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Syphilis Total Ab 1 plaque - 96 72530 5 plaques - 480 72531 TROUSSE POUR LA DÉTECTION QUALITATIVE DES ANTICORPS TREPONEMA PALLIDUM PAR TECHNIQUE IMMUNO-ENZYMATIQUE DANS LE SERUM OU LE PLASMA HUMAIN

883679– 2014/11

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TABLE DES MATIÈRES

1. UTILISATION PREVUE ............................................................................. 3

2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST ...................................................... 3

3. PRINCIPE DU TEST ................................................................................. 3

4. REACTIFS ............................................................................................... 4

5. AVERTISSEMENT ET MESURE DE PRECAUTION ................................... 5

6. ÉCHANTILLONS ...................................................................................... 6

7. PROCÉDURE .......................................................................................... 7

8. LIMITES DU TEST .................................................................................... 9

9. CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES .......................................... 1 0

10. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ..................................................... 1 3

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1. UTILISATION PREVUE Ce kit est destiné à être utilisé par un personnel dûment formé et qualifié pour la détection qualitative d’anticorps anti-Treponema Pallidum dans le sérum et le plasma humains. Ce test peut être utilisé pour le dépistage chez les donneurs de sang et comme aide pour le diagnostic des patients où l’infection par la Syphilis est soupçonnée.

2. RESUME ET EXPLICATION DU TEST La Syphilis est une infection chronique évoluant au travers d'étapes distinctes : primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire. Ces étapes présentent divers symptômes cliniques, produisant typiquement les chancres initiaux puis l'éruption syphilitique suivie de longues périodes d'inactivité. Une infection non traitée peut éventuellement entrainer éventuellement des problèmes cardiovasculaires et une neurosyphilis. L’infection est causée par un spirochète, Treponema Pallidum, transmis généralement par contact sexuel bien que la Syphilis puisse également être transmise par transfusion de sang contaminé. Il peut également y avoir une transmission intra-utérine. Le tréponème s’est avéré pratiquement impossible à cultiver en milieu synthétique, le diagnostic de l'infection repose généralement sur la détection d’anticorps dans le sang, qui apparaissent peu après l'infection initiale et peuvent persister pendant des années. Les tests pour la Syphilis se divisent en quatre catégories : l'examen microscopique direct; les tests de dépistage des anticorps tréponémiques; les tests de dépistage des anticorps non tréponémiques et les tests directs de dépistage des antigènes. A cause des longues périodes d'inactivité et de la nature non spécifique des tests non tréponémiques, les méthodes détectant les anticorps spécifiques anti-tréponème dans les échantillons de patients sont de plus en plus utilisés pour le dépistage. Le test Syphilis Total Ab est l'un de ces tests.

3. PRINCIPE DU TEST Le test Syphilis Total Ab utilise trois antigènes recombinants dans un format sandwich. Les antigènes détectent les IgG, IgM et IgA spécifiques de T. pallidum ce qui permet la détection des anticorps durant toutes les étapes de l'infection. Les cupules de la microplaque sont sensibilisées avec des antigènes recombinants du T. pallidum 15Kd, 17Kd et 47Kd. Les échantillons (sérum ou plasma) à étudier sont distribués dans les cupules. Le conjugué, qui est préparé avec les mêmes antigènes recombinants conjugués à la peroxydase, est distribué dans les cupules où se trouvent l’échantillon. Si des anticorps spécifiques sont présents dans les échantillons à tester, ils se lient aux antigènes de la phase solide et forment un complexe avec les antigènes du conjugué. Après incubation, la fraction du conjugué restée libre est éliminée par lavage. Après une nouvelle incubation à température ambiante, la présence de l’enzyme immobilisée sur les complexes est révélée par la modification de la coloration du substrat. L’absorbance observée pour un échantillon permet de conclure quant à la présence ou l’absence des anticorps spécifiques du T. pallidum.

