Stress oxydant et Vieillissement · Progeria/syndrome de Werner Alcoolisme Cataracte...

Stress oxydant et Vieillissement

Isabelle Petropoulos

Equipe Biologie Cellulaire du VieillissementUR4, Vieillissement, stress et Inflammation

Module de Gérontologie Fondamentale

18 janvier 2011

Le Vieillissement

Vieillissement : Processus progressif et irréversible de modification des structures et des fonctions de l’organisme et de sa capacité d’adaptation aux conditions de l’environnement.

Altération voire perte des fonctions physiologiques Augmentation de la susceptibilité de l’apparition des maladies Diminution de la résistance au stress

77,5 ans pour les hommes84,4 ans pour les femmes

Augmente d’un trimestre tous les ans

16,2 % des personnes en Franceont plus de 65 ans

Chiffres INSEE 2007

Les 3 âges de la femme, Klimt

Usure de l’organisme suite à l’accumulation d’altérations subies au cours du temps

Les changements associés au vieillissement sont dus à l’accumulation des dommages produits pas les Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO).

Production des ERO

Défenses antioxydantes

Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondre au stress oxydant

Théorie des radicaux libres

Effet de l’hyperoxie

(Baret et al., 1994)

L’hyperoxie entraîne une diminution de la durée de vie des drosophiles et accélère le processus de vieillissement

Pas de modification du taux métabolique (respiration) mais des ERO

Les altérations dues à l’oxygène (oxydations) représentent une part importante dans le vieillissement normal

Défenses antioxydantes Sources endogènes Sources exogènes

EROONOO-

H2O2

ROO. O.2

NO.NO2

OH.

• Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx

• Systèmes non-enzymatiques : Glutathionvitamines (A, C et E)

Taux basal Taux élevé

• Mitochondries• Péroxysomes• Lipoxygénases• NADPH oxydase• Cytochrome P450

• UV, Radiations ionisantes• polluants• Xénobiotiques oxydants• inflammation (cytokines)

Homéostasie• Croissance normale• métabolisme normal

Altération des fonctions physiologiques• vieillissement• maladie• mort cellulaire

Origine et réponses cellulaires aux ERO

Production mitochondriale des ERO

Systèmes de défenses cellulaires

O2°- + O2°- + 2H+ H2O2 + O2

H2O2 + H2O2 2 H2O + O2

H2O2 + 2GSH GSSG + 2 H2O

ROOH + 2GSH GSSG + H2O + ROH

SODCAT

GPx

Les principales cibles des EROL’ADN- Mutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl

- 8-OH-dG : 8 hydroxydesoxyguanine

- Coupures simple brin et double brins

- Délétions (ADN mitochondrial)

Les lipidesOxydation des phospholipides des membranes.Formation de peroxydes lipidiques Aldéhydes

- 4-hydroxynonenal (4-HNE)- malonaldéhyde (MDA)

Les protéinesModifications oxydatives multiples (carbonyles)

Principales modifications oxydatives de l’ADN

L’oxydation de l’ ADN peut provoquer des mutations

N

N

O

H2N

HN N

N O

H

H

N

N

O

H2N

HN N

N OHH

N

NH

HHN

N

OH2N

NN

O

HH

HH

H

N

NN

Adenine

8 OH-Gu a (enol) 8 oxo-Gu a (k eto) Basepairs

A T

G C8 OHdG A

8 O H - G u a

8-hydroxyguanine

Oxydation des acides gras insaturés

OH.

Stress oxydant et mitochondriesThéorie mitochondriale du Vieillissement, notion de cercle vicieux

ROS ROS ⇑⇑

Inhibition des complexesMutations dans l’ADNmtDégradation des membranes

ATP ATP ⇓⇓

Changement d'état stationnaire

ADN mitochondrial plus sensible à l’oxydation

Mutations et délétions de l’ADN mitochondrial associées au vieillissement

(Schriner et al., 2005)

H2O2 OH°Fe, Cu

H2O

Effets de la surexpression de la catalase humaine spécifiquement dans :

les péroxysomes

Le noyau

Les mitochondries

Catalase

Surexpression de la catalase dans les mitochondries

Fibroblastes

Muscle

Effets sur la longévité des souris

de 20% de la durée de vie moyenne

de 10% de la durée de vie maximale

catalase péroxysomale

catalase nucléaire

catalase mitochondriale

Protection contre le stress oxydant

Oxydation et lésions de l’ADN

Production d’ERO

Qu’est-ce que l’oxydation des protéines?

