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ASSOCIATION DES PRATICIENS DE GENETIQUE MOLECULAIRE (ANPGM)

Stratégies d’études des gènes F8 et F9 impliqués dans les Hémophilie A et Hémophilie B Référence : ANPGM_080 Numéro de version : 2 /19

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Pour les versions révisées :

- Date de 1ère mise en application : février 2016 - Numéro de l’ancienne version du document : ANPGM_080 - Date de révision : 2 décembre 2015

Nom Hôpital Date

Rédacteur(s) Catherine Costa Mathilde Fretigny Pierre Boisseau Christophe Zawadski

CHU Cochin CHU Lyon CHU Nantes CHU Lille

02/12/2015

Vérificateur(s) Filière

Christine Vinciguerra MHEMO

CHU Lyon

02/12/2015 17/12/2015

Approbateur(s)

Pour le CA de l’ANPGM : Benoit ARVEILER Cécile ACQUAVIVA Anne-Sophie LEBRE Pascale SAUGIER-VEBER

CHU Bordeaux CHU Lyon CHU Reims CHU Rouen

04/10/2016



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I-Introduction Description et mode de transmission Les hémophilies sont des affections hémorragiques héréditaires, transmises selon un mode récessif lié au chromosome X et dues à un déficit en facteur VIII (hémophilie A) ou en facteur IX de la coagulation (hémophilie B). L’hémophilie A, concerne environ une naissance masculine sur 5 000, est plus fréquente que l’hémophilie B (environ une naissance masculine sur 30 000). La sévérité clinique dépend de l’importance du déficit en activité coagulante. On distingue classiquement les hémophilies sévères, où le taux résiduel de l’activité coagulante du facteur VIII (FVIII:C) ou du facteur IX (FIX:C) est inférieur ou égal à 1%, les hémophilies modérées où le taux résiduel est entre 1 et <5%, et les formes mineures où le taux résiduel se situe entre 5 et 40% (définition ISTH). Aujourd’hui il est recommandé de génotyper tous les patients hémophiles A et B, et ce quel que soit le degré de sévérité de la maladie. Ces recommandations sont publiées depuis 2006 par le « United Kingdom Haemophilia Centre Doctors Organization » (1), et concernent tous les patients hémophiles. Le génotypage n’apporte aucun élément pour le diagnostic d’hémophilie chez un sujet atteint, les dosages des facteurs VIII et IX de la coagulation donnant des éléments indiscutables pour un tel diagnostic, mais il est indispensable pour la détection des conductrices d’hémophilie et le diagnostic prénatal. De plus, il donne des informations pour la prise en charge d’un patient hémophile. L’anomalie génétique est l’un des facteurs de risque de développement d’inhibiteur (environ 30% HA 5% HB) qui survient le plus souvent dans les formes sévères mais également dans les formes modérées et mineures (2,3). Il existe une corrélation entre anomalie génétique et inhibiteur avec une incidence/prévalence fonction du type de mutation. La présence d’une mutation à haut risque d’inhibiteur (délétion de grande taille par exemple) chez les patients hémophiles ayant développé un inhibiteur est associée à une moindre efficacité d’une induction de tolérance immune. D’autre part, il existe une corrélation entre le type d’anomalie génétique et la réponse au traitement par la desmopressine. Pathologie moléculaire Hémophilie A : Le gène du facteur VIII de la coagulation (F8) est un très grand gène constitué de 26 exons répartis sur 186kb (1). Des microinversions interrompant le gène F8 au niveau des introns 1 ou 22 résultant de la recombinaison intrachromosomique entre deux séquences homologues sont respectivement responsables de 3% et 45% des cas d’hémophilie A sévère (2, 3). De très nombreuses mutations ponctuelles rendent compte d’environ 40% des cas d’hémophilie A sévère et de la presque totalité des cas d’hémophilie modérée ou mineure. Des délétions/insertions de quelques paires de bases sont également la cause d’hémophilies de sévérité variable. Les 5% d’hémophilies sévères restant sont dus à de grands réarrangements tels des délétions de grande taille ou autres mécanismes plus rares tels des duplications d’exons. Dans environ 3% des formes sévères et environ 10% des formes modérée/mineures, aucune anomalie moléculaire n’est identifiée par les techniques actuelles. (4) Hémophilie B : Le gène du facteur IX de la coagulation (F9) est plus petit, contient 8 exons et est réparti sur 34kb (1). La majorité des mutations sont des mutations ponctuelles non-sens, faux-sens, ou des insertions/délétions de quelques paires de bases. Plusieurs centaines de mutations sont répertoriées et sont réparties sur l’ensemble du gène. Environ 5% des cas d’hémophilie B sévère sont dus à des délétions de plus grande taille. Noms et références des gènes Hémophilie A, N° OMIM : 300841, N° ORPHANET : 121677, gène F8, NM_000132.3, NP_000123.1 Hémophilie B, N° OMIM : 300746, N° ORPHANET : 121683, gène F9, NM_000133.3, NP_000124.1