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4. REACTIFS

4.1. Description

Identification de l’étiquetage

Description

Présentation/Préparation 72530 72531

R1 Microplate

Microplaque 12 barrettes de 8 cupules sensibilisées avec des antigènes recombinants du T. pallidum Identifiant spécifique = 97

1 plaque Prêt à l’emploi

5 plaques Prêt à l’emploi

R2 Concentrated washing solution (20X)

Solution de lavage, concentrée (20X) Tampon Tris, NaCl, pH 7,4 Conservateur : ProClin™ 300 (0,04%)

1 flacon 70 ml

A diluer

1 flacon 235 ml

A diluer

R3 Negative control

Contrôle négatif Tampon Tris HCl, contenant de la S.A.B. (albumine de sérum bovin) ; Conservateur : ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon 2,1 ml

Prêt à l’emploi

1 flacon 2,1 ml

Prêt à l’emploi

R4 Positive control

Contrôle positif (Humain) Sérum humain contenant des anticorps anti-T. pallidum et négatif en HIV1/2, Ag HBs et VHC dilué dans le tampon Tris HCl, contenant de la S.A.B Conservateur : ProClin™ 300 (0,1%)

1 flacon 1,6 ml

Prêt à l’emploi

1 flacon 1,6 ml

Prêt à l’emploi

R6 Conjugate

Conjugué Antigènes recombinants du T. pallidum conjugués à la peroxydase Conservateurs : ProClin™ 300 (0,05%)

1 flacon 8 ml

Prêt à l’emploi

1 flacon 30 ml

Prêt à l’emploi

R8 Substrate buffer

Tampon substrat Solution d’acide citrique et d’acétate de sodium pH 4,0 contenant 0,015% d’H2O2 et 4 % de diméthylsulfoxyde (DMSO)

1 flacon 60 ml

A reconstituer

1 flacon 60 ml

A reconstituer

R9 Chromogen: TMB solution (11X)

Chromogène : solution TMB (rose) Solution contenant du tétraméthyl benzidine (TMB)

1 flacon 5 ml

A diluer

1 flacon 5 ml

A diluer

R10 Stopping solution

Solution d’arrêt Solution d’acide sulfurique (H2SO4 1 N)

1 flacon 28 ml

Prêt à l’emploi

1 flacon 28 ml

Prêt à l’emploi

4.2. Conditions de conservation et de manipulation La trousse doit être conservée à +2-8°C. Chaque élément de la trousse conservé à +2-8°C peut être utilisé jusqu’à la date d’expiration indiquée sur le coffret (sauf indication spécifique). Après ouverture et en l’absence de contamination, les réactifs R3, R4, R6, R8, R9 et R10 conservés à +2-8°C sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.

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Identification Conservation

R1 Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées à +2-8°C sont stables pendant 1 mois dans leur sachet d’origine refermé avec soin.

R2 La solution de lavage diluée peut être conservée à +2-30°C pendant 2 semaines. La solution de lavage concentrée (R2) peut être conservée à +2-30°C.

R8 + R9 Après reconstitution, les réactifs conservés à l’obscurité sont utilisables pendant 6 heures à température ambiante (18-30°C) .

5. AVERTISSEMENT ET MESURE DE PRECAUTION

Pour utilisation en diagnostic in vitro par un professionnel de santé.

5.1. Précautions relatives à la santé et à la sécurité • Ce coffret doit être manipulé uniquement par du personnel qualifié formé aux procédures de

laboratoire et familier avec leurs risques potentiels. Porter des vêtements protecteurs appropriés, gants et protection des yeux/visage et manipuler de manière appropriée selon les bonnes pratiques de laboratoire requises.

• La trousse contient des composants du sang humain. Les composants d’origine humaine utilisés

dans la préparation des réactifs ont été testés et trouvés non réactifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B (Ag HBs) et en anticorps anti HIV-1/anti HIV-2 et anti-HCV. Aucune méthode d’analyse connue ne peut offrir une complète assurance que des agents infectieux sont absents. Par conséquent, tous les dérivés du sang humain, réactifs et échantillons humains, doivent être manipulés comme s’ils étaient capables de transmettre une maladie infectieuse, en suivant les précautions universelles recommandées pour les pathogènes sanguins comme définies par les réglementations nationales, régionales et locales.