Modifications covalentes des protéines provoquées par des

espèces réactives de l’oxygène ou par des dérivés induits

par le stress oxydant

Protéine oxydée non fonctionnelle

Protéine active

Oxydation

OxydationOxydation

GlycationGlycationConjugaison avec des

produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA)

Conjugaison avec des produits de péroxydation

lipidique (e.g. HNE, MDA)

GlycoxydationGlycoxydation

Tous les acides aminés

LysineArginine

AGEs

HistidineCystéineLysine

CarboxymethylysineCOO-CH2R NH

Modification oxydatives des protéines

R’

N

H

NH

NR

Pentosidine

Produits d’Amadori

Protéine native Hydroxyls R-OH Carbonyls R-C-H, R-C-R’, O ODisulfide cys-S-S-cysMethionine sulfoxide MeSO

N

Produits d’oxydation des protéines

semialdehyde, chloramines,

semialdehyde glutamique, chloraminesAcide 2-Amino-3-cetobutyrique

acide oxalique, acide pyruvique

Hydroperoxides

Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynurenines

Methionine sulfoxide, methionine sulfone

Lysine

Arginine

Threonine

Glutamyl

Valine, Leucine

Tryptophane

Methionine

Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehydeProline

2-Oxohistidine, asparagine, aspartateHistidine

HydroxyphenylalaninesPhenylalanine

Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPATyrosine

Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiquesCysteine

Produits d’oxydation Acide aminé

Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l’oxydation des protéines Athérosclérose (LDL) Arthrite rhumatoïde (IgG) Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébrale Emphysème pulmonaire (inhibiteur de l’a -1-proteinase, elastase) Maladies neurodegeneratives - Alzheimer

- Parkinson Dystrophie musculaire Syndrome de détresse respiratoire Vieillissement Progeria/syndrome de Werner Alcoolisme Cataracte (a-crystallines) Cancer

Rôle de l’oxydation des LDL dans l’athérogenèse

Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l’ athérogenèse et sont impliquéesdans les événements précoces de formation de la plaque :

- Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T)- Formation de cellules spumeuses- Migration et prolifération des cellules musculaires lisses- Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose)- Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome

Exemple de l’α1-antitrypsine

Synthétisée dans les hépatocytes.

Présente dans le parenchyme pulmonaire. Protection de la matrice alvéolaire contre l’activité de l’élastase (sérine protéase).

L’oxydation de cette enzyme est mise en cause dans l’emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonaire caractérisée par une destruction des bronchioles)

Inactivation de l’ α1-antitrypsine par oxydation

cigarette

Cigarette(H202, phénol)

Régulation de l’activité élastase

LE PROTEASOME

Rôles dans le vieillissement et les maladies liées à l’âge

ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES

Oxydation des protéines et systèmes de maintenance

O2

O2

.-

H2O2

OH.

ERO

Modifications irréversibles carbonylation

modifications réversibles

Réparation

Thiorédoxine/Thiorédoxine R. SulfirédoxineMéthionine Sulfoxide Réductases

Dégradation

(Cytoplasme / Noyau)Protéasome

Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502

(fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche)


O2

O2

.-

H2O2

OH.

ERO



Réparation


Dégradation


Accumulation des protéines oxydéesStress oxydant / Vieillissement

Le protéasome : machinerie d’élimination des protéines endommagées

Protéasome 20S

αββα

Chymotrypsine-similaire

Hydrolase post-glutamique

Trypsine-similaire

Protéasome 20SDégradation des protéines oxydées


Les protéasomes

Protéasome 26S Dégradation des protéines marquées par les

chaînes de polyubiquitines

Rôles physiologiques importants dans:

Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines) la présentation de l ’antigène L ’inflammation (activation de NFkB) L ’apoptose (p53) La réparation de l’ADN (PARP)





Protéasome et vieillissement de la peau

Diminution du renouvellement cellulaire, sénescence Dégradation de la matrice extra-cellulaire Endommagement des macromolécules cellulaires

Vieillissement intrinsèquechronologique et génétique

Vieillissement extrinsèqueStress oxydant, photo-vieillissement

Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l’épiderme Rôle du protéasome dans les processus de vieillissement

