1 Facult de Mdecine et de Pharmacie de FES - MAROC BIOCHIMIE II (Biochimie-Biologie molculaire) Travaux dirigs de Biologie Molculaire (Fvrier 2008) Pr Yves MOREL QUESTION N 1 (1 point) La coupure de l'ADN gnomique par l'enzyme de restriction Taq 1 donne en autre un fragment de 600bp englobant un gne A. Par la mthode de Southern une seule bande est rvle. Quelle quantit d'ADN reprsente cette bande si 10 g a t dpos ? A20 ng B20 pg C0,2 pg D5 pg E2 pg QUESTIONN2 (1 point) Le gnome humain contient des squences rptes et uniques. Parmi les squences suivantes, lesquelles sont considres comme uniques ? Asquence crant un RFLP (restriction fragment length polymorphism) Bsquence AluCsquence transcrite par la RNA polymrase de type I Dsquence codant pour un ARN 5S Esquence transcrite par la RNA polymrase de type II QUESTIONN3 A la suite d'une prise de sang sur anticoagulant, l'extraction de l'ADN se fait partir A - du srum B - des plaquettes C - des leucocytes D - du plasma E - des globules rouges La figure ci-dessous reprsente schmatiquement un gne eucaryote. Rpondez aux 4 questions suivantes. QUESTION N 4 O se trouve le site d'initiation, ATG ? QUESTION N 5 O se trouve le site de polyadnylation ? QUESTION N 6 O se trouve le site d'initiation de la transcription ? QUESTION N 7 O se trouve le codon stop ? QUESTION N 8 Dans le muscle, l'expression du gne ci-dessus (figure avant la question 6) diffre de celle observ dans les autres tissus, l'ARN messager est constitu des exons 2-3-4-5 et 6. On en dduit :Al'existence d'un promoteur diffrent dans le muscle Bl'existence d'une modification post transcriptionnelle: une dition Cl'obtention d'une protine de taille diffrente Dla prsence d'un codon stop dans l'exon 2.5' 3'1 2 3 4 561'' 2' 3' 4'C EDA B5'2 QUESTION N 9 L'ADN mitochondrial : Aest transmis surtout par le pre Bcode pour toutes les protines mitochondriales Cest circulaire Dn'a pas d'intron ElesmutationsdecetADNsetraduisentcliniquementsurtoutpardesatteintesmusculaireset encphaliques QUESTIONN10 Parmi les molcules suivantes, lesquelles sont utilises pour marquer radioactivement l'extrmit 5' d'un oligonuclotide ? AT7 DNA polymrase Bo-32P-dATP C-32P-dATP D-32P-ATP ET4 polynuclotide-kinase QUESTIONN11 (1 point) Pourmarquerradioactivementunesonded'ADNparlamthodedemulti-amorageauhasard"multi-random priming", on utilise AT4 polynuclotide-kinase Bo-32P-dCTP Co-32P-CTP D-32P-CTP EFragment de klenow QUESTION N 12 (2 points) Pour mettre en vidence de longs remaniements de l'ADN gnomique, la mthode de Southern est frquemment utilise. Parmi les propositions suivantes, quelles en sont les tapes par ordre chronologique ? 1- Lavage selon des conditions de stringence lies la nature de la sonde 2- Transfert sur une feuille de nylon 3- Migration sur un gel d'agarose 4- Autoradiographie 5- Dnaturation de l'ADN de sujets normaux et de patients 6- Hybridation avec une sonde marque au 32P 7- Digestion par une enzyme de restriction 8- Extraction de l'ADN de sujets normaux et de patients A8 - 5 - 7 - 3 - 2 - 6 - 1 - 4 B8 - 7 - 5 - 3 - 2 - 6 - 1 - 4 C8 - 7 - 3 - 6 - 2 - 1 - 5 - 4 D8 - 7 - 3 - 6 - 2 - 5 - 1 - 4 E8 - 7 - 3 - 5 - 2 - 6 - 1 4 QUESTION N 13 LamthodedeSouthernestcourammentutilisepourtudierungnede3000bpcommeceluicodant pour la 21-hydroxylase, enzyme uniquement surrnalienne. A - L'ADN des sujets est extrait des leucocytes, digr par un enzyme de restriction, spar par lectrophorse et transfr sur une feuille de nylon aprs dnaturation par la soude. B - Le gne tudi reprsente un millionnime du gnome haploide humain. C - Le gne tudi reprsente un 1/100000ime du gnome haploide humain. D - On utilise une sonde marque au 32P provenant d'une librairie d'ADNc de leucocytes. E - Cette mthode ne permet pas de mettre en vidence une dltion de 8 paires de base. 3 QUESTIONN14 Aprs avoir digr l'ADN d'un sujet par l'enzyme de restriction Eco RI, le gne ci-dessous est tudi par lamthodedeSouthern.Cegneestreprsentschmatiquement:lesrectanglesnoirsreprsententles exons,lesflcheslessitesderestrictiondel'enzymeEcoRI,lenombreenkilobases(kb)entredeux flches correspond la distance entre deux sites de restriction. Uneseulecombinaisonci-dessouscorrespondl'ensembledesfragmentss'hybridantavecunesonde rprsentant tout l'ADN complmentaire de ce gne : A - 2,6 kb - 1,5 kb - 3,5 kb - 4,5 kb - 3 kb - 1kb B - 2,6 kb - 4,5 kb - 3 kb - 1kbC - 2,6 kb - 4,5 kb - 3 kbD - 2,6 kb - 1,5 kb - 4,5 kb - 3 kb - 1kb E -3,5 kb - 1kb QUESTIONN15 Si le sujet tudi ci-dessus tait homozygote pour une dltion de l'exon 3 qui n'abolit pas de site Eco RI, on dtecterait par rapport au rsultat de la question prcdente : A - aucun changement B - un fragment suprieur 4,5kb avec absence des fragments 4,5 kb et 3 kbC - un fragment suprieur 4,5kb avec absence du fragment 4,5 kbD - un fragment infrieur 4,5kb avec absence des fragments 4,5 kb et 3 kb E - un fragment infrieur 4,5kb avec absence du fragment 4,5 kb QUESTIONN16 (2 points) A l'aide des deux squences ci-dessous, il est possible de voir qu'il existe un intron.Squence d'une partie d'un gne : 16 11 162181 8691 5' AGGCAGCACA AGGTGGGGACTGTCC.......CCATAGCAG GAGAGCCTC 3' Squence de l'ADN complmentaire qui correspond cette partie du gne : 5' AGGCAGCACAAGGAGAGCCTC 3' Par quels nuclotides commence et finit cet intron? A - 11.......84 B - 14.......87 C - 12.......85D - 13.......86 E - 22.......86 QUESTIONN17 Pour isoler l'ADN complmentaire de la proopiomlanocortine, on utilise: A - une banque gnomique B - une banque d'ADN complmentaire hpatiqueC - une banque d'ADN complmentaire hypothalamiqueD - une banque d'ADN complmentaire de leucocytes E - une banque d'ADN complmentaire d'anthypophyse 5'3'2,6kb 1,5kb3,5kb 4,5kb12433kb1kb4 QUESTION N 18 (2 points) UnfragmentBglII-XbaId'ADNhumainreprsentantungneatisolpartird'unelibrairie gnomique. Pour en faire la carte de restriction et le squenage, on veut le sous cloner dans un plasmide de 3 kb. Le site de clonage comprend plusieurs sites uniques d'enzymes de restriction dont la localisation de5'vers3'estlasuivante:EcoRI-BamHI-XbaI-SacI-HindIII.Onrappellelessitesde reconnaissance et de coupure des enzymes suivants :Site Bam HI5' G + G A T CC 3' Site Bgl II5' A + G A T CT 3' 3' CC T A G | G 5' 3' TC T A G | A 5' Site Eco RI5' G + A A T TC 3' Site Xba I5' T + C T A GA 3' 3' CT T A A | G 5' 3' AG A T C | T 5' Ale sous-clonage est impossible Ble sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Eco RI Cle sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Eco RI et Xba I Dle sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Bam HI et Xba I Ele sous-clonage ncessite la coupure du plasmide par Xba I QUESTION N 19 (3 points) Les rsultats obtenus aprs digestion de ce plasmide recombinant avec diverses enzymes de restriction sont les suivants :- avec Xba I : un fragment de 10 kb - avec Eco RI : un fragment de 10 kb - avec Sac I : deux fragments de 4 kb et de 6 kb On en dduit : Ale fragment gnomique insr est de 3 kb Ble fragment gnomique insr est de 7 kb Cle fragment gnomique insr contient 2 sites Sac I Dle fragment gnomique insr contient 1 site Sac I Ele fragment gnomique insr peut tre rcupr par une digestion simultane Eco RI et Xba I QUESTIONN20 (2 points) On utilise la mthode de PCR pour dterminer si un sujet est porteur d'une mutation d'un gne responsable d'une maladie gntique.Voici la liste des produits et de mthodes pouvant tre utiliss 1- Taq polymrase 2- l'enzyme de restriction Taq I 3- ADN gnomique 4- dnaturation -hybridation des amorces- extension (25 cycles) 5- hybridation des amorces-dnaturation de l'ADN gnomique- extension (25 cycles) 6- dsoxynuclotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 7- didsoxynuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Parmi les propositions suivantes, laquelle permettra d'amplifier ce fragment ? Aon met dans le mme tube (3 + 1 + 7) puis on ralise 4 Bon met dans le mme tube (3 + 1 + 6) puis on ralise 5 Con met dans le mme tube (3 + 2 + 7) puis on ralise 4 Don met dans le mme tube (3 + 2 + 7) puis on ralise 5 Eaucune solution juste QUESTIONN21 Parmi les molcules suivantes, lesquelles sont utilises pour amplifier un fragment d'ADN humain par la mthode de PCR ? A - l'ADN humain B - oligonuclotides servant d'amorces C - l'enzyme de restriction Taq I D - des ribonuclotides E - la Taq polymrase 5 QUESTIONN22 Les produits de PCR amplifis donnent sur un gel d'agarose un profil qui diffre selon la concentration en MgCl2 utilise:

