TD : Croissance bacterienne ¤ Résolution des exercices ...

Module : Bioproduction S1 TILF – ISTA 2019-2020 Enseignant (e) : Dr CHERIF ANTAR Asmaa

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TD : Croissance bacterienne

¤ Résolution des exercices ¤

Partie 1 : Courbe de croissance

Exercice 1:

Partie I :

1) Schéma du protocole expérimental (Figure P) :


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2) Délimitation des phases de croissance (Figure 1) :

Interprétation : Phase I : Phase de latence : - Adaptation au nouveau milieu. Préparation de la machinerie enzymatique nécessaire à la dégradation des nouveaux substrats. - Détoxication du milieu.

- Pas de division bactérienne (μ = zéro). Phase III : Phase expérimentale :

- C’est la seule phase de la courbe expérimentale dont l’évolution correspond à la théorie (log

2N = μt + log

2N

0 est une courbe du type y =

ax + b c.à.d une droite de pente μ). - Les bactéries sont dans leur état physiologique et métabolique optimum. D’où un maximum de synthèses surtout d’ADN et par conséquent un maximum de divisions bactérienne. Le taux de croissance est maximum (μmax). Ce paramètre qui permet de caractériser la croissance doit être calculé au niveau de cette phase (pente de la courbe).

Phase V : Phase stationnaire : - ‘’Arrêt’’ de croissance. ‘’Arrêt’’ de divisions bactérienne (m = zéro). - Les conditions de culture commencent à devenir défavorables.

Phase VI : Phase de déclin : - Les conditions de culture sérieusement défavorables. - Il y a mort des bactéries (μ < zéro).

- Existence possible de formes de résistance (spores) pour les souches qui sporulent.


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Phase II : Phase d’accélération : - Phase intermédiaire entre la phase de latence et la phase exponentielle.

- Il y a accélération du rythme de division bactérienne (μ passe de zéro et tend vers μ max).

Phase IV : Phase de ralentissement :

- Phase intermédiaire entre la phase exponentielle et la phase stationnaire (μ passe de μmax et tend vers zéro).. - Il y a ralentissement du rythme de division bactérienne.

3) La phase de latence dépend : - De la nature et la richesse du milieu. Pour un milieu riche (naturel) cette phase est

courte ou inexistante alors que pour un milieu pauvre (synthétique) elle est longue. Dans le cas de l’exercice la phase de latence est justifiée par le passage d’un milieu riche et naturel (gélose nutritive) à un milieu plus pauvre et synthétique (milieu M).

4) La phase stationnaire est conditionnée par :

- L’épuisement du milieu en nutriments tels que la source de carbone (ex : Glucose dans ce cas).

- L’accumulation de produits toxiques qui ne sont pas nécessairement des déchets mais peuvent être tout simplement des produits métaboliques ( ex : éthanol pour la fermentation alcoolique) qui deviennent inhibiteurs à partir d’une certaine concentration.

- Le développement d’un équilibre physico-chimique défavorable. Ex : variation du pH du milieu, variation de l’oxygénation du milieu …etc.

- Le remplissage du volume du récipient disponible (il n’y a plus d’espace pour les bactéries).

5) Les trois paramètres nécessaires et suffisants pour caractériser la croissance sont : Le taux de croissance maximum (μ max), θ min et la croissance totale (Ns – N

0).

- μ max est calculé au niveau de la phase exponentielle (Figure 1) par projection sur les axes du graphe. Μ max = log

2 N

2 – log

2 N

1 / t

2 - t

1. Sa valeur numérique est environ 2

heure-1

. - θ min = 1 / μ max = 1 / 2 = 0,5 heure ou 30 minutes. - Ns – N

0 : Se calcule à partir des valeurs sur la Figure 1. Ns = nombre de bactéries en

phase stationnaire et N0

= nombre de bactéries initiales. Sachant que si log2N = x donc

N = 2x

N0

= 221

= 2.106

ufc /ml

Ns = 225,5

= 47,45.106

ufc /ml

Ns – N0

= (47,45 – 2).106

= 45,45.106

ufc /ml

Partie II :


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1) Comparaison de la croissance totale (Ns – N0) et μ max pour les concentrations de glucose

de 0,5, 4 et 32 g/l.

