Structure et Dynamique des Lipides - CBMN · des lipides membranaires C. Structures cristallines D....

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Structure et Dynamique des Lipides Structure et Dynamique des Lipides. Master de Chimie, (Chimie Moléculaire du Vivant), Université Bordeaux 1 Erick Dufourc, UMR 5248 CBMN, CNRS-UBx1-ENITAB, +33 5 4000 2218, [email protected] Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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Structure et Dynamique des LipidesStructure et Dynamique des Lipides.

Master de Chimie, (Chimie Moléculaire du Vivant), Université Bordeaux 1

Erick Dufourc, UMR 5248 CBMN, CNRS-UBx1-ENITAB, +33 5 4000 2218, [email protected]

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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Structure et Dynamique des LipidesStructure et Dynamique des Lipides.

Master de Chimie (Chimie Moléculaire du Vivant) Master de Chimie, (Chimie Moléculaire du Vivant), Université Bordeaux 1

Introduction: les membranes

A Classes de lipidesA. Classes de lipides

B. Extraction, purification et caractérisation des lipides membranaires

C. Structures cristallines

D. Hydratation des lipides

E Dynamique des lipidesE. Dynamique des lipides

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Les membranes biologiquesLes membranes biologiques

mitochondrie

cellulecelluleVirus HIV

Réticulum sarcoplasmique et GolgiErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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Les membranes biologiquesLes membranes biologiques

Membrane

Double couche de lipides

Membrane plasmique et réseau d’actine

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A. Classes de lipides

1. Glycérolipides (dérivés du glycérol)y p g y

2. Sphingolipides (dérivés de la sphingosine)

3. Stéroïdes (dérivés du cholestérol)

4. Autres

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A. Classes de lipides

A1. Les glycérolipides (dérivés du squelette glycérol)

a) Glycérophospholipides

O1,2–diacyl-sn-glycerol-3-phospho-base

OCH2

CH (R)

H C O

O

OP

O-Ochaînes de 12 à 24 carbones

H2C OO

baseO

Base = H2C

CH3

H

H HCCH2

N+CH3

CH3cholineH2C

N+

H

H2C

CHN+

H

H

HC

O O-

sérineC

CH2

N+H

HethanolamineH2C

C

H

O O

HOOH

OH

OH

CHC

H

OHHO

glycérolOH

inositolErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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A. Classes de lipides

Glycérophospholipide particulier :

diphosphatidylglycérol (cardiolopide)

O

O

CH2

CHOO

OCH

H2COO

PO-

CH2

CH OH

O

CH

H2CO

O

OP O-

O

O

H2C

O

O

CH2

Présent dans les mitochondries

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A. Classes de lipides

Nomenclature IUPAC :

• 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphocholine

ou aussi :

• 1,2-diacylphosphatidylcholine

• phosphatidylcholine (PC)

abréviations :

PA = phosphatic acid

PC = phosphatidylcholinePC = phosphatidylcholine

PE = phosphatidylethanolamine

PS = phosphatidylsérine

PG h h d l l é lPG = phosphatidylglycérol

PI = phosphatidylinositol

CL = cardiolipine

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A. Classes de lipides

1,2–dialkyl-sn-glycerol-3-phospho-base (liens éther, archébactéries)

OCH2

CH (R)

H2C O

O

PO-

O

H2C

baseO

1-alkenyl-2–acyl-sn-glycerol-3-phospho-base (plasmogène, myéline, RS cardiaque)

l é hO CH2

CH (R)1

O

O-

O

Vinyl-éther

H2C OO P

O base

1-acyl-sn-glycerol-3-phospho-base (lysolipides)

O

O

CH2

CH1

(R)HO

PO-

O

H2C OP

O baseHydrolyse de la fonction ester, lyso PC, lyso PE, …

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A. Classes de lipides

b) Glycéroglycolipides

1,2–diacyl-sn-glycerol-3 –sucreO

Galactose (Gal)O CH2

CH (R)

H2CO

O

O O

HOOH

OH

CH2OH

Monogalactosyldiglycéride (MGDG)

1,2–diacyl-sn-glycerol-3 –sucre-sucre

HO

O

O

CH2

CH (R)

H C

O

O O

O

HOOH

OH

CH2OH

O

H2CO

O

HOOH

OH

Digalactosyldiglycéride (DGDG)

Algues, bactéries (peu chez les animaux)

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A. Classes de lipides

A2. Les sphingolipides (dérivés du squelette sphingosine)

sphingosine

(R)

OH

( )

(S)

CH2OH

NH2C15

a) Céramides (N-acyl sphingosine)

(R)

(S)

OH

CH2OH

NH

O

Longueur et insaturations variables

Contenus dans la peauContenus dans la peau

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A. Classes de lipides

b) Sphingophospholipides (N-acyl sphingosine)

céramide-1-phospho-base

(R)

(S)

OH

baseO

PO

O

O-

Base =

• Choline

Longueur et insaturations variables

NH

O

Choline

• Éthanolamine

• Inositol

• Glycérol

Sphingomyéline (base = choline), retrouvé dans les globule rouges

y

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A. Classes de lipides

b) Sphingoglycolipides

céramide-1-sucre

OH

(R)

(S)

OH

NH

sucre

Longueur et insaturations variables

O

Cérébrosides (retrouvés dans le cerveau)

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A. Classes de lipides

c) sphingoglycolipides (cérébrosides)

céramide-1-sucres

sucres = (R)

OH

sucre sucres =

• glucose (Glc)

• galactose (Gal)

(S)

NH

O

sucre

Longueur et insaturations variables

Présents à la surface des cellules : reconnaissance, groupes sanguins g p g(avec protéines glycosilées)

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A. Classes de lipides

A3. Les stéroïdes

a) Dérivés du cholestérol (animaux)

HO

A B

C D

HO

A B

C D

HOHO

sulfate de cholestérol

Peau, spermatozoïdes

O-O3S

esters de cholestérol

p

Ex: palmitate de cholestérol (transport du cholestérol)O

O

du cholestérol)

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A. Classes de lipides

b) Phytostérols (végétaux)

Principaux squelettes Cholestane

Ergostane

Stigmastane

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A. Classes de lipides

c) Hopanoïdes (bactéries)(OH)(OH)

OH

(OH)

A3. Autres

a) Acides gras et alcools

En général de 12 à 24 atomes de carbone

Handbook of phospholipids, Cevc, Dekker, 1993

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A. Classes de lipides

b) Diacylglycérols

O

O

CH2

CH (S)OHydrolyse des phospho et

H2COH

O

p pglycolipides

c) Lipides des archébactéries (sédiments pétroles, volcans)

R O CH2

CHR OOH C

HC

CH2X

O Liens éther

H2C X

OH2C

R =

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B. Extraction, purification des lipides

B1. Extraction

Membranes +Membranes

20 volumes MeOH/CHCl3 (1:2)

Filtration Filtration centrifugation

E t it li idi

Séparation de phases:

Phase méthanolique :

Sphingolipides acidesExtrait lipidique (lipides solubilisés)

Sph ngol p des ac desSphingoglycolipides

Phase chloroformique :

Phospholipidesp pStérols

Lipides non membranaires (mono, di, triglycérides,

acides gras)g )

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B. Extraction, purification des lipides

B2. Purification

Rf

1

Rf

1

Rf

1

1 2 3

Front d’élution

Chromatographie : colonne (alumine, silice), plaque (couche mince) –TLC-, liquide haute performance –HPLC-

