufs, il est salé

puis bouillit pendant 15 mn environ. Le produit obtenu est appelé lebaa (Lemouchi, 2008).

II.1.8.Méchouna

Il est fabriqué à partir du lait cru qui est chauffé jusqu'à ébullition. Ensuite, on ajoute

de lait fermenté <<lben>> ou <<rayeb>> et du sel. En utilisant une gaze, le mélange est laissé

égoutter. Il est consommé frais ou avec la galette (Lemouchi, 2008).

II.1.9.Madghissa

Le fromage est connu dans la zone du chaouia coté Est du pays. Il est préparé avec la

klila fraîche après salage et incorporation du lait frais. L'ensemble est porté à ébullition sur

feu doux jusqu'à séparation du caillé et de lactosérum. Après refroidissement du mélange, la

marmite est basculée pour éliminer le lactosérum. Le fromage ainsi préparé est une pâte jaune

salée et élastique appelée madghissa (Aissaoui, 2003).

II.1.10. kémaria

La kémaria c‘est un type de fromage traditionnel qui caractérise une place très

important dans la société d‘une valeur de consommation très remarquable autochtone de la

wilaya de Ghardaïa. (HARROUZ et OULAD HADJ ,2007).

II.1.11.J’ben (Fromages frais traditionnel)

Le « J‘ben » est le fromage traditionnel frais le plus connu depuis fort longtemps aussi

bien en milieu rural qu'en milieu urbain.

Le J‘ben est obtenu par coagulation enzymatique (présure extrait à partir de la caillette

de veau). Le lait destiné à la fabrication est chauffé, une fois tiède, un fragment de caillette

bovine est macéré dans le lait. après coagulation du lait et égouttage, le caillé ainsi obtenu

peut être salé ou additionné de quelques épices ou de plantes aromatiques (Abdelaziz et Ait

Kaci, 1992).


10

Le fromage frais commercialisé est fabriqué soit à partir du lait de vache ou du lait de

chèvre. Le processus de fabrication nécessite trois grandes étapes essentielles : la maturation,

la coagulation et l‗égouttage (Randazo et al., 2002).

A/ La maturation

C‗est l‗incubation du lait cru à température ambiante pendant un temps variable de

façon à favoriser la multiplication d‗une flore lactique qui va jouer un rôle important dans

l‗acidification du lait. Cette maturation peut être spontanée ou provoquée par adjonction de

levains. Le recours à des levains artificiels du commerce n‗est cependant pas toujours une

nécessité absolue, car le fermier producteur de lait a lui-même la possibilité de cultiver un

levain naturel à partir de la flore contenue dans son propre lait (Randazo et al., 2002).

B/La coagulation

C‗est une opération qui vise à coaguler le lait au moyen de la présure (emprésurage)

ou de toute autre enzyme coagulante. L‗activité coagulante est déterminée par la force de

présure, la température du lait et son acidité. Après l‗emprésurage, le lait est abandonné au

repos à température ambiante pendant 6 à 10 heures. Il va prendre en masse (caillage) avec

une consistance plus ou moins ferme selon le degré d‗acidité développé.

En réalité, le coagulum est obtenu par deux modes de coagulation : la coagulation dite

lactique et celle engendrée par l‗action de la présure. Ces deux modes ont une action

simultanée sur le lait avec cependant une prédominance plus ou moins marquée de l‗un ou

l‗autre selon que le fromager souhaite obtenir une pâte à caractère plus présure ou à caractère

plus lactique(Randazo et al., 2002).

C/L‘égouttage

Un des buts essentiels de cette opération est de régler la teneur en eau du fromage. Il

permet l‗élimination de la plus grande partie du sérum qui imprègne le coagulum. L‗égouttage

est amorcé dans des moules qui confèrent au fromage sa forme. La nature du gel influe sur la

conduite de l‗égouttage. Un gel lactique subit un égouttage spontané et le caillé a par

conséquent une forte humidité. Cependant, un gel présure est un gel compact, solide ou

l‗égouttage ne peut avoir lieu qu‗après certaines interventions telles des actions mécaniques

de pression.


11

Suivant le goût du fromager, le salage peut être fait. C‗est une opération importante

dans la fabrication des fromages. Elle a des effets multiples : elle améliore l‗égouttage en le

complétant, elle oriente et sélectionne le développement microbien et relève la saveur de la

pâte (Kbibou, 1987; Benkerroum et Tamime 2004).

II.1.11.1. Caractéristiques physiques et chimiques du J’ben

le fromage frais « J‘ben » ne présente pas de caractéristiques définies à cause des

méthodes artisanales utilisées pour sa préparation reposant, essentiellement, sur les

connaissances acquises à partir d‘une longue expérience (Salmeron et al., 2002). Les arômes,

les propriétés organoleptiques et les caractéristiques physico-chimiques du fromage dépendent

de celles du lait cru qui à son tour dépend de la race des animaux et leur type d‘alimentation

(Poznanski et al., 2004). Généralement, Le pH (< 4,2) et l'acidité titrable (> 0,9%) sont les

paramètres les moins variables du « J‘ben ». Cependant, les matières solides totales du «

J‘ben » sont le facteur le plus variable car ce dernier dépend de la durée d‘égouttage. Étant

donné que les lipides, le lactose et les protéines constituent les principaux composants de

l‘ensemble des matières solides en « J‘ben », ils sont directement influencés par les variations

des dites matières solides (Benkerroum et Tamime 2004). De nos jours, J‘ben est également

préparé à partir de lait pasteurisé. Les caractéristiques finales d‘un J‘ben typique sont

variables et affectées par le préparation du fromage (Ouadghiri et al., 2005).

II.2. Microflore du lait fermenté

Bactéries, leveurs, moisissures et virus peuvent être présents dans le lait fermenté. Les

bactéries ont une place prédominante dans l‘ensemble des problèmes microbiologique du lait,

et des produits laitiers, les levures et les moisissures intéressent surtout la fromagerie.

II.2.1.Les bactéries lactiques

Elles rassemblent en effet un certain nombre de genres qui se caractérisent par la

production, liée à un métabolisme exclusivement fermentaire, de quantités importantes

d‘acide lactique à partir des sucres.

La fermentation est dite : homolactique si l ‘acide lactique est pratiquement le

seul produit formé et hétérolactique si d ‘autres composés sont aussi présents (acide

acétique, éthanol, CO2 …etc.) (Leveau et Bouix, 1993 ; Pilet et al., 2005).


12

Elles sont à Gram positif, généralement immobiles, asporulées, catalase

négatives, oxydase négatives généralement nitrate réductase négative, ce sont des

bactéries anaérobies facultatives. Elles ont des exigences nutritionnelles complexes pour

les acides aminés, les peptides, les vitamines, les sels, les acides gras et les glucides

fermentescibles (Dellaglio et al., 1994 ; Hogg, 2005).

II.2.1.1.Le genre Lactobacillus

Lactobacillus est le genre principal de la famille des Lactobacillaceae, il

contient de nombreuses espèces qui sont des agents de fermentation lactique intervenant

dans de nombreuses industries ou qui sont rencontrées comme contaminants. Il s ‘ agit

de bacilles longs et fins (parfois incurvés) souvent groupés en chaînes, immobiles,

asporulés, catalase négative, se développent à un optimum de température situé entre 30 et

40°C. Les lactobacilles ont des exigence s nutritionnelles très complexes en acides

aminés , en vitamines, en acides gras, en nucléotides, en glucides et en minéraux

(Khalid et Marth, 1990 ; Leclerc et al., 1994 ).

II.2.1.2.Le genre Lactococcus

Les lactocoques se présentent sous forme de coques en paire ou en chaînes de

longueur variable. Ce sont des bactéries anaérobies facultatives homofermentaires ne

produisant que de l‘acide lactique L(+), seul Lactococcus lactis ssp. lactis biovar .

diacetyla ctis produit le diacétyle. Leur température optimale de croissance est proche de

30°C, capable de se développer à 10°C mais pas à 45°C. Quelques espèces produisent

des exopolysaccharides et des bactériocines. Elles sont capables de se développer à 3% de b

leu de méthylène et d‘hydrolyser l‘arginine (Tamime, 2002).

Actuellement, le genre Lactococcus comprend cinq espèces, Lactococcus lactis est l ‘espèce

la plus connue avec ses trois sous - espèces : Lc. lactis ssp. lactis, Lc. lactis ssp. cremoris

et Lc. lactis ssp. hordniae (Pot et al., 1996 ; Pot, 2008) .

II.2.1.3Le genre Streptococcus

La seule espèce de streptocoques qui soit utilisée en technologie alimentaire est

Streptococcus thermophilus (Stiles et Holzapfel, 1997).


13

Streptococcus thermophilus se différencie par son habitat (lait et produits laitiers) et

son caractère non pathogène. La résistance à la température, la capacité de croitre à 52°C

et le nombre limité des hydrates de carbones permettent de distinguer les St.

thermophilus de la plupart des autres streptocoques (Haddie, 1986 ; Pilet et al., 2005).

II.2.1.4.Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella

Ils ressemblent les coques lenticulaires en paires ou en chainettes mésophiles,

qui possèdent un caractère hétérofermentaire marqué, avec production d‘acide lactique

(isomère D), de CO2 et d‘éthanol. Les caractéristiques telles que l‘hydrolyse de

l‘esculine, la formation de dextrane, lesconditions de croissance, la capacité à croître à

différents pH et température, l‘assimilation de citrate et/ou malate permettent la

différenciation entre les genres Leuconostoc et Weissella (Pilet etal., 1998 ; Ho et al . ,

2007).

Le développement des leuconostoc entraîne souvent l‘apparition d‘une viscosité dans

le milieu grâce àla production des exopolysaccharides. Les leuconostoc principalement Ln.

mesenteroides ssp. cremoris et L n. lactis sont utilisés en association avec les lactocoques

dans l‘industrie laitière pourproduire en plus de l‘acide lactique et le CO2, des substances

aromatiques telles que le diacétyle etl‘ acétoïne à partir des citrates du lait (Hassan et Frank,

2001 ; Guiraud, 2003 ; Ogier et al., 2008 ).

II.2.1.5.Le genre Enterococcus

Ce genre regroupe les s treptocoques fécaux . Ce sont des commensaux de

l‘intestin. Les espèces rencontrées dans l‘alimentation sont essentiellement En. faecalis

et les espèces proches. Les entérocoques sont des coques qui peuvent être mobiles,

homofermentaires, généralement différenciés par la fermentation de l‘arabinose et le

sorbitol, ils croissent entre 10°C et 45° C (Tamime, 2002 ; Ho et al., 2007).

II.2.1.6.Les genres Pediococcus et Tetragenococcus

Les Pediococcus sont des coques homofermentaires dont la particularité est le

regroupement en tétrade. Ils sont mésophiles, le plus souvent incapable d‘utiliser le

lactose, et leur développement nécessite la présence de divers facteurs de croissance.

Certaines espèces se distinguent par leur capacité à se développer à des teneurs en


14

sels très élevées, comme Pediococcus halophilus , renommé Tetragenococcus halophilus

et Tetragenococcus muriaticus qui tolère jusqu ‘à 18% de NaCl (Pilet et al., 2005).

II.2.1.7.Le genre Bifidobacterium

Le genre Bifidobacterium est considéré comme faisant partie du groupe des

bactéries lactiques grâce à la similarité de ses propriétés physiologiques et biochimiques et à

sa présence dans le même habitat écologique, tel que le tube gastro intestinal. .

Les bifidobactéries s e caractérisent par leur forme très irréguli ère souvent en forme

V mais pouvant être coccoïdes, la présence d'une enzyme, le fructose - 6- phosphate

phosphocétolase, celle- ci leur permet de fermenter les hexoses en produisant de l'acide

acétique et de l'acide lactique. Leur température de croissance varie de 36°C à 43°C

(Axelsson et al., 2004 ; Pilet et al., 2005 ; Ho et al., 2007)

II.2.2.Les levures

Bien que présentes dans le lait, leur action est minime. Certaines d‘entre elles sont

capables de fermenter le lactose en alcool (production de l‘éthanol).

On n‘a pas identifié pour l‘instant de levures pathogènes associées au domaine laitier.

Il y a des levures qui participent à l‘affinage de certaines fromages et d‘autres entrent dans la

fabrication de certains produits laitiers fermentés.

On retrouve aussi dans le domaine laitier des levures nuisibles responsables de

certaines dégradation détectées par des odeurs d‘alcool, par un gonflement des emballages et

du fromage du à la production de gaz et par le limonage (Carole. l ., 2002).

II.2.3.Les moisissures

Sans importance dans le lait liquide, elles intéressent un grand nombre d‘autres

produits laitiers. Elles se développent en surface, ou dans les parties internes aérées. Elles sont

productrices de lipases et de protéases, dont on rencontre le Penicillium et le Geotrichum

(F.A.O, 1995).


15

II.2.4.Les virus

Nuisibles à la culture des levains, ils sont aussi appelés bacériophages (F.A.O, 1995).

II.3.Microflore de J’ben

La composition microbiologique du fromage dépend de celle du lait de départ, du

processus de fabrication qu‘il a subi et de l‘âge du fromage (Ercolini et al., 2009).

Généralement, elle est dominée par les bactéries lactiques en l‘occurence les

Lactococcus et les Enterococcus qui influencent les caractéristiques sensorielles du produit

fini (Randazzo et al., 2009).

II.4.Composition biologique du lait

II.4.1.Flore originelle

Le lait contient peu de micro-organismes lorsqu‘il est dans de bonnes conditions, à

partir d‘un animal sain (moins de 5000 germes / ml et moins de 1 coliformes /ml) Il s‘agit

essentiellement de germes saprophytes du pis et des canaux galactophores : microcoques

streptocoques lactiques et lactobacilles.

D‘autres micro-organismes peuvent se trouver dans le lait lorsqu‘il est issu d‘un animal

malade ; ils sont généralement pathogènes et dangereux du point de vue sanitaire Il peut s‘agir

par exemple d‘argents de mammites.

Les mammites sont dues à des infections par Staphylococcus aureus, Streptococcus

agalactiae, Escherichia coli…etc.

Les pathogènes pour l‘homme sont également les micro-organismes suivants :

Mycrobacterrium bovis, Mycobacterium tuberculosis, Brucellella, Streptococcus

agalactiae Escherichia coli, salmonella, Leptospira, Listeria monocytogene ,Bacillus cereus,

Pasteurella multocido, Clositridium perfringens , Coxiella burnetii, Campylobacter, Yesinia

(bourgeois et al ; 1996).


16

II.4.2.Flore de contamination

Le lait au cours de la traite, du transport et du stockage à la ferme ou à l‘usine, est

contamine par une grande variéte de micro –organismes une partie seulement d‘entre eux peut

se multiplier dans le lait si la température leur est favorable et le milieu propice.

Les principales sources de contamination sont les suivants :

Fèces et téguments de l‘animal ; coliformes, Bacillus, Clositridium, Salmonella.

Sol ; Streptomyces , bactéries sporulées spores de champignons.

Litières et aliment : flore banale, Lactobacilles ; Clostridium butyriques (ensilage)

Air et eau : flores divers

Equipements de traite et de stockage du lait : flore lactique, microcoques

Lactobacilles ; Chromobacterium , Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium,

Acinetobacter , levures.

Manipulateur : Staphycoques des mains, germes d‘expectoration et contamination

fécale.

Vecteur divers : insectes en particulier.

Parmi ces micro- organismes il en est d‘inoffensifs d‘autres de dangereux du point de

vue sanitaire, d‘autres enfin sont capables d‘entrainer la détérioration du lait (ARPENT ;

1997).

II.4.3.Action de la flore microbienne

De nombreux micro-organismes peuvent se développer dans le lait en entrainant par

leur action des modifications des propriétés organoleptiques Ces altérations vont dépendre des

conditions de stockage du lait et des traitements qu‘il subit (Guiraud ;1998).

II.4.4.Acidification ou Fermentation acide

La plupart des micro-organismes du lait sont capables de fermenter le lactose en

produisant une acidification qui entraine la coagulation de la caséine : Lactococcus lactis,

Coliformes, Enterococcus, Feacalis ; Lactobacilles (Bourgeois et al 1991)


17

II.4.5.Le filage

II consiste à la modification de la viscosité, soit par la présence de fibrine et de

leucocytes qui passent dans le lait pendant la traite ; soit par la production de capsules

mucilagineuses qui peuvent apparaitre à faible température par Alcaligenes, Microccus

(Guiraud, 1998, Bourgeois et al 1991).

II.4.6.L’alcanisation du lait

Les genres Pesudomonas ,Alcaligens , Micrococcus peuvent produire l‘alcalinité du lait

sans protéolyse ,l‘alcalinisation est due, soit à la formation d‘ammoniaque à partir de l‘urée ,

soit à la décomposition des acides organiques, tel que l‘acide citrique (Bourgeois et al,1991).

II.4.7.Autres dégradation

Pseudomonas et les bactéries sporulées peuvent dénaturer la matière grasse par

hydrolyse des acides gras insaturés ou oxydation ou les deux (Guiraud ,1998)

Les microorganismes pigmentes peuvent entrainer des colorations anormales du lait,

coloration bleu (Pseudomonas syncynea), jaune (flavobacterium) (bourgeois et al 1991) .

II.4.8.La protéolyse

Protéolyse: est le phénomène le plus complexe et le plus important de la maturation

des fromages; elle est subdivisée en deux étapes:

a. Protéolyse primaire: c'est une hydrolyse spécifique des caséines qui est

influencée par la concentration, la rétention d'eau, l'activité des enzymes elle-

même et le pH (Kalit et coll., 2005).

La protéolyse primaire représente l'étendue de la dégradation des caséines native en gros

peptides, et essentiellement liée à l'action des protéases contenues dans la présure,

notamment la chymosine et à celle de la plasmine, la protéolyse primaire est évaluée par

électrophorèses.( GRAPPIN et al. (1985) et PAVIA et al. (2000)) .

b. Protéolyse secondaire : correspond à l'hydrolyse des gros peptides par l'action

des protéinases et des peptidases des bactéries lactiques "levains" et "non levains" qui


18

donnent des peptides plus courts et des acides aminés. (GRAPPIN et al., 1985 ; PAVIA

et al., 2000), Cette dégradation a deux conséquences:

La pâte fromagère devient plus molle et plus onctueuse (action sur la texture de la

pâte).

il y a production de métabolites qui confèrent un arôme et une saveur particulière au

fromage (action sur la flaveur) (Eck, 1975).

Elle est favorisée par un long stockage à basse température, la protéolyse peut se

manifester directement par l‘odeur et paroo légère alcalinisation du lait : les germes

responsables sont : Micrococcus, Alcaligenes,Bacillus, Clostridium ,Pseudomonas Ces micro-

organismes interviennent directement ou par l‘action de leurs enzymes thermostables

(Guiraud,1998).

II.4.8.1.Activité protéolytique

Les BL exigent plusieurs acides aminés pour leur croissance et le milieu de culture

doit donc en contenir, sous une forme quelconque, pour leur permettre de se développer. Cela

explique pourquoi les milieux commerciaux destinés à la propagation des ferments

contiennent des peptones ou des extrais de levure. Il n‘y a malheureusement pas de milieu

universel pour les BL, car les exigences acides aminés varient avec les souches (carol.l ;

2002).

Il n‘y a que très peu d‘acides aminés ou de peptides libre dans le lait en fait, si les

Lactocoques ne disposaient que de cette source, leur population ne dépasserait guère 3 fois

10000000 unités formant des colonies (UFC) /ml (juillard et al 1996). On a démontré que la

majorité de l‘azote servant à la croissance des Lactocoques provient des caséine et que la

croissance des Lactocoques sur lait se fait croissance des oligopeptides libères de la

protéolyse de la caséine (juillard et al 1995).

Dans une culture mixte de BL il doit donc y avoir des souches qui synthétisent les

protéases pour qu‘une abondante croissance sur lait soit possible. Certains ferments sont

applés « lents» lorsque inoculés dans le lait. cette dénomination n‘est pas tout à fait exacte.

Car les ferments lents ont un taux initial de croissance aussi élevé que les cultures dites

rapides (Cogan 1980) les ferments lents ont typiquement des activités protéinasiques réduites.


19

Le métabolisme d‘hydrolyse des protéines affecte non seulement la croissance des

cellules, mais également la saveur des fromages. Une accumulation de peptides peut

provoquer de l‘amertume. Pour éviter ce défaut causé par certains ferments, les fournisseurs

préparent des cultures mixtes ayant des mélanges de souches avec diverses activités

protéolytiques et peptidasiques.

Le système protéolytique des bactéries lactique est compose de protéases associees a la

paroi cellulaire, qui catalysent l‘hydrolyse de proteines en peptides contenant de 7 a16 residus

amines (Law et Haandrikman, 1997).

II.4.8.2.Bactéries lactiques protéolytique

La croissance jusqu‘à des densités cellulaires permettant aux bactéries lactiques

d ‘assurer les fonctions de fermentation repose sur un système protéolytique capable de

satisfaire tous les besoins en acides aminés en hydrolysant les protéines. Les bactéries

lactiques démontrent des potentialités différentes, liées à leur équipement enzymatique,

pour l‘utilisation de la fraction azotée. Les lactobacilles présentent généralement une

activité protéolytique plus prononcée que les lactocoques (Donkor et al., 2007 ; Monnet et

al., 2008 ; Roudj et al., 2009) .

Le catabolisme des acides amines (des activités peptidases et amino-peptidases) ont

été rapportées chez LB.sakei , Lb. Cuvvatus et LB.plantarum (Fadd et al. ,1999a:1999b).

II.4.8.3.Intérêt de l’activité protéolytique des bactéries lactiques

Le système protéolytique joue un rôle clé dans la fermentation du lait et permet

l‘obtention d‘acides aminés à partir des caséines, les protéines les plus abondantes dans le lait.

(Savijoki et al .,2006) .

Les bactéries lactiques provoquent une augmentation des protéines solubles dans le

milieu et l'apparition de peptides et d'acides aminés qui outre le fait qu'ils stimulent la

croissance des microorganismes, interviennent dans la formation de certains composés

aromatiques(Savijoki et al.,2006).

Ce microorganisme est responsable d‘une activité protéolytique qui est le

phénomène dominant lors de l‘affinage. Cette activité contribue dans l‘apparition des


20

courts peptides et acides amines, précurseurs de nombreuses molécules riches en arômes et

en saveurs.

Or la dégradation de la caséine durant ce processus participe également à la

modification de la texture et la flaveur des fromages. A ce stade les aminopeptidases ont

l‘activité la plus forte en hydrolysant pratiquement la totalité des courts peptides

hydrophobes responsables de làpparition du goût des fromages (Desmazeaud, 1998).

Une fraction de ces peptidiques est susceptible d‘exercer des effets désirables chez le

consommateur après l‘ingestion de ce lait fermenté. Ces peptides sont désignés peptides

fonctionnels ou encore peptides bioactifs. Il y a quatre domaines principaux dans lesquels

lèffet observé lors de la consommation des produits laitiers, peut être attribue à ces

peptides, qui sont respectivement, le système digestif, les défenses de lòrganisme, le

système cardio-vasculaire et le système nerveux (Tome, 1998).

Certains Lactobacillus, notamment Lb. sakre, Lb curvatus et Lb. plantarum sont dotées

des leucine et valine amino-peptidases), contribuant ainsi a la formation de la flaveur du

produit par les produit par les acides amines et les petits peptides porduits (PAPAMANDI

et al.,2003)

Le catabolisme des acides amines peut résulter la formation d'autre produits dont

les méthyles et les alcools méthyles (TALON et al., 2002).


21


Notre étude a porté sur une durée de 3 mois de Mars à Mai et a été réalisée au niveau

des laboratoires de microbiologie et de biochimie de la faculté des sciences de la nature et de

la vie (Université KASDI Merbah Ouargla).

I. Matériel Biologique

I.1. Préparation de fromage frais (j’ben)

Un fromage (J‘ben) variété molle est produit selon un protocole traditionnel qui

comprend la coagulation de lait cru entier de vache collecté à partir d‘une ferme à Hassi

benaballah , à laquelle a été ajouté un sel dans une proportion de par litre de lait (Mennane et

al., 2007).

Le processus de fabrication nécessite trois grandes étapes essentielles (figure 1):

la maturation, la coagulation et l‘égouttage (Voire annexe 1).

Le salage peut être fait. C‘est une opération importante dans la fabrication des

fromages

Après l‘obtention du fromage frais on n‘a divisé ce dernier en trois portions ;

une est seulement salée

la 2éme portions additionné par l‘ail

la 3éme portions additionné par coriandre.

Cette préparation est résumée dans la figure 1


22

Lait cru

Maturation Fermentions spontanée a T°

Ambiante pendant 24-72h

Lait cillée

Coagulation

Egouttage

J‘ben gout coriandre j‘ben gout l‘ail

Figure 1: Schéma de la fabrication de fromage frais (j’ben).

J‘ben


23

II .Méthodes

II.1.Techniques de prélèvements et échantillonnages

On a effectué des prélèvements sur trois échantillons de fromage frais (j‘ben) :

a-j‘ben

b- j‘ben avec gout d‘ail

c –j‘ben avec gout de coriandre

II.2.Mesure de pH

Le pH des différents échantillons de j‘ben est mesuré par un pH-mètre, la mesure du

pH exprime la concentration en H+.

Après l‘étalonnage du pH-mètre, l‘électrode est placée directement dans la masse

l‘échantillon (j‘ben) (Saoudi., 2012).

On a rincé l‘électrode du pH-mètre avec de l‘eau distillée, après l‘électrode a été

insérée directement dans (Owusu et al, 2012).

II.3. Préparation des dilutions

II.3.1.Préparation de la solution mère

La solution mère a été préparée ; en introduit 1 g du fromage frais (j‘ben) dans un tube

stérile qui contient 9ml d‘eau physiologique ; l‘homogénéisation a été réalisée à l‘aide du

vortex après introduction du j‘ben.

Cette suspension constitue alors la dilution mère (DM) qui correspond à la dilution

1/10 ou 10-1

(Lebres et al., 2002).

II.3.2.Préparation des dilutions décimales

Un millilitre de la dilution mère (10-1

) est prélevé aseptiquement à l‘aide d‘une

micropipette et introduit dans un tube à essai contenant 9 ml d‘eau physiologique stérile. On

obtient ainsi la dilution 10-2 et on répète la même procédure en prélevant 1mlà partir de la


24

dilution 10-2

et en l‘introduisant aseptiquement dans un tube à essai contenant 9 ml du diluant

et ainsi de suite jusqu‘à 10-6

(Guiraud., 2003).

II.4. Isolement des bactéries lactiques

L‘isolement des bactéries lactiques est réalisé sur le milieu MRS solide à pH 6.2 et le

milieu M17, l‘isolement se fait en profondeur à partir des dilutions 10-3,

10-4

,10-5

.

Les cultures sont incubées pendant 24 à48 heures à 30 °C dans des boîtes de Pétri à

l‘obscurité. (Kacem et Karam, 2006, Cheriguene et al., 2007).

II.5.Purification

La purification des souches isolées est réalisée par repiquages successifs alternant sur

milieux sélectifs MRS liquide et solide (par la méthode des stries), et l‘incubation à 30°C.

(Kacem et Karam, 2006, Cheriguene et al., 2007).

La pureté des souches est révélée par des colonies homogènes ayant le même aspect

extérieur (couleur, taille et forme) (Guiraud, 2004).

Ces colonies pures sont retenues pour la suite de l‘étude.

II.6.Conservation des souches

La conservation des souches pures a été faite selon deux méthodes: à court et à long

terme.

A courte terme a été effectuée à 4°C dans des tubes à essais en géloses MRS

inclinées en tubes à raison d‘un repiquage toutes les 4 semaines

A long terme, les souches sont conservées dans une solution contenant 70% de lait

écrémé (enrichie par 0.5g/l d'extrait de levure et 0.5g/l de glucose) et 30% de glycérol

à 40% à -20°C (Samelis et al., 1994).

II.7. Identification des souches

L‘identification a été établie en se basant sur des caractères morphologiques et divers

caractères biochimiques : production d‘enzymes, température de croissance, production de

gaz carbonique, fermentation de divers sucre.


25

II.7.1.Pré-identification des souches

II.7.1.1. Caractérisation phénotypique des souches

II.7.1.1.1. Étude morphologiques

A/L’aspect macroscopique et microscopique

Cette étude est basée sur l‘observation visuelle de la culture des isolats sur milieu

MRS solide et liquide ; pour caractériser la taille, la forme et la couleur des

colonies sur milieu MRS solide (Badis et al, 2005). Et le trouble dans le milieu

liquide.

L‘étude macroscopique nous a permis de noter le diamètre, la pigmentation et l'aspect

des colonies. (Hassaine.O,2013)

B/L’aspect microscopique

L'étude microscopique par l‘intermédiaire de la coloration de Gram, nous a permis

d‘examiner la forme, le mode d‘association et le Gram de ces bactéries. (Hassaine

O ,2013)

La coloration de Gram a été effectuée selon le protocole décrit par (Prescott et al.,

2003 )(voir annexe 3).

Cette coloration permet de différencier les bactéries à Gram positif de celles à Gram

négatif, les bâtonnets, les coques et le mode de regroupement. (Hadef S.,2012)

II.7.1. 2. Production de la catalase

L‘activité catalytique permet la dégradation de l‘eau oxygénée en oxygène et en eau.

Elle est mise en évidence en émulsionnant une à deux colonies de l‘isolat de la souche à tester

dans une solution fraîche d‘eau oxygénée à 10 volumes. Un dégagement gazeux abondant

sous forme de mousse, traduit la décomposition de l‘eau oxygénée sous l‘action de l‘enzyme à

tester (Guiraud, 2003).

La catalase permet la décomposition de l'eau oxygénée selon la réaction :

2 H2O2 2 H2O + O2


26

II.7.2. Testes physiologique et biochimique

II.7.2.1. Testes physiologique

II.7.2.1.1. Croissance dans les conditions hostiles

A/Croissance à différentes températures (4, 15, 37 et 45°C)

Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques mésophiles des

bactéries lactiques thermophiles, ce test est réalisé en bouillon MRS. La croissance est

appréciée par un trouble du milieu après 24 heures à 4, 15, 37 et 45°C en comparaison avec

un tube témoin non ensemencé (Hassaine O.,2013).

B/Croissance en présence de différentes concentrations de Na Cl

Ensemencement des isolats dans des tubes de bouillon de MRS à 2 %, 4% et 6% de

NaCl l‘incubation se fait à 30°C pendant 24 heures. (Hassaine O.,2013)

La croissance de ces bactéries se manifeste par un trouble du milieu en

comparaison avec un tube témoin non ensemencé.

C/Croissance à pH 4 et 9,6

Ce test est réalisé uniquement pour les cocci en milieux MRS liquide dont le pH est

ajusté à 4et9, 6.

La croissance est appréciée par un trouble du milieu après 24 heures à 30C °

(Hassaine O ,2013).

II.7.2.1.2. Thermorésistance

Le teste de thermorésistance est destiné aux coques, il permet de sélectionner des

espèces thermorésistantes. Les souches à tester sont préalablement réparties dans des tubes

de milieu MRS. Ces tubes sont par la suite exposés à une température de 62°C pendant 30

min en suite on incuber a 30C° pendant 24 à 72heures (Hassaine O,2013)


27

II.7.2.1.3Type fermentaire

Ce test permet de différencier les bactéries lactiques homofermentaires de celles

hétérofermentaires. (Hassaine O,2013)

Il consiste à mettre en évidence la production du gaz (CO2). De jeunes souches

préalablement préparées sont ensemencées dans des tubes contenant du bouillon MRS, avec

une cloche de Durham. Après incubation à 37°C pendant 24–48 heures, la présence ou

l‘absence du gaz dans la cloche indique le type fermentaire (Hariri et al., 2009).

Les souches homofermentaires vont produire 90% d‘acide lactique et seulement 10%

de CO2, par contre les souches hétérofermentaires vont produire l‘acide lactique et le CO2 a

proportions égales (Carr et al., 2002).

II.7.2.1.4 Croissance sur lait bleu de Sherman

Une série de tubes à essais de 10ml de lait écrémé stérilisé à 0,1% et à 0,3% de bleu de

méthylène est ensemencé par des cultures pures puis incubés durant une période de24 à 48

heures à 30°C, on note que les observations relatives à la réduction de bleu de méthylène et la

coagulation du lait.

Seuls les entérocoques peuvent se développer dans le lait à 0,3% de bleu de

méthylène (Rabah N., 2010).

Et certaines coques sont capables de se développer sur du lait à 0.1% de bleu de

méthylène après incubation à 30°C pendant 48 heures (Hassaine O,2013).

II.7.2.2. Test biochimique

II.7.2.2.1. Profile fermentaire

Les bactéries lactiques dégradent différemment les sources de carbone. L‘étude de la

fermentation des sucres est réalisée sur le milieu spécifique bouillon MRS (sans le glucose

et l‘extrait de viande), additionné de pourpre de bromocrésol comme indicateur de pH

(MRS-BCP) (Bekhouche et (Boulahrouf, 2005, Mannu et al., 2000) .


28

Les solutions de sucres ont été préparées dans 10 ml d‘eau distillée contenant 1 g des

différents sucres. Ces préparations sont stérilisées par chauffage au bain Marie à 100°C

pendant 10 min puis conservées au réfrigé rateur (Joffin et Leyral,1996).

Les sucres que nous avons testés sont : Arabinose, Glucose, Lactose, Maltose ,

Rhamnose, Saccharose, Sorbitol , Sucrose, Tréhalose, Xylose. Nous avons effectué

l‘identification des souches en nous référant au manuel de Bergey (De Vos et al., 2009).

Ce test est résumé dans les étapes suivantes :

Dans des tubes à hémolyse stériles, on mit 1ml de MRS BCP.

On récupère les culots après centrifugation des cultures jeunes des souches

étudiées après lavage par l‘eau distillée.

On ajoute 0,1ml de chaque sucre dans les tubes précédents.

On ensemence le contenu des tubes avec 0,1ml des souches et en dernier on y

ajoute une goutte d‘huile de paraffine stérile pour l‘anaérobiose.

L‘incubation se fait à 30°C pendant 24 à 48 h. (Rabah N., 2010).

Le virage de la couleur du milieu du violet au jaune indique la fermentation du sucre

donc la souche a dégradé le sucre (résultat positif), si non le résultat est négatif. (Hariri et

al., 2009).

II.7.2.3.Tests technologiques

II.7.2.3.1. Test de citrate

L‘utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980) (Kihal et al

,1996 ; Moulay, 2006). Ce milieu contient une solution de ferricyanide de potassium et une

solution de citrate ferrique. La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l‘ion

ferrique et le potassium ferricyanide. Les colonies qui fermentent le citrate lancent la réaction

entre ces ions il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18 h-

72 h d‘incubation). Les colonies incapables de fermenter le citrate restent blanches. (Marchal

et al., 1991).

Citrate-positive : culture avec alcalinisation du milieu (virage de l‘indicateur au bleu).


29

Citrate-négative : pas de culture (coloration verte de milieu inchangée) (Marchal et

al., 1991).

II.7.2.3.2. Production de dextrane

La production du dextrane (exo-polysaccharides) à partir du saccharose est mise

en évidence sur milieu solide MSE (Mayeux et al., 1962). L‘ensemencement des isolats se

fait par méthode de strie, et incubées à 30°C pendant 24h à48h.

Les souches productrices de déxtrane sont caractérisées par la formation de colonies

larges, visqueuses et gluantes. Ce test est aussi considéré comme clé d‘indentification

permettant aussi de différencier entre les leuconostocs productrices et non productrice de

dextran.