- Dans les conditions expérimentales, la croissance totale (biomasse produite) est

directement proportionnelle à la concentration du glucose : Plus la concentration du glucose augmente plus la quantité de biomasse produite augmente. - Pour μ max et donc θ min, l’évolution des courbes μ max = f([Glucose]) et

θ min = f([Glucose]) sur la figure 4 montre l’existence de 2 phases : - Phase I : - 0 g/l < [Glucose] > 4 g/l.

- μ max augmente et θ min diminue lorsque la concentration du glucose augmente.

- Le glucose est donc considéré ici comme facteur limitant la croissance. - Phase II : - [Glucose] ≥ 4 g/l.

- μ max constant et maximum et θ min constant et minimum lorsque la concentration du glucose augmente.

- Le glucose n’est donc pas considéré ici comme facteur limitant la croissance. 2) La valeur seuil de limitation est la concentration de glucose de 4 g/l.

Partie III :

1) Addition du glucose (figure 5a) : - Il y a reprise de la croissance après ajout du glucose. Ce dernier est donc épuisé et

constitue dans ce cas le facteur limitant la croissance. - Il y a démarrage immédiat (pas de phase de latence L2) après ajout du glucose. Ceci

s’explique par le fait qu’il s’agit du même substrat (glucose) et donc le même milieu et que les bactéries sont encore jeunes (début de la phase stationnaire).

- μmax1 = μmax2 et CT2 > CT1 (CT = croissance totale). Ceci n’est possible que si la [Glucose]1 et [Glucose]2 ne sont pas limitantes et que [Glucose]2 > [Glucose]1 (voir figure 3).

2) Addition du lactose (figure 5b) : - Il y a reprise de la croissance après ajout du lactose. La source de carbone (glucose

épuisé) est donc dans ce cas le facteur limitant la croissance. - Existence d’une phase de latence L2 après ajout du lactose. Ceci s’explique par le fait

qu’il s’agit de substrats différents (lactose au lieu du glucose) et donc de milieux différents.

- μmax1 et μmax2 sont différents puisqu’il s’agit de substrats différents (lactose au lieu du glucose).

On peut avoir ce type de courbe pour des cultures en présence de co-substrats carbonés (ex : glucose et lactose ou glucose et peptones). Le glucose plus simple est d’abord utilisé


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par les bactéries avant d’attaquer le deuxième substrat plus complexe (lactose ou peptone)


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Exercice 2 :

1. numération en milieu solide par la méthode des dilutions

2.1. Courbe Ln N=f(t) (voir figure 1). Le choix de Ln N au lieu de N s’implique dans la mesure

où l’on désire linéariser en courbe la phase exponentielle afin de l’interpréter et d’en tirer

les paramètres caractérisant la croissance (taux de croissance et temps de génération).

Figure 1 : Courbe Ln N=f(t)

2.2. Phase de latence de 0 à 3 heures, phase d’accélération de 3 à 5 heures, phase

exponentielle de 5 à 10 heures, phase de décélération de 10 à 16 heures, phase stationnaire

après 16 heures.

2.3. Ln (Nt+G)= Ln Nt+ Ln2, car G étant le temps de doublement de population Nt+G= 2Nt et

Ln2Nt=Ln Nt + Ln2.

2.4. Soit Ln Nt= 12,45 à t=5h, Ln2Nt=12,45+ Ln2, soit 12,45+0,7=13,15 d’abscisse temps 5h50

environ. Le temps de génération, G, est donc de 50 minutes.