Modification oxydative des protéines

inter

médiai

res

jeune

s

âgés

kDa

97.4

68

Oxydation globale des protéines dans les kératinocytes

Anti-DNPAnticorps

* **

** *

**

oxydéeprotéine

O

DNPHDNP

protéine

DNP

DNP- protein

DNPMise en évidence des protéines carbonylées par Oxyblot

12084

47.8

Anti-HNE

Altération du protéasome

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

8070605040302010âge du donneur (années)

CT-

like

pmol

AM

C/m

in. p

er m

g

PG

PHpm

ol N

A/m

in. p

er m

g

Diminution des activités CT et PGPH dans les kératinocytes âgés

17 an

s

50 ans

67 ans

Protéaso

me

purifi

é

33.2

20

kDa

Modification de l’expression

b

pH 3 pH 10

SDS-PA

GE21kDa

30.6 kDa

IEFModification de la structure

β

α

espèce tissu âge effet sur l’activité

Humain

Rat

Lymphocytes T

Cristallin

Foie

CoeurPoumonCerveau

muscle

21-30 ans vs 65-85 ans

clair vs cataracte

3-8 mois vs 24-34 mois

3 mois vs 28 mois

4 mois vs 34 mois

Chymotrypsine

Chymotrypsine

ChymotrypsineTrypsinePGPH

Chymotrypsine


Effet de l’âge sur les activités du protéasome

Effet de l’âge sur l’expression du protéasomeAnalyse de transcriptome

espèce tissu âge Effet sur l’expression

restriction calorique

Humain

souris

Fibroblastes

Muscle squelettique

8 ans vs 92 ans

5 mois vs 30 mois

α2, α7(protéasome 20 S)

sous-unités du 19S (protéasome 26S)

β2, β7(protéasome 20 S)


Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients Alzheimer

Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence cellulaireMort neuronale

Induction de la sénescenceInhibition du protéasome

+ Mg132 ou Epoxomycin

Inhibition du protéasome et sénescence

Inhibition du protéasome 26Ssections de cortex d’animaux de 6 semaines

Profils de cortex de 2, 3 et 6 semaines de souris contrôles et mutantes

Rpt2

CT-

Like

Act

ivity

(AFU

)

Inhibition du protéasome 26S

NeurodegenerationLewy bodies in

post-mortem brain

(Bedford et al., 2008)

1

Stress oxydant et Vieillissement

Isabelle Petropoulos

Equipe Biologie Cellulaire du VieillissementUR4, Vieillissement, stress et Inflammation

Module de Gérontologie Fondamentale

18 janvier 2011

2

Le Vieillissement

Vieillissement : Processus progressif et irréversible de modification des structures et des fonctions de l’organisme et de sa capacité d’adaptation aux conditions de l’environnement.

Altération voire perte des fonctions physiologiques Augmentation de la susceptibilité de l’apparition des maladies Diminution de la résistance au stress

77,5 ans pour les hommes84,4 ans pour les femmes

Augmente d’un trimestre tous les ans

16,2 % des personnes en Franceont plus de 65 ans

Chiffres INSEE 2007

Les 3 âges de la femme, Klimt

3

Usure de l’organisme suite à l’accumulation d’altérations subies au cours du temps

Les changements associés au vieillissement sont dus à l’accumulation des dommages produits pas les Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO).

Production des ERO

Défenses antioxydantes

Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondre au stress oxydant

Théorie des radicaux libres

4

Effet de l’hyperoxie

(Baret et al., 1994)

L’hyperoxie entraîne une diminution de la durée de vie des drosophiles et accélère le processus de vieillissement

Pas de modification du taux métabolique (respiration) mais des ERO

Les altérations dues à l’oxygène (oxydations) représentent une part importante dans le vieillissement normal

5

Défenses antioxydantes Sources endogènes Sources exogènes

EROONOO-

H2O2

ROO. O.2

NO.NO2

OH.

• Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx

• Systèmes non-enzymatiques : Glutathionvitamines (A, C et E)

Taux basal Taux élevé

• Mitochondries• Péroxysomes• Lipoxygénases• NADPH oxydase• Cytochrome P450

• UV, Radiations ionisantes• polluants• Xénobiotiques oxydants• inflammation (cytokines)

Homéostasie• Croissance normale• métabolisme normal

Altération des fonctions physiologiques• vieillissement• maladie• mort cellulaire

Origine et réponses cellulaires aux ERO

6

Production mitochondriale des ERO

7

Systèmes de défenses cellulaires

O2°- + O2°- + 2H+ H2O2 + O2

H2O2 + H2O2 2 H2O + O2

H2O2 + 2GSH GSSG + 2 H2O

ROOH + 2GSH GSSG + H2O + ROH

SODCAT

GPx

8

Les principales cibles des EROL’ADN- Mutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl

- 8-OH-dG : 8 hydroxydesoxyguanine

- Coupures simple brin et double brins

- Délétions (ADN mitochondrial)

Les lipidesOxydation des phospholipides des membranes.Formation de peroxydes lipidiques Aldéhydes

- 4-hydroxynonenal (4-HNE)- malonaldéhyde (MDA)

Les protéinesModifications oxydatives multiples (carbonyles)

9

Principales modifications oxydatives de l’ADN

10

L’oxydation de l’ ADN peut provoquer des mutations

N

N

O

H2N

HN N

N O

H

H

N

N

O

H2N

HN N

N OHH

N

NH

HHN

N

OH2N

NN

O

HH

HH

H

N

NN

Aden ine

8 OH-Gu a (enol) 8 oxo-Gua (k eto) Basepai rs

A T

G C8 OHdG A

8 O H - G u a

8-hydroxyguanine

11

Oxydation des acides gras insaturés

OH.

12

Stress oxydant et mitochondriesThéorie mitochondriale du Vieillissement, notion de cercle vicieux

ROS ROS ⇑⇑

Inhibition des complexesMutations dans l’ADNmtDégradation des membranes

ATP ATP ⇓⇓

Changement d'état stationnaire

ADN mitochondrial plus sensible à l’oxydation

Mutations et délétions de l’ADN mitochondrial associées au vieillissement

13

(Schriner et al., 2005)

H2O2 OH°Fe, Cu

H2O

Effets de la surexpression de la catalase humaine spécifiquement dans :

les péroxysomes

Le noyau

Les mitochondries

Catalase

Surexpression de la catalase dans les mitochondries

Fibroblastes

Muscle

14

Effets sur la longévité des souris

de 20% de la durée de vie moyenne

de 10% de la durée de vie maximale

catalase péroxysomale

catalase nucléaire

catalase mitochondriale

15

Protection contre le stress oxydant

Oxydation et lésions de l’ADN

Production d’ERO

16

Qu’est-ce que l’oxydation des protéines?

Modifications covalentes des protéines provoquées par des

espèces réactives de l’oxygène ou par des dérivés induits

par le stress oxydant

Protéine oxydée non fonctionnelle

Protéine active

Oxydation

17

OxydationOxydation

GlycationGlycationConjugaison avec des

produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA)

Conjugaison avec des produits de péroxydation

lipidique (e.g. HNE, MDA)

GlycoxydationGlycoxydation

Tous les acides aminés

LysineArginine

AGEs

HistidineCystéineLysine

CarboxymethylysineCOO-CH2R NH

Modification oxydatives des protéines

R’

N

H

NH

NR

Pentosidine

Produits d’Amadori

Protéine native Hydroxyls R-OH Carbonyls R-C-H, R-C-R’, O ODisulfide cys-S-S-cysMethionine sulfoxide MeSO

N

18

Produits d’oxydation des protéines

semialdehyde, chloramines,

semialdehyde glutamique, chloraminesAcide 2-Amino-3-cetobutyrique

acide oxalique, acide pyruvique

Hydroperoxides

Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynurenines

Methionine sulfoxide, methionine sulfone

Lysine

Arginine

Threonine

Glutamyl

Valine, Leucine

Tryptophane

Methionine

Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehydeProline

2-Oxohistidine, asparagine, aspartateHistidine

HydroxyphenylalaninesPhenylalanine

Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPATyrosine

Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiquesCysteine

Produits d’oxydation Acide aminé

19

Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l’oxydation des protéines Athérosclérose (LDL) Arthrite rhumatoïde (IgG) Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébrale Emphysème pulmonaire (inhibiteur de l’a -1-proteinase, elastase) Maladies neurodegeneratives - Alzheimer

- Parkinson Dystrophie musculaire Syndrome de détresse respiratoire Vieillissement Progeria/syndrome de Werner Alcoolisme Cataracte (a-crystallines) Cancer

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Rôle de l’oxydation des LDL dans l’athérogenèse

Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l’ athérogenèse et sont impliquéesdans les événements précoces de formation de la plaque :

- Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T)- Formation de cellules spumeuses- Migration et prolifération des cellules musculaires lisses- Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose)- Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome

21

Exemple de l’α1-antitrypsine

Synthétisée dans les hépatocytes.