[1], concentration en MgCl2 utilise pour obtenir le profil 1, [2].....pour le profil 2, [3] ...... D'aprs les trois profils, vous pouvez dduire que

A - [1] < [2] < [3] B - [2] < [1] < [3] C - [3] < [2] < [1] D - [2] < [3] < [1] E - [1] < [3] < [2] QUESTIONN23 LesproduitsdePCRamplifisdonnentsurungeld'agaroseunprofilquidiffreselonlatemprature utilise: T1, temprature utilise pour obtenir le profil 1, T2.....pour le profil 2, T3 ...... D'aprs les trois profils, vous pouvez dduire que A - T1 < T2 < T3 B - T2 < T1 < T3 C - T3 < T2 < T1 D - T2 < T3 < T1 E - T2 = T3 < T1QUESTIONN24 Pour trouver les meilleures conditions d'amplification spcifique d'un fragment d'ADN de 500 bppar la mthode de PCR, on fait varier un seul paramtre, la temprature. De quelle temprature s'agit-il? A - de la temprature de dnaturation de l'ADN B - de la temprature d'extension des amorces C - des tempratures de dnaturation et d'hybridation des amorces D - de la temprature d'hybridation des amorces E - des tempratures de dnaturation et d'extension des amorces 1 2 3500 pb1 2 3500 pb6 QUESTIONN 25 (1 point) Cette figure reprsente le gne d'une protine enzymatique qui prsente un peptide signal.O commence la squence nuclotidique qui code pour ce peptide signal (utilisez la nomenclature donne en cours) ? QUESTIONN 26 (3 points) On ralise un Western blot pour tudier l'expression de ce gne dans le foie et le muscle. Deux anticorps sont utiliss: l'anticorps monoclonal 1 est dirig contre l'pitope cod par l'exon 5 qui contient la squence du site actif; l'anticorps monoclonal 2 est dirig contre l'pitope cod par l'exon 3. Ces deux anticorps sont des anticorps de souris.A noter qu'on observe la mme activit enzymatique dans les deux tissus, mais avec une rgulation diffrente. Le transcrit primaire du gne ci-dessus est identique dans les deux tissus. Ci dessous, la liste de diffrentes tapes exprimentales permettant d'tudier une protine (des tapes intermdiaires peuvent ne pas tre cites). 1-Autoradiographie 2 - Transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose 3 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de souris marqu l'iode radio-actif 4 - Biopsie du tissu 5 - Gel-filtration 6 - Electrophorse en utilisant un gel SDS-acrylamide avec mercaptothanol. 7 - Incubation avec soit l'anticorps 1 soit avec l'anticorps 2 8- Lavage Dans quel ordre, se droule la ralisation de ce Western blot ? A4 - 5 - 2 - 7 - 8 - 3 - 8 - 1 B 4 - 6 - 2 - 3 - 8 - 7 - 8 - 1 C4 - 5 - 2 - 3 - 8 - 7 - 8 - 1 D4 - 6 - 2 - 7 - 8 - 3 - 8 - 1 E4 - 2 - 7 - 8 - 3 - 8 - 6 - 1 C ED5'3'1 2 3 4 561''2'3'4'AB5'7 QUESTIONN27 (2 points) muscle foie muscle foie Les rsultats ci-dessus du Western blot et les renseignements donns ci-dessus permettent d'en dduire Ales deux protines ont la mme taille Bchacun des deux protines peut avoir plusieurs sous-units de taille diffrente Cchacun des deux protines peut avoir plusieurs sous-units de taille identique Dles deux protines sont codes par des gnes diffrents Eles deux protines sont des isoenzymes QUESTIONN 28 (2 points) Quel est le mcanisme responsable des profils nots sur le western blot ? Apromoteur diffrent Bpissage alternatif de l'exon 5 dans le muscle Cpissage alternatif de l'exon 3 dans le muscle Dpissage alternatif de l'exon 5 dans le foie Epissage alternatif de l'exon 3 dans le foie ENONCE CORRESPONDANT AUX QUESTIONS (29 34) La squence suivante est celle d'un exon avec ses bordures introniques. La partie codante reprsente 300bp : 5 ' AGTACCTTGATGGCATGACTAGTACCCGGGCTAATCGATCCC IleGlnGln Arg LeuGln GluGluLeu Asp HisGlu Leu GATCATTCCCCAG [ATT CAG CAG CGA CTG CAG GAG GAG CTA GAC CAC GAA CTG GlyPro GlyAla SerSerSerArg...............//................ ThrArg ProSerSe GGC CCT GGT GCC TCC AGC TCC CGG ...............//................ACACGG CCC AGC AG ] GTGACTCCCGAGGGTTGGGGAGTCATTCGATGGCATAGCT3' QUESTION N 29 (3 points) Quelles sont parmi les amorces suivantes les deux qui vous demanderez synthtiser pour amplifier par la mthode de PCR cet exon ? A5'TCGATACGGTAGCTTACTGA3' B5'AGTCATTCGATGGCATAGCT3' C5'AGCTATGCCATCGAATGACT3' D5' TCATGGAACTACCGTACTGA3' E5'AGTACCTTGATGGCATGACT3' QUESTION N 30 (2 points) Quelle est la longueur du fragment amplifi ?A355 bp B395 bp C375 bp D300 bp Eaucune Anticorps1 Anticorps 2 25 ?15 ?8 QUESTION N 31 (1 point) Une mutation C T apparait dans le troisime codon Glutamine (Leu-Gln-Glu).Nous rappelons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction, Eco RI et Pst I, sont les suivants: 5' G + AATTC 3'site Eco RI5' C TGCA+ G 3'site Pst I 3' CTTAA | G 5'3' G |ACGT C 5' Quel est le retentissement de cette mutation ?Achangement d'acide amin Bpas de retentissement Cdcalage du cadre de lecture Dapparition d'un codon stop Eaucune QUESTION N 32 Le profil lectrophortique de l'ADN correctement digr d'un malade homozygote pour cette mutation montrera par rapport celui de l'ADN control Aaucune diffrence Bapparition d'une bande supplmentaire plus grande Capparition d'une bande supplmentaire plus petite Ddisparition d'une bande sans autre changement Edisparition de deux bandes avec apparition d'une bande plus grande QUESTION N 33 Pour mettre en vidence cette mutation, plusieurs tapes sont proposes 1- Amplification d'un fragment d'ADN entourant cette mutation 2-Coloration au bromure d'thidium du gel d'agarose 3- Digestion par l'enzyme Eco RI 4- Digestion par l'enzyme Pst I 5- Digestion par les enzymes Eco RI et Pst I 6- Migration sur un gel d'agarose 7- Photographie du gel color 8- Extraction de l'ADN d'un sujet normal et du sujet suspect d'avoir cette mutation Dans quel ordre, faites-vous cette exprience ? A8 - 5 - 1 - 2 - 6 - 7 B8 - 1 - 4 - 6 - 2 - 7 C8 - 4 - 1 - 2 - 6 - 7 D8 - 3 - 1 - 6 - 2 - 7E8 - 1 - 3 - 6 - 2 - 7 QUESTION N 34 (1 point) Chez un malade htrozygote pour cette mutation (c'est--dire ayant cette mutation sur un seul de ses deux chromosomes), quel est le profil lectrophortique obtenu aprs amplification de ce fragment et coupure par l'enzyme de restriction dont le site est modifi par cette mutation (on admet qu' il est unique dans ce fragment) ?A1 bande B2 bandes C3 bandes D4 bandesE :5 bandes 9 Enonc correspondant au Gne de la DystrophineLes dltions du gne de la dystrophine sont responsables de deux maladies musculaires, l'une trs svre appele Myopathie de Duchenne, l'autre moins grave appele "Maladie de Becker". A la fin du fascicule, vous avez la squence des exons 44 51 du gne de la dystrophine et leurs bordures introniques. Le reste desintronsdetailletrsgrandeestmarqupardespointills(-----------).Souslespartiesexoniquesse trouvent la squence des acides amins. La jonction intron-exon n'est pas signale et peut se trouver 1 ou 2 bp du codon indiqu. De mme la fin d'un exon peut correspondre un codon incomplet. Une mini-dystrophine dpourvue de la squence protique code par les exons 44 51 reste un peu fonctionnelle. La numrotation correspond aux nuclotides. QUESTIONN35 (2 points) Parmi les dltions suivantes, quelles sont celles responsables de la Maladie de Duchenne (myopathie svre) Adltion de l'exon 44 Bdltion de l'exon 45 Cdltion de l'exon 46 Ddltion de l'exon 47 Edltion de l'exon 48 QUESTIONN36 (2 points) Parmi les dltions suivantes, quelles sont celles responsables de la Maladie de Becker (myopathie moins grave) Adltion de l'exon 49 Bdltion de l'exon 50 Cdltion de l'exon 51 Ddltions englobant les exons 47 et 48 Edltions englobant les exons 48 et 49 QUESTIONN 37 (2 points) Parmi les dltions suivantes, quelles sont celles responsables de la Maladie de Duchenne (myopathie grave) Adltions englobant les exons 45, 46 et 47 Bdltions englobant les exons 46, 47 et 48 Cdltions englobant les exons 46, 47, 48, 49 et 50 Ddltions englobant les exons 47, 48, 49 et 50 Edltions englobant les exons 48, 49, 50 et 51 QUESTION N 38 (2 points) Pour tudier l'exon 51 du gne de la dystrophine, un fragment de 340 bp (voir question suivante) est amplifi par la mthode de PCR.Quelles sont parmi les amorces suivantes de 20 bp les deux que vous demanderiez synthtiser