2.5. Soit Ln N1=12,45 à t1=5h et Ln N2=16,55 à t2=10h, tous deux pris en phase exponentielle,

µx expo, s’exprime par la relation (Ln N2-Ln N1)/(t2-t1), soit (16,55-12,45)/(10-5)=0,82 h-1 .

2.6. µx expo est relié au temps de génération par la relation G= Ln2/ µx expo. Si on calcule, on

trouve 0,7/0,85 heure soit 50 minutes, ce qui confirme ce que l’on a trouvé graphiquement

en 2.4.


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Exercice 3 :

1. En présence de glucose, la culture démarre directement en phase exponentielle sans

phase de latence. Par contre, en présence de xylose, ce n’est qu’après une latence de 2

heures environ que la culture se trouve en phase exponentielle. Cependant, quels que soient

les milieux, la phase exponentielle se déroule à la meme vitesse (droites parallèles). La

vitesse spécifique de croissance et le temps de génération sont les mêmes dans les deux cas.

2. Cette courbe présente trois phases. De 0 à 2 heures, Ln N est proportionnel à t, puis de 3 à

5 heures, une phase stationnaire avant une reprise de croissance matérialisée par une pente

identique à la première phase. D’après ce que l’on a appris dans l’équation 1, la première

phase correspond à la croissance par utilisation du glucose uniquement puis, après

adaptation au xylose, croissance par utilisation de ce sucre avec des paramètres identiques :

phénomène de diauxie.


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Partie 2 : Mesure de la croissance bacterienne

Exercice 1 :

• N0= Nombre initial de cellules

• Nn = Nombre de cellules après n générations

• n = nombre de générations

Formule : N= N0 (2n)

N = 150 (16) = 2400 cellules

N= 10000(16)= 160000 cellules (ou 16.104)

N=1000000(32)=32000000 cellules (ou 32.106)

Exercice 2 :

G=temps de génération

t=temps

Formule: n=t/G

1) Après 2 heures :

n= (2 heures x 60minutes/heure)/20 minutes= 6 générations

N= N0 (2n) donc : N=1(26)=64 cellules

2) Après 5 heures :

n= (5 heuresx60minutes/heures)/20 min= 15 générations

N=N0 (2n) donc : N=1 (215)= 32768 cellules

3) Après 12h :

n= (12x60min)/20min=36 générations

N=N0 (2n) donc : N=236=68719476736 cellules

4) Le taux de croissance :

µ=Ln2/G donc µ=0,7/20 µ=0,035min-1


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Exercice 3 :

N=2000 cellules, N0=2 cellules t=2h

n=t/G

N=N0 (2n) donc 2n= N/N0 2

n=2000/2=1000 bc=a donc Log b a=c alors log2 1000=n et

LogaX=LnX/Lna n=Ln1000/Ln2=0,90/0,7 n=9,9 générations

G=t/n et donc : G=2x60/9,9 G=12,12 min

Exercice 4 :

µ=lnN-lnN0/t-t0 donc µ= ln6,6 106-ln100/4 µ=3,92 H-1

G=ln2/µ donc G=0,7/3,92 G=0,17h=10,71 min

Exercice 5 :

1) La fonction qui représente le nombre de bactéries en fonction du temps :

F (x)= nombre de bacteries X=temps B0=nombre initial t0=temps initial

X (min) Calculs F(x)

X (min) Calculs F(x)

0 B0 20B0

10 2 x B0 21B0

20 2 x (2B0) 22B0

30 2 x (22B0) 23B0

40 2 x (23B0) 24B0

50 2 x (24B0) 25B0

Donc la fonction est sous la forme : F(x)=B0 x 2x/10

Ou F(x) : nombre de bactérie B0 : inoculum de départ

2 : taux de croissance (Bactérie double)

x/10 : intervalle de temps


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2) Après 1H : N = 896 bactéries B0= ? x = 1H = 60 minutes

F(x) =B0 x 2x/10 896 = B0 x2x/10 896 = B0 x 26/60 B0=14 bactéries

3) F(x) =? x=3H=180 minutes B0=14

F(x) =14 x 218 F(x)= 3670 106 bactéries

4) x= ?

