TECHNIQUES DE CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE

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TECHNIQUES DE

CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE :

DE LA FISH AUX PUCES A ADN

KARINE CORDIER-COUREL

XXème colloque ATC

Aix-en-Provence - 2010 Prolonger votre offre de soins, jour après jour


LA CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE

Cytogénétique conventionnelle

Biologie moléculaire

Cytogénétique moléculaire


DE LA FISH AUX PUCES A ADN

v FISH (Hybridation In Situ en Fluorescence)

• Principe

• Différents types de sondes

• Applications

• Avantages et inconvénients

v CGH (Hybridation Génomique Comparative)

• Principe

• Sensibilité

v FISH et CGH : Limites des techniques

v Puces à ADN

• Définitions

• Différents types de puces

• CGH-array

• Puces à SNP

• Intérêts, applications, inconvénients


FISH : Principe

FISH = Fluorescence In Situ Hybridization

v Hybridation de séquences spécifiques marquées sur un

génome entier : centromères, régions sub-télomériques, loci

spécifiques et peintures

v Détection de délétions, identification de translocations ou

d’autres réarrangements chromosomiques


FISH : Principe

CIBLESONDE

ADN double brin (mitoses

ou noyaux interphasiques)

ADN double brin marqué

T A A G G A T A A T T C C T A T

Dénaturation thermique

Hybridation complémentaire

37°C O/N


FISH : Principe

LavagesElimination des

sondes non spécifiquement fixées

La sonde moléculaire se fixe sur sa cible

Pas de sonde fixée = délétion

Analyse au microscope en épifluorescence (filtres adaptés aux différents fluorochromes)


FISH : Différents types de sondes

Peintures chromosomiques

M-FISHSondes centromériques


FISH : Différents types de sondes

Sondes télomériques

Loci spécifiques (Tuple1 / N85A3)

Sondes de BACs

RP11-335E8 2p12

RP11-356H17 2p13.3


FISH : Sondes de BAC

v Bacterial Artificial Chromosome = ADN circulaire bactérien

dans lequel un fragment d’ADN (du génome humain) a été inséré

v Sonde de BAC = sonde fabriquée à partir d’une

séquence d’ ADN connue insérée dans un vecteur de clonage

bactérien


FISH : Choix des BACs

v Sélection des BACs selon leur localisation chromosomique (en

fonction du réarrangement à étudier) ou la séquence d’un gène

d’intérêt

v Séquençage du génome humain

=> Cartographie des chromosomes

=> bases de données


FISH : Choix des BACs

National Center for Biotechnology Information

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606

University of California Santa Cruz http://genome.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway

Ensembl Genome Browserhttp://www.ensembl.org/Homo_sapiens/index.html


NCBIFISH : Choix des BACs

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/map_search.cgi?taxid=9606


FISH : Fabrication de sondes de BAC

Sonde prête à l’emploi pour

la FISH

BAC

Culture bactérienne

Extraction de l’ADN bactérien

Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,

dNTP, dUTP*)

Technique « lourde » 6 à 8 jours

Amplification par PCR (dNTP, amorces,

ADN pol)

Extraction et fragmentation

de l’ADN bactérien

Marquage par nick-translation (DNaseI, ADN pol,

dNTP, dUTP*)

Technique rapide 3 à 5 jours

cot 1, AcNa, EtOH


FISH : Applications

v Confirmation d’anomalies suspectées par le caryotype

v Précision de points de cassure

v Origine des marqueurs, dm, hsr

v Détection des aneuploïdies

v Détermination du sexe

v Microdélétions

v Suivi de traitements, recherche de maladie résiduelle

v Suivi d’allogreffe (avec sexe opposé) de moelle


FISH : Avantages et Inconvénients

Avantages

v Technique sensible (noyaux et

métaphases)

v Grand choix de sondes

(commerciales ou « maison »)

Inconvénients

v Technique lourde nécessitant des traitements différents selon la nature de l’échantillon à analyser (métaphases, noyaux, tissus)

v Analyse ciblée : Nécessité d’avoir une idée préalable de la région chromosomique ou du gène à étudier

v 3 cibles maximum par test


CGH : Principe

ADN à tester

Co-hybridation

ADN de référence

nb copies ADN test > nb copies ADN de référence

=> amplification

nb copies ADN de référence > nb copies ADN test

=> délétion


FISH et CGH : Limites des techniques

FISH

Etude ciblée

Résolution = 100-300Kb

Caryotype

CGH

Analyse globale du génome

Résolution = 5-10 Mb

Comment réaliser une analyse globale du génome et augmenter la résolution?

⇒ Hybrider de nombreuses sondes sur un échantillon?

⇒ Hybrider un échantillon sur de nombreuses sondes?


PUCES A ADN : Définitions

v Petites surfaces solides sur lesquelles un grand nombre de

sondes ont été fixées

v Puces à ADN = DNA arrays, DNA chips, DNA micro-arrays ou micro-

arrays

v BAC-array = sondes de BACs

v DNA-array = faible densité (quelques centaines à quelques milliers

de sondes)

v DNA micro-array = haute densité (plusieurs milliers de sondes)

v puces « pangénomiques » = ensemble du génome

v puces « à façon » = ciblant une fonction biologique ou une

pathologie


PUCES A ADN : Différents types de puces

Il existe trois types de technologies :

v CGH-array proprement dite ( hybridation génomique comparative par rapport à un ADN de référence)

Ø Bac-array (Array 300 Abbott, Cyto Chip Blue Gnome, …) : résolution limitée (50-200Kb)

Ø Puces à oligo (Agilent) : meilleure résolution (oligonucléotides de 60-mer)

v Puces à SNP ne nécessitant pas d’ADN de référence ( Illumina, Affymetrix) : haute résolution (oligonucléotides de 25 à 80-mer) + recherche de régions de perte d’hétérozygotie


v Extraction de l’ADN => quantification (A260nm)