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II-Organisation de la prise en charge des études génétiques au sein des réseaux de laboratoires Les laboratoires sont organisés en réseau depuis 2006 afin d’offrir une couverture nationale homogène selon un rationnel simple. Ce réseau national des laboratoires réalisant les caractéristiques génétiques des maladies constitutionnelles de la coagulation et de la fibrinolyse est intitulé GENOSTASE. Les laboratoires ne réalisant pas l’étude du gène demandé ou n‘explorant qu’une partie du gène doivent adresser le prélèvement d’ADN pour étude complémentaire à un laboratoire de niveau 2 ou un laboratoire expert de niveau 2 selon le schéma ci-dessous.

En 2015 les laboratoires réalisant les études génétiques des gènes F8 et F9 sont répartis selon le tableau ci-après.



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Analyses réalisées Type de laboratoire Niveau 1 avec

recherche évènements récurrents

Niveau 1 Niveau 2 Niveau 2 expert

Hémophilie A Recherche inversions du gène F8 intron 22 / intron 1 X X X X Etude des régions codantes et sites d’épissage des 26 exons du gène F8 X X X

Etudes complémentaires : promoteur, région 3’NTR, grands ré-arrangements X X

Etudes fonctionnelles : ex vivo ARNm F8, minigène F8, expression cellulaire de variants FVIII

X

Hémophilie B Etude des régions codantes et sites d’épissage des 8 exons du gène F9 + Etudes complémentaires : promoteur, région 3’NTR, grands ré-arrangements

X X

Etudes fonctionnelles : ex vivo minigène F9, expression cellulaire de variants FIX

X

III-Arbres décisionnels des études des gènes F8 et F9 Ces arbres s’appuient sur les guidelines publiées en hémophilie A et B (1). 1-The molecular analysis of haemophilia B: a guideline from the UK haemophilia centre doctors' organization haemophilia genetics laboratory network. Mitchell M1, Keeney S, Goodeve A; UK Haemophilia Centre Doctors' Organization Haemophilia Genetics Laboratory Network. Haemophilia. 2005 Jul;11(4):398-404. Ces arbres décisionnels sont validés au sein du réseau des laboratoires GENOSTASE après une mise à jour incluant le séquençage à haut débit (NGS). Dans le contexte d’étude d’un gène unique, il n’y a pas de recommandation à privilégier l’utilisation du NGS par rapport au séquençage Sanger. Le choix entre séquençage Sanger et NGS dans un laboratoire relève de contraintes techniques, organisationnelles et économiques. La transition au NGS doit avoir fait l’objet d’une validation qui garantit une sensibilité analytique de détection des mutations au moins équivalente à celle du séquençage Sanger. Si besoin, les régions mal couvertes en NGS doivent faire l’objet d’une analyse complémentaire (par exemple la séquence de l’exon 14 riche en régions d’homopolymères (A)6 à (A)9. Les indications d’étude sont à adapter en fonction des différentes situations telles que présentées ci-après. Les indications d’étude se présentent sous 2 aspects selon qu’il s’agisse d’une étude utilisant le séquençage à haut débit NGS ou le séquençage Sanger. A- Stratégie d’étude des Hémophilies intégrant le NGS selon les Indications Le NGS permet le séquençage simultané des gènes F8 et F9



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1- Patients Hémophiles 2- Femmes à taux bas FVIII :C ou FIX :C 3- Femmes à taux normaux mais notion d’antécédents d’hémophilie A ou B dans la famille 4- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation identifiée 5- Cas particulier des néomutations 6- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation non identifiée 7- Conduite à tenir lors de l’identification d’une mutation

Dans les cas d’identification d’une anomalie du gène celle-ci devra être vérifiée de préférence et si possible par une autre méthode. Exemple anomalie d’un nombre de copie du gène MLPA et qPCR.