7168=14 x 2x/10 2x/10=7168/14 2x/10= 512 bc=a logb (a) =c alors log2 (512)=x/10

92=X/10 x=90 minutes

Exercice 6 :

1) Calcul du nombre de colonies :

1 colonie dans 1 litre =107 bactéries

1 ml=104 bactéries

1 ml/9 ml=103 bactéries/ml

100 µl=102 bactéries donc 100 colonies après culture (1 bactérie donnera 1 colonie)

2) Le bouillon nutritif est placé à 37°C et les bactéries sont dénombrées, le calcul du taux de

croissance horaire et le temps de génération :

Nn=N02n

Log Nn- log N0=n log 2= µ t log2

µ=log N2 – log N1/ (t2-t1) x log 2 = (7,19-6,39)/(1) x 0,3 = 2,69 division/heure

g= 60/µ = 22,3 minutes

3) Calcul du nombre de bactéries/ ml :

Log Nn – log N0= n log2 = µt log 2

Log N7 – log N6 = 2,69 x 1 x 0,3 = 0,807

N7 = 9,9 107 bactéries / ml

Exercice 7 :

1) On trouve ces bactéries dans la cavité buccale

2-a) Calcul du nombre de bactéries :

Microscope : 0,2 µl…................120 bacteries


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5000 µl (5 ml)................?

D’où ?= 5000 x 120/0,2 = 3 106 bactéries/5 ml

Isolement sur gélose (dénombrement par la technique de la viabilité cellulaire) :

0,1 ml au 1/1000 donne 15 colonies

Nombre de bactéries /5 ml = 15 x inverse de la dilution x5 ml / 0,1 ml

= 15 x 1000 x 5/ 0,1

=7,5 105 bactéries/ ml

2-b) Comparaison des chiffres :

3 106 divisé par 7,5 105 = 4 il y a 4 fois moins de bactéries dénombrées sur la gélose que

sous le microscope.

Explication :

-Erreur de dilution

-Erreur d’échantillonnage (tube non homogénéise lors du prélèvement de 0,1 ml au 1/1000)

-Erreur d’étalement

- 75% des bactéries sont mortes (4 fois moins = il reste 25% de bactéries vivantes) – peu probable -

culture fraiche

-Les bactéries s’associent 4 par 4 (chainette) = 1 ufc contient 4 bactéries mais après culture ne donne

qu’une colonie. Explication +++ vu le groupement des streptocoques. Pour les streptocoques, on

évite le dénombrement par la technique de la viabilité cellulaire sur gélose.

B) Méthodes d’évaluation :

Turbidimétrie, spectrophotomètre, compteur électronique.

3-a) Calcul du temps de génération :

À t=0, on compte dans 0,2 µl 120 bactéries (méthode microscope) i.e 0,1 µl donne 60 bactéries.

*À 37°C : on a 240 bactéries dans 0,1 µl au bout de 2h soit 120 min.

On peut calculer n selon la formule N=2n N0 en ramenant N et N0 à un nombre de bactéries par

meme unité de volume.

On peut tout ramener à 0,1 µl et multiplier par 2 (1 génération).

T=0 min, 0,1µl donne 60 bactéries

T=120 min, 0,1 µl donne 240 bactéries 60 x 2= 1 génération=120


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120 x 2= 1 génération= 240 d’où G=120 min/ 2 générations= 60 min.

*À 42°C : on a 480 bactéries dans 0,05 µl i.e 960 bactéries pour 0,1 µl soit 120 min.

On peut calculer n selon la meme formule et la meme méthode :

T=0 min, 0,1 µl donne 60 bactéries

T=120 min, 0,1 µl donne 960 bactéries = 60 x 2= 1 génération=120

120 x 2=1 génération=240



D’où G=120 min/4 générations=30 min

3-b) D’après ces résultats, ces bactéries sont thermophiles

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