Présente dans le parenchyme pulmonaire. Protection de la matrice alvéolaire contre l’activité de l’élastase (sérine protéase).

L’oxydation de cette enzyme est mise en cause dans l’emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonaire caractérisée par une destruction des bronchioles)

22

Inactivation de l’ α1-antitrypsine par oxydation

cigarette

Cigarette(H202, phénol)

Régulation de l’activité élastase

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LE PROTEASOME

Rôles dans le vieillissement et les maladies liées à l’âge

ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES

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O2

O2

.-

H2O2

OH.

ERO



Réparation


Dégradation


25

Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36:1495-1502

(fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche)

26


O2

O2

.-

H2O2

OH.

ERO



Réparation


Dégradation


Accumulation des protéines oxydéesStress oxydant / Vieillissement

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Le protéasome : machinerie d’élimination des protéines endommagées

Protéasome 20S

αββα

Chymotrypsine-similaire

Hydrolase post-glutamique

Trypsine-similaire

28



Les protéasomes









29

Protéasome et vieillissement de la peau

Diminution du renouvellement cellulaire, sénescence Dégradation de la matrice extra-cellulaire Endommagement des macromolécules cellulaires

Vieillissement intrinsèquechronologique et génétique

Vieillissement extrinsèqueStress oxydant, photo-vieillissement

Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l’épiderme Rôle du protéasome dans les processus de vieillissement

30

Modification oxydative des protéines

inter

médiai

res

jeune

s

âgés

kDa

97.4

68

Oxydation globale des protéines dans les kératinocytes

Anti-DNPAnticorps

* **

** *

**

oxydéeprotéine

O

DNPHDNP

protéine

DNP

DNP- protein

DNPMise en évidence des protéines carbonylées par Oxyblot

12084

47.8

Anti-HNE

31

Altération du protéasome

0

20

40

60

80

100

0

20

40

60

80

100

8070605040302010âge du donneur (années)

CT-

like

pmol

AM

C/m

in. p

er m

g

PGPH

pmol

NA

/min

. per

mg

Diminution des activités CT et PGPH dans les kératinocytes âgés

17 an

s50

ans

67 an

s

Protéa

some

purifi

é

33.2

20

kDa

Modification de l’expression

b

pH 3 pH 10

SDS-PA

GE21kDa

30.6 kDa

IEFModification de la structure

β

α

32

espèce tissu âge effet sur l’activité

Humain

Rat

Lymphocytes T

Cristallin

Foie

CoeurPoumonCerveau

muscle

21-30 ans vs 65-85 ans

clair vs cataracte

3-8 mois vs 24-34 mois

3 mois vs 28 mois

4 mois vs 34 mois

Chymotrypsine

Chymotrypsine


Chymotrypsine


Effet de l’âge sur les activités du protéasome

33

Effet de l’âge sur l’expression du protéasomeAnalyse de transcriptome

espèce tissu âge Effet sur l’expression

restriction calorique

Humain

souris

Fibroblastes

Muscle squelettique

8 ans vs 92 ans

5 mois vs 30 mois

α2, α7(protéasome 20 S)


β2, β7(protéasome 20 S)


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Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients Alzheimer

Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence cellulaireMort neuronale

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Induction de la sénescenceInhibition du protéasome

+ Mg132 ou Epoxomycin

Inhibition du protéasome et sénescence

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Inhibition du protéasome 26Ssections de cortex d’animaux de 6 semaines

Profils de cortex de 2, 3 et 6 semaines de souris contrôles et mutantes

Rpt2

CT-

Like

Act

ivity

(AFU

)

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Inhibition du protéasome 26S

NeurodegenerationLewy bodies in

post-mortem brain

(Bedford et al., 2008)

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