pour amplifier ce fragment ? A5'AAAATGATAAAAGTTGGCAG3' B5'AAATTGGCTCTTTAGCTTGT3' C5'GACGGTTGAAAATAGTAAAA3' D5' ACAAGCTAAAGAGCCAATTT3' E5'CTGCCAACTTTTATCATTTT3' QUESTION N 39 (1 point, 1 seule rponse juste) Par quels nuclotidescommence et se termine le fragment prcdent amplifi ? A1791 et 2110 B1811 et 2130 C1791 et 2130 D1811 et 2110 E1791 et 2130 10 Sites de restriction pour les questions 40 et 41 BstN I:5' CC + TGG3'Mbo I: 5' + GATC 3' Mse I: 5' T + TAA3'Afl II:5'C+ TTAAG3' QUESTION N 40 (1 point) La mutation du nuclotide 2021 en T situ dans l'exon 51 du gne de la dystrophine ? Ane modifie pas la fonction de la dystrophine Bcre un site de restriction Centrane un dcalage de lecture Dchange un acide amin un autre diffrent Edonne une protine tronque QUESTION N 41 (1 point) La mutation du nuclotide 2030 en T situ dans l'exon 51 du gne de la dystrophine ? Ane modifie pas la fonction de la dystrophine Bcre un site de restriction Centrane un dcalage de lecture Dchange un acide amin un autre diffrent Edonne une protine tronque Squence des exons 44 51 du gne de la dystrophine et des bordures introniques 11 12 Problme sur FGFR2 La squence ci-dessous correspond une partie du gne du rcepteur de type 2 de FGF (fibroblaste growth factor). Elle commence dans un exon et se termine dans un autre exon. Sous les parties exoniques, la squence protique correspond la troisime boucle Immunoglobuline-like de la partie extra-cellulaire de ce rcepteur. La suite 3 du gne code pour le passage transmembranaire et la partie cytoplasmique qui contient deux domaines tyrosine-kinases.Ala : GCUGCAGCCGCG QUESTION N 42(2 points) Lexamen de ces squences nuclotidique et protiques permet de dire que : Ail existe 3 introns Bles sites accepteurs sont les plus frquemment rencontrs chez les gnes humains Cil existe la possibit de pont disulfure intra-chane dans cette 3me boucle Dla dltion de lexon (contenant les nuclotides 250-350) donnerait une protine tronque Eil existe 3 sites potentiels de N-glycosylation Le changement du nuclotide 328 G en A est responsable chez un nouveau-n dun syndrome malformatif trs important des os de crne et de la face. Plusieurs hypothses ont t mises pour expliquer la gravit de cette mutation .QUESTION N 43(3 points) La premire est la cration dun site Accepteur. Dans ce cas Ale rcepteur FGF de type 2 est plus court de 17 acides amins Ble rcepteur FGF est tronqu du domaine transmembranaire et des domaines tyrosine-kinases Cil existe un dcalage de lecture DlARNm mature de FGFR de type 2 est plus court que lARNm normal Eaucune des propositions ci-dessus nest juste 13 QUESTION N 44(3 points) La seconde est la cration dun site Donneur. Dans ce cas Ale rcepteur FGF de type 2 est plus court de 17 acides amins Ble rcepteur FGF est tronqu du domaine transmembranaire et des domaines tyrosine-kinases Cil existe un dcalage de lecture DlARNm mature de FGFR de type 2 est plus court que lARNm normal Eaucune des propositions ci-dessus nest juste QUESTION N 45 (1 point) En considrant que le patient est homozygote pour cette mutation, on ralise une RT-PCR partir

AdADN extrait de muscle BdADN extrait de fibroblaste CdADN extrait de surrnale DdADN extrait dos Eaucune des propositions ci-dessus nest juste QUESTION N 46 (2 points) En considrant que le patient est homozygote pour cette mutation, on ralise une RT, puisune PCR en prenant comme amorces des oligonuclotides compris entre 100 - 120 et 500 - 520. Parmi les oligonuclotides suivants, lesquels sont utiliss ? A G T C T G G G G A A G C T G T A A T C T CB G A G A T T A C A G C T T C C C C A G A CC C T C T A A T G T C G A A G G G G T C T GD C T T G A G G T A G G G C A G C C C G T CE G A C G G G C T G C C C T A C C T C A A G Items de rponse pour les 3 questions suivantesCi-dessous 5 squences potentielles obtenues aprs le squenage du produit de PCR (seulement une partie de la squence du produit de PCR est montre, la partie souligne est la plus intressante pour rpondre la question) ? ATATACGTGCTTGGCGGGTAATTCTATTGG BTATACGTGCTTGGCAGGTAATTCTATTGG CGTTCTCAAGGTAATTCTATTGGGATATCC DTATACGTGCTTGGCAGCGCCTGGAAGAGAAAA EGTTCTCAAGCGCCTGGAAGAGAAAAGGAG QUESTION N 47 (2 points, 1 seule rponse juste) Si la mutation cre un site accepteur, quelle est la bonne squence ? QUESTION N 48 (2 points, 1 seule rponse juste) Si la mutation cre un site donneur, quelle est la bonne squence ? QUESTION N 49 (2 points, 1 seule rponse juste) Prenons une troisime hypothse, lexon, qui porte la mutation, est limin par exon skipping , quelle est la bonne squence ? 14 Squence de la PROINSULINE ci-dessous et premires questions du problme sur lINSULINE 15 QUESTION N50 (1 point) Pour isoler ce gne humain, une sonde d'ADN complmentaire de l'insuline a t obtenue partir Ad'une banque gnomique Bd'une banque d'ADN complmentaire hpatique Cd'une banque d'ADN complmentaire d'hypophyse Dd'une banque d'ADN complmentaire de pancras Eaucune rponse bonne QUESTION N 51 (4 points) L'ARN messager mature de l'insuline sans compter l'extrmit 3' polyA est peu prs long de ? A333 paires de bases B350 paires de bases C423 paires de bases D465 paires de bases E490 paires de bases 16 QUESTION N 52 (1 point) Combien d'introns contient le gne de l'insuline ? A1 B2 C3 D4 Eaucune rponse juste 17 Problme sur lINSULINE (suite) : voir squence du gne sur fascicule part QUESTION N 53 (2 points) Combien d'acides amins contient le peptide signal de l'insuline? A15 B24 C33 D41 E45 QUESTION N 54 (2 points) Chez un patient homozygote pour la mutation du nuclotide G en T appele R65L du gne de l'insuline, onralisepartirduplasmaunwesternblotenutilisantunanticorpspolyclonaldelapinreconnaissant lesdeuxchanesdel'insuline?Cidessoussetrouvelalistedediffrentestapesexprimentales permettant d'tudier l'expression de ce gne mut de l'insuline (des tapes intermdiaires peuvent ne pas tre cites ou tre inutiles dans cette exprience). 1 - Lavage 2 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de souris li un enzyme 3 - Prise de sang 4 - Transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose 5 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de lapin li un enzyme 6 - Electrophorse en utilisant un gel SDS-acrylamide avec mercaptothanol. 7 - Incubation avec l'anticorps polyclonal dirig contre l'insuline ? 8- Raction enzymatique avec formation d'un produit mesurable Dans quel ordre, se droule la ralisation de ce Western blot ? A 3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 B3 - 6 - 4 - 7 - 5 - 1 - 8C3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 D3 - 6 - 4 - 7 - 2 - 8 - 1 E3 - 7 - 6 - 4 - 5 - 8 - 1 Ci-dessus se trouvent 5 profils de Western blot. En tenant compte de deux renseignements supplmentaires : - la bande accompagne d'une astrisque (*) correspond la proinsuline - on considre que la proinsuline est absente dans le sang d'un individu normalRpondez aux questions suivantes QUESTIONN55 (1 point) Quelle est environ la taille de la proinsuline ? A258 paires de bases B86000 daltons C10214 daltons D8,6 kilodaltons E86 kilopaires de base QUESTIONN56 (2 points) Quel est le profil de Western blot qui correspond un homme normal ? XkDMarqueursA B C D E*0, 5XkD18 QUESTIONN57 (2 points) Quel est le profil du Western blot qui correspond l'individu homozygote pour la mutation R65L ? QUESTION N 58 (3 points) Pour tudier cette mutation chez les parents et d'autres membres de la famille, un fragment d'environ 250 bp est amplifi par la mthode de PCR. Une des deux amorces se trouve proche du site accepteur de l'intron qui prcde l'exon qui porte cette mutation. Quelles sont parmi les amorces suivantes de 20 bp les deux que vous demanderiez synthtiser pour amplifier ce fragment qui contient la mutation ? A5'TGCTCTGCGCGGCACGTCCT3' B5'ACGCAGCCTGCAGGCAGCCC3' C5'GAACCAGCCCTGCTGTGCCG3' D5' CTTGGTCGGGACGACACGGC3' E5'CGGCACAGCAGGGCTGGTTC3' QUESTION N 59 (1 point) Nous rappelons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction, Eco RI et Hind III, sont les suivants: 5' G + AATTC 3'site Eco RI5' A + AGCT T3'site Hind III 3' CTTAA | G 5'3' TTCGA | A 5' Chez un htrozygote pour cette mutation (un seul de ses deux chromosomes porte cette mutation), aprs amplification de ce fragment d'ADN que faites-vous pour