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TTHHÈÈSSEE

En vue de l'obtention du

DDOOCCTTOORRAATT DDEE LL’’UUNNIIVVEERRSSIITTÉÉ DDEE TTOOUULLOOUUSSEE

Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Chimie- Biologie -Santé

JURY

Dr. Nicole Jaffrézic-Renault, Directrice de Recherche CNRS, Université Lyon 1 (Rapporteur) Dr. Jöel Pincemail, Université de Liège (Rapporteur)

Pr. Bernard Muller, Professeur, Université Bordeaux 2 (Examinateur) Dr. Monique Mauzac, Directrice de Recherche CNRS, Université Toulouse 3 (Examinateur)

Dr. Karine Reybier, Maître de conférences, Université Toulouse 3 (Examinateur) Pr. Françoise Nepveu, Professeur, Université Toulouse 3 (Directrice de thèse)

Pr. Paul-Louis Fabre, Professeur, Université Toulouse 3 (Invité)

Ecole doctorale : Ecole Doctorale Sciences de la Matière

Unité de recherche : Laboratoire de Pharmacochimie des Substances Naturelles et Pharmacophores Rédox, UMR 152 IRD-Université Directeur(s) de Thèse : Pr. Françoise Nepveu

Rapporteurs :

Présentée et soutenue par Clotilde Ribaut

Le 28/11/2008

Titre : Elaboration d'un biocapteur cellulaire impédancemétrique pour la mesure des

changements physiologiques affectant la cellule parasitée

i

Remerciements

Le travail présenté dans ce manuscrit a été réalisé au Laboratoire « Pharmacochimie des

Substances Naturelles et Pharmacophores Redox », LPSNPR, UMR 152 IRD-Université,

dirigé par Madame le Professeur Françoise Nepveu. A l’issue de ce travail, je souhaite

remercier tous ceux qui ont permis sa réalisation.

Je remercie Madame le Professeur Françoise Nepveu, ma directrice de thèse, pour m’avoir

accueilli dans son équipe de recherche.

Je remercie très sincèrement Madame le Docteur Karine Reybier pour avoir encadré et suivi

quotidiennement mes travaux avec rigueur et efficacité pendant ces trois années, dans une

ambiance toujours conviviale.

Je souhaite également remercier Monsieur le Professeur Paul-Louis Fabre, du Laboratoire

Génie Chimique de L’Université de Toulouse, sans qui ce travail n’aurait pas abouti. Je le

remercie pour nous avoir fait partager ses connaissances en électrochimie et pour s’être

investi dans notre travail.

Je remercie Madame le Docteur Nicole Jaffrézic-Renault, Directrice de Recherche au

Laboratoire des Sciences Analytiques de l’Université Claude Bernard-Lyon 1, ainsi que

Monsieur le Docteur Joël Pincemail du CHU Service de Chirurgie Cardiovasculaire de

l’Université de Liège, pour avoir accepté de juger ce travail et d’en être les rapporteurs.

Je souhaite également remercier Madame le Docteur Monique Mauzac, Directrice de

Recherche des IMRCP de l’Université de Toulouse III, et Monsieur le Professeur

Bernard Muller de l’Université Victor Segalen Bordeaux 2, pour m’avoir fait l’honneur de

siéger dans ce jury.

ii

Je tiens également à remercier le personnel de la plateforme biologique de l’UMR 152, dirigé

par Alexis Valentin. Merci à Séverine Chevalley, Agnès Coste, et Eliane Pélissou pour le

temps qu’elles m’ont consacré et leurs nombreux conseils.

Je désire remercier Messieurs les Docteurs Pierre Temple-Boyer, Jérôme Launay et Benoît

Torbiéro du Laboratoire d’Analyse et d’Architecture des Systèmes (LAAS) de Toulouse

pour nous avoir introduit dans le monde capteur.

Bien entendu, je remercie tous les membres, passés ou présents, du laboratoire qui ont permis

de travailler dans une ambiance toujours sympathique : Ménana Haddou, Sothea Kim,

Hany Ibrahim, Peggy Rigou, Anne-Cécile Lelamer, Valérie Jullian, Mohamed Haddad,

Marie-Carmen Monje, Nicolas Fabre, Dominique Bruel, Pierre Perio, Lucia Acebey,

Bénédicte Portet, Alexandre Boyer, Luke Many, Billy Joel, Nawal Bouaynayne.

Enfin un grand merci à mes parents, Guillaume ainsi que toute ma famille, pour leur soutien

et les encouragements qu’ils m’ont apportés.

iii

Liste des symboles

C : capacité (F)

Ci : concentration de l’espèce i

d : épaisseur (m)

Di : coefficient de diffusion de l’espèce i (cm-2

.s-1

)

E0 : potentiel d’équilibre (V)

Et : tension sinusoïdale (V)

f0 : fréquence de résonance intrinsèque du cristal (Hz)

F : constance de Faraday (96 484,5 C.mol-1

)

i0 : courant d’échange (A)

iox : courant d’oxydation (A)

ired : courant de réduction (A)

It : courant sinusoïdal (A)

j : densité de courant à l’électrode (A.cm-2

)

k : constante du transfert de charge apparent

k0 : constante de transfert électronique

n : nombre d’électron célibataire

n : coefficient de rugosité

R : constante de gaz parfaits (8,314 J. mol-1

. K-1

)

R : résistance (Ω)

S : Surface (m)

T : température (K)

Y : admittance (S)

Z : impédance (Ω)

ZRe : impédance réelle (Ω)

ZIm : impédance imaginaire (Ω)

Δf : variation de la fréquence (Hz)

Δm : variation de la masse (m)

ε : constante diélectrique (F.m-1

)

η : surtension (V)

iv

θ : recouvrement de l’électrode

λ : longueur d’onde (m)

μq : module de cisaillement d’un matériau (J.m-2

)

ρ : coefficient de conductivité

ρq : densité du matériau

σ : coefficient de Warburg (Ω.s-1/2

)

τ : nombre de mole /cm2

ν : viscosité cinématique (cm2.s

-1)

υ : déphasage

ω : fréquence (Hz)

v

Liste d’abréviations

4-amino-TEMPO : 4-amino-2,2,6,-tétraméthylpiperidine-1-oxyl

AD : Anti D

BCNU : 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourée

Cads : capacité d’adsorption (F)

Cdc : capacité de double couche (F)

CDNB : 1-chloro-2,4-dinitrobenzene

CHEMFET : chemically sensitive field effect transistor

1-Cys Prx : 1-cys peroxiredoxine

DMEM : dulbecco’s modified eagle’s medium

ERA : espèces réactives de l’azote

ERO : espèces réactives de l’oxygène

EIS : electrochemical impedance spectroscopy

ENFET : enzyme field effect transistor

EDC : n-ethyl-n’-(dimethylaminopropyle)-cardodiimide

FET : field effect transistor

GR : globule rouge

GSH : glutathion

GSHR : glutathion réductase

GSSG : glutathione disulphide

H2DCFDA : 2’,7’-dichlorofluoresceine

IR : infrarouge

ISFET : ion selective field effect transistor

LAPS : light addressable potentiometric sensor

LPG : lipophosphoglycan

LPS : lipopolysaccharide

MH : 6-mercapto-1-hexanol

MOSFET : metal oxide semi conductor field effect transistor

MUA : acide 11-mercaptoundécanoique

NHS : n-hydroxysuccinimide

vi

OMS : organisation mondiale de la santé

PBS : tampon phosphate

PG : protéine G

QCM : quartz crystal microbalance

Qdc : capacité non parfaite de double couche (F.sn-1

)

Qf : capacité non parfaite du film (F.sn-1

)

RAW : macrophage de souche de souris

Rads : résistance d’adsorption (Ω)

Rf : résistance du film (Ω)

RPE : résonance paramagnétique électronique

RPMI : roswell park memorial institute

Rs : résistance d’électrolyte (Ω)

RS2 : protéines disulphides

Rtc : résistance de transfert de charge (Ω)

SAMs : self assembled monolayers

SPR : surface plasmon resonance

TR : trypanothione réductase

TrxSH2 : thiorédoxine

TS2 : trypanothione disulphide

T(SH)2 : trypanothione

XPS : X-ray photoelectron spectroscopy

ZF : impedance faradique

Zw : impédance de Warburg

vii

Sommaire

Remerciements ......................................................................................................................i

Liste des symboles............................................................................................................... iii

Liste d’abréviations .............................................................................................................. v

Introduction ...........................................................................................................................i

Introduction .......................................................................................................................... 1

Chapitre 1 ............................................................................................................................. 3 1. Cycle d’infection parasitaire des cellules hôtes ................................................................................ 7

1.1 Infection érythrocytaire par Plasmodium ................................................................................ 7 1.1.1 Plasmodium et détoxification de l’hème ............................................................................ 8 1.1.2 Plasmodium et détoxification des espèces réactives de l’oxygène ....................................... 8

1.2 Infection des macrophages par Leishmania .......................................................................... 10 2. Les biocapteurs : généralités ......................................................................................................... 15 3. Biocapteurs cellulaires .................................................................................................................. 16

3.1 Diversité des cellules utilisées dans les biocapteurs cellulaires .............................................. 17 3.2 Technologies de microfabrication ........................................................................................ 18 3.3 Immobilisation des cellules .................................................................................................. 18

3.3.1 Greffage des cellules par le biais d’interfaces chimiques .................................................. 18 3.3.2 Inclusion des cellules dans une matrice ............................................................................ 20

3.4 Différents modes de transduction ......................................................................................... 20 3.4.1 Transduction optique ....................................................................................................... 20 3.4.2 Transduction piézoélectrique ........................................................................................... 22 3.4.3 Transduction électrochimique.......................................................................................... 24

a. Potentiometrique ............................................................................................................. 25 b. Ampérométrique ............................................................................................................. 26 c. Impédancemétrique ......................................................................................................... 27

4. Principe de l’impédance ................................................................................................................ 28 4.1 Description de l’impédance .................................................................................................. 30 4.2 Modélisation de l’impédance. .............................................................................................. 32

Références ................................................................................................................................... 37

Chapitre 2 ........................................................................................................................... 47

Introduction ................................................................................................................................ 51

Partie expérimentale ................................................................................................................... 53 1. Matériels ...................................................................................................................................... 53 2. Méthodes ...................................................................................................................................... 53

2.1 Procédés de fabrication des électrodes .................................................................................. 53 2.2 Modifications des électrodes ................................................................................................ 54

2.2.1 Nettoyage des électrodes ................................................................................................. 54 2.2.2 Modification par dépôt de polylysine ............................................................................... 54 2.2.3 Modification par dépôt d’anticorps .................................................................................. 54

2.3 Spectroscopie d’impédance électrochimique ........................................................................ 55 2.4 Microbalance à quartz .......................................................................................................... 56 2.5 Culture in vitro de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ............................. 56 2.6 Enrichissement d’échantillons de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ....... 56

Résultats et discussion ................................................................................................................ 59 1. Modèle d’accrochage utilisant la polylysine .................................................................................. 59

1.1 Construction de l’édifice moléculaire ................................................................................... 59 1.2 Caractérisation du système par microbalance à quartz « QCM » ........................................... 61

2. Modèle d’accrochage par liaison antigène/anticorps ...................................................................... 62 2.1 Construction de l’édifice moléculaire ................................................................................... 62 2.2 Caractérisation des couches d’accroche ................................................................................ 64

viii

2.2.1 Microscopie optique ........................................................................................................ 64 2.2.2 Caractérisation des couches par microbalance à quartz « QCM » ..................................... 65 2.2.3 Caractérisation des couches par spectroscopie d’impédance électrochimique « EIS » ....... 66

a. Détermination des coefficients de diffusion des ions ferricyanuress et ferrocyanures ........ 66 b. Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique appliquées à l’or nu ................... 68 c. Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique appliquée aux couches d’accroche69 d. Conclusion ...................................................................................................................... 73

3. Caractérisation des changements physiologiques affectant les globules rouges sains et parasités par

spectroscopie d’impédance électrochimique ........................................................................................... 74 3.1 Concentration des érythrocytes parasités .............................................................................. 74 3.2 Mesures d’impédance en absence de couple rédox................................................................ 75

a. Caractéristiques du film................................................................................................... 79 b. Caractéristiques interface film/solution ............................................................................ 81

3.3 Mesures de stabilité du biocapteur cellulaire ........................................................................ 83

Conclusion................................................................................................................................... 84

Références ................................................................................................................................... 85

Chapitre 3 ........................................................................................................................... 89

Introduction ................................................................................................................................ 93

Partie expérimentale ................................................................................................................... 95 1. Matériels ...................................................................................................................................... 95 2. Méthodes ...................................................................................................................................... 95

2.1 Culture des macrophages ..................................................................................................... 95 2.2 Culture des Leishmania amazonensis promastigotes............................................................. 95 2.3 Dépôt des cellules sur les électrodes d’or ............................................................................. 95 2.4 Stimulation et infection des macrophages ............................................................................. 96 2.5 Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS).............................................. 96

Résultats et discussion ................................................................................................................ 97 1. Modification et caractérisation des électrodes modifiées ................................................................ 97 2. Optimisation des couches cellulaires ............................................................................................. 99

2.1 Influence du temps d’incubation sur la reproductibilité des dépôts ........................................ 99 3. Effet de l’infection des macrophages par Leishmania amazonensis ...............................................100

3.1 Mesures par spectroscopie d’impédance électrochimique ....................................................100 3.2 Modélisations en circuit électrique équivalent .....................................................................102

3.2.1 Interprétation des résultats ..............................................................................................107 a. Caractéristiques du film..................................................................................................107 b. Caractéristiques de l’interface film/solution : Qdc ............................................................108 c. Caractéristiques de la couche cellulaire : Rads et Cads .......................................................109 d. Caractéristiques de l’interface film/solution : Rtc et σ ......................................................109 e. Conclusion .....................................................................................................................110

4. Effet de la stimulation des macrophages par ajout de LPS.............................................................111 4.1 Mesure par spectroscopie d‘impédance électrochimique ......................................................111 4.2 Modélisations en circuit électrique équivalent .....................................................................112

a. Caractéristiques du film..................................................................................................114 b. Caractéristiques de l’interface film/solution : Qdc ............................................................114 c. Caractéristiques de la couche cellulaire : Rads et Cads .......................................................114 d. Caractéristiques interface film/solution : Rtc et σ .............................................................115 e. Nouvelles mesures en présence de LPS dans la cellule électrochimique...........................115 f. Conclusion .....................................................................................................................115

Conclusion................................................................................................................................. 116

Références ................................................................................................................................. 117

ix

Chapitre 4 ......................................................................................................................... 119

Introduction .............................................................................................................................. 123

Partie expérimentale ................................................................................................................. 125 1. Matériel .......................................................................................................................................125 2. Méthodes .....................................................................................................................................125

2.1 Culture in vitro de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ............................125 2.2 Enrichissement d’échantillons de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ......125 2.3 Culture des macrophages ....................................................................................................125 2.4 Culture des Leishmania amazonensis promastigotes ............................................................125 2.5 Résonance paramagnétique électronique (RPE) ...................................................................126

2.5.1 Erythrocytes...................................................................................................................126 2.5.2 Macrophages..................................................................................................................127

2.6 Microscopie confocale ........................................................................................................128 2.6.1 Erythrocytes...................................................................................................................128 2.6.2 Macrophages..................................................................................................................128

Résultats et discussion .............................................................................................................. 131 1. Etude comparative entre globules rouges sains et globules rouges parasités par Plasmodium

falciparum ............................................................................................................................................131 1.1 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge à l’aide d’une sonde

paramagnétique ................................................................................................................................131 1.1.1 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge dépourvu de

glutathion et de glutathion réductase ............................................................................................134 a. Globules rouges sains .....................................................................................................134 b. Globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ....................................................136 c. Etudes comparatives entre globules rouges sains et parasités ...........................................137

1.2 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge à l’aide d’une sonde

fluorescente......................................................................................................................................139 2. Etude comparative entre macrophages sains, macrophages parasités et macrophages activés ........141

2.1 Evaluation de la production radicalaire chez le macrophage soumis à divers stimuli.............141 2.1.1 Evaluation du •NO dans le macrophage stimulé par LPS .................................................142 2.1.2 Evaluation du •NO dans le macrophage infecté par Leishmania amazonensis promastigote143

2.2 Evaluation globale de la production d’espèces radicalaires chez le macrophage ...................145

Conclusion................................................................................................................................. 147

Références ................................................................................................................................. 149

Conclusion ........................................................................................................................ 151

Introduction

Introduction 1

Introduction

Le paludisme et la leishmaniose sont des maladies parasitaires responsables de centaines de

millions d’infections essentiellement localisées dans les zones tropicales. Ces maladies sont

provoquées par la présence de parasites, véhiculés par des moustiques, qui se logent dans des

cellules hôtes, le globule rouge et le macrophage. Les cycles d’infection du paludisme et de la

leishmaniose causés, respectivement, par Plasmodium et Leishmania provoquent de

nombreux dégâts cellulaires dus à la défense immunitaire des cellules hôtes en état de stress

oxydant et aux systèmes de détoxification des parasites.

L’objectif de ce travail de thèse est d’étudier le stress oxydant global généré lors de l’invasion

parasitaire en mettant en œuvre des méthodes physicochimiques capables de différencier les

deux états, sain et parasité, de la cellule hôte.

L’originalité du travail réside dans l’élaboration d’un biocapteur cellulaire

impédancemétrique, technologie émergente dans de nombreux domaines et qui permet

d’obtenir des informations sur la physiologie et le métabolisme cellulaire. Les biocapteurs ont

suscité un grand intérêt ces dernières années en raison de leurs applications prometteuses dans

le criblage pharmaceutique, la détection d’agents pathogènes, les applications biomédicales et

biotechnologiques, ainsi que pour les mesures environnementales. La technologie des

biocapteurs cellulaires a ainsi été appliquée aux cellules hôtes de Plasmodium et Leishmania.

Les réponses ont été analysées par spectroscopie d’impédance électrochimique.

En complément de cette technologie innovante, deux méthodes capables de rendre compte de

l’état rédox cellulaire, la résonance paramagnétique électronique et la microscopie confocale,

ont également été mises en œuvre, afin de compléter l’analyse des états cellulaires.

L’objectif ultime de ce travail de thèse est de pouvoir disposer d’outils technologiques

capables de différencier des états cellulaires du cycle parasitaire et de détecter l’impact

éventuel de nouvelles molécules sur ses états.

Ce mémoire s’organise en quatre chapitres.

La première partie est consacrée à une étude bibliographique sur le cycle d’infection des deux

parasites et les mécanismes rédox cellulaires mis en jeu et d’autre part sur les biocapteurs

cellulaires et leurs principales applications.

Les résultats et discussions concernant les biocapteurs cellulaires incorporant les globules

rouges et les macrophages infectés constituent les chapitres 2 et 3, respectivement.

Le chapitre 4 présente une étude comparative des cellules saines et parasitées basée sur la

détection d’espèces radicalaires, à l’aide de la résonance paramagnétique électronique et de la

microscopie confocale.

Introduction 2

Chapitre 1

Revue Bibliographique

3

Chapitre 1

Revue Bibliographique

Chapitre 1 – Revue Bibliographique 4


Sommaire

1. Cycle d’infection parasitaire des cellules hôtes ............................................................................ 7 1.1 Infection érythrocytaire par Plasmodium ......................................................................................... 7

1.1.1 Plasmodium et détoxification de l’hème ................................................................................. 8

1.1.2 Plasmodium et détoxification des espèces réactives de l’oxygène ........................................... 8 1.2 Infection des macrophages par Leishmania.................................................................................... 10

2.Les biocapteurs : généralités ................................................................................................... 15

3.Biocapteurs cellulaires ............................................................................................................. 16 3.1 Diversité des cellules utilisées dans les biocapteurs cellulaires ....................................................... 17 3.2 Technologies de microfabrication ................................................................................................. 18 3.3 Immobilisation des cellules ........................................................................................................... 18

3.3.1 Greffage des cellules par le biais d’interfaces chimiques ....................................................... 18

3.3.2 Inclusion des cellules dans une matrice ................................................................................ 20

3.4 Différents modes de transduction .................................................................................................. 20 3.4.1 Transduction optique ........................................................................................................... 20

3.4.2 Transduction piézoélectrique ............................................................................................... 22

3.4.3 Transduction électrochimique .............................................................................................. 24

a. Potentiometrique ................................................................................................................. 25

b. Ampérométrique.................................................................................................................. 26

c. Impédancemétrique ............................................................................................................. 27

4.Principe de l’impédance .......................................................................................................... 28 4.1 Description de l’impédance ........................................................................................................... 30 4.2 Modélisation de l’impédance. ....................................................................................................... 32

Références ........................................................................................................................... 37


1. Cycle d’infection parasitaire des cellules hôtes

1.1 Infection érythrocytaire par Plasmodium

Le paludisme est la maladie infectieuse la plus importante au monde avec 350 à 500 millions

de personnes infectées et plus d’un million de morts par an (source de UNICEF et OMS,

2005). Le parasite responsable de 90% des décès chez l’homme, Plasmodium falciparum,

envahit le globule rouge pour un cycle érythrocytaire de 48 heures [Bozdech, Z et al., 2003]

(Figure 1.1). L’infection commence par l’injection du parasite à l’homme via la piqure d’un

moustique du genre aèdes et anophèles. Le parasite se trouve alors sous la forme d’un

sporozoïte qui circule dans le sang pour ensuite pénétrer dans le foie. Lorsqu’il se libère du

foie le parasite a évolué et se trouve sous la forme de mérozoïtes. Ceux-ci circulent dans le

sang et vont infecter les globules rouges où ils se nourrissent d’hémoglobine. Ils entament

alors un cycle de multiplication dit intra-érythrocytaire. En se développant dans le globule

rouge, le parasite se trouve dans un milieu peu hospitalier. Il est alors obligé d’effectuer

plusieurs transformations. L’infection passe par différents stades, notamment le stade anneau,

trophozoïte et le stade schizonte. Ce dernier est atteint entre 36 et 48 heures, il s’en suit une

rupture de la membrane du globule rouge et l’infection d’autres érythrocytes.

Figure 1.1. Cycle d’infection érythrocytaire du Plasmodium.

Pour survivre, le parasite altère la perméabilité des membranes du globule rouge, favorisant

les échanges de nombreuses espèces avec le cytosol, telles que les anions et les cations

organiques et inorganiques, les carbohydrates, les acides aminés, les nucléosides et les

peptides.


2O2 + 2H+ H2O2 + O2

Fe2+ + H2O2Fe3+ + OH + -OH

Fe3+ + O2 Fe2+ + O2

H2O2 + O2 OH + OH + O2

1.1.1 Plasmodium et détoxification de l’hème

Durant son cycle érythrocytaire, Plasmodium digère de grande quantité d’hémoglobine qui est

sa principale source d’acides aminés conduisant à la libération d’espèces toxiques telles que

l’hème et des espèces réactives de l’oxygène (ERO) et de l’azote (ERA) [Becker, K. et al.,

2004]. L’hème libéré par le parasite génère de grande quantité de radical superoxyde (O2•-)

qui mène à la formation de radical hydroxyle (•OH) particulièrement toxique. Pour ce

protéger, le parasite met en place un système de détoxification de l’hème permettant de

l’éliminer. La détoxification se fait dans le globule rouge par l’hème oxygénase (HO) qui

catabolise l’hème pour former la bilirubine [Kumar, S. et al., 2008]. Cependant Plasmodium

falciparum est démuni de ce système et détoxifie l’hème en le polymérisant sous forme

d’hémozoine (ou pigment malarique) non toxique qu’il stocke dans sa vacuole digestive.

Malgré ces deux mécanismes de détoxification il est possible qu’une faible quantité d’hème

persiste pouvant causer des dommages rédox aux protéines et membranes de la cellule hôte,

inhiber les enzymes du parasite et provoquer la lyse des globules rouges.

1.1.2 Plasmodium et détoxification des espèces réactives de l’oxygène

Une fois dans le globule rouge, le parasite vit dans un environnement comprenant de

l’oxygène et du fer et est donc particulièrement vulnérable au stress oxydant durant son cycle

érythrocytaire [Müller, S. et al., 2003]. En effet, l’utilisation de l’oxygène par les organismes

vivants s’accompagne inévitablement de la formation d’espèces toxiques tel que le radical

superoxyde (O2•-) qui est rapidement dismuté en peroxyde d’hydrogène par une réaction

catalysée par une superoxyde dismutase (a).

Réaction de dismutation du superoxyde : •- (a)

Le peroxyde d’hydrogène ainsi formé réagit avec le Fe2+

, présent dans le globule rouge, par la

réaction de Fenton (b) pour former le radical hydroxyle (•OH).

Réaction de fenton : (b)

La régénération de Fe2+

se fait par réaction avec O2• –

: (c)

Le radical superoxyde et le peroxyde d’hydrogène réagissent ensemble par la réaction

d’Haber-Weiss pour former un produit secondaire nocif, le radical hydroxyle.

Réaction d’Haber-Weiss : (d)

Cette production d’espèces délétères est généralement équilibrée par leur consommation à

vitesse égale par les systèmes antioxydants endogènes du globule rouge. Cependant,

l’infection parasitaire provoque une surproduction de ces radicaux qui engendre la rupture de

l’équilibre entre les espèces pro et anti-oxydantes, ce que l’on désigne par le terme de stress

oxydant. L’infection provoque, de fait, un déséquilibre rédox de la cellule hôte. Le parasite et

le globule rouge activent leur système de détoxification contre ces espèces délétères

engendrant un nouvel équilibre rédox, comme le montre la figure 1.2.


Générateurs d’ERO Digestion de l’hémoglobine Processus métaboliques Transport d’électron mitochondrial

H2O2

2O2•-

2H+

O2

Superoxyde

dismutase

2O2•-

2H+

O2

Superoxyde

dismutase

GrxS2

GrxSH2

Ribonucléotide

réductase

2H2O2

1-Cys Prx (ox)

1-Cys Prx (red)

2H2O + O22H2O2

2H2O + O2

GSH

GSSG

Glutathione

S-transferase

NADP+NADPH + H+

GSH

conjugé

Nucléophile

toxique

Glutathione

réductase

Glutathione

S-transferase

TrxS2

TrxSH2

2H2O2

2H2O + O2

2-Cys

peroxidine

Ribonucléotide

réductase

Pompes MRP et/ou GSSG Cellule hôte

Thioredoxine

réductase

Générateurs d’ERO Digestion de l’hémoglobine Processus métaboliques Transport d’électron mitochondrial

H2O2

2O2•-

2H+

O2

Superoxyde

dismutase

2O2•-

2H+

O2

Superoxyde

dismutase

GrxS2

GrxSH2

Ribonucléotide

réductase

2H2O2

1-Cys Prx (ox)

1-Cys Prx (red)

2H2O + O2

2H2O2

1-Cys Prx (ox)

1-Cys Prx (red)

2H2O + O22H2O2

2H2O + O2

GSH

GSSG

Glutathione

S-transferase

NADP+NADPH + H+

GSH

conjugé

Nucléophile

toxique

Glutathione

réductase

Glutathione

S-transferase

TrxS2

TrxSH2

2H2O2

2H2O + O2

2-Cys

peroxidine

Ribonucléotide

réductase

Pompes MRP et/ou GSSG Cellule hôte

Thioredoxine

réductase

La biochimie et la biologie moléculaire des défenses antioxydantes ont été de nombreuses fois

étudiées [Becker, K. et al., 2004, Bozdech, Z. et al., 2004], ce qui a permis l’identification

d’enzymes et d’antioxydants participants aux mécanismes complexes de détoxification. Les

enzymes antioxydantes ainsi que leur substrat sont sollicités dès que le parasite commence la

digestion de l’hémoglobine et lorsque le système immunitaire est contré par les antigènes du

parasite. Le mécanisme de détoxification débute à l’état âgé du trophozoite (Figure 1.1) qui

correspond au moment où le parasite digère de grande quantité d’hémoglobine.

Figure 1.2. Schéma des différents procédés biochimiques de défense antioxydante de Plasmodium.

Pour contrer ces espèces délétères, le globule rouge et le parasite sont munis de systèmes de

défenses antioxydants incluant des enzymes antioxydantes ainsi que des antioxydants de plus

petites masses. Le glutathion (GSH) et la thioredoxine (TrxSH2) représentent les principaux

systèmes antioxydants pour le parasite et la cellule [Becker, K. et al., 2004, Kanzok, SM. et

al., 2000, Rahlfs, S. et al., 2002].

Le glutathion est un tripeptide (γ-L-glutamyl-L-cystéinyl-glycine) aux fonctions

antioxydantes qui peut interagir directement avec des ERO [Ré, DB. et al., 2005]. Le GSH est

biosynthétisé par deux étapes distinctes, présentées dans la figure 1.3.


Figure 1.3. Biosynthèse du glutathion.

Le glutathion est présent dans les globules rouges et a pour fonction de neutraliser les

substances toxiques qui pénètrent dans la cellule. Il protège l’érythrocyte contre le stress

oxydant [Ayi, K. et al., 1998, Müller, S., 2004], module à la fois les modifications

membranaires due à l’infection du parasite et à la dégradation de l’hème [Atamna, H. et al.,

1995, Turrini, F. et al., 1992]. En plus de la cellule hôte, les parasites possèdent leur propre

glutathion qui leur permet de se défendre contre les espèces oxydantes [Müller, S. et al., 2003,

Romao, PRT. et al., 2006].

En complément du glutathion, la thioredoxine, présente chez le parasite, possède des activités

antioxydantes. La TrxSH2 est impliquéé dans la défense antioxydante, dans la réduction de

ribonucléotides et de péroxydase [Becker, K. et al., 2004], protège contre les dommages

oxydants, et inhibe l’apoptose [Rahlfs, S. et al., 2002].

Certaines ERO peuvent échapper à la défense antioxydante du parasite et atteignent la cellule

hôte où elles sont inhibées par la catalase et la glutathione péroxydase. Cependant, l’addition

des deux systèmes de défense (parasite + cellule) ne suffit pas à inhiber entièrement les

radicaux puisque des marques de stress oxydant sont perceptibles dans la membrane du

globule rouge tel que l’agglomération de protéine band 3 [Giribaldi, G. et al., 2001] et

l’augmentation de peroxydes lipidiques [Simoes, APCF. et al., 1992].

1.2 Infection des macrophages par Leishmania

La leishmaniose est une maladie parasitaire causée par des agents infectieux protozoaires

Leishmania véhiculés par des moustiques de la famille des Phlebotomus et Lutzomyia

[Castilho, T et al., 2003, Pham, N K et al., 2005]. Douze millions de personnes seraient

infectés dans le monde [Croft, SL. et al., 2006].

Une fois injecté chez l’homme, le parasite se loge dans sa cellule hôte, le macrophage, et

entame son cycle d’infection (Figure 1.4). Une fois phagocyté par le macrophage, le parasite

subit une étape de transformation durant son cycle d’infection. Il évolue du stade

promastigote au stade amastigote en perdant son flagelle [Bosetto, MC. et al., 2007, Croft,

SL. et al., 2006, Grimaldi, G. et al., 1993].

L-glutamate

+

L-cystéineγ-L-glutamyl-L-cysteine

γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine

(Glutathion, GSH)

ATP ATP + Pi

1er étape

γ-L-glu-cys synthethase

Glycine, ATP ATP + Pi

2eme étape

Glutathion synthethase

L-glutamate

+

L-cystéineγ-L-glutamyl-L-cysteine

γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine

(Glutathion, GSH)

ATP ATP + Pi

1er étape

γ-L-glu-cys synthethase

Glycine, ATP ATP + Pi

2eme étape

Glutathion synthethase


Figure 1.4. Cycle d’infection de Leishmania.

L’infection du macrophage par Leishmania, comme dans le cas de Plasmodium, engendre un

déséquilibre rédox de la cellule hôte. Cette infection est contrôlée par le système immunitaire

[Bhattacharya, A. et al., 2008] et provoque chez le macrophage un processus de défense se

traduisant par la production variée de médiateurs inflammatoires, incluant les cytokines, les

espèces réactives de l’oxygène et de l’azote tel que •NO [Ferret, PJ. et al., 2002, Mehta, A. et

al., 2006]. Le parasite et la cellule activent donc leur système de défense immunitaire et un

nouvel équilibre rédox s’installe.

La formation d’espèces oxydantes est une des stratégies de la cellule pour tuer le parasite

[Murray, HW., 1981]. Les deux principales espèces oxydantes identifiées comme néfastes

dans le contrôle de l’infection par Leishmania sont l’anion superoxyde et le monoxyde

d’azote.

La phagocytose du parasite induit la production d’espèces oxygénées toxiques telles

que l’anion superoxyde (O2•-), catalysé par l’enzyme NADPH oxydase, et le peroxyde

d’hydrogène [Wilson, ME. et al., 1994]. Des études ont démontré que Leishmania à

son état promastigote est sensible aux attaques de O2•- et du radical hydroxyle (

•OH)

généré par H2O2.