LE

TG

AG

1 1LN

PEPIPS

1G7

G6G5G4

DG

C

MG

PC

SPHLPL

G3G2G1

Gel de silicePL

0

LPL

0 0

Gel de silice

Dépot

Plaque de verre 1. Heptane/éther/acide acétique (60/40/2) : lipides polaires/non polaires

2. Méthanol/acide acétique/eau (60/50/14) : phospholipides

3. Propanol/eau (7/3) : gangliosides

Eluants

Migration : capillarité Révélation : UV, Iode, PO4, NH2Séparation : affinité gel solvant

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B. Extraction, purification des lipides

B2. Purification

HPLC : colonne de silice ou greffée C18, C6, etc

Temps de rétentionErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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B. Extraction, purification des lipides

B2. Purification

Caractérisation des chaînes hydrocarbonées :

GPC (lipides hydroolisés acides gras métthylés -volatils-)GPC (lipides hydroolisés, acides gras métthylés volatils )

12 0

C16:0

I C12:0C14:0 C18:1

C18:2

Temps de rétention

La quantité d’acides gras dans un mélange est proportionnelle à la surface d’un pic

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B. Extraction, purification des lipidesB2. Composition lipidique des membranes

En % Myéline Érythrocyte Mitochondrie Microsome E. coli

Cholestérol 25 25 5 6 0

Pl totaux 32 56 95 94 100

Dont PE 14 20 28 17 80

PS 7 11 0 0 0

PC 11 23 48 64 0

PI 0 2 8 11 0

PG 0 0 1 2 15

diPG 0 0 11 0 5

SP totaux 32 18 0 0 0

autres 11 1 0 0 0autres 11 1 0 0 0

Certaines membranes ne contiennent qu’une classe de lipides ex: E. coliErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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B. Extraction, purification des lipides

Composition en acides gras dans les phosphocholines (PC)

M b 14 0 16 0 16 1 18 0 18 1 18 2 20 1 20 4Membrane 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:1 20:4

Cerveau humain (mat. Blanche)

1,3 34,3 1,0 13,4 45,2 0,4 1,1 1,3

Cerveau humain (mat. grise)

2,9 45,0 3,1 9,3 31,4 0,4 0,7 4,1

Cerveau rat 0,3 45,0 1,4 13,8 32,3 0,4 5,1

Cerveau poulet 0,7 51,0 16,5 26,3 0,7 3,9

Erythrocytes h. 31,2 11,8 18,9 22,8 0,5 6,7

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B. Extraction, purification des lipides

Composition en acides gras dans les phosphoéthalamines (PE)Composition en acides gras dans les phosphoéthalamines (PE)

M b 14 0 16 0 16 1 18 0 18 1 18 2 20 1 20 4Membrane 14:0 16:0 16:1 18:0 18:1 18:2 20:1 20:4

Cerveau humain (mat. Blanche)

5,9 0,4 30,4 8,7 0,5 0,5 13,4

Cerveau humain (mat. grise)

6,2 1,1 13,8 43,2 0,5 6,0 7,9

Cerveau rat 0,3 8,3 0,8 28,5 13,2 0,2 0,2 13,2

Cerveau poulet 1,6 17,9 1,1 28,5 12,4 0,4 12,6

Erythrocytes h. 12,9 11,5 11,5 18,1 7,1 0,7 23,7

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C. Structures cristallines

Méthodes

• Glycérolipides (dérivés du glycérol)

• Sphingolipides (dérivés de la sphingosine)

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C. Structures cristallines

Méthodes

Croissance des cristaux

Diffraction des RX

Reconstruction 3D

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C. Structures cristallines

C1. Les glycérolipides

a) Glycérophospholipides

O

O

CH2O

O

CH2O

CH (R)

H2C O

O

OP

O-O

baseO

O

CH (R)

H2C O

O

OP

O-O

baseO

DMPC ou 1,2–dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine

Système cristallin : monoclinique

β = 97°

55 4 Åc = 55,4 Å

a = 8,72 Å

b = 8,92 Å

4 molécules par maille

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

P

N

Dipoles P->N

Structure en bicouche dans le cristal

Li i Liaisons hydrogène

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

DMPC

Chaîne sn-2 coudée

Épaisseur Bicouche = 54,9 Å

Épaisseur zone polaire = 10,4 Å

Aire moléculaire = 38,9 Å

Tilt des chaînes = 12°

Section 2 chaînes = 38 Å2

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

DLPE ou 1,2–dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine

Système cristallin : monoclinique

β = 92°

Åc = 9,95 Å

a = 47,7 Å

b = 7,87 Å

4 molécules par maille

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

DLPE ou 1,2–dilauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine

PÉpaisseur Bicouche = 47,7 Å

P

N

Épaisseur zone polaire = 7,9 Å

Aire moléculaire = 38,6 Å

Tilt des chaînes = 0°

Section 1 chaîne = 19,3 Å2

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides interdigitation

Lyso PC ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphocholine

O

OCH2

CH1

(R)

H2C O

HO

PO-

O

O base

Système cristallin : monoclinique

β = 99,7°

c = 10,94 Å

24 82 Åa = 24,82 Å

b = 9,53 Å

4 molécules par maille

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

L PC 1 l l l l 3 h h h liLyso PC ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphocholine

Épaisseur Bicouche = 24 5 ÅÉpaisseur Bicouche = 24,5 Å

Épaisseur zone polaire = 7,3 Å

Aire moléculaire = 52,1 Å2

Tilt des chaînes = 41°

Section 1 chaîne = 19,7 Å2

Liaisons hydrogène

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

Lyso PE ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine

Dipoles P-N à plat

Système cristallin : monoclinique

β = 99,7°

c = 10,94 Å

24 82 Åa = 24,82 Å

b = 9,53 Å

4 molécules par maille

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

Lyso PE ou 1-lauroyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine

Projection sur a-b

Épaisseur Bicouche = 37 1 ÅÉpaisseur Bicouche = 37,1 Å

Épaisseur zone polaire = 7,1 Å

Aire moléculaire = 34,8 Å2

Tilt des chaînes = 57,5°

Section 1 chaîne = 18,7 Å2

Réseau de liaisons Réseau de liaisons hydrogène N -> O

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

O

O

CH2O

O

CH2

DMPA ou 1,2 dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphatidic acid

CH (R)

H2C O

O

OP

O-O

baseO

CH (R)

H2C O

O

OP

O-O

baseObase = H

Système cristallin : monoclinique

β= 114,19°

c = 43,98 Å

5 44 Åa = 5,44 Å

b = 7,95 Å

2 molécules par maille

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

DMPA ou 1,2 dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphatidic acid

Structure en chevron

Chaîne sn-1 coudéeChaîne sn 1 coudée

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C. Structures cristallinesC1. Les glycérolipides

PDMPA ou 1,2 dimyristoyl-sn-glycerol-3-phosphatidic acid

P

Na

Épaisseur Bicouche = 40 1 ÅÉpaisseur Bicouche = 40,1 Å

Épaisseur zone polaire = - Å

Aire moléculaire = 43,2 Å2

Tilt des chaînes = 31°

Section 1 chaîne = 18,6 Å2

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C. Structures cristallinesC.1 Les glycérolipides

) Gl é l li id

1,2–diacyl-sn-glycerol-3 –sucreO Galactose (Gal)

a) Glycéroglycolipides

O

O

CH2

CH (R)O

OCH2OH

Galactose (Gal)