• Projections Biologiques : les projections de matériel humain doivent être traitées comme

potentiellement infectieuses. Les projections ne contenant pas d’acide doivent être immédiatement décontaminées (incluant la zone de projection, le matériel et toute surface contaminée ou équipement) avec un désinfectant chimique approprié qui doit être efficace pour les risques potentiels relatifs aux échantillons impliqués (communément une dilution à 1:10 d’eau de Javel, 70-80% d’Ethanol ou Isopropanol, un iodophore [tel que 0,5% Wescodyne™ Plus, etc.), et séchées. Les projections contenant de l’acide doivent être absorbées (essuyées) de manière appropriée ou neutralisées, la zone lavée avec de l’eau et séchée; le matériel utilisé pour absorber la projection peut nécessiter d’être jeté dans une poubelle pour risque biologique. Ensuite la zone doit être décontaminée avec un des désinfectants chimiques.

NOTE : Ne pas mettre des solutions contenant de l’eau de Javel dans l’autoclave !

• Jeter tous les échantillons et le matériel utilisés pour réaliser le test comme s’ils contenaient un agent infectieux. Les déchets de laboratoire, chimiques ou biologiques doivent être manipulés et jetés selon les réglementations locales, régionales et nationales.

• Pour les risques et recommandations de précaution relatifs à certains composants chimiques dans

cette trousse, merci de vous référer au(x) pictogramme(s) indiqué(s) sur les étiquettes et à l’information fournie à la fin de la notice. La fiche de données de sécurité du produit est disponible sur www.bio-rad.com.

5.2. Précautions relatives au protocole 5.2.1. Préparation

La qualité des résultats dépend du respect des bonnes pratiques de laboratoire suivantes : • Ne pas utiliser des réactifs dont la validité est expirée. • Ne pas mélanger ou associer des réactifs de lots différents au cours d’une même série. • Avant utilisation, sortir les réactifs de la boite et attendre 30 minutes que les réactifs s'équilibrent à

température ambiante (18-30°C).

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• Le nom du test ainsi qu’un numéro d’identification spécifique du test sont mentionnés sur le cadre de chaque microplaque. Ce numéro d’identification spécifique figure également sur chaque barrette.

Syphilis Total Ab : Numéro spécifique d’identification = 97 Cette identification doit être vérifiée avant chaque utilisation. Toute barrette dont le numéro de test

est absent, ou différent de celui correspondant au test réalisé, ne doit pas être utilisée.

REMARQUE : Il est possible d'utiliser d'autres lots de solution de lavage (R2, identifié 20X en vert sur l’étiquette), de tampon substrat (R8, identifié TMB buf. en bleu), de chromogène (R9, identifié TMB 11X en violet) et de solution d'arrêt (R10, identifié 1N en rouge), que ceux fournis dans la trousse sous réserve d'utiliser un seul et même lot de ceux-ci au cours d'une même série. Ces réactifs peuvent être utilisés avec d'autres produits de notre société. Contacter nos services techniques pour obtenir des informations détaillées.

• Reconstituer soigneusement les réactifs en évitant toute contamination. • Utiliser une verrerie parfaitement lavée et rincée à l'eau distillée ou de préférence du matériel à

usage unique. • Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du lavage et la distribution des réactifs. • La réaction enzymatique est très sensible à tous métaux ou ions métalliques. En conséquence,

aucun élément métallique ne doit entrer en contact avec les différentes solutions contenant le conjugué ou la solution substrat.

• La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être colorée en rose. L'apparition d'une autre coloration dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est inutilisable et doit être remplacé. Pour cette préparation, utiliser de préférence des récipients et du matériel de distribution en plastique à usage unique ou de la verrerie préalablement lavée à l'acide chlorhydrique 1N, rincée à l'eau distillée et séchée. Conserver cette solution à l’obscurité.

• Ne jamais utiliser le même récipient pour distribuer le conjugué et la solution de révélation.

5.2.2. Réalisation

• Ne pas changer le mode opératoire. • Ne pas réaliser le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou de

poussières qui pourraient altérer l'activité enzymatique du conjugué. • Utiliser un cône de distribution neuf pour chaque sérum. • Le lavage des cupules est une étape essentielle de la manipulation : respecter le nombre de cycles

de lavages prescrits, et s'assurer que toutes les cupules soient complètement remplies, puis complètement vidées. Un mauvais lavage peut entraîner des résultats incorrects.