Après phagocytose, lorsque le parasite est à son état amastigote, il est soumis dans le

macrophage à un deuxième oxydant, le monoxyde d’azote radicalaire (•NO) [Gantt,

KR. et al., 2001]. Le •NO est considéré comme la meilleure défense contre l’infection

parasitaire par Leishmania [Kolodziej, H. et al., 2008]


L’accumulation de ces espèces délétères conduit à des dommages sur l’ADN [Kocyigit, A. et

al., 2005] et n’est pas suffisante pour éradiquer le parasite puisqu’une partie des Leishmania

survit conduisant à la maladie [Murray, HW., 1981].

Le parasite a par conséquent su s’adapter à son environnement par le biais d’une défense

antioxydante vis-à-vis des espèces oxygénées et azotées. Alors que dans la majorité des

organismes eucaryotes les systèmes glutathion/glutathion réductase et

thiorédoxine/thiorédoxine réductase maintiennent l’homéostasie rédox des thiols

intracellulaires, Leishmania possède un métabolisme rédox unique basé sur la

trypanothione/trypanothione réductase [Krauth-Siegel, RL. et al., 2008], présenté dans la

figure 1.5.

Contrairement au Plasmodium, Leishmania ne possède ni de glutathion réductase ni de

thiorédoxine réductase. Le GSH présent sert, avec la spermidine, à la synthèse de la

trypanothione (T(SH)2). La T(SH)2 réduit les protéines disulphides (RS2), telle que la

thiorédoxine (Trx), la tryparédoxine et le glutathion disulphide (GSSG). La trypanothione

disulphide (TS2) générée par cette réaction est réduite en T(SH)2 actif par la trypanothione

réductase (TR) dépendant de la NADPH.

Figure 1.5. Schéma du métabolisme rédox basé sur le trypanothione.

La figure 1.6 présente un schéma des différents mécanismes de détoxification se déroulant

dans un macrophage infecté par Leishmania.

Spermidine + GSH Gsp T(SH)2

Trypanothione

synthétase

Trypanothione

synthétaseTS2

NADPHNADPH

Trypanothione

réductase

Thyorédoxine

RS2

R(SH)2

GSSG

2 GSH

Ornithine

Putrécine

Ornithine

décarboxylase

Spermidine

synthasedSAM

CO2

TS2 T(SH)2

Tryparédoxine

Glutarédoxine

Groupe de fer sulfurique Glutathione péroxydase (Px)Minicercle universel

des protéines de liaison2-Cys péroxirédoxine (Prx)

Mitochondrie

Cytosol

Déoxyribonucléotides

(dNTP)

Ribonucléotide

réductase

Tryparédoxine

PxPrx

ROOH

ROH + H2O

dNTP

ADN

Noyau

Spermidine + GSH Gsp T(SH)2

Trypanothione

synthétase

Trypanothione

synthétaseTS2

NADPHNADPH

Trypanothione

réductase

Thyorédoxine

RS2

R(SH)2

GSSG

2 GSH

Ornithine

Putrécine

Ornithine

décarboxylase

Spermidine

synthasedSAM

CO2

TS2 T(SH)2

Tryparédoxine

Glutarédoxine

Groupe de fer sulfurique Glutathione péroxydase (Px)Minicercle universel

des protéines de liaison2-Cys péroxirédoxine (Prx)

Mitochondrie

Cytosol

Déoxyribonucléotides

(dNTP)

Ribonucléotide

réductase

Tryparédoxine

PxPrx

ROOH

ROH + H2O

dNTP

ADN

Noyau


Les mécanismes par lesquels Leishmania résiste aux effets oxydants toxiques incluent les

lipophosphoglycanes (LPG), glycolipides prédominants de la surface du promastigote, qui

détruisent O2•- [Chan, J. et al., 1989], régulent la NO synthase [Proudfoot, L. et al., 1996] et

inhibent les réponses du macrophage [Miller, MA. et al., 2000]. En plus de l’action de LPG,

Leishmania se défend contre le monoxyde d’azote en utilisant son système antioxydant via la

trypanothione et le glutathion pour contrer les effets néfastes du radical •NO [Bhattacharya, A.

et al., 2008, Romao, PRT. et al., 2006].

Figure 1.6. Schéma des différents procédés biochimiques de défense antioxydante de Leishmania.

Plasmodium et Leishmania provoque chez leur cellule hôte un déséquilibre rédox du à leurs

propres systèmes de défenses et à la défense immunitaire de la cellule. Des procédés

biochimiques divers permettent aux parasites d’évoluer dans ces milieux délétères.

Plasmodium produit son cycle érythrocytaire lui permettant de se multiplier en stockant

l’hème en hémozoine et en utilisant ses défenses antioxydantes à base de thiols. Leishmania a

un mécanisme de défense différent, il évite la réponse immunitaire dirigée contre lui en se

reproduisant à l’intérieur des macrophages mais également en inhibant plusieurs fonctions de

celui-ci qui pourraient lui être néfastes.

L’objectif de ce mémoire sera de différencier les deux états cellulaires, sain et parasité, en

mettant en œuvre des méthodes physicochimiques capables de rendre compte de l’état global

de stress oxydant vécu par la cellule. En corollaire il sera ensuite pertinant d’examiner la

capacité de ces méthodes à différencier le cas de Plasmodium, parasite se défendant du stress

oxydant qu’il génére (invasion) et produit (digestion de l’hémoglobine) de celui de

Leishmania, parasite mettant à profit les radicaux produit par le macrophage pour se

reproduire, et générant son propre système antioxydant.

Leishmania

Macrophage

Détruit O2•-

Détoxifie

Promastigote + O2•- Amastigote + •NO

LPG

GSSG

GSH

NADPH

oxydase

L-arginine + O2

Ng-OH-L-arginine

L-citruline

NO synthase

T(SH)2

T(SH)2

TS2

TR

Phagocytose Transformation

Inhibe NOS

LPG

Leishmania

Macrophage

Détruit O2•-

Détoxifie

Promastigote + O2•- Amastigote + •NOAmastigote + •NO

LPG

GSSG

GSH

NADPH

oxydase

L-arginine + O2

Ng-OH-L-arginine

L-citruline

NO synthase

T(SH)2

T(SH)2

TS2

TR

Phagocytose Transformation

Inhibe NOS

LPG


La principale méthode mise en œuvre dans ce travail pour examiner l’état de stress global

d’une cellule est un biocapteur cellulaire impédancemétrique constituant le caractère

novateur de ce mémoire. En complément de ce nouvel outil d’analyse, deux méthodes

capables de rendre compte de l’état rédox cellulaire, la résonance paramagnétique

électronique (RPE) et la microscopie confocale, ont également été mises en œuvre, dans ce

mémoire, afin de compléter l’analyse des états cellulaires.

L’objectif ultime de ces travaux est de pouvoir disposer d’outils tecnhologiques permettant de

différencier des états du cycle d’infection parasitaire et, par cet intermédiaire, d’étudier

l’effet de nouvelles molécules actives sur ces stades comparativement aux médicaments de

référence. Il s’agirait alors d’identifier les niveaux, stades ou mécanismes d’action de ces

nouveaux composés en laissant la porte ouverte à toute nouvelle observation issue de ces

nouveaux outils.


S upport

T rans formation du s ignal en

effet électrique quantifiable

R écepteurAnalyte T ransducteur

T raitementdu

s ignal

Capteur

S upport

T rans formation du s ignal en

effet électrique quantifiable

R écepteurAnalyte T ransducteur

T raitementdu

s ignal

Capteur

2. Les biocapteurs : généralités

Un biocapteur est un outil qui détecte, transmet et enregistre des informations sur des

changements physiologiques ou biochimiques [D'Souza, SF., 2001]. Il combine un élément

biologique avec un détecteur physicochimique capable de transformer un signal biochimique

en une réponse électrique quantifiable (Figure 1.7).

Figure 1.7. Schéma d’un capteur

Depuis l’invention du premier biocapteur par Clark et Lyons en 1962, le développement de

ces outils de détection simple et des techniques similaires ont considérablement progressé

[Mehrvar, M. et al., 2004].

Depuis une vingtaine d’années, l’intérêt des biocapteurs n’a cessé de croître avec des

applications dans différents domaines tel que l’environnement [Kim, RR., 1995, Reybier, K.

et al., 2002], la santé [Hamlaoui, ML. et al., 2002, Wilkins, E. et al., 1996], les études

toxicologiques et les applications pour la défense [Paddle, BM., 1996]. Les biocapteurs sont,

en effet, des outils qui peuvent fournir des mesures rapides, sensibles et peu coûteuses pour le

contrôle des concentrations d’analyte de nature biologique. Les biocapteurs ont deux

principaux avantages : les éléments de reconnaissance ont une sélectivité naturelle vis-à-vis

des analytes biologiques et une capacité à réagir avec l’analyte de manière physiologique.

Les biocapteurs moléculaires conventionnels détectent des analytes via l’utilisation de

biomolécules telles que des enzymes, des anticorps et des acides nucléiques (Figure 1.8).

L’identification de l’analyte dépend des propriétés chimiques et moléculaires des éléments

biologiques de reconnaissance. En raison des nouvelles protéines et des séquences d’acides

nucléiques émergeant de la caractérisation des génomes et des protéosomes, la liste des

molécules biologiques qui pourraient potentiellement être utilisée dans un biocapteur est sans

cesse grandissante, élargissant par conséquent les applications potentielles de tels outils.


Figure 1.8. Différents éléments de reconnaissance utilisés.

Il existe en tout, trois classes de biocapteurs : i) les biocapteurs moléculaires, ii) les

biocapteurs à base de tissus, iii) les biocapteurs cellulaires.

3. Biocapteurs cellulaires

Les biocapteurs cellulaires sont de nouveaux systèmes hybrides utilisant des cellules vivantes

comme élément de reconnaissance pour mesurer les changements physiologiques causés par

un stimuli interne ou externe [Bousse, L., 1996, McFadden, P., 2002, Pancrazo, JJ. et al.,

1999, Stenger, DA. et al., 2001]. L’utilisation de cellules vivantes a été suggérée pour

remplacer les enzymes purifiées afin d’améliorer la réponse des biocapteurs. En effet, sous

l’effet de molécules bioactives ou de substances toxiques, les cellules fournissent plus

d’informations que des biocapteurs enzymatiques. De plus l’utilisation de cellules par rapport

aux enzymes permet l’élimination des étapes d’extraction et de purification [Campbell, TE. et

al., 1999].

Les biocapteurs cellulaires permettent ainsi d’obtenir des informations sur des cellules

vivantes pour des applications dans des domaines variés tels que le criblage pharmacologique

[Asphahani, F. et al., 2007], la détection de pathogènes (virus, bactérie) [Rider, TH. et al.,

2003], les applications biomédicales et biotechnologiques [Bettaieb, F. et al., 2007] ainsi que

les mesures environnementales [Bettaieb, F. et al., 2007, Bousse, L., 1996, Park, TH. et al.,

2003]. Les applications sont liées au mode de transduction qui peut être électrique, optique ou

piézoélectrique ou une combinaison de ces différents types [De Blasio, BF. et al., 2004].

Parmi les applications dans le domaine des biocapteurs cellulaires, la Défense utilise cette

technologie avec la détection de toxines chimiques ou biologiques dans le cadre d’activités

militaires ou de luttes anti-terroristes [Gilchrist, KH. et al., 2001]. L’analyse médicale utilise

cette technologie avec par exemple l’imagerie fluorescente pour la détection de protéines ou

des mesures électriques pour l’adhésion de cellules [Fohlerova, Z. et al., 2007]. Des mesures

cinétiques sur l’adhésion de cellules et des études de cytotoxicité ont été menées sur divers

types de cellules incluant les macrophages [Kowolenko, M. et al., 1990], les fibroblastes

[Xiao, C. et al., 2003], les cellules épithéliales et endothéliales [Marx, KA. et al., 2005].

Même si la demande pour la conception de tels systèmes est importante, divers problèmes liés

à la nature de l’échantillon cellulaire ralentissent leur développement. Le principal

inconvénient des biocapteurs cellulaires provient de leur reproductibilité puisqu’ils sont sujets

aux variabilités biologiques. Ils sont également difficiles à associer dans un dispositif

classique de biocapteur puisque les cellules nécessitent un environnement particulier afin de


fonctionner normalement. De plus, il est difficile d’obtenir des informations spécifiques étant

donné la nature et la concentration des substances à analyser. Malgré ces inconvénients, les

biocapteurs cellulaires présentent de nombreux avantages les rendant attractifs dans différents

domaines :

l’utilisation de cellules est le seul moyen d’obtenir des informations fonctionnelles. En

effet, les biocapteurs cellulaires exploitent la sensibilité des cellules envers divers

stimuli biochimiques pour la détection d’agents biochimiques actifs et permettent ainsi

la détection de substances inconnues grâce aux mesures directes des fonctions

physiologiques. Cette capacité distingue les biocapteurs cellulaires des biocapteurs

moléculaires qui fonctionnent sur la détection de modifications moléculaires telles que

la liaison d’anticorps, l’hybridation d’ADN ou les réactions enzymatiques.

l’utilisation de cellules permet d’obtenir des informations analytiques, qualitatives ou

quantitatives. Les cellules comportant un certain type de récepteur peuvent, en effet,

être considérées comme un capteur ayant une sensibilité déterminée par la liaison

récepteur/ligand.

3.1 Diversité des cellules utilisées dans les biocapteurs cellulaires

Les biocapteurs cellulaires peuvent intégrer des cellules de nature différente. Le

développement de méthodes sensibles et spécifiques pour la détection de pathogènes a amené

certains chercheurs à travailler sur des cellules végétales comme Chlorella vulgaris pour la

détection d’herbicides [Nguyen-Ngoc, H. et al., 2007], des cellules de tabac pour la détection

de flagelline [Oczkowski, T. et al., 2007] ou des cellules de levures pour optimiser le taux de

transfert de masse de particules sur la surface du capteur [Fatoyinbo, HO. et al., 2007].

La détection de métabolites cellulaires est primordiale pour l’étude de l’activité et la fonction

des cellules. Les cellules de mammifères ont donc été longuement étudiées. Les cellules

animales ont notamment permis de nombreux essais, avec par exemple l’utilisation de cellules

de thymus de souris [Endo, T. et al., 2008], des cellules de glandes de cochon [Curtis, T. et

al., 2008], des cellules endothéliales de porc ou des cellules de muscle de lapin [Mohri, S. et

al., 2006], ainsi que des fibroblastes d’embryon de souris [Fanigliulo, A. et al., 1996].

Dans le domaine biomédical, l’utilisation de cellules de souches humaines est indispensable.

Par exemple, des cellules neuronales ont été employées pour des essais toxicologiques [Park,

TH. et al., 2003, Stenger, DA. et al., 2001], des fibroblastes ont été de nombreuses fois

étudiés [Fanigliulo, A. et al., 1996, Feng, X. et al., 2007, Tlili, C. et al., 2003], des cellules

cancéreuses pour l’étude de diagnostics [Chan, LL. et al., 2008, Jia, Y. et al., 2007, Yun, Y. et

al., 2007] ainsi que des cellules cardiaques pour la détection de métaux lourds [Liu, Q. et al.,

2007] ont été utilisées.

Des cellules eucaryotes unicellulaires (levure) ont permis de mettre en place un biocapteur

pour la détection de L-cystéine, un acide aminé impliqué dans une variété de fonctions

cellulaires importantes [Hassan, SHM. et al., 2007].

Enfin des cellules procaryotes comme des bactéries Escherichia coli ont également été

employées [Bettaieb, F. et al., 2007, Castellarnau, M. et al., 2007, Castellarnau, M. et al.,

2008, Maskow, T. et al., 2006, Roach, PCJ. et al., 2003].


La diversité cellulaire offre par conséquent une multitude de choix pour l’élaboration de

nouveaux biocapteurs cellulaires.

3.2 Technologies de microfabrication

L’élaboration de biocapteurs cellulaires a nécessité l’intégration de technologies de

microfabrication telle que la photolitographie [Park, TH. et al., 2003] utilisée pour améliorer

les performances et la fonctionnalité des biocapteurs. En général, ces techniques réduisent la

taille des systèmes permettant ainsi de travailler sur des volumes plus petits, sur des quantités

de cellules moins importantes et d’obtenir des sensibilités et des temps de résolution plus

faibles [Bousse, L., 1996].

Une des étapes clefs de la construction d’un biocapteur cellulaire est l’immobilisation de

cellules sur le support.

3.3 Immobilisation des cellules

L’intégration de cellules dans un biocapteur nécessite l’immobilisation rigoureuse de cellules

entières. Comme pour les biocapteurs moléculaires, l’étape d’immobilisation de l’élément de

reconnaissance est très importante car c’est elle qui va gouverner la performance globale du

biocapteur, c'est à dire ses performances en terme de temps de réponse, de spécificité, de

sélectivité, de sensibilité et de fiabilité. Le but est d’accrocher des cellules intactes sans altérer

leurs propriétés.

Les métaux sont souvent utilisés comme support, notamment les métaux nobles. En effet, l’or,

l’argent et le platine résistent à la corrosion et à l’oxydation faisant d’eux des matériaux

idéaux pour les capteurs. Ayant une très bonne conductivité, l’or est très couramment

employé. Les nanoparticules de métaux tel que l’or sont également des outils efficaces pour

l’immobilisation de biomolécules [De la Fuente, JM. et al., 2006, Gu, HY. et al., 2001, Tang,

D. et al., 2007] et de cellules [Tang, D. et al., 2007].

3.3.1 Greffage des cellules par le biais d’interfaces chimiques

Cependant sauf exception, comme dans le cas des cellules adhérentes, les cellules n’ont

aucune affinité pour les surfaces métallisées ce qui nécessite une fonctionnalisation de surface

par le biais d’interface chimique. Cette étape consiste à déposer sur la surface des fonctions

chimiques ayant une affinité avec des biomolécules capables de fixer la cellule. Les

principales fonctions chimiques permettant le greffage de biomolécules sont les fonctions

amines et carboxylates.

Les premiers travaux de fonctionnalisation de surface employaient des interfaces chimiques

épaisses comme des polymères déposés par électropolymérisation sur des surfaces tels que la

polyaniline, des polyphénols, ou des polythiophènes [Barlett, PN. et al., 1993]. D’autres films

denses ont également été utilisés tels que des moulages à base de glutaraldéhyde, des

immobilisations covalentes à l’aide de dicyclohexyle carbodiimide, ou des couches de

polylysine [Davis, F. et al., 2005].


Depuis plusieurs années, la majorité des recherches dans le domaine du greffage de

biomolécules sont réalisées sur des couches plus minces permettant une meilleure diffusion à

travers le film [Davis, F. et al., 2005]. Une grande variété de matériaux peut offrir jusqu’à

l’épaisseur d’une seule molécule :

Des films à base de polyélectrolytes permettent l’adsorption de biomolécules par

l’intermédiaire d’interactions électrostatiques pour former des monocouches [Davis, F.

et al., 2005, Decher, G. et al., 1992]. Des érythrocytes ont été incorporés dans une

matrice de polyélectrolyte à base de polypyrrole grâce à l’affinité du polymère avec

l’antigène Rh (D) présent dans la membrane cellulaire, permettant ainsi l’élaboration

d’un nouvel outil pour la détermination du groupe sanguin [Campbell, TE. et al.,

1999].

Les monocouches auto-assemblées « SAMs » (Self Assembled Monolayers) sont

appropriées pour l’immobilisation de biomolécules sur des surfaces [Yang, L. et al.,

2005]. Elles sont utilisées pour l’immobilisation de nombreuses biomolécules, comme

des protéines [Briand, E. et al., 2006, Liu, GY. et al., 2002, Wang, ZH. et al., 2006],

des antigènes/anticorps [Dong, Y. et al., 2000, Hirlekar Schmid, A. et al., 2006], la

polylysine [Jordan, CE. et al., 1994]. Ce sont des molécules composées de chaînes

carbonées plus ou moins longues, avec à une extrémité un atome qui se lie

spontanément à la surface, et de l’autre un groupement fonctionnel compatible avec

des biomolécules. Les atomes tels que l’azote ou le soufre peuvent s’adsorber

spontanément sur des métaux nobles par chimisorption et forment respectivement des

liaisons Au-N et Au-S (Figure 1.9) [Boubour, E., 2000]. Ces molécules ont la capacité

de former spontanément une monocouche auto-assemblée dans laquelle les molécules

sont organisées en raison des interactions et à une forte cohésion entre les chaînes

(liaison de Van der Waals), donnant lieu à un film anisotrope stable et ordonné. Une

monocouche auto-assemblée organisée formée sur un support solide permet

l'obtention d'une surface organique dense, homogène et ayant des paramètres bien

définis à la fois chimiquement et structurellement. La préparation des SAMs est

simple et rapide. Elle se fait par simple immersion de la surface dans une solution

contenant le groupement fonctionnel [Kanta, A. et al., 2006]. Les systèmes les plus

utilisés sont les monocouches auto-assemblées d’alkanethiols [Yang, L. et al., 2005].

Néanmoins, d’autres groupements existent tels que les disulphides, les thiones et les

thioesters qui s’adsorbent sur les métaux nobles [Davis, F. et al., 2005]. L’utilisation

de thiols mixtes, constitués d’un mélange de deux thiols avec des fonctions terminales

différentes, permet d’éviter les adsorptions non spécifiques en diluant la quantité de

groupements fonctionnels [Lee, JW. et al., 2005].

Figure 1.9. Dépôt de monocouches auto-assemblées de thiols sur un support.

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

Adsorption par chimisorption

Chaînes carbonées

Groupements fonctionnels

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

S

R

Adsorption par chimisorption

Chaînes carbonées

Groupements fonctionnels


Les surfaces, ainsi fonctionnalisées par une interface chimique, peuvent être modifiées à

l’aide d’éléments biologiques. Le récepteur peut ainsi recevoir une multitude d’éléments de

reconnaissance telles que des enzymes, des anticorps, de l’ADN ou des microorganismes

capables de reconnaître leur analyte spécifique.

De nombreuses recherches ont abouti à l’utilisation d’interfaces chimiques pour

l’immobilisation de cellules. Par exemple, des travaux ont été réalisés sur l’apoptose de

cellules endothéliales après stimulation par des endotoxines à l’aide d’un système d’accroche

complexe à base de polymère. Du polystyrène déposé sur une couche de thiols permet

l’immobilisation de fibronectine utilisée comme élément biologique permettant l’accrochage

de cellules endothéliales. Ce système est présenté comme un modèle de substrat reproductible

pour l’étude d’interactions cellules/matériau [Bouafsoun, A. et al., 2008].

3.3.2 Inclusion des cellules dans une matrice

D’autres travaux consistent à immobiliser les cellules, non plus par greffage, mais par

inclusion dans des gels. Ainsi, une matrice inorganique translucide, obtenue par un procédé

sol-gel sur un support en silice, a été imaginée pour l’immobilisation de cellules végétales

(Chlorella vulgaris) pour une étude par fluorescence [Nguyen-Ngoc, H. et al., 2007]. Un

biocapteur a été élaboré avec un gel d’agarose pour immobiliser des bactéries (Escherichia

coli K-12) afin d’étudier des agents biologiques actifs [Bettaieb, F. et al., 2007]. Enfin, des

travaux ont utilisé un disque d’éponge de diméthyle silicone (ImmobaSilTM

) pour

l’immobilisation de cellules (Rhodococcus ruber NCIMB 40457) pour la détection

d’acrylonitrile [Roach, PCJ. et al., 2003].

Les biocapteurs cellulaires possèdent un récepteur et un transducteur. Un biocapteur cellulaire

fonctionne avec deux étapes de transduction. Les cellules servent de premier transducteur en

convertissant l’analyte détecté en une réponse cellulaire. Le second transducteur converti

ensuite cette réponse cellulaire en un signal électrique qui est analysé [Park, TH. et al., 2003].

Comme dans le cas des biocapteurs moléculaires, différentes méthodes (optique, calorimétrie,

piézoélectricité, électrochimie) permettent de transcrire les réponses cellulaires en un signal

quantifiable.

3.4 Différents modes de transduction

3.4.1 Transduction optique

Les biocapteurs optiques sont plus particulièrement utilisés pour des systèmes de détection

directe. Leur fonctionnement est fondé sur la mesure de la lumière absorbée ou émise lors

d’une réaction biologique et/ou chimique ou sur une modification de la permittivité relative à

l’interface. Les biocapteurs optiques sont simples et robustes, ils ont une grande sensibilité

avec un seuil de détection de 0,11 µmol/L et un temps de réponse allant de 30 minutes à

quelques secondes [Mehrvar, M. et al., 2004].


Lumière réflé

chieLumière polarisée

Prisme

Courant

Capteur

Source

de lumière

Détection optique

Lumière réflé


Prisme

Lumière réflé

chie

Lumière réflé


Lumière polarisée

PrismePrisme

Courant

Capteur

Source

de lumière

Détection optique

Fluorescence

Des travaux ont employé la fluorescence pour la détection d’herbicides à l’aide de cellules

végétales immobilisées dans des matrices sol-gel [Nguyen-Ngoc, H. et al., 2007]. Le principe

repose sur l’action d’herbicides tels que les triazines ou les phenylurées qui inhibent le flux

d’électron photosynthétique des cellules et qui par conséquent augmentent l’intensité de

fluorescence de la chlorophylle.

Résonance des plasmons de surface

Le phénomène optique de résonance des plasmons de surface (SPR, Surface Plasmon

Resonance) est très utilisé comme mode de transduction optique. La SPR est une technique

sensible et simple qui peut-être employée pour étudier les changements d’indice de réfraction

η se produisant à proximité d’une surface métallisée [Mullet, WM. et al., 2000]. Le principe

de détection par SPR quantifie des changements de l'indice de réfraction près de la surface,

reliés à la variation de masse à la surface du biocapteur, due à la formation et à la dissociation

des complexes moléculaires (Figure 1.10). En effet, lorsqu'une lumière monochromatique

polarisée arrive à l'interface entre deux milieux d'indice de réfraction différents, et que cette

interface est recouverte d'une fine couche métallique, l'intensité de la lumière réfléchie est

nettement réduite pour un angle d'incidence particulier. Ceci provient du fait qu'une

composante électromagnétique de la lumière, l'onde évanescente, se propage

perpendiculairement à l'interface. L'angle de résonance varie notamment en fonction de

l'indice de réfraction, jusqu’à 1 µm, donc en fonction de la masse des molécules situées au

voisinage de la surface. Par conséquent, un suivi de l'angle SPR en fonction du temps permet

de suivre en temps réel l'association et la dissociation entre le ligand fixé sur la surface

métallique et l'analyte. Le signal obtenu est enregistré: c'est un sensorgramme. Il est quantifié

en unités de résonance (RU). Une variation de 1000 RU correspond à un déplacement de

l'angle de 0,1° et équivaut à une fixation de 1 ng de protéine par mm2.

Figure 1.10. Schéma du fonctionnement de la résonance des plasmons de surface.

Le système BIACORE® est un biocapteur utilisant le principe physique de la résonance des

plasmons de surface. Il permet de mesurer en temps réel, et sans marquage spécifique, les

caractéristiques d'interaction entre deux molécules sur une surface biospécifique. Pour cela,


une des molécules (le ligand) est immobilisée sur la surface " sensor " et l'autre (l'analyte) est

injectée. Les systèmes « Biacore », longuement utilisés pour mesurer les spécificités, les

affinités et les cinétiques des interactions des protéines, sont désormais plus compétents. En

effet, le mode de fonctionnement SPR leur offre des mesures aboutissant à des données d’une

grande qualité, dans la mesure de concentration ou dans le criblage de nouvelles drogues

[Cooper, MA., 2006].

Bioluminescence

Les biocapteurs bioluminescents appartiennent à la famille des biocapteurs optiques. Ils sont

utilisés avec certaines enzymes qui ont la capacité de produire des photons comme co-

produits de leurs réactions. Ils sont particulièrement employés pour des essais de toxicité,

utilisant les bactéries marines luminescentes, comme le test de Microtox [Bulich, AA., 1979,

Lapertot, M. et al., 2008]. Ces biocapteurs possèdent de très grandes spécificités et permettent

de distinguer des cellules viables de celles non viables. Ces biocapteurs étaient à la base

utilisés pour la détection de H+, O2, CO2, mais sont aujourd’hui employés pour un grand

nombre d’applications en particulier pour les études environnementales [Girotti, S. et al.,

2008]. On peut notamment citer un biocapteur bioluminescent à base de bactéries

(Pseudomonas fluorescens HK44) utilisé pour la détection de naphtalène. Les cellules

immobilisées dans un gel sont mises en contact avec du naphtalène solide ; le maximum

d’émission a été mesuré après 80 minutes d’exposition [Valdman, E. et al., 2008].

Cristal photonique

Une nouvelle classe de biocapteur optique basé sur la photonique à cristal a été développée.

La géométrie d’un cristal photonique est faite de manière à la fois à concentrer la lumière

dans des volumes extrêmement petits et à obtenir un champ électromagnétique intense et

localisé. Les biocapteurs à cristal photonique reflètent 100% de la lumière incidente à la

longueur d’onde de résonance, lorsque toutes les autres longueurs d’onde sont émises à

travers la structure du capteur. Le biocapteur fonctionne en mesurant les changements de

longueur d’onde de la lumière réfléchie lorsque des liaisons biochimiques ou cellulaires ont

lieu à la surface. Cette technique permet la détection de changements de masse avec une

résolution inférieure à 1 pg/mm2. Ce niveau de résolution est donc suffisant pour mesurer des

interactions de petites molécules, mais il permet également de détecter des biomolécules plus

larges ainsi que des entités telles que des cellules entières [Lin, B. et al., 2006]. Des cellules

cancéreuses ont ainsi permis de tester 61 extraits de plantes dont certains induisaient une

apoptose tandis que d’autres augmentaient le pourcentage de prolifération des cellules [Chan,

LL. et al., 2008]. Une mesure est réalisée en 20 ms permettant la lecture de plusieurs

interactions en parallèle. De plus, un système d’imagerie peut être utilisé pour générer une

image de la surface du biocapteur avec une résolution en pixel de 13 µm.

3.4.2 Transduction piézoélectrique

Le phénomène de piézoélectricité existe dans certains diélectriques anisotropes naturels

(quartz, topaze, tourmaline, …) et artificiels (céramiques, polymères, …). C’est un processus

réversible pour lequel on distingue :


Or

Quartz

Contact électrique

Or

Quartz

Contact électrique

l’effet piézoélectrique direct : propriété d’un diélectrique qui sous l’action d’une

déformation mécanique se polarise ou voit sa polarisation électrique varier. Ainsi

en appliquant une force sur les traces d’une lame piézoélectrique, il apparaît une

différence de potentiel proportionnelle à la force appliquée.

l’effet piézoélectrique inverse ou électrostriction : propriété d’un matériau à se

déformer sous l’action d’un champ électrique.

De nombreux cristaux présentent l’effet piézoélectrique, mais les propriétés électriques,

mécaniques et chimiques du quartz en font le cristal type pour des applications analytiques

[Bunde, RL. et al., 1998].

Le biocapteur piézoélectrique le plus utilisé est la microbalance à quartz (QCM). Elle

comprend un quartz métallisé sur chacune des faces (Figure 1.11). Une tension alternative est

appliquée sur le quartz induisant la résonance du quartz à une certaine fréquence. Cette

fréquence de résonance varie en présence d’espèces chimiques ou biologiques adsorbées sur

le quartz. La loi de Sauerbrey permet de calculer, à partir de la variation de fréquence de

vibration, la masse déposée sur la surface. Cependant, cette équation ne s’applique que pour

des dépôts uniformes, rigides et minces.

qq

m

Sf

f2

0

Avec :

0f = fréquence résonance intrinsèque du cristal

S = surface du cristal

q = densité du matériau

q= module de cisaillement du quartz

La microbalance à quartz est actuellement un capteur qui permet de mesurer de très faibles

masses, en temps réel, avec une grande sensibilité et une grande spécificité, peu cher et

nécessitant une instrumentation légère. La sensibilité de cet appareil qui est 100 fois

supérieure à une balance électronique, a un seuil de 1 ng/cm2 [O'Sullivan, CK. et al., 1999],

ce qui signifie que la QCM permet de détecter des changements de masses équivalents à une

monocouche d’atomes. Ceci en fait une technique attractive pour de nombreux domaines

d’applications, comme l’électrochimie, la biotechnologie, la santé et l’environnement.

Figure 1.11. Cristal de quartz piézoélectrique.


De nombreux procédés peuvent être suivis en observant des variations de masse. Ainsi Shons

et al. ont utilisé la microbalance à quartz comme transducteur pour la détection des anticorps

d’albumine bovine (BSA) [O'Sullivan, CK. et al., 1999]. Fawcett et al. ont été les précurseurs

pour l’utilisation de la QCM pour la mesure des variations de masse induites par l’hybridation

des brins d’ADN [O'Sullivan, CK. et al., 1999].

Le tableau 1.1 recense quelques exemples d’applications de biocapteurs piézoélectriques.

Tableau 1.1. Exemples de biocapteurs piézoélectriques.

