Stress Oxydant et Vieillissement

Modifications oxydatives des protéinesau cours du vieillissement

GERONTOLOGIE FONDAMENTALE

Isabelle Petropoulos

Laboratoire de Biologie Cellulaire du VieillissementUMR 7079

Implication du stress oxydant dans les processus de vieillissement (rôle des espèces réactives de l’oxygène ou ERO)

Modifications par voie oxydative des protéines au cours du vieillissement

Implication du protéasome et plus généralement des systèmes de maintenance (élimination et réparation des protéines oxydées)

Plan du cours

Le vieillissement se caractérise par une diminution de la capacité d’unorganisme à faire face à son environnement

Usure de l’organisme suite à l’accumulation d’altérations subies aucours du temps

Théorie des radicaux libresLes changements associés au vieillissement sont dus à l’accumulation desdommages produits pas les ERO.

Production des ERO

Défenses antioxydantes

Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondreau stress oxydant

Qu’est ce que le vieillissement ?

Relation entre la longévité et résistance au stress oxydant

Igf-1 receptor Tyrosine-kinase receptor 26 % increase in KO mouse Enhanced (paraquat, H202)

(Nature, 2003, Y. Le Bouc)

Défenses antioxydantesSources endogènes Sources exogènes

ROSONOO-

H2O2

RO.O2

.-

NO.

ROO.NO2

OH.

• Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx

• Systèmes non-enzymatiques : Glutathion etvitamines (A, C et E)

Taux basal Taux élevé

• Mitochondries• Péroxysomes• Lipoxygénases• NADPH oxydase• Cytochrome P450

• UV• Radiations ionisantes•Toxines• inflammation (cytokines)

Homéostasie• Croissance normale• métabolisme normal

Altération des fonctions physiologiques• vieillissement• maladie• mort cellulaire

Origine et réponses cellulaires aux ROS

Les principales cibles des Espèces Réactives de l’Oxygène dans la cellule

Oxydation de l’ADNmutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl : 8 hydroxyguanineCoupures simple brin et double brinDélétions (ADN mitochondrial)

Oxydation des lipides

Oxydation des phospholipides des membranesFormation de peroxydes lipidiques

- 4-hydroxynonenal (4-HNE)- malonaldéhyde (MDA)

Oxydation des protéinesModifications oxydatives multiples (carbonyles)

Qu’est-ce que l’oxydation des protéines?

Modification covalente des protéines provoquées par

des espèces réactives de l’oxygène ou par des

dérivés induits par le stress oxydant

Protéine oxydée non fonctionnelle

Protéine active

Oxydation

Oxydation

GlycationConjugaison avec des

produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA)

Glycoxydation

Tous les acides aminés

LysineArginine

AGEs

HistidineCystéineLysine

CarboxymethylysineCOO-CH2R NH

Modification des protéines par voie oxydative

R’

N

N

H

NH

NR

Pentosidine

Produits d’Amadori

Protéine nativeHydroxyls R-OHCarbonyls R-C-H, R-C-R’,

O ODisulfide cys-S-S-cysMethionine sulfoxide MeSO

Acides aminés les plus susceptibles à l’oxydation et leurs principaux produits de réaction

Acide aminé Produits d’oxydation

Cysteine Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiques

Methionine Methionine sulfoxide, methionine sulfoneTyrosine Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPA

Tryptophane Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynureninesPhenylalanine Hydroxyphenylalanines

Valine, Leucine HydroperoxidesHistidine 2-Oxohistidine, asparagine, aspartateGlutamyl acide oxalique, acide pyruvique

Proline Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehyde

Threonine Acide 2-Amino-3-cetobutyriqueArginine semialdehyde glutamique, chloramines

Lysine semialdehyde, chloramines,

Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l’oxydation des protéines

Athérosclérose (LDL)Arthrite rhumatoïde (IgG)Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébraleEmphysème pulmonaire (inhibiteur de l’α -1-proteinase, elastase)Maladies neurodegeneratives - Alzheimer

- ParkinsonDystrophie musculaireSyndrome de détresse respiratoireVieillissementProgeria/syndrome de WernerAlcoolismeCataracte (α-crystallines)Cancer