• Pour des performances optimales, suivre attentivement les procédures de lavage décrites. Selon les instruments, il peut être nécessaire d’optimiser la procédure de lavage (augmentation du nombre d’étapes de cycles de lavage et/ou le volume de la solution de lavage pour chaque cycle) afin d’obtenir un niveau acceptable de bruit de fond pour les échantillons négatifs.

• Contacter Bio-Rad pour l’adaptation et les procédures spéciales.

6. ÉCHANTILLONS

Prélever un échantillon de sang selon les pratiques en usage. Les tests sont effectués sur des échantillons non dilués de sérum ou de plasma (collectés avec des anticoagulants comme l’EDTA, Héparine de Sodium, Citrate de Sodium ou ACD). Les échantillons présentant des agrégats doivent être clarifiés par centrifugation avant le test. Les échantillons seront conservés à +2-8°C si le dépistage est effectué dans les 7 jours ou peuvent être conservés congelés à -20°C pour une plus longue période. Eviter les congélations/ décongélations répétées (au-delà de 5 cycles de congélation / décongélation). Les échantillons qui ont été traités par chauffage à 56°C pendant 30 minutes peuvent être utilisés. Les échantillons contenant jusqu’à 120 g/l d’albumine, 200 mg/l de bilirubine, 33 g/l de trioléine ou 2 g/l d’hémoglobine n’affectent pas les résultats. Il est cependant recommandé de ne pas utiliser des échantillons de sérum ou de plasma hyper lipémiques et hyper hémolysés. Les échantillons doivent être décongelés et bien homogénéisés avant le test.

Si les échantillons doivent être expédiés, les emballer selon la réglementation en usage pour le transport des agents étiologiques et les transporter préférablement congelés.

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7. PROCÉDURE 7.1. Equipements nécessaires mais non fournis

• Eau distillée ou complètement déminéralisée. • Eau de javel et bicarbonate de soude. • Papier absorbant. • Gants à usage unique. • Lunettes de protection. • Tubes à usage unique • Pipettes automatiques ou semi-automatiques réglables ou fixes pouvant distribuer 50 μl, 1 ml et

10 ml. • Eprouvettes graduées de 100 ml et 1L. • Système de lavage, automatique, semi-automatique ou manuel pour microplaque (*). • Incubateur sec, pouvant être thermostaté à 37°C ± 1°C(*). • Conteneur de déchets contaminés. • Appareil de lecture pour microplaques équipé de filtres 450, 490 et 620-700 nm (*).

(*) Nous consulter pour une information précise concernant les appareils validés par nos services techniques.

7.2. Préparation des réactifs 7.2.1. Réactifs prêts à l’emploi

Réactif 1 (R1) : Microplaque Chaque support cadre contenant 12 barrettes est conditionné en sachet aluminium scellé. Couper le sachet à l’aide de ciseaux ou scalpel 0,5 à 1 cm au-dessus de la soudure. Ouvrir le sachet et sortir le cadre. Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C. Réactif 3 (R3) : Contrôle Négatif Réactif 4 (R4) : Contrôle Positif Réactif 6 (R6) : Conjugué Homogénéiser par inversion avant utilisation. Réactif 10 (R10) : Solution d’arrêt

7.2.2. Réactifs à reconstituer

Réactif 2 (R2) : Solution de lavage concentrée (20X) Diluer 20 fois la solution dans l’eau distillée. On obtient ainsi la solution de lavage prête à l’emploi. Préparer 800 ml pour une microplaque de 12 barrettes. Réactif 8 (R8) + Réactif 9 (R9) : Solution de révélation enzymatique Diluer le réactif R9 dans le réactif R8 au 1/11ème (exemple : 1 ml de réactif R9 dans 10 ml de réactif R8) sachant que 10 ml sont nécessaires et suffisants pour traiter 12 barrettes. Homogénéiser.

7.3. Mode opératoire

Suivre strictement la procédure. Utiliser les contrôles positifs et négatifs pour chaque test afin de valider la qualité du test. Suivre les Bonnes Pratiques de Laboratoire suivantes :

1) Etablir soigneusement le plan de distribution et d'identification des échantillons. 2) Préparer la solution de lavage diluée R2. 3) Sortir le cadre support et le nombre de barrettes nécessaires (R1) de l’emballage protecteur.