Les zones d’homopolymères étant des régions difficiles à étudier selon la technique de séquençage haut débit utilisée, il sera parfois nécessaire de faire un complément d’étude de ces régions par la technique de Sanger. Dans les formes non familiales d’hémophilie A modérée et mineure il est généralement demandé d’avoir éliminé une maladie de Willebrand et un déficit combiné FV+VIII. Chez certains patients il peut co-exister une hémophilie A modérée/mineure et certaines formes de maladie de Willebrand homozygote ou hétérozygote, pour lesquels une étude du gène vWF sera une aide au diagnostic. (Ex : taux discordants au sein des différents membres d’une même famille). Ceci sera à discuter avec le clinicien pour une prise en charge par le Centre de référence de la maladie de Willebrand. Dans certaines situations un second prélèvement de contrôle peut-être demandé. Cette situation est discutée au cas par cas. Exemple, en cas d’étude négative un contrôle d’identité par étude de marqueurs polymorphes sur un 2nd prélèvement peut être proposé.



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Lorsqu’une mutation est identifiée et considérée comme responsable de l’hémophilie du patient, sa recherche chez les apparenté(e)s est recommandée et une étude de ségrégation familiale est proposée. On notera qu’actuellement le taux de détection d’une mutation délétère varie selon la forme de l’hémophilie. Dans les formes sévères ce taux est d’environ 99%, il passe à 94-95% dans les formes modérées et 88% dans les formes mineures. (4)

Remarque : l’étude ne sera entreprise que si le diagnostic de maladie de Willebrand et un déficit combiné en FV/FVIII sont éliminés. (Une étude de liaison FVIII-VWF doit être réalisée). Il sera utile de préciser la méthode utilisée pour doser le FVIII :C : chronométrique et/ou chromogénique. D’autres éléments évocateurs sont à rechercher : tendance hémorragique familiale par exemple. Dans les situations d’urgence telles qu’une grossesse en cours, l’étude génétique peut être entreprise sans attendre les résultats biologiques complémentaires, après discussion téléphonique avec le prescripteur. La patiente a en effet généralement été prélevée le même jour pour étude de l’hémostase et étude génétique afin de gagner du temps. Chez certaines patientes il peut co-exister hémophilie A modérée mineure et certaines formes de maladie de Willebrand homozygote ou hétérozygote, pour lesquels une étude du gène vWF sera une aide au diagnostic. Ceci sera à discuter avec le clinicien pour une prise en charge par le Centre de référence de la maladie de Willebrand. Lorsqu’une mutation est identifiée et considérée comme pouvant être responsable d’une hémophilie, sa recherche chez les apparenté(e)s est recommandée, y compris chez les hommes sains. En effet dans les cas d’identification d’une mutation pouvant être associée à une hémophilie modérée ou mineure la maladie a pu passer inaperçue.



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Remarques : Cette situation est à discuter pour chaque cas. Le clinicien doit réaliser une enquête approfondie avant de prescrire une telle demande Dans les situations d’urgence telles qu’une grossesse en cours, l’étude génétique peut être entreprise après discussion téléphonique avec le prescripteur. En cas d’étude négative un contrôle d’identité par étude de marqueurs polymorphes sur un 2nd prélèvement peut être proposé. Lorsqu’une mutation est identifiée et considérée comme pouvant être responsable d’une hémophilie, sa recherche chez les apparenté(e)s est recommandée, y compris chez les hommes sains. En effet dans les cas d’identification d’une mutation pouvant être associée à une hémophilie modérée ou mineure la maladie a pu passer inaperçue.



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La recherche chez les apparentées a pour but de déterminer un statut de conductrice. Les apparentées sont la mère et les autres femmes de la famille. La recherche est effectuée par la technique en vigueur au laboratoire pour les inversions du gène au niveau des introns 1 et 22 et par séquençage Sanger de l’exon concerné en première intention.

• La mère : Rechercher uniquement la mutation identifiée chez le cas index: - si positif -> résultat - si négatif : - refaire avec une autre méthode ou la même méthode, sur une extraction d’ADN

différente de préférence et si possible. - il est possible de faire une étude des microsatellites avec le prélèvement du fils pour vérifier la ségrégation ou redemander un prélèvement de contrôle si l’étude des marqueurs n’est pas possible - si négatif et ou micro satellites cohérents -> envisager la possibilité d’une mosaïque. Il est conseillé d’étudier cette hypothèse par : -l’utilisation d’une méthode plus sensible telle le NGS afin d’augmenter le nombre de lectures, pour multiplier les chances de confirmer cette hypothèse, ou toute autre méthode, -et l’analyse d’autres tissus tels des cellules buccales et ou un culot de cellules épithéliales urinaires

Les autres apparentées : Rechercher uniquement la mutation identifiée chez le cas index: - si positif -> résultat - si négatif : - refaire avec une autre méthode ou la même méthode, sur une extraction d’ADN

différente de préférence et si possible. Il est difficile de confirmer la ségrégation chez les apparentées par l’étude des microsatellites car cela

nécessite souvent l’étude d’autres membres de la famille.