Récepteur Analyte Référence

Nanoparticules d’or / héparine Antithrombine [Zhang, Q. et al., 2008]

Silice poreuse / hémoprotéine

(guanynyle cyclase soluble) NO [Palaniappan, A. et al., 2008]

Avidine-biotine / acide

nucléique peptidique (PNA) Virus Hépatite B [Yao, C. et al., 2008]

ADN thiolé Escherichia coli O157 :H7 [Wu, VCH. et al., 2007]

Nanotubes / peptides Anticorps spécifiques du

sérum humain

[Drouvalakis, KA. et al.,

2008]

Thiols / biotine / BSA ADN [Aung, KMM. et al., 2008]

Polymères ADN [Vattanaviboon, P. et al.,

2008]

La microbalance à quartz est particulièrement attractive pour les biocapteurs cellulaires

puisque la QCM permet la mesure d’interactions cellules-surface de manière non invasive

[Fatoyinbo, HO. et al., 2007] en mesurant simplement la variation de masse à la surface du

quartz. Cette technique permet de réaliser des mesures cinétiques sans compromettre

l’architecture des cellules ou la structure des protéines cellulaires. De tels avantages ont

abouti à de nombreuses études pionnières qui ont démontré l’habilité de cette technique à

mesurer l’adhésion et la prolifération des cellules pour des applications biomédicales

[Andersson, M. et al., 2005, Elsom, J. et al., 2008, Fatoyinbo, HO. et al., 2007, Marx, KA. et

al., 2005].

3.4.3 Transduction électrochimique

Les biocapteurs électrochimiques sont des outils capables de fournir des informations

analytiques spécifiques, quantitatives ou semi-quantitatives, à l’aide de transducteurs

électrochimiques [Thevenot, DR. et al., 2001]. Lors d’interactions biologiques et chimiques

entre une substance biologique active et son substrat, une ou des espèces électroactives sont

consommées et/ou générées. Durant ce procédé, un détecteur électrochimique mesure le

signal électrochimique produit par les interactions. Ces biocapteurs sont intéressants en raison

de leur capacité de miniaturisation, leur simplicité, leur faible coût et leur rapidité de réponse.

Ils fonctionnent avec des systèmes de détection différents, comme la conductimétrie, la

potentiométrie et l’ampérométrie [Gerard, M. et al., 2002, Thevenot, DR. et al., 2001].


a. Potentiometrique

Les mesures potentiométriques reposent sur la mesure d’une différence de potentiel, entre une

électrode de travail et une électrode de référence. Cette différence de potentiel est, d’après la

loi de Nernst, proportionnelle au logarithme de la concentration de l’analyte.

]ln[0 xnF

RTEEp Equation de Nernst (1)

Potentiométrie classique

Parmi les nombreuses applications, la potentiométrie classique a été utilisée dans un

biocapteur à base de cellules végétales de tabac pour la détection de flagelline. Les mesures

du gradient de proton électrochimique servent de signal analytique [Oczkowski, T. et al.,

2007]. Un biocapteur à base de cellules de levure a également permis par potentiométrie de

détecter la production de L-cystéine par la quantification d’ions sulfide produits par les

cellules [Hassan, SHM. et al., 2007].

Light Addressable Potentiometric Sensor

Une nouvelle gamme de capteur, les LAPS (Light Addressable Potentiometric Sensor), a fait

son apparition dans les années 90. Ces biocapteurs sont depuis très souvent utilisés,

notamment dans le domaine biomédical avec, par exemple, la détection de phosphatase

témoin de la présence de cancers [Jia, Y. et al., 2007], ou dans l’environnement pour la

détection des métaux lourds à l’aide de cellules cardiaques [Liu, Q. et al., 2007]. Un système

a été commercialisé par Molecular Devices corp., sous le nom de Cytosensor

Microphysiometer.

Ce système peut être employé sur des cellules de mammifères, des cellules de levures, des

cellules procaryotes et des cellules d’insectes [Hafner, F., 2000].

Transistors à effet de champ

Les ISFET (Ion Selective Field Effect Transistor) sont un cas particulier des biocapteurs

potentiométriques. Depuis 1970, lorsque Bergveld a présenté pour la première fois les

biocapteurs à effet de champ sélectif aux ions en tant que capteurs [Bergveld, P., 1970], de

nombreuses versions et configurations de cet outil ont été explorées dans le but de développer

des biocapteurs [Fanigliulo, A. et al., 1996]. Les ISFETs ont été développés comme

alternative aux électrodes en verre fragile pour la mesure du pH et de la concentration de

nombreux ions (Na+, K

+, NH4

+, Ca

2+). Les systèmes à effet de champ, fabriqués selon la

technologie des semi conducteurs, sont d’excellents candidats pour la construction de

biocapteurs de par leur haut niveau de pureté dans le design et leur très petite taille [Shinwari,

MW. et al., 2007], leur temps de réponse très court, leur grande sensibilité et la possibilité de

les intégrer sur une puce [Yuqing, M. et al., 2003]. Les biocapteurs à effet de champ peuvent

être classées en : i) ENFET (Enzyme Field Effect Transistor), ii) EISFET (Electrolyte

Insulator, Sensitive Field Effect Transistor) et iii) CHEMFET (Chemically Sensitive Field

Effect Transistor) [Shinwari, MW. et al., 2007], comme le montre le tableau 1.2. La plupart

des applications repose sur la détection des changements de pH induit par le processus de


reconnaissance à l’aide de semi-conducteurs sensibles aux H+ tels que Si3N4 comme le montre

le tableau 1.2.

La technologie ISFET fait partie des transductions électrochimiques les plus utilisées car elle

permet de contrôler en temps réel les variations de pH se produisant au niveau d’une cellule

qui sont des indicateurs métaboliques permettant de contrôler l’état de la cellule [Castellarnau,

M. et al., 2007]. Ainsi des travaux ont permis la détection d’agents biologiquement actifs à

l’aide d’un biocapteur microbien [Bettaieb, F. et al., 2007], certains ont mesuré l’habilité du

Lactobacillus à fermenter du sucre [Castellarnau, M. et al., 2008], tandis que d’autres

recherches sont basées sur l’étude de l’activité métabolique [Fanigliulo, A. et al., 1996,

Mohri, S. et al., 2006].

Tableau 1.2. Exemples de biocapteurs à transition à effet de champs.

Type biocapteur Détection Support Analyte Référence

ISFET pH

Nanoparticules

aimantées /

Enzyme lipase

thermostable

Triglycerides [Vijayalakshmi,

A. et al., 2008]

ISFET pH

Nanoparticules de

SiO2 / polyaniline

auto-assemblée

Acethylcholine [Liu, Y. et al.,

2007]

ENFET pH

Enzymes :

creatininase,

creatinase et

uréase

Créatinine et

Urée

[Premanode, B.

et al., 2007]

ENFET pH BSA / Trypsine Protéine [Marrakchi, M.

et al., 2006]

ENFET pH

Nanoparticules de

MnO2 / glucose

oxydase

Glucose [Luo, XL. et al.,

2004]

ISFET pH

Enzyme β-

lactamase

(pénicillinase)

Pénicilline [Poghossian, A.

et al., 2001]

ISFET pNH4+

Zéolite /

Glutaraldéhyde /

Uréase

Urée [Hamlaoui, ML.

et al., 2002]

b. Ampérométrique

Les biocapteurs ampérométriques mesurent des variations de courant à l’électrode de travail

provenant de l’oxydoréduction à potentiel constant d’espèces électroactives produites lors

d’une réaction biochimique directe ou indirecte. Contrairement aux biocapteurs

potentiométriques, ils sont dépendants linéairement de la concentration, ce qui les rend plus

sensibles. Ces biocapteurs ont également l’avantage d’être plus rapides, moins coûteux et plus

disponibles que les biocapteurs conductimétriques et potentiométriques.

L’ampérométrie est utilisée pour la mesure de concentration d’espèces produites ou

consommées par une cellule telles que la protéine G [Feng, X. et al., 2007], des espèces


radicalaires (O2• -

, •NO) [Prieto-Simon, B. et al., 2007], des cytokines [Ghosh, G. et al., 2007],

du glucose [Newman, JD. et al., 2005] ou du glutathion [Mello, LD. et al., 2007].

En mode sinusoïdal (E +/- ΔE), il ne s’agit plus de mesure ampérométrique mais d’impédance

électrochimique. L’impédance est un cas particulier de l’ampérométrie.

c. Impédancemétrique

La spectroscopie d’impédance électrochimique « EIS » est une excellente technique pour

étudier les propriétés électriques interfaciales de n’importe quel matériau solide ou liquide

connecté à un transducteur électrochimique [Bard, AJ. et al., 2001]. C’est une technique non

invasive qui ne requiert pas d’instrumentation complexe permettant des applications courantes

en laboratoire.

Les biocapteurs impédancemétriques mesurent l’impédance électrique d’une interface

soumise à une faible tension alternative à différentes fréquences. L’impédance est donnée par

le rapport tension/courant en prenant en compte le déphasage.

L’EIS est de plus en plus utilisée dans le développement de capteurs, comme par exemple

pour la mesure de pesticides [Ramon-Azcon, J. et al., 2008], la détection de molécules

odorantes [Hou, Y. et al., 2007], l’étude de la dégradation de polymères [Fernandez-Sanchez,

C. et al., 2005]. En général, les mesures impédancemétriques sont adaptées à la détection de

changements conformationnels dues à la reconnaissance de molécules [Lisdat, F. et al., 2008].

Le tableau 1.3 présente quelques applications.

Tableau 1.3. Exemples de biocapteurs impédancemétriques.

Récepteur Analyte Référence

SAM / Biotine Hydrazine Avidine [Tlili, C. et al., 2008]

Nanoparticules d’or /

Aptamères thiolés Thrombine [Li, X. et al., 2008]

Nanoparticules d’oxyde de

zinc / Cholestérol oxydase Cholestérol [Khan, R. et al., 2008]

Liquide ionique / Horseradish

péroxydase H2O2 [Ding, C. et al., 2008]

Nanotubes de carbone /

Polylysine / ADN Fragment de gène PAT [Jiang, C. et al., 2008]

Nano-SiO2 / PATP / ADN Gène PAT [Ma, Y. et al., 2008]

Les biocapteurs impédancemétriques décrits par Giaever et Keese [Giaever, I. et al., 1984]

sont couramment utilisés pour obtenir des informations sur le comportement cellulaire,

détecter les changements morphologiques [Arndt, S. et al., 2004], étudier l’adhésion des

cellules [Bouafsoun, A. et al., 2007, Bouafsoun, A. et al., 2007] ou tester l’efficacité des

médicaments [Durick, K. et al., 2001, Huang, X. et al., 2004, Otto, AM. et al., 2004].


La spectroscopie d’impédance électrochimique est particulièrement intéressante comme mode

de transduction pour les biocapteurs cellulaires puisque les cellules vivantes ont d’excellentes

propriétés isolantes. Lorsque les cellules recouvrent ou migrent vers la surface des électrodes

ou lorsque un agent biologique ou chimique induit soit la perméabilisation des membranes

cellulaires soit la production d’espèces chimiques, l’impédance de l’électrode change. Par

conséquent, en mesurant les changements électriques entre les cellules et l’électrode, le

biocapteur cellulaire impédancemétrique détecte, analyse et détermine les effets physiques

d’analytes externes sur la cellule, de manière noninvasive, quantitativement et sans ajout de

substances. Les biocapteurs cellulaires impédancemétriques sont par conséquent capables de

déterminer les évènements tels que l’adhésion des cellules, leur étalement, leur croissance,

leur motilité et leur mort pour tous types de cellules. Ils sont également capables d’analyser

les réponses cellulaires à des agressions chimiques ou biologiques.

Par exemple, l’adhérence de cellules endothéliales, utile pour le développement d’outils

biomédicaux a été étudiée [Bouafsoun, A. et al., 2008]. L’étude de l’impact de molécules

potentiellement actives vis-à-vis de la cellule (criblage) a été réalisée [Curtis, T. et al., 2008].

L’analyse de l’apoptose de cellules a été menée [Arndt, S. et al., 2004] ainsi que l’étude de

mortalité des cellules [Luong, JHT. et al., 2001]. L’EIS a également permis la détection de

bactéries [Dickert, FL. et al., 2003], la différentiation directe des cellules [Chang, TC. et al.,

2000] et la quantification de la densité des cellules viables [Jonsson, M. et al., 2006].

Certaines études environnementales utilisent également cette technologie avec la

détermination de cellules dans des eaux polluées [Nishikawa, S. et al., 1982] ou la détection

de molécules odorantes [Hou, Y. et al., 2007].

Le paragraphe suivant décrit le principe de cette technique ainsi que la méthodologie utilisée

pour le traitement des données.

4. Principe de l’impédance

Les voltampérométries les plus classiques, comme la potentiométrie, la conductimétrie ou

l’ampérométrie nécessitent des contraintes de surpotentiel de type continu et de large

amplitude avec une étude de la réponse en fonction du potentiel d’électrode.

La spectroscopie d’impédance électrochimique est une méthode voltampérométrique qui se

distingue des autres méthodes [Tremillon, B., 1993] en deux points.

1. L’impédance consiste à superposer au potentiel de l’électrode une tension sinusoïdale

de faible amplitude (quelques mV).

tEEEt sin0 (2)

Avec :

f 2 : fréquence angulaire où f est la fréquence en Hz

E0 : potentiel d’équilibre


2. L’analyse de la réponse du courant (It) se fait en fonction de la fréquence f.

(3)

Avec :

= le déphasage

L’application des mesures d’impédance nécessite l’utilisation d’excitation de type alternatif

(sinusoïdal). Une tension uniquement sinusoïdale s’exprime par la formule suivante :

(4)

Figure 1.12. Diagramme de phase pour une tension alternative

Le courant sinusoïdal s’exprime généralement comme :

tII t sin (5)

L’angle de phase courant/tension ( ) est négatif dans ce cas.

Figure 1.13. Diagramme de phase montrant la relation entre le signal du courant It et la tension Et

alternatifs à une fréquence et un φ = 90°.

La spectroscopie d’impédance comporte de nombreux avantages. Les plus importants sont : i)

une habilité expérimentale à faire des mesures d’une grande précision ; ii) une capacité à

traiter les réponses théoriques avec des caractéristiques de courant potentiel linéaire ; iii) une

large gamme de fréquences (entre 10-4

– 10+6

Hz) [Bard, AJ. et al., 2001].

E

- E

/ 2/

E

- E

/ 2/

tEEt sin

tIIIt sin0


Warburg est apparemment le premier, à la fin du 19eme

siècle, à avoir utilisé le concept

d’impédance électrochimique en dérivant l’impédance en un procédé diffusionnel qui porte

toujours son nom « l’impédance de Warburg».

4.1 Description de l’impédance

D’un point de vue physique l’impédance (Z(ω)) est une résistance complexe, mesurée en

ohms, qui apparaît lorsqu’un courant alternatif circule à travers un circuit composé de

résistances, de capacités et d’inductances [Fernandez-Sanchez, C. et al., 2005]. Dans ce cas,

la loi d’ohm s’écrit :

(6)

L’impédance électrochimique « Z(ω) » se calcule pour chaque fréquence et est un nombre

complexe.

imre jZZZ ou sincosexp jI

EjZ

I

EZ

t

t

(7)

Avec :

Z : module de l’impédance

: angle de déphasage

L’impédance complexe est couramment représentée selon deux modes différents :

en mode Bode (Figure 1.14), le module Z et la phase sont tous les deux représentés

en fonction du logarithme de la fréquence angulaire.

-1 0 1 2 3 4 5 6

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

-1 0 1 2 3 4 5 6

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Lo

g IZ

I

Log (w) (Hz)

IZI

Phase

Phase

Figure 1.14. Diagramme de Bode qui représente log module et en fonction de log .

ZIE tt


4.0x102

8.0x102

1.2x103

0.0

3.0x102

6.0x102

-ZI (

ohm

)

ZR (ohm)

Hautes fréquences

Basses fréquences

4.0x102

8.0x102

1.2x103

0.0

3.0x102

6.0x102

-ZI (

ohm

)

ZR (ohm)

Hautes fréquences

Basses fréquences

en mode Nyquist (Figure 1.15) qui est une représentation alternative de ZRe (impédance

réelle) en fonction de – ZIm (impédance imaginaire) paramétrée en fréquence angulaire.

Figure 1.15. Diagramme de Nyquist représentant - ZI en fonction de ZR.

D’autres modes de représentations sont utilisés, comme l’admittance. De même que la

conductance, qui a été créée afin de faciliter les calculs des circuits comportant des éléments

purement résistifs en parallèle, l’admittance a été imaginée pour les circuits utilisant des

impédances. L’admittance (Y) est l’inverse de l’impédance et s’exprime en siemens (S).

Z

Y1

et

Y

Z1

(8)

L’admittance un nombre complexe qui s’écrit : 22

imre

imre

ZZ

jZZY

(9)

La spectroscopie d’impédance électrochimique permet de différencier les différents

phénomènes qui peuvent avoir lieu dans une cellule électrochimique (Figure 1.16) en fonction

de la fréquence. Ainsi, les phénomènes rapides tels que les transferts d’électron se produisent

à hautes fréquences, tandis que les phénomènes lents comme les transferts de masses et la

diffusion se réalisent à basses fréquences (Figure 1.16).

L’impédance totale Z(ω) mesurée correspond à l’ensemble d’une cellule électrochimique.

Dans le cas d’une électrode simple, elle comprend une impédance d’interface qui correspond

à l’électrode étudiée (travail), la résistance interne de la cellule (Rs) due principalement à

l’électrolyte, une impédance de la contre électrode et pour des processus électrochimiques une

impédance faradique (ZF).

Fd

F

SZCj

ZRZ

1 (10)


Métal ElectrolyteInterface

n e- n e-

Réaction chimique

Adsorption, désorption

Réactions de

Transfert de charge

Rapides

Réactions de

Transfert de masse

Lentes

Métal ElectrolyteInterface

n e-n e- n e-n e-

Réaction chimique

Adsorption, désorption

Réactions de

Transfert de charge

Rapides

Réactions de

Transfert de masse

Lentes

Figure 1.16. Différents processus électrochimiques à l’interface métal/électrolyte.

4.2 Modélisation de l’impédance.

Une cellule électrochimique, étudiée par spectroscopie d’impédance, peut être représentée par

un circuit électrique équivalent comprenant des éléments simples :

les résistances R qui sont indépendantes de la fréquence et qui ne produisent aucun

déphasage. L’impédance ZR d’une résistance est égale à la résistance R. RZR

les capacités C qui déphasent le signal. L’impédance correspondante ZC, diminuant avec

la fréquence, équivaut à : Cj

Z C

1 .

les inductances L qui déphasent le signal. Dans ce cas, l’impédance ZL augmente avec la

fréquence et correspond à : LjZL .

Le calcul de l’impédance totale Z dépend de la nature du circuit. Lorsque les éléments sont en

série, l’impédance totale est égale à la somme des impédances de chaque

élément

I

iT ZZ , alors qu’en parallèle i iT ZZ

11 ou

i

it YY

De nombreux diagrammes impédancemétriques peuvent être modélisés par un circuit

électrique équivalent comprenant uniquement des résistances et des capacités. Le modèle de

Randles (Figure 1.17) est le circuit le plus couramment utilisé pour décrire une cellule

électrochimique [Ding, SJ. et al., 2005, Fernandez-Sanchez, C. et al., 2005, Hou, Y. et al.,


Rs

Cdc

Rtc Zw

Rs

Cdc

Rtc Zw

2007]. Il combine quatre éléments, la résistance de l’électrolyte (Rs), la capacité de double

couche (Cdc), la résistance de transfert de charge (Rtc) et l‘impédance de Warburg ZW.

Figure 1.17. Circuit électrique de Randles.

RS est la résistance de l’électrolyte entre l’électrode de travail et l’électrode de référence.

Rtc correspond au transfert d’électron.

2/2/022,

00

0

112

eCeCSkFn

RT

I

ER

ROxEC

tc

j

où

RT

nFEE 0

0

0

(11)

Avec :

R : constante des gaz parfaits


n : nombre d’électrons échangés

F : constante de Faraday

S : surface de l’électrode

k0 : constante de transfert électronique

C : concentration

Cdc caractérise l’interface métal/solution qui est une zone de séparation de charges. Le

caractère non parfait de cette capacité traduit le caractère rugueux de la surface de

l’électrode. La capacité est dite non parfaite ou CPE (Constant Phase Element).

L’impédance de la capacité non parfaite de double couche Qdc est donnée par la

relation (12) pour laquelle 0,5 < n < 1 traduit la rugosité de la surface.

(12)

ZW qui traduit le phénomène de diffusion pure reflète l’influence du transport de matière

de l’espèce électroactive.

2/1

1

jZW

ou

RROxOx CDCDSFn

RT2/12/122

11

2 (13)

Avec :

R : constante des gaz parfaits S : surface de l’électrode

T : température (K) C : concentration

n : nombre d’électrons échangés D : coefficient de diffusion

F : constante de Faraday σ : coefficient de Warburg

C

jZ

n

Qdc


8.0x101

1.6x102

2.4x102

0.0

5.0x101

1.0x102

1.5x102

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

RtcRs

f0 = (1/Rtc*Cdc)n

W

8.0x101

1.6x102

2.4x102

0.0

5.0x101

1.0x102

1.5x102

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

RtcRs

f0 = (1/Rtc*Cdc)n

W

Dans cette configuration, les diagrammes de Nyquist et de Bode permettent de remonter aux

valeurs des différents composants du circuit. Comme le montre le diagramme de Nyquist

présenté dans la figure 1.18, les valeurs de Rs et Rtc peuvent être déduites de la courbe tandis

que Cdc nécessite un calcul.

Rs (Ω) correspond à la valeur sur l’axe ZR du premier point du demi-cercle.

Rtc (Ω) se lit sur l’axe ZR et équivaut au diamètre du demi-cercle.

Cdc (F) ou Q (F.sn-1

) se calcule à partir de la valeur de la plus haute fréquence du demi-

cercle, f0. n

dctc CRf

10

Figure 1.18. Calcul des différents composants du circuit de Randles à partir du diagramme de Nyquist.

Tandis que les valeurs précédentes proviennent de l’analyse du diagramme de Nyquist,

l’impédance de Warburg est elle calculée à partir du diagramme de Bode comme l’illustre la

figure 1.19.

iW

2

1, ωi étant la fréquence au point d’intersection des diagrammes de phase et

d’impédance comme l’illustre la figure 1.19.


-1 0 1 2 3 4 5 6

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3.0

3.1

3.2

-1 0 1 2 3 4 5 6

-30

-25

-20

-15

-10

-5

0

Lo

g IZ

I

Log (w) (Hz)

IZI

w = Sigma2

Phase

Phase

Figure 1.19. Calcul du coefficient de Warburg à partir du diagramme de Bode.

Cette analyse n’est valable que pour le modèle de Randles qui traduit une électrode simple

mais ne prend pas en compte la présence de film adsorbé à la surface. Dans le cas de modèles

plus sophistiqués, la modélisation mène à des circuits électriques équivalents plus complexes.

La détermination de la valeur des composants constituants le circuit équivalent est réalisée à

l’aide de logiciels (ex : FRA).

Il est important de noter que les circuits électriques équivalents dessinés pour une cellule

électrochimique ne sont pas uniques, notamment pour des processus complexes.

La spectroscopie d’impédance électrochimique a été de nombreuses fois utilisée comme mode

de transduction dans des biocapteurs cellulaires. Cependant, malgré les nombreux travaux

publiés sur cette nouvelle technologie utilisant des cellules vivantes, jusqu’à présent aucune

publication ne décrit la faisabilité d’utiliser ce type de biocapteurs pour mesurer directement

le développement intracellulaire d’un parasite dans sa cellule hôte.

La première partie du mémoire de thèse a pour objectif d’élaborer un biocapteur cellulaire

pour mesurer les changements physiologiques affectant des cellules parasitées. Ainsi, les

chapitres 2 et 3 décrivent les résultats obtenus avec le biocapteur cellulaire construit à partir

de globules rouges ou de macrophages, respectivement.


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Chapitre 2

Biocapteur

Globule rouge/Plasmodium

47

Chapitre 2

Biocapteur

Globule rouge/Plasmodium

Chapitre 2 – Biocapteur Globule rouge/Plasmodium 48


Sommaire

Introduction ........................................................................................................................ 51

Partie expérimentale........................................................................................................... 53

1. Matériels ............................................................................................................................. 53

2. Méthodes............................................................................................................................. 53 2.1 Procédés de fabrication des électrodes ........................................................................................... 53 2.2 Modifications des électrodes ......................................................................................................... 54

2.2.1 Nettoyage des électrodes ...................................................................................................... 54 2.2.2 Modification par dépôt de polylysine ................................................................................... 54 2.2.3 Modification par dépôt d’anticorps....................................................................................... 54

2.3 Spectroscopie d’impédance électrochimique ................................................................................. 55 2.4 Microbalance à quartz ................................................................................................................... 56 2.5 Culture in vitro de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ...................................... 56 2.6 Enrichissement d’échantillons de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ................ 56

Résultats et discussion ........................................................................................................ 59

1. Modèle d’accrochage utilisant la polylysine ...................................................................... 59 1.1 Construction de l’édifice moléculaire ............................................................................................ 59 1.2 Caractérisation du système par microbalance à quartz « QCM » .................................................... 61

2. Modèle d’accrochage par liaison antigène/anticorps ........................................................ 62 2.1 Construction de l’édifice moléculaire ............................................................................................ 62 2.2 Caractérisation des couches d’accroche ......................................................................................... 64

2.2.1 Microscopie optique ............................................................................................................ 64 2.2.2 Caractérisation des couches par microbalance à quartz « QCM » .......................................... 65 2.2.3 Caractérisation des couches par spectroscopie d’impédance électrochimique « EIS » ............ 66

a. Détermination des coefficients de diffusion des ions ferricyanuress et ferrocyanures ............. 66 b. Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique appliquées à l’or nu ........................ 68 c. Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique appliquées aux couches d’accroche69 d. Conclusion .......................................................................................................................... 73

3. Caractérisation des changements physiologiques affectant les globules rouges sains et

parasités par spectroscopie d’impédance électrochimique ........................................................ 74 3.1 Concentration des érythrocytes parasités ....................................................................................... 74 3.2 Mesures d’impédance en absence de couple rédox ......................................................................... 75

a. Caractéristiques du film ....................................................................................................... 79 b. Caractéristiques interface film/solution ................................................................................ 82

3.3 Mesures de stabilité du biocapteur cellulaire.................................................................................. 83

Conclusion .......................................................................................................................... 84

Références ........................................................................................................................... 85


Introduction

Le paludisme est la maladie infectieuse la plus importante au monde avec plus d’1 million de

morts par an dans le monde (source de UNICEF et OMS, 2005). Le parasite responsable chez

l’homme, Plasmodium falciparum, envahit les érythrocytes et induit des changements

membranaires importants notamment dans la fluidité, la perméabilité, la déformabilité et

l’adhérence des cellules hôtes.

L’infection par Plasmodium induit chez le globule rouge un stress oxydant, se traduisant par

la production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, dont des espèces radicalaires, en

partie responsables des nombreux dégâts engendrés dans la cellule. Ainsi, les travaux

présentés dans ce chapitre ont pour objectif l’élaboration d’un nouvel outil analytique

permettant d’évaluer le stress oxydant généré lors de l’invasion parasitaire. Ce nouvel outil

repose sur la construction d’un biocapteur cellulaire utilisant le globule rouge (cellule hôte du

parasite) comme élément de reconnaissance.

Un biocapteur cellulaire basé sur le globule rouge a donc été élaboré afin de mesurer les

changements affectant la cellule parasitée par des mesures de spectroscopie d’impédance

électrochimique (EIS). Sa réalisation nécessite au préalable la mise au point d’une méthode

d’immobilisation reproductible des érythrocytes compatible avec la détection par

spectroscopie d’impédance électrochimique.

La première partie de ce chapitre présente une façon originale de greffer, de manière

reproductible, des globules rouges sur une électrode d’or et la caractérisation des couches

d’accrochage par différentes techniques incluant la spectroscopie d’impédance et la

microbalance à quartz.

La deuxième partie de ce chapitre est consacrée à l’étude par spectroscopie d’impédance

électrochimique des couches cellulaires parasitées ou non déposées sur l’électrode d’or, ainsi

qu’aux modélisations des courbes en circuit électrique équivalent correspondants permettant

de différencier l’état sain de l’état parasité.


Partie expérimentale

1. Matériels

Le ferrocyanure de potassium (ref : 26 816.298) et l’éthanol absolu (ref : 20 820.362) sont

fournis par VWR Prolabo. Le ferricyanure de potassium provient de Merck (ref : 4973). Le

Roswell Park Memorial Institute « RPMI » 1640 (ref : BE12-702F) et l’hépès sont fournis par

LONZA (Belgique). Le 6-mercapto-1-hexanol «MH» (ref : 63762) ; l’acide 11-

mercaptoundecanoique « MUA » (ref : 450561) ; le n-hydroxysuccinimide « NHS »

(ref :56480) ; le n-ethyl-n’-(dimethylaminopropyl)-carbodiimide « EDC » (ref : E6383) ; le

tampon phosphate «PBS» (ref : P4417) ; la protéine G (ref : 19459) ; le péroxyde

d’hydrogène (ref : H1009) et la glutamine (ref : G8540) sont fournis par Sigma-Aldrich.

L’Anti D (IgG) Lorisix (ref : HGSABO10-0M) est fourni par Eurobio. L’éthanol 95 % (ref :

64-17-5) et l’acide sulfurique (ref : 7664-93-9) proviennent de Fisher Scientific. Les globules

rouges (O+) et le sérum humain AB

+ sont fournis par l’établissement français du sang (EFS,

Toulouse).

Les colonnes « LD » (ref : 130-042-901), l’aimant « QuadroMACS Separator » (ref : 130-

090-976) et le portoir « MACS MultiStand « (ref : 130-042-303) sont fournis par Miltenyi

Biotec (France).

2. Méthodes

2.1 Procédés de fabrication des électrodes

Les travaux sont réalisés sur deux types d’électrodes fabriquées au Laboratoire d’Architecture

de d’Analyse des Systèmes (LAAS) :

des électrodes rectangulaires (type 1)

des électrodes originales présentant une microcuve sur leur surface (type 2)

Les électrodes rectangulaires (1 x 1,5 cm) en or ont été obtenues par pulvérisation sous vide

d’oxyde de silicium, de titane (30 nm) puis d’or (300 nm) sur des substrats en silicium.

Les microélectrodes avec microcuves sont fabriquées en utilisant les procédés de fabrication

de masse de la microélectronique (Figure 2.1). Afin de permettre une caractérisation des

couches par microscopie optique, les microélectrodes sont fabriquées sur des substrats en

pyrex transparents. Le procédé de métallisation est optimisé de façon à obtenir la meilleure

adhérence entre les couches de titane et d’or (Ti/Au) sur le pyrex. Ce résultat est obtenu en

contrôlant le recuit des couches de Ti/Au et en utilisant un taux de déposition bas (1 nm/min)

pour les deux procédés d’évaporation. Une étape de photogravure de métallisation est ensuite

réalisée afin de définir exactement les microélectrodes. La totalité de la surface est ensuite

recouverte d’une couche de polysiloxane. Une nouvelle étape de photogravure permet


l’ouverture des contacts au niveau des microélectrodes, définissant ainsi une microcuve

entourée d’un polymère hydrophobe facilitant les dépôts des différentes couches d’accrochage

par l’intermédiaire de gouttes.

Figure 2.1. Procédé de fabrication des microélectrodes en or

2.2 Modifications des électrodes

2.2.1 Nettoyage des électrodes

Les électrodes de type 1 sont préalablement lavées par immersions successives dans l’éthanol,

l’acétone et une solution de piranha (70% H2SO4 / 30% H2O2), abondamment rincées à l’eau

distillée et séchées sous argon avant toute utilisation.

Dans le cas des microélectrodes, compte tenu de leur fragilité, le lavage se fait simplement par

immersion dans l’acétone.

2.2.2 Modification par dépôt de polylysine

La modification des électrodes débute par une immersion de 18 h, à température ambiante,

dans une solution d’acide 11-mercaptoundecanoique à 5 mM dans de l’éthanol absolu. Les

électrodes sont ensuite rincées à l’éthanol absolu, séchées sous argon, avant d’être immergées

dans une solution de polylysine à 1 mg/mL pendant 3 h à température ambiante. Les

électrodes sont ensuite rincées au PBS et de nouveau séchées sous argon.

2.2.3 Modification par dépôt d’anticorps

Ce type de modification a été mis en œuvre uniquement pour des microélectrodes type 2

(microcuve).