mettre en vidence cette mutation R65L du gne de l'insuline ? Cochez les tapes utilises. Acoloration par le bleu de coomassie Bdigestion par l'enzyme Eco RI Cdigestion par l'enzyme Hind III Dlectrophorse en utilisant un gel d'agarose Electrophorse en utilisant un gel SDS-polyacrylamide QUESTION N 60 (2 points) Quel profil obtient-on (rsultat 5 bp prs) ? A1 bande de 256 bp B2 bandes de 174bp et 82 bp C2 bandes de 154 bp et 102 bp D3 bandes de 256 bp, 154 bp et 102 bp E3 bandes de 256 bp, 174 bp et 82 bp Biochimie II /Biologie Molculaire 1re session Mai 2004 (extraits) : Rcepteur aux andrognes Leslsionsdugnedurcepteurauxandrognessontresponsablesdusyndromedinsensibilitaux andrognes. Il sagit dune maladie gntique transmission rcessive lie au chromosome X. Seuls les individus46,XYsontatteints.Ilexistedeuxformescliniques :lunecompltedonnantunphnotype fminin, lautre incomplte donnant une ambigut des organes gnitaux externes. Alafindufascicule,vousavezdeuxsquencescontenantlesrgionscodantesdurcepteuraux andrognes(squence1etsquence2).Lasquence1reprsentelasquencepartielledel'ADN complmentairedurcepteurauxandrognes(ilmanquelesextrmits5'et3').Ellecontientdes astrisquesquicorrespondentdesacidesaminstrsconservsparmilercepteurauxandrognesde nombreusesespces.Lacideamin667correspondaupremieracideamindelhliceoH1du domainequiencontient12.Lacideaminquiterminela12mehliceoestS900.Lesexonssont nomms en lettre. QUESTIONN 61 (3 points) Ala squence 1 peut tre obtenue aprs lextraction de lADN dun individu Bla squence 2 provient dune banque dADN gnomique Cle rcepteur aux andrognes contient 919 acides amins daprs ces deux squencesDces deux squences contiennent plusieurs zones rptes 19 Eles acides amins marqus par un astrisque appartiennent au domaine liant les andrognes QUESTIONN62 (2 points) Le rcepteur aux andrognes A est un rcepteur membranaire Bse lie lADN sous forme dhtrodimre Ca son domaine liant les andrognes qui stend de lexon D lexon H Dlie un coactivateur en labsence de ligand Erecrute des histones-dactylases en prsence de ligand QUESTIONN 63 (1 point) Deux ARN messagers du rcepteur aux andrognes sont dtects par la mthode de Northern en utilisant commesondelADNcomplmentairedugnedurcepteurauxandrognes.Lunprdominantaune taille de 10 kb, lautre une taille de 7 kb. Pour raliser ce Northern, plusieurs tapes sont utilises. Parmi celles listes ci-dessous, lesquelles ont servi la ralisation de ce Northern. AExtraction de l'ADN de la prostate ou de fibroblaste de peau gnitale BDigestion de lARN par des enzymes de restriction CAprs sparation de lARNm par lectrophorse, transfert sur une feuille de nylonD Avant le transfert, dnaturation de lARNm par la soude E Amplification par RT-PCR QUESTIONN64 (1 point) Comme la diffrence de taille entre les 2 ARN messagers de 10 kb et 7 kb du rcepteur aux andrognes nesontpassecondaireunpissagealternatif,ellepourraittredue(aidez-vousdeslongueursdes squences 1 et 2) A une initiation diffrente de la traduction B une initiation diffrente de la transcription C la prsence de deux sites de la polyadnylationD la prsence de deux codons stop E Aucune des rponses prcdentes n'est juste Enonc pour les questions 65 71 En hybridant avec lADN complmentaire du rcepteur aux andrognes une banque dADN gnomique, plusieurs clones ont t isols.Lacarte de restriction de lun de ces clones est dessine sur la figure ci- dessous.LefragmentSmaI-KpnI(2601-4000)reprsentelefragmentdelasquence2allantdu nuclotide 169 au nuclotide 1568. Le Northern prcdent est hybrid par 3 fragments distincts du clone ci-dessous.LesfragmentsSmaI-KpnI(2601-4000)etSmaI-SmaI(1401-2600)donnentunsignal dhybridation avec deux bandes, lune de 10 kb et lautre de 7 kb. Avec le fragment Xba I-Nsi I, il ny a pas de bandes lautoradiographie. Il nexiste quun seul site dinitiation de la transcription. Pour dterminer avec prcision le site dinitiation de la transcription, on ralise une exprience utilisant la protection la nuclase S1. Elle se droule en 3 tapes :i)hybridation en phase liquide de fragments dADN complmentaire du brin 5-3 du clone (figure la question 26) aux ARN totaux extraits de tissus prostatiques;ii)coupure par la nuclase S1; Nsi IEco RISma IXba IKpn ISma IEco RIBst NIClone provenantdunebanquegnomique hybridparlADNcdurcepteur aux andrognesLes chiffres correspondent la position du nuclotide prcdant la coupure par l enzyme de restriction. Lenombre 0 par la coupure parXha I est arbitraire.02600400014007501600pb3 520 iii)lectrophorse et autoradiographie.Le rsultat est sur la figure ci-dessous. QUESTION N 65 (1 point) Les trois sondes (1, 2 et 3) utilises respectivement dans les expriences dposes sur les lignes 1, 2 et 3 ont t marques en 5' Apar la Taq polymrase Bpar la rserve transcriptaseCpar la T4 polynuclotide-kinase Den utilisant de l'ATP marqu en par le 32P Een utilisant de l'ATP marqu en o par le 32P QUESTION N 66 (3 points) On peut en dduire que le gne du rcepteur aux andrognes Aa son site dinitiation de la transcription situ ~80 pb de son site dinitiation de la traduction Ba 9 intronsCa son site dinitiation de la transcription situ ~1110 pb de son site dinitiation de la traduction Da une rgion non codante en 5 denviron 1310 pb (5UTR) Ea une rgion non codante en 5 denviron 1510 pb (5UTR) QUESTION N 67 (3 points) On peut en dduire daprs tous les renseignements dj obtenus depuis le dbut que Ales squences 1 et 2 ne contiennent pas le site dinitiation de la transcription Blinsertion de la queue polyA peut se faire sur le nuclotide 3120 de la squence 1 Cla transcription peut sarrter au nuclotide 4343 de la squence 2 Dle fragment en amont du site Nsi I nest pas transcrit Ela partie 3 non codante est de taille variable QUESTION N 68 (2 points) Pourconnatrelasquencegnomiquedelapartie5enamont(upstream)delasquence2,onutilise lors du squencage du clone gnomique ci-dessus une amorce correspondant la squence souligne A1 dans la squence 2.Loligonuclotide utilis sera : A5'CGCCTGTTGAACTCTTCTGAGC3' B5'GCGGACAACTTGAGAAGACTCG3' C5'GCTCAGTTGAAAATAGTAGGCG3' D5' GCTCAGAAGAGTTCAACAGGCG3' E5'CGAGTCTTCTCAAGTTGTCCGC3' 1 2 30, 2 kpb1, 2 kpb1, 4 kpbAutoradiographieaprsprotection lanuclaseS1Sonde 1: NsiI-Bst N I (750-1600)Sonde 2: SmaI-SmaI(1400-2600)Sonde 3: Sma I-Kpn I(2601-4000)21 QUESTION N 69 (2 points) UnedltiondelexonBdugnedurcepteurauxandrognes,englobantlesborduresintroniques,est responsable dune forme complte dinsensibilit aux andrognes.Cette dltion Adonne une protine tronque c'est--dire de taille infrieure la protine normale Bdonne une protine liant les andrognes, mais ne liant pas lADN Cdonneuneprotinedtectableparwesternblotavecunanticorpsmonoclonaldirigcontreun pitope correspond aux acides amins 800 850 du rcepteur aux andrognes Ddonne une protine capable in vitro de stimuler lactivit dun gne reporter (lucifrase) ayant dans sa rgion promotrice plusieurs ARE Esera dtectable en tudiant lARNm par RT-PCR QUESTION N 70 (3 points) Avantl'utilisationdelabiologiemolculairepermettantlesquenagedugnedurcepteuraux andrognes, ltude de la liaison des andrognes sur des fibroblastes enculture provenant dune biopsie de peau gnitale dun patient suspect dinsensibilit complte aux andrognes tait un outil diagnostique en permettant d'valuer le KD et le nombre de rcepteurs.Parmi les mutations suivantes qui sont toutes responsables dune insensibilitcomplte aux andrognes, lesquelles abolissent totalement la liaison des andrognes ces fibroblastes.Amutation C784Y (TGTTAT) Bmutation dans lintron B (ou 2) changeant le nuclotide 2 A en C produisant un exon skipping de lexon C Cmutation R607X (CGATGA) Dmutation H874C (CATCGT) Emutation C619S (TGTTCT) QUESTION N 71 (3 points) Un patient, porteur de la mutation Q60X (CAGTAG) du gne du rcepteur aux andrognes a une forme partielledinsensibilitauxandrognes.Ltudedelaliaisondesandrognessurdesfibroblastesen culture de ce patient montre une liaison diminue mais relle aux rcepteurs.Lewesternblotfaitpartirdesextraitscellulaires(1et3 :fibroblastesdusujetnormal ;2et4 : fibroblastes du patient ayant la mutation Q60X)est hybrid par deux anticorps monoclonaux diffrents; lun(anticorpsA)reconnatlextrmitN-terminaledelaprotine,lautre(anticorpsB)reconnatle domaine de liaison des andrognes (figure ci-dessous).