On peut ainsi proposer dans le compte rendu : Devant ce résultat négatif et afin de s'affranchir de toute erreur d'échantillon, si vous le souhaitez, conformément aux règles de bonnes pratiques établies dans le cadre du réseau des laboratoires de génétique moléculaire de l'hémophilie (Genostase), nous sommes à votre disposition pour vérifier ce résultat sur un nouveau prélèvement sanguin.



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Dans les vraies formes sporadiques où la mère ne porte pas la mutation identifiée chez son fils : Il est fortement conseillé de vérifier la mutation sur un 2nd prélèvement et de vérifier la ségrégation correcte des échantillons mère - fils par étude de microsatellites. Il est souhaitable d’alerter le clinicien sur :

-Le fait que la mutation est vraisemblablement survenue de novo dans les gamètes de la patiente, ou au stade zygote chez son fils.

-que la patiente n'est vraisemblablement pas conductrice d'hémophilie A ou B sévère modérée ou mineure, bien que l'on ne puisse éliminer le risque d'une mosaïque somatique ou germinale chez elle.

-que dans la mesure où le statut de conductrice de la patiente n'est pas clairement établi, le risque pour elle d'avoir un autre enfant atteint est lié à l'existence d'une mosaïque germinale et ne peut donc définitivement être exclu.

- dans les formes sévères, dans l'éventualité d'une grossesse, en cas de foetus de sexe masculin, ceci sera à discuter dans le cadre d'une consultation de conseil génétique, un diagnostic prénatal par recherche directe de la mutation est techniquement réalisable et doit être proposé. Dans les formes familiales méconnues penser à étudier les grands-mères du propositus et si négatives alerter sur le risque de mosaïque possible chez les grand-mères maternelles ainsi que chez les grands-pères paternels. Cette hypothèse de mosaïque pourra être étudiée par le séquençage NGS qui est plus sensible si le séquençage Sanger des patients est négatif. Ne pas négliger des formes familiales méconnues passées inaperçues du fait de la forme mineure de la maladie.



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L’analyse indirecte est basée sur l’étude de marqueurs polymorphes liés aux gènes d’intérêt. Elle est peu utilisable dans les formes sporadiques (un tiers des cas sont des mutations de novo), en cas de mosaïque et dans les familles non informatives. Elle présente un risque potentiel de recombinaison génétique. De plus, elle impose souvent d’étudier plusieurs membres de la famille ce qui entraine des délais allongés de résultats. Attention : il est utile de rappeler qu’elle ne permet qu’un diagnostic d’exclusion dans les formes sporadiques.



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(1) Cas des mutations faux sens, non ou peu décrites, dont la détermination de la pathogénicité peut

avoir une répercussion sur la prise en charge du patient ou d’un membre de sa famille (conseil génétique, diagnostic prénatal, prise en charge thérapeutique…)

(2) Ces mutations sont à discuter au cas par cas avec le biologiste du laboratoire référent qui prendra en charge l’étude minigène F8 ou F9 après concertation avec le clinicien concerné.

B- Stratégie d’étude des Hémophilies sans NGS selon les Indications

1-Patients Hémophiles 1-Le cas index est un Hémophile A sévère : FVIII :C<1% 2-Le cas index est un Hémophile A modéré FVIII :C=1-5% ou mineur FVIII :C>5% 3-Le cas index est un Hémophile B FIX :C <1% - 40%

2-Diagnostic de conductrices chez des apparentées 4- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation identifiée 5- Cas particulier des néomutations 6- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation non identifiée

3-Situations particulières de Diagnostic de conductrices 7- Femmes à taux bas de facteur VIII :C sans antécédents familial d’hémophilie 8- Femmes à taux bas de facteur IX :C sans antécédents familial d’hémophilie 9- Femme avec notion d’hémophilie dans la famille et taux de FVIII :C et FIX :C normaux



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Les situations suivantes 4, 5, 6 sont identiques au paragraphe A et ne sont pas rappelées ici. 4- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation identifiée 5- Cas particulier des néomutations 6- Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation non identifiée