H2CO

O O

HOOH

OH

Monogalactosyldiglycéride (MGDG)

Pas de structure cristalline connue

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallinesC.2 Les sphingolipides

Pas de structure

a) Céramides (N-acyl sphingosine)

(R)

OH

CH2OH Pas de structure cristalline connue

(S)

NH

O

) h h h l d ( l h )b) Sphingophospholipides (N-acyl sphingosine)

céramide-1-phospho-base

(R)

(S)

OH

baseO

PO

O

O Pas de structure (S)

NH

O

O- Pas de structure cristalline connue

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallinesC.2 Les sphingolipides

c) Sphingoglycolipides (cérébrosides)

(R)

OH

sucre

(S)

NH

O

β D galactosyl N (2 D hydroxyoctadecanoyl) Dβ-D-galactosyl-N-(2-D-hydroxyoctadecanoyl)-D-dihydrosphingosine

Galactosyl ceramide (Cer-Gal)

β= 99°

c = 46 46 Å

Système cristallin : monoclinique

c = 46,46 Å

a = 11,2 Å

b = 9,26 Å

4 molécules par maille

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallinesC.2 Les sphingolipides

c) Sphingoglycolipides (cérébrosides)

liaisons hydrogèney g

Épaisseur Bicouche = 45,9 Å

Épaisseur zone polaire = - Å

Aire moléculaire = 51,9 Å2

Tilt des chaînes = 49°

Section 1 chaîne = 19,1 Å2,

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallinesC.2 Les sphingolipides

d) Gl hi i OHd) Glycosphingosine

1-O-(β-O-glucopyranosyl)-D-ribo-3,4-dihydroxy-2-aminoctadecane

(R)

(S)

OH

CH2OH

NH2

sucre

c = 49,71 Å

a = 11,36 ÅBicouche interdigitée

Système cristallin : orthorhombique

a 11,36 Å

b = 5,26 Å

4 molécules par maille

Épaisseur Bicouche = 24,9 Å

É i l i ÅÉpaisseur zone polaire = - Å

Aire moléculaire = 59,8 Å2

Tilt des chaînes = 48°

Section 1 chaîne = 19,8 Å2

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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C. Structures cristallines

Résumé

Empilement cristallin = bicouches

parfois interdigitées

Système cristallin : monoclinique, orthorhombique

Épaisseur Bicouche = 40 à 60 Å; 25 Å si interdigitationÉpaisseur Bicouche = 40 à 60 Å; 25 Å si interdigitation

Épaisseur zone polaire = 10 Å

Aire moléculaire = 40-50 Å2 (Glycerophospho); 50-60 Å2 (Spingoglyco)

°Tilt des chaînes = 0 à 60°

Section 1 chaîne = 19 Å2

Réseau de liaisons hydrogène

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

D1 Diagrammes de phaseD1. Diagrammes de phase

D2 Lipides en excès d’eauD2. Lipides en excès d eau

D3 Mélange de lipides en excès d’eauD3. Mélange de lipides en excès d eau

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

D1. Diagrammes de phase (binaires : lipides + eau)

a) PhasesLyotropes (polymorphisme = f(conc))

Lipides + eau

Thermotropes (polymorphisme = f(T))

Règle de Gibbs : nombre de degrés de liberté F = C – P + 2

C = nombre de composantsF = C – P + 1Ou à pression constante :P = nombre de phases

Régime d’hydratation limité, C=2 1 phase, F=2 (concentration, température)

2 phases F=1 (concentration ou température2 phases, F=1 (concentration ou température

3 phases, F =0 (concentration et température fixées)

Excès d’eau, C=1 (concentration é

1 phase, F=1 (température)fixée : limite d’hydratation) 2 phases, F=0 (température fixée)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

b) Techniques de détermination de la nature des Phases

Diffraction des rayons X ou des neutrons Braggθλ sin d 2 lk,h,=

Grands angles : ordre à courte Grands angles ordre à courte distance (3-5 Å), e.g., empilement de chaînes

Petits angles : ordre à longue distance (période > 10 Å), e.g., symétrie du réseau

Type de réseau :

• micellaire (solution)( )

• Périodique 1D (lamellaire),

• Périodique 2D (hexagonal)

• Périodique 3D

dhsk /=

)( hkkhashk −+= 2222

• Périodique 3D

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

b) Techniques de détermination de la nature des Phases

Diffraction des rayons X sur un empilement lamellaire

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

b) Techniques de détermination de la nature des Phases

RMN des solides du phosphore-31 (dispersion de phospholipides)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

b) Techniques de détermination de la nature des Phases

cryofracture et microscopie électronique

Création d’une réplique d’un échantillon clivé à basse température

Phase lamellaire

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D. Hydratation des lipides

c) Nomenclature des phases (lLuzzati, 1968)

L Réseau mono dimensionnel, lamellaire

P Réseau bi dimensionnel, oblique ou centré (ondulé)

H Réseau bi dimensionnel hexagonal

Ordre à longue distance

H Réseau bi dimensionnel, hexagonal

HI Réseau bi dimensionnel, hexagonal normal, huile dans eau

HII Réseau bi dimensionnel, hexagonal inverse, eau dans huile

R RhomboédriqueR Rhomboédrique

Q cubique

C Tridimensionnel, cristallin

LC Lamellaire cristallinLC Lamellaire cristallin

α Chaînes désordonnées, fluide

β Chaînes partiellement ordonnées gel

Ordre à courte distance

β Chaînes partiellement ordonnées, gel

β’ Chaînes partiellement ordonnées, tiltées, gel

δ Partiellement ordonné (hélicoïdal), gel

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D. Hydratation des lipidesd) Glycérophospholipides + eau

DMPC 1 2–dimyristoyl-sn-O

O

CH2

CH (R)O OO

O

CH2

CH (R)O ODMPC, 1,2 dimyristoyl snglycerol-3-phosphocholine

CH (R)

H2C O

O

OP

O-O

baseO

CH (R)

H2C O

O

OP

O-O

baseO

252 =lipide

OH

nn

172 =OHn 172 =lipiden

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D. Hydratation des lipides

d) Glycérophospholipides + eau

DPPC 1,2–dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholineg y p p

92 =lipide

OH

nn

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D. Hydratation des lipides

d) Glycérophospholipides + eau

DLPE 1,2–didodécyl-rac-glycerol-3-phosphoéthanolaminephosphoéthanolamine

T ~ 120°C152 =

lipide

OH

nn

TH ~ 120 C

80°C

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D. Hydratation des lipides

d) Glycérophospholipides + eau

DHPE 1 2 dih x dé l sn l l 3 ph sph éth n l minDHPE 1,2–dihexadécyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine

15°C

TH ~ 90°C

15 C

52 =lipide

OH

nn

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D. Hydratation des lipides

d) Glycérophospholipides + eau

DAPE 1,2–diarachinoyl-sn-glycerol-3-phosphoéthanolamine

10°C

TH ~ 90°C

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

d) Glycérophospholipides + eau O

Lyso PCO

CH2

CH1

(R)

H2C O

HO

PO-

O

O base

micelles

72 =lipide

OH

nn272 =

lipide

OH

nn

pp

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D. Hydratation des lipides

e) Glycéroglycolipides + eau

MGDGO

MGDGO CH2

CH (R)