On peut en conclure que cette mutation

Adonne une protine tronque de son domaine de liaison lADNBne donne aucune protine Cdonne une protine tronque ne contenant pas les 200 premiers acides amins Dentranelutilisationdunnouveausitedinitiationdelatraductionpermettantlasynthsedune protine commenant par la mthionine 189 Edonne un ARN messager mature plus court~108 kDa~78 kDaWe ste rn blotAnticorps A Anticorps B1 2 3 422 Facult de Mdecine et de Pharmacie de FES 1re anne - mai 2004 (1re session) EPREUVE DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE Pr Yves MOREL dure de lpreuve : 90 minutes IMPORTANT : vous devez vrifier que votre livret contient 20 questions : QUESTIONS N 1 20 En rponse chaque question vous pouvez noircir une cinq cases sur la grille QUESTION N 1 (1 point) Le gnome humain contient des squences rptes et uniques. Parmi les squences suivantes, lesquelles sont considres comme uniques ? Asquence crant un RFLP (restriction fragment length polymorphism) Bsquence AluCsquence transcrite par la RNA polymrase de type I Dsquence codant pour un SNP Esquence transcrite par la DNA polymrase de type II QUESTION N 2 (1 point) Parmi les domaines suivants, lesquels se retrouvent dans une protine nuclaire qui module la transcription. Adomaine 7 passagestransmembranaires Bdomaine leucinezipper Cdomaine du peptidesignal Ddomaine 2 doigtsde zinc Ehomodomaine QUESTION N 3 (1 point) Un coactivateur A se lie une squence HRE Bpermet de tranformer leuchromatine en htrochromatine Ca une activit histone dactylase Dpeut se lier au domaine de liaison contenant 12 hlices o Eagit comme un mdiateur pour augmenter la transcription dun gne QUESTION N 4 (1 point) La protine HP1 (heterochromatine protein 1) A se lie des coactivateurs Bpermet de tranformer leuchromatine en htrochromatine Cfavorise le recrutement dune histone dacetylase pour inactiver lhistone adjacent Dse lie au rsidu lysyl 9 dans lhistone H3 Einhibe directement la RNA polymrase DNA dpendante de type II 23 Enonc pour les Questions n 5 et 6Pour liminer le gne AMH dans les cellules de Sertoli au moment de la pubert chez la souris, il faut obtenir un ensemble de croisements entre des souris normales et transgniques comme le montre la figure ci-dessous. La recombinaison homologue a lieu dans les cellules ES. Les cellules ES sont incorpores dans un blastocyte. La souris obtenue correspond la souris 1 de larbre ci-dessous. La souris 4 est homozygote par linvalidation conditionnelle du gne AMH (il sera appel gne AMH*). La souris 8 a le matriel gntique permettant tout moment dinvalider compltement le gne AMH. QUESTION N 5 (2 points) La souris 1 a t obtenue aprs recombinaison homologue avec un vecteur recombinant.Ce vecteur recombinant avant son introduction dans les cellules ES contient Aune partie de la squence gnomique de lAMH Bun gne NEO qui a t introduit dans un exon du gne AMH en provoquant un dcalage de lecture Cun des exons codant pour un domaine essentiel de la fonction anti-mullerienne qui est entour par des sites CREDle gne Thymidine kinase pour obtenir une slection positiveEau moins trois sites Lox P QUESTION N 6 (2 points) Daprs larbre gnalogique, on peut dire Ala souris 8 est homozygote pour le gne AMH* et htrozygote pour le gne CRE-LBDantistrogne Bau moins une de deux souris 6 et 7 est htrozygote pour le gne CRE-LBDantistrogne et le gne AMH* Cla souris 5 contient dans son ADN un gne CRE-LBDantistrogne pouvant sil est transcrit donner une protine fusion CRE-domaine de liaison aux strognes mut capable de lier seulement un anti-strogne comme le TamoxifneDla souris 5 contient dans son ADN le gne CRE-LBDantistrogne sous le contrle dun promoteur spcifique de cellules cardiaques Ela souris nest quhtrozygote pour le gne CRE-LBDantistrogne QUESTION N 7 (1 point) Ltiquettage dune protine Y

Ase ralise avant la synthse de la protine YBpermet de purifier les molcules qui interagissent avec cette protine YCncessite pour des tudes in vivo le transfert dun vecteur dexpression pouvant produire une protine de fusion comme la green fluorescent protein + protine Y Dncessite la connaissance de la fonction de la protine Y Epermet la purification de la protine Y par une chromatographie daffinit 124356 7824 Enonc pour les Questions suivantes :Le dficit en 17|-hydroxystrode dhydrognase Ledficiten17|-hydroxystrodedhydrognase(17|-HSD),maladietransmissionautosomique rcessive,estresponsablechezlesujet46,XYduneambigutsexuelleduelabsencedesynthsede testostrone par les cellules de Leydig du testicule. Il est trs frquent dans la bande de Gaza. Lenzyme responsable na jamais pu tre purifi mme partiellement partir du tissu testiculaire. Avant la dcouverte du gne 17|-HSD de type 3 responsable de cette maladie, deux gnes ont t isols.- Le gne 17|-HSD de type 1 catalysant les ractions 2 et 4. - Le gne 17|-HSD de type 2 catalysant la raction 3. LesADNcdeces2gnesnhybridentpaslesARNmdoriginetesticulairequisontdposssurun northern blot. QUESTIONN 8 (1 point) Parmi les propositions suivantes, quelles sont les tapes qui diffrent entre la mthode de Northern et la mthode de Southern ? ALavage aprs hybridation selon des conditions de stringence lies la nature de la sonde BTransfert sur une feuille de nylon C Dnaturation par la soude du gel dlctrophorse avant le transfert sur la feuille de nylon D Hybridation avec une sonde marque au 32P EDigestion par une enzyme de restriction QUESTIONN 9 (2 points) DesauteursontisollADNcresponsabledudficiten17|-HSDpartirdunebanquedADNcde testicule construite dans un vecteur dexpression. Pour dcouvrir le bon clone, ils ont recherch les clones dADNc qui synthtisent de la 3H-testostrone. Parmi les outils suivants, lesquels ont t utiliss lors de cette exprience ? A 3H-oestradiol comme substrat B 3H-A4-androstnedione comme substratC lADNc dugne 17|HSD de type 2 comme sonde D des anticorps anti-17|HSD de type 2 comme sonde Edes anticorps anti-17|HSD de type 3 comme sonde OOOHHOOOH1 1Testostrone A4-androstnedionestradiol strone2 23 34 4HOO5 56 6OOOHHOOOH1 1Testostrone A4-androstnedionestradiol strone2 23 34 4HOO5 56 625 QUESTIONN 10 (3 points) A la fin du fascicule, vous avez deux squences 5'3' correspondant soit cet ADN complmentaire soit unepartiedugne17|-HSDdetype3.Lestrianglessontsitusaudessusdudbutdunexon.La numrotation utilise dans ces deux squences est totalement indpendante. La squence correspondante lADNcomplmentaireestcomplte.Lenzymecodeparlegne17|-HSDdetype3necatalyse quune seule raction, la conversion de la A4-Androstnedione en testostrone. La seule bande dtectable parcessquencessurlautoradiographiedunNorthernreprsentatifdunnombreimportantdetissus correspond celle du testicule. On peut dire que AlADNc du gne 17|-HSD de type 3 correspond la squence 2 Bla squence 2 contient toute la squence du gne 17|-HSD de type 3 Cla bande dtecte lors du Northern est suprieure 1,1 kDADun exon est constitu uniquement dune squence non codante (UTR) ElADNc du gne 17|-HSD de type 3 correspond la squence 1 QUESTIONN11 (2 points) La squence 1 Acontient un site de polyadnylation Bcomprend les exons 3, 4 et 5 Ccomprend la squence complte de deux intronsDmontre que lintron 5 commence au nuclotide 501 Ereprsente le 0,32 millionime du gnome haplode humain QUESTIONN12 (1 point) La mutation R80Q est la plus frquente du dficit en 17|-HSD car elle atteintla population de la bande de Gaza o une trs forte consanguinit existe. Cette mutation Aest situe dans lexon 2 Bchange le nuclotide 146 en A (numrotation de la squence 1) Cchange le nuclotide 147 en A (numrotation de la squence 1) Dchange le nuclotide 148 en A (numrotation de la squence 1) Eaurait pu crer un site donneur