Pyrex Métallisation Ti/Au Photogravure

Dépôt de polysiloxanePhotogravure ouverture des contacts

Substrat en pyrex

Titane

Au

Polysiloxane

PyrexPyrex Métallisation Ti/Au Photogravure

Dépôt de polysiloxanePhotogravure ouverture des contacts

Substrat en pyrex

Titane

Au

Polysiloxane

Substrat en pyrex

Titane

Au

Polysiloxane


Les électrodes lavées après séchage sous argon sont immédiatement modifiées de la manière

suivante : 10 µL d’un mélange de 6-mercapto-1-hexanol (MH) 10 mM et d’acide 11-

mercaptoundecanoique (MUA) 1 mM dans l’éthanol 99% sont déposés sous forme de goutte

dans la microcuve à température ambiante, pour former la monocouche autoassemblée mixte

(SAM Self Assembled Monolayer). Après 18 h de dépôt, les électrodes sont rincées dans

l’éthanol 99% sous ultrasons pendant 5 min puis séchées sous argon. L’activation des

groupements carboxylates du MUA se fait par immersion dans une solution aqueuse

contenant 15 mM de NHS et 75 mM d’EDC. Après 25 min, à température ambiante, la

surface est rincée à l’eau milliQ. 40 µL d’une solution à 100 µg/mL de protéine G dans du

PBS à pH 7,4 sont déposés sur la couche de SAM estérifiée. Après 18 h d’incubation à

température ambiante, les électrodes sont rincées avec du PBS à pH 7,4 et séchées sous argon.

40 µL d’anti D à 40 µg/mL (solution commerciale) sont ensuite déposés sur l’électrode. Après

une nuit d’incubation à 4 °C la surface est rincée avec du PBS à pH 7,4 et séchée sous argon.

Les globules rouges (GR) sains ou parasités, à 50% d’hématocrite dans du milieu de culture

(RPMI + hépès), sont déposés par goutte de 20 µL sur les surfaces fonctionnalisées. Après

1,5 h d’incubation à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 en présence d’un

humidificateur (Sanyo, ref : MCO-15AC), les électrodes sont rincées par immersion dans du

milieu de culture. Les électrodes sont immédiatement utilisées afin d’éviter la déshydratation

des GR.

2.3 Spectroscopie d’impédance électrochimique

Les mesures impédancemétriques sont réalisées à l’aide d’un Voltalab 80 PGZ 402 et du

logiciel voltamaster 4 (fourni par Radiometer) dans une cellule électrochimique comprenant

trois électrodes dont une électrode au calomel saturée (SCE) comme électrode de référence

(Radiometer analytical, part n° : B20B110, Type : XR110), une électrode en or (0,137 cm2)

comme électrode auxiliaire et une électrode en or (0,053 cm2) comme électrode de travail

(type 1 ou 2). Les surfaces sont définies par les joints toriques utilisés pour plaquer l’électrode

sur la cellule électrochimique (Figure 2.2). Les expériences sont réalisées soit dans le milieu

de culture (RPMI complémenté avec de l’hépès), soit dans une solution aqueuse de

[Fe(CN)6]3-/4-

.

Les spectres impédancemétriques sont enregistrés pour des fréquences variant entre 50 kHz et

100 mHz au potentiel d’équilibre de l’électrolyte, avec une amplitude de 10 mV. Toutes les

mesures sont réalisées à 25 °C dans une cage de Faraday.


Référence

Auxiliaire TravailPotentiostat

Traitement des données

Cellule thermostatée

Schéma du montage pour mesures

par spectroscopie d’impédance

Figure 2.2. Schéma du montage utilisé pour les expériences de spectroscopie d’impédance.

2.4 Microbalance à quartz

Les mesures de microbalance à quartz (Maktek RQCM, Beaverton, USA) sont réalisées à

l’aide de disques de quartz non polis métallisés avec de l’or (Neyco, ref : P/N149238-2)

(S = 1,37 cm2), ayant une fréquence de vibration fondamentale égale à 5 MHz. Les mesures

sont réalisées à l’air ce qui permet l’utilisation de l’équation de Sauerbrey pour calculer la

masse déposée à partir de la variation de fréquence de vibration enregistrée (cf. Chapitre 1, §

3.4.3).

2.5 Culture in vitro de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum

Les parasites sont cultivés selon la méthode décrite par Trager et Jensen [Trager, W. et al.,

1976] avec des modifications [Jacquemont-Collet, I. et al., 2002]. Brièvement, les parasites

sont maintenus entre 0,5 et 4% de parasitémie dans du milieu de culture à un taux

d’hématocrite variant entre 2 et 4%. Le milieu de culture contient du RPMI complémenté

avec 25 mM d’hépes et 2 mM de L-glutamine et supplémenté avec 7,5% de sérum humain.

2.6 Enrichissement d’échantillons de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum

L’enrichissement des cultures en globules rouges parasités est réalisé grâce à l’utilisation de

colonnes magnétiques. Les manipulations sont réalisées dans des conditions stériles. Les

colonnes chromatographiques LD sont placées dans l’aimant QuadroMacs (Photo 2.1) puis

optimisées avec du milieu de culture (RPMI complémenté avec 25 mM d’hépès) à 37 °C. 5

mL de la culture parasitée à 10% d’hématocrite préalablement lavée sont déposés au sommet

de la colonne. Lorsque la totalité du volume déposé est élué, les colonnes sont rincées avec le

milieu de culture jusqu’à que le filtrat ne contienne plus de GR (filtrat transparent). La

colonne est ensuite désolidarisée de l’aimant afin de récupérer le culot de GR parasités


enrichis. La récupération se fait, grâce au piston, en injectant délicatement 3 mL de milieu

dans la colonne. La solution ainsi récupérée est ensuite centrifugée à 1600 rpm pendant 5 min.

Photo 2.1. Colonne LD dans aimant MACS.


Résultats et discussion

Par leur nature circulante, les globules rouges sont difficilement immobilisables expliquant la

rareté des études publiées concernant les biocapteurs cellulaires à base d’érythrocytes. Il a

déjà été démontré que les globules rouges n’adhérent pas aux protéines couramment

employées dans les biocapteurs cellulaires, comme la fibronectine, la vitronectine, la

fibrinogène ou le collagène [Joneckis, CC. et al., 1996]. La majorité des publications

évoquant l’immobilisation de globules rouges concerne des études spectroscopiques

(fluorescence [Kanz, L. et al., 1986, Tanaka, M. et al., 2001], Raman [Ramser, K. et al.,

2003]) ou en imagerie (AFM) [Dulinska, I. et al., 2006, Grandbois, M. et al., 2000, Touhami,

A. et al., 2002, Zachée, P. et al., 1996] ayant pour principal objectif d’étudier leurs propriétés

mécaniques (taille et forme). Un nombre important de méthodes a été développé pour

immobiliser les globules rouges via l’utilisation de molécules telles que la glutaraldéhyde

[Betz, T. et al., 2007], le dextran, le polyéthylène glycol et la polylysine [Darmani, H. et al.,

1990, Wolf, H. et al., 1983].

La première étape de ce travail a consisté en la mise au point d’un édifice moléculaire pour

immobiliser de manière reproductible des globules rouges sur une surface d’or. Les premiers

essais ont été réalisés sur des systèmes simples et peu coûteux, impliquant l’utilisation de

polylysine [Darmani, H. et al., 1990, Wolf, H. et al., 1983].

1. Modèle d’accrochage utilisant la polylysine

1.1 Construction de l’édifice moléculaire

La polylysine (Figure 2.3), polypeptide synthétique couramment employée en culture

cellulaire, a été choisie pour immobiliser les érythrocytes. Le pKa du groupement amine étant

de 10,2 à pH neutre, le groupement NH2, sous sa forme cationique, adhère sur le verre chargé

négativement (SiO-). La surface de verre ainsi modifiée favorise l’accrochage ainsi que la

survie des cellules [Jordan, CE. et al., 1994].

Figure 2.3. Formule développée de la lysine

L’accrochage de la polylysine sur l’or est réalisé grâce à l’utilisation de monocouches auto-

assemblées de thiols (cf. Chapitre 1). Le thiol choisi pour cette expérience est l’acide 11-

mercaptoundécanoique (MUA) (Figure 2.4) qui comprend une fonction carboxylate. La

liaison entre la polylysine et la monocouche autoassemblée se fait grâce aux liaisons

électrostatiques s’établissant entre les groupements carboxylates et la charge positive des

H2N OH

NH2

O


fonctions amines de la polylyisne. La monocouche de thiols permet ainsi de faire un lien entre

la surface d’or des électrodes et la polylysine, comme l’illustre la figure 2.5.

Figure 2.4. Formule chimique de l’acide 11-mercaptoundécanoique « MUA ».

Figure 2.5. Schéma représentant l’assemblage SAM/polylysine pour l’immobilisation des globules

rouges.

Afin de garantir la reproductibilité des résultats, il est indispensable que le dépôt des

érythrocytes soit reproductible d’une électrode à une autre. Les couches d’accroches

SAM/polylysine ont donc été caractérisées par différentes méthodes spectroscopiques (IR,

XPS) et par microbalance à quartz.

De nombreuses études ont mis en évidence, par spectroscopie infrarouge et par spectroscopie

de photoélectrons X, la présence des monocouches autoassemblées de thiols et de polylysine

sur support d’or [Feng, Y. et al., 2006, Jordan, CE. et al., 1994, Wagner, P. et al., 1996].

Cependant, étant donné la très faible épaisseur des films déposés, les mesures de

spectroscopie infrarouge et de spectroscopie de photoélectrons X n’ont pas permis, dans notre

cas, de mettre en évidence les fonctions chimiques ou les atomes caractéristiques des

différentes couches. Certaines études ont déjà souligné la difficulté d’obtenir ces résultats

[Briand, E. et al., 2006].

CH2 (CH2)8 CH2 SH

O


1.2 Caractérisation du système par microbalance à quartz « QCM »

La microbalance à cristal de quartz est un instrument permettant de mesurer des variations de

masse supérieures à 0,1 µg/cm2 à la surface d’une électrode.

Le principe de cette technique (cf. Chapitre 1 §3.4.3) repose sur la relation de Sauerbrey qui

relie la variation de la fréquence de vibration du quartz à la masse déposée.

mf

qq

m

CS

ff

2

0 (1)

Avec :

0f = fréquence de résonance intrinsèque du cristal

S = surface du cristal piézoélectrique

q = densité du quartz

q= module de cisaillement du quartz

fC = coefficient de proportionnalité

Les quartz utilisés ont une fréquence de vibration fondamentale égale à 5 MHz et pour cette

fréquence le coefficient de proportionnalité Cf est égal à 0,057 Hz/ng/cm

2.

qq

fS

fC

2

0 = 0,057 Hz/ng/cm2

(2)

Il faut noter que la relation de Sauerbrey a été utilisée pour toutes les couches en dépit du fait

que cette équation suppose que la combinaison du quartz et des couches adsorbées équivaut à

un assemblage rigide.

Les mesures de QCM ont été réalisées à chacune des étapes de la construction de l’édifice

moléculaire sur la surface métallique des quartz piézoélectriques.

La figure 2.6, qui présente les variations de fréquence enregistrées à chaque étape de la

modification des quartz métallisés, met clairement en évidence une diminution de la

fréquence de vibration et donc une augmentation de la masse déposée après dépôt de la

couche de thiols et de polylysine.

Pour les quatre quartz testés, le dépôt de thiols est sensiblement reproductible et correspond à

un dépôt de 1,8 µg/cm2. La nature de la monocouche auto-assemblée formée par les thiols

explique la reproductibilité des dépôts. Les SAMs sont, en effet, des assemblages

moléculaires ordonnés, formés grâce aux liaisons chimiques fortes entre les soufres et la

surface d’or et par une forte cohésion entre les chaînes.

En revanche, dans le cas de la polylysine les dépôts ne sont pas reproductibles. Les variations

de fréquence enregistrées dans ce cas correspondent à des masses déposées de 1,9 µg/cm2 à

9,8 µg/cm2. Ces irrégularités pourraient être expliquées par plusieurs facteurs : i) la nature des

liaisons entre la polylysine et la couche auto-assemblée qui sont de faible intensité et ii) la


nature de la polylysine utilisée qui est en fait une suspension ne garantissant pas la

reproductibilité des quantités déposées pour chaque électrode.

Figure 2.6. Variation de la fréquence de vibration du quartz piézoélectrique pour chaque étape de

modification de la surface d’or.

Etant donné que la reproductibilité des dépôts, essentielle pour la réalisation de capteurs

cellulaires permettant la différentiation de deux états cellulaires avec deux électrodes

distinctes, est mauvaise un nouveau procédé d’accrochage a été envisagé.

2. Modèle d’accrochage par liaison antigène/anticorps

Afin d’augmenter la reproductibilité des dépôts, de nouvelles électrodes de type

microélectrodes au design original ont été fabriquées et utilisées (cf. partie expérimentale §

2.1).

Les électrodes ont été fabriquées à partir de substrats en pyrex transparent, métallisés avec de

l’or de faible épaisseur, afin de permettre la visualisation des dépôts par microscopie optique.

L’ensemble de l’électrode est ensuite recouvert de polysiloxane hydrophobe, l’ouverture des

contacts se faisant au niveau de la microélectrode par photogravure permettant de définir des

microcuves qui empêchent l’étalement des gouttes déposées pour accrocher les globules

rouges, à l’extérieur de la surface d’or.

2.1 Construction de l’édifice moléculaire

Afin d’éviter l’utilisation de polylysine, une nouvelle voie d’accrochage des globules rouges

par liaison antigène/anticorps a été envisagée. Un anticorps est une protéine qui se lie à un

antigène ciblé avec une extrême spécificité. Pour cette raison, l’immobilisation d’anticorps sur

des supports solides a été de nombreuses fois utilisée [Kanno, S. et al., 2000, Moll, N. et al.,

2008].


Les globules rouges à rhésus positif possèdent dans leur membrane des antigènes spécifiques

(immunoglobuline) qui peuvent reconnaître l’anticorps anti D (AD). Cette interaction

antigène/anticorps a déjà été mise à profit pour l’immobilisation des globules rouges sur des

substrats en silice [Kumpel, BM. et al., 2003, Vashist, SK. et al., 2006].

Comme dans le cas de la polylysine, la liaison entre l’anticorps et la surface d’or de

l’électrode a été réalisée grâce à l’utilisation de SAM. Afin d’éviter des adsorptions non

spécifiques dues à un trop grand nombre de motifs carboxylates à la surface de l’électrode

[Lee, JW. et al., 2005] un assemblage de thiols mixtes a été préféré [Jong, SY. et al., 2004,

Spinke, J. et al., 1993]. La solution de thiols mixtes est, conformément à la littérature, [Jong,

SY. et al., 2004] un mélange de 6-mercaptohexanol et d’acide 11-mercaptoundecanoique, en

proportion 1/10. La couche autoassemblée possède alors deux types de fonctions terminales :

une fonction COO- pour dix fonctions OH.

L’immobilisation d’anticorps sur des supports solides implique une diminution de leur activité

de piégeage. Une des raisons de la réduction d’activité est attribuée à l’orientation aléatoire

des molécules d’anticorps sur la surface. Pour palier à ce problème, la fixation de l’anti D à la

surface de la monocouche autoassemblée a été réalisée par l’intermédiaire d’une protéine

d’attachement, la protéine G (PG) [Qoronfleh, MW. et al., 2003]. Cette protéine se lie

spécifiquement à la molécule d’immunoglobuline par la région Fc sans interagir avec le site

actif de l’antigène [Akerstrom, B. et al., 1985, Bjorck, L. et al., 1984] et permet ainsi

d’obtenir une orientation donnée de l’anticorps. Dans ce cas, l’immobilisation de l’anticorps

ne se fait pas de manière covalente mais la liaison est suffisamment forte en raison d’une

grande affinité entre la protéine G et l’anticorps [Moll, N. et al., 2008]. L’étape d’accrochage

de la protéine G sur la monocouche auto-assemblée de thiols nécessite une étape préliminaire

d’estérification du groupement terminal carboxylate du MUA [Patel, N. et al., 1997]. Cette

estérification est réalisée, comme indiqué sur la figure 2.7, par ajout de N-ethyl-N’-

(dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) et de N-hydroxysuccinimide (NHS). Le

groupement terminal ainsi estérifié permet l’accrochage de la protéine G par liaison

peptidique [Dammer, U. et al., 1996].

Le nouvel édifice moléculaire ainsi formé comporte 5 couches, comme l’illustre la figure 2.8.

N

H3C

H3C

CH2 CH2 CH2 N C N CH2 CH3

H

O

HN

CH2 CH2 CH2

C

N

CH3

CH3

N CH2 CH3

O

N CH3

O

ON OO

O

O

S

O

S

O

S

H2N Enzyme

N

Enzyme

H

S

O

Figure 2.7. Mécanisme d’estérification des fonctions carboxyles des thiols par le couple NHS/EDC.


Figure 2.8. Schéma des différentes couches moléculaires utilisées pour le greffage de globules rouges

par l’intermédiaire d’interaction antigène/anticorps.

Expérimentalement, la construction de cet édifice est très longue puisqu’elle comporte 5

étapes réalisées sur quatre jours.

lavage méticuleux des électrodes.

formation de la monocouche de thiols mixtes par immersion des électrodes pendant

18 h dans une solution de thiols.

estérification des fonctions carboxylates par immersion des électrodes pendant 25 min

dans la solution de NHS et EDC.

dépôt de la couche de protéine G par immersion des électrodes dans une solution de

protéine G pendant 18 h.

dépôt d’anti D par immersion des électrodes dans une solution d’anti D pendant 18 h.

Afin de garantir la reproductibilité des résultats, il est indispensable que le dépôt des

érythrocytes soit reproductible d’une électrode à une autre. Les nouvelles couches

d’accroches SAM/protéine G/Anti D ont donc été caractérisées par différentes méthodes

spectroscopiques (IR, XPS), par microbalance à quartz et finalement par spectroscopie

d’impédance électrochimique.

2.2 Caractérisation des couches d’accroche

2.2.1 Microscopie optique

La photo (x 40), figure 2.9, des électrodes modifiées démontre bien la présence d’un tapis

cellulaire recouvrant la surface d’or.


Figure 2.9. Photo x40 d’une microcuve d’or recouverte de globules rouges immobilisés via

l’assemblage SAM/PG/AD.

Plusieurs électrodes, observées au microscope optique, ont donné le même résultat. Cette

expérience a permis d’optimiser le dépôt de globules rouges en variant le taux d’hématocrite

et le temps d’incubation afin d’obtenir les meilleures conditions permettant de se rapprocher

d’une monocouche de globules rouges. Les tapis cellulaires les plus homogènes ont été

obtenus pour un taux d’hématocrite égal à 50% et un temps d’incubation de 1h30.

Comme dans le cas des électrodes de type 1, ni l’IR, ni l’XPS n’ont permis de démontrer

l’existence des différentes couches à la surface de l’électrode.

2.2.2 Caractérisation des couches par microbalance à quartz « QCM »

Les valeurs moyennes des variations de fréquence enregistrées à chaque étape de la

modification des électrodes et les masses correspondantes sont présentées dans le tableau 2.1.

Il est possible à partir des masses calculées d’en déduire le nombre de moles déposées par

cm2.

Tableau 2.1 : Variation de la fréquence de vibration du quartz, de la masse déposée et du nombre de

mole/cm2 obtenu à chaque étape de la modification de l’électrode. Les variations de masse sont

calculées à partir de la variation de fréquence grâce à l’approximation de Sauerbrey.

SAMs Protéine G Anti D GR sains

MW (g.mol-1

) 142 31 800 50 000 -

F (Hz) - 63 ± 23 - 221 ± 37 - 128 ± 30 - 395 ± 28

m (µg.cm-2

) 0,8 ± 0,3 2,8 ± 0,5 1,6 ± 0,4 5,0 ± 0,4

mole.cm-2

5,6 x 10-9

8,8 x 10-11

3,2 x 10-11

-

La masse détectée pour la SAM mixte est à la limite de détection de l’appareil due à la faible

épaisseur de la monocouche. Le nombre de moles de thiols par cm2 est égal à 5,6 x 10

-9 ce qui


correspond à 5,6 x 10-10

mole de groupements COO- disponibles par cm

2 pour le greffage de

la protéine G.

La protéine G étant une macromolécule, la masse détectée est logiquement supérieure à celle

enregistrée pour la monocouche de thiols. La variation de masse enregistrée a permis de

déduire la présence de 8,8 x 10-11

mole de protéine G par cm2, ce qui correspond à une

fonction carboxylate sur six impliquée dans la liaison peptidique entre la protéine G et la

SAM.

La variation de masse enregistrée pour l’anti D est égale à 1,6 µg.cm-2

soit 3,2 x 10-11

mole

d’anti D par cm2, indiquant que l’anti D se lie à une protéine G sur trois.

Les globules rouges ont produit la plus grande variation de masse avec 5,0 µg.cm-2

. Dans ce

cas il n’est pas possible de calculer le nombre de cellules déposées sur la surface puisque les

mesures ont été réalisées à l’air, ce qui conduit à la mort des cellules par déshydratation.

Compte tenu des valeurs des incertitudes calculées, il apparaît que les dépôts sont

reproductibles. Afin de caractériser les couches d’un point de vue électrique des analyses de

spectroscopie d’impédance ont été mises en œuvre.

2.2.3 Caractérisation des couches par spectroscopie d’impédance électrochimique « EIS »

L’EIS est un outil puissant pour déterminer les paramètres cinétiques et le pourcentage de

recouvrement d’une surface en utilisant un couple rédox comme sonde (cf. chapitre 1). Des

mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique ont donc été mises en oeuvre à

chaque étape du procédé d’immobilisation en utilisant le couple rédox [Fe(CN)6]3-/4-

comme

sonde.

a. Détermination des coefficients de diffusion des ions ferricyanuress et ferrocyanures

Afin de déterminer les coefficients de diffusion des ions ferricyanures [Fe(CN)6]3-

et

ferrocyanures [Fe(CN)6]4-

, nécessaires entre autre au calcul des taux de recouvrement, des

expériences préliminaires de voltammétrie cyclique sur électrode tournante de platine sont

réalisées.

La figure 2.10 présente les diagrammes obtenus par voltammétrie cyclique en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

, à 5 mM dans du PBS à pH 7,4.


-160

-120

-80

-40

0

40

80

120

-0.4 -0.2 0 0.2 0.4 0.6 0.8

500 tr/min

1000 tr/min

1500 tr/min

2000 tr/min

3000 tr/min

I / µ

A

E / V

ID(Fe

II)

ID(Fe

III)

Figure 2.10. Voltampérogrammes obtenus en présence de [Fe(CN)6]

3-/4- sur une électrode tournante de

platine.

Comme attendu, les voltampérogrammes présentent une vague anodique pour le ferrocyanure

(Fe(II)) et une vague cathodique pour le ferricyanure (Fe(III)). Les voltampérogrammes ont

été enregistrés pour différentes vitesses de rotation (ω) de l’électrode. Les coefficients de

diffusion des ions ferricyaures et ferrocyanures sont déduits des valeurs des courants limites

(j = ID) enregistrés pour chaque vitesse de rotation de l’électrode, grâce à l’équation de Levich

(3) [Tremillon, B., 1993].

iii

i

CCDFn

j 03/26/12/155,1

(3)

Avec :

j = densité de courant à l’électrode (A.cm-2

)

n = nombre d’électron F = constante de Faraday (96 484,5 C.mol

-1)

= fréquence de rotation de l’électrode (Hz)

= viscosité cinématique (cm2.s

-1)

iD = coefficient de diffusion de l’espèce i (cm2.s

-1)

*

iC = concentration de l’espèce i à la surface de l’électrode (mol/cm3)

Les courants j sont donc proportionnels à la racine carrée de la vitesse de rotation de

l’électrode (ω). La pente de la droite représentant j en fonction de ω1/2

permet de calculer les

valeurs des coefficients de diffusion.

Les valeurs des coefficients de diffusion des ions ferrocyanures et ferricyanures sont égales

respectivement à 5,1 x 10-6

et 5,6 x 10-6

cm2.s

-1. Le coefficient de diffusion (D) est lié à la

mobilité ionique, il est donc normal que Fe(III) qui possède trois charges positives diffuse


3x102

4x102

5x102

6x102

7x102

8x102

9x102

1x103

0

1x102

2x102

3x102

4x102

5x102

6x102

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Mesure expérimentale

Modélisation

Rs

Cdc

Rtc Zw

mieux que Fe(II) qui n’en possède que deux. Ces valeurs sont supérieures à celles rapportées

dans la littérature [Campuzano, S. et al., 2006, Janek, RP. et al., 1998, Sabatani, E. et al.,

1993, Tremillon, B., 1993], mais il faut rappeler qu’elles dépendent du type d’électrolyte et de

la dilution [Tremillon, B., 1993].

b. Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique appliquées à l’or nu

Un des intérêts de la spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) est la modélisation des

diagrammes de Nyquist en circuit électrique équivalent. La décomposition des courbes en

plusieurs composants électriques (résistance, capacité) permet d’expliquer les phénomènes de

transferts de masse, de transfert d’électron ou de diffusion à la surface des électrodes

modifiées.

L’électrolyte utilisé est une solution équimolaire du couple redox [Fe(CN)6]3-/4-

à 5 mM dans

du PBS à pH 7,4. Les mesures sont réalisées au potentiel d’équilibre de l’électrolyte, avec une

amplitude de 10 mV, pour une fréquence variant entre 100 kHz et 50 mHz.

Le diagramme de Nyquist, de l’or nu obtenu en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

est représenté sur la

figure 2.10a. Le spectre, classiquement composé d’un demi cercle suivi d’une droite, peut être

facilement modélisé avec le circuit de Randles (Figure 2.10b). Le circuit électrique de

Randles se compose de 4 éléments dont une résistance d’électrolyte Rs, une résistance de

transfert de charge Rtc, une capacité non parfaite de double couche Qdc et une impédance de

Warburg ZW qui traduit les phénomènes de diffusion (transfert de matière).

(a) (b)

Figure 2.10. (a) Diagramme de Nyquist de l’or nu (b) Circuit électrique de Randles.

Les différentes valeurs des éléments constituants le circuit de Randles peuvent être déduites

de la courbe, comme expliqué dans le chapitre 1.

La résistance de l’électrolyte est égale à 352 Ω. Cette valeur ne dépend que de l’électrolyte et

doit par conséquent être constante quelques soient les couches déposées.


RROxOx CDCDSFn

RT2/12/122

11

2

La résistance de transfert de charge traduit la vitesse de transfert d’électron à la surface. Rtc

est égale à 92 Ω. Cette faible résistance s’explique logiquement par le fait que l’or est un très

bon conducteur qui présente par conséquent une faible résistance au passage du courant.

L’interface électrode/solution est représentée par la capacité de double couche Qdc. D’après la

figure 2.10a, Qdc = 3,12 µF.sn-1

avec n = 0,85 (surface presque parfaite). L’impédance de

Warburg a été estimée à partir de la courbe en mode Bode, à σω = 607,5 Ω.s-1/2

. La valeur

théorique du terme de Warburg, calculée à l’aide de la relation (4) est égale à

σω = 614,6 Ω.s-1/2

, valeur très proche de la valeur expérimentale.

(4)

Avec : R = constante des gaz parfaits

T = température en Kelvin

S = surface de l’électrode

n = nombre d’électrons échangés (ici égale à 1)

F = Faraday (96484,5 C.mol-1

)

iD = coefficient de diffusion de l’espèce i (DOx = 5,6 x 10-6

cm2.s

-1 et DR = 5,1 x 10

-6 cm

2.s

-1)

iC = concentration de l’espèce i (COx = 5,0 x 10-6

mol.cm-3

et CR = 5,0 x 10-6

mol.cm-3

)

Compte tenu de nos conditions expérimentales (potentiel d’équilibre, concentration

équimolaire du couple rédox CR = COx = C) la constante de transfert de charge standard k0

calculée à l’aide de l’équation (5) est égale à 0,11 cm.s-1

:

tcSCRFn

RTk

22

0 (5)

Avec : R = constante des gaz parfaits

T = température en K

S = surface de l’électrode

n = nombre d’électrons échangés (ici égale à 1)

F = Faraday (96500 C.mol-1

)

C = concentration

Rtc = résistance du transfert de charge

Cette valeur est proche de celle reportée dans la littérature [Ganesh, V. et al., 2006].

c. Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique appliquée aux couches d’accroche

La modification des surfaces par des couches isolantes doit altérer les caractéristiques

impédancemétriques. Dans les mêmes conditions que pour les mesures sur l’électrode d’or nu,

la modélisation des couches obtenues sur les électrodes d’or modifiées à l’aide du modèle de

Randles devrait conduire à :


une augmentation de la taille du demi-cercle aux hautes fréquences due à l’inhibition

du transfert de charge. La variation du transfert de charge est reliée au taux

recouvrement de l’électrode par la relation :

(6)

Avec :

= recouvrement de l’électrode

0

tcR = résistance de transfert de charge mesurée sur l’électrode d’or nu

tcR = résistance de transfert de charge mesurée sur l’électrode modifiée

De plus la constante du transfert de charge apparent k est reliée à la constante du taux

de transfert d’électron standard k0, par la relation :

(7)

une déviation de l’impédance de Warburg selon la dépendance linéaire de ω1/2

, à

basses fréquences, correspondant à une diffusion semi infinie. De telles déviations

sont observées lorsque les défauts ou les trous sur l’électrode sont loins les uns des

autres. Cependant lorsque les trous et les défauts se chevauchent, l’impédance de

Warburg se comporte comme une électrode d’or nu.

La figure 2.11 présente les courbes impédancemétriques, en mode Nyquist, obtenues en

présence de [Fe(CN)6]3-/4-

pour les électrodes modifiées (SAM, protéine G, anti D et GR

sains). Comme attendu, le rayon du demi-cercle augmente vers les hautes fréquences alors

que l’impédance de Warburg se déplace dans les basses fréquences, comparées aux mesures

sur l’or nu. En effet, la résistance de transfert de charge augmente pour les électrodes

modifiées en raison des couches isolantes déposées au fur et à mesure de la construction de

l’édifice moléculaire, qui s’opposent au passage du courant.

tc

tc

R

R0

1

10kk


Rs

Qdc

Rtc ZwRf

Qf

Film RandlesSolution

Rs

Qdc

Rtc ZwRf

Qf


0.0 4.0x103

8.0x103

1.2x104

0

1x103

2x103

3x103

4x103

5x103

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Figure 2.11. Diagrammes de Nyquist obtenu pour une électrode d’or nu (), ou après modification

par dépôts successifs () d’une monocouche auto-assemblée de thiols mixtes, (◄) d’une couche de

protéine G sur des SAMs, () d’une couche d’anti D déposée sur la protéine et () des globules

rouges immobilisés grâce à l’interaction antigènes/anticorps.

Afin de calculer les valeurs des éléments du circuit électrique équivalent, les courbes

impédancemétriques des électrodes modifiées ont été modélisées à l’aide du circuit de

Randles. Comme attendu, ce modèle n’a pas été satisfaisant puisqu’il décrit une électrode

métallique sans tenir compte de la présence du film. Comme le montre la figure 2.11, il

apparaît clairement que la courbe de la protéine G correspond à la superposition de deux demi

cercles. Afin de comparer les caractéristiques électriques de chacune des couches l’une par

rapport à l’autre il est important de choisir un modèle « compatible » avec chacune d’entre

elles. Deux nouveaux circuits électriques équivalents ont été envisagés :

le modèle B qui traduit la nature d’une électrode sandwich comprenant le circuit de

Randles auquel sont adaptés deux nouveaux éléments, une résistance et une capacité

en parallèle, caractérisant la présence du film.

B


le modèle C qui est couramment utilisé dans le domaine de la corrosion pour

représenter l’effet d’une peinture isolante (Rf, Qf) recouvrant l’électrode.

Les meilleures modélisations ont été obtenues avec le modèle B. Les valeurs des composants

correspondant ainsi que les taux de recouvrement sont reportés dans le tableau 2.2. Comme

attendu, les résistances de l’électrolyte Rs sont constantes quelque soit l’étape modélisée

(360 Ω ± 10 Ω).

Tableau 2.2. Valeurs des éléments du circuit électrique équivalent (modèle B) obtenues par modélisation des courbes (Figure 2.11).

Solution Film Transfert d’électron Recouvrement

de la surface

Electrode Rs (Ω) Rf (Ω) Qf (µF.s

n-1)

n Rtc (Ω)

Qdc (µF.sn-1

) n

σW (Ω.s

-1/2)

Θ

Or nu 352 - - 92 3

0,85 607,5 -

SAM 350 4560 0,42

0,97 1904

70

0,60 885 0,952

Protéine G 372 4915 0,37

0,98 4310

31

0,66 1162 0,979

Anti D 371 3325 0,34

0,99 1525

71

0,56 1298 0,940

GR sains 363 8447 0,38 0,97

4562 152 0,51

1724 0,980

Couches d’accroche :

La formation de la monocouche de thiols mixtes (SAM) à la surface de l’électrode induit une

forte augmentation de la résistance de transfert de charge, qui passe de 92 Ω pour l’or nu à

1904 Ω en présence de SAM. Cette importante augmentation provient du caractère isolant de

la couche qui présente en plus un taux de recouvrement important. La valeur calculée du taux

de recouvrement est égale à 95%, valeur proche de celles décrites dans la littérature

[Campuzano, S. et al., 2006, Janek, RP. et al., 1998, Sabatani, E. et al., 1993]. En ce qui

concerne la capacité de double couche Qdc, sa valeur augmente en présence de thiols de

3,12 µF.sn-1

à 70,3 µF.sn-1

. Cette augmentation provient des charges négatives introduites à la

surface de la couche via la présence des groupements carboxylates.