H2C

O

O OOH

CH2OH

H2CO

HOOH

OH

1,2-dioleoyl-3-α-D-glucosyl-sn-glycerol

(Cubique inversé)

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D. Hydratation des lipides

d) Glycéroglycolipides + eau

DGDGDGDG

O

O OH

CH2OH

O CH2

CH (R)

H2CO

O

O O

HOOH

OH

HOOH

OH

O

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

f) Sphingolipides + eau

Spin ph sph lipid sSpingophospholipides(R)

(S)

OH

NH

baseO

PO

O

O-

Sphingomyéline O

Sphingomyéline, cerveau

Transition gel-fluide à

Tphisio

352 =lipide

OH

nnLα

502 =lipide

OH

nn

phisio

Lβ’

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D. Hydratation des lipides

f) Sphingolipides + eau OH

Spingoglycolipides (Galcer)

(R)

(S)

NH

O

sucre

Longueur et insaturations variables

252 =lipide

OH

nnLα Lα+ H2O

Lβ’Transition gel-fluide à

haute

Cérébroside de cerveau de boeuf

utempérature

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D. Hydratation des lipides

D2. Lipides en excès d’eau

a) CMC (concentration micellaire critique)

Définition : nM MnSéparation de phase : monomères + micelles

micelles

m

La concentration en monomères est indépendante de la concentration totale : CMC

Énergie libre de formation des micelles :Énergie libre de formation des micelles :ΔG = RT Ln (CMC) CMC exprimée en mol.L-1 ou en fraction

molaireDiacylglycerophosphocholinesy g y p p

10

5 DPPC (4,6 10-10 mol.L-1)

nb de carbones (chaînes acyles)6 10 16

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D. Hydratation des lipides

D2. Lipides en excès d’eau

Lyso PC, PE

1010-5 mol.L-1)

5

nb de carbones (chaînes acyles)6 10 16 22

Glycosphingolipides

(R)

OH

(R)

(S)

NH

O

sucre CMC ~ 10-7 à 10-8 mol.L-

1)

Chaînes en C18-C22

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

D2. Lipides en excès d’eau

b) Phases en excès d’eau (C > CMC)

Glycérophospholipides

PC, PS séquence Lβ’ -- Pβ’ -- Lα

PE séquence Lβ’ -- Lα -- HΙΙ

Glycéroglycolipides

Lysos micelles ∀ T

MGDG HII ∀ T (-10°C et 50°C)

DGDG Lα ∀ T (-10°C et 80°C)

Sphingophospholipides séquence Lβ’ -- Lα

Sphingoglycolipides séquence Lβ’ -- LαSphingoglycolipides séquence Lβ Lα

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

D2. Lipides en excès d’eau

c) Concept de forme (excès d’eau)

Explication de l’origine des différentes organisations lipidiques (Israelashvilli)

Volume de la zone hydrophobe vs. Volume de la zone hydrophile

L HI, II HII, III

(PC,PS) (Lysos,DGDG) (PE,PG)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

c) Concept de forme (excès d’eau)

paramètres influençant la nature des phases

(insaturations)

(cholestérol)

(température)

(h )

HI, II HII, III

(hydratation)

L

compensation de formes

LHI HII+

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

c) Concept de forme (excès d’eau)

organisations lipidiques au sein d’une membrane biologique

L

poumons

HI, II

Fusion de cellules

HII, III ?

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases (excès d’eau)

Définition Lβ (gel) Lα (fluide) Tm

t

tt S

HTΔΔ

= ordre désordreordre désordre

ThEn général :

ΔHH << ΔHL

ΔSH << ΔSL

Th > T

hexagonal

Th > Tm

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases, (excès d’eau)

Températures de transition gel-fluide, Tm

influence de la longueur des chaînes

70 Fluide

40

Gel

PC, PE, MGDG

10Gel

nb de carbones (chaînes acyles)12 16 22

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence du nombre de doubles liaisons

40 FluidePC

20

PC

(18:0) (18:n)

sn-1 sn-200

Gel

nb de doubles liaisons en cis et en trans0 2 4

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence de la position de la double liaisonPC

40 Fluide

20

00Gel

Position de la double liaison2 10 18

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence de la position de la chaîne

PTm °C

1-(10:0)-2- (18:0) PC 10 PC

1-(18:0)-2- (10:0) PC 18.6

1 (14 0) 2 (18 0) PC 39 51-(14:0)-2- (18:0) PC 39.51-(18:0)-2- (14:0) PC 30.5

1-(16:0)-2- (18:0) PC 491 (16 0) 2 (18 0) PC 491-(18:0)-2- (16:0) PC 44

1-(12:0)-2- (22:0) PC 37.51 (22:0) 2 (12:0) PC 43

(n:0) (m:0)

sn-1 sn-2

1-(22:0)-2- (12:0) PC 43

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence de la longueur de l’une des chaînes

PC

40

Fluide

20

00 Gel

n, chaîne sn-210 16 22 (16:0) (n:0)

sn-1 sn-2

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence du pH, ex DMPA

Fluide

40

F

40

GelpKa1 pKa2

20 PO4H2 PO4- H, liens H PO4

2-, répulsions

pH2 5 8

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence de la nature de la tête polaire

Fluide

40

50

Ftête

(14:0) (14:0)40

30

sn-1 sn-2

20Gel

Nature de la tête polairePA PE PGPS PC

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

O

influence du nombre de sucres sur la tête polaire

O CH2

CH (R)

H2CO

O

O O

HOOH

OH

CH2OH

70 HO

Fluiden

50

Gel

Nombre de sucres sur la tête polaire1 2

Nombre de sucres sur la tête polaire

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

Températures de transition Lα-HII, Th

influence de la longueur des chaînes

120 HII

100

120

PE

80Lα

nb de carbones (chaînes acyles)12 16 22

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence du nombre de doubles liaisonsPE

100

50

HII

0(18) (18)

nb de doubles liaisons en cis et en trans0 2 4 (18) (18)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

d) Températures de transition de phases

influence de la force ionique

90

100 HII

90

80Lα

[NaCl, M]0 2 4

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D. Hydratation des lipides

e) Hydratation des interfaces

Aire par tête polaire en phase Lα (excès d’eau) H2C

CH2

N+

CH3

CH3

CH3choline

H2C

CH2

N+

CH3

CH3

CH3cholineO

O

C H 2

H2C

CH2

N+

H

H

Hethanolamine

H2C

CH2

N+

H

H

HethanolaminePC = 70 Å2

C H (R )

H 2 C O

O

OP

O -O

b a s eO

PE = 57 Å2

DGDG = 80 Å2

PC + Chol (1:1) 100 Å2PC + Chol (1:1) = 100 Å2

PE + Chol (1:1) = 70 Å2

A B

C D

A B

C DO

O

CH2

CH (R)O

O

HOOH

OH

CH2OH

O

HOHOH2C

OO O

HOOH

OH

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D. Hydratation des lipides

e) Hydratation des interfaces

Variation de l’aire de la tête avec la température (excès d’eau)

70PC

50

Température °CTp Tm

Température C

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D. Hydratation des lipides

e) Hydratation des interfaces

Variation de l’aire de la tête avec la température (excès d’eau)

PE

70

ordre désordreordre désordre

60

40

50

déshydratation

Température °CTm Th

Température C

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS

Glycérophosphocholines (DPPC)

60 d

50

60 d

30

40

dl

dl

d

dw

20

dl

dw

Température °C30

10

Tm10 20 60Température C

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS

Effet de la longueur de chaîne en phase fluide T=Tm + 5°C (PC)

PC

50

60d

PC

40 dl

20

30

dw

14

10

1612 18

dw

Nombre de carbones

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS

Glycérophosphatidyléthanolamines (DLPE)

50

40

d

d

dw

30dl

dl

d

20dw dw d2a =

10

60 8020 40 100 120 dl

dw d3

a

Température °C6 dl

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS

PE

Effet de la longueur de chaîne en phase fluide T=Tm + 5°C (PE)

50

60d

PE

40 dldw

20

30

dw

dl

d

14

10

1612 18

dw

Nombre de carbones

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels (excès d’eau), mesure SAXS

Effet de la longueur de chaîne en phase HII T=Th + 5°C (PE)

PE80

a

PE

60

20

40

d

dwdw d

32a =

14 16

20

12 18

dl dl

20Nombre de carbones

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels H2C

H H2H

Glycérophospholipides (PS, PA, PG)C

CHN+

H

HC

O O-

CCH

CH

OHHO

100d

Comportement gonflant

DMPS.NH4+

80gonflant

40

60

dl

dw Phase Lβ’

40 50

40

3020Teneur en eau en % (H20/Lip)

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels

Glycéroglycolipides en excès d’eau

O

O

CH2

O

O

O

CH2

O

O

HOOH

OH

CH2OH

O

MGDGDGDG

60

CH (R)

H2CO

O

O O

HOOH

OH

CH2OH

60 d

CH (R)

H2CO

O

O O

HOOH

OH

HOO

40 dl

a

40dl

20

dw

20

dl

dw

d

dwdw d3

2a =Température °C 200 200 Température °C

dl

dlPhase HΙΙ

Phase Lα

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D. Hydratation des lipides

f) Paramètres dimensionnels

Glycosphingolipides (GalCer) en excès d’eau

(R)

OH

d

(R)

(S)

NH

O

sucre

60

d

CnC24:0

50

dC16:0

LC Lα

Température °C50 7030 90

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D. Hydratation des lipides

D3. Mélanges de lipides en excès d’eau

a) Systèmes binaires en excès d’eau

F = C – P + 1 A pression atmosphérique

Excès d’eau, C=2

Existence d’1 phase, P=1, sur une gamme de composition et/ou température variables F=2

Existence de 2 phases, P=2, sur une gamme de composition ou de température définies par les limites du diagramme, F=1

Existence de 3 phases P=3 pour une composition et une Existence de 3 phases, P=3, pour une composition et une température fixées (point singulier) F=0

Eutectique Péritectique Monotectique Formation de composés « complexes »

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D. Hydratation des lipidesa) Systèmes binaires en excès d’eau

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DMPC/DPPC C14/C16DMPC/DPPC C14/C16

Lα, Fluide

isomorphe

F+G

Lβ‘, Gel

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DMPC/D PC C14/C18DMPC/DSPC C14/C18

Lα, Fluide

isomorphe

F+G

Lβ‘, Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DMPC/D PC C14/C20DMPC/DAPC C14/C20

Lα, Fluide

isomorphe

F+G

Lβ‘, Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DMPC/DBPC C14/C22DMPC/DBPC C14/C22

Lα, Fluide

isomorphe

F+G

Lβ‘, Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

diffé d l d h î

DMPC/DSPC C14/C18DSPC/DBPC C18/C22

différence des longueurs de chaîne

DMPC/DSPC C14/C18

Lα, Fluide

Lα, Fluide

F+G25°C

F+G

F+G

20°C

Lβ‘, Gel Lβ‘, Gel

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DPPC/DPPE C16/C16

Lα, Fluide

F+Gisomorphe

Lβ‘, Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DPPC/DPPE C16/C16DPPC/DPPE C16/C16

Lα, Fluide2° phase Lα

F+GMonotectique, péritectique ?

Lβ‘, GelLβ , G

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DEPC/DPPE C16/C16DEPC/DPPE C16/C16

Lα, Fluide2° phase Lα

F+GMonotectique

Lc, Lβ‘, Gel

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides en excès d’eau

DEPC/DPPE C16/C16DEPC/DPPE C16/C16

Lα, Fluide

F+G

péritectique

2° phase GelLβ‘, Gel

2 phase Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides/Sphigophospholipides en excès d’eau

DMPC/SPM C14/C16

Analogue à PC/PC

Lα, Fluide

Lβ‘, Gel

F+G

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides/Sphigoglycolipides en excès d’eau

GalCer/DPPC C14/C16

Lα, Fluide

Phase cristalline

Lβ‘, Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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D. Hydratation des lipides

a) Mélanges de glycérophospholipides/cholestérol en excès d’eau

DPPC/Chol

Lα, Fluide

Phase β : HOPhase β intermédiaire entre

fluide et gel :

liquide ordonné

Lβ‘, Gel

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. Dynamique des lipides

E.1. Les mouvementsE m m

a) Isotropes

b) Anisotropes

) H d d n mic) Hydrodynamique

E.2 Mesure de la dynamique

a) Mouvements intramoléculaires

b) Mouvements moléculaires

c) Mouvements collectifs

E.3 Quelques ExemplesQ q p

E.4. Notions de fluidité membranaire

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E. Dynamique des lipides

E.1. Les mouvements

Les mouvements isotropes Molécules en solution

Colloïdes de faible taille (< 1000Å)

Equation de Stokes (diffusion isotrope) :

31 TkD B38

36 R

kD B

c πητ==

2R

Fonction d’auto-corrélation

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

G(τ)

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

G(τ)

Viscosité ηceG τ

ττ

−=)(

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

τc = temps de corrélation du mouvement considéré

0 20 40 60 80 100-0.1

τ0 20 40 60 80 100

-0.1

τ

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E. DynamiqueE Dy m q

E1. Les mouvements

Les mouvements anisotropes (direction privilégiée de mouvement)

Intramoléculaire

τc ∼ 10-12-10-9 sMoléculaire

τc ∼ 10-9-10-6 s

R t ti Rotations, isomérisations gauche-

trans, fluctuations locales

Rotations, balancement,

diffusion anisotrope

Collectifs

τc ∼ 10-6-10-1 s

Modes hydrodynamiques de déformation, twist,

splay, etc.p y

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E. DynamiqueE Dy m q

a) Mouvements intramoléculaires Rotations autour de liaisons, vibrations

R RR’

RR’

R’JJ D6

1=τ

R

trans gauche + gauche -Temps caractéristique, ps

E

Angle de rotationErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

Mouvements locaux dans une phase cristal liquide

ZD

C DC DC DC Di

énergie d’une configuration iii

dispii AEEE γ++= int1 p

Probabilité d’existence d’une configuration donnée

Énergie potentielle (isomérisation)

Attraction entre

Répulsions stériquesJ

J D61

ZTk

Eep B

i

i

−=

Attraction entre chaînes (champ moyen)

γ = pression latérale

A s f d l fi ti iZ A = surface de la configuration i

Z = fonction de partitionErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

Le concept de paramètre d’ordre (Saupe, 1964), phases de cristaux liquides

ZDZk ZD ZD : Axe moléculaire

CH

βi

k

Zk : Axe local, ⊥ plan H-C-H

Cas à symétrie axiale : orientation d’un axe Z par rapport à un autre axe ZC

Hk axe Z par rapport à un autre axe Z

Paramètre d’ordre (local) de la position k

Conformère i 21β3cosS i

2

izz,−

=k

ii

k p izz,zz S S ∑=

Chaîne rigide, ordonnée

1Szz =k

P = 1

Chaîne « liquide », désordonnée

0Szz =k

Intérêt :

