"Staphylococcus aureus" dans les produits laitiers

Utilisation des bactériophages pour le contrôle de

Staphylococcus aureus dans les produits laitiers

Thèse

LYNN EL HADDAD

Doctorat en microbiologie

Philosophiae doctor (Ph. D.)

Québec, Canada

© Lynn El Haddad, 2014

iii

Résumé

Staphylococcus aureus et ses entérotoxines constituent un risque pour l’industrie

alimentaire ainsi que pour les consommateurs. Environ la moitié des souches de S. aureus

peuvent libérer des toxines menant à des symptômes de nausées, de diarrhées et de

vomissements chez la personne ayant ingéré un produit contaminé. Une des solutions

envisagées pour éliminer S. aureus et éviter la production d’entérotoxines, est l’utilisation

d’un cocktail de phages.

Au cours de ce projet de doctorat, trois objectifs ont été développés afin de poursuivre

une stratégie de sélection d’un cocktail de phages anti-S. aureus. Tout d’abord, deux

phages isolés du milieu laitier, adaptés à celui-ci et respectant des critères de sélection, ont

été caractérisés. Ensuite, afin d’éviter un transfert de facteurs de virulence, des myophages

anti-S. aureus ont été produits sur une souche de Staphylococcus xylosus, une espèce non-

pathogène utilisée en transformation alimentaire et ont été caractérisés afin de confirmer

leur identité lorsqu’amplifiés sur les deux espèces. D’un autre côté, l’efficacité contre une

panoplie de souches de S. aureus isolées de sources distinctes, l’absence de gènes de

virulence dans les génomes phagiques et la résistance à différentes conditions

environnementales ont permis de sélectionner des phages différents. Ceux-ci ont fait l’objet

de deux cocktails de phages efficaces menant à une réduction significative de la

concentration de S. aureus dans des fromages de type Cheddar produits en laboratoire. De

plus, ces phages n’ont pas déclenché une surproduction d’entérotoxines staphylococciques

C, confirmant la sécurité de leur utilisation dans le milieu laitier. Enfin, la conservation des

phages sous forme encapsulée et congelée dans des microbilles de gel d’alginate/calcium

semble une approche à approfondir.

Les phages staphylococciques virulents analysés dans cette thèse constituent

d’excellents agents de biocontrôle étant non nocifs et infectant spécifiquement une espèce

bactérienne donnée. Ayant confirmé l’efficacité de deux cocktails de phages, l’utilisation

du produit phagique permettra de diminuer le risque d’apparition de souches bactériennes

résistantes aux phages. De plus, entreprendre une mise à jour constante du cocktail

phagique permettra de réduire la contamination causée par S. aureus, préservant ainsi

l’innocuité et la qualité des aliments.

v

Abstract

Staphylococcus aureus and its enterotoxins pose a risk to the food industry and for

consumers. Approximately half of the S. aureus strains can release toxins leading to

symptoms of nausea, diarrhea and vomiting to the person who ingests a contaminated

product. One emerging solution to eliminating and preventing S. aureus enterotoxin

production is the use of a phage cocktail.

Through this doctoral project, three objectives were developed to pursue a strategy for

selecting an anti-S. aureus phage cocktail based on well-defined criteria. First, a

methodology was developed leading to the isolation and characterization of two phages

from raw milk. Then, in order to avoid a transfer of virulence factors, anti-staphylococcal

myophages were produced on a strain of Staphylococcus xylosus, a non-pathogenic species

used in food processing. Their genomic identity when propagated separately on the two

species was confirmed. Moreover, the host range of these phages was tested against a panel

of S. aureus strains isolated from different sources. Their genome was analyzed to confirm

the lack of virulence genes. In addition, their resistance to different environmental

conditions was used to select different phages for application purposes. These data helped

design two efficient phage cocktails leading to a significant drop of S. aureus concentration

in small-scale laboratory-based Cheddar cheeses. In addition, they did not trigger the

overproduction of staphylococcal enterotoxin C confirming the safety of their use in the

dairy environment. Finally, in the aim of commercializing the product, conservation

methods were investigated and the encapsulation and freeze of phages in micro-beads

consisting of alginate/calcium gel particles appear promising.

Staphylococcal virulent phages seem to be excellent biocontrol agents, being harmless

and infecting specifically a given bacterial species. Having confirmed the efficacy of two

phage cocktails, the use of the phage product could help decreasing the risk of emergence

of phage resistant bacteria. Furthermore, undertaking a constant update of the phage

cocktail could also help reducing contamination caused by S. aureus and thereby preserving

safety and food quality.

vii

Table des matières Résumé ........................................................................................................................................... iii

Abstract ........................................................................................................................................... v

Table des matières ........................................................................................................................ vii

Liste des tableaux ........................................................................................................................... ix

Liste des figures ............................................................................................................................. xi

Liste des abréviations ................................................................................................................... xiii

Avant-propos ................................................................................................................................ xv

Chapitre 1. Introduction .................................................................................................................. 1

Avant-propos............................................................................................................................................ 1

Staphylococcus aureus, un danger médical et alimentaire ....................................................................... 1

Danger médical ................................................................................................................................ 2

Danger alimentaire ........................................................................................................................... 8

Identification du problème ............................................................................................................. 12

Les bactériophages, agents de biocontrôle potentiels ............................................................................ 14

Historique des phages..................................................................................................................... 14

Classification des phages ............................................................................................................... 15

Cycles lytique et lysogénique ......................................................................................................... 17

Critères de sélection des phages destinés à des fins de biocontrôle ............................................... 20

Un phage strictement virulent ......................................................................................21

Un phage ayant un génome dépourvu de tout facteur de virulence .............................22

Un phage polyvalent ....................................................................................................23

Un phage efficace dans tout type de matrice ...............................................................24

Un phage ayant une activité stable et une bonne conservation à long terme ...............25

Cocktails de phages ........................................................................................................................ 28

Applications phagiques .......................................................................................................................... 31

Thérapie par les phages .................................................................................................................. 31

Assainissement par les phages ....................................................................................................... 33

Biocontrôle et bio-préservation par les phages .............................................................................. 35

Problématique, hypothèses et objectifs du projet ......................................................................... 41

Chapitre 2. Characterization of a novel Panton-Valentine leukocidin-encoding

staphylococcal phage and its natural PVL-lacking variant ........................................................... 43

Résumé ................................................................................................................................................... 43

Avant-propos.......................................................................................................................................... 43

Contribution des auteurs ................................................................................................................. 43

Publication ...................................................................................................................................... 43

Abstract .................................................................................................................................................. 44

viii

Short-form paper .................................................................................................................................... 44

Acknowledgments .................................................................................................................................. 52

References .............................................................................................................................................. 53

Supplemental materials .......................................................................................................................... 56

Chapitre 3. Improving the safety of a Staphylococcus aureus polyvalent phage by their

production on a Staphylococcus xylosus strain ............................................................................. 61

Résumé ................................................................................................................................................. 611

Avant-propos .......................................................................................................................................... 61


Publication ...................................................................................................................................... 62

Abstract .................................................................................................................................................. 62

Introduction ............................................................................................................................................ 63

Materials and Methods ........................................................................................................................... 64

Results and Discussion ........................................................................................................................... 69

Acknowledgments .................................................................................................................................. 77

References .............................................................................................................................................. 78

Supplemental material ............................................................................................................................ 81

Chapitre 4. Efficacy of two Staphylococcus aureus phage cocktails in a small-scale

laboratory-based cheese production .............................................................................................. 89

Résumé ................................................................................................................................................... 89

Avant-propos .......................................................................................................................................... 89


Publication ...................................................................................................................................... 90

Abstract .................................................................................................................................................. 90

Introduction ............................................................................................................................................ 90

Materials and Methods ........................................................................................................................... 92

Results and Discussion ........................................................................................................................... 98

Acknowledgments ................................................................................................................................ 109

References ............................................................................................................................................ 109

Chapitre 5. Discussion, conclusion et perspectives ..................................................................... 113

Problématique de S. aureus .................................................................................................................. 113

Stratégie de sélection et d’élaboration de bons agents de biocontrôle staphylococciques ................... 114

Évaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux cocktails de phages staphylococciques ................ 119

Conclusions et perspectives ................................................................................................................. 121

Bibliographie ............................................................................................................................... 123

Annexe ........................................................................................................................................ 141

Liste des tableaux

Tableau 1.1. Protéines extracellulaires de S. aureus ............................................................. 6

Table S2.1. ORF identification, putative function, and comparison of LH1 genome with

sequences available in public databases ............................................................................... 56 Table 3.1. Genotyping of the 56 S. aureus strains used in this study. ................................. 66 Table 3.2. Codon usage of S. aureus JH1 and phages G1 and ISP for the amino acids

encoded by the Team1 tRNAs. ............................................................................................. 73

Table 3.3. Host range of phages Team1, phi812, and K propagated on S. aureus SA812 and

on S. xylosus SMQ121 ........................................................................................................ 736 Table S3.1. ORF identification, putative function, and comparison of Team1 genome with

sequences available in public databases ............................................................................... 82

Table 4.1. Phages used in this study .................................................................................... 93 Table 4.2. Log10 reduction of phage concentration after heat treatment at 73ºC for 20

seconds .................................................................................................................................. 98

Table 4.3. EOP values of the 5 phages infecting 57 strains of S. aureus and one strain of S.

xylosus SMQ121. ................................................................................................................ 101

ix

xi

Liste des figures

Figure 1.1. Fonctions des protéines de la paroi cellulaire de S. aureus. ................................ 5

Figure 1.2. Les morphotypes des bactériophages. ............................................................... 16 Figure 1.3. Représentation du réseau entre les phages de staphylocoques basée sur le

contenu protéomique. .................................................................................................... 17 Figure 1.4. Cycles lytiques et lysogéniques des phages virulents et tempérés. ................... 18 Figure 1.5. Micrographes par microscopie électronique à transmission de microsphères

d’alginate et d’alginate/carbonate de calcium remplies du phage K. ........................... 26 Figure 1.6. Exemple de l’efficacité des cocktails de phages. .............................................. 29 Figure 1.7. Effet d’un cocktail de phages (phiIPLA35 et phiIPLA88) sur la croissance de S.

aureus Sa9 dans un fromage à pâte pressée durant l’affinage. ..................................... 39

Figure 2.1. Genome alignments of LH1 and LH1-MUT, proteins bands shown on a SDS-

PAGE, and identification of the different structural proteins. ...................................... 48 Figure 2.2. Part of the LH1 genome showing the deleted region in LH1-MUT genome and

the nucleotide sequence of the attachment site attP. ..................................................... 50 Figure S2.1. Electron micrograph of S. aureus phage LH1. ................................................ 57

Figure S2.2. Genome alignments of all PVL-carrying phages available including LH1. ... 58 Figure S2.3. Comparison of staphylococcal phage complete proteome .............................. 59

Figure 3.1. Electron micrograph of phage Team1. .............................................................. 69 Figure 3.2. One-step growth curves of both Team1-SA812 and Team1-SMQ121 ............. 70 Figure 3.3. Circular genome comparison of phages Team1, G1, and ISP. .......................... 72

Figure 4.1. Monitoring phage concentration in Cheddar cheese curd at pH 5.5, stored at

4ºC for 28 days.............................................................................................................. 99

Figure 4.2. Monitoring staphylococcal and phage counts over time during a small-scale,

laboratory-based Cheddar cheese production ............................................................. 104

Figure 4.3. Monitoring phage concentration with or without encapsulation in beads in

fresh, freezed, and lyophilised states. ......................................................................... 107

Figure 4.4. Free phage and encapsulated phage concentration monitoring during 3 months

of storage at 4ºC and -20ºC ......................................................................................... 108

xiii

Liste des abréviations

ADN acide désoxyribonucléique

ADNdb acide désoxyribonucléique double brin

ADNsb acide désoxyribonucléique simple brin

ARN acide ribonucléique

ARNm acide ribonucléique messager

ARNr acide ribonucléique ribosomique

ARNt acide ribonucléique de transfert

Aw activité de l’eau

BIM mutant bactérien résistant aux bactériophages (bacteriophage-

insensitive mutant)

CA-SARM S. aureus résistant à la méthicilline associé à la communauté

CC complexe clonal

CI Intervalle de confiance (confidence interval)

CoNS staphylocoque à coagulase négative

CoPS staphylocoque à coagulase positive

Db double brin

ES entérotoxine

ET exfoliatine

EOP efficiency of plaquing

FDA food and drug administration

G + C contenu en guanine et cytosine de l’ADN

HA-SARM S. aureus résistant à la méthicilline acquis dans les hôpitaux

Kpb kilo paires de bases

LukS-PV sous-unité S de la toxine PVL

LukF-PV sous-unité F de la toxine PVL

MAPAQ ministère de l’agriculture, des pêcheries et de l’alimentation du

Québec

µl microlitre

ml millilitre

MLST multi-locus sequence type

MOI multiplicité d’infection (multiplicity of infection)

MSCRAMM protéines de sa paroi cellulaire (microbial surface components

recognizing adhesive matrix molecules)

nm nanomètre

ORF cadre de lecture ouvert (open reading frame)

Pb paire de bases

PBP protéine liée à la Pénicilline (Penicillin-binding protein)

PCR réaction en chaîne de la polymérase (polymerase chain reaction)

PVL Panton-Valentine leucocidine

PSM moduline soluble au phénol (phenol-soluble modulin)

RCRMB réseau canadien de recherche sur la mammite bovine

SARM S. aureus résistant à la méthicilline

Sb simple brin

SCC cassette chromosomique staphylococcique

SCV petite variante de colonie (small colony variant)

xiv

SDS-PAGE électrophorèse sur gel de polyacrylamide contenant du sodium

(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

ST séquence type

TSA tryptic soy agar

TSB tryptic soy broth

TSST toxine du syndrome de choc toxique

UFC unité formatrice de colonie

UFP unité formatrice de plaque

UHT ultra-haute température

xv

Avant-propos

Résultats trouvés. Conclusions retirées. Article publié. Thèse déposée. Une succession

de faits résumant quatre longues années de travail soulignées par une réussite bien méritée.

Je dois ce succès à plusieurs personnes qui m’ont inspirées, encouragées et fortifiées au

cours de ces années.

Je me permets tout d’abord de remercier mon directeur de thèse, Prof Sylvain Moineau,

sans qui cette étape n’aurait pas été accomplie. Merci Sylvain pour tes conseils

indispensables, pour ta présence inconditionnelle et pour la confiance que tu m’as accordée.

C’est grâce à toi que mon enthousiasme, ma curiosité et mon esprit scientifiques se sont

développés et m’ont permis d’atteindre cette étape aujourd’hui.

Je tiens aussi à remercier mon co-directeur de thèse ainsi que mon comité aviseur, Prof

Steve Labrie, Dr Claude Champagne et Dr Daniel St-Gelais. Merci pour votre confiance en

mon potentiel, pour vos mots encourageants, vos expertises respectives et surtout pour

avoir été présents tout au long de mon cheminement scientifique. Je remercie aussi Dr

Lawrence Goodridge d’avoir accepté le rôle d’examinateur externe.

Je voudrais aussi remercier les organismes subventionnaires, FQRNT, MAPAQ, AAC

et Novalait qui m’ont permis de réaliser ce parcours.

Un grand merci à mes collègues de travail, passés et présents. Merci pour votre simple

présence qui a rendu l’environnement de travail chaleureux et joyeux. Je voudrais surtout

remercier ma collègue de travail, mon amie depuis mon premier jour au Canada, Siham.

Merci pour tes conseils fraternels, merci d’avoir partagé ma joie et mes moments stressants.

Merci tout simplement d’avoir été ma grande sœur durant mon parcours au Canada.

Je voudrais aussi remercier tous mes amis et ma famille libanaise au Québec ainsi que

ma famille québécoise. La liste est tellement longue que je ne pourrais citer tout le monde

un par un. Je suis bénie de vous avoir tous dans ma vie. Vous m’avez tous submergée

d’amour. Votre présence m’a réconfortée et m’a permis de surmonter toutes les difficultés

rencontrées.

xvi

Merci à mon adorable frère Alain. J’ai passé deux années complètes à tes côtés et j’ai

appris à mieux te connaitre. Merci d’avoir supporté mes crises de folie et mon stress,

surtout en fin de parcours doctoral. Tu as toujours su quoi faire et quoi dire durant ces

moments et je te suis à jamais reconnaissante. Je remercie aussi mon frère Nicolas et ma

sœur Léa qui, malgré les distances, ont été présents chaque jour à mes côtés. Je vous aime

beaucoup vous trois!

Je tiens à remercier du fond du cœur mes parents, Paula et Sami. Vous êtes et vous

resterez mes idoles. Vous êtes l’exemple des parents forts, consacrés à offrir le meilleur des

vies à leurs enfants même si ceci conduit à un éloignement géographique. Merci d’avoir eu

confiance en moi et d’avoir eu le courage de m’envoyer seule à un pays si loin. Je vous

dédie mon succès et j’espère que vous êtes fiers de moi. Je vous aime!

Un grand merci à mon amour, à l’homme de ma vie, Georges. Tu as tellement enduré

pendant toutes ces années à cause des distances géographiques entre nous. Je te remercie

d’avoir toujours été là pour moi et d’avoir partagé mes moments de stress, de solitude et de

joie. Merci d’avoir toujours eu confiance en moi et en mon potentiel. La fin approche et

notre vie ensemble commencera bientôt! Je t’aime!

Je remercie Dieu chaque jour de m’avoir entourée de personnes si précieuses. C’est

grâce à vous tous que j’achève cette étape de vie avec succès et que je quitte le Canada en

gardant plein de beaux souvenirs inoubliables au fond de mon cœur.

When you reach the end of what you should know,

you will be at the beginning of what you should sense.

-Khalil Gibran, Sand and Foam-

1

Chapitre 1. Introduction

Avant-propos

L’introduction de la thèse est divisée en trois sections. La première section décrit le

microorganisme Staphylococcus aureus qui fait l’objet de cette thèse et sa problématique

dans les produits laitiers. Ensuite, une deuxième section consiste à développer une des

solutions de lutte contre S. aureus, soit les bactériophages virulents. Enfin, les applications

médicales et alimentaires des phages anti-staphylocoques sont détaillées dans la dernière

section.

Staphylococcus aureus, un danger médical et alimentaire

S. aureus appartient à la famille des Micrococcaceae et au genre Staphylococcus qui

regroupe 41 espèces reconnues jusqu’à présent (Gillaspy & Iandolo, 2009). C’est en l’an

1880 que la première description d’une infection suppurative par un staphylocoque a été

observée en Écosse et a été nommée par le chirurgien Alexander Ogston (Ogston, 1984).

L’adjectif aureus (ou "or" en latin) lui a été attribué en 1884 par Anton J. Rosenbach suite à

la couleur formée par les colonies sur du milieu sang (Rosenbach, 1884).

Ce qui diffère les staphylocoques des autres membres de cette famille est leur contenu

faible en G+C d’environ 32,8 % (Dlawer & Hiramatsu, 2004), leur tolérance élevée au sel

dans le milieu (jusqu’à 20 %) ainsi que leur résistance à la digestion par le lysozyme grâce

à son taux élevé d’O-acétylation au niveau de la couche de peptidoglycanes (Gillaspy &

Iandolo, 2009).

S. aureus est un coque à Gram positif d’environ 0,7 à 1,2 micromètre de diamètre qui se

trouve seul, en paires ou en grappe dans divers milieux liquides et solides. Cette bactérie

aérobie ou anaérobie facultative a une température optimale de croissance de 37 ºC lui

conférant le caractère de mésophile.

S. aureus est considérée avant tout comme une bactérie commensale. En effet, elle fait

partie de la microflore normale de la peau, du tractus intestinal et du nasopharynx. Dix à

35 % de la population générale sont des porteurs sains permanents et 60 % des individus

2

sont des porteurs sains temporaires de S. aureus (Edwards & Massey, 2011). Cependant, S.

aureus peut se retrouver dans d’autres niches écologiques dont la terre, l’air, l’eau et les

aliments dont les produits laitiers. Certaines souches infectent les mammifères incluant

l’humain. C’est le staphylocoque à coagulase positif le plus isolé d’infections humaines

puisqu’il est capable de produire l’enzyme menant à la coagulation du plasma sanguin.

Lorsque cette bactérie se transmet d’un individu malade à l’autre, change d’habitat normal

ou est exposée à une situation de stress, elle s’attache, colonise et déchaîne ses facteurs de

virulence multiples. De ce fait, S. aureus présente un danger de santé publique, que ce soit

au niveau médical ou alimentaire.

Danger médical

S. aureus est connue par sa prévalence dans les lieux hospitaliers et son transfert rapide

dans la communauté. En effet, environ 1 200 000 cas d’infections par S. aureus/an sont

notés dans les hôpitaux aux États-Unis (www.cdc.org/) ainsi que 28,4 cas d’infections par

S. aureus/100 000 habitants par an dans la région de Calgary au Canada (Laupland et al.,

2003).

Le problème de santé publique majeur relié à S. aureus et présent partout dans le monde

est celui de sa résistance aux antibiotiques. À cause d’une exposition fréquente à différents

types d’antibiotiques, ce pathogène est de plus en plus résistants à ceux-ci, dont notamment

à la famille des bêta-lactames (méthicilline, pénicilline, etc.). Ces souches pathogènes

prennent le nom de SARMs (S. aureus résistants à la méthicilline). Cette résistance est à

l’origine de la présence d’un gène nommé mecA localisé dans la cassette chromosomique

staphylococcique mec (ou SCCmec). Le gène mecA encode une protéine membranaire

appelée PBