Techniques immunologiques par Mme Boumendjel Messarah A. Année 2008/2009 Université Badji Mokhtar...
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Techniques Techniques immunologiquesimmunologiques
par Mme Boumendjel Messarah A.par Mme Boumendjel Messarah A.Année 2008/2009Année 2008/2009
Université Badji Mokhtar (Annaba)Université Badji Mokhtar (Annaba)Cours de techniques immunologiquesCours de techniques immunologiques
Cytométrie en fluxCytométrie en flux
Exemple d’application de la Exemple d’application de la cytométrie en flux: Etude de cytométrie en flux: Etude de l’expression du récepteur de l’expression du récepteur de l’IL-27 sur les lymphocytes Bl’IL-27 sur les lymphocytes B
BBBB
Cellules B spléniques CD19+ (naïves et mémoires)Cellules B ombilicales naïves
CD19+CD27-
Obtention des Lymphocytes B humains
A partir de fragments de ratePar Sélection positive (Microbeads, MACS)
et tri magnétique préparatif (Miltenyi Biotech)
A partir du sang de cordon Par Déplétion négative (Rosettesep, StemCell)
Marquage magnétique (30 min)
Séparation magnétique
Elution des cellules marquées
Ajout du cocktail RosettessepAc anti-CD2, CD3, CD16, CD36, CD56 et CD66b
couplés à des anticorps anti-glycophorine A
Formation d’immunorosettes
Collecte des cellules à l’interface Plasma/Ficoll
Mise en culture des cellules B naïves ou mémoires
BBBB
BBBB Anti-CD40
IL-27, IL-21, IL-4
Après 4 jours
Incorporation de la H3-thymidine
Mesure de la radioactivité incorporée par l’ADN cellulaire
Après 12 jours
Dosage ELISA: - IgE
- isotypes d’IgG
Récupérer les surnageants de culture
Mise en culture dans du milieu YSSEL
(10% SVF)
BB
BB BBBB BBBB BB
5% CO2 à 37°C
Détermination de la réponse proliférative Production d’IgE et d’IgG
Analyse de l’expression de l’IL-27R et des différents autres marqueurs membranaires
BB
Marquage direct ou indirect par immunofluorescence simple, double ou triple
En utilisant des Ac couplés aux fluorochromes (FITC, PE ou APC)
Passage au cytomètre (FACSCan BD) et/ou Tri cellulaire (FACS Vantage BD)
et enfin analyse par le logiciel Cell Quest
BB
BBBB
Expression des sous unités (TCCR et gp130) du récepteur de l’IL-27 sur les cellules B
Cellules B naïves (CD19+CD27-) du sang de cordon
Cellules B naïves (CD27-) de la rate
Cellules B mémoires (CD27+) de la rate
Selon la littérature (Larousserie et al., 2006) :les 2 sous unités de l’IL-27R sont constitutivement exprimées
Sur les Lc B d’amygdales humains naïfs et mémoires