Ptrans = 1

Pj = 0équiprobabilité

Pj = Pi

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E. DynamiqueE Dy m q

Diffusion latérale dans le plan de la bicouche

b) Mouvements moléculaires

Diffusion latérale dans le plan de la bicouche

Equation de diffusion à deux dimensions

τcP 1DP D

tP

2

22

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡∂∂

+∂∂

=∇=∂∂

rrrLL

P(r,t) = probabilité, au temps t qu’une molécule soit à une distance r de l’origine

D ffi i t d diff i L té l ( 2 1)DL = coefficient de diffusion Latérale (m2s-1)Analogie avec le libre parcours moyen <r> d’une particule :

r 2 t = 0

Lipides : Fréquence νj, distance λ

1

cL

rD

τ4=

t = 0

t = τc

r

2

41 λν jLD =

Valeurs types : DL = 10-11 à 10-12 m2s-1

RTkD B

πη8=(cas isotrope, particule sphérique : )

Valeurs types : DL 10 à 10 m s

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E. DynamiqueE Dy m q

Diffusion transverse

b) Mouvements moléculaires

Diffusion transverse

Flip-flopout

[Lout] [Lin]kin

kout

in

kin = γin kkout = (1-γin) k

γin = nin/ (nin+ nout)

Bicouches étendues : γin = ½ , kin = kout = k/2

in

γin

0,5 t½ = 1/ (Ln2 k)

Valeurs typiques : t½ = heures jours

tt½

Valeurs typiques : t½ heures, jours

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E. DynamiqueE Dy m q

Diffusion rotationnelle anisotropeb) Mouvements moléculaires

p

ZNZN : Axe directeur, ⊥ couche

ZD : Axe de diffusion moléculairerotation

oscillationZN

θ

22 ⎤⎡ ⎞⎛

Équation de rotation diffusion anisotrope :YN

2

2

//2

22 PDPθcot

θPsinθ

θsinθ1D

tP

ϕϕ ∂∂

+⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡∂∂

+⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

∂∂

∂∂

=∂∂

⊥XN ϕ

P(θ,ϕ,t) = probabilité, au temps t d’avoir une orientation de la molécule définie par θ et ϕ

D// = coefficient de diffusion // à Temps de corrélation de rotation anisotrope

D// = coefficient de diffusion // à l’axe de diffusion moléculaire

D⊥ = coefficient de diffusion ⊥ à l’axe de diffusion moléculaire//

// D61

=τ⊥

⊥ =D61τ

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E. DynamiqueE Dy m q

Paramètre d’ordre moléculaire

b) Mouvements moléculaires

ZN

θZD

Rotation restreinte de ZD dans un potentiel d’orientation de la forme :

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛ −=

213

2 θλθ cos)(U

θ

λ = amplitude du potentiel

13S 21 θ

Paramètre d’ordre moléculaire :

( )( )

∫ −π

TkθU-

2 dθ sinθe 1θ3cos B

13cosS 221

zz −= θ ( )

∫=

π

0

TkθU-

021

dθ sinθe B

Intérêt :Intérêt : Pas d’oscillation Oscillations sur (0-π) équiprobables

1Szz = 0Szz =

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E. DynamiqueE Dy m q

Mouvements collectifs dans une phase cristal liquide

c) Mouvements collectifs

Mouvements collectifs dans une phase cristal liquideZ0

ξ

ZN Déformation d’une couche (film)

Hydrodynamique : analyse des déformations en une large distribution de modes q activés thermiquement (de Gennes, 1974)dl

Fluctuations ξ(q)

22ll

B2

Kqλ dTk(q)ξ =

K = constante d’élasticité de la couche

Q = vecteur d’onde du mode q

λl

Q q

λl = longueur de cohérence (μm)

η = viscositéTemps de corrélation : 2Kqητ(q) =q

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E. DynamiqueE Dy m q

Quelsques modes de déformationc) Mouvements collectifs

Q q

Courbure sphérique Courbure gaussienne

Module d’élasticité ΚModule d’élasticité de courbure gaussienne, Module d élasticité

de courbure, kc(Κ)

cour ur gauss nn ,

Etirement Compression

Module élastique

Module élastique de compression, Β

d’étirement, kS

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E. DynamiqueE Dy m q

Caractérisation de la dynamique des lipides à différentes échelles

Intramoléculaires (rotations, vibrations)m ( , )

qques Å, akj

kzz

kc E,p,S(ps),τ

Moléculaires (rotations, oscillations, translation flip-flop)

qques 10 Å L EDtS(ns)τ(ns)τ 1//⊥qques 10 Å, aLzz E ,D , t,S(ns), τ(ns),τ21//⊥

Film lipidique (modes hydrodynamiques de déformation)

qques μm, ημ k(k s),-s(τ SC ),,,, ΒΚKq

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E. DynamiqueE Dy m q

E2. Mesure de la dynamique

a) Mouvements Intramoléculaires

Spectroscopies infrarouge et Raman

Modes d’élongation (stretching) C-H ou C-D

28802930

2880 h

Raman

2930

2930

Gel Fluide

2880

2930

hh

∝ nb d’isomères gauche

2800 2900 3000 2800 2900 3000

Gel Fluide

cm-1 cm-1

2920 Gel

(g±) par chaîne lipidique

Le déplacement des bandes est proportionnel au nb d’isomères gauche (g±) par chaîne lipidique

2850

2920 GelFluide

IR

chaîne lipidique

280029003000 cm-1Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

Résonance paramagnétique électronique

Interaction entre le spin électronique (s = ½) de l’électron célibataire et le spin nucléaire de l’azote -14 (I = 1)

CH

CH2

O

P

O

O-O

N+

Domaine des micro-ondes, ν = 1010 Hz, é l h f

O

O

H2CO

O

O

éclatement hyperfin, ΔH

B0

N

Radical nitroxide

Pour des raisons historiques, le spectre est représenté en mode dérivée

nitroxide

B0

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E. DynamiqueE Dy m q

Exemple: spectre RPE d’un lipide marqué (N-0°) dans une phase lamellaire

O

O

H2C

CH

CH2

O

O

O

P

O

O-O

N+

O

O

H2C

CH

CH2

O

O

O

P

O

O-O

N+

O

O

H2C

CH

CH2

O

O

O

P

O

O-O

N+

IsotropeO

N

O

O O

Lα, FluideL’éclatement hyperfin permet d’accéder aux paramètres d’ordre paramètres d ordre des chaînes

Lβ‘, Gelmolzz

intrazz S SΔH ∝

Inconvénient = sondes encombrantes, peu précises en phase gelErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qRMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …

i i d bli d él i

H2C N+

H3CCH3

Anisotropie de blindage électroniqueSpectres

Δσ

Lα, Fluide

CH

CH2

OP

O

O-O

H2CC N

CH3 Dispersions de lipides dans l’eau

Lβ‘, GelCH2

O

O

H2C

CH

H2C

CH2

CH2

O

O

LcCH2

H2C

CH2

H2C

H C

CH2

H2C

C H

H

molintra SSΔ ∝σ

-10 0 10

Frequency (kHz)