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C-Diagnostic prénatal des Hémophilies L’étude doit comporter l’analyse des parents et du fœtus. Elle s’appuie sur les recommandations ANPGM du Diagnostic prénatal. Se fait sur rendez-vous afin d’organiser au mieux l’analyse. La mutation doit être connue de préférence. Si cela n’est pas le cas prévenir le clinicien que le délai de résultat sera allongé. Peut-être réalisé sur une ponction de villosités choriales ou sur liquide amniotique. Dans tous les cas demander ou s’assurer qu’une culture des cellules fœtales sera réalisée. Un prélèvement sanguin de la mère est obligatoire et le prélèvement du père est souhaitable, Cas particulier de la recherche de l’inversion 22 du gène F8. Informer qu’il est préférable de travailler sur villosités choriales et que l’étude en direct sur liquide amniotique n’est pas possible et nécessite une culture cellulaire, ce qui retarde le résultat. Sexe fœtal : Doit toujours comporter la détermination du sexe par une ou l’autre des méthodes suivant le terme ou la situation : - recherche de séquences du gène SRY dans le sérum maternel - échographie - caryotype ou FISH. Mutation connue : inversion du gène F8 ou mutation caractérisée : Rechercher l'inversion ou la mutation responsable de l’hémophilie dans la famille par 2 méthodes différentes ou la même méthode en deux réactions indépendantes.



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Inversion 22 et 1 : réaliser 2 fois la réaction ou 2 méthodes au choix selon les disponibilités du laboratoire. Mutation ponctuelle : utiliser deux couples de primers différents si possible ou réaliser deux fois la réaction. Délétion : Selon les méthodes en vigueur au laboratoire : duplex PCR ou MLPA ou autre. Duplication : Selon les méthodes en vigueur au laboratoire, ex qPCR, MLPA ou autre. + si possible, étudier un marqueur intragénique ou deux marqueurs extragéniques encadrant le gène F8. Vérifier la ségrégation correcte des échantillons et l’absence de contamination maternelle par l’étude des microsatellites situés sur des chromosomes différents (dans ce cas, le prélèvement du père est souhaitable). Absence de mutation ou d’inversion et la mère est informative : Si conductrice obligatoire : étudier si possible les marqueurs intragéniques Si statut non établi : tester tous les marqueurs informatifs chez la mère Si exclusion : foetus non atteint Si pas d'exclusion et foetus de sexe masculin : proposer de réaliser un prélèvement de sang foetal pour dosage des facteurs de coagulation Situation à discuter avec le clinicien Absence de mutation ou d’inversion et la mère n'est pas informative : Détermination du sexe Si masculin : prélèvement de sang foetal pour dosage des facteurs de coagulation. Prendre contact avec le laboratoire d’hématologie hôpital Edouard Herriot Lyon pour s’assurer des modalités de prélèvement. Situation à discuter avec le clinicien. REFERENCES 1-The molecular analysis of haemophilia B: a guideline from the UK haemophilia centre doctors' organization haemophilia genetics laboratory network. Mitchell M1, Keeney S, Goodeve A; UK Haemophilia Centre Doctors' Organization Haemophilia Genetics Laboratory Network. Haemophilia. 2005 Jul;11(4):398-404. 2-F8 gene mutation type and inhibitor development in patients with severe hemophilia A: systematic review and meta-analysis. SC. Gouw, et al . Blood, 2012,(119) 12. 3-Factor VIII gene (F8) mutation and risk of inhibitor development in nonsevere hemophilia A. Corien et al for the for the INSIGHT Study Group. Blood, 2013, (122), 11. 4-Spectrum of Molecular Defects and Mutation Detection Rate in Patients With Mild and Moderate Hemophilia A Nadja Bogdanova,et al. Human Mut 2007 Jan 28(1) 54-60. Principales databases des gènes F8 et F9 http://eahad-db.org/ http://www.cdc.gov/ ANNEXES 1-Modèle de Feuille de Renseignement Clinique Etablis dans le cadre d’un groupe de travail de membres du Réseau Genostase et de cliniciens de la Cometh (Centre de coordination médicale d’étude des maladies de la thrombose et de l’hémostase)



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2-Liste des laboratoires du réseau en 2015

Ville Responsable de la structure

Responsable de l'activité

Adresse Coordonnées Intitulé activité Gènes

Caen Pr Xavier Troussard

Dr Annie Borel-Derlon Dr Yohann Répéssé

Laboratoire d’Hématologie niv 03 CHU Côte de Nacre 14000 Caen

Tél : 02 31 06 48 49 Fax : 02 31 06 50 99 [email protected] [email protected]