QUESTIONN13 (1 point) LedpistagedecettemutationR80Qpeuttrefaitelargechelledanslapopulationdelabandede Gaza. Plusieurs mthodes peuvent tre utilises, mais elles ncessitent toutes au pralable une extraction de lADN chez chaque individu et une amplification par PCR du fragment de 970 bp de la squence 1.Voici la liste des produits et de mthodes pouvant tre utiliss 1- Taq polymrase 2- l'enzyme de restriction Taq I 3- ADN gnomique 4- ARN 5- dnaturation -hybridation des amorces- extension (25 cycles) 6- hybridation des amorces-dnaturation de l'ADN gnomique- extension (25 cycles) 7- dsoxynuclotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 8- didsoxynuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) Parmi les propositions suivantes, laquelle permettra d'amplifier ce fragment ? Aon met dans le mme tube (4 + 2 + 7) puis on ralise 6 Bon met dans le mme tube (3 + 1 + 8) puis on ralise 5 Con met dans le mme tube (4 + 1 + 7) puis on ralise 5 Don met dans le mme tube (3 + 2 + 7) puis on ralise 6 Eon met dans le mme tube (3 + 1 + 7) puis on ralise 5 26 QUESTIONN14 (2 points) Si la mthode de coupure par les enzymes de restriction est utilise, quels sont les items justes Acoupure du fragment de 970 bp par lenzyme Alu I Bun sujet normal a trois bandes : 606 bp, 219 bp, 145 bp Cun sujet htrozygote pour la mutation a quatre bandes : 825 bp, 606 bp, 219 bp, 145 bp Dun sujet homozygote pour la mutation a deux bandes : 825 bp, 145 bp Eun sujet htrozygote pour la mutation a quatre bandes : 751 bp, 606 bp, 219 bp, 145 bp QUESTIONN15 (2 points) Si la mthode de dot-blot est utilise, quels sont les items justes. Les squences des sondes correspondent aux squences 5-3 donnes la fin du polycop. Alessondesutilisespeuventtredesoligonuclotidesdenviron20nuclotidesmarqusgrce une T4-polynuclotidekinase en utilisant de [o32P]ATP Blune des sondes a comme squence (dbut T138)5TTATTAGCCGGACGCTGGAA 3Clune des sondes a comme squence (dbut T138)5TTATTAGCCGAACGCTGGAA 3 Dlune des sondes a comme squence (dbut T138)5TTATTAGCCAGACGCTGGAA 3 EDeux sondes marques hybrident en mme temps la mme feuille de nylon QUESTIONN16 (1 point) La mutation changeant le nuclotide 189 (squence 1) en T Aest situe dans lintron 3 Bscrit IVS4+4A>T Cscrit IVS3-4A>T Dse trouve dans le site accepteur de lintron 3 Eest une mutation stop Enonc pour les Questions 17, 18, 19 et 20Aprsgonadectomie,lARNdunpatienthomozygotepourcettemutationchangeantlenuclotide189 (squence 1) en T est extrait du tissu gonadique. Le Northern (figure droite) est hybrid par lADNc du gne 17|-HSD de type 3. LARN est amplifi par RT-PCR en utilisant deux amorces, lune situe dans lexon1(amorce1)etlautredanslexon5(amorce2).Llectrophorsedesproduitsobtenusmontre lexistencede2bandes.Lesquenagede5ldelaractiondeRT-PCRestfaitenutilisantplusieurs amorces.Onnobtientunesquencelisiblesurtoutesalongueurquavecuneamorcesetrouvantdans lexon 4. On retrouve en particulier cette squence (le brin dADN ci-dessous est le mme que ceux des squences 1 et 2 situes la fin du fascicule) :5 GAAAGCGTACTCGTTCGAGAGCGGACTACAGGGAGGAGTGTGAA 3 QUESTIONN17 (3 points) Cette squence 5 GAAAGCGTACTCGTTCGAGAGCGGACTACAGGGAGGAGTGTGAA 3

Ane correspond qu lexon 4 Bcorrespond la jonction entre lexon 4 et 5 Ccorrespond la jonction entre lexon 3 et 4 Dcorrespond la jonction entre lexon 3 et 5 Ecorrespond la jonction entre lexon 2 et 4 27 QUESTIONN18 (3 points) On peut dire que Alesfragmentsdposesdanslespuits(normaletmut)delafigureci-dessusdroitesontdes fragments dADN Bles bandes visibles sur llectrophorse des produits de RT-PCR ont tcolores par le bleue de coomassie Clasquenceci-dessusaputreobtenueenutilisantlamorcedduitedelasquence461-480 (squence 1) : 5 CCTGCAAGTTTTTCTTTAAT 3 Dlasquenceci-dessusaputreobtenueenutilisantlamorcedduitedelasquence411-430 (squence 1) : 5 TGCTTGTATAATCTTCACAC 3 Elasquenceci-dessusaputreobtenueenutilisantlamorcedduitedelasquence461-480 (squence 1) : 5 ATTAAAGAAAAACTTGCAGG 3 QUESTIONN19 (2 points) En vous aidant du profil du Northern blot ci-dessus, des rponses aux questions 17 et 18 et en considrant quelunedesbandesdelARNmutcorrespondlexonskippingdesexons3et4,ltudedu retentissement de la mutation changeant le nuclotide 189 (squence 1) en T ltat homozygote (voir le profil mut du Northern blot ci-dessus et) permet de dire que AlARNmrsultantdunpissagenormaldugne17|-HSDdetype3nestpasvisiblesurle Northern (profil mut) Bla bande qui a la taille la plus grande correspond un ARNm sans lexon 4 Cla bande qui a la taille la plus petite correspond un ARNm sans les exons 3 et 4 DlARN ayant la plus grande taille na pas darrt prmatur de la traduction ElARN ayant la plus petite taille correspond lexon 4 QUESTIONN20 (2 points) La protine rsultant de lexon skipping des exons 3 et 4 Aest une protine dau moins de 240 acides amins Bpeut tre visualise par la mthode de Southern Cseradtecteparunanticorpsmonoclonalanti-17|-HSDdetype3dirigcontrelapartieC-terminal de la protine Dne sera pas dtecte par un anticorps monoclonal anti-17|-HSD de type 3 dirig contre les acides amins 80 140 Eest une protine trs courte de 82 AA (mthionine 1 incluse) 28 Facult de Mdecine et de Pharmacie de FES 1re anne - mai 2005 (1re session) EPREUVE DE BIOCHIMIE ET BIOLOGIE MOLECULAIRE Pr Yves MOREL dure de lpreuve : 90 minutes IMPORTANT : vous devez vrifier que votre livret contient 20 questions : QUESTIONS N 1 20 En rponse chaque question vous pouvez noircir une cinq cases sur la grille QUESTION N 1 (1 point) Un microsatellite spcifique dune rgion de notre gnome Aest bialllique Best une squence rpte variable dun individu lautreCdoit tre amplifi avec des amorces contenant en 3 au moins 2 3 copies du motif rpt Dpeut tre une squence Alu Epeut tre un SNP QUESTION N 2 (1 point) Un SNP single nuclotide polymorphism Aest bialllique Best un microsatellite Cconcerne un polymorphisme suprieur 1% de la population Dest assez rare (environ 500 000 dans notre gnome haplode) Eest une squence unique QUESTION N 3 (1 point) Un domaine leucine-zipper A contient une hlice o avec beaucoup dacides amins chane latrale basique Best constitu de 3 hlices o Ccontient ube rptition de rsidus leucyl Dpermet la constitution de dimres grce aux chanes latrales charges de rsidus leucyl Eindique que la protine est un coactivateur QUESTION N 4 (1 point) Un gne domestique house keeping gene A na pas de bote TATA Bsexprime spcifiquement dans un tissu Cest une squence unique Dest un pseudogne par duplication Epossde dans la rgion rgulatrice une squence GC hypermthyle 29 QUESTION N 5 (1 point) Le code gntique

Aest chevauchant Best dgnr Cest constitu de 64 codons codant 20 acides amins Dest spcifique despce Epermet de protger lindividu en ayant par exemple 6 codons pour les acides amins les plus frquemment rencontrs dans les protines QUESTION N 6 (1 point) A propos des polymrases, A lARN polymrase ADN dpendante de type III permet la transcription des tRNA BlARN polymrase ADN dpendante de type I permet la transcription des ARN ribosomaux ClADN polymrase ADN dpendante de type II permet la transcription des squences gniques uniquesDla Taq polymrase est une ADN polymrase thermosensible Ela Transcriptase inverse est une ARN polymrase QUESTION N 7 (1 point) A propos de la transgense, A le gne NEO permet dinvalider le gne lors de la transgense conditionnelle Ble gne NEO permet la slection positive suelement des cellules ayant eu une recombinaison homologue Cle gne TK (thymidine-kinase) permet la phosphorylation de la nomycine Dun des sites Lox P doit tre dans un exon pour une invalidation conditionnelle de ce gne Ela slection des cellules ES ayant eu une recombinaison homolgue ncessite dabord une slection positive suivie dune slection ngative. Enonc pour les questions suivantes Tous les nonces des questions suivantes peuvent servir rpondre aux questions 8 20 A la fin du fascicule se trouvent deux squences : 1-lasquencedugnedela21-hydroxylase,CYP21etdesonpseudogneCYP21P(distribueen cours).Lasquencecompltecorrespondcelledugnefonctionnel,CYP21.Pourlepseudogne CYP21P,seulementlesnuclotidesdiffrentssontnots.Danslesdeuxsquences,untraitsignalela dltion dun nuclotide. Les flches verticales indiquent les dbuts de la transcription. Entre le dbut de la transcriptionet le dbut de la traduction, il nexiste pas dintron. 