TD4

La culture

cellulaire

À quoi servent les cultures de cellules?

La biologie et la biochimie

cellulaires de base,

les interactions

entre les cellules et les

agents induisant des

maladies,

les effets des médicaments

sur les cellules,

Le processus et le

déclenchement du

vieillissement

pour

étud

ie

r

À quoi servent les cultures de cellules?

La cellule comme usine de productionl'utilisation de

cellules en remplacement

de tissus et d'organes (greffes

d’organes).

Recherche sur le cancer

Les cellules normales et les cellules cancéreuses

pouvant toutes deux être cultivées.

À quoi servent les cultures de cellules?

Virologie

-la réplication de virus dans les cultures cellulaires (à la place des animaux) pour les utiliser dans la production de vaccins.

À quoi servent les cultures de cellules?

La cellule comme usine de production

trois domaines se sont montrés plus intéressants:

la production à grande échelle de cellules génétiquement modifiées pour produire des protéines présentant une valeur médicale ou commerciale. (les anticorps monoclonaux, l'insuline, les

hormones, etc.)

Division cellulaire

Division cellulaire

CytokinèseCytodierese

Division du cytoplasme

et des organites

cellulaires

Division des chromosomes

La division cellulaire est le processus fondamental par

lequel une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques

c

c

c

M

G2

S

Généralités

Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Les phases du cycle de division cellulaire

G1

S

G2

MM

G2

est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la

cytokinèse.

La phase M comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l’enveloppe nucléaire, phases décrites

il y a plus de cent ans :

1 la prophase

2La

prométaphase

3 la métaphase

4 l’anaphase

5 la télophase

correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l’enveloppe nucléaire

est la période de formation du fuseau et du début d’alignement des chromosomes

est la phase d’alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles

voit la disjonction des chromosomes

La culture cellulaire

C’est le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non

organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro

et d'exprimer des métabolismes et des fonctions

spécifiques

Principe de la culture:on prend des cellules, des tissus ou des fragments d'organes sur un être vivant (animal ou végétal) ou des cellules naturellement isolées dans la nature telles que les bactéries et on les place dans un milieu favorable à leur survie.

Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Introduction

Différentes sources

InsectesInsectes

PoissonsPoissons

MammifèresMammifères

HumainsHumains

Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études

Culture de cellules animales

Mise en cultureLa culture cellulaire est obtenue après le maintien en vie de cellules plus de 24 heures dans un milieu de culture artificielle. On met en évidence deux types de cultures

Mise en culture

cultures histiotypiques

cultures organotypiques

Les cultures organotypiques sont soumises à un maintien de la différentiation morphologique et fonctionnelle. Ces fragments

d’organes ou tissus sont appelés des explants.

Les cultures histiotypiques correspondent à une multiplication active mais sans maintien de l’organisation.

Toutefois, dans la pratique, cet objectif n'est jamais atteint, essentiellement parce que la composition de l'environnement habituel des cellules n'est pas connue avec précision, il ne peut donc qu'être approché.

Les techniques d'obtention des

cellules:

On distingue 2 types de cellules:

Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang

Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et

centrifugation.

Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu.

Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en œuvre de techniques plus originales qui

peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la

méthode par digestion enzymatique.

La méthode par dissection:

Cette méthode est la plus ancienne. Elle a permis aux précurseurs de la culture de tissu d'obtenir les premières cellules in-vitro.La méthode de dissection consiste à couper en fragment d'environ 1 à 4 mm3  le tissu que l'on réduit encore à l'aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif.  Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s'appelle également la méthode des explants.

Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.

La méthode par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit. L'obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours).

La méthode par digestion enzymatique:

Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. on utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline.

Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.

La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.

MILIEU DES

CULTURES

Température 37°C permissivité faible

pH 7.2-7.5 Système tampon: HCO3- avec CO2 atmosphérique (5-10%)Indicateur coloré: Rouge de PhénolLumière visible à éviter

Les cultures en milieu liquide•Le contenant de la culture est un flacon. Les cellules sont ensemencées dans un milieu liquide En suspension dans ce milieu, elles peuvent croître librement jusqu'à épuisement des éléments nutritifs.

Les cultures sur support solide•Cas plus fréquent chez les mammifères et d'une manière générale chez les animaux.•Le fond d'une boite de pétri ou des puits est recouvert d'un support qui permettra aux cellules de s'accrocher.

Les cultures sur support solide•Les cellules sont déposées à la surface de ce support, puis elles seront recouvertes d'un milieu nutritif, naturellement liquide.•Le support peut être très varié. Il peut s'agir simplement de gélatine pour les plus simples, jusqu'a des milieux très complexes contenant des protéines et des facteurs de croissance.

ContaminationsContaminants biologiquesBactériesLevures/moisissures Virus

Contaminants chimiquesEndotoxinesQualité du plastiqueReste de détergentTrace d’aluminiumRésidus désinfectants

Chambres à culture

Chambres à culture

Différents types

• Culture primaire

• Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un

tissu.

• Différenciée. Généralement à attachement obligatoire

(ADC).

Différents types

• Culture secondaire• Propagation d’une culture primaire.

• Création d’une lignée cellulaire «indifférencié» (Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de Cancérisation, soit

des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement).

• Peut être cultivé en suspension.• Durée de vie limitée (30-50 divisions).

Lignage cellulaire:Possibilité d’étudier la spécification de types cellulaires au niveau cellulaire dans un contexte embryonnaire (un peu à la frontière entre cultures cellulaires et embryologie…)

Modèle ascidies= modèle phylogénétiquement proche des vertébrés+modèle « simple » qui autorise études fonctionnelles poussées.

Le lignage cellulaire

neuralnotochorde

Différents types

• Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée.

Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.

Cellules Hela(cellules immortalisées dérivées de cellules d’un cancer cervical)

Cellules nerveuses

 les cellules Hela sont les cellules les plus largement utilisés en biologie cellulaire. prises d'une dame africaine appelée Henrietta Lacks en 1951 et envoyé le tour du monde sans son consentement. Ce sont les lignes mêmes cellules qui ont mené à la découverte du vaccin contre la polio.

La dynamique cellulaire:

On cherche à observer une évolution (par exemple la localisation d’une protéine en fonction du temps)

Il faut donc que la cellule soit vivante!

On va insérer dans la cellule un plasmide.

Le plasmide est un ADN circulaire contenant le gène codant pour la protéine que l’on veut observer couplé à un gène codant pour une protéine naturellement fluorescente

La cellule va incorporer le plasmide dans son ADN et va transcrire puis traduire la protéine qui sera fluorescente.

Liposomes• vésicule artificielle à membrane lipidique• Se forme spontanément en milieu aqueux• Pour transfection les lipides = ceux rencontrés dans les membranes plasmiques

Microinjection:+Efficacité élevée- Difficile à mettre en œuvre qq centaines de cellules peuvent être traitées/ exp

Electroporation (1982 par Wong)+Efficace pour la plupart des types cellulaires+Rendement important pour transfection transitoire ou stable+Facile à mettre en œuvre

Transfection par vecteurs viraux : Les rétrovirus (ARN monocaténaire)