II.7.2.3.3. la recherche l’arginine dihydrolase (ADH)

La mise en évidence de cette enzyme est intéressent pour la caractérisation des

bactéries lactiques. Le rôle de cette enzyme est de libérer l‘ammoniac à partir de l‘arginine.

Pour effectuer ce test on utilise le milieu M16 BCP par l‘ensemencement en stries

et l‘incubation se fait à 30 °C pendant 24 h (Thomas ., 1973).

Ce milieu contient un indicateur de pH, le pourpre de bromocrésol, si la couleur du

milieu vire au jaune puis vers le violet ceci indique la présence de l‘enzyme et la dégradation

de l‘arginine. Si elle reste jaune cela veut dire que la bactérie est ADH négative.

II.8. Étude de l’activité protéolytique des isolats (Hassaine O,2013).

II.8.1. Activité protéolytique en milieu solide.

L‘activité protéolytique des bactéries est mise en évidence et comparée sur un milieu

plus riche(MRS) additionné de lait écrémé (YMA) (Van Den Berg et al., 1993).

Les bactéries à tester, issues d‘une culture jeune,

Pour le milieu YMA : Ont été ensemencées en touches à l‘aide d‘une anse de platine.

Après incubation à 30°C pendant24 h


30

L‘activité protéolytique de ces isolats se manifeste par l‘apparition d‘un halo clair

autour des colonies. (Hassaine O,2013).

II.9. Cinétique d’acidité

L‘un des caractères technologiques essentiels des bactéries lactiques est leur aptitude à

l‘acidification du lait qui dépend de l‘aptitude à la fermentation du lactose et de la résistance à

l‘acide développé dans le lait écrémé stérile

La mesure de l‘activité acidifiante consiste à suivre d‘une part l‘évolution du pH des

différentes cultures en fonction du temps et d‘autre part à doser simultanément l‘acidité totale

par la soude (Hadef S., 2012).

L‘acide lactique produit par les souches isolées est mesuré à l‘aide d‘un Ph mètre

puis titré par le NaOH 1/9 N en présence d‘un indicateur de pH (la

phénolphtaléine 1%). Cette acidité est exprimée en degré Dornic (D°).

Un degré Dornic correspond à l‘acidité apporté par 0,1g d‘acide lactique dans un litre

de lait.

Chaque souche est ensemencée dans un tube à 10 ml de lait écrémé stérile puis

incubés à 30°C pendant 24h. Dés que le lait coagule, on mesure le pH et on note la souche la

plus acidifiante, la moins acidifiante et qui acidifié le lait moyennement.

Dans flacon contenant 100 ml de lait écrémé stérile, on transfère 3ml de lait coagulé

de chaque tube sélectionnés puis on homogénéise.

Le flacon est réparti dans des tubes stériles à raison de 10ml de lait par tube puis en

mis dans l‘incubateur Figure 2.

La quantité d‘acide lactique est calculée après différents temps (2h, 4h, 6h, 8h, 18h

et24h). (Rabah N.,2010) .

L‘acidité est déterminée par la formule :

Acidité (°D) = V NaOH x 10

V NaOH: Volume de NaOH utilisé pour titrer l‘acide lactique contenu dans les 10ml de lait.

La mesure de pH est faite directement par le pH-mètre, en plongeant l‘électrode dans

le volume du lait. Le pH a été déterminé à chaque fois qu‘on procède au dosage de l‘acide

lactique


31

0,1ml 10 ml de lait écrème 30C° / 18h

Culture jeune de 18h

Sur MRS 3ml

100ml de lait écrème

0h 2h 4h 6h 8h 18h 24 h

Figure 2 : Schéma résumant la méthodologie utilisé pour l’étude de Cinétique d’acidité

Résultats et discussion


32

III RESULTATS ET DISCUSSION

A fin d‘étudier le pouvoir protéolytique des bactéries lactiques isolées d‘un produit

laitier fermenté (J‘ben) on a passé par plusieurs tests.

III.1.Mesure de pH

Les résultats de mesure du pH de chaque échantillon montrent que :

a-J‘ben Sallé 5

b- J‘ben avec gout d‘ail 4,5

c –J‘ben avec gout de coriandre 4,7

Ces résultats du pH montrent que le J'ben possède un pH acide, ceci est due à la

production des acides organique qui abaissent le pH (l‘activité acidifiante).

Les différences des valeurs de pH de J‘ben par rapport aux autres produits peuvent être

dues à la méthode de préparation, au type de lait, à la date de préparation ou peuvent être liées

au type d‘alimentation donnée aux animaux (Ouadghiri., 2009).

III.2.Isolement, purification

A partir des 3 échantillons du J‘ben, on a isolé les bactéries lactique sur milieu MRS

et M17 solide.

La purification des souches lactiques isolées par plusieurs repiquages successifs

sur milieu M17et MRS (alternant sur milieux liquide), on a obtenu 27 souches pures du

j‘ben, les colonies sont d‘un aspect (couleur, taille et forme) typique et homogènes, ils ont

été gardées pour la suite de l‘étude (Figure 3 et 4).


33

Figure 3: des colonies des bactéries Figure 4 : des colonies des bactéries

Lactiques sur le milieu MRS lactiques sur le milieu M17

III.3.Pré-identification des souches

Lors de cette étude nous avons identifié les souches isolées à partir du lait de vache par

les procédures phénotypique conventionnelles basées sur les tests morphologiques,

physiologiques et biochimiques.

III.3.1.Caractérisation phénotypique des souches

Ces tests sont effectués pour but de déterminer le genre des souches isolées

III.3.1.1.Étude morphologiques

A/L’aspect macroscopique

- Sur milieu solide

Les cultures obtenues sur les boites de Pétri sont observées à l‘œil nu pour caractériser

la forme, la taille, l‘aspect ainsi que la couleur des colonies (Badis et al., 2006).

Ces colonies sont apparues de petite taille, de forme circulaire ou lenticulaire, avec

une couleur blanchâtre et d‘un pourtour régulier (Figure 5) (Voir le tableau III).


34

Figure 5: L’aspect macroscopique de la souche sur milieu MRS

- Sur milieu liquide

La croissance des bactéries apparaît sous forme de trouble homogène fumeux dans le

milieu MRS liquide, ce trouble est concentré au fon du tube à la recherche des conditions

anaérobiques de ces bactéries. (Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002)(Figure 6).

Figure 6: Aspect d’une culture pure dans un milieu liquide

B/L’aspect microscopique

L'étude microscopique est basée sur la coloration de Gram (Figure 7).


35

L‘observation microscopique a révélé que les colonies isolés et purifiés

sont Gram positif, apparaissant sous différentes formes avec différents modes

d‘associations.

Cette observation a montré que les souches étudiées sont des cocci isolés ou en

chainettes.

Les résultats de l‘examen microscopique sont illustrés dans le tableau III.

Figure7: Observations microscopiques des bactéries lactiques avec un grossissement

(G : 10x100)

III.3.2.Production de la catalase

L‘activité catalytique permet la dégradation de l‘eau oxygénée en oxygène et en

eau, par la mise en contact des colonies avec quelques gouttes d‘eau oxygénée (Guiraud,

2003).

Un dégagement gazeux abondant sous forme de mousse, traduit la décomposition

de l‘eau oxygénée sous l‘action de l‘enzyme à tester (Guiraud, 2003).

Toutes les souches lactiques isolées sont à catalase négative car l‘absence de

dégagement gazeux (O2) (Voir le tableau III).


36

III.4.Identification des souches

Après effectuer l‘examen de la recherche de la catalase et la coloration de Gram,

toutes les bactéries Gram positif et catalase négatif sont présumées comme bactéries lactiques

(Kihal, 1996 ; Carr et al, 2002).

Les isolats Gram positif, catalases négatifs sont étudiées pour déterminer leurs

espèces.

III.4.1.Testes physiologique et biochimique

III.4.1.1. Testes physiologique

Les résultats des tests physiologiques sont résumés dans Le tableau III.