Rs Qdc

Rtc Zw

C

Rf

Qf


Comme dans le cas des thiols, l’ajout de protéine G induit une augmentation de la résistance

de transfert de charge (Rtc = 4310 Ω) en raison d’une augmentation du taux de recouvrement

(97,9%) et donc d’une diminution de la surface de l’électrode (S

dR ). En revanche,

contrairement aux thiols l’ajout de protéine G entraîne une diminution de Qdc (31,0 µF.sn-1

) en

raison du remplacement des fonctions terminales COO- par une liaison peptidique.

L’ajout de l’anticorps entraîne une diminution importante de la résistance de transfert de

charge qui passe de 4310 Ω à 1525 Ω. Cette importante diminution traduit une augmentation

de la surface de l’électrode d’or et donc une désorganisation des couches d’accrochage

conduisant à une diminution du taux de recouvrement (94%). Ce résultat contraste avec ceux

reportés dans la littérature [Yang, L. et al., 2005] où l’anti D augmente de 29% la valeur de la

résistance de transfert de charge.

La modification des électrodes altère également l’impédance de Warburg, en particulier avec

la protéine G et l’anti D pour lesquelles les coefficients de Warburg σw sont 2 fois supérieurs

à ceux de l’or nu. De telles augmentations traduisent le fait que ces deux couches rendent plus

difficile la diffusion des espèces rédox et par conséquent les transferts de matière.

Concernant l’interface électrode/film, la capacité non parfaite Qf est presque constante tandis

que la résistance Rf suit logiquement le comportement de Rtc (couche isolante).

Film cellulaire :

L’ajout du film cellulaire induit de forts changements dans les différents composants

électriques du circuit.

En ce qui concerne Randles, la résistance Rtc est supérieure à celle de toutes les couches, avec

une valeur de 4562 Ω. Cette valeur s’explique par un important taux de recouvrement égal à

98%. Le film cellulaire joue le rôle d’isolant et ralentit par conséquent le passage du courant.

La capacité non parfaite Qdc atteint également une valeur beaucoup plus élevée passant de

71 µF.sn-1

pour l’anticorps à 152 µF.sn-1

pour les érythrocytes. Cette variation pourrait

provenir du fait que les globules rouges sont chargés. La charge des globules rouges

favoriserait ainsi la formation de la double couche. Enfin l’élément de Warburg suit

l’évolution des couches d’accroche et augmente à nouveau, avec une valeur de σ égale à

1724 Ω.s-1/2

. Les cellules sont un nouvel obstacle au transfert de matière rendant plus difficile

la diffusion.

Les caractéristiques du film évoluent également, avec une augmentation logique de la

résistance Rf d’un facteur deux (8447 Ω) du à l’ajout d’une couche isolante supplémentaire.

La capacité non parfaite du film reste stable comme dans le cas des couches d’accroche.

d. Conclusion

Cette étude nous a permis de mettre au point une méthode fiable et reproductible permettant

l’immobilisation de globules rouges sur électrode d’or modifiée par un assemblage complexe

via l’utilisation de liaison antigène/anticorps [Ribaut, C. et al., 2008]. Chaque couche a été

caractérisée par la microbalance à quartz, permettant de mesurer la masse déposée à chaque

étape de la construction de l’édifice moléculaire, ainsi que par spectroscopie d’impédance


électrochimique en utilisant un couple rédox. Les mesures EIS et les modélisations

correspondantes ont permis le calcul des valeurs de chaque composant représentant les

interfaces électrode/film/solution, à chaque étape du procédé de greffage. Le pourcentage de

recouvrement a été calculé à partir de ces valeurs. Les mesures impédancemétriques ont mis

en évidence des différences importantes d’une couche à l’autre. Cette électrode modifiée par

le globule rouge peut donc servir de capteur pour étudier des changements physiologiques

affectant un globule rouge parasité et en particulier pour tenter de différencier l’état sain de

l’état parasité.

3. Caractérisation des changements physiologiques affectant les globules rouges sains et parasités par spectroscopie d’impédance électrochimique

Comme nous l’avons décrit précédemment dans la partie expérimentale, les cultures de

globules rouges parasités ont dans un premier temps dûes être enrichies en globules rouges

parasités à l’aide de colonnes d’affinité magnétique étant donné que les parasitémies des

cultures n’excèdent pas 4 à 8%. Les globules rouges ainsi triés ont été déposés sur les

électrodes préalablement modifiées par l’assemblage SAM/Protéine G/Anti D.

3.1 Concentration des érythrocytes parasités

La propriété de toutes les espèces de Plasmodium de dégrader l’hème (complexe de Fe(II)

diamagnétique) en hémozoïne (complexe de Fe(III) paramagnétique) [Rosenthal, PJ. et al.,

1996] a rendu possible la purification magnétique de culture de globules rouges infectés

[Uhlemann, AC. et al., 2000].

Hème Hémozoïne

Les culture de globules rouges parasités ont été enrichies grâce à des colonnes MACS®

. Des

colonnes sont remplies de nanobilles de fer (50 nm de diamètre) qui sous l’effet d’un champ

magnétique attirent les espèces paramagnétiques, telle que l’hémozoïne. Ainsi lorsqu’une

culture de globules rouges parasités est introduite dans la colonne, les érythrocytes parasités

sont retenus préférentiellement par rapport aux globules rouges sains qui sont élués. Le

rendement est supérieur à 90% [Ribaut, C. et al., 2008]. Cette méthode chromatographique

reproductible ne détériore pas les érythrocytes et a permis de travailler sur des échantillons

d‘érythrocytes à forte parasitémie comme le montre les photos des frottis obtenus avant et

après enrichissement (dépôt sur lame de verre puis coloration au giemsa)

Fe

N

N

N

N

COOH

CH

CH2

CH3HC

CH2

H3C

HC

H3C

HOOC

CH


(a) (b)

Photo 2.2. Frottis de culture de globules rouges (a) avant enrichissement (b) après enrichissement en

globules rouges parasités.

3.2 Mesures d’impédance en absence de couple rédox

Les analyses de spectroscopie d‘impédance réalisées en présence d’une sonde rédox ont

permis d’accéder au taux de recouvrement et au caractère plus ou moins isolant des

différentes couches y compris des couches cellulaires. Afin d’obtenir des informations sur les

espèces rédox provenant des couches cellulaires elles-mêmes, des manipulations identiques

sont réalisées en l’absence de sonde. Dans ce cas, les manipulations ont été réalisées dans le

milieu de culture (RPMI complémenté avec de l’hépès) au potentiel d’équilibre de

l’électrolyte, avec une amplitude de 10 mV pour une gamme de fréquences de 50 kHz à

100 mHz.

Il est important de mentionner que de grandes différences dans les potentiels d’équilibre ont

été enregistrées pour des globules rouges sains (E0 = 60 ± 20 mV) et parasités

(E0 = - 140 ± 50 mV). Le potentiel d’équilibre est un potentiel mixte correspondant à la

somme des potentiels d’équilibre du couple rédox le plus oxydant et le plus réducteur. Le

déplacement cathodique (200 mV) du potentiel d’équilibre entre les érythrocytes sains et

parasités implique l’apparition d’un nouveau réducteur (Figure 2.12).


Rs

Qdc

Rtc ZwRf

Qf


Rs

Qdc

Rtc ZwRf

Qf


Figure 2.12. Schéma des courbes d’oxydation et de réduction dans un milieu de culture

La figure 2.13 présente les différents diagrammes de Nyquist obtenus après greffage de

chacune des couches d’accrochages et de la couche cellulaire. Il apparaît clairement que la

couche cellulaire induit un important changement des caractéristiques électriques de

l’interface par rapport au film d’accroche.

0.0 5.0x105

1.0x106

1.5x106

0

1x106

2x106

3x106

4x106

-ZI (

Oh

m)

ZR (Ohm)

Figure 2.13. Diagrammes de Nyquist obtenu pour une électrode d’or nu (), ou après modification

par dépôts successifs, () d’une monocouche auto-assemblée de thiols mixtes, () d’une couche de

protéine G sur des SAMs, () d’une couche d’anti D déposée sur la protéine, () de globules rouges

sains et () de globules rouges parasités immobilisés grâce à l’interaction antigènes/anticorps.

H2O O2

Eeq GR sains

Eeq GR parasités

E

Nouveau réducteur

H2O O2

Eeq GR sains

Eeq GR parasités

E

Nouveau réducteur


Dans le but d’obtenir des informations sur les propriétés électriques des érythrocytes parasités

par rapport aux érythrocytes sains, les courbes impédancemétriques ont été modélisées selon

le circuit électrique B. En absence de sonde rédox, les diagrammes de Nyquist obtenus avec

les cellules présentent non plus un demi cercle suivi de la droite de Warburg mais dessine un

début de demi cercle. Dans le cas de globules rouges parasités le rayon du cercle est inférieur

à celui obtenu pour les globules rouges sains.

Les modélisations sont présentées sur la figure 2.14. Les valeurs des composants électriques

correspondants obtenus pour des expériences réalisées le même jour sur quatre électrodes

modifiées (quatre avec des globules rouges sains et quatre avec des globules rouges parasités)

sont résumées dans le tableau 2.3.

0.0 5.0x105

1.0x106

1.5x106

0.0

5.0x105

1.0x106

1.5x106

-ZI (

Oh

m)

ZR (Ohm)

Figure 2.14. Diagrammes de Nyquist obtenus pour des globules rouges sains () et parasités (), en

absence de couple rédox. Les points correspondent aux valeurs expérimentales et le trait plein à la

modélisation.

La résistance de l’électrolyte Rs est logiquement constante quelque soit l’état du globule

rouge. La modélisation donne une valeur moyenne de 470 Ω.

78

Tableau 2.3. Moyenne et écart type des composants du circuit électrique équivalent (modèle B) modélisés à partir des courbes présentées figure 2.14.

Chap

itre 2 –

Bio

capteu

r Glo

bule ro

uge/P

lasm

odiu

m

Rs (Ω) Qf (µF.sn-1

) n Rf (KΩ) Qdc (µF.sn-1

) n Rtc (MΩ) σ (Ω.s-1/2

)

GR sains 470 ± 1 8 ± 0,8 0,9 ± 0,09 22 ± 10 0,65 ± 0,04

0,94 ± 0,004 2 ± 0,5 400 000 ±

500 00

GR parasités 470 ± 1 4 ± 1 0,9 ± 0,05 12 ± 5 0,65 ± 0,02

0,9 ± 0,03 1 ± 0,6 810 000 ±

1 250 000


a. Caractéristiques du film

La capacité non parfaite du film Qf diminue d’un facteur deux entre les globules rouges sains

(8 µF.sn-1

) et les globules rouges parasités (4 µF.sn-1

). D’un point de vue électrique, la capacité

du film peut être considérée comme l’addition en série de la capacité de chaque couche. La

capacité du film est alors donnée par la relation :

(8)

Par conséquent, une diminution de Qfilm correspond à une diminution de QGR pour les

érythrocytes parasités par rapport aux sains. Cette diminution pourrait provenir des

changements induits par l’infection puisqu’après l’invasion, Plasmodium falciparum débute

une série de réarrangements morphologiques dans le cytoplasme de la cellule hôte.

L’érythrocyte mature devient alors un sac flottant d’hémoglobine exempt de protéines

endogènes [Tilley, L. et al., 2008]. Ces importants changements dans le cytoplasme et la

membrane de la cellule hôte pourrait induire une variation de la constante diélectrique de la

couche cellulaire, et donc de la capacité du film :

d

C r 0 (9)

Avec :

C : capacité

: constante diélectrique

d : épaisseur

La résistance du film Rf diminue pour les érythrocytes parasités par rapport aux sains de

22 KΩ à 12 KΩ. Cette évolution pourrait également résulter des changements importants se

produisant dans la membrane cellulaire provoqués par l’infection. Pour survivre dans le

globule rouge, le parasite altère la perméabilité de la membrane de la cellule pour se nourrir

de nutriments. Le pathogène perméabilise les érythrocytes hôtes pour une large variété de

substances [Ginsburg, H. et al., 1983, Kutner, S. et al., 1982], incluant des anions [Kirk, K.,

2001] et des cations [Kirk, K. et al., 1994] organiques et inorganiques, des carbohydrates, des

amino acides, des nucléosides et des petits peptides. Plasmodium induit une perturbation

importante des concentrations cytosoliques en Na+ et K

+. Les globules rouges sains

maintiennent une forte concentration intracellulaire de K+ et une faible concentration de Na

+.

Les ions Na+ sont rejetés hors de la cellule alors que les ions K

+ sont attirés dans la cellule,

générant ainsi un gradient de concentration opposé pour les deux ions induisant un équilibre

cytoplasmique [Na+] / [K

+] (Figure 2.15.a). Le parasite induit chez la cellule hôte une

augmentation de la concentration en Na+ en ouvrant les canaux (Figure 2.15.b).

La perturbation de la composition ionique due au parasite dans la cellule pourrait expliquer

les changements de la résistance du film, la couche cellulaire étant moins isolante.

GRADPGSAMsfilm QQQQQ11111

Chapitre 2 – Biocapteur Globule rouge/Plasmodium 80 80

Membrane

cytoplasmique

Compartiment

extracellulaire

Compartiment

intracellulaire

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

Canal à K+

Canal à Na+

Na+

K+

Na+

K+

Membrane

cytoplasmique

Compartiment

extracellulaire

Compartiment

intracellulaire

Na+Na+ Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

Canal à K+

Canal à Na+

Na+Na+

K+K+

Na+Na+

K+K+

Membrane

cytoplasmique

Compartiment

extracellulaire

Compartiment

intracellulaire

Na+ Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

K+

Canal à K+

Canal à Na+

Na+

K+

Na+

K+

Membrane

cytoplasmique

Compartiment

extracellulaire

Compartiment

intracellulaire

Na+Na+ Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

Na+Na+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

K+K+

Canal à K+

Canal à Na+

Na+Na+

K+K+

Na+Na+

K+K+

a) Cellule saine avec une concentration intracellulaire élevée en K

+, et une concentration

extracellulaire élevée en Na+ induisant un équilibre cytoplasmique.

b) Cellule parasitée avec un déséquilibre cytoplasmique induit par une augmentation de la

concentration intracellulaire en Na+.

Figure 2.15. Schéma de la membrane cytoplasmique et de ses pompes Na

+/K

+,

pour une cellule saine (a) et une cellule parasitée (b).


H2O O2

Eeq GR sains

Eeq GR parasités

GR sainsGR parasités

Ei0i0

H2O O2

Eeq GR sains

Eeq GR parasités

GR sainsGR parasités

Ei0i0

b. Caractéristiques interface film/solution

En ce qui concerne l’impédance électrochimique du circuit de Randles, la capacité non

parfaite de double couche Qdc est la même pour les érythrocytes sains et parasités

(0,65 µF.sn-1

) alors que la résistance de transfert de charge Rct diminue de 2 à 1 MΩ.

Une réduction de la résistance de transfert de charge implique une augmentation du courant

d’échange i0 [Bard, AJ. et al., 2001] avec i0 = iox = - ired, au potentiel d’équilibre. Par

conséquent, une augmentation de i0 est nécessairement liée à une augmentation de iox et ired.

ctnFR

RTi 0 (10)

Avec :

i0 : courant d’échange


T : température en Kelvin

n : nombre d’électrons échangés


Rct : résistance du transfert de charge

Figure 2.16. Schéma des courbes d’oxydation et de réduction dans un milieu de culture.

Le dioxygène étant toujours présent, il correspond à l’espèce oxydante (Figure 2.16) alors que

l’espèce réductrice semble provenir du globule rouge puisque aucun courant n’est produit

dans du milieu de culture en absence de globules rouges. Le courant de réduction ired provient

donc de la réduction de O2. L’augmentation de ired est liée au déplacement cathodique du

potentiel d’équilibre enregistré pour les globules rouges parasités. Cependant, selon la loi de

Tafel (11) un déplacement de 200 mV du potentiel d’équilibre devrait induire une

augmentation de i0 d’un facteur 40, alors que dans notre cas le courant n’augmente que d’un

facteur deux.


iba log (11)

Avec :

η : surtension

i : courant

a et b : paramètres caractéristiques de la réaction et de l’électrode

Cette différence implique que la concentration en O2 du milieu diminue pour les globules

rouges parasités en comparaison des globules rouges sains (courbe en pointillée grise). Ce

résultat est en accord avec la littérature puisque Murphy et al. ont démontré que la

consommation d’oxygène était de 0,1 nmole/min pour les érythrocytes sains contre

2,2 nmole/min pour les globules rouges parasités [Murphy, AD. et al., 1997].

En ce qui concerne iox, une augmentation du courant d’oxydation associé à un déplacement du

potentiel d’équilibre vers le potentiel cathodique implique, premièrement que l’espèce

réductrice responsable de iox soit différente pour les globules rouges parasités par rapport aux

sains, et deuxièmement que l’oxydation de ce réducteur ait lieu à un potentiel plus faible

(courbe pointillée noire). Ce nouveau réducteur proviendrait des espèces produites par le

parasite ou induites par l’infection. Ces espèces pourraient correspondre à l’acide lactique qui

s’oxyderait en acide pyruvique. En effet, les globules rouges infectés ont une activité

glycolytique 100 fois plus intense pour satisfaire leurs besoins énergétiques [Elliott, JL. et al.,

2001], et par conséquent transforment une quantité plus importante de glucose en acide

lactique. Selon le stade de développement, les globules rouges parasités produisent entre 5 et

100 fois plus d’acide lactique en comparaison d’érythrocytes sains cultivés dans les mêmes

conditions [Zolg, JW. et al., 1984]. Cette augmentation d’activité devrait mener à une

accumulation d’acide lactique dans le cytosol du parasite et par conséquent menacer la

stabilité osmotique de la cellule (diminution du pH intracellulaire). Pour cette raison le

parasite libère l’acide lactique de son cytosol vers celui de la cellule hôte, menant ainsi à une

augmentation de la concentration en acide lactique dans le globule rouge.

Cependant, les mesures ayant été réalisées sur des globules rouges à l’état schizonte

correspondant à la dernière étape du cycle érythrocytaire, précédent la rupture membranaire

(cf. chapitre 1, § 1.1), il est possible que de faibles quantités d’acide lactique soient présentes

à l’extérieur du globule rouge. Le milieu extracellulaire pourrait donc contenir de l’acide

lactique en faible quantité, détectable par EIS.

Une autre source d’espèces réductrices provenant du parasite pourrait également être l’hème

(Fe(II)). Pour subvenir à son développement rapide, le parasite digère l’hémoglobine de la

cellule hôte. Tandis que l’hydrolyse de l’hémoglobine mène à la production d’acides aminés

disponibles pour le développement du parasite, ce procédé libère également de l’hème,

extrêmement toxique pour le parasite. 75% de l’hème est détoxifiée par le parasite par la

conversion en une espèce cristalline insoluble appelée hémozoine [Egan, TJ. et al., 2002,

Pagola, S. et al., 2000]. Les 25% restant semblent être dégradés par un procédé non-

enzymatique conduisant à l’accumulation de fer dans le cytoplasme du parasite. En dépit des

différentes voies de détoxification de l’hème par dégradation, réaction avec le glutathion ou

avec le peroxyde d’hydrogène, il est possible qu’une faible quantité échappe à ces procédés de

neutralisation et soit détectée en tant qu’espèces réductrices par le biocapteur EIS.

Enfin, le dernier élément du circuit de Randles, σ, augmente pour les érythrocytes infectés par

rapport aux globules rouges sains. Comme l’illustre l’équation 12 donnée pour un simple

couple rédox, une augmentation de σ provient d’une diminution de la concentration de


l’espèce oxydante et/ou réductrice. Dans notre cas l’augmentation de σ serait due à la

diminution de la concentration de l’oxydant O2.

(12)

Avec :

n : nombre d’électron


S : surface de l’électrode

Ci : concentration de l’espèce i

Di : coefficient de diffusion de l’espèce i

3.3 Mesures de stabilité du biocapteur cellulaire

Afin d’évaluer la stabilité de la couche cellulaire, des expériences de spectroscopie

d’impédance ont été réalisées sur de longues périodes pour des globules rouges sains dans le

milieu de culture (RPMI complémenté avec 12,5% d’hépès). Les analyses ont été réalisées

pour des fréquences variant de 50 kHz à 100 mHz, pour dix balayages successifs.

Les spectres impédancemétriques en mode Nyquist correspondant sont présentés sur la figure

2.17. Les spectres révèlent une évolution du signal dans le temps. Ces courbes mettent

clairement en évidence une diminution de l’impédance réelle et de l’impédance imaginaire

(augmentation de – ZI). Une rapide analyse des courbes permet de montrer que ces variations

d’impédance sont liées à une diminution de la capacité et de la résistance du film. Ces

changements pourraient provenir du décrochage des globules rouges qui induirait d’une part

une diminution de la résistance et, d’autre part une diminution de l’épaisseur et donc de la

capacité du film (d

SC

). Il semblerait que l’évolution du signal tende à se rapprocher de la

courbe obtenue en absence de cellules.

Avec :

C = capacité

S = surface de l’électrode constante

= constante diélectrique

d = épaisseur du diélectrique

2/12/122

11

2 RROO DCDCSFn

RT


t

0.0 2.0x105

4.0x105

6.0x105

8.0x105

0

1x106

2x106

3x106

4x106

-ZI (

ohm

)

ZR (ohm)

t

0.0 2.0x105

4.0x105

6.0x105

8.0x105

0

1x106

2x106

3x106

4x106

-ZI (

ohm

)

ZR (ohm)

Figure 2.17. Spectres impédancemétriques, en mode Nyquist, obtenus pour des électrodes

Au/SAM/PG/AD/GR enregistrés pour 10 balayages successifs.

Conclusion

Ce travail démontre pour la première fois la possibilité de réaliser des mesures par

spectroscopie d’impédance électrochimique sur des globules rouges adsorbés sur une

électrode d’or pour une caractérisation globale des changements physiologiques affectant la

cellule après invasion par Plasmodium falciparum. Cette technique permet, grâce à l’étude

d’érythrocytes parasités au dernier stade du développement, de mettre en évidence des

évènements spécifiques ayant lieu après l’invasion du globule rouge par Plasmodium, comme

la perméabilisation de la membrane cellulaire, le relargage d’espèces réductrices ainsi que

l’augmentation de la consommation d’oxygène.

De nouvelles études pourraient être envisagées pour examiner l’application de ce nouveau

biocapteur telle que : i) la différentiation des érythrocytes parasités par rapport aux sains à

chaque étape du développement du parasite, ii) la comparaison de la réponse cellulaire en

présence d’antipaludiques de références ou de nouvelles molécules sur des globules rouges

sains et infectés, iii) la compréhension des évènements se déroulant pendant les différents

stades de développement du parasite lors d’ajout d’antipaludiques connus.


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Chapitre 3

Biocapteur

Macrophage / Leishmania

89

Chapitre 3

Biocapteur

Macrophage / Leishmania

Chapitre 3 – Biocapteur Macrophage/Leishmania 90


Sommaire

Introduction ........................................................................................................................ 93

Partie expérimentale........................................................................................................... 95

1. Matériels ............................................................................................................................. 95

2. Méthodes............................................................................................................................. 95 2.1 Culture des macrophages .............................................................................................................. 95 2.2 Culture des Leishmania amazonensis promastigotes ...................................................................... 95 2.3 Dépôt des cellules sur les électrodes d’or ...................................................................................... 95 2.4 Stimulation et infection des macrophages ...................................................................................... 96 2.5 Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS) ....................................................... 96

Résultats et discussion ........................................................................................................ 97

1. Modification et caractérisation des électrodes modifiées .................................................. 97

2. Optimisation des couches cellulaires .................................................................................. 99 2.1 Influence du temps d’incubation sur la reproductibilité des dépôts ................................................. 99

3. Effet de l’infection des macrophages par Leishmania amazonensis ................................ 100 3.1 Mesures par spectroscopie d’impédance électrochimique..............................................................100 3.2 Modélisations en circuit électrique équivalent ..............................................................................102

3.2.1 Interprétation des résultats ..................................................................................................107 a. Caractéristiques du film ......................................................................................................107 b. Caractéristiques de l’interface film/solution : Qdc.................................................................108 c. Caractéristiques de la couche cellulaire : Rads et Cads ............................................................109 d. Caractéristiques de l’interface film/solution : Rtc et σ ...........................................................109 e. Conclusion .........................................................................................................................110

4. Effet de la stimulation des macrophages par ajout de LPS............................................. 111 4.1 Mesure par spectroscopie d‘impédance électrochimique ...............................................................111 4.2 Modélisations en circuit électrique équivalent ..............................................................................112

a. Caractéristiques du film ......................................................................................................114 b. Caractéristiques de l’interface film/solution : Qdc.................................................................114 c. Caractéristiques de la couche cellulaire : Rads et Cads ............................................................114 d. Caractéristiques interface film/solution : Rtc et σ .................................................................115 e. Nouvelles mesures en présence de LPS dans la cellule électrochimique ...............................115 f. Conclusion .........................................................................................................................115

Conclusion ........................................................................................................................ 116

Références ......................................................................................................................... 117


Introduction

Etant donné les résultats encourageants obtenus avec le biocapteur cellulaire

impédancemétrique basé sur des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum, ce

système a été appliqué à d’autres types de cellules. Le deuxième modèle cellulaire étudié dans

ce travail par spectroscopie d’impédance électrochimique est basé sur des macrophages.

Les macrophages sont des cellules adhérentes qui participent au système de défense

immunitaire. Elles sont connues pour participer aux fonctions physiologiques et protectrices,

en particulier pour leur implication dans la régulation des inflammations et de la réponse

immunitaire par la production variée de médiateurs inflammatoires, incluant les cytokines, les

espèces réactives de l’oxygène (ERO) ainsi que le monoxyde d’azote (•NO).

Les macrophages sont les cellules hôtes de Leishmania, agent parasitaire de la leishmaniose.

La leishmaniose est une maladie parasitaire présente dans 88 pays, dont 72 comptent parmi

les plus pauvres du monde [Davies, CR. et al., 2003]. Deux millions de nouveaux cas chez

l’homme sont recensés chaque année ce qui élève la population mondiale infectée à

12 millions [Croft, SL. et al., 2006]. Les parasites à l’état promastigote (chez l’insecte) sont

phagocytés par les macrophages où ils sont soumis à un stress oxydant en raison de la

production d’espèces réactives oxygénées et azotées produites par le macrophage pour

détruire le parasite. Malgré la toxicité des ces espèces délétères, des parasites survivent et se

transforment en amastigote [Bhattacharya, A. et al., 2008], permettant au parasite de se

multiplier jusqu’à libération extracellulaire des Leishmania menant à la mort de la cellule.

La production par les macrophages d’espèces réactives, telle que les radicaux oxygénés et

azotés, a déjà été démontrée. En particulier, la production de •NO a été mise en évidence par

différentes méthodes telles que la réaction de Griess [Winberg, EM. et al., 2007], les analyses

Western blot [Cherng, SC. et al., 2007], le test ELISA [Ferret, PJ. et al., 2002], la microscopie

immunofluorescente [Underhill, DM. et al., 1998], les essais par électromobilité de gel [Lee,

JW. et al., 2007], les électroporations [Stacey, KJ. et al., 1993] et les mesures

électrochimiques [Villeneuve, N. et al., 1998], ou par résonance paramagnétique électronique

[Loibl, S. et al., 2002]. Comme pour les globules rouges (cf. Chapitre 2), le but de ce travail

est d’étudier les changements physiologiques affectant la cellule parasitée avec l’espoir de

mettre en évidence le stress oxydant très important généré avec le modèle

macrophage/parasite.

Ce chapitre présente les résultats obtenus grâce au biocapteur cellulaire incluant les

macrophages (RAW 264.7) comme cellules reconnaissantes. Les études ont été réalisées sur

des cellules parasitées par Leishmania amazonensis, système hôte/parasite étudié et cultivé

dans l’UMR 152. Afin de mimer l’agression des microorganismes, des expériences ont

également été réalisées sur des cellules stimulées in vitro par l’ajout de lipopolysaccharide

(LPS). En effet, le LPS est connu comme un des activateurs les plus puissants induisant la

production endogène de •NO [Stuehr, DJ. et al., 1987].



1. Matériels

Le ferrocyanure de potassium (ref : 26 816.298) et l’éthanol absolu (ref : 20 820.362) sont

fournis par VWR Prolabo. Le ferricyanure de potassium provient de Merck (ref : 4973).

L’acide sulfurique (ref : 7664-93-9) provient de Fisher Scientific. Le RPMI (ref : BE12-

702F), le Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM, ref : BE12-719F), le bicarbonate de

sodium à 7,5% (ref : BE17-613E), la L-glutamine à 200 mM (ref : BE17-605E) et le sérum de

veau (ref : DE14-801E) sont fournis par LONZA. Le D-(+)-glucose (ref : G6152), le

peroxyde d’hydrogène (ref : H1009) et le lipopolysaccharide (LPS) (ref : L4391) proviennent

de Sigma-Aldrich. Les grattoirs (Iwaki) utilisés pour décrocher les RAW (ref : 9010320) sont

fournis par Starlab.

2. Méthodes

2.1 Culture des macrophages

Les macrophages de souris (RAW 264.7, fournis par l’IFR31 Institut de Médecine

Moléculaire de Rangueil, Toulouse) sont maintenus à 37 °C sous une atmosphère contenant

5% de CO2, dans du milieu de culture contenant du Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

(DMEM) complémenté avec 1,5 g/L de bicarbonate de sodium, 4,5 g/L de D-glucose, 4 mM

de L-glutamine et 10% de sérum de veau décomplémenté. Les cellules sont décrochées à

l’aide d’un grattoir puis centrifugées (1600 rpm pendant 5 minutes). Le comptage des RAW

est réalisé sur des cellules de Malassez, au microscope optique (x 40), après une dilution par

10 dans du bleu trypan qui colore les cellules mortes et permet ainsi de calculer le

pourcentage de cellules viables.

2.2 Culture des Leishmania amazonensis promastigotes

Les parasites sont maintenus à 25 °C dans le milieu de culture contenant du RPMI

complémenté avec 10% de sérum de veau décomplémenté. Le comptage des cellules est

réalisé sur des cellules de Malassez, pour deux dilutions différentes (au 10ème

et au 100ème

)

dans du bleu trypan.

2.3 Dépôt des cellules sur les électrodes d’or

Les dépôts sont réalisés sur des électrodes rectangulaires de type 1 (1 x 1,5 cm) (cf. Chapitre

2). Les électrodes sont soigneusement lavées par immersions successives dans de l’éthanol

95%, de l’acétone et dans une solution de Piranha (70% H2SO4 / 30% H2O2) puis rincées à


l’eau distillée et séchées sous argon. Les électrodes sont ensuite rincées à l’éthanol absolu

puis déposées dans des boîtes de Petri stériles et séchées en condition stérile. Les électrodes

sont ensuite immergées dans une solution contenant 10 millions de RAW dans un volume de

8 mL de milieu de culture. Après 24 heures d’incubation à 37 °C sous une atmosphère

contenant 5% de CO2, les électrodes sont rincées avec le milieu de culture.

2.4 Stimulation et infection des macrophages

La stimulation des macrophages a lieu dans les boîtes de Petri contenant les électrodes

recouvertes de macrophages en ajoutant au milieu de culture une solution de

lipopolysaccharide (LPS) 12 µg/mL dans du tampon EBSS stérile. Les mesures sont ensuite

réalisées après 24 heures d’incubation à 37 °C sous une atmosphère contenant 5% de CO2.

L’infection des macrophages est réalisée en immergeant l’électrode modifiée dans du milieu

de culture contenant 50 millions de parasite Leishmania amazonensis sous la forme

promastigote. Après quatre heures d’incubation à 37 °C sous une atmosphère contenant 5% de

CO2, les électrodes sont abondamment rincées au PBS stérile.

2.5 Mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS)

Les mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique sont conduites en présence ou

non de la sonde [Fe(CN)6]3-/4-

suivant le protocole décrit dans le chapitre 2 (§ 2.3).


500 1000 1500 2000

0

300

600

900 RAW sains

Or nu

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Demi-cercle

Droite

500 1000 1500 2000

0

300

600

900 RAW sains

Or nu

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Demi-cercle

Droite


1. Modification et caractérisation des électrodes modifiées

La propriété d’adhérence des macrophages (RAW) permet de déposer les cellules sur la

surface d’or sans aucune modification préalable, évitant ainsi les incertitudes liées aux

couches d’accroche. La construction de l’électrode modifiée se limite à immobiliser les RAW

sur l’or par simple immersion des électrodes dans une solution contenant 10 millions de

RAW. La reproductibilité des dépôts dépend ainsi de la nature des RAW et de leur nombre.

