TD Les Applications de La Fusion de Protoplaste

7/23/2019 TD Les Applications de La Fusion de Protoplaste

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TD2: Les applications de lafusion de protoplastes

Sommaire

I. Un exemple d'exploitation des ressources gntiques par

l'hybridation somatique (cas des agrumes)! 2I.1. Ressources gntiques! 2

I.2. Mthodologie! 4I.2.a. Obtenir un systme de rgnration partir de protoplastes efficaces! 4

I.2.b. La mthode de fusion (fusion lectrique)! 5I.2.c. Slection des produits de fusion! 5

I.3. Rsultats! 7I.3.a. Elargir le pool gntique! 7

I.3.b. Crer de nouveaux porte-greffes! 9I.3.c. Crer des cultivars triplodes! 9

II - Introduction de caractres provenant d'espces sauvages

(cas de la pomme de terre)! 10III. Grer les gnomes cytoplasmiques! 10

III.1. Gnome chroloroplastique du colza! 10III.2. Le gnome mitochondrial de la tomate! 11

Biotechnologies animales et vgtales

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3 applications majeures:largir les ressources gntiques au sein de pools gntiques d'espces

L'hybridation somatique (fusion symtrique) 2n + 2n 4n (cas des agrumes)

Introgresser des gnes provenant d'espces sauvages des espces cultivesFusion asymtrique: spontane ou induite (cas de la pomme de terre)

Grer les gnomes cytoplasmiques:Chloroplastes:

- Rsistance des herbicides- limination des dficiences chlorophyllienne (cas du colza)

Mitochondries strilit mles cytoplasmiques (cas de la tomate)

I. Un exemple d'exploitation des ressources

gntiques par l'hybridation somatique (cas desagrumes)

Figure1: Diffrentes associations nuclo-cytoplasmiques gnrales par hybridation somatique! I.1. Ressources gntiquesPool primaire, 3 genres:

Citrus espces consomms

Fortunella

quelques cultivars (comme le kumquat)Poncirus trifoliata porte-greffe (il apporte des rsistances)


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Ces 3 genres sont thoriquement sexuellement compatible et du coup, on retrouve une plusgrande variabilit gntique dans les:

Caractres pomologiques (caractres lis la morphologie du fruit):" - Couleur" - Forme" - Taille" - Albedo

Figure2: Diversit des fruits au sein du genre CitrusCaractres organoleptiques:" - Gout (acidit, amertume, sucr, armes, huiles essentielles...)

Caractres agronomiques:" - Priode de production des fruitsLe mandarinier saltuma produit en septembre! ! ! ! ! ! Oranger Valencia Late produit en juillet aout" - Rsistance:" " Contraintes biotiques

Maladie due aux champignons" " " " Bactrie (chancre citrique)" " " " Virus (tristga)" " " " Nmatodes" " " Contraintes abiotiques" " " " Rsistance la scheresse" " " " Rsistance au sel (mandarinier Cloptre)" " " " Rsistance au froid (kumquat)" " " " Rsistance au calcaire (citrus macrophylla)Facteur limitant la reproduction sexue:


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" - PolyembryonieCes embryons ne sont pas issus de la fcondation, mais ils sont issus du dveloppement des cellules du nucelle(2n cellules somatiques) et donc les plantes sont identiques la plante mre. Ce phnomne ne sapplique pasaux cdratiers, quelques mandariniers et pamplemousses

" - Strilits mles et femellesFabriques par l'Homme et empche maintenant de faire des croisements

" - L'htrozygotie leve" - La longueur de la phase juvnileIl faut beaucoup de temps avant de faire des croisements (6 ans parfois pour obtenir la premire fleur)

Pool secondaire: plantes toujours sexuellement compatible avec celles du pool primaire, maison obtient des hybrides striles. Eremocitrus et macrocitrus ont une trs forte rsistance au sel

Pool tertiaire: sexuellement incompatible avec celle du pool primaireOn a alors entrepris de faire de lhybridation somatique afin de contourner la non-compatibilitdes pools entre eux