37

Tableau III : résultats des tests physiologiques

Tests

Souches

Gram

Catalase

Forme de cellules

Et

Regroupement

Type

fermentaire

Test physiologique et lait de Sherman

Test biochimiques Lait de

Sherman PH Na cl Températures

2

%

3

% 4 9

2

%

4

% 6% 4°C 15°C 37°C

42°C

62°C

Dégradation

de citrate ADH Production de EPS

S8 + - Cocci ; isolé Hétérofermetaire + - + + + - - - + + - - - - -

S9 + - Cocci;

Chaînette Homofermentaire + - + + + - - + + + - - - - -

S10 + - Cocci;

Chaînette Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -

S13 + - Cocci ; isolé Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -

S14 + - Cocci;

Chaînette Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -

S16 + - Couque- isolé Homofermentaire + - + + + + - + + + - - - - -

S17 + - Homofermentaire - - + + + + - + + + - - - - -

S18 + - Cocci ; isolé Homofermentaire / / + + + + + - + + - + - - -

S19 + - Cocci ; isolé Homofermentaire + - + + - - + + + + + - - - -

S21 + - Cocci ; isolé Homofermentaire + - + + + - - - + + - - - - -

S22 + - Cocci ; isolé Homofermentaire / / + - + + + - + + + - - - -

S23 + - Cocci- diplocoque Homofermentaire / / + - + + + - + + + - - - -

S24 + - Cocci- diplocoque Homofermentaire / / + - + + + + + + - - - - -

S27 + - Cocci ; isolé Hétérofermentaire / / - + + + - - + + - + - + -

S28 + - Cocci ; isolé Hétérofermentaire + + / / / / / / / / / / - + -

S29 + - Cocci ; isolé Hétérofermentaire + + + + + + - + + + - - + + -

S116 + - Cocci ;isolé Hétérofermentaire + + + + / / / + + + + - + + -

S128 + - Cocci ;Chaînette +7 Homofermentaire + - + + + + + - + + + + - + -

S129 + - Cocci ;

Chaînette +4 Hétérofermentaire + + + + + + + + + + - - - + -

S132 + - Cocci ;

Chaînette 2à3 Hétérofermentaire + + + + + + - + + + + + - + -

S133 + - Cocci ;

Chaînette 5à7 Homofermentaire + + + + + + - - + + + - - + -

S134 + - Cocci ;

Chaînette 3à5 Homofermentaire + + + + + + - / / / / / - + -

S135 + - Cocci ;

Chaînette >5 Homofermentaire + + - + + + - + + + + + - + -

S143 + - Cocci ;

Chaînette Homofermentaire + + / / / / / / / / / / - + -

S145 + - Cocci ;diploco-que Hétérofermentaire + + - + + + + + + + - + - - -

S146 + - Cocci ;

Chaînette Homofermentaire / / / / / / / / / / / / - - -

S148 + - Cocci ;diploco-que Hétérofermentaire + + - + + + - + + + - - - - -

S149 + - Cocci ;

Chaînette Homofermentaire + + - + + + - - + + - - - - -


38

III.4.1.1.1.Croissance dans les conditions hostiles (en différents température, pH, NaCl).

Ce test est réalisé dans le but de différencier les lactocoques des Entérocoques,

Nous avons remarqué que la majorité des souches testées capable de croitre sur

milieu MRS liquide à pH 4 et 9 (Figure 8).

Pour des concentrations différentes de Na Cl la pluparts des isolas poussent a 2%

et 4% et la moitie pu croitre a 6% de Na Cl (Figure 8).

Tous les souches poussent à température 15C° et 37C°, seulement 13 souches se

multiplier a 4C° et la plut parts des souches sont incapables de se multiplier à

la température 42 ºC à l‘exception de 8 souches Ce qui assure que ces souches

sont mésophiles en générales(Voir le tableau III).

Figure 8: Résultat des tests physiologique (déférents pH et NaCL).

III.4.1.1.2.Thermorisistance

La pluparts des isolats n'ont pas des thermorésistantes sauf 7 souches (après

traitement à 62C° pendant 30 min) (Voir le tableau III).

III.4.1.1.3. Type fermentaire

Ce test permet d'apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est

transformé, il consiste à mettre en évidence la formation de CO2 qui est piégé dans une

cloche de Durham en milieu MRS-BCP glucosé pour les bacilles (Hassaine O, 2013).

Ce test permet de différencier les isolats homolactiques des hétérolactiques après

une incubation à 30°C pendant 24 heures jusqu'à 72 heures (Hassaine O,2013).


39

La plus parts des souches sont homofermentaires qui fermentent le sucre en lactate

sans produire du gaz, et les autres souches sont hétérofermentaires où il y a un dégagement

de gaz qui va poussée la cloche de Durham vers le haut (Figure 9).

Figure 9: Type fermentaire sur milieu MRS liquide glucosé contenant la cloche de

durham.

Les bactéries lactiques homofermentaires comprennent les espèces de lactocoques,

pediocoques, ainsi que certains lactobacilles. Cette voie conduit dans des conditions optimales

de croissance à la production de deux molécules de lactate et deux molécules d‘ATP par

molécule de glucose consommée. (Thompson et al., 1994).

Les bactéries lactiques qui fermentent le glucose en produisant, en plus de l‘acide

lactique, de l‘acétate, de l‘éthanol et du CO2 sont dites hétérofermentaires. Les groupes

principaux de bactéries présentant ce type de métabolisme sont les leuconostoc et certains

lactobacilles. Ces microorganismes sont dépourvus d‘une FBA et le système de transport PTS

(Thompson et al., 1994).

III.4.1.1.4. Test de lait de Sherman

Ce test est basé sur le mode respiratoire des souches ensemencées, Les résultats

de ce test est résumé dans le tableau III.


40

Pour les résultats positives on a obtenus 21 souches qui ont réduit le bleu de

méthylène 1% et 8 souches qui ont réduit le bleu de méthylène 3%, ceci signifie que

ces souches sont des entérocoques, elles vont tirés leurs oxygène depuis le bleu de

méthylène présent dans le lait, donc ce dernier va perdre sa couleur (Figure 10).

Et on a obtenus 8 souches qui ont donné des résultats négatifs pour le bleu de

méthylène 3%, et une seule souche pour le bleu de méthylène 1% ,ceci signifie que

ces souches sont des lactocoques qui sont microaérophiles, elles vont utiliser

une petite quantité d‘oxygène qui ne peut pas changer la couleur du lait donc il

reste bleu (Figure 10).

Figure 10: Le test de lait de Sherman

III.4.1.2. Test biochimique

III.4.1.2.1. Profile fermentaire

Nous avons identifié les bactéries au niveau de l‘espèce et même parfois de la

sous-espèce, en établissant leur profil fermentaire à l‘aide de plaque d‘Eliza (Figure

11).

Donc ce test est utilisé pour but d‘identifié les isolats au niveau de l‘espèce, Seules les

isolats qui on un effet inhibiteur sont identifiées, Les résultats obtenus sont résumés dans le

tableau IV.


41

Figure 11 : Le profil fermentaires des isolats effectué sur microplaque.

Couleur jaune dégradation du sucre. Couleur bleue résultat négatif.

Tableau IV: Profil fermentaire des souches isolées.

les sucres

Les souches

tréh

alo

se

Su

cro

se

rha

mn

ose

xy

lose

ma

lto

se

glu

cose

lact

ose

Sa

cch

aro

se

ara

bin

ose

So

rbit

ole

Souches identifié

Souche 8 + + + _ _ + _ _ _ + Leuconostoc mesonteroide

Souche 9 + + + + _ _ _ _ + + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 10 + + _ + _ _ _ _ + + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 13 _ + _ +/- +/- _ _ _ + _ Lactococcus crémoris

Souche 14 + + +/- +/- + + + + + _ Lactococcus raffinolactis

Souche 16 + + +/- +/- + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 17 + + _ _ + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 18 _ + _ _ + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 19 _ + _ _ + + + + + + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 21 + + _ _ + + + + + _ Lactococcus raffinolactis

Souche 22 _ + _ _ + + + + + _ Lactococcus lactis subsp lactis

souche 23 _ _ + _ + + + + _ _ Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 24 + + _ _ _ _ + _ _ _ Lactococcus lactis subsp lactis

Souche27 _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Weissella halotolerans

Souche 28 _ _ _ + _ _ _ + _ _ Entérococcus


42

Souche 29 + + _ + _ _ + _ _ + Entérococcus durans

Souche 116 _ + _ + + _ + _ _ _ Entérococcus durans

Souche 127 _ _ _ _ _ + _ + _ _ Lactococcus lactis subsp

crémoris

Souche 128 _ + _ _ _ _ _ _ _ _ Pediococcus pentosaceus

Souche 129 _ + _ + _ _ + _ + _ Entérococcus durans

Souche 132 _ + _ _ + _ _ _ _ _ Entérococcus faecuim

Souche 133 _ _ _ _ _ _ _ + _ _ Lactococcus lactis subsp

crémoris

Souche 134 + _ _ _ + + _ _ _ _ Lactococcus lactis subsp

crémoris

Souche 135 _ _ + + + + _ _ _ + Lactococcus lactis subsp

crémoris

Souche 145 _ _ _ _ + + + + _ + Leuconostoc lactis

Souche 146 _ _ _ _ _ _ + + _ + Entérococcus durans

Souche 148 _ _ + + _ _ _ + _ + Lactococcus lactis subsp lactis

Souche 149 _ _ _ _ _ + _ _ + + Lactococcus lactis subsp lactis

Le virage de couleur de milieu M16BCP indique que les souches ont dégradé la

pluparts des sucres ajouté dans le milieu Figure 11.

Le profil fermentaire des sucres nous a permis de confirmer la pré-identification de

nos isolats en se basant sur des donnés bibliographiques établis par ( Carr et

al., 2002 et Khedid et al, (2006)).

III.4.1.3. Tests technologiques

III.4.1.3.1. Test de citrate

Le milieu KMK différencié entre les bactéries qui utilisent le citrate pour donner des

produits aromatiques et les bactéries qui n‘utilisent pas le citrate. Dans le premier cas les

résultats se manifestent par des colonies de couleur bleus contrairement les résultats négatif

donnent des colonies de couleur blanche (Figure 12).

Sur milieu KMK (1980) qui est utilisé pour savoir le pouvoir des bactéries de

dégrader le citrate, ce dernier qui se trouve en faible concentration dans le lait mais il est

constitue néanmoins une substance clé dans l‘élaboration des produits laitiers

fermentés (François, 1986 ; Sanchez et al, 2005).

Les souches capables de fermenter le citrate permettant la réaction entre l‘ion


43

ferrique et le potassium ferricyanide de cette façon résulte la formation des colonies

bleues, et ces les cas pour les souches : S29et S106, contrairement pour les autres souches

qui ne dégradent pas le citrate cette perte de la capacité d‘utiliser le citrate est peut être due

à une perte de plasmide codant pour le citrate permease (Kihal et al, 1996) (résultats dans le

tableau III).

Figure 12: Résultat de la dégradation de citrate sur milieu KMK

III.4.1.3.2. La production de dextrane

Milieu MSE est utilisé pour détectée La production des exopolysaccharides (la

formation de colonies gluantes).

La production de exopolysaccharides sur milieu saccharosé MSE est un critère

important pour différencier entre les espèces de bactéries lactiques (Kheddid et al, 2006).

D‘après ce test on a obtenue des résultats négatifs pour touts les souches lactiques qui

sont incapables de produire les exopolysaccharides ceci inhiber la croissance des colonies

visqueuse, gluante (résultats dans le tableau III) (Figure 13).


44

Figure 13: Test de production des exopolysaccharides ( dextrane)

III.4.1.3.3. Recherche de l’Arginine dihydrolase (ADH)

Sur M16BCP on observe que la majorité des isolats n‘ont pas la capacité à

hydrolyser l‘arginine, car ne possèdent pas l‘ADH (arginine déhydrolase) (Kheddid et

al., 2006), ceci signifié que Les bactéries lactiques utilisent le lactose en acidifiant le

milieu, les colonies donnant ainsi une coloration jaunâtre (Figure 14).

Et les autres isolats sont capables d‘utiliser l‘arginine et ré-alcalinisent le milieu,

leurs colonies apparaissent blanchâtres. La couleur de l‘indicateur de pH demeure inchangée

(mauve) (résultats dans le tableau III).


45

Figure 14: Résultat du test d’hydrolyse de l’arginine

III.5. Étude de l’activité protéolytique des isolats

La protéolyse catalysée par les enzymes bactériennes est un des événements

biochimiques essentiels de la maturation du fromage (Muyncka et al. , 2004).

L'hydrolyse des caséines du lait modifie la texture de la pate et les acides amines

et peptides liberes sont précurseurs des composes responsables de l'arome des fromages.

L'activité protéolytique est également une caractéristique technologique

importante chez les bactéries lactiques puisqu'elle leurs confère la capacité de croître

efficacement dans le lait( Maghnia.D.,2011). ce milieu étant déficient en sources azotées

disponibles.

L‘activité protéolytique des souches isolées a été traduite par la présence d‘un

halo claire d‘hydrolyse de la protéine du lait (caséine) sur boite de MRS

additionnée de lait écrémé à des concentrations de 1% et 2%( Maghnia. D., 2011),

Les résultats sont montrés que après l‘identification des 27 souches, nous avons

obtenu 16 souches protéolytiques, 13 isolées à partir de milieu MRS et 3 souches isolées à

partir de milieu M17 (Figure 15) et parmis les souches qui n‘sont pas protéolytiques ont sites

Leuconostoc mesonteroide et Weissella halotolerans .


46

Les genres Lactococcus, Lactobacillus composant la flore des ferments

lactiques possèdent des systemes de degradations des proteines qui contribuent grandement a

la protéolyse du fromage (Zeppa et al 2001).

Nos résultats ont révélés que tous les souches isolées (Lactococcus lactis subsp

lactis , Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus, Entérococcus durans,

Pediococcus pentosaceus) sont à coloration Gram positives et catalase négatives.

Parmis les Lactococcus isolées nous avons remarqués que la pluparts ne se

développent pas en concentration 6% de NaCl.

Notre étude montre la présence des coques et l‘absence des bacilles, dans

les échantillons du lait fermenté traditionnellement (J‘ben) sur 27 souches lactiques

isolées.

On remarque aussi que la plus part des lactocoques isolées apartiennent à l‘espèce

Lactococcus lactis subsp lactis cette especes a été signalé comme majoritaire dans les lait

crus étudier en Algérie (Karam, 1995 ; Rouisset et al., 2006).

L‘activité des enzymes protéolytique est fondamentale, car elle complète l‘action de

la présure restant dans le caillet. La protéolyse due aux bactéries lactiques va surtout

conduire à des précurseurs pour de nombreux produits d‘aromes (Desmazeaud, 1992,

Sanni et al 2002).

Les bactéries lactiques protéolytiques participent donc à l‘amélioration de la

qualité organoleptique du produit fini.

Ces résultats nous permettent de comfirmer d‘une part le caractère

protéolytique ou non des souches isolées et d‘autres parts la présence d‘une protéase

de paroi comme il a été raporté par les travaux de (Desmazeaud, 1992, Sanni et al

2002).

Certaines bactéries lactiques sont capables de produires des composées

d‘aromes qui participent aux qualités organoleptiques des fromages.

Etant donné les éxigences nutritionnelles des bactéries lactiques


47

(Desmazeaud, 1992), ces défférences entre les laits vont avoir des conséquences sur

la croissance et production de métabolites de ces microorganismes dans le lait.

Figure 15: Étude de l’activité protéolytique sur milieu YMA

III.6. Cinétique d'acidité

Parmi les bactéries isolées à partir de J‘ben , on a choisi une souche

protéolytique :

La souche 19 qui est moyennement acidifiante afin de suivre leur cinétique

d‘acidification, le pH a diminué progressivement en fonction du temps (Tableau V).

Par contre le degré Dornic a augmenté à cause de l‘augmentation de l‘acide lactique

présent dans le milieu de culture (Figure 16).


48

Figure 16 : Résultat de la cinétique d'acidité

La production de l‘acide lactique à été suivie en fonction du temps en utilisant la

culture pure de la souche sélectionnée S19, cette activité acidifiante est souvent utilisée

dans le choix de la souche pour l‘industrie alimentaire.

Le suivi de la quantité d‘acide lactique produite et l‘évolution du pH dans les

conditions mésophiles nous a permis de conclure que le temps d‘incubation à influencer

positivement sur le rendement de notre souches. Les résultats sont présentés sous forme

de diagramme (Figure17et 18).

De ces résultats nous avons constaté que la quantité d‘acide lactique produite change

selon le stade de vie de la bactérie cette différence de production peu être expliqué par une

déficience dans le système du transport des substances fermentescibles du milieu vers le

cytoplasme cellulaire. (Albenzino et al, 2001).

Nous remarquons aussi que la production d‘acide lactique par notre souche est

moins importante, on explique ceci par leur métabolisme hétérofermentaire donc la

production d‘autre composé organique tel que l‘acide acétique, le glyceraldehyde,

l‘éthanol et le CO2 plus l‘acide lactique (Kihal et al ,2006).


49

Le suivi du pH montre une diminution progressive pour la souche sélectionnée, cela

s‘explique par plusieurs facteurs le plus important est l‘aptitude de souches a possédé une

activité protéolytique qui est codé par un matériel extra-chromosomique (Juillard et

al, 1998).

TableauV : la variation de pH et de degré Dornic en fonction du temps chez la souche

S19

V: volume de Na OH coulé D°: degré dornic

Figure 17: Variation de pH en fonction du temps chez la souche S19

Souche 19

Ph V D°

0h 6.6 1.3 13

2h 6.57 1.5 15

4h 6.4 1.7 17

6h 6.22 2 20

8h 6.09 2.4 24

18h 5.22 4.7 47

24h 5.17 5.1 51


50

Figure 18: variation de l’acidité exprimée en degrés Dornic en fonction du temps

chez la souche S19

Conclusion

Conclusion

51

Conclusion

Pour prolonger la duré de conservation du lait il est transformé a autres produits

fermentées, cette fermentation qui est due à l‘activité des bactéries lactiques présentent dans

le lait.

Les produits laitiers sont très variées, consomable a cause de leur richesse en matières

nutritives, J‘ben ce produit laitier traditionnel provient d‘une fermentation spontané, préparé à

base du lait cru.

Notre travail est débuté par l‘isolement et la purification de 27 souches à partir de

3 échantillons d u J‘ben préparé au laboratoire àbase du lait cru de vache.

L‘isolement s‘est effectué sur milieux MRS et M17ou on a obtenu des colonies

blanchâtres rondes lisses et de formes lenticulaires de petite taille.