=> pureté (A260nm / A280nm)

=> intégrité (migration sur gel d’agarose)

v Digestion par des enzymes de restriction / Amplification par PCR

v Marquage et Fragmentation

v Hybridation

v Lavages

v Quantification du signal d’hybridation pour chaque sonde (lecture par

un scanner)

v Numérisation par un logiciel spécifique

PUCES A ADN : Etapes techniques


CGH-array : Principe

v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN

(ou ARN/ARN)

v Co-Hybridation compétitive de séquences d’ADN (ou ARN) test et

témoin marqués par fluorescence sur un grand nombre de loci

spécifiques présents sur un support solide (lame de verre)

v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau de loci

spécifiques et connus sur un génome entier


ADN test marqué en CYA3

ADN de référence marqué en CYA5

Dénaturation et hybridation sur puce à ADN

Loci spécifiques (BAC / PAC / oligonucléotides de synthèse)

SCANNER

Défaut d’ADN test

Excès d’ADN test

Lame de verre

CGH-array : Principe


CGH-array : Capture et Analyse des résultats

Ex : BAC-array / Array-300 Abbott®

DAPI IV (sondes) Cy3 (ADN Test) Cy5 (ADN Référence)

ratio T/R calculé

3 spots / clone

• 0.8 < T/R < 1.2 => pas de déséquilibre

• T/R < 0,8 => délétion

• T/R > 1,2 => amplification


CGH-array: Exemple d’application

v Dysmorphie faciale => caryotype t(5;9) + dup(9)(q?)


v Confirmation par FISH (peintures des chromosomes 5 et 9)

Peinture du chromosome 5Peinture du chromosome 9



v Résultats analyse sur puce Array-300 Abbott®

9p21 - CDKN2A(p16),MTAP 1,13 9p11.2 - AFM137XA11 1,35 9q21 - D9S166 1,51 9q22.3 - PTCH 1,41 9q33.2 - DBCCR1 1,08



v Résultats analyse sur puce IntegraGen®



Puces à SNP: Principe

v Les oligonucléotides spécifiques sont synthétisés directement sur la

puce

v Principe biochimique d’hybridation complémentaire ADN/ADN

(ou ARN/ARN)

v L’ADN à tester s’hybride avec sa séquence complémentaire

fixée sur la puce

v Identification de pertes ou de gains d’ADN au niveau des

marqueurs spécifiques et connus sur un génome entier

v Identification de pertes d’hétérozygotie (LOH)


Puces à SNP: Analyse des résultats

Puce SNP6.0 / Affymetrix ®



Puce SNP6.0 / Genotyping Console / Affymetrix ®



Allèle Différence

Copy Number state

Segments

Fishclones (BACs)

Genomic variants (polymorphismes)

Refseq (gènes)

Idéogramme / règle

Log2Ratio



FISH CLONES (BAC)



Refseq (gènes)



Genomic Variants


Puces à SNP : Résolution

SNP6.0 (Affymetrix)Cytogenetics Array

(Affymetrix)

Copy Number Marker 1 878 785 2 761 979

SNP 945 806 400 103

RefSeq genes 12 093 (64,7%) 18 270 (97,7%)

Cancer genes 233 (73,3%) 318 (100%)

OMIM genes 8 068 (43,1%) 12 046 (97,6%)

Average marker spacing (bp) 1,629 1,086


Puces à ADN : Intérêts

v Pas de mise en culture des cellules à analyser

v Analyse l’ADN de tout type de tissus

v Technique hautement résolutive (< 150 Kb)

v Analyse pangénomique qui ne nécessite pas d’avoir une idée

préalable de chromosomes impliqués (# FISH)


Puces à ADN : Applications

v Corrélations nombre de copies / conséquences biologiques

v Compréhension de maladies (Couplée à une puce à ARN )

v Comparaison tumeur/tissu sain

v Etude du génome des patients atteints d’une même pathologie et

compréhension des mécanismes géniques


Puces à ADN : Inconvénients

v Anomalies chromosomiques équilibrées non détectables

v Polymorphismes (encore beaucoup d’interrogations à ce sujet)

v Seuil de sensibilité, mosaïques faibles?

v Plateau technique onéreux


CONCLUSION

C I B L E S S U P P O R T I N T E R E T S L I M I T E S

CARYOTYPE

5-10 Mb Génome entier Métaphases

Recherche d’

Anomalies chromosomiques

Technique longue

Peu sensible pour les anomalies cryptiques (mais technique de référence en cytogénétique)

FISH

5 Mb à

100-300 Kb

Chromosomes entiers

Régions spécifiques

(sub-télomèriques, centromériques, loci,…)

Métaphases

Noyaux interphasiques

Coupes de tissus

Micro-remaniements

Points de cassures

Marqueurs

Aneuploïdie

Sexe

Suivi de maladie

TK lourde et peu automatisable

3 cibles / test

Recherche ciblée

CGH-ARRAY /

PUCES ADN

10-300 Kb

Loci spécifiques

(BACs ou oligonucléotides de synthèse)

Génome entier

ADN ou ARN

Analyse de

tout type d’échantillon

(sang, moelle, tissu sain, tumeur)

Détection de déséquilibres cryptiques non détectable par les autres techniques

Ne détecte pas les anomalies chromosomiques équilibrées

Polymorphismes

Mosaïques faibles


Remerciements

v Département Génétique du Laboratoire

v Equipe de R&D: Azarnouche Ardalan, Anne Bazin, Catherine

Destigny, Hossein Mossafa

v Françoise Allamy et son équipe de FISH

v Sophie Pedronno et son équipe de Biologie moléculaire

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