CH2

H2C

CH2

H2C

CH3

H2C

CH2

H2C

zzzz SSΔσ

CH3

H2C Accès au paramètre d’ordre de la tête

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qRMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …

C l i i di (di l i ) 13C 13C 13C 1H (1H 1H)Couplage spin-spin direct (dipolaire), 13C-13C, 13C-1H, (1H-1H)Spectres

Dispersions de l d d l’

H2C

H2C N+

H3CCH3

lipides dans l’eau

CH

CH2

O

O

P

O

O-O

2

CH3

H2C

CH2

O

O

H2C

C

H2C

CH2

CH2

O

O

H Echantillon orienté dans BΔD

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH

H2C

CH2

CC

HH

H

15 10 5 0 5 10 15

Echantillon orienté dans B0

molzz

intrazz S SΔD ∝H2C

CH2

H2C

CH2

2

CH3

H2C

CH2 -15 -10 -5 0 5 10 15

Frequency (kHz)

Accès aux paramètres d’ordres des 3Δ

rD ∝

CH3

Accès aux paramètres d ordres des segments C-C, C-H, aux distances

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qRMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …

C l él i d l i 2H 14N Couplage électrique quadrupolaire, 2H, 14N, …Spectres

Dispersions de l d d l’

H2C N+

H3CCH3

lipides dans l’eau

CH

CH2

O

P

O

O-O

H2C N

CH3

Echantillon orienté dans BΔQ

H C

CH2

O

O

H2C

H2C

CH2

CH2

O

O

D

90 60 30 0 30 60 90

Echantillon orienté dans B0

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

H2C

CH2

C

C DDH

H

molzz

intrazz S SΔ ∝Q

-90 -60 -30 0 30 60 90

Frequency (kHz)

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH3

H2C

CH2

Accès aux paramètres d’ordres des segments C-D

Interaction magnétique la plus facile à utiliser, C-DCH3

des segments C D

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qRMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …

T d l i é i lé iTemps de relaxation magnétique nucléaire

zLM0zLM0

Mz(t) Retour à l’équilibre

yL

0

yL

0

txL xL )e - (1 M (t)M 1ZTt -

0z =

équilibre perturbation

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

G(τ)G(τ)= exp(-τ/τc)

τc = temps de corrélation 1 2 cJT τω =∝− )(

Temps de relaxation longitudianal « spin-réseau », T1Z

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5c p

du mouvement considéré

∫+∞ τω− ττ=ω de GJ 0i

0 )()(

220

01 1 cZ JT

τωω

+=∝ )(

G(τ), fonction d’autocorrélation liquide

solide

0 20 40 60 80 100-0.1

0.0

τ

∫∞−

0 d autocorrélation liquide

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qRMN des Solides 13C, 31P, 2H, 14N, …

Temps de relaxation magnétique nucléaireTemps de relaxation magnétique nucléaire

Mesure de T1Z pour plusieurs températures ou ω0

T1Z (s) ω0/2π = 1000 MHz

104

105

106 ω0/2π = 500 MHzω0/2π = 100 MHzω0/2π = 10 MHzAvec T1 (min) : τc = 1/ω0

102

103

104

107 Hz < ω0/2π < 109 Hz

10-1

100

101

10-8 s < τc < 10-10 s

10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5 10-410-2

10

τc (s)

<< 1 t id 10 10 < < 10 12

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

ω0 τc << 1, mouvements rapides, 10-10s < τc < 10-12 s

ω0 τc >> 1, mouvements lents, 10-6 s < τc < 10-8 s[10-6 s , 10-12 s]

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E. DynamiqueE Dy m qb) Mouvements Moléculaires

Diff i l é l FR P (Ré i i d l fl è h bl hi )Diffusion latérale

D

FRAP (Réapparition de la fluorescence après photoblanchiement)

N+

P

O

O-O

H2C

H2C N+

H3CCH3

CH3

CHNH

N

O

N

NO2

DLN+

Sondes de fluorescence, DPH, TMA-DPH, NBD-PC,

NBD-PEH2C

CH2

H2C

CH2

O

O

H2C

CH

CH2

O

NHO

O

N

O NNO2

H C

CH2

O

O

H2C

CH

CH2

O

H2C

CH2

CH2

O

O

P

O

O-O

H2CCH2

H

CH3

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH3

H2C

CH2

H2C

CH2

C

CH

HH

H

CH3Bicouches ou monocouches sur balance de Langmuir (observation au microscope)

F

LDt e BA −−

équilibre Photoblanchiement (laser)

t

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qb) Mouvements Moléculaires

Diff i l é l M d fl h éDiffusion latérale Marqueurs de fluorescence chargés

cathode anode cathode anodeE = 0 E ≠ 0

F

Fonctions en

LDt e−

E = 0E = 0

Fonctions en

t

E ≠ 0E = 0

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qb) Mouvements Moléculaires

Diff i RPE CDiffusion transverse RPE

Utilisation de marqueurs de spinH3C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C O C

H2

CH

H2C

O

H3CCH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C CH2

OO

P O

O

O-CH2

CH2

N+

CH3

H3C N O°

CH3

H3C

CH3H3C

H2 2O

Incorporation du marqueur de spin

Addition d’un agent réducteur (ascorbate)

Flip-flop Réduction ultérieure

Sign

al R

PE

tSignal de RPEErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qb) Mouvements Moléculaires

Diff i i ll iDiffusion rotationnelle isotrope

RMN ou RPE rotation

oscillationZN

θ

(voir mouvements intramoléculaires)

YN

XN ϕ

Accès à τ//, τ⊥, Ea, molzz

intrazz S S

Dans le cas de molécules rigides, on peut séparer et intrazzS mol

zzS

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qb) Mouvements Moléculaires

Diff i i ll i Fl fl h i id

N+

Diffusion rotationnelle isotrope Fluorescence fluorophores rigides

Milieu anisotrope

I// > I⊥

Lumière naturelle

Avant excitation

excitation

Photo sélection (ps) li id

I// = I⊥

naturelle excitation sélection (ps)

Lumière polarisée

liquide

r00,4t− τ// = temps de corrélation

Anisotropie ou polarisation de fluorescence

+−

=IIIIr

2//

//

⊥−=

IIP //

r

//)()( τerrrtr ∞∞ −+= 0

2)( molSr ∝

pde rotation du fluorophore, doit être plus petit que le

temps de vie de l’état excité

⊥+ IIP

//

t (ns)r∞

0,0

)( zzSr ∝∞

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements collectifs

Fl i h i d é i l (li ) éFluctuations thermiques de vésicules (liposomes) géantes

Observation au microscope optique

2)(tm )(tum

n

50 μmFluctuations du rayon moyen dans le plan équatorial

),()(

pkTktu m

nC

Bmn σλ

12=

Tensions de membrane Pression hydrostatique

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements collectifs

RMN DRX ( é i d dil i / fl )RMN et DRX (expérience de dilution/gonflement)

Z0ZN Lipide marqué au deutérium ΔQ RMNξ

O

H2C

CH

CH2

O

CH2

O

O

P

O

O-O

H2C

H2C N+

H3CCH3

CH3

p m q m

90 60 30 0 30 60 90

dl

dH2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

H2C

CH2

O

CH3

H2C

CH2

H2C

CH2

C

C

H2C

CH2

DDH

H

-90 -60 -30 0 30 60 90

Frequency (kHz)