! I.2. Mthodologie! ! I.2.a. Obtenir un systme de rgnration partir de protoplastes efficaces

Figure3: Induction et gestion des cals embryognes dagrumesIl faut partir de matriel trs jeune (embryons ou ovules) qui donne des cals embryogneslorsquils sont dans un milieu + saccharose. Ces cals lorsquils seront dans un milieu avec dugalactose, se transformeront en embryon somatique et donneront des plantules


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! ! I.2.b. La mthode de fusion (fusion lectrique)

Figure4. lectrofusion de protoplastes et rgnration d'embryons.a: Mlange de protoplastes de cals de mandarinier Commun (A1) et de protoplastes defeuille de kumquat Marumi (A2). b: Alignement des protoplastes dans le champ lectrique.c: Population de protoplastes aprs mission de pulses lectriques (C1: htrofusions ; C2:

homofusions ; C3: protoplastes parentaux). d : Rgnration d'embryons partir deprotoplastes lectrofusionns

Les cals embryognes protoplastes AFeuilles protoplastes B

On obtiendra des protoplastes AB htrocaryons et des protoplastes AA et BB

homocaryons

! ! I.2.c. Slection des produits de fusionIls ont commenc faire une double slection, mais la mort des protoplastes AA et BB librsdes composs toxiques pour les protoplastes AB

Ils ont donc fait une slection tardive sur les plantes rgnres:


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On peut utiliser la cytomtrie de flux les plantes ABauront double quantit d'ADN comme les htrofusion

et homofusion, mais on ne peut pas distinguer lesplantes AA ou BB des AB

Figure5. Analyse par cytomtrie en flux (le citronnier Lisbonne est utilis comme tmoin interne diplode)du niveau de plodie d'hybrides rgnrs partir defusions de protoplastes haplodes de clmentinier etdiplodes de mandarinier Kinnow . a : hybridesomatique triplode. b: hybride somatique ttraplode

Pour les distinguer les plantes AA, BB et AB:" - Caractres morphologiques" - Marqueurs molculaires" - Marqueurs biochimiques (isoenzymes) ce que les chercheurs de Grenoble ont utilis

Figure6. Analyse par lectrophorse enzymatique (phosphoglucomutase) de l'origine nuclairede plants rgnrs aprs fusions de protoplastes de pomelo Star Ruby et de limettier

Mexicain . P: pomelo Star Ruby ; L: limettier Mexicain ; SP: plantes rgnresaprs fusion de protoplastes


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On amplifie par PCR une petite squence spcifique dugnome mitochondrial et ensuite, on la clive avec uneenzyme de restriction. Si il y a du polymorphisme au niveaudu site de restriction et bien on aura ou non une coupure dufragment PCR

Figure7. Analyse par CAPS (amorce: trnT3/trnD2 (44) et enzyme de restriction DraI) de lasgrgation des chloroplastes parentaux chez des hybrides somatiques entre le pomelo StarRuby et le mandarinier Commun . 1: marqueur de taille, 2 11: hybrides somatiques, 12:mandarinier Commun , 13: pomelo Star Ruby Ils ont ralis une analyse par caps sur une squence intergnique du gnome chloroplastique.Cest une squence qui est situ entre le gne TRNt et le gne TRNd (TRN correspond desgnes qui codent pour des ARN de transfert). Ils ont amplifi la squence qui est entre les 2

parce quils savaient quil y avait du polymorphisme au niveau dun site de restriction (marqueurdj mis au point avant). Ensuite il ont fait agire lenzyme de restriction DRA1 et chez lesmandarinier sa oupe le fragment au niveau du site de restriction et chez le pamplemousse il nya pas de site de restriction donc sa coupe pas le fragment donc on a 2 fragments pour lemandarinier et quun seul fragment pour le pamplemousse et lorsquon analyse nos hybridessomatiques, on peut voir si notre chloroplate vient dun parent ou de lautre parent car comme ilny a pas de recombinaison du gnome chloroplastique, si on a un seul marqueur, cela nouspermet de dire sil sagit du chloroplaste de lun ou de lautre parent, ce qui nest pas le cas avecles mitochondrie car comme les mitochondrie recombine, si on utilise quun seul marqueur celane veut pas dire quil y a quand mme eu des recombinaisons. Donc le fait davoir 2 fragmentschez un hybride veut dire que lon a obligatoirement le gnome chloroplastique du mandariniercommun. Et donc en fonction des hybrides, on a pas forcement le mme gnomechloroplastique (chez certains cest le mandarinier et chez dautres a sera le pamplemousse)

! I.3. Rsultats! ! I.3.a. Elargir le pool gntiqueFusion d'espces polyembryonnaires:


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Alloplaste: Le noyau d'une cellule et le cytoplasme d'une autre cellule2n + 2n 4n restauration de la fertilit4n + 2n 3n triplodes striles donc varits sans ppins

Fusion entre plantes des diffrentes gntiques:


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C'est un chec et sa montre la limite de la fusion de protoplaste, il faut rester dans la mme

espce. Pour y arriver, il faudrait faire de la fusion asymtrique

! ! I.3.b. Crer de nouveaux porte-greffes

Les chercheurs de Grenoble ont choisi de croiser le Citrus reticulata trs rsistant aux solscalcaires avec le Poncirus trifoliata

! ! I.3.c. Crer des cultivars triplodes2n + n (technique d'haplodisation, mais cela ne marche que sur le clmentinier)


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II - Introduction de caractres provenant

d'espces sauvages (cas de la pomme de terre)

Pomme de terre Solanum tuberosum (4n) de la famille des solanaces2n = 4x = 48

Elle est trs sensible aux nombreuses maladies. Tandis que les espces sauvages sont trsrsistantes aux maladies comme Solanum brevidens, elle rsiste l'erwinia (soft rot) et 3virus (PLRV, PVY, PVY). Mais elle est 2n = 24

Donc pour faire de la fusion de protoplastes, ils doivent rduire le lot de 48 24 de la pommede terre (dihaplode)

Fusion S.t + S.b donne des hybrides striles, ils ne sont donc pas intressants. On a essay lafusion asymtrique. Pour se faire, il irradie le noyau de S.b pour liminer des chromosomes. De2 17 chromosomes ont t conservs et c'est intressant si lon garde les chromosomes avec

les bons gnes

III. Grer les gnomes cytoplasmiques

! III.1. Gnome chroloroplastique du colzaOn a utilis la fusion de protoplaste pour transfrer un gne de rsistance afin d'liminer ladficience chlorophyllienne

Tout a commenc avec un colza qui au dpart nest pas mle strile. Il croise le colza + radisafin dobtenir des colzas mles striles. Ils ont russi, mais la plante obtenue pousse trs malparce que les chloroplastes du radis ont t aussi transfrs


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Ils ont donc fait de la fusion de protoplastes en slectionnant que les croisements qui possdles bons chloroplastes

Ils ont voulu introduire en plus un gne de rsistance l'atragine pour le colza. Ils ont donccrois le colza mle strile avec la navette (qui possde le gne de rsistance l'atrasine) et

comme ces 2 plantes sont trs proches, il n'y a pas d'incompatibilit des chloroplastes

! III.2. Le gnome mitochondrial de la tomateTomate licopersicon exculentum de la famille des solanaces. Elle dispose de 24chromosomes comme chez la pomme de terre

Ils ont fait des fusions de pomme de terre avec des tomates qui donnent des hybridessomatiques, c'est la pomate

Ils utilisent des rayons gamma sur le noyau de pomme de terre et un inhibiteur mtaboliquepour inhiber la mitochondrie de la tomate afin que les mitochondries ne se divisent plus


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Dans les 2 cas, on obtient 2 types de protoplastes qui peuvent rgnrer des plantes, mais enfusionnant les 2 protoplastes, ils esprent que le noyau de l'un (tomate) utilise le cytoplasme del'autre (pomme de terre)

Ils ont obtenu 88 cals 3 plantes:2 qui sont 2n = 241 qui est 4n = 48 (car fusion de 2 protoplastes de tomate avec un protoplaste de pomme de terre)


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