Les cellules ne proviennent pas de donneurs, comme dans le cas des érythrocytes, mais sont

cultivées in vitro. Cependant, les premières analyses impédancemétriques ont mis en évidence

des différences importantes en fonction de l’âge des cellules. Par conséquent chaque série de

manipulation est réalisée le même jour afin de pouvoir comparer les différents résultats entre

eux.

La figure 3.1 présente les diagrammes de Nyquist obtenus pour une électrode d’or et une

électrode recouverte de macrophages, en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

.

Figure 3.1. Diagrammes de Nyquist obtenus en présence du couple rédox [Fe(CN)6]

3-/4-, pour une

électrode d’or nu ( ), et une électrode d’or recouverte de RAW sains (■).

Comme il l’a été décrit dans le chapitre 2 (§2) l’électrode d’or nu présente un diagramme de

Nyquist classique composé d’un demi-cercle suivi d’une droite de pente égale à un. Les

valeurs de différents composants du circuit équivalent de Randles (Figure 3.2) sont

représentées dans le tableau 3.1.


Rs

Cdc

Rtc Zw

Rs

Cdc

Rtc Zw

Figure 3.2. Circuit électrique de Randles.

La présence des cellules sur l’électrode engendre une modification importante de l’allure du

signal. En effet, le diagramme obtenu pour une électrode recouverte de macrophages

comporte deux demi-cercles suivis d’une droite (schématisés en pointillés sur le diagramme

de Nyquist figure 3.1).

Comme dans le cas des globules rouges, les diagrammes de Nyquist pour les électrodes

recouvertes de cellules ont été modélisés à l’aide du circuit électrique modèle B (Figure 3.3).

Figure 3.3. Circuit électrique équivalent B type sandwich.

Les résultats des modélisations sont présentés dans le tableau 3.1.

Tableau 3.1. Valeurs des composants du circuit électrique équivalent modèle B modélisées pour une

électrode d’or nu et modifiée par des RAW, mesurés en présence d’un couple rédox [Fe(CN)6]3-/4-

.

Rs (Ω) Qf (F) n Rf (Ω) Qdc (F) n Rtc (Ω) σ

(Ω.s-1/2

)

Or nu 325 -

- - 3. 10-6

0.9 300

740

RAW 325 3. 10-5

0,71 50 2 ,2. 10-4

0.59 4 000

285

Les mesures ayant été réalisées dans les mêmes conditions, la résistance d’électrolyte est

logiquement identique avec une valeur égale à 325 Ω.

La valeur de la capacité de double couche Qdc pour l’or nu égale à 3 µF équivaut à 50 µF/cm2

ce qui correspond à une capacité normale. La valeur de Qdc obtenue pour l’électrode

recouverte de macrophages est quand à elle très élevée atteignant 220 µF, soit 70 fois la

Rs

Qdc

Rtc ZwRf

Qf


Rs

Qdc

Rtc ZwRf

Qf



valeur de l’or nu, traduisant un séparation de charge très forte. Pour comparaison la capacité

de double couche calculée pour les globules rouges était 50 fois plus faible. La capacité Qdc

obtenue pour la SAM formant une monocouche isolante, était également 25 fois plus petite.

La faible valeur du coefficient de rugosité n égal à 0,59, dans le cas des macrophages,

explique en partie cette forte valeur de Qdc pour les macrophages sains dans [Fe(CN)6]3-/4-

.

Comme le montre les diagrammes de Nyquist, le diamètre du deuxième demi-cercle de la

courbe mesurée en présence de RAW, est beaucoup plus grand que celui de l’or nu. La valeur

de la résistance de transfert de charge Rtc, qui correspond au diamètre du demi-cercle, est

égale à 4000 Ω en présence de RAW contre 300 Ω pour l’or nu. Cette augmentation est due

au caractère isolant du film cellulaire empêchant par conséquent la sonde de se réduire ou de

s’oxyder à la surface de l’électrode. Le taux de recouvrement de la couche de macrophages

calculé à partir des résistances de transfert de charge de l’or nu et de l’or recouvert de cellules

(cf. Chapitre 2 §2.2) est de 93%.

Le coefficient de Warburg σ est faible pour les RAW sains avec une valeur égale à 285 Ω.s-1/2

contre 700 Ω.s-1/2

pour l’or nu. Les valeurs de σ obtenues traduisent de manière surprenante

une meilleure diffusion des espèces en présence de cellules.

2. Optimisation des couches cellulaires

Le dépôt de macrophages se fait par immersion des électrodes dans le milieu de culture

contenant des macrophages en suspension qui se redéposent par la suite sur la surface des

électrodes pour former une couche cellulaire. Afin d’optimiser les dépôts et de déterminer le

temps d’incubation permettant d’obtenir de manière reproductible une couche cellulaire la

plus uniforme possible, des mesures de spectroscopie d’impédance ont été mises en œuvre

pour deux temps d’incubation différents.

2.1 Influence du temps d’incubation sur la reproductibilité des dépôts

Les analyses de spectroscopie d’impédance électrochimique ont été réalisées sur des

électrodes modifiées par des macrophages pour deux temps d’incubation : 2 heures et

24 heures. La figure 3.4 présente les diagrammes de Nyquist correspondants réalisés pour

quatre électrodes.


200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

0

200

400

600

800

1000-Z

I (o

hm

)

ZR (ohm)

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

0

200

400

600

800

1000

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

(a) 2 heures (b) 24 heures

Figure 3.4. Diagrammes de Nyquist, obtenus pour des électrodes recouvertes de RAW, en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

pour (a) 2 heures et (b) 24 heures d’incubation.

Comme le montre les figures 3.4.a et 3.4.b, il apparaît clairement qu’une meilleure

reproductibilité des dépôts est obtenue pour un temps d’incubation de 24 heures. En effet,

dans ce cas les diagrammes sont très proches alors que des écarts apparaissent pour un temps

d’incubation plus court. La différence provient de la résistance de transfert de charge Rct,

représentée par le deuxième demi-cercle, qui différe pour un temps d’incubation de deux

heures traduisant une variation du recouvrement.

Compte tenu des résultats, les manipulations ont été réalisées pour des temps d’incubation de

24 heures.

Les dépôts des macrophages ayant été optimisés, des mesures de spectroscopie d’impédance

ont été mises en œuvre sur ces mêmes couches pour des macrophages ayant été préalablement

parasités par Leishmania amazonensis.

3. Effet de l’infection des macrophages par Leishmania amazonensis

Le parasite Leishmania amazonensis appartient à la famille des leishmanioses cutanées. Le

parasite à son état promastigote infecte les macrophages par phagocytose et se transforme

ensuite à l’état amastigote, moment où la maladie se déclare [Alexander, J. et al., 1992]. Cette

infection provoque chez la cellule hôte de fortes perturbations liées d’une part, au

développement du parasite et d’autre part, aux défenses de la cellule hôte. La cellule et le

parasite sont alors soumis à un fort stress oxydant. Afin de distinguer les deux états

cellulaires, les expériences ont été réalisées sur des macrophages sains et parasités.

3.1 Mesures par spectroscopie d’impédance électrochimique

Des électrodes préalablement modifiées avec des macrophages ont été mises en contact avec

des parasites (Leishmania). Après incubation, les électrodes sont utilisées comme électrodes


0 1000 2000 3000

0

500

1000

RAW sains

RAW parasités par Leishmania Amazonensis

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Demi-cercle

Droite

0 1000 2000 3000

0

500

1000

RAW sains


-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Demi-cercle

Droite

de travail pour des mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique. Les expériences

sont effectuées au potentiel d’équilibre avec une amplitude de 5 mV et pour une fréquence

variant de 50 kHz à 100 mHz dans deux électrolytes : i) en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

à 5 mM

dans du PBS à pH 7,4 et ii) dans le milieu de culture.

Dans l’électrolyte contenant [Fe(CN)6]3-/4-

, le potentiel d’équilibre est égal à 150 mV tandis

qu’en absence de couple rédox, dans le milieu de culture, le potentiel d’équilibre se stabilise à

– 100 mV. Contrairement aux globules rouges, l’infection n’engendre aucune modification du

potentiel d’équilibre.

La figure 3.5 correspond aux mesures réalisées avec la sonde [Fe(CN)6]3-/4-

en présence de

macrophages sains et parasités. L’infection par Leishmania induit un changement important

de la réponse du biocapteur. En effet, dans le cas des macrophages parasités le diagramme de

Nyquist ne fait plus qu’apparaître le début d’un demi-cercle suivi d’une droite, comme dans le

cas de l’or nu, alors que le diagramme de Nyquist des cellules saines dessine deux demi-

cercles, comme le schématise les courbes en pointillés.

Figure 3.5. Diagrammes de Nyquist obtenus, en présence de [Fe(CN)6]

3-/4-, pour des électrodes

recouvertes de macrophages sains (■) et parasités par Leishmania amazonensis ( ).

Afin d’obtenir des renseignements sur les propriétés rédox intrinsèques de la couche

cellulaire, les mêmes analyses ont été réalisées en l’absence de sonde. Les résultats

correspondants sont présentés sur la figure 3.6. Dans le cas de RAW sains, le diagramme de

Nyquist dessine le début d’un demi-cercle alors qu’après l’infection, le diamètre du demi-

cercle est plus petit et laisse apparaître la droite de Warburg.


0.0 8.0x104

1.6x105

2.4x105

3.2x105

0.0

8.0x104

1.6x105

2.4x105

3.2x105

4.0x105

RAW sains


-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Demi-cercle

Droite

0.0 8.0x104

1.6x105

2.4x105

3.2x105

0.0

8.0x104

1.6x105

2.4x105

3.2x105

4.0x105

RAW sains


-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

Demi-cercle

Droite

Figure 3.6. Diagrammes de Nyquist obtenus en l’absence de sonde, pour des électrodes

recouvertes de macrophages sains (■) et parasités par Leishmania amazonensis ( ).

3.2 Modélisations en circuit électrique équivalent

Les modélisations ont été réalisées pour des expériences effectuées le même jour pour une

série de quatre électrodes (quatre électrodes avec des RAW sains et quatre électrodes avec des

RAW parasités). Les moyennes et écarts types des valeurs de chaque composant du circuit

électrique équivalent correspondant au modèle B ont été calculés et rapportés dans les

tableaux 3.2 et 3.3 respectivement pour les mesures réalisées avec et sans sonde.

103

Tableau 3.2. Moyenne et écart type des valeurs des composants du circuit électrique équivalent (modèle B) modélisés pour les RAW sains et pour les RAW

parasités par Leishmania amazonensis, à partir des diagrammes de Nyquist réalisés en présence de la sonde [Fe(CN)6]3-/4-

(Figure 3.8).

Tableau 3.3. Moyenne et écart type des valeurs des composants du circuit électrique équivalent (modèle B) modélisés pour les RAW sains et pour les RAW

parasités par Leishmania amazonensis, à partir des diagrammes de Nyquist réalisés dans le milieu de culture (Figure 3.9).

Chap

itre 3 –

Bio

capteu

r Macro

phag

e/Leish

mania


) n Rf (Ω) Qdc (µF.sn-1

) n Rtc (Ω) σ (Ω.s-1/2

)

RAW sains 330 ± 8 20 ± 12 0,7 ± 0,05 50 ± 0 240 ± 26

0,57 ± 0,03 4700 ± 1150 200 ± 18

RAW

parasités 330 ± 7 8 ± 4 0,98 ± 0,02 60 ± 10 500 ± 32

0,54 ± 0,06 2800 ± 1150 2000 ± 1000


) n Rf (kΩ) Qdc (µF.sn-1

) n Rtc (kΩ) σ (Ω.s-1/2

)

RAW sains 470 ±17 5,2 ± 0,4 0,87 ± 0 50 ± 2,8 2,7 ± 0,24

0,935 ± 0,002 600 ± 100 66666 ±

10000

RAW

parasités 445 ± 5 5,45 ± 0,06 0,86 ± 0,01 15 ± 0 2,5 ± 0,7

0,93 ± 0,007 235 ± 57

83333 ±

27777


Une analyse rapide permet de mettre en évidence :

des résistances d’électrolyte Rs stables avec une valeur égale à 330 Ω en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

et 460 Ω environ dans le milieu de culture.

une forte variation de la capacité du film Qf pour les cellules parasitées (8 µF.sn-1

) par

rapport aux macrophages sains (20 µF.sn-1

) pour des analyses réalisées en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

.

peu d’influence de l’infection sur la capacité de double couche Qdc dans le milieu de

culture avec une valeur égale environ à 2,5 µF.sn-1

.

une variation importante de la résistance de transfert de charge Rtc qui varie fortement

à la fois en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

et dans le milieu de culture avec respectivement

une évolution après infection de 4700 Ω à 2800 Ω et de 600 kΩ à 235 kΩ.

D’une manière générale, la résistance de transfert de charge Rtc est constante pour des

expériences réalisées en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

, puisque le courant produit provient de

l’oxydoréduction de la sonde dont la concentration reste constante. Dans notre cas, la forte

diminution de Rtc signifierait, si le modèle du circuit équivalent est satisfaisant, que l’infection

induit la production d’espèces électroactives en quantité comparable à [Fe(CN)6]3-/4-

. De plus,

une telle production d’espèces électroactives devrait se répercuter sur les valeurs obtenues en

absence de sonde : Rtc devrait dans ce cas atteindre après infection une valeur comparable

(2800 Ω) à celle obtenue avec la sonde. Or, la résistance de transfert de charge pour les

cellules parasitées mesurées dans le milieu de culture est seulement égale à 235 kΩ.

Par conséquent, le modèle choisi semble inadapté d’autant plus que, comme il le sera

démontré dans le chapitre 4, la production d’espèces se fait principalement à l’intérieur de la

cellule. Pour cette raison, le circuit D présenté figure 3.7 a été préféré. Ce circuit utilise deux

nouveaux éléments en série : i) une résistance d’adsorption Rads et ii) une capacité

d’adsorption Cads permettant de caractériser la production d’espèces au sein de la couche

cellulaire. Rads correspond à une résistance de transfert de charge et Cads correspond à la

concentration d’espèces électroactives adsorbées.

occupélibreads

RT

FC

2

Avec :




τ : nombre de mole/cm2

θlibre : sites libres

θoccupé : sites occupés


Rs

Qdc

Rtc Zw Rf

Qf

Rads Cads

Figure 3.7. Circuit électrique équivalent D.

Les valeurs des modélisations des diagrammes de Nyquist calculées à partit du modèle D

sont présentées dans les tableaux 3.4 et 3.5 respectivement pour les analyses réalisées en

présence ou en l’absence de sonde.

106

Tableau 3.4. Moyenne et écart type des valeurs des composants du circuit électrique équivalent (modèle D) modélisés pour les RAW sains et pour les RAW

parasités par Leishmania amazonensis, à partir des diagrammes de Nyquist réalisés en présence de la sonde [Fe(CN)63-/4-

] (Figure 3.8).

Echantillon Rs (Ω) Qf (µF.sn-1

) n Rf (Ω) Qdc

(µF.sn-1

) n Rads (Ω) Cads (µF) Rtc (Ω) σ (Ω.s

-1/2)

RAW sains 333 ± 9 17,8 ± 0 0,83 ± 0,04 25 ± 5 186 ± 7 0,57 ± 0,01 2733 ± 680 14 ± 3 3633 ± 230 700 ± 57

RAW

parasités 325 ± 10 5 ± 0 0,84 ± 0,01 57 ± 3 600 ± 98 0,4 ± 0,16 2700 ± 583 15 ± 5,7 4353 ± 1120

2 000 ±

1300

Tableau 3.5. Moyennes et écarts types des valeurs des composants du circuit électrique équivalent (modèle D) modélisés pour les RAW sains et pour les RAW

parasités par Leishmania amazonensis, à partir des diagrammes de Nyquist réalisés dans le milieu de culture (Figure 3.9).


) n Rf (kΩ) Qdc

(µF.sn-1

) n Rads (kΩ) Cads (µF) Rtc (kΩ) σ (Ω.s

-1/2)

RAW sains 460 ± 0 5,5 ± 0 0,88 ± 0,03 70 ± 4 2,6 ± 0,28 0,91 ± 0,03 725 ± 0 0,18 ± 0,028 650 ± 57 62 500 ±

29 000

RAW

parasités 448 ± 3 6 ± 0.057 0,93 ± 0,017 10 ± 0.05 2,25 ± 0.05 0,89 ± 0,009 81,2 ± 0 0,1 ± 0 250 ± 0,25

107 000 ±

7 200

Chap

itre 3 –

Bio

capteu

r Macro

phag

e/Leish

mania


3.2.1 Interprétation des résultats

Les résistances d’électrolyte sont logiquement stables dans les deux solutions avec une valeur

moyenne de 330 Ω en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

et de 455 Ω dans le milieu de culture.


Les caractéristiques électriques du film Qf et Rf évoluent différemment après infection suivant

l’électrolyte utilisé (milieu de culture ou présence de la sonde [Fe(CN)6]3-/4-

).

La capacité non parfaite du film Qf diminue fortement en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

de

17,8 µF.sn-1

pour les RAW sains à 5 µF.sn-1

pour les RAW parasités, alors qu’elle est

constante (5,5 µF.sn-1

) quelque soit l’état de la cellule lorsque les mesures sont effectuées dans

le milieu de culture. De la même manière la résistance du film Rf augmente après infection

pour les mesures réalisées en présence du couple rédox, passant de 25 Ω pour les RAW sains

à 57 Ω pour les cellules parasitées, alors qu’elle diminue fortement lorsque les analyses sont

réalisées dans le milieu de culture avec un Rf égal à 70 Ω pour les cellules saines et à 10 Ω

pour les cellules parasitées. Ces résultats semblent indiquer que la présence de [Fe(CN)6]3-/4-

affecte fortement la cellule et que cet effet dépend de l’état de la cellule.

La valeur importante de Qf enregistrée pour les RAW sains en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

(17,8 µF.sn-1

) pourrait provenir d’une augmentation de la surface du film (étalement des

cellules) et/ou d’une diminution de l’épaisseur de la couche cellulaire comme le schématise la

figure 3.8.

Figure3.8. Evolution possible de la géométrie du macrophage déposé sur électrode d’or en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

.

Cet effet serait plus important sur les RAW sains que sur les RAW parasités. Il est possible

que la cellule perçoive la présence des ions ferrocyanures et ferricyanures comme une

agression et réagisse en conséquence. Il se pourrait également que les cellules parasitées ne

soient plus en mesure de répondre à une seconde agression, ce qui expliquerait le fait que

l’effet de [Fe(CN)6]3-/4-

ne soit visible que pour les cellules saines.

Des études ont déjà mis en évidence l’activation de macrophages par des ions ferricyanures

[Fe(CN)6]3-

[Kaul, N. et al., 1997]. Kaul et al. ont utilisé le ferricyanure comme stimulateur

pour étudier l’action du facteur de transcription NF-kB, et ont conclu que la réduction du

ferricyanure lors de l’activation des macrophages induisait un changement de pH

intracellulaire en raison du relargage de proton. En contraste, les ions ferrocyanures

[Fe(CN)6]4-

n’ont aucune activité sur les cellules. De plus, Baoutina et al. ont étudié l’activité

du transport d’électron membranaire trans-plasma (TPMET) des macrophages à l’aide d’ions

ferricyanures [Fe(CN)6]3-

comme accepteur d’électron extracellulaire [Baoutina, A. et al.,

ee

diamètrediamètre

ee

diamètrediamètre


2001]. Ils ont mesuré la formation du réducteur, ferrocyanure [Fe(CN)6]4-

. Les résultats

démontrent une activité de ferricyanure-réductase des cellules, sans doute arbitrée par des

réducteurs tels que des thiols secrétés par les macrophages.

La résistance du film Rf étant proportionnelle à l’épaisseur du film et inversement

proportionnelle à sa surface (R = ρd/S, avec ρ coefficient de conductivité, d épaisseur et S

surface du film), les changements morphologiques liés à l’effet de [Fe(CN)6]3-/4-

pourraient

également expliquer les changements enregistrés au niveau de la résistance du film, ρ étant

constante compte tenu de la présence des ions [Fe(CN)6]3-/4-

. La forte diminution de la valeur

de Rf enregistrée dans le milieu de culture suite à l’infection des macrophages par Leishmania

amazonensis pourrait quant à elle provenir d’une variation de la permittivité électrique du film

suite à la production d’espèces chargées facilitant le passage du courant. Le mécanisme

complexe d’infection de la cellule par Leishmania conduit au relargage de nombreuses

espèces comme des espèces radicalaires (O2•-,

•OH,

•NO) [Bhattacharya, A. et al., 2008,

Lemesre, JL. et al., 1997, Mehta, A. et al., 2006], des ions calciums et potassiums ainsi que

des cytokines [Alexander, J. et al., 1999, Bogdan, C. et al., 1996]. Lorsque les analyses sont

réalisées avec [Fe(CN)6]3-/4-

les ions s’intercalent dans la couche isolante masquant ainsi la

production d’espèces chargées en moindre concentration, ne laissant apparaître que les

changements morphologiques. Les coefficients de conductivité des solutions étant différents,

la comparaison des Rf des deux expériences est difficile.

b. Caractéristiques de l’interface film/solution : Qdc

En ce qui concerne l’interface film/solution, la capacité non parfaite de double couche Qdc

augmente pour les RAW infectés en présence de sonde, mais reste stable dans le milieu de

culture avec une valeur proche de 2,5 µF.sn-1

. Les valeurs obtenues pour Qdc dans

[Fe(CN)6]3-/4-

sont très élevées, atteignant 186 µF.sn-1

pour les cellules saines contre

600 µF.sn-1

pour les RAW parasités, valeurs correspondant à un supercondensateur qui

équivaut à une importante séparation de charges. Cependant, ces valeurs sont légèrement

compensées par des coefficients n très faibles (entre 0,4 et 0,57).

Les charges des RAW sains et parasités pourraient expliquer cette forte séparation de charge.

Dans le cas de cellules saines, la répartition des charges se stabilise, comme le montre la

figure 3.9. Pour des cellules parasitées, l’infection provoque une hyperpolarisation de la

membrane, engendrant une augmentation des charges positives sur la membrane [Vieira, L. et

al., 1995]. Les charges positives des membranes cellulaires et les fortes charges négatives de

la sonde [Fe(CN)6]3-/4-

pourraient expliquer cette forte valeur de Qdc, avec notamment une

augmentation dans le cas des cellules parasitées en raison de l’augmentation des charges

positives à la surface de la cellule due à l’hyperpolarisation causée par l’infection.


+ + + + + + + + +_ _ _ _ _ _ _ _ _

+ +

+ + + + + + + + +_ _ _ _ _ _ _ _ _

_ _

Membrane cellulaire

Milieu extracellulaire

Milieu intracellulairePotentiel de repos Hyperpolarisation

+ + + + + + + + +_ _ _ _ _ _ _ _ _+ + + + + + + + +_ _ _ _ _ _ _ _ _

+ +

+ + + + + + + + +_ _ _ _ _ _ _ _ _

_ _

+ +

+ + + + + + + + +_ _ _ _ _ _ _ _ _

_ _

Membrane cellulaire

Milieu extracellulaire

Milieu intracellulairePotentiel de repos Hyperpolarisation

Figure 3.9. Schéma du potentiel de repos membranaire de cellules saines et de l’hyperpolarisation

causée par l’infection par Leishmania.

c. Caractéristiques de la couche cellulaire : Rads et Cads

En ce qui concerne les éléments caractéristiques de la couche cellulaire Cads et Rads,

l’explication de leur valeur dépend fortement du milieu dans lequel sont réalisées les analyses.

En présence de [Fe(CN)6]3-/4-

, Cads (15 µF) et Rads (2700 Ω) sont constants. Rads

correspond à une résistance de transfert de charge et par conséquent sa valeur est régie

par l’oxydoréduction d’espèces au niveau de la couche cellulaire. Le fait que Rads soit

constant en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

implique que le transfert de charge mis en jeu

provient dans ce cas de l’oxydoréduction des ions ferrocyanures/ferricyanures qui

seraient adsorbés sur la couche cellulaire. Cette hypothèse est renforcée par le fait que

Cads est également constant indiquant la présence d’ions [Fe(CN)6]3-/4-

adsorbés et que

Qdc est très forte suggérant une très importante séparation de charges.

En l’absence de sonde, Rads provient de l’oxydoréduction d’espèces présentes dans la

couche cellulaire. Une forte diminution de la valeur de Rads, de 725 kΩ pour les

cellules saines à 81,2 kΩ pour les RAW parasités, implique une importante production

d’espèces électroactives dans la couche adsorbée. Ces espèces pourraient correspondre

aux espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, qui comme il est démontré dans le

chapitre 4, sont produites dans la cellule [Ferret, PJ. et al., 2002, Winberg, EM. et al.,

2007].

d. Caractéristiques de l’interface film/solution : Rtc et σ

Transfert d’électron

En ce qui concerne la résistance de transfert de charge « globale » Rtc, celle-ci est

logiquement constante en présence de la sonde, avec une valeur proche de 4000 Ω,

(oxydoréduction de la sonde en solution) alors qu’elle diminue d’un facteur trois en l’absence

de sonde, passant de 650 Ω pour des RAW sains à 250 Ω après l’infection. Cette diminution

pourrait provenir, comme dans le cas de Rads, de la production d’espèces électroactives à

l’extérieur de la couche cellulaire (diffusion des espèces produites à l’extérieur).


Transfert de masse


la résistance de transfert de masse caractérisée par le coefficient

de Warburg (σ) est égale à 700 Ω.s-1/2

pour une électrode recouverte de RAW sains alors

qu’elle est égale à 740 Ω.s-1/2

pour l’or nu. Ce résultat semble indiquer que le macrophage

attire les ions vers la couche cellulaire sans doute via une interaction électrostatique comme

nous l’avons expliqué précédemment.

Quelque soit l’électrolyte, σ augmente pour les cellules parasitées par rapport aux cellules

saines. En présence du couple rédox σ augmente de 700 Ω.s-1/2

pour les cellules saines à

2000 Ω.s-1/2

pour les RAW parasités, tandis qu’en absence de sonde σ évolue de 62 500 Ω.s-1/2

pour les RAW sains à 107 000 Ω.s-1/2

pour les macrophages parasités. Le transfert de matière

de l’espèce rédox est donc plus difficile dans le cas des cellules parasitées. Cette différence

pourrait provenir de la consommation des espèces produites par la cellule par le système

antioxydant du parasite empêchant ainsi l’espèce d’arriver à l’électrode pour y être oxydée ou

réduite.

Nous pouvons également noter que la valeur calculée de σ pour les macrophages infectés

(2000 Ω.s-1/2

) est du même ordre que celle obtenue pour les globules rouges parasités (cf.

Chapitre 2) pour le modèle cellulaire à base d’érythrocytes.

e. Conclusion

Ces études réalisées dans les deux électrolytes ont permis de différencier par spectroscopie

d’impédance électrochimique les macrophages sains des macrophages parasités par

Leishmania. Parmi tous les évènements répertoriés précédemment, deux éléments sont

intéressants.

Premièrement, l’analyse des modélisations en circuit électrique équivalent (modèle D) des

diagrammes de Nyquist a mis en évidence la production d’espèces chargées dans la couche

cellulaire après l’infection des macrophages par Leishmania amazonensis. Ces espèces

pourraient correspondre aux radicaux oxygénés et azotés produits par les macrophages en

réponse à une agression connue largement décrite dans la littérature [Das, M. et al., 2001,

Lemesre, JL. et al., 1997, Murray, HW., 1981, Winberg, EM. et al., 2007].

Deuxièmement, les mesures semblent mettre en évidence un comportement différent des

cellules saines en fonction de l’électrolyte. En effet, en plus de l’infection par le parasite le

biocapteur cellulaire a mesuré une différence de comportement des macrophages sains en

présence de [Fe(CN)6]3-/4-

. Il semblerait que les cellules saines subissent une agression en

présence du couple rédox, à priori due à la stimulation des cellules saines par la sonde.

Le rôle des macrophages étant de participer au système immunitaire, ils se trouvent par

conséquent impliqués dans de nombreuses pathologies et/ou stimuli externes ou internes. En

particulier, le lipopolysaccharide (LPS) est connu pour activer les macrophages. En effet,

comme il est démontré dans le chapitre 4 ainsi que dans de précédents travaux [Stuehr, DJ. et

al., 1987, Wu, W. et al., 2004], le LPS provoque la libération d’espèces radicalaires produites

par le macrophage. Le lipopolysaccharide est un des composants essentiels de la paroi

bactérienne des bactéries à Gram négatif. Il active une grande variété de cellules dont les

macrophages par un mécanisme d’action encore indéterminé [Wu, W. et al., 2004]. De

nombreuses études ont cependant démontré que la forte stimulation des macrophages, par


0.0 9.0x102

1.8x103

2.7x103

0.0

4.0x102

8.0x102

1.2x103

RAW sains

RAW stimulés par LPS

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

(b)

(a)

Demi-cercle

Droite

0.0 9.0x102

1.8x103

2.7x103

0.0

4.0x102

8.0x102

1.2x103

RAW sains

RAW stimulés par LPS

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

(b)

(a)

Demi-cercle

Droite

l’ajout de LPS, engendrait une forte production de •NO [Ferret, PJ. et al., 2002, Lee, JW. et

al., 2007, Winberg, EM. et al., 2007].

Afin d’obtenir davantages de renseignement d’un point de vue électrique concernant le

macrophage infecté, les mêmes analyses ont été réalisées pour des macrophages stimulés par

le LPS.

4. Effet de la stimulation des macrophages par ajout de LPS

Afin d’évaluer l’influence de la stimulation, les expériences de spectroscopie d’impédance

sont réalisées sur des cellules provenant de la même culture. La stimulation est réalisée par

incubation pendant 24 heures (à 37 °C) sur des macrophages préalablement déposés sur les

électrodes par ajout de LPS à 12 µg/mL.

4.1 Mesure par spectroscopie d‘impédance électrochimique

La figure 3.9 présente les diagrammes de Nyquist correspondant obtenus en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

sur des électrodes recouvertes de RAW avant et après stimulation par ajout de

LPS.

Comme l’illustre la figure 3.9, les diagrammes se décomposent comme dans le cas des

macrophages parasités (cf. Figure 3.5) en trois éléments : i) un premier demi-cercle aux

hautes fréquences ; ii) un deuxième demi-cercle de plus grand diamètre à plus basse fréquence

représentant l’interface film/solution et iii) une droite correspondant au phénomène de

diffusion.

Figure 3.9. Diagrammes de Nyquist obtenus, en présence de [Fe(CN)6]

3-/4-, pour des électrodes

recouvertes de macrophages stimulés (b) ou non (a) par ajout de LPS (12 µg/mL).


0 1x105

2x105

3x105

4x105

0

1x105

2x105

3x105

4x105

RAW sains (a)

RAW stimulés (b)

-ZI (

oh

m)

ZR (ohm)

(a)

(b)

La figure 3.10 présente les diagrammes de Nyquist obtenus, en absence de couples rédox,

pour des électrodes modifiées par des macrophages stimulés ou non par ajout de

lipopolysaccharide.

Contrairement aux mesures effectuées en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

, les diagrammes

correspondant aux mesures réalisées dans le milieu de culture pour deux états cellulaires

(normal et stimulé) sont relativement proches.

Figure 3.10. Diagrammes de Nyquist obtenus, dans le milieu de culture, pour des électrodes

recouvertes de macrophages stimulés (b) ou non (a) par ajout de LPS (12 µg/mL).

L’analyse des ces courbes a été réalisée à l’aide des modélisations en circuit électrique

équivalent à partir du modèle D (Figure 3.6) utilisé pour caractériser l’interface des

macrophages parasités par Leishmania.

4.2 Modélisations en circuit électrique équivalent

Les moyennes et écarts types des valeurs de chaque composant du circuit électrique

équivalent ont été calculés et sont rapportés dans les tableaux 3.6 et 3.7, respectivement, en

présence et en absence de sonde rédox.

113

Tableau 3.6. Valeurs des composants du circuit électrique équivalent modélisé à partir du modèle D pour les RAW stimulés ou non par le LPS, mesurés en

présence d’un couple rédox [Fe(CN)6]3-/4-

.


) n Rf (Ω) Qdc

(µF.sn-1

) n Rads (Ω) Cads (µF) Rtc (Ω) σ (Ω.s

-1/2)

RAW sains 330 ± 3 12 ± 1,7 0,71 ± 0,04 87 ±11 200 ± 63 0,58 ± 0,06 1450 ± 498 14 ± 4 2114 ± 392 850 ± 67

RAW

stimulés

par LPS

337 ± 11 3,71 ± 0 0,96 ± 0,05 50 ± 8,6 300 ± 54 0,5 ± 0,005 4500 ± 1800 8 ± 1 3700 ± 230 830 ± 38

Tableau 3.7. Valeurs des composants du circuit électrique équivalent modélisés à partir du modèle D pour les RAW stimulés ou non par le LPS, mesurés en

absence de couple rédox.