Replacer dans le sachet les barrettes inutilisées. Refermer le sachet soigneusement et le replacer à +2-8°C.

4) Déposer directement, sans prélavage de la plaque, successivement : • 50 μl de contrôle négatif (R3) dans les cupules A1, B1, C1 • 50 μl de contrôle positif (R4) dans les cupules D1, E1 • 50 μl d’échantillons non dilués dans chaque cupule, F1, G1 etc • 50 μl de conjugué (R6) dans chaque cupule

En fonction du système utilisé, il est possible de modifier la position ou l’ordre de distribution des contrôles. Homogénéiser le mélange réactionnel avec au moins 3 aspirations ou à l’aide d’un agitateur de microplaque pendant 5 secondes.

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REMARQUE : La distribution des échantillons peut être contrôlée à ce stade de la manipulation, en effet il y a une nette différence de coloration entre une cupule vide et une cupule contenant de l'échantillon. Distribuer le conjugué dans les 5 minutes après la distribution de l’échantillon. Il y a une nette différence de coloration entre une cupule vide et la cupule contenant la solution du conjugué (R6) rouge (Se référer § 7.7).

5) Couvrir la plaque si possible d’un film adhésif 6) Incuber la microplaque pendant 30 à 35 minutes à 37°C ± 1°C. 7) Si nécessaire, retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de toutes les cupules dans un conteneur

pour déchets contaminés (contenant de l’hypochlorite de sodium) et ajouter dans chacune d’elles un minimum de 370 µl de solution de lavage. Aspirer de nouveau. Répéter le lavage au moins 4 fois (total de 5 cycles de lavage). Le volume résiduel doit être inférieur à 10 µl (si nécessaire, sécher la plaque par retournement sur une feuille de papier absorbant). Si l’on dispose d’un laveur automatique, respecter le même cycle opératoire.

REMARQUE : Procéder à l’étape de lavage dans les 20 minutes qui suivent l’incubation.

8) Préparer la solution de révélation (R8 + R9) 9) Distribuer rapidement dans chaque cupule 50 µl de la solution de révélation de l’activité enzymatique

(R8 + R9) préalablement préparée. Laisser la réaction se développer à l'obscurité pendant 25 à 35 minutes à température ambiante (18 à 30°C). Lors de cette incubation, ne pas utiliser de film adhésif.

REMARQUE : La distribution de la solution de révélation, qui est colorée en rose, peut être contrôlée visuellement. Il y a une nette différence de coloration entre une cupule vide et une cupule contenant la solution de révélation rose. (Se référer § 7.7).

10) Ajouter 50 μl de la solution d'arrêt (R10) en adoptant la même séquence et le même rythme de distribution que pour la solution de révélation. Homogénéiser le mélange réactionnel.

REMARQUE : La distribution de la solution d'arrêt, qui est incolore, peut être contrôlée visuellement à ce stade de la manipulation. La coloration du substrat, rosée (pour les échantillons négatifs) ou bleue (pour les échantillons positifs), disparaît des cupules qui deviennent incolores (pour les échantillons négatifs) ou jaunes (pour les échantillons positifs) après addition de la solution d'arrêt.

11) Essuyer soigneusement le dessous des plaques. Attendre au moins 4 minutes après la distribution de la solution d'arrêt avant la lecture et, dans les 30 minutes qui suivent l'arrêt de la réaction, lire la densité optique à 450/620-690 nm à l'aide d'un lecteur de plaques.

12) S’assurer avant la transcription des résultats de la concordance entre la lecture et le plan de distribution et d’identification des plaques et des échantillons.

7.4. Contrôle qualité

Utiliser le contrôle négatif (R3) et le contrôle positif (R4) dans chaque série de test pour valider l’essai. (Se référer § 7.5).

7.5. Critères de validation du test

Le test est validé si les conditions ci-dessous sont respectées : 1) Pour le contrôle négatif R3 :

OD R3 ≤ 0.080 Si l’une des valeurs individuelles du contrôle négatif R3 est au-dessus de cette valeur, l’éliminer et refaire le calcul avec les deux valeurs de contrôle négatif restantes.