2-lasquencedelextrmit3delADNcomplmentairesanslaqueuepolyAdugnedela21-hydroxylase. Ce gne code pour une enzyme, le cytochrome P450c21, exclusivement surrnalien, qui catalyse une 21-hydroxylation.Cetteractionestirrversible.Ledficiten21-hydroxylase,maladietransmission autosomiquercessive,estresponsabledunehyperplasiecongnitaledessurrnales.Laformelaplus graveentraneunedhydratationsvredunouveau-nparunsyndromedepertedesel.Durantlavie ftale, le nouveau-n 46 XX prsente une virilisation des organesgnitaux externes mais a des organes gnitaux internes normaux.30 QUESTIONN 8 (3 points) On peut dire que Ala fin de la transcription du gne CYP21 peut tre dtermine Ble gne CYP21 contient 10 exons Cle gne CYP21 contient un exon sans squence codante Dle dbut de la transcription se trouve un endroit attendu si lon regarde la squence du gne CYP21Ele dernier nuclotide transcrit est le nuclotide 2706 (squence 1) QUESTIONN 9 (3 points) Le pseudogne CYP21P Aest un rtroposon Bcontient dans la partie codante 2 insertions de nuclotides qui entranent un dcalage de lecture avec formation dun codon stop Ccontient une dltion qui entrane un dcalage de lecture avec formation dun codon stop Dcontient une mutation ponctuelle qui cre un codon stopEcontient une insertion qui entrane un codon stop dans le mme exon QUESTIONN 10 (3 points)( une seule rponse juste) En vous aidant des deux squences, quelle serait la taille ( 5pb prs) de lADNc correspondant lARNm le plus transcrit A1491 pb B2179 pb C2207 pb D2251 pb E2360 pb QUESTIONN 11 (2 points) La protine SF1, rcepteur nuclaire orphelin, et lACTH, peptide, rgulent lexpression du gne CYP21. On peut dire que ASF1 contient plusieurs passages transmembranaires BACTH est synthtis par lhypophyse sous forme dun prcurseur nomm la POMC CACTH se lie un rcepteur membranaire sept passages transmembranaires qui a pour second messager le systme tyrosine-kinase DSF1 doit lier un lment de rponse appel enhancer EPour stimuler la transcription, le domaine 12 hlices o de SF1 change de conformation pour recruter des histones dactylases 31 QUESTIONN 12 (2 points) Le premier ADNc dcouvert concernant le gne CYP21 a t isol chez le bovin. Cet ADNc bovin a t utilis pour isoler lADNc humain du gne CYP21. Comme lhomologie de squence entre lADNc bovin et humain est diffrente, la sonde dADNc CYP21 bovine hybride avec des conditions diffrentes dhybridation les banques bovines et humaines dADNc. On peut dire que Acest une banque humaine dADNc de foie qui a permis disoler lADNc CYP21 humain Bla temprature dhybridation de la banque humaine a t suprieure celle utilise pour la banque bovine Cla concentration en sel lors de lhybridration de la banque humaine a t suprieure celle utilise pour la banque bovine Dcette sonde contient des intronsElADNc humain isol, dont la squence est la fin de ce fascicule, contient les exons 8, 9, 10 et 11 du gne CYP21 QUESTIONN 13 (2 points) Pour dterminer le dbut de la transcription, deux mthodes sont possibles. Si on utilise la mthode par la protection la nuclase S1, lesquelles des phrases suivantes sont justes ? Aextraction de lARNm dans le tissu o sexprime le gne CYP21 Butilisation dune sonde marque situe en amont de la premire flche et allant jusquau nuclotide 150 Ccoupure par la RNase Dmigration des fragments protgs sur un gel de squence Eutilisation dun e amorce complmentaire de la squence correspondante aux7 premiers acides amins de la protine Cytochrome P450c21 QUESTIONN 14 (2 points) Pour dterminer le dbut de la transcription, deux mthodes sont possibles. Si on utilise la RT-PCR, on prend une amorce dans la rgion du gne CYP21 o dbute la traduction. Lesquelles des phrases suivantes sont justes ?

Aextraction de lARNm dans le tissue o sexprime le gene CYP21 Butilisation de lamorce 5 ATGCTGCTCCTGGGCCTGCT 3 Cutilisation de lamorce 5 TACGACGAGGACCCGGACGA 3 Dutilisation de lamorce 5 AGCAGGCCCAGGAGCAGCAT 3 Emigration des fragments synthtiss sur un gel de squence QUESTIONN 15 (2 points) Pour tudier la mutation Q318X, la plus frquente en Tunisie dans le dficit en 2&-hydroxylase, on utilise une amplification dun fragment dADN en utilisant des amorces trs spcifiques du gne. Cette mutation modifie lun des sites de restriction ci-dessous (appel site Q318X). Le fragment normal amplifi contient trois sites de restriction de lenzyme dont le site est modifi. Site Bam HI5' G + GATCC 3'Site Bgl II5' A + GATCT 3' Site Eco RI5' CTGCA + G3'Site Xba I5' T + CTAGA 3' On peut dire que Acette mutation est localise dans lexon 7 Bcette mutation entrane un dcalage de lecture et une protine tronque Cle fragment amplifi normal aprs digestion donne 4 bandes Dle fragment amplifi contenant la mutation ltat homozygote donne 5 bandes Ele fragment amplifi contenant la mutation ltat htrozygote donne 5 bandes 32 QUESTIONN 16 (2 points) La dltion de lexon 3 ltat homozygote Adonne une ARNm plus court Bnentrane pas de dcalage de lecture Cdonne une protine tronque de 108 acides amins Dfait apparatre un codon stop dans lexon 5 Edonne une protine reconnue par un anticorps monoclonal dirig vers lpitope reconnaissant les acides amins 110-130 Enonc commun pour les questions n 17 n20 Le nuclotide 655C du gne CYP21 peut subir deux changements qui ont des consquences diffrentes. Un seul de ces changements modifie un site de restriction (site Alu : AGCT). 1-LechangementdeCenAnemodifiepaslamaturationdutranscritprimaireetlactivit21-hydroxylase.2 - En revanche, le changement de C en G ltat homozygote donne un dficit en 21-hydroxylase trs svre.QUESTIONN17 (1 point) Le changement de C en A ApeuttremisenvidenceenamplifiantparPCRunfragmentlecontenantetendigrantle fragment amplifi par une enzyme de restriction Best un RFLP Cest un polymorphisme appel SNP : single nucleotide polymorphism Dpeut tre mis en vidence en amplifiant par PCR un fragment le contenant et en faisant un dot blot Ese trouve dans lintron 3 du gne CYP21

QUESTIONN18 (3 points) Le changement de C en G Afait disparatre le site Alu I (AGCT) Bfait apparatre une mutation dltre qui scrit IVS2-13C>G Centranerait un dcalage du cadre de lecture si le site accepteur quil cre est utilis Ddonnerait une protine de 498 acides amins si le site accepteur quil cre est utilisEdonnerait une protine tronque si le site accepteur quil cre est utilis 33 QUESTIONN19 (2 points) Enfaitdesexpriencesinvitromontrentquelesiteaccepteurpotentielcreparcechangementdu nuclotide 655 C en G nest pas reconnu.Le caractre dltre sexplique par desanomalies dpissage quinesontpascelleprvue.Ceciatdmontrgrceltudedelacorticosurrnaledunepatiente homozygote pour cette mutation qui a subi une surrnalectomie bilatrale parce quelle ne prenait pas son traitement. A partir de ce tissu surrnalien, une protection de lARN total par la nuclase S1 a t ralise (rsultatfigureci-dessous :WTnormal ;C>Ghomozygotepourlamutation).Lasondeutilise commence en 5 au milieu de lintron 2 du gne CYP21 et se termine en 3 au milieu de lexon 3. Elle est marque par la mthode multi-amorcage au hasard . Lorigine des flches en pointill montre la fin de laprotectiondelARNen5(nuclotideengras).Chaquefragmentprotgestnumrot.Lasquence