OXYDATION

CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION

LIPIDIQUESGLYCATION/

GLYCOXIDATION

PROTEINENATIVE

BIOSYNTHESE

PROTEINEENDOMMAGEE DEGRADATION

PEPTIDESAcides Aminés

Proteasome

Aggregats

REPARATIONPeptide methionine

sulfoxide reductase system

Modification et devenir des protéines cellulairesendommagées

Immunodétection des groupements carbonyles sur les protéines

Western blot, ELISA, immunohistochimie

Anti-DNPanticorps

* **

***

oxydéeproteine

O

DNPHDNP

protéine

DNP DNP

En western blot :

• Détection des protéines oxydées dans un mélange de protéines (susceptibilité différentielle des protéines à l’oxydation)

• Sensibilité ≤1 pmol de groupement carbonyle

DNP protéine

Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502

(fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche)

OXYDATION

CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION

LIPIDIQUESGLYCATION/

GLYCOXIDATION

PROTEINENATIVE

BIOSYNTHESE

PROTEINEENDOMMAGEE

DEGRADATION

PEPTIDESAcides Aminés

Proteasome

Aggregats

REPARATIONPeptide methionine

sulfoxide reductase system

Modification et devenir des protéines cellulairesendommagées

LE PROTEASOME

Rôles dans le vieillissement et les maladiesliées à l’âge

ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES

Le protéasome : machinerie d’élimination des protéines endommagées

Protéasome 20S

ATP

Complexe 19S

Protéasome 26S

Chymotrypsine-similaire

Hydrolase post-glutamique

Trypsine-similaire

αββα

Dégradation des protéines modifiées par oxydation

Dégradation des protéines marquéespar les chaînes de polyubiquitines

Rôles physiologiques importants dans:

Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines)La présentation de l ’antigèneL ’inflammation (activation de NFkB)L ’apoptose (p53)La réparation de l ’ADN (PARP)

Protéasome 20 SProtéasome 26 S

Régulateur 19 S

+ ATP

Micrographies de particules protéasomales

Dégradation des protéines ubiquitinées par le protéasome 26 S

Dégradation des protéines oxydées par le protéasome 20 S

Protéasome et vieillissement de la peau

Diminution du renouvellement cellulaire, sénescenceDégradation de la matrice extra-cellulaireEndommagement des macromolécules cellulaires

Vieillissement intrinsèquechronologique et génétique

Vieillissement extrinsèqueStress oxydant, photo-vieillissement

Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l’épidermeRôle du protéasome dans les processus de vieillissement

120

84

47.8

B0.8

ng e

q gl

ycat

ed-B

SA/μ

g of

pro

tein

s

0

0.2

0.4

0.6

0 20 40 60 80age of donor (years)

D

AMWMkDa

97.4

68

C120

84

47.8

MWMkDaOxyblot

Western blot anti-HNE

Western blot anti-AGE

ELISA anti-AGE

Modifications des protéines cytosoliques durant le vieillissement de l’épiderme

Excitation 350 nmEmission 440 nm

Activités protéolytiques du protéasome

20S

LLVY-AMC

Activité Chymotrypsine-similaire

-AMC

(Coupure après acide aminé aromatique)

LSTR-AMC

Activité Trypsine -similaire

(Coupure après acide aminé basique)

-AMC

LLE-NA

Activité Hydrolasepost - glutamique

(Coupure après acide aminé acide)

-βNA

Excitation 333 nmEmission 410 nm

33.2

20

MWMkDa

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100A

B8070605040302010

age du donneur (années)

Chy

mot

ryps

in-li

kepm

ol A

MC

/min

. per

mg

Pept

idyl

glut

amyl

-pep

tide

hydr

olas

epm

ol N

A/m

in. p

er m

g

Effet de l’âge sur les activités du protéasome dans les cellules épidermiques

b

pH=3 pH=10

SDS-PA

GE

21kDa

30.6 kDa

GEL BIDIMENSIONNEL DE PROTEASOME PURIFIE A PARTIRDE L’ EPIDERME DE DONNEUR DE 17 ANS

Comparaison avec des donneurs plus âgés : Diminution de 3 sous-unités α : α3, α4 et α5Augmentation d ’1 sous-unité β : β4

