Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle

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Techniques d’étude des interactions protéine- protéines à grande échelle Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006

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Techniques d’étude des interactions protéine-protéines à grande échelle. Hervé PHILIPPE BIN1001 – hiver 2006. Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?. beaucoup de matériel à disposition focus sur l’étude des fonctions cellulaires capacité des protéines à former des complexes - PowerPoint PPT Presentation

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Techniques d’étude des interactions protéine-

protéines à grande échelle

Hervé PHILIPPEBIN1001 – hiver 2006

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Pourquoi étudier les interactions protéine-protéine ?

• beaucoup de matériel à disposition

• focus sur l’étude des fonctions cellulaires

• capacité des protéines à former des complexes• ≈5 partenaires pour chaque protéine

• importance des complexes protéiques dans l’aspect fonctionnel

interactome

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De nombreuses techniques d’étude

Piehler J. Curr.Op.Struct.Biol. 2005; 15:4-14

in vivo• maintien du contexte cellulaire

in vitro• caractérisation détaillée des interactions

(cinétique, stochiométrie …)• validation des résultats in vivo

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Co-immunoprécipitation

http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=9C471132-0F72-4F39-8DF0-455FB515718F

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Double hybride

• utilisation de facteurs de transcription modulaires chez la levure • domaine d’activation• domaine de liaison à l’ADN

• fusion des protéines à tester chacune avec un module du facteur de transcription

• expression du produit de transcription si les protéines testées interagissent

Principe :

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Double hybrideDA

DL

mARN

DA : domaine d’activationDL : domaine de liaison à l’ADN

TF

Système rapporteur

Fusion protéines et modules du facteur de transcription

Expression du système

DA

DLprot 1

prot 2

DL

prot 3

pas d’expression

expression du gène

colonies de levures

mARN

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Double hybride

• expérience facile à mettre en placeAvantages :

• analyse qualitative• faux positifs si les interactions préexistent chez la

levure• faux négatifs : problème d’expression des protéines

cibles chez la levure• non applicable aux protéines membranaires (30%

du protéome)

Inconvénients :

• identification des interactions• criblage de banque de protéines

Application :

Fields S. & Song O. Nature. 1989; 340:245-246.

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Interactome chez C. elegans

Li S. et al.; Science 2004; 303:540–543

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PCA : protein fragment complementation assay

a) rapporteur (enzyme ou protéine fluorescente)b) fractionnement du rapporteur + fusion aux protéines à

testerc) mesure de la reconstitution du rapporteur si les

protéines testées interagissent

Principe :

Michnick SW. Curr Opin Biotechnol. 2003;14(6):610-7

Johnsson N & Varshavsky A. PNAS. 1994; 91:10340-10344

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PCA : protein fragment complementation assay

Application :

• applicable pour les protéines membranaires• réponse très rapide

Avantages :

• décalage temporel de la réponse au signal d’expression

• nombreux faux positifs : accumulation du substrat et du produit de la réaction enzymatique

Inconvénients :

• identification des interactions• étude des réseaux d’interaction

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FRET (fluorescence resonance energy transfer)

525

accepteur

donneur

excitation

475 nm 525 nm

• excitation d’un fluorophore donneur par un photon• émission fluorescence par le donneur• excitation du fluorophore accepteur s’il est suffisamment proche• mesure du rapport de fluorescence

Principe :

R0

10-70 Å

475nm

émission

L. Stryer; Annu Rev Biochem 1978; 47: 819–846

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FRET (fluorescence resonance energy transfer)

• étude dynamique en temps réel • applicable in vivo dans le système cellulaire originel• peut être couplé à un signal biologique• applicable dans tous les compartiments cellulaires

Avantages :

• création de protéines chimériques qui peuvent modifier les interactions

• nécessite la surexpression des protéines testées

Inconvénients :

• signification biologique des interactions• localisation cellulaire par couplage avec des techniques

de microscopie

Application :

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TAP-Tag : Tandem Affinity Purification

1.

2.

3.

4.

5.Puig O. et al.; Methods 2001; 24:218–229

Principe :tag

1. constitution du complexe protéique in vivo puis lyse des cellules

2. fixation du complexe via la ProtA sur la colonne d’affinité et élution douce des contaminants

3. clivage du tag par la protéase4. fixation du complexe via le peptide

de fixation à la calmoduline et élution douce des contaminants résiduels et de la protéase

5. élution du complexe et analyses subséquentes

peptide de fixation à la calmoduline

domaines de fixation de la ProtA aux IgG

site de clivage à la TEV protéase

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Spectrométrie de masse

• nécessite la purification des complexes• méthode compliquée et coûteuse

Inconvénients :

Application : • identification des protéines présentes dans un complexe

Gingras et al. (2005) J Physiol 563:11-21

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TAP-Tag : Tandem Affinity Purification

• seules les interactions très stables peuvent être détectées

Inconvénients :

• seul l’appât est modifié, pas les autres protéines du complexe

• taux d’expression biologique des protéines• identification de complexes avec plus de 2 protéines

Avantages :

Application : • identification des complexes protéiques