) n Rf (kΩ) Qdc

(µF.sn-1

) n Rads (kΩ) Cads (µF) Rtc (kΩ) σ (Ω.s

-1/2)

RAW sains 427 ± 30 5,5 ± 0 0,88 ± 0,02 122 ± 47 1,66 ± 0,23 0,94 ± 0,05 35 ± 26 0,15 ± 0,05 3000 ±

2100

550 000 ±

85 000

RAW

stimulés

par LPS

535 ± 21 5,25 ± 0,35 0,88 ± 0,05 50 ± 0 1,9 ± 0,15 0,91 ± 0,04 600 ± 26 0,15 ± 0,07 775 ± 176 80 000 ±

50 000

Chap

itre 3 –

Bio

capteu

r Macro

phag

e/Leish

mania


Comme attendu, les résistances d’électrolytes sont proches pour des mesures effectuées dans

le même électrolyte.


Comme dans le cas des analyses réalisées après infection par Leishmania amazonensis, les

caractéristiques du film Qf et Rf varient différemment en fonction de l’électrolyte.


, la couche cellulaire de RAW sains présente une valeur

de capacité Qf relativement élevée (12,3 µF.sn-1

) par rapport aux RAW stimulés

(3,7 µF.sn-1

) en raison du changement morphologique (augmentation de la surface et

diminution de l’épaisseur du film) induit par les ions ferro/ferricyanures. Cette

variation de géométrie est également à l’origine de la diminution de la résistance du

film Rf qui évolue de 87 Ω pour les cellules saines à 50 Ω pour les macrophages

stimulés.

En absence de [Fe(CN)6]3-/4-

, on retrouve l’évolution constatée pour les macrophages

parasités avec une valeur de Qf constante (5,5 µF.sn-1

) alors que la résistance du film

Rf diminue de 122 kΩ pour les RAW non stimulés à 50 kΩ après stimulation. Cette

diminution serait liée, comme dans le cas du macrophage parasité, à la production

d’espèces chargées. La production d’espèces chargées par les cellules stimulées

augmenterait la conductivité du film et diminuerait donc la résistance du film.

b. Caractéristiques de l’interface film/solution : Qdc

Les valeurs de la capacité non parfaite de double couche Qdc enregistrées en présence de

[Fe(CN)6]3-/4-

sont également très élevées quelque soit l’état de la cellule. Comme pour les

mesures sur Leishmania cette différence provient d’une importante séparation de charges due

à la charge des cellules.

En l’absence de sonde, la séparation de charge est la même pour les cellules stimulées ou non

avec des valeurs de Qdc égale à 1,66 µF.sn-1

pour les cellules saines et 1,9 µF.sn-1

après

stimulation.

c. Caractéristiques de la couche cellulaire : Rads et Cads

En revanche de très fortes différences apparaissent entre cellules parasitées et stimulées au

niveau des caractéristiques électriques de la couche représentées par les éléments Rads et Cads.

Contrairement aux cellules parasitées, le LPS induit une importante augmentation de la

résistance Rads, en particulier dans le milieu de culture avec des valeurs de 35 kΩ pour les

cellules saines contre 600 kΩ pour les RAW stimulés, indiquant une diminution du courant et

par conséquent une diminution de la quantité d’espèces oxydées ou réduites au niveau de

l’électrode. Ce résultat est très surprenant car l’ajout de LPS est très couramment utilisé pour

activer les macrophages et étudier la production d’espèces réactives tel que le •NO

[Camacho, M. et al., 2008, Kolodziej, H. et al., 2008].

Les résultats semblent par conséquent démontrer un comportement très différent entre les

cellules parasitées et stimulées.


d. Caractéristiques interface film/solution : Rtc et σ

Transfert de charge

Contrairement à Rads, la résistance de transfert de charge Rtc diminue très fortement (de

3000 Ω à 775 Ω) après stimulation par LPS. La quantité d’espèces oxydoréductibles produites

en solution est donc bien plus importante pour les RAW stimulés par rapport aux RAW sains.

Cette « nouvelle » répartition de transfert de charges entre espèces adsorbées dans la couche

cellulaire ou provenant de la solution pourrait provenir du fait qu’une cellule stimulée ne

produit pas d’espèces réactives de la même manière qu’une cellule parasitée.

Transfert de masse

Le coefficient de Warburg (σ) évolue différemment en présence ou en absence de sonde, avec

une valeur stable de 840 Ω.s-1/2

en moyenne en présence de [Fe(CN)6]3-/4-

et une diminution de

σ de 550 kΩ.s-1/2

pour les cellules saines à 80 kΩ.s-1/2

après stimulation, dans le milieu de

culture. σ étant inversement proportionnel aux concentrations, une diminution du coefficient

de Warburg pourrait provenir d’une augmentation de la concentration en espèces

oxydoréductibles, et conforterait ainsi l’analyse effectuée pour la résistance de transfert de

charge.

Etant donné les résultats étonnants obtenus sur les macrophages stimulés par

lipopolysaccharide, en comparaison des RAW parasités, une dernière expérience a été

réalisée.

e. Nouvelles mesures en présence de LPS dans la cellule électrochimique

Les mesures d’impédance ayant été effectuées dans un milieu de culture dépourvu de LPS, sur

des macrophages préalablement incubés 24 heures en présence de LPS, les mêmes

expériences ont été menées sur des cellules stimulées directement dans la cellule

électrochimique. En effet, des études ont démontré que le maximum d’activité du LPS était

atteint au bout d’une heure [Wu, W. et al., 2004].

Dans ce cas, les modélisations en circuit électrique équivalent des diagrammes de Nyquist

correspondants à l’aide du circuit D ont mis en évidence les mêmes résultats que ceux

observés pour les macrophages stimulés en culture : i) une diminution de la résistance du film,

ii) une forte augmentation de la résistance d’adsorption et iii) une diminution de la résistance

de transfert de charge. Cette seconde expérience a permis de confirmer l’effet du LPS

(production d’espèces oxydoréductibles) ainsi qu’un comportement différents des cellules

stimulées par rapport aux cellules parasitées.

f. Conclusion

En conclusion, les études réalisées par spectroscopie d’impédance électrochimique ont révélé

un comportement différent pour des macrophages stimulés par LPS par rapport à des

macrophages sains. L’analyse des modélisations des diagrammes de Nyquist a permis de

révéler une production d’espèces oxydoréductibles après stimulation des cellules. Les données


montrent une production à l’extérieur de la cellule avec une forte diminution de la résistance

de transfert de charges tandis que la résistance d’adsorption augmente.

La spectroscopie d’impédance électrochimique a donc mis en évidence un comportement

différent entre cellules parasitées par Leishmania et stimulées par ajout de LPS, notamment au

niveau de la résistance d’adsorption. Contrairement aux mesures effectuées en présence de

LPS, les modélisations des cellules infectées par Leishmania mettent en évidence une

production d’espèces chargées ainsi qu’une importante production d’espèces électroactives

dans le film cellulaire.

Conclusion

Les mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique réalisées sur des cellules

parasitées par Leishmania, en présence et en absence de sonde, ont permis de mettre en

évidence la production d’espèces dues à l’infection de la cellule. D’une part, l’évolution de la

résistance du film après infection démontre la production d’espèces chargées. D’autre part,

l’évolution de la résistance d’adsorption et de la résistance du transfert de charge met en avant

la production d’espèces électroactives. Ces deux éléments pourraient concorder avec la

formation de monoxyde d’azote •NO, bien connu dans la réponse inflammatoire des

macrophages.

Les modélisations des diagrammes de Nyquist obtenus sur des cellules saines puis stimulées

ont aboutit à des résultats inverses de ceux obtenus après l’infection par Leishmania.

L’élément caractérisant la production d’espèces adsorbées varie différemment pour un

macrophage stimulé ou parasité.

Il est cependant très important de noter que, contrairement à la cellule stimulée, la cellule

parasitée est beaucoup plus complexe. Le parasite est en effet une entitré vivante qui pénètre

le macrophage et y subit ensuite un changement de conformation passant de son état

promastigote à son état amastigote, faisant donc subir à la cellule hôte un déséquilibre rédox

plus complexe qu’une stimulation par LPS. Comme il est expliqué dans le chapitre 4, le LPS

et Leishmania créent des équilibres rédox dans le macrophage différents. Le LPS agit sur une

enzyme spécifique (NO synthase) tandis que Leishmania provoque plusieurs réactions rédox

mettant en jeu de nombreuses protéines et enzymes cellulaires

Le biocapteur cellulaire impédancemétrique à base de macrophages a donc permis de

différencier trois états de la cellule (sain, infecté et stimulé). La spectroscopie d’impédance

électrochimique est un outil puissant qui pourrait être utilisé dans des études plus poussées

notamment pour l’étude d’effet d’antileishmanicide sur des cellules infectées, à différents

stades de l’infection, comme dans le cas des globules rouges parasités.


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Chapitre 4

Comparaison des états

cellulaires sains et parasités

par RPE et

microscopie confocale

119

Chapitre 4

Comparaison des états

cellulaires sains et parasités

par RPE et

microscopie confocale

Chapitre 4 – Comparaison des états cellulaires 120


Sommaire

Introduction ...................................................................................................................... 123

Partie expérimentale......................................................................................................... 125

1. Matériel ............................................................................................................................ 125

2. Méthodes........................................................................................................................... 125 2.1 Culture in vitro de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum .....................................125 2.2 Enrichissement d’échantillons de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ...............125 2.3 Culture des macrophages .............................................................................................................125 2.4 Culture des Leishmania amazonensis promastigotes .....................................................................125 2.5 Résonance paramagnétique électronique (RPE) ............................................................................126

2.5.1 Erythrocytes .......................................................................................................................126 2.5.2 Macrophages ......................................................................................................................127

2.6 Microscopie confocale .................................................................................................................128 2.6.1 Erythrocytes .......................................................................................................................128 2.6.2 Macrophages ......................................................................................................................128

Résultats et discussion ...................................................................................................... 131

1. Etude comparative entre globules rouges sains et globules rouges parasités par

Plasmodium falciparum ............................................................................................................. 131 1.1 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge à l’aide d’une sonde

paramagnétique ....................................................................................................................................131 1.1.1 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge dépourvu de

glutathion et de glutathion réductase ............................................................................................... 1344 a. Globules rouges sains .........................................................................................................134 b. Globules rouges parasités par Plasmodium falciparum ........................................................136 c. Etudes comparatives entre globules rouges sains et parasités ...............................................137

1.2 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge à l’aide d’une sonde

fluorescente ..........................................................................................................................................139

2. Etude comparative entre macrophages sains, macrophages parasités et macrophages

activés ........................................................................................................................................ 141 2.1 Evaluation de la production radicalaire chez le macrophage soumis à divers stimuli ......................141

2.1.1 Evaluation du •NO dans le macrophage stimulé par LPS ......................................................142 2.1.2 Evaluation du •NO dans le macrophage infecté par Leishmania amazonensis promastigote ..143

2.2 Evaluation globale de la production d’espèces radicalaires chez le macrophage ............................145

Conclusion ........................................................................................................................ 147

Références ......................................................................................................................... 149


Introduction

Après avoir analysé les deux infections parasitaires à l’aide du biocapteur cellulaire, une étude

comparative des cellules hôtes avant et après infection a été réalisée à l’aide de la résonance

paramagnétique électronique (RPE) et la microscopie confocale. Ces deux méthodes, par

l’intermédiaire de sondes spécifiques, permettent la mise en évidence d’espèces radicalaires.

La production d’espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, dont les espèces radicalaires, est

un des mécanismes de défense des cellules hôtes soumises à une agression. Lors de l’infection

les parasites se trouvent donc dans un environnement toxique et leur survie dépend de leur

système de détoxification. Plasmodium et Leishmania ont des procédés biochimiques propres

à chacun. Ils évoluent différemment dans leur cellule hôte, respectivement le globule rouge et

le macrophage (cf. Chapitre 1).

Plasmodium produit son cycle érythrocytaire dans le globule rouge en se nourrissant

essentiellement d’hémoglobine, libérant ainsi de grandes quantités d’hème toxique. La

détoxification de l’hème par le parasite mène au stockage d’hémozoine. Plasmodium utilise

son arsenal d’antioxydants à base de thiol (glutathion (GSH) et thiorédoxine (TrxSH2)) pour

lutter contre les radicaux. Les procédés biochimiques de Leishmania sont différents du

Plasmodium. Leishmania évolue dans le macrophage en se reproduisant et en inhibant

plusieurs fonctions du macrophage grâce notamment à un antioxydant majeur, la

trypanothione (T(SH)2).

La production d’espèces radicalaires étant caractéristique de l’infection cellulaire, ce chapitre

a pour but de rendre compte de l’état rédox cellulaire en examinant la production d’espèces

radicalaires chez les cellules saines et parasitées pour les deux modèles cellulaires analysés

précédemment avec le biocapteur. L’objectif de ce travail est de compléter les informations

sur l’état rédox global lors des deux infections, comme le rôle majeur du glutathion chez

Plasmodium ou les fonctions d’inhibition de Leishmania.

Les deux modèles cellulaires, globule rouge parasité et macrophage infecté ou stimulé,

étudiés précédemment à l’aide du biocapteur cellulaire ont ainsi été analysés dans un premier

temps par résonance paramagnétique électronique et dans un deuxième temps par microscopie

confocale.



1. Matériel

Le 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourée (BCNU, ref : C0400), l’acide diéthyldithio

carbamique de sodium (NaDETC, ref : D9428), la 2′,7′-dichlorofluoresceine

diacetate (H2DCFDA, ref : D6883), le sérum d’albumine bovine (BSA, ref : A6003), le

sulphate de fer(II) heptahydrate (FeSO4, ref : 215422), le 4-amino-2,2,6,6-

tétraméthylpiperidine-1-oxyl (4-amino-TEPMO, ref : 163945) et le 1-chloro-2,4-

dinitrobenzene (CDNB) proviennent de Sigma-Aldrich. Le dithionite de sodium (Na2S2O4,

ref : UN1384) est fourni par Merck.

2. Méthodes

2.1 Culture in vitro de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum

Les cultures de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum sont effectuées suivant

le protocole décrit dans le chapitre 2 (§2.5).

2.2 Enrichissement d’échantillons de globules rouges parasités par Plasmodium falciparum

L’enrichissement des cultures de globules rouges parasités par Plasmodium faciparum est

réalisé selon le protocole décrit dans le chapitre 2 (§2.6).

2.3 Culture des macrophages

Les cultures de macrophages sont effectuées selon le protocole décrit dans le chapitre 3 (§

2.1).

2.4 Culture des Leishmania amazonensis promastigotes

Les cultures de Leishmania amazonensis promastigotes sont réalisées selon le protocole

décrit dans le chapitre 3 (§ 2.2).


2.5 Résonance paramagnétique électronique (RPE)

2.5.1 Erythrocytes

Erythrocytes normaux

50 µL de globules rouges sains ou parasités à 40% d’hématocrite dans le milieu de culture

(RPMI + hépès) sont prélevés puis mélangés à 5,5 µL de 4-amino-TEMPO à 411 µM dans du

PBS à pH 7,4. Le mélange homogénéisé est placé dans un capillaire de 50 µL puis analysé par

RPE.

Erythrocytes dépourvus de glutathion,

L’élimination du glutathion se fait par ajout de 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) : 60 µL

d’une solution de CDNB à 2 mM dans du RPMI sont mélangés à 40 µL de culot de globules

rouges, incubés 1 h à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO2 puis lavés une fois au RPMI

(centrifugation à 1600 rpm pendant 1 min). 50 µL du mélange globule rouge + CDNB à 40%

d’hématocrite dans le milieu de culture sont récupérés puis mélangés avec 5,5 µL de 4-amino-

TEMPO à 411 µM dans du PBS à pH 7,4. Le mélange homogénéisé est placé dans un

capillaire de 50 µL puis analysé en RPE.

Erythrocytes dépourvus de glutathion réductase

L’élimination de la glutathion réductase se fait par l’ajout de 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-

nitrosourée (BCNU) : 8 mL de RPMI complémenté avec de l’hépès, 700 µL de sérum

humain, 100 µL de L-glutamine et 15 µL de BCNU à 0,1 mM dans EtOH sont ajoutés à

400 µL de culot de globules rouges, puis incubés 18 h à 37 °C dans une atmosphère

contenant 5% de CO2. La culture est ensuite lavée (centrifugation 1600 rpm pendant 10 min)

puis incubée à nouveau 48 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2 avec un

changement de milieu au bout de 24 h. 50 µL de globules rouges sains ou parasités à 40%

d’hématocrite dans le milieu de culture (RPMI + hépès) sont prélevés puis mélangés à 5,5 µL

de 4-amino-TEMPO à 411 µM dans du PBS à pH 7,4. Le mélange homogénéisé est placé

dans un capillaire de 50 µL puis analysé par RPE.

Erythrocytes dépourvus de glutathion et de glutathion réductase

Les érythocytes sont dans un premier temps dépourvus de glutathion réductase comme décrit

dans le paragraphe précédent. L’élimination du glutathion se fait ensuite par l’ajout de 60 µL

CDNB à 2 mM au 40 µL de culot cellulaire. Le mélange est incubé 1 h à 37 °C dans une

atmosphère à 5% de CO2 puis lavé une fois au RPMI (centrifugation à 1600 rpm pendant 1

min). 50 µL du mélange globules rouges traités + CDNB à 40% d’hématocrite dans le milieu

de culture sont récupérés puis mélangés avec 5,5 µL de 4-amino-TEMPO à 411 µM dans du

PBS à pH 7,4. Le mélange homogénéisé est placé dans un capillaire de 50 µL puis analysé en

RPE.

Tous les échantillons (GR sains, parasités, ± CDNB, ± BCNU) sont mesurés dans les mêmes

conditions. Les capillaires sont analysés à l’aide d’un Miniscope MS 200 avec les paramètres


suivants : champs magnétique : 3343, 98 G ; balayage ; 42,80 G ; temps de balayage : 60 s ;

nombre de scans : 1 ; modulation : 2 000 mG ; MW atténuation : 10 dB ; gain : 60.

2.5.2 Macrophages

Deux millions de macrophages (RAW 264.7) dilués dans un volume de 4 mL de milieu de

culture (DMEM complémenté avec 1,5 g/L de bicarbonate de sodium, 4,5 g/L de D-glucose, 4

mM de L-glutamine et 10% de sérum de veau décomplémenté) sont déposés par puit dans des

plaques de 6 puits. Les cellules sont incubées 24 h à 37 °C dans une atmosphère contenant 5%

de CO2. Les cellules sont ensuite rincées avec 2 mL de PBS puis remises en culture avec 3

mL de milieu de culture par puits.

Pour les mesures sur les macrophages stimulés par le LPS, 1 mL d’une solution de LPS à 40

µg/mL dans le milieu de culture est ajouté aux 3 mL de milieu de culture contenus dans

chaque puits (concentration finale en LPS : 10 µg/mL). Les cellules sont ensuite incubées

avec le LPS pendant 4 h à 37 °C en présence de 5% CO2. Les cellules sont rincées au PBS

puis remises en culture dans 3 mL avant d’être mises en contact avec le piégeur de •NO ; une

solution composée de sérum d’albumine bovine (BSA) à 3% et de NaDETC à 8 mM dans le

milieu de culture est préparée. 1 mL de ce mélange est ajouté aux 3 mL de milieu de culture

de chaque puits (concentration finale de NaDETC : 2 mM). 40 µL d’une solution de FeSO4 à

100 mM dans du milieu de culture est ensuite ajoutée aux 4 mL de chaque puits

(concentration finale de FeSO4 : 1 mM). Les macrophages sont ensuite incubés 1h30 à 37 °C

dans une atmosphère contenant 5% de CO2. 40 µL d’une solution de dithionite (Na2S2O4) à

500 mM dans le milieu de culture sont ajoutés dans chaque puits (concentration finale de

Na2S2O4 : 5 mM). Les macrophages sont incubés à nouveau 30 min, à 37 °C dans une

atmosphère contenant 5% de CO2. Les cellules sont ensuite lavées dans 2 mL de PBS, reprises

dans 2 mL de milieu puis décollées à l’aide d’un grattoir. Les cellules sont centrifugées à

1600 rpm pendant 3 minutes. Les analyses sont réalisées pour un nombre de cellule

correspondant à 3 puits repris dans 300 µL de milieu de culture.

Pour les mesures réalisées sur les macrophages parasités par Leishmania, 1 mL de milieu de

culture contenant six millions de Leishmania amazonensis promastigotes sont ajoutés aux 3

mL de milieu de culture contenus dans chaque puits. Les cellules sont ensuite incubées avec

les parasites pendant 4 h à 37 °C en présence de 5% CO2. Les cellules sont rincées au PBS

puis remises en culture dans 3 mL avant d’être mises en contact avec le piégeur de •NO,

comme expliqué précédemment. Les analyses sont réalisées pour un nombre de cellules

correspondant à 3 puits repris dans 300 µL de milieu de culture.

Tous les échantillons (RAW sains, activés, parasités) sont mesurés dans les mêmes

conditions. Les mesures sont réalisées, à l’aide du spectromètre RPE Brucker EMX 8/2.7

BDX. Les tubes en quartz sont analysés à 119 K avec les paramètres suivants :

champs magnétique : 3310, 00 G ; balayage ; 140 G ; résolution : 1024 points ; fréquence :

9,465 Hz ; puissance : 20,020 mW ; gain : 20 000 ; phase : 0 ° ; harmonique : 1 ; modulation

fréquence : 100,00 Hz ; amplitude modulation : 5,00 G ; conversion : 81,92 ms ; constante de

temps : 10,24 ms ; temps de balayage : 82 s ; nombre de scans : 10.


2.6 Microscopie confocale

Les mesures par microscopie confocale ont été réalisées à l’aide du microscope confocal LSM

510 à la plateforme d’imagerie cellulaire RIO de l’hôpital de Rangueil (Toulouse). Les

analyses ont été réalisées en présence de 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA) qui

fluoresce à 530 nm lorsqu’elle est excitée à 514 nm.

2.6.1 Erythrocytes

Les analyses sont réalisées sur des globules rouges préalablement immobilisés sur des lames

de microscope par l’intermédiaire de polylysine. Le dépôt de polylysine est réalisé le jour

précédent l’analyse de la manière suivante : 1 ml d’une suspension commerciale de polylysine

diluée à 0,001% dans du PBS est étalé sur la lame de verre qui est ensuite séché pendant au

moins 12 h (une nuit) à température ambiante.

5 µL de la sonde fluorescente 2′,7′-dichlorofluoresceine diacetate (H2DCFDA) à 4 mM dans

le DMSO sont ajoutés à 5 mL des globules rouges (sains ou parasités) à 3% d’hématocrite

dans du milieu de culture (RPMI + hépès). Le mélange est homogénéisé puis incubé 20 min

dans le noir à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% CO2. Les échantillons sont rincés

dans 5 mL de milieu de culture (1600 rpm, 5 min). Le culot de globules rouges est ensuite

repris dans 1 mL de milieu de culture, homogénéisé puis étalé sur la lame préalablement

modifiée par le dépôt de polylysine. Les lames sont incubées à nouveau 20 min à l’abri de la

lumière à 37 °C en présence de 5% de CO2. Afin d’éliminer les globules rouges non

accrochés, les lames sont délicatement rincées avec du PBS. La lame est ensuite recouverte de

la lamelle, l’ensemble étant ensuite conservé à l’abri de la lumière à température ambiante

jusqu’à qu’il soit analysé.

2.6.2 Macrophages

Les analyses sont dans ce cas réalisées pour des macrophages préalablement déposés sur des

lamelles. Le dépôt des macrophages est réalisé en déposant au fond de chaque puits de culture

(plaque de 24 puits), une lamelle préalablement lavée à l’éthanol et séchée en conditions

stériles. Chaque lamelle est alors immergée dans 1 mL de milieu de culture contenant un

million de macrophages. Les cellules sont incubées 2h30 à 37 °C dans une atmosphère

contenant 5% de CO2 puis rincées avec 1 mL de PBS. Après avoir vérifié l’adhérence des

cellules sur le verre à l’aide du microscope optique, 1 mL d’une solution de 2′,7′-

dichlorofluorescein diacetate à 20 µM dans du milieu de culture est ajouté dans chaque puits.

Les cellules sont à nouveau incubées 20 minutes à 37 °C dans une atmosphère contenant 5%

de CO2 puis lavées au PBS.

La stimulation des macrophages par le lipopolysaccharide a été réalisée en ajoutant dans

chaque puits contenant les lamelles recouvertes de RAW après une heure d’incubation, 10 µL

de LPS à 1 mg/mL (concentration finale de LPS : 10 µL/mL). Après 1h30 supplémentaire

d’incubation chaque puits est rincé au PBS. Après avoir vérifié l’adhérence des cellules sur le

verre à l’aide du microscope optique, 1 mL d’une solution de 2′,7′-dichlorofluorescein

diacetate à 20 µM dans du milieu de culture est ajouté dans chaque puits. Les cellules


stimulées sont à nouveau incubées 20 minutes à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de

CO2 puis lavées au PBS.

L’infection des macrophages par Leishmania est réalisée en ajoutant dans chaque puits

contenant les lamelles recouvertes de RAW après 2h30 d’incubation, 5 millions de parasites

(soit 5 parasites pour 1 macrophage). Après 1 h d’incubation, les cellules sont lavées au PBS.

Après avoir vérifié l’adhérence des cellules sur le verre à l’aide du microscope optique, 1 mL

d’une solution de 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate à 20 µM dans du milieu de culture est

ajouté dans chaque puits. Les cellules infectées sont à nouveau incubées 20 minutes à 37 °C

dans une atmosphère contenant 5% de CO2 puis lavées au PBS.

Les lamelles sont ensuite retirées des puits et conservées à l’abri de la lumière à température

ambiante jusqu’à ce qu’elles soient analysées.



La résonance paramagnétique électronique et la microscopie confocale ont été employées afin

d’étudier et de comparer la production d’espèces radicalaires dans les modèles cellulaires.

1. Etude comparative entre globules rouges sains et globules rouges parasités par Plasmodium falciparum

Les expériences de résonance paramagnétique électronique ont été réalisées sur des

échantillons de globules rouges (GR) sains et parasités à forte parasitémie (culture enrichie

avec des parasitémies proches de 95%) provenant du même don.

1.1 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge à l’aide d’une sonde paramagnétique

Dans ce travail, un marqueur de spin hydrophile, le 4-amino-2,2,6,6-tetraméthylpiperidine-1-

oxyl (4-amino-TEMPO), a été employé pour étudier la présence des radicaux dans le

cytoplasme du globule rouge. Cette sonde qui a un temps de vie plus long que les espèces

radicalaires de l’oxygène [Takechi, K. et al., 1997], réagit avec toutes les espèces radicalaires.

L’interaction entre le marqueur de spin et le radical provoque une diminution de la

concentration en forme radicalaire du 4-amino-TEMPO et par conséquent une diminution de

l’intensité du signal RPE.

NCH3

CH3

CH3

H3C X

O

NCH3

CH3

CH3

H3C

O

X 4-amino-TEMPO radicalaire Adduit non radicalaire

Signal RPE Pas de signal RPE

Les figures 4.1 et 4.2 présentent les spectres RPE obtenus, respectivement, pour des globules

rouges sains et parasités en présence du marqueur de spin 4-amino-TEMPO, à différents

temps d’incubation.

Le triplet caractéristique du 4-amino-TEMPO (aN = 1,682 mT et g = 2,006 [Takechi, K. et al.,

1997]) a été détecté pour les deux échantillons. Les spectres comprennent la superposition de

sept enregistrements correspondants aux mesures réalisées toutes les dix minutes, entre 0 et

60 minutes. Les spectres mettent en évidence une diminution de l’intensité du signal RPE au

cours du temps.


0 1000 2000 3000 4000

1.50x104

1.75x104

2.00x104

t 60 min

t 50 min

t 40 min

t 30 min

t 20 min

t 10 min

t 0 min

I

B (G)

t

0 1000 2000 3000 4000

1.50x104

1.75x104

2.00x104

t 60 min

t 50 min

t 40 min

t 30 min

t 20 min

t 10 min

t 0 min

I

B (G)

t

0 1000 2000 3000 4000

1.50x104

1.75x104

2.00x104

t 60 min

t 50 min

t 40 min

t 30 min

t 20 min

t 10 min

t 0min

I

B (G)

t

0 1000 2000 3000 4000

1.50x104

1.75x104

2.00x104

t 60 min

t 50 min

t 40 min

t 30 min

t 20 min

t 10 min

t 0min

I

B (G)

t

Figure 4.1. Spectre RPE du 4-amino-TEMPO, pour différents temps d’incubation (de 0 à 60 min) en

présence de globules rouges sains.

Figure 4.2. Spectre RPE du 4-amino-TEMPO, pour différents temps d’incubation (de 0 et 60 min) en

présence de globules rouges parasités.

La figure 4.3 présente l’évolution de l’intensité du signal du 4-amino-TEMPO (pic central) en

fonction du temps pour les globules sains et les globules rouges parasités.

L’évolution de l’intensité du signal RPE observée figure 4.3 met en évidence la diminution du

signal du 4-amino-TEMPO en présence d’érythrocytes sains et parasités conformément à ce

qui est décrit dans la littérature [Deslauriers, R. et al., 1987].


0 10 20 30 40 50 60

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000 GR sains

GR parasités

Inte

nsité

du

pic

Temps (min)

Figure 4.3. Evolution de l’intensité du pic du 4-amino-TEMPO, pour différents temps d’incubation

(de 0 à 60 min), en présence de globules rouges sains () et parasités().

Il est important de noter que l’intensité initiale du pic central (t = 0 min) est différente entre

globules rouges sains (I0 = 6700) et parasités (I0 = 7700). La vitesse de diminution du signal

est quand à elle identique quelque soit l’état des cellules. Ces résultats montrent que la

réduction de la sonde est équivalente quelques soit la nature des cellules.

Deux types de réactions peuvent expliquer la décroissance du signal RPE en fonction du

temps :

la réaction entre la sonde radicalaire et une espèce radicalaire aboutissant à des

espèces non radicalaires

la réduction de la sonde par une molécule antioxydante

Le 4-amino-TEMPO peut, en effet, être réduit entrainant la disparition de son caractère

radicalaire. Dans notre cas la réduction peut être due aux systèmes antioxydant de la cellule

mais également du parasite dans le cas des globules rouges parasités. En particulier il est

possible que la réduction se fasse par l’intermédiaire du glutathion (GSH).

Le glutathion ayant un rôle protecteur chez la cellule parasitée, il serait par conséquent moins

disponible pour réduire la sonde chez les globules rouges parasitées par rapport aux cellules

saines, ce qui qui pourrait expliquer une intensité de la sonde toujours supérieure pour les

érythrocytes parasités.

Afin de s’affranchir de l’effet réducteur du glutathion et d’analyser la réduction de la sonde

provenant uniquement d’une réaction avec des espèces radicalaires, les mêmes expériences

ont été réalisées sur des globules rouges dépourvus de glutathion.


1.1.1 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge dépourvu de glutathion et de glutathion réductase

Un traitement par alkylation avec le 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) permet

l’élimination du glutathion des globules rouges et du parasite [Awasthi, YC. et al., 1981, Ayi,

K. et al., 1998]. Awasthi et al. ont démontré que l’inhibition du glutathion des érythrocytes

n’induisait ni de lyse ni de libération d’hémoglobine indiquant que le globule rouge restait

intact.

Cependant, la cellule et le parasite possèdent leur propre système de régénération de

glutathion par le biais de l’enzyme, la glutathion réductase (GSHR) (cf. Chapitre 1 §1).

L’ajout de CDNB a permis l’élimination du glutathion au temps t = 0, mais n’a pas inhibé sa

production en continu. Par conséquent, afin d’éliminer complètement le glutathion du globule

rouge il est important d’inhiber non seulement le glutathion mais également la glutathion

réductase.

Le 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourée (BCNU) est un inhibiteur très spécifique de la

glutathion réductase [Zhang, Y. et al., 1988]. Le protocole d’inhibition de l’enzyme est plus

complexe et nécessite une incubation de 48 heures [Zhang, Y. et al., 1988]. Notons que le

BCNU a fait l’objet d’étude d’activité antipaludique [Zhang, Y. et al., 1988]. Une fois la

glutathion réductase inhibée dans le globule rouge, le glutathion est éliminé par l’ajout de

CDNB.

L’ajout de CDNB et de BCNU agit, respectivement, sur le glutathion et son enzyme de la

cellule hôte ainsi que ceux du parasite. L’élimination de la glutathion réductase dans la cellule

parasitée provoque une baisse de la parasitémie des cultures de Plasmodium. L’inhibition de

l’enzyme empêche la régénération du GSH, laissant le parasite dans un milieu ayant moins

d’antioxydants moléculaires. La baisse de la concentration en antioxydant dans la cellule

entraîne, de fait, une augmentation des espèces oxydantes.

Les mesures sur les deux échantillons de globules rouges (sains et parasités) ont de nouveau

été réalisées en présence de 4-amino-TEMPO.

a. Globules rouges sains

La figure 4.4 présente l’évolution de l’intensité du signal du 4-amino-TEMPO ajouté à une

suspension de globules rouges sains, dépourvus de glutathion et de glutathion réductase.

L’intensité initiale (t = 0 min) des spectres est légèrement différente entre globules rouges

sains non traités (I0 = 6700) et globules rouges sains traités (I0 = 7200). Cette faible différence

démontre que l’action du glutathion sur la sonde est immédiate, car en l’absence de glutathion

(globule rouge traités) la sonde est moins réduite au temps t = 0, ce qui se traduit par une

intensité plus forte.


0 10 20 30 40 50 60

2000

3000

4000

5000

6000

7000

GR sains

GR sains démunis de glutathion

GR sains démunis de glutathion et de glutathion réductase

Inte

nsité

du

pic

Temps (min)


(de 0 à 60 min), en présence de globules rouges sains () dépourvus de glutathion (▲)

et de glutathion réductase (●).

Le tableau 4.1 présente les valeurs moyennes des pentes de chacune des courbes. Il apparait

clairement que la présence du glutathion accélère fortement la disparition du signal.

Tableau 4.1. Pente des courbes correspondant à la vitesse de disparition du signal du 4-amino-TEMPO

en présence de globules rouges sains traités ou non (Figure 4.8).

Non traités Dépourvus de GSH Dépourvus de GSH et

GSHR

GR sains

(unité/minute) 82 ± 5 24 ± 3 37 ± 2

La diminution de l’intensité du signal passe de 82 unités/minute pour les globules rouges

sains non traités à 24 unités/minute pour les globules rouges sains dépourvus de GSH et à

37 unités/minute pour les cellules saines dépourvues de GSH et de GSHR.

La vitesse moyenne de consommation de la sonde par les globules rouges dépourvus de GSH

est donc moins importante que pour les érythrocytes dépourvus à la fois du GSH et de la

GSHR. L’évolution est la même pour les 10 premières minutes après lesquelles des

différences apparaissent. Au bout de 10 minutes la diminution du signal semble se stabiliser

dans le cas des globules rouges dépourvus de glutathion alors que celle-ci s’intensifie dans le

cas de cellules dépourvues de GSH et de GSHR. Ce palier pourrait correspondre au temps

nécessaire à la cellule pour régénérer son GSH. Après 40 minutes l’intensité du signal

diminue à nouveau. Dans le cas des globules rouges sains dépourvus de de GSH et de GSHR,

l’intensité du signal diminue de manière constante pendant toute la durée de l’analyse.


Afin de mettre en évidence l’effet de l’infection vis-à-vis de la production d’espèces

radicalaires au sein de la cellule, les mêmes analyses ont été réalisées pour des globules

rouges parasités par Plasmodium.

b. Globules rouges parasités par Plasmodium falciparum

La figure 4.5 présente l’évolution de l’intensité du pic du 4-amino-TEMPO obtenue pour des

érythrocytes parasités (culture enrichie) en présence ou non de glutathion et de glutathion

réductase, pour des temps d’incubation compris entre 0 et 60 minutes.

Comme dans le cas des globules rouges sains, la sonde est d’avantage réduite au temps

t = 0 minute pour des globules rouges parasités non traités. Conformément à ce qui est

observé pour les cellules saines, ces résultats indiquent que la réduction de la sonde par le

GSH débute rapidement.

0 10 20 30 40 50 60

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000 GR parasités

GR parasités démunis de glutathion

GR parasités démunis de glutathion et de glutathion réductase

Inte

nsité

du

pic

Temps (min)


(de 0 à 60 min), en présence de globules rouges parasités () dépourvus de glutathion (▲)

et de glutathion réductase (●).

Le tableau 4.2 présente les valeurs des pentes des courbes d’intensité du 4-amino-TEMPO

calculées pour les trois courbes de la figure 4.5.


en présence de globules rouges parasités traités ou non (Figure 4.9).


GSHR

GR parasités

(unité/minute) 85 ± 2 39 ± 1 61 ± 1


0 10 20 30 40 50 60

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

GR parasités non traités

GR parasités dépourvus de GSH

GR parasités dépourvus de GSH et de GSHR

GR sains non traités

GR sains dépourvus de GSH

GR sains dépourvus de GSH et de GSHR

Inte

nsité

du

pic

Temps (min)

I0

0 10 20 30 40 50 60

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

GR parasités non traités

GR parasités dépourvus de GSH

GR parasités dépourvus de GSH et de GSHR

GR sains non traités

GR sains dépourvus de GSH

GR sains dépourvus de GSH et de GSHR

Inte

nsité

du

pic

Temps (min)

I0

La vitesse de diminution de l’intensité du signal la plus importante correspond aux globules

rouges parasités non traités comme dans le cas des globules rouges sains. La plus faible

vitesse est également obtenue dans le cas des globules rouges dépourvus de GSH

(39 unités/minute).

Afin d’obtenir des renseignements sur l’effet de l’infection, les résultats obtenus pour les

érythrocytes sains et parasités ont été comparés.

c. Etudes comparatives entre globules rouges sains et parasités

La figure 4.6 présente la superposition de toutes les courbes de décroissance de l’intensité du

signal RPE du 4-amino-TEMPO obtenues en présence de globules rouges sains ou parasités,

traités ou non.

Figure 4.6. Evolution de l’intensité du pic du 4-amino-TEMPO, pour différents temps d’incubation (de

0 à 60 min), en présence de globules rouges parasités () dépourvus de glutathion ( )

et de glutathion réductase ( ), et de globules rouges sains () dépourvus de glutathion ( ) et de glutathion réductase (○).

Les intensités initiales des signaux diffèrent entre globules rouges sains et parasités. Les

intensités initiales sont supérieures dans le cas des globules rouges parasités. Ces résultats

indiquent que pour une même concentration initiale de 4-amino-TEMPO la réduction est plus

importante, à t = 0 minute, pour les cellules saines que pour les globules rouges parasités.

Cette différence pourrait provenir du fait que dans un érythrocyte parasité, le glutathion est

déjà impliqué dans un processus de détoxification de la cellule infectée et est par conséquent

moins disponible pour réduire rapidement la sonde.


Le tableau 4.3 présente les valeurs des pentes des courbes d’intensité du 4-amino TEMPO

calculées pour les trois courbes obtenues sur globules rouges sains (Figure 4.4) et sur globules

rouges parasités (Figure 4.5).


en présence de globules rouges sains traités ou non (Figure 4.8) et de globules rouges parasités traités

ou non (Figure 4.9).


GSHR

GR sains

(unité/minute) 82 ± 5 24 ± 3 37 ± 2

GR parasités

(unité/minute) 85 ± 2 39 ± 1 61 ± 1

Il est important de noter que les vitesses de disparition du signal RPE des cellules non traitées

sont comparables (85 unités/minute contre 82 unités/minute) quelques soit leur état, sain ou

parasité. Le glutathion étant moins disponible dans les cellules infectées, ce résultat semble

indiquer que dans le cas des globules rouges parasités un autre phénomène est responsable de

la diminution du signal.

La réduction avec une espèce radicalaire pourrait expliquer les différences entre globules

rouges sains et globules rouges parasités. Atamna et al. ont notamment démontré que des

érythrocytes parasités par Plasmodium falciparum produisaient deux fois plus de radicaux

hydroxyle (•OH) et de H2O2 que des globules rouges sains [Atamna, H. et al., 1993, Playfair,

JHL. et al., 1985]. Dans le cas des globules rouges parasités non traités, la réduction de la

sonde par réaction avec une espèce radicalaire compenserait la moins grande disponibilité du

glutathion, ce qui expliquerait que l’on obtienne néanmoins des vitesses de disparition

comparables.

Les expériences sur les cellules saines et parasitées dépourvues à la fois de GSH et de son

enzyme, qui participent en grande partie au système de détoxification des cellules, mettent en

avant une diminution de l’intensité de la sonde supérieure dans le cas des globules rouges

infectés (61 unités/minute) par rapport aux cellules saines (37 unités/minute). Ce résultat

indique que les érythrocytes parasités produisent des espèces radicalaires en plus grande

quantité, normalement détoxifiés par le système antioxydant du parasite GSH/GSHR.

D’autre part il est important de noter que contrairement au cas des globules rouges sains

dépourvus de glutathion, la diminution de l’intensité pour les globules rouges parasités

dépourvus de GSH est continue et ne présente pas de palier. Ce résultat est également en

faveur d’une autre voie de disparition du signal. Cette différence, pourrait en effet provenir du

fait que le parasite génère également son propre glutathion [Krauth-Siegel, RL. et al., 1996,

Müller, S., 2004] et que cette régénération est beaucoup plus rapide que celle du globule

rouge [Ayi, K. et al., 1998].

Ces expériences de RPE nous ont donc permis de mettre en évidence la production d’espèces

radicalaires suivant l’état du globule rouge et de mettre en évidence le rôle du couple

GSH/GSHR.


1.2 Evaluation de la production d’espèces radicalaires dans le globule rouge à l’aide d’une sonde fluorescente

Certaines sondes fluorescentes détectent la production cellulaire d’espèces radicalaires. Ces

sondes sont des marqueurs du stress oxydant via le piégeage de radicaux. Elles peuvent être

mesurées par différents outils [Halliwell, B. et al., 2004], notamment par microscopie

confocale qui est un outil puissant permettant à la fois de visualiser les sondes (présence de

pixel flourescent) et de quantifier la fluorescence émise. La sonde la plus utilisée est la

dichlorofluoresceine diacetate (H2DCFDA). Elle a la caractéristique de pénétrer dans les

cellules et de s’accumuler dans le cytosol. L’H2DCFDA est, tout d’abord, déacétylée par une

estérase en dichlorofluoresceine (H2DCFH). Ce produit non fluorescent réagit ensuite avec

des radicaux pour former la dichlorofluoresceine desestérifiée (H2DCF) qui fluoresce à

530 nm quand elle est excitée à 514 nm. Cette sonde permet la détection des RO•, ROO

•,

NO•2, CO3

• -,

•OH, et

•NO.

Des échantillons de globules rouges sains et parasités (5% de parasitémie) en présence de la

sonde 2′,7′-dichlorofluoresceine diacetate (H2DCFDA) ont été immobilisés sur des lames de

microscope puis observés au microscope confocal (cf. partie expérimentale § 2.6.a). Cette

sonde n’étant pas sélective, ces mesures permettent d’obtenir une vision globale de la

présence d’espèces radicalaires.

Les figures 4.7 et 4.8 présentent les clichés (x 63) des globules rouges sains et des globules

parasités respectivement immobilisés sur des lames de microscope après traitement avec la

sonde H2DCFDA. L’observation des cellules a été réalisée dans le visible et à 530 nm pour

une longueur d’onde d’excitation égale à 514 nm. La superposition des deux clichés permet

de localiser la fluorescence de la sonde.

L’analyse des clichés démontre la présence de spots fluorescents dans le cas de la culture de

globules rouges parasités alors que ce n’est pas le cas pour les cellules saines. La culture

d’érythrocytes infectés étant à une faible parasitémie (5%), seul les cellules parasitées

fluorescent. Ce résultat confirme, comme dans le cas des analyses RPE, la production

d’espèces radicalaires dans le cas de globules rouges parasités par Plasmodium.

L’utilisation de sondes spécifiques, analysées par résonance paramagnétique électronique et

par microscopie confocale, a permis de mettre en évidence la production d’espèces

radicalaires intracellulaire chez le globule rouge infecté par Plasmodium falciparum.

L’homéostasie rédox étant la cîble de certains antipaludiques, ces deux méthodes analytiques

pourraient être utilisées pour l’étude de nouvelles molécules antipaludiques vis à vis de cette

production radicalaire afin de mieux comprendre leur mécanisme d’action.


(a)(b)

(Superposition a + b)

(a)(b)


(a)(b)


(a)(b)


Figure 4.7. Cliché de globules rouge sains (x63) en présence de H2DCFDA observés

dans le visible (a) et à λ = 530 nm (b).

Figure 4.8. Clichés de globules rouges parasités (x 63) en présence de H2DCFDA observés dans le

visible (a) et à λ = 530 nm (b).


2. Etude comparative entre macrophages sains, macrophages parasités et macrophages activés

L’infection par Leishmania provoque également des dommages importants chez la cellule.

Comme après toute agression, la cellule se défend contre l’infection par la production

d’espèces radicalaires néfastes pour le parasite. Des mesures des résonance paramagnétique

électronique et de microscopie confocale ont été réalisées sur les trois états du macrophage

(sain, infecté et activé) dans le but d’analyser la réponse cellulaire en fonction de l’agression

et de confirmer les résultats obtenus avec le biocapteur cellulaire.

2.1 Evaluation de la production radicalaire chez le macrophage soumis à divers stimuli

Dans un premier temps, la spectroscopie de résonance paramagnétique électronique a été

employée pour mettre en évidence des différences de comportement chez le macrophage

activé par lipopolysaccharide (LPS), et la cellule parasitée par Leishmania amazonensis par

rapport aux cellules saines compte tenu des résultats surprenants enregistrés avec le

biocapteur cellulaire. Dans le cas des macrophages, la détection spécifique du radical •NO a

été choisie. Les macrophages libèrent, en effet, de grande quantité de monoxyde d’azote lors

de divers stimuli [MacMicking, J. et al., 1997, Stuehr, DJ. et al., 1987, Winberg, EM. et al.,

2007]. Le monoxyde d’azote radicalaire (•NO) est l’espèce radicalaire de l’azote la plus

abondante. Il possède un rôle protecteur en participant, à la fois au maintien de l’homéostasie,

et en réagissant avec certains espèces radicalaires de l’oxygène pour protéger la cellule, ainsi

qu’aux contrôles des fonctions vasculaires. La production de monoxyde d’azote radicalaire

étant commune dans la plupart des voies métaboliques cellulaires, il est logiquement impliqué

dans plusieurs pathologies, comme le diabète, les pathologies gastro-intestinales, dans des

fonctions pulmonaires, l’athérosclérose [Delattre, J. et al., 2005] et Leishmania [Gantt, KR. et

al., 2001]. Le •NO est synthétisé à partir de L-arginine, d’une molécule d’oxygène et d’une

famille de NO synthases, les NOS.

NOS

L-arginine + O2 Ng-OH-L-arginine L-citruline + •NO

La détection du monoxyde d’azote dans les cellules infectées par Leishmania est cruciale

étant donné le rôle majeur de cette espèce dans la destruction du parasite. Winberg et al. ont

mesuré l’impact du •NO sur l’infection par Leishmania sur des macrophages activés au

préalable par LPS. Ils ont démontré que la présence de •NO, mesuré par le test de Griess, dans

la cellule réduisait les chances de survie du parasite [Winberg, EM. et al., 2007]. Des études

similaires antérieures avaient mis en évidence ce phénomène, en utilisant la

chimiluminescence pour mesurer le •NO produit par le macrophage activé après infection par

Leishmania [Liew, FY. et al., 1990].

Les expériences ont débutés par des mesures sur des cellules stimulées par l’ajout de LPS qui

engendre la production de monoxyde d’azote chez le macrophage.


3260 3280 3300 3320 3340 3360 3380

-200000

-100000

0

100000

200000

300000

RAW activés par LPS

RAW non traités

I

B (G)

3260 3280 3300 3320 3340 3360 3380

-200000

-100000

0

100000

200000

300000

RAW activés par LPS

RAW non traités

I

B (G)

2.1.1 Evaluation du •NO dans le macrophage stimulé par LPS

Le complexe diéthyldithiocarbamate de fer [Fe(DETC)2]2+

permet le piégeage du radical •NO

[Pieper, GM. et al., 2003, Vanin, AF. et al., 2007]. En présence de [Fe(DETC)2]2+

et de

monoxyde d’azote, un nouveau complexe stable se forme [Fe(DETC)2NO]2+

détectable par

résonance paramagnétique électronique.

La figure 4.9 présente les spectre RPE obtenus pour des macrophages non traités et activés

4 heures par du LPS à 10 µg/mL.

Le triplet caractéristique de la présence du complexe [Fe(DETC)2NO]2+

(gmoy = 2,039),

obtenu pour l’échantillon stimulé par LPS, atteste de la présence de •NO due à l’activation des

macrophages par l’ajout de lipopolysaccharide. Cette expérience confirme des travaux

précédents mettant en évidence la production de •NO par des macrophages activés par LPS,

souvent détecté par le test de Griess qui consiste à mesurer la concentration du couple

NO2-/NO3

- [Cherng, SC. et al., 2007, Lee, JW. et al., 2007, Winberg, EM. et al., 2007]. De

plus, l’absence du triplet pour l’échantillon non traité renforce le résultat, démontrant que la

production de •NO provient uniquement de l’action du LPS.

Figure 4.9. Spectre RPE de macrophages stimulés par ajout de LPS, en présence de [Fe(DETC)2]

2+.


2.1.2 Evaluation du •NO dans le macrophage infecté par Leishmania amazonensis promastigote

La figure 4.10 présente les spectres RPE obtenus sur des macrophages sains et des

macrophages parasités par Leishmania amazonensis promastigotes, en présence du piégeur

[Fe(DETC)2]2+

. Le triplet caractéristique du complexe [Fe(DETC)2NO]2+

n’a pas été observé

pour les deux échantillons. La formation du complexe [Fe(DETC)2NO]2+

n’a donc pas eu lieu

traduisant l’absence de •NO en quantité suffisante dans les cellules saines et parasitées pour

être détecté.

3260 3280 3300 3320 3340 3360 3380

-150000

-100000

-50000

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

Macrophages sains

Macrophages parasités

I

B (G)

Figure 4.10. Spectre RPE obtenu pour des macrophages sains et infectés par Leishmania

amazonensis promastigotes, pour un temps d’incubation de 24 heures, en présence de [Fe(DETC)2]2+

.

Cependant, la production d’espèces radicalaires après infection des macrophages par

Leishmania a déjà été mise en évidence. La détection du radical superoxyde (O2•-) par RPE à

l’aide d’une sonde 4-hydroxy-2,62,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl sur des macrophages

infectés par Leishmania chagasi a notamment été réalisée [Gantt, KR. et al., 2001]. Les

travaux effectués sur la compréhension des mécanismes rédox mis en jeu lors de l’infection

par Leishmania consistent souvent à provoquer la formation du •NO dans les cellules, en

activant les macrophages par ajout de LPS, afin d’étudier l’action de •NO sur le parasite en

étudiant la cytotoxicité par exemple [Romao, PRT. et al., 2006].

Dans notre étude, les cellules ne sont pas activées au préalable et l’utilisation du complexe

[Fe(DETC)2]2+

a pour objectif de détecter le •NO produit par le système de défense

immunitaire de la cellule uniquement provoquée par l’infection. L’absence du monoxyde

d’azote observé dans l’échantillon parasité (Figure 4.10) peut être expliqué par différents

mécanismes. Lors de l’infection, le parasite active ses systèmes de défense pour contrer les

attaques de la cellule hôte. Les procédés biochimiques créés engendrent un nouvel équilibre


rédox dans le macrophage. La production de radicaux oxygénés tel que le radical superoxyde

O2•- a été mis en évidence lors de la phagocytose du parasite, alors que la production de

monoxyde d’azote semble apparaitre à un état plus tardif après la transformation du parasite

en amastigote (Cf. Chapitre 1 §1) [Gantt, KR. et al., 2001]. Leishmania arrive à détourner la

production d’espèces radicalaires à son avantage. La figure 4.11 présente un schéma simplifié

des différents mécanismes de détoxification du •NO par le parasite. Le parasite utilise des

glycolipidiques présent à sa surface, les lipophosphoglycanes (LPG), pour inhiber la NO

synthase, enzyme responsable de la formation du •NO. De plus, Leishmania est muni

d’antioxydant tel que le glutathion [Romao, PRT. et al., 2000] et la trypanothione (T(SH)2)

pour agir sur les radicaux.

Figure 4.11. Schéma des mécanismes de détoxification de Leishmania.

La production du monoxyde d’azote par les macrophages stimulés par LPS a été largement

démontrée par différentes techniques (test de Griess, chimiluminescence, RPE) [Cherng, SC.

et al., 2007, Ferret, PJ. et al., 2002, Lee, JW. et al., 2007]. En contre partie l’étude par

résonance paramagnétique électronique de la production de •NO par des macrophages infectés

par Leishmania amazonensis, sans activation au préalable des cellules par l’ajout de LPS, est

plus restreinte. Cette technique pourrait donc être appliquée aux cellules parasitées par

Leishmania à un stade plus tardif (forme amastigote) de l’infection afin de mieux étudier

l’action du monoxyde d’azote sur le parasite.

Comme nous l’avons expliqué précédemment, la défense cellulaire ne se limite pas à la

formation du monoxyde d’azote. La cellule produit d’autres espèces radicalaires tel que les

ERO également toxiques pour le parasite. Pour cette raison, comme dans le cas des globules

rouges parasités, des études de microscopie confocale ont été mises en oeuvre afin de

visualiser de manière globale la production radicalaire se produisant au niveau du macrophage

infecté ou stimulé.

Détoxifie

Amastigote

•NO

GSSGGSH

T(SH)2

T(SH)2 TS2

TR

Transformation

Inhibe NOS

LPG

Leishmania

Promastigote

Phagocytose

Macrophage

Détoxifie

Amastigote

•NO

GSSGGSH

T(SH)2

T(SH)2 TS2

TR

Transformation

Inhibe NOS

LPG

Leishmania

Promastigote

Phagocytose

Macrophage


(a)(b)


(a)(b)


2.2 Evaluation globale de la production d’espèces radicalaires chez le macrophage

La sonde fluorescente dichlorofluoresceine diacetate (H2DCFDA), utilisée précédemment sur

les globules rouges, a été employée afin d’observer la présence de radicaux dans les

macrophages sains, activés par LPS et parasités par Leishmania préalablement immobilisés

sur des lamelles en verre puis analysés par microscopie confocale (cf. partie expérimentale

§2.6.b).

Les figure 4.12, 4.13 et 4.14 présentent respectivement les clichés de macrophages sains,

activés par LPS et parasités par Leishmania amazonensis.

Figure 4.12. Clichés de macrophages (x 63) sains en présence de H2DCFDA

observés dans le visible (a) et à λ = 530 nm (b).


(a)(b)


(a)(b)


(a)(b)


(a)(b)


Figure 4.13. Clichés de macrophages (x 63) activés par ajout de LPS en présence de

H2DCFDA observés dans le visible (a) et à λ = 530 nm (b).

Figure 4.14. Clichés de macrophages parasités (x 63) par Leishmania amazonensis

en présence de H2DCFDA observés dans le visible (a) et à λ = 530 nm (b).


L’analyse de ces clichés apporte plusieurs informations.

Dans un premier temps, les clichés de macrophages sains montre une activité radicalaire quasi

inexistante. L’expérience n’a donc pas endommagé les cellules saines ne provoquant pas de

dégâts cellulaires.

La comparaison des figures 4.12 et 4.13, respectivement, met clairement en évidence une

émission de fluorescence au niveau des macrophages beaucoup plus importante dans le cas

des macrophages stimulés par ajout de LPS par rapport aux cellules saines. Une importante

émission de fluorescence indique la présence de radicaux de type RO•, ROO

•, NO2

•,

•NO,

CO3•- ou

•OH dans le macrophage.

Les analyses réalisées sur des RAW parasités met en évidence une fluorescence encore plus

importante que pour les macrophages stimulés traduisant une production radicalaire intense.

L’infection par Leishmania provoque en effet une défense cellulaire très active, avec la

formation intracellulaire de nombreuses espèces radicalaires, comprenant des espèces

radicalaires de l’oxygène et de l’azote.

Compte tenu des résultats obtenus par RPE, il semblerait, comme nous l’avions supposé suite

aux études réalisées avec le biocapteur cellulaire (cf. Chapitre 3), que la réponse cellulaire

est différente entre un macrophage stimulé et un macrophage infecté. En particulier, il

semblerait que la nature des radicaux produits soit différente : la stimulation par le LPS

contrairement à l’infection produirait des radicaux azotés de type •NO [Jorens, PG. et al.,

1995]. Dans le cas de l’infection parasitaire, les radicaux produits pourraient être différents.

Il est difficile à ce stade de conclure quant aux quantités produites car nous ne connaissons

pas l’affinité de la sonde pour chaque radical.

Conclusion

Le cycle érythrocytaire de Plasmodium ainsi que l’infection de Leishmania d’un macrophage

demeurent le sujet de nombreuses recherches puisque ces deux infections sont les deux

maladies parasitaires les plus importantes au monde. La compréhension des mécanismes

rédox mis en jeu reste une étape clef pour une meilleure compréhension des étapes clés du

développement du parasite. Ce chapitre avait pour but de rendre compte de l’état rédox

cellulaire par des techniques différentes du biocapteur cellulaire, afin de compléter les

informations.

Etant donné que l’agression cellulaire provoque une modification de l’équilibre rédox de la

cellule hôte, les analyses se sont focalisées sur la détection d’espèces radicalaires. Une étude

comparative des différents états cellulaires du globule rouge et du macrophage a été réalisée.

Les résultats obtenus sont différents entre Plasmodium et Leishmania.

Plasmodium survit dans les érythrocytes en digérant de grande quantité d’hémoglobine

provoquant la libération d’hème toxique pour le parasite et la production d’espèces

radicalaires produites par le système immunitaire de la cellule. Le parasite doit par conséquent

à la fois détoxifier la cellule des radicaux par le biais d’antioxydants et stocker l’hème en

hémozoine. L’utilisation des sondes a permis de mettre en évidence la formation

intracellulaire de radicaux après infection de la cellule. Les expériences ont également révélé


le rôle majeur du glutathion dans la cellule parasitée. En son absence, le parasite se retrouve

démuni face aux attaques incessantes de la cellule.

Leishmania promastigote est phagocyté par le macrophage puis évolue en amastigote,

provoquant une défense cellulaire. Le macrophage produit en effet de grande quantité de

radicaux néfastes pour le parasite. Les expériences précédentes ont mis en avant une

production d’espèces radicalaires de l’oxygène importante dès le premier stade d’infection,

contrairement au monoxyde d’azote qui n’a pas été détecté. Il semblerait que le macrophage

active sa production de •NO après la transformation du parasite en amastigote. L’effet toxique

du •NO sur le parasite a été mis en évidence dans de précédent travaux, cependant sa

formation tardive et les procédés biochimiques de détoxification du parasite pourraient

expliquer en partie la survie du parasite dans le macrophage.

Ce chapitre a permis de confirmer et de mettre en avant des comportements spécifiques de

chaque infection parasitaire. Il serait intéressant de compléter ces expériences par l’utilisation

de piégeurs plus spécifiques afin d’identifier les différentes espèces radicalaires. L’inhibition

de GSH pourrait également être étudié chez Leishmania qui semble ne pas autant dépendre de

ses antioxydants puisque Leishmania arrive à réguler la production de radicaux du

macrophage.


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Conclusion

Conclusion

151

Conclusion

Ce mémoire avait pour but d’étudier le stress oxydant global généré lors des cycles

parasitaires de Plasmodium falciparum et Leishmania amazonensis dans leur cellule hôte,

respectivement, le globule rouge et le macrophage. Différents outils technologiques

permettant de différencier les états cellulaires, sain et parasité, ont ainsi été employés. La

particularité de ce travail est d’avoir utilisé la technologie innovante des biocapteurs

cellulaires impédancemétriques. En effet, cette technologie, émergente dans de nombreux

domaines, n’avait jamais été adaptée à l’étude de cellules parasitées.

Le biocapteur, appliqué aux deux modèles cellulaires, a permis de différencier les cellules

hôtes avant et après infection grâce à la modélisation des diagrammes de Nyquist en circuit

électrique équivalent judicieusement choisis. Le biocapteur cellulaire impédancemétrique

donne une information globale sur les changements physiologiques se produisant au niveau

des cellules.

Le chapitre 2 présente pour la première fois la possibilité de réaliser des mesures par

spectroscopie d’impédance électrochimique sur des globules rouges immobilisés sur une

électrode d’or pour une caractérisation globale des changements physiologiques affectant la

cellule après invasion par Plasmodium falciparum. Cette technique permet de mettre en

évidence des évènements spécifiques ayant lieu après l’invasion du globule rouge par

Plasmodium, comme la perméabilisation de la membrane cellulaire, le relargage d’espèces

réductrices ainsi que l’augmentation de la consommation d’oxygène.

Le chapitre 3 présente des mesures de spectroscopie d’impédance électrochimique réalisées

sur des macrophages parasités par Leishmania ou stimulés par ajout de lipopolysaccharide

qui ont permis de mettre en évidence la production d’espèces rédox en fonction de l’état

cellulaire. Le biocapteur cellulaire à base de macrophages a ainsi détecté la production

d’espèces dues à l’infection ou à l’activation de la cellule telles que des espèces chargées et

des espèces électroactives.

Le chapitre 4 avait pour but de rendre compte de l’état rédox cellulaire par des techniques

différentes du biocapteur cellulaire, afin de compléter les informations. Des mesures basées

sur la détection d’espèces radicalaires ont été mises en oeuvre à l’aide de la résonance

paramagnétique électronique et par microscopie confocale en utilisant des sondes appropriées.

Les résultats ont mis en évidence la production d’espèces radicalaires et ont ainsi permis de

confirmer et de mettre en avant des comportements spécifiques de chaque infection

parasitaire.

Les résultats encourageants obtenus permettent d’envisager des analyses plus approfondies

notamment sur l’étude des cycles d’infection au cours du temps. Il serait, en effet, intéressant

de suivre à l’aide du biocapteur cellulaire à la fois le cycle érythrocytaire de Plasmodium et le

cycle d’infection de Leishmania, afin d’étudier plus amplement les changements

physiologiques des cellules infectées à chaque stade du développement du parasite dans la

Conclusion

152

cellule hôte. Ces expériences permettraient d’étudier l’effet de nouvelles molécules à

potentialité antiplasmodiale ou leishmanicide comparativement aux antiparasitaires de

références.

Enfin, le biocapteur cellulaire pourrait être modifié en incorporant, comme électrode de

travail, une électrode multiparamétrique qui permettrait la détection simultanée de différents

ions. Nous avons, en effet, constaté que les deux infections provoquent chez leur cellule hôte

des perturbations au niveau de leurs canaux ioniques (ex : Na+, K

+, Cl

-). L’utilisation d’une

électrode multiparamétrique permettrait par conséquent de cibler plus précisément les espèces

produites avant et après infection et d’examiner ensuite l’influence de nouvelles molécules

antiparasitaires sur ces échanges.

Elaboration of an impedimetric cell-based sensor for the measurements of physiological changes affecting parasitized cell

The aim of the present work was to study physiological changes affecting parasitized cells

and due to oxidative stress originating from the infection using electrochemical impedance

spectroscopy. Impedimetric studies carried out with in one hand red blood cells parasitized by

Plasmodium falciparum (malaria agent) and in the other hand macrophages infected by

Leishmania amazonensis responsible of leishmaniasis allow differentiation between healthy

and infected states of the host cell. In the case of infected macrophages, this innovative

technology allows the detection of species due to oxidative stress which has been highlighted

elsewhere by other techniques such as electronic paramagnetic resonance and confocal

microscopy.

AUTEUR : Clotilde Ribaut

TITRE : Elaboration d’un biocapteur cellulaire impédancemétrique pour la mesure des

changements physiologiques affectant la cellule parasitée

DIRECTEUR DE THESE : Pr. Françoise Nepveu

LIEU ET DATE DE SOUTENANCE : Université Paul Sabatier, le 28 novembre 2008

_________________________________________________________________________________ RESUME :

L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier les changements physiologiques affectant des

cellules parasitées du à l’état de stress oxydant provenant de l’infection, à l’aide de la

spectroscopie d’impédance électrochimique. Les études impédancemetriques réalisées d’une

part sur des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum (agent pathogène du

paludisme), et d’autre part sur des macrophages infectés par Leishmania amazonensis

responsable de la leishmaniose ont mis en évidence des différences entre les deux états

cellulaires, sain et parasité des cellules hôtes. Dans le cas des macrophages infectés, cette

technologie innovante a permis la détection d’espèces du à l’état de stress oxydant de la

cellule hôte, qui ont par ailleurs été détectées par d’autres techniques, la résonance

paramagnétique électronique et la microscopie confocale.

_________________________________________________________________________________MOTS-CLES :

Biocapteur cellulaire, spectroscopie d’impédance électrochimique, résonance paramagnétique

électronique, microscopie confocale, globule rouge, Plasmodium, macrophage, Leishmania

_________________________________________________________________________________ DICSCILPLINE ADMINISTRATIVE :

Chimie

INTITULE ET ADRESSE DE L'U.F.R. OU DU LABORATOIRE :

Université de Toulouse, Laboratoire de Pharmacochimie des Substances Naturelles et

Pharmacophores Redox, LPSNPR, UMR 152 IRD-Université Paul Sabatier, 118 route de

Narbonne, Toulouse cedex 9, France.

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