LICENCE BGS

SEMESTRE 3

UEP 1.3.1

Structures et Propriétés des Biomolécules

Présentées par Nicole LAURENT

III - Purification des protéines

Tenir compte des paramètres de la protéine:• La taille (filtration sur gel)

• La solubilité (précipitation séquentielle)

• La charges (chromatographie échangeuse d’ions

• La densité (centrifugation sur gradient, ultracentrifugation)

• Hydrophobicité (chromatographie en phase inverse)

• Si marqueur ajouté (chromatographie d’affinité )

(immunoblot – immunoélectrophorèse)

Suivre la purification de la protéine- dosage- mesure de l’activité- marquage…..

Planifier les diverses étapes avec soin!!!!!!!!!!! travailler à - 4°C

1 - La densité : centrifugation différentielleExtraction : protéines solubles dans le

surnageant

La sédimentation en gradient de densité

2 - Solubilité des protéines

• La solubilité des protéines dans l’eau est complexe.• les molécules d’eau interagissent

– par des liaisons hydrogènes avec les -CO-NH- de la chaîne peptidique

– et les radicaux hydrophiles libres des résidus( S T Y N Q D R E K H )

• Les radicaux hydrophiles s’orientent vers l'extérieur de la molécule

• Les radicaux hydrophobes ont tendance à réagir entre eux à l'intérieur de la molécule

• Les protéines globulaires sont en général plus solubles dans l’eau que les hélicoïdales

• En solution saline,la solubilité des protéines dépend:

des interactions électrostatiques ("salting in"), à basse force ionique, la solubilité des protéines augmente lorsque la concentration en sels croît, jusqu'à un certain seuil.Au delà, elle diminue avec l'addition de sels:

due à des interactions hydrophobes ("salting out").

Ces deux effets sont antagonistes

• Influence de la température:la solubilité augmente avec la température, !!!!!!!!!!!! Dénaturation des protéines

Pour éviter la dénaturation – 4°C

• Influence du pH :la solubilité est minimale au pH isoélectrique

3 - Précipitation des protéines

a - Précipitation totale : dénature les protéines- Par addition:

- 80% d’éthanol à -20°C (certaines protéines sont solubles dans l’éthanol)

- 2 volumes d’acétone à -20°C (protéines difficile à redissoudre)- PhénolLes protéines se dénaturent et se solubilisent

dans le phénol(les acides nucléiques restent dans la phase aqueuse)

- Acide trichloracétique TCAtrès corrosif-4°C pour éviter la dénaturationlavage à l’étherredissolution difficile

- Acide perchlorique PCAcorrosif, explosif-4°C pour éviter la dénaturationinsoluble dans KOH à -4°C

- Sulfate de Zn + base forte (NaOH )………….

b - Précipitation fractionnée ou différentielle

- préserve l’intégrité les protéines- Associe force ionique et pH à -4°C

Chaque protéine ayant des caractéristiques hydrophiles, hydrophobes et pI particuliers,et donc une solubilité propre, permet sa précipitation

!!!!!! Plusieurs protéines de solubilité similaires peuvent précipités dans les mêmes conditions

• Précipitation au sulfate d’ammonium- Le plus utilisé car peu dénaturant- très soluble dans l’eau, permet des forces

ioniques très élevées - très hydrophile, il déshydrate la protéine- ions sulfates (SO4--) et ammonium (NH4+)

neutralisent la protéine qui est alors moins soluble

associé avec le pH et à -4°C• Redissolution facile des protéines précipités

dans l’eau

Membrane semi-perméable

Permet d’enlever les sels ( ex : sulfate d’ammonium )de la solution protéiqueaprès redissolution

Les protéines restent dans le sac

On utilise aussi la filtration sur membrane semi-perméable.

Dialyse

4 - La taille : chromatographie gel filtration

Les « billes » du gel présententdes « pores »Les petites molécules traversent cespores et sont ralenties

Les billes ont des diamètres bien définis formant un réseau où circulent les molécules plus grosses que les « pores »

Plus la molécule est grosse,plus le chemin parcouru sera petitet la traversée rapide.

Les protéines de masse moléculaire les plus élevées sont éluées en premier

Gels commercialisés: Sephadex, Sepharoseor Sephacryl

Chromatographie : un peu d’ histoire…

• Réalisée en 1906 par le botaniste russe Mikhaïl Tswett

• Séparation des pigments (en grec : "chromato") d'une feuille d'épinard

• Chlorophylles en solution dans l'éther de pétrole, « filtrées » sur une colonne de carbonate de calciummontrent des zones colorées vertes et jaunes.

• Ces composantes colorées peuvent être analysées qualitativement et quantitativement".

• Cette invention de la chromatographie d’adsorption par Tswett reste ignorée jusqu'en 1931.

Les différents principes de chromatographie :

Résultent du fait que l'on privilégie l'effet de l'un des facteurs suivants :

- la solubilité dans un solvant liquide : chromatographie de partage

- la taille, la forme : chromatographie d’exclusion ou gel filtration

- la polarité : chromatographie en phase inversées

- la charge électrique : chromatographie par échange d’ions

- la présence de groupements d'atomes formant des sites particuliers : chromatographie d’affinité

La chromatographie de partage :préférence pour les petites molécules

La phase stationnaire est un liquide fixé sur un support inerte.

Basée sur le partage du soluté dans les deux phases liquides.

CPL

(acides aminés – sures – vitamines …..)

Rapport frontal : RF

(ou référence front, coefficient de migration)

Distance parcourue par le soluté

/ Distance parcourue par le solvant

RF = x / y

La révélation des plaques :Colorations spécifiques suivantla nature des molécules séparées.

Chromatographie bidimensionnelle