β5

MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60

20

40

60

80

100

α3

MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60

20

40

60

80

100

MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60

20

40

60

80

100

EE)

Nombre de passages18 22 26 30 34

0

20

40

60

80

100

β7

MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60

20

40

60

80

100β2

MRC5 8 28 50 80 C1 C2 C3 C60

20

40

60

80

100

α6

Expression des sous-unités du protéasome 20 S

espèce tissu âge effet sur l’activité

Humain

Rat

Lymphocytes T

Cristallin

Foie

CoeurPoumonCerveau

muscle

21-30 ans vs 65-85 ans

clair vs cataracte

3-8 mois vs 24-34 mois

3 mois vs 28 mois

4 mois vs 34 mois

Chymotrypsine

Chymotrypsine

ChymotrypsineTrypsine

PGPH

Chymotrypsine

ChymotrypsineTrypsine

PGPH

Effet de l’âge sur les activités peptidasiques du protéasome

Effet de l’âge sur l’expression du protéasomeAnalyse de transcriptome

espèce tissu âge Effet sur l’expression

Effet de la restriction calorique

Humain

souris

Fibroblastes

Muscle squelettique

8 ans vs 92 ans

5 mois vs 30 mois

α2, α7(protéasome 20 S)sous-unités du 19S

(protéasome 26S)

β2, β7(protéasome 20 S)sous-unités du 19S

(protéasome 26S)

PROTEASOME ET VIEILLISSEMENT CONCLUSIONS

Le contenu en groupements carbonyles des protéines augmentent avec l ’âge dans les kératinocytes et les fibroblastes. Ces groupements peuvent être générés :

- soit par oxydation directe d ’acides aminés- soit par conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique- soit par glycation

Deux des activités (chymotrypsine et peptidyl-glutamylpeptide hydrolase) du protéasome diminuent avec l ’âge, ce qui peut s ’expliquer, au moins en partie, par une diminution de la quantité de protéasome cellulaire.

Une diminution de l ’activité, de la quantité du protéasome est également observée au cours de la sénescence réplicative (kératinocytes et fibroblastes en culture).

Une diminution de l ’expression de certains gènes codant des sous-unités catalytiques et régulatrices a été observée dans les fibroblastes âgés.

Les centenaires semblent avoir la capacité de «préserver» leur protéasome

Rôle de l’oxydation des LDL dans l’athérogenèse

Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l’ athérogenèse et sont impliquées dans les événements précoces de formation de la plaque :

- Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T)- Formation de cellules spumeuses- Migration et prolifération des cellules musculaires lisses- Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose)- Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome

Bile

FCCL

Foie

A-I

MacrophageA-I

CECELCATF

C

CETP

HDL MatureHDL Naissant

CL

Oxydation des HDL et transport reverse du cholestérol

HDL impliqués dans le transport réverse du cholestérol des macrophages spumeuxvers le foie.

Dysfonctionnement des HDL mis en cause dans les maladies cardiovasculaires

Ce dysfonctionnement serait en partie du aux attaques oxydatives(myélopéroxydase élevée dans les macrophages des tissus athérosclérotiques).

Rôle de l’oxydation de l’Apo A1 sur l’activité de la LCAT (lecithine:cholestérolacyltranférase)

Oxydation de l’Apo A1 et activité LCAT

Exemple de l’α1-antitrypsine

Synthétisée dans les hépatocytes.

Présente dans le parenchymepulmonaire. Protection de la matricealvéolaire contre l’activité de l’élastase(sérine protéase).

Contient 9 résidus méthionines dont2 (Met 351 et Met 358) seulementsont oxydables en présence d’oxydant.

Une déficience de l’activité de cette enzyme est mise en causedans l’emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonairecaractérisée par une destruction des bronchioles)

Inactivation de l’ α1-antitrypsine par oxydation desrésidus méthionines

cigarette

Cigarette(H202, phénol)

Régulation de l’activité élastase

Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d’Alzheimer

Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence et mort neuronale