Après la purification des isolats ont subit une identification en utilisant la galerie

biochimique classique les tests effectuer on révélé d‘identifier les espaces suivante :

(Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis,

Entérococcus, Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide

et Weissella halotolerans )

Notre étude s‘est ensuite développée autour de ces souches isolées de J‘ben en

examinant certains caractéristiques d‘intérêt technologique afin d‘évaluer leurs potentiels

pour un éventuel usage industriel. Dans cette partie, nous nous sommes intéressés

spécialement à leur activité acidifiante, l‘activité protéolytique (Omar hassaine ,2013).

L‘activité protéolytique des souches isolées a été traduite par la présence d‘un

halo claire d‘hydrolyse de la protéine du lait (caséine) sur milieu Y M A , On a

obtenu 16 souches protéolytiques( qui appartienne au espèces : Lactococcus lactis subsp

lactis , Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus, Entérococcus

durans, Pediococcus pentosaceus),ainsi elles ont la capacité de produire des substances

aromatiques ce qui leur donne un intérêt technologique dans la fabrication des différents

fromages. (Hassaine O .,2013)

Perspective

Identification moléculaire est très essentielle pour mieux identifier les isolats ;

Caractérisation physico-chimique partielle de l‘activité protéolytique ;

Dosage de l‘activité protéolytique.

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51 p.

Annexes

Annexes

Annexe1 : les étapes de préparation du J’ben

I.1.1.1. la maturation

On a incubé lait cru à température ambiante pendant un temps variable de façon à

favoriser la multiplication d‘une flore lactique qui va jouer un rôle important dans

l‘acidification du lait.

Cette maturation a été accélère par adjonction de levains.

I.1.1.2. La coagulation

Cette opération qui vise à coaguler le lait au moyen de la présure (emprésurarge) ou de

toute autre enzyme coagulante. L‘activité coagulante est déterminée par la force de

présure, la température du lait et son acidité. Après l‘emprésurage, le lait est abandonné au

repos à température ambiante pendant 6 à 10 heures. Il va prendre en masse (caillage) avec

une consistance plus ou emoins ferme selon le degré d‘acidité développé.

I.1.1.3. L’égouttage

Se fait a l‘aide d‘un tissu très fin pendant 24 heurs, il permet l‘élimination de la plus

grande partie du sérum qui imprègne le coagulum. L‘égouttage est amorcé dans des

moules qui confèrent au fromage sa forme.

Annexes

Annexe 2 : Milieux de culture

Milieu MRS (Man Rogosa et Sharpe, 1960)

Extrait de levure 5 g

Extrait de viande 10 g

Polypeptone 10 g

Citrate de sodium 2 g

Acétate de sodium 5 g

Glucose 20 g

KH2PO4 2 g

MgSO4 0,25g

MnSO4 0,05 g

Agar-Agar 15 g

Eau distillée 1000 ml

pH 6.2

Autoclavage 120°C/ 20 minutes

Milieu MSE (Mayeux, Sandine et Elliker, 1962)

Tryptone 20 g

Gélatine 2.5 g


Saccharose 100 g

Glucose 5 g

Citrate de sodium 1 g

Azide de sodium 0.075 g

Agar-Agar 15 g


pH 6,8


Annexes

Milieu KMK (Kempler et Mc Kay, 1980)


Biopolytone 2,5g

Glucose 5 g

Agar 15 g


pH 6.6

Le milieu est réparti à raison de 100 ml par flacon, puis autoclavé 15 minutes à 121°C.

Au moment de l‘emploi on ajoute :

1 ml d‘une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10 % (p/v)

1 ml d‘une solution aqueuse à 2.5 % (p/v) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)

Ces solutions sont stérilisées par filtration sur filtre millipore 0.22 μm et sont

conservées à l‘obscurité à 4°C.

Milieu M16 BCP (Thomas, 1973)

Extrait de levure 2,5 g

Extrait de viande 5 g

Peptone 10 g

Acide ascorbique 0,5 g

Lactose 2 g

L-arginine 4 g

Pourpre de Bromocrésol 0,05 g

Agar-Agar 15 g


pH 6,8

Autoclavage 120°C pendant 20 minutes

Milieu MRS BCP

MRS (milieu liquide) moins l‘extrait de viande et sans sucre

1000 ml

Bromocrésol pourpre 0,025 mg

pH 7.0


Annexes

Lait écrémé

Lait en poudre 110 g


Extrait de levure 3g

Autoclavage 110°C pendant 10 minutes

Eau Physiologique

Chlorure de sodium 8,5 g

Peptone 0,5 g


pH 7,0

Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.

le milieu YMA :

On a prépare le milieu MRS à part et l‘ait écrémé à part et par la suit on

1% 90ml de MRS +10ml de l‘ait écrémé.

2% 80ml de MRS +20ml de l‘ait écrémé.

Annexes

Annexe 3: Coloration de Gram

1- Déposer une goutte d‗eau physiologique stérile sur une lame bien propre

2- Prélever un échantillon de colonie et mélanger avec la goutte d‗eau, strier et sécher

par passage rapide sur la flamme d‗un bec benzène

3- Couvrir le frottis par du cristal violet pendant 60 secondes

4- Laver l‗excès du colorant avec de l‗eau distillée

5- Couvrir de lugol pendant 30 secondes

6- Laver à l‗eau distillée pendant 5 secondes

7- Rincer immédiatement le frottis avec le mélange alcool - acétone en inclinant la

lame et par goutte à goutte jusqu‗à disparition complète de la coloration violette


9- Couvrir avec de la fuschine pendant 15 secondes


11- Déposer une goutte d‗huile à immersion sur le frottis et observer au microscope à un

fort grossissement.

Les cellules Gram+ absorbent la couleur du cristal violet et demeurent bleues violettes

en apparence, contrairement aux cellules Gram- qui apparaissent distinctement rosâtres.

Résumé

Nous avons isolé et purifié 27 souches à partir de 3 échantillons d‘un produit laitière fermenté traditionnel (J‘ben) à

base de lait de vache cru collecté à partir d‘une ferme à hassi sidi benaballah(une portion seulement salée ;la 2éme

portions additionné par l‘ail, la 3éme portions additionné par coriandre).

L‘identification phénotypique des isolats a été assurée en utilisant des méthodes classiques de microbiologie

ou on a pu identifier les genres suivants : (Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus

raffinolactis, Entérococcus, Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide et Weissella

halotolerans )

Nous avons par la suite examiné chez ces souches certaines caractéristiques d‘intérêts technologiques afin

d‘évaluer leurs potentiels pour un éventuel usage industriel. Nous nous sommes intéressés spécialement à

l‘évaluation de l‘activité acidifiante, l‘activité protéolytique, cette dernière qui a été mis en évidant sur milieu YMA

.les résultats obtenu montre 16 souches ont la capacité de dégradé la caséine du lait contenant dans le milieu .ces caractère

qui ont un intérêt essentiel dans l‘industrie fromagère.

Mots clé : Bactéries lactiques, J‘ben, identification phénotypique, caractères technologique, protéolyse, pouvoir acidifiant.

Abstract

We isolated and purified stem 27 from 3 samples of a traditional fermented dairy product

( J'ben ) from raw cow milk collected from a farm in Hassi Sidi benaballah ( salted only a portion; the 2nd portions added

by garlic, 3rd servings supplemented by coriander) .

Phenotypic identification of isolates was assured using conventional microbiology methods or have been identified the

following genres: (Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus,

Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide et Weissella halotolerans )

We subsequently examined in these strains of technological interest some features to assess their potential for possible

industrial use. We looked specifically at the evaluation of the acidification activity , proteolytic activity , the latter which

was set by recessing on YMA medium .the shows results obtained 16 strains have the capacity gradient milk casein

containing in the middle .ces character have a vital interest in the cheese industry.

Keywords:Lactic acid bacteria, J'ben , phenotypic identification, technological character , proteolysis , acidifying power .

ملخص

ي حهب انبقش انطاصج انت تى خؼها ي يضسػت ف حاس ب ػبذ هللا ( خب ) ػاث ي اندب انتقهذي 3 سالنت ي 27تى ػضل و تقت

(ػت يهحت فقظ ، و انثات يضاف نها انثىو و انثانثت انكضبشة )

: و أكذ تحذذ خصائص انؼضالث باستخذاو طشق ػهى األحاء انذققت انتقهذت و تى تحذذ االخاط انتانت

(Lactococcus lactis subsp lactis ,Lactococcus crémoris, Lactococcus raffinolactis, Entérococcus,

Entérococcus durans, Pediococcus pentosaceus ,Leuconostoc mesonteroide et Weissella halotolerans )

تى دساست هز انسالالث راث ي احت االهت انتكىنىخت نتقى قذساتهى نالستخذاو ف اندال انصاػ و دانك بتقى انشاط تحض ،

سالالث نذها قذسة 16تذل ػهى انتائح انت تحصها ػهها ا . YMAانشاط انتحهم انبشوت ، وهزا األخش انزي تى ػهى وسظ انضسع

. هذ انخاصت نها اهت حىت ف صاػت اندب. ػهى تحهم اكاص انحهب ف انىسظ

.قىة انحىضت ، وتحذذ انظهشي ، وانطابغ انتكىنىخ، و انتحهم انبشوت ، خببكتشا حض انالكتك ، : الكلمات المفتاحية

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