dADN situe sous la figure est la copie de lune des deux qui se trouvent la fin du fascicule. A propos de cette protection la nuclase S1, Ale marquage de la sonde a t effectu grce une polynuclotide-kinase Bla sonde gnomique va shybrider avec lARNm mature soit normal soit mut Cla nuclase S1 dgrade lADN ou lARN monobrin Dcest une mthode plus sensible que la RT-PCR pour tudier lARNm Elimage ci-dessus est une autoradiographie dun gel dacrylamide utilis pour le squenage QUESTION N 20 (3 points) LARN du patient homozygote pour la mutationC>G a t amplifi par la raction de RT-PCR et sous clon. Plusieurs clones ont t dtects par la mme sonde utilise pour la protection la nuclase S1. Le squenagedecesclonesestfaitavecuneamorcesitueaudbutdelexon3avantladltionde8bp prsente dans le pseudogne. Les bandes 1 et 2 correspondent aux fragments protgs de la figure incluse dans la question prcdente. On peut dire que Alamorce utilise pour le squencage est 5AAGAACTACCCGGACCTGTCCTTG 3 BlesquencagedelADNccorrespondantlpissagedduitedelabande1permetdedireque lARNm mature sera 5CCACUUACCUUUCCCACCCU 3 Cle squencage de lADNc correspondant lpissage dduite de la bande 2 permet de dire que le lARNm mature sera 5CCACUUACCUCCCCCACCUCCU 3 DlaprotinetraduitepartirdelARNmobtenudaprslpissagedduitedelabande1est tronque ElaprotinetraduitepartirdelARNmobtenudaprslpissagedduitedelabande2est tronque 5 CATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTCCTCCTGCAGACAAG 3GWT C>GSens de la migration1 2 35 CATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTCCTCCTGCAGACAAG 3GWT C>GSens de la migration5 CATCAGTTCCCACCCTCCAGCCCCCACCTCCTCCTGCAGACAAG 3GWT C>GSens de la migration1 2 334 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 TATA Facteurs trans Facteursde transcription de base ARN polymerase II Promoteur(~100 pb 500 pb) Rgion transcrite Rgions rgulatrices enhancer Signal depolyadenylation Exon Exon Exon Intron stop ATG Intron AATAA 47 agccctccag gacaggctgc atcagaagag gccatcaagc aggtctgttc caagggcctt60 tgcgtcaggt gggctcagga ttccagggtg gctggacccc aggccccagc tctgcagcag 120 ggaggacgtg gctgggctcg tgaagcatgt gggggtgagc ccaggggccc caaggcaggg 180 cacctggcct tcagcctgcc tcagccctgc ctgtctccca gatcactgtc cttctgcc 238 atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggcc 283 MALWMRLLPLLALLActctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctg 328 LWGPDPAAAFVNQHLtgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaa 373 CGSHLVEALYLVCGEcgaggcttcttctacacacccaagacccgccgggaggcagaggac 418 RGFFYTPKTRREAEDctgcagg gtgag ccaactgccc attgctgccc ctggccgccc ccagccaccc 470 LQV cctgctcctg gcgctcccac ccagcatggg cagaaggggg caggaggctg ccacccagca 530 gggggtcagg tgcacttttt taaaaagaag ttctcttggt cacgtcctaa aagtgaccag 590 ctccctgtgg cccagtcaga atctcagcct gaggacggtg ttggcttcgg cagccccgag 650 atacatcaga gggtgggcac gctcctccct ccactcgccc ctcaaacaaa tgccccgcag 710 cccatttctc caccctcatt tgatgaccgc agattcaagt gttttgttaa gtaaagtcct 770 gggtgacctg gggtcacagg gtgccccacg ctgcctgcct ctgggcgaac accccatcac 830 gcccggagga gggcgtggct gcctgcctga gtgggccaga cccctgtcgc caggcctcac 890 ggcagctcca tagtcaggag atggggaaga tgctggggac aggccctggg gagaagtact 950 gggatcacct gttcaggctc ccactgtgac gctgccccgg ggcgggggaa ggaggtggga 1010 catgtgggcg ttggggcctg taggtccaca cccagtgtgg gtgaccctcc ctctaacctg 1070 ggtccagccc ggctggagat gggtgggagt gcgacctagg gctggcgggc aggcgggcac 1130 tgtgtctccc tgactgtgtc ctcctgtgtc cctctgcctc gccgctgttc cggaacctgc 1190 tctgcgcggc acgtcctggc ag 1202 tggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcag 1259 GQVELGGGPGAGSLQcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgc 1325 PLALEGSLQKRGIVEQCCTSIC tccctctaccagctggagaactactgcaactagac gcagcccgca ggcagcccca 1380 48 SLYQLENYCN*cacccgccgc ctcctgcacc gagagagatg gaataaagcc cttgaaccag ccctgctgtg 1440 ccgtctgtgt gtcttggggg ccctg Figure : Squence du gne de linsuline humaine Quel tissu ? cDNA Pour isoler ce gne humain, une sonde d'ADN complmentaire de l'insuline a t obtenue partir Ad'une banque gnomique Bd'une banque d'ADN complmentaire hpatique Cd'une banque d'ADN complmentaire d'hypophyse Dd'une banque d'ADN complmentaire de pancras Eaucune rponse bonne Taille (bases) ARNm mature ? L'ARN messager mature de l'insuline sans compter l'extrmit 3' polyA est peu prs long de ? A333 paires de bases B350 paires de bases C423 paires de bases D465 paires de bases E490 paires de bases Taille (bases) ARNm codante ? Combien dintron contient le gne de linsuline ? Quelle environ la taille (pb) de la proinsuline ? Quelle la taille (acides amins) de la proinsuline ? Combien d'acides amins contient le peptide signal de l'insuline? A15 B24 C33 D41 E45 Chez un patient homozygote pour la mutation du nuclotide G en T appele R65L du gne de l'insuline, on ralise partir du plasma un western blot en utilisant un anticorps polyclonal de lapin reconnaissant lesdeuxchanesdel'insuline?Cidessoussetrouvelalistedediffrentestapesexprimentales permettant d'tudier l'expression de ce gne mut de l'insuline (des tapes intermdiaires peuvent ne pas tre cites ou tre inutiles dans cette exprience). 1 - Lavage 2 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de souris li un enzyme 3 - Prise de sang 4 - Transfert sur une membrane de nylon ou nitrocellulose 5 - Incubation avec un anticorps anti-anticorps de lapin li un enzyme 6 - Electrophorse en utilisant un gel SDS-acrylamide avec mercaptothanol. 7 - Incubation avec l'anticorps polyclonal dirig contre l'insuline ? 8- Raction enzymatique avec formation d'un produit mesurable 49 Dans quel ordre, se droule la ralisation de ce Western blot ? A 3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 B3 - 6 - 4 - 7 - 5 - 1 - 8C3 - 7 - 6 - 4 - 2 - 8 - 1 D3 - 6 - 4 - 7 - 2 - 8 - 1 E3 - 7 - 6 - 4 - 5 - 8 1 Ci-dessus se trouvent 5 profils de Western blot. En tenant compte de deux renseignements supplmentaires : - la bande accompagne d'une astrisque (*) correspond la proinsuline - on considre que la proinsuline est absente dans le sang d'un individu normalRpondez aux questions suivantes Quel est le profil de Western blot qui correspond un homme normal ? QUESTIONN57 (2 points) Quel est le profil du Western blot qui correspond l'individu homozygote pour la mutation R65L ? QUESTION N 58 (3 points) Pour tudier cette mutation chez les parents et d'autres membres de la famille, un fragment d'environ 250 bp est amplifi par la mthode de PCR. Une des deux amorces se trouve proche du site accepteur de l'intron qui prcde l'exon qui porte cette mutation. Quelles sont parmi les amorces suivantes de 20 bp les deux que vous demanderiez synthtiser pour amplifier ce fragment qui contient la mutation ? A5'TGCTCTGCGCGGCACGTCCT3' B5'ACGCAGCCTGCAGGCAGCCC3' C5'GAACCAGCCCTGCTGTGCCG3' D5' CTTGGTCGGGACGACACGGC3' E5'CGGCACAGCAGGGCTGGTTC3' QUESTION N 59 (1 point) Nous rappelons que les sites de reconnaissance des enzymes de restriction, Eco RI et Hind III, sont les suivants: 5' G + AATTC 3'site Eco RI5' A + AGCT T3'site Hind III 3' CTTAA | G 5'3' TTCGA | A 5' Chez un htrozygote pour cette mutation (un seul de ses deux chromosomes porte cette mutation), aprs amplification de ce fragment d'ADN que faites-vous pour mettre en vidence cette mutation R65L du gne de l'insuline ? Cochez les tapes utilises. Acoloration par le bleu de coomassie Bdigestion par l'enzyme Eco RI Cdigestion par l'enzyme Hind III Dlectrophorse en utilisant un gel d'agarose XkDMarqueursA B C D E*0, 5XkD50 Electrophorse en utilisant un gel SDS-polyacrylamide QUESTION N 60 (2 points) Quel profil obtient-on (rsultat 5 bp prs) ? A1 bande de 256 bp B2 bandes de 174bp et 82 bp C2 bandes de 154 bp et 102 bp D3 bandes de 256 bp, 154 bp et 102 bp E3 bandes de 256 bp, 174 bp et 82 bp