Diagnostic Génétique des hémophilies A

F8

Paris-Cochin

Pr Michel Vidaud

Pr Marc Delpech Dr Catherine Costa

Laboratoire de Biochimie et Génétique Moléculaire Groupe Hospitalier Cochin - Broca - Hôtel Dieu - Bâtiment Jean Dausset 27, rue du Faubourg Saint Jacques 75014 Paris

Tel : 33 1 58 41 19 23 Tél : 33 1 58 41 16 17 Fax : 33 1 58 41 15 80 marc;[email protected] [email protected]

Diagnostic Génétique des hémophilies A et B Etude de l’Inactivation de l’X

F8 et F9

Le Bremlin Bicetre

Pr Ali Turhan Dr Valérie Proulle Laboratoire d'hématologie Hôpital Bicêtre 78 rue du Général-Leclerc 94275 LE KREMLIN-BICETRE Cedex

Tél : 01 45 21 36 68 Fax : 01 45 21 28 47 [email protected]


F8

Lyon Pr Claude Negrier

Pr Christine Vinciguerra Dr Mathilde Fretigny

Laboratoire de Biologie Moléculaire des Pathologies de l'hémostase Laboratoire d'hématologie Pavillon E 2étage Hôpital Edouard Herriot Place d’Arsonval 69437 Lyon Cedex 03

Tel : 04 72 11 73 68 Fax : 04 72 11 95 05 [email protected] [email protected]

Diagnostic Génétique des hémophilies A et B

F8 et F9

Nantes Pr Stephane Bezieau

Dr Pierre Boisseau Laboratoire de Génétique Moléculaire Institut de Biologie CHU Hôtel Dieu 9, Quai Moncousu 44093 NANTES Cedex 01



F8 et F9

Saint-Ouen l’Aumône

Sylvie Cado Dr Jean-Marc Costa

Laboratoire Cerba ZI les Béthunes 5-7 rue de l'Equerre 95310 Saint-Ouen l'Aumône France



F8 et F9

Rennes Pr Thierry Fest

Dr Benoit Guillet Unité de biologie moléculaire Service d'hématologie cellulaire-Hémostase Hôpital Pontchaillou CHU de Rennes 2 rue Henri Le Guilloux 35033 Rennes

Tel : 02.99.28.24.10 Fax: 02.99.28.92.13 [email protected]


F8 et F9

Tours Dr Martine Raynaud

Service de Génétique Moléculaire Hôpital Bretonneau 2 boulevard Tonnellé 37044 TOURS Cedex 01



F8

Lille Pr Sophie Susen

Dr Christophe Zawadzki

Institut d'Hématologie -Transfusion, Centre de Biologie Pathologie, Bd du Pr Jules Leclercq, 59037 Lille Cedex

Tel : 03 20 44 42 16 Fax: 03 20 44 69 89 [email protected]


F8 et F9



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3-Cotation RIHN selon les indications 1-Patients Hémophiles Le cas index est un Hémophile A sévère : FVIII :C<1% = inversions 1 et 22 (PCR-LR et/ou southern Blot) + NGS +ou- MLPA Le cas index est un Hémophile A modéré FVIII :C=1-5% ou mineur FVIII :C>5% = NGS+ou- MLPA Le cas index est un Hémophile B FIX :C <1% - 40% = NGS +ou- MLPA

N318x2+N350 ou N318x2+N037+N350 N350+N318 N350+N318

2-Diagnostic de conductrices chez des apparentées Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation identifiée Cas particulier des néomutations : NGS recherche de mosaïque Diagnostic de conductrices chez des apparentées avec mutation non identifiée : Etude de microsatellites

N353 N350 N354

3-Situations particulières de Diagnostic de conductrices Femmes à taux bas de facteur VIII :C sans antécédents familial d’hémophilie = inversion 22 (PCR-LR ou southern Blot) + NGS +ou- MLPA Femmes à taux bas de facteur IX :C sans antécédents familial d’hémophilie = NGS +ou- MLPA Femme avec notion d’hémophilie dans la famille et taux de FVIII :C et FIX :C normaux = inversions 1 et 22 (PCR-LR et/ou southern Blot) + NGS +ou- MLPA

N318x2+N350 ou N037+N350+N318 N350+N318 N318x2+N350 ou N318x2+N037+N350

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