DRX

λl

CH3

Constants lors molzz

intrazz

collzz S S SΔ ∝Q

( )22

2collzz

1cos 2

13S =−

= ξξ ;cos

Constants lors de la dilution

ΔQ

( )2zz 12 uΔ+ξ;

d( ) ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=Δ

dkLn

kdfu C

C

2

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

E2. Quelques exemples

(Lα)

c) Mouvements intramoléculaires

intrazzS Fluide

1401401.0

80

100

120

z) 80

100

120

z)

//

0.9

0.8

40

60

80

1 / T

1z (H

40

60

80

1 / T

1z (H

0.6

//

0

20

0

200.3

0.0

Labeled carbon position2 9 14γ β α g3 g2 g1

Labeled carbon position2 9 14γ β α g3 g2 g1

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

c) Mouvements intramoléculairesc) Mouvements intramoléculaires

intrazzS (Lα)

1.0

FluideintraS

4

0.5

0 0

GelzzS

13

0.0

TempératureTm

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

c) Mouvements intramoléculaires

Ordre dans la bicouche en phase Lα, Lβ’, HII, HI

1.0

intraSLβ’

0.5

zzS

4HI

0 0

13 Lα

HI

HII0.0

# Carbone des chaînes2 4 6 8 10 12 14 16

HII

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

c) Mouvements intramoléculaires

Probabilités de conformères trans-gauche en phase Lα

1.0 4.0

0 5

kip trans

2 00.5

gauche

2.0

0.0

# C b d h î2 4 6 8 10 12 14 16

0.0

TempératureTm

# Carbone des chaînes Température

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

c) Mouvements intramoléculaires

τc, Ea (kJ mol-1)

tête

10-2

L Lβ’Pβ’

10-24

τc (s) τc (s)tête chaînes

Lα Lβ’Pβ’

10-4

Lα LβPβ

10-41350

8

α ββ

10-8

10-6

10-11

10-10

45 815

10-10

10

10-12

10

1220

15

15

1/Tm3 3.5 4 x103 K-1 1/Tm3 3.5 4 x103 K-1

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

Page 139: Structure et Dynamique des Lipides - CBMN · des lipides membranaires C. Structures cristallines D. Hydratation des lipides E. Dynamique des lipides Erick J. Dufourc, CNRS, janvier

E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements intramoléculaires

Eff t d h l té l E (kJ l 1) intraSEffet du cholestérol τc, Ea (kJ mol-1),

+ Chol

zzS

10-2

τc (s) chaînes

Lα Lβ’Pβ’1 0

4

- Chol

10-4

α ββ1.013

intrazzS

10-11

10-10

0.5

10-12

10

0.0

1/Tm3 3.5 4 x103 K-1

TempératureTm

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements moléculaires

Diffusion transverse

Vésicules phospholipidiques,

t½ = 1 - 1000 heures, Ea ~ 8-150 kJ mol-1t½

out

20

in

t½(h)

10

DMPC

Effet de la longueur de chaîne : n ↑, t½ ↑

10

Nature de la tête, PE/PC : t½ ~ 1900 h

Température (°C)3020 5040

1

Température ( C)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements moléculaires

Diffusion transverse

Membrane du Globule rouge

uit

100 %

O

P

O

O-O

N+PS

PE n

on r

édu

50 %

O

O

H2C

CH

CH2

O

O

O

O

PE

Sign

al R

P 50 %N

PC

Temps d’incubation avant réduction du NO° (h)2.50

0

5

PCSM

Temps d incubation avant réduction du NO (h)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements moléculaires

τc

Diffusion Latérale

Nature de la tête (L )

30 100

Nature de la tête (Lα)

1

Température10 ns

2010-1

2m

2 s-1

1 10-

12m

2 s-1

1 μs20

DL

x 1 1

DL

x0.1 ms

+ Cholestérol

SMPC PE

10

Température (°C)Tm

0.01

Peu d’influence de la longueur de chaîne p ( )Peu d influence de la longueur de chaîneVitesse de saut d’un lipide à l’autre

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements moléculaires

oscillation

Diffusion rotationnelle

rotation

1 0

τc (s)

Lα Lβ’Pβ’

10-3

τ

Ea en kJ mol-1

1.0

molzzS

+ 30% cholestérol

α ββ τ⊥90

35

0.5

10-6

τ//

+ 30% chol

0.0LαLβ’ Pβ’ 10-9 60

TempératureTm 1/Tm3 3.5 4 x103 K-1

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements collectifs

LαLongueur des chaînes

2.0

1.5

Cx1

0-19

J

kC ~ d2

1.0

k C kC ~ d

1.0

400 500 600 Å2 (d2)

DLPC DMPC DPPCErick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qc) Mouvements collectifs

température, cholestérol

2.0 5.0

1.5

Cx1

0-19

J

3.0

Cx1

0-19

J

1.0

k C

1 0

k CTm Tm+5°C

1.0

0 20 40% cholestéroltempérature

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qE.4 Notions de fluidité membranaire

Fluidité : ensemble des phénomènes dynamiques se produisant aussi bien à l’échelle de l’Å que du micron (intra-, moléculaire, collectif)

Rôle de la fluidité membranaire :

Assurer un fonctionnement cellulaire correct

Barrière sélective

diffusion d’ions et de molécules

o dans le plan de la membrane

o à travers la membrane

déformation de la membrane

o passage de cellules dans les capillaireso passage de cellules dans les capillaires

fusion (endocytose, exocytose)

stabilisation de récepteurs à la surface de canaux membranairescanaux membranaires

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m qFluidité membranaire adéquate

Réactions membranaires Transport

Ex: transport actif de b-galactoside à travers la membrane

DL Lβ’100

nspo

rt

La vitesse de réaction est contrôlée par la diffusion latérale des protéines 1

10

esse

de

tra

Dépend de DL des lipides

Lα0.1

1

Vite

1/T x 10-3Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

Régulation de la fluidité membranaire

Perturbations extérieures (température, diète, pH, …)

Fluidité optimale CONSTANTE

Compensations (molécules régulatrices, synthèse de double liaisons dans les acides gras, cholestérol, …)

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

Page 149: Structure et Dynamique des Lipides - CBMN · des lipides membranaires C. Structures cristallines D. Hydratation des lipides E. Dynamique des lipides Erick J. Dufourc, CNRS, janvier

E. DynamiqueE Dy m q

Hétérogénéité de la fluidité membranaire

Les radeaux lipidiques

Image en microscopie de fluorescence d’îlots dans une membraned îlots dans une membrane

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004

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E. DynamiqueE Dy m q

The role of phytosterols in plant adaptation to temperature

21

22

120

140

0 7

0,8

0,9

ain|

so

so

2

34

5

101

HO 67

89

19

H

14

1312

11

15

16

17

2022

2324

25

27

26

H

18

H

H

Cholesterol

80

100

0,5

0,6

0,7

M1 [k

Hz]

|2*<

S CD> ch

lo

50 kHz

40

60

0,3

0,4

ld

lo

CH3

H

H3C

CH3

CH3

H

CH3

H

H

CH3

Sitosterol

Beck, J. G., Mathieu, D., Loudet, C., Buchoux, S., and Dufourc, E. J. (2007) Plant sterols in

0 10 20 30 40 50 60[T] °C ld HO

H H

, , , , , , , , , ( )"rafts": a better way to regulate membrane thermal shocks., FASEB J 21, 1714-1723.

Erick J. Dufourc, CNRS, janvier 2004