2) Pour le contrôle positif R4 : OD R4 ≥ 0.700

7.6. Calcul / Interprétation des résultats

La valeur seuil est déterminée à l’aide du contrôle négatif R3. Calculer la moyenne des absorbances mesurées pour le contrôle négatif R3 et calculer la valeur seuil : VS = moyenne DO R3 + 0,100

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Les échantillons avec une valeur de densité optique inférieure à la valeur seuil (ratio < 1) sont considérés négatifs d’après le test Syphilis Total Ab. Les résultats juste en dessous de la valeur seuil (VS-10% < DO < VS) doivent être interprétés avec prudence. Il est conseillé de tester de nouveau les échantillons correspondant en double lorsque les systèmes utilisés et les procédures du laboratoire le permettent. Les échantillons avec une valeur de densité optique supérieure ou égale à la valeur seuil sont considérés comme initialement positifs par le test Syphilis Total Ab. Il est conseillé de tester de nouveau les échantillons correspondant en double avant l’interprétation finale. Si après répétition du test au moins un des 2 doublets a une valeur de densité optique supérieure à la valeur seuil, le résultat initial est reproductible et l’échantillon est déclaré positif d’après le test Syphilis Total Ab. Si le ratio des 2 doublets est inférieur à 1, le résultat initial est non reproductible et l’échantillon est déclaré négatif. Dans le cas où des échantillons testés ont des densités optiques très faibles (DO négative) et que leur présence a été contrôlée ainsi que celle des réactifs, alors les résultats peuvent être interprétés comme négatifs. Il est recommandé de confirmer les échantillons positifs conformément aux recommandations et algorithmes nationaux en vigueur.

7.7. Vérification spectrophotométrique du dépôt des échantillons et du conjugué (optionnel) Vérification du dépôt des échantillons et contrôles La présence des échantillons et contrôles dans les cupules peut être vérifiée par lecture spectrophotométrique à 450/620 nm. Une cupule contenant un échantillon présente une DO comprise entre 0,050 et 1,100. Vérification du dépôt du conjugué Le conjugué est coloré en rouge. La présence du conjugué dans les cupules peut être contrôlé par une lecture spectrophotométrique à 450/620 nm. Une cupule contenant du conjugué présente alors une DO supérieure ou égale à 1,200. Vérification du dépôt de la solution de révélation Il est possible de vérifier la présence de la solution de révélation rosée par lecture automatique à 492 nm. Une cupule contenant la solution de révélation doit avoir une densité optique supérieure à 0,100 (une DO plus faible indique une mauvaise distribution de la solution de révélation).

8. LIMITES DU TEST

Comme avec tous les tests sérologiques pour la Syphilis, l’interprétation des résultats obtenus avec le test Syphilis Total Ab doit être utilisée en conjonction avec les symptômes cliniques des patients, les antécédents médicaux et d’autres résultats de laboratoires afin d’établir un diagnostic clinique global. Aucun test ou standard de référence n’est disponible pour chaque stade de la maladie. Ainsi, le diagnostic de la Syphilis repose essentiellement sur des tests sérologiques, exigeant des résultats à la fois non tréponémiques et tréponémiques. Aucun test de diagnostic ne peut garantir que des échantillons ne contiennent pas des anticorps anti-T.pallidum même à des taux très faibles, comme c’est le cas au premier stade de l’infection. Par conséquent, un résultat non réactif n’empêche pas la possibilité d’exposition à la Syphilis ou d’une infection par la Syphilis. Toute technique ELISA peut entraîner des réactions faussement positives. Il est recommandé de vérifier la spécificité de la réaction pour tout échantillon trouvé positif selon les critères d'interprétation du test Syphilis Total Ab en utilisant la méthode suivante : Treponema pallidum par Hémagglutination passive. Tous les tests tréponémiques ont tendance à rester réactifs après une infection tréponémique ; ainsi, ils ne devraient pas être utilisés pour évaluer la réponse au traitement. En raison de la persistance de la réactivité

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(probablement toute la vie du patient), les tests tréponémiques ne permettent pas au clinicien de diagnostiquer une rechute ou une réinfection chez un patient qui avait eu des résultats réactifs. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser d’autres tests : Syphilis IgM EIA, RPR et TPHA. La méthode colorimétrique de vérification du dépôt des échantillons et/ou des conjugués et/ou de la solution de révélation ne permet pas de vérifier l'exactitude des volumes distribués mais seulement de montrer la présence d'échantillons et/ou de conjugué et/ou de solution de révélation. Le taux de réponses erronées obtenues avec cette méthode est lié à la précision du système utilisé (des CV cumulés de pipetage et de lecture supérieurs à 10% peuvent dégrader significativement la qualité de cette vérification).

9. CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCES

9.1. Fidélité de Mesure La précision du test Syphilis Total Ab a été déterminée par l’analyse d’échantillons de concentrations variées en anticorps anti-T. pallidum. La répétabilité a été évaluée par l’analyse de ces échantillons qui ont été testés 30 fois au cours de la même manipulation. La fidélité intermédiaire a été évaluée par l’analyse de ces mêmes échantillons qui ont été testés en double pendant 20 jours à raison de 2 séries indépendantes chaque jour. Les moyennes, les écart-types (ET) et les coefficients de variation (CV) ont été déterminés sur les ratios.

9.1.1. Répétabilité

Echantillons N Moyenne des

ratios Ecart-Types CV %

Faible Négatif 30 0.14 0.014 9.5%

Fort Négatif 30 0.68 0.051 7.5%

Faible positif en Ac Syphilis

30 1.90 0.070 3.7%

Positif en Ac Syphilis

30 3.76 0.130 3.5%

Les CV obtenus pour les échantillons positifs sont inférieurs à 10%.

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9.1.2. Fidélité intermédiaire

Echantillons N Moyenne

des ratios

Entre les séries Entre les séries

/ opérateurs Entre les

jours Précision totale

ET CV% ET CV% ET CV% ET CV%

Faible Négatif

80 0,15 0,035 22,5 0,023 14,7 0,017 10,9 0,045 29,0

Fort Négatif 80 0,74 0,038 5,1 0,074 10,0 0,006 0,8 0,084 11,2

Faible positif en

Ac Syphilis 80 2,30 0,112 4,9 0,312 13,5 0,099 4,3 0,346 15,0

Positif en Ac Syphilis

80 4,13 0,180 4,3 0,543 13,1 0,195 4,7 0,604 14,6

Les CV obtenus pour les échantillons positifs sont inférieurs ou égaux à 15%.

9.2. Performances cliniques

Les performances du test Syphilis Total Ab ont été déterminées à partir de tests réalisés sur des échantillons d’études prospective et rétrospective. Etude prospective :

- 5195 échantillons de donneurs de sang (aléatoire) - 460 échantillons de patients où l’infection de la Syphilis est suspectée

Etude rétrospective :

- 350 patients avec un diagnostic de la syphilis dont 348 confirmés positifs et 2 négatifs. Les études ont été réalisées sur 2 sites de donneurs de sang, dans un centre de dépistage MST et sur le site de Bio-Rad.

9.2.1. Spécificité diagnostique L’étude a été réalisée sur des échantillons de sérum et de plasma EDTA collectés au hasard auprès de deux Banques de Sang en France. Une étude de spécificité a également été menée sur des échantillons provenant de patients. Tous les résultats ont été comparés à ceux déjà obtenus avec des tests de Syphilis marqués CE. Donnée 1 : Test de Spécificité (IR = Initialement réactif ; RR = Réactivité répétée)

Population Site Type

d’échantillon

Nombre total

d’échan-tillons

Initialement réactif (IR)

Réactivité répétée

(RR)

Spécificité RR (%)

IC (%) 95%

Donneurs #1 + #2

Sérum SST 3127 2 2* 3125/3125

Plasma EDTA

K2 2068 2 2* 2066/2066

Total 5195 4 4* 100%

5191/5191 99,93% - 100%

Patients #3 Sérum 351 1 1 99,72% 350/351

98,42% – 100%

*Les échantillons réactifs répétés trouvés positifs avec un autre test de Syphilis EIA marqué CE ont été exclus du calcul de la spécificité diagnostique.

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9.2.2. Sensibilité diagnostique

Etude rétrospective : L’étude a été faite sur 350 échantillons congelés dont 2 échantillons ont été déclarés négatifs et 348 positifs confirmés avec les tests Syphilis marqués CE. Parmi les 348 échantillons positifs, 7 échantillons proviennent de patients au stade préliminaire de l’infection. Les 348 échantillons ont été trouvés positifs avec le test Syphilis Total Ab de Bio-Rad. Etude prospective : Un total de 460 échantillons non congelés a été évalué avec le test Syphilis Total Ab de Bio-Rad et comparé aux tests Syphilis marqués CE. 348 échantillons ont été trouvés négatifs avec le test de Bio-Rad et les tests de référence (dont 2 échantillons qualifiés de faux positifs avec les tests EIA). 109 ont été trouvés positifs avec le test Bio-Rad et les tests de référence. 3 échantillons ont montré des résultats discordants (après les avoir re-testés avec le test de Bio-Rad) :

• 1 échantillon positif avec le test Bio-Rad et fortement négatif avec les tests de référence. Cet échantillon avec un taux faible d’anticorps anti-Syphilis était à la limite de la valeur seuil pour l’ensemble des tests EIA

• 1 échantillon positif avec les tests de référence, négatif avec le test Bio-Rad (provenant d’un patient sans signe d’infection)

• 1 échantillon positif avec les tests de référence, initialement négatif puis positif après retest avec le test de Bio-Rad

Etudes rétrospective et prospective : La sensibilité diagnostique globale est égale à 99,56% (457/459) avec un intervalle de confiance à 95% de [98,44% - 99,95%]. La sensibilité a également été étudiée sur 3 panels commerciaux et un panel de séroconversion. Le test Syphilis Total Ab de Bio-Rad a été comparé avec les tests Syphilis marqués CE. La détection de chaque échantillon des panels est équivalente entre le test Bio-Rad et les tests de références.

9.3. Sensibilité analytique La sensibilité analytique du test a été évaluée à partir de 2 standards OMS, et déterminée au niveau de la valeur seuil à l’aide d’une régression :

1. La limite de détection pour l’IgG/IgM a été évaluée sur 3 lots du test Syphilis Total Ab et

estimée à 0,53 mUI/ml avec un intervalle de confiance de 95 % [0,10 mUI/ml – 1.30 mUI/ml] à l’aide du standard IgM/IgG de l’OMS (NIBSC code : 05/132).

2. La limite de détection pour l’IgG a été évaluée sur 1 lot du test Syphilis Total Ab et estimée à 0,11 mUI/ml avec un intervalle de confiance de 95 % [0,02 mUI/ml – 0,27 mUI/ml] à l’aide du standard IgG de l’OMS (NIBSC code : 05/122).

9.4. Spécificité analytique / réactions croisées Un total de 125 échantillons potentiellement interférents, contenant des anticorps dirigés contre des pathogènes pouvant entraîner des maladies infectieuses (Lyme, Toxoplasmose, EBV, Leptospirose, SLE (lupus), Hépatite A, Hépatite B, Hépatite C, HTLV I/II et VIH), des groupes d’échantillons de patients à risques (femmes enceintes, et femmes multipares) ou des échantillons de patients avec des troubles du système immunitaire (facteurs rhumatoïdes) ont été testés avec le test Syphilis Total Ab. Parmi les 125 échantillons, 1 échantillon a été trouvé positif avec une réactivité répétée avec le test Syphilis Total Ab ; cet échantillon a été vérifié comme vrai positif avec d’autres tests de Syphilis EIA marqués CE et des tests de confirmation. La spécificité observée sur cette population ciblée est égale à 100% (124/124) avec un intervalle de confiance à 95% de [97,1% - 100,0%].

9.5. Effet crochet La recherche d’un potentiel effet crochet a été réalisée en testant 6 échantillons fortement positifs en Syphilis à différentes dilutions. Les résultats d’équivalence observés parmi les échantillons non-dilués et dilués indiquent l’absence d’un effet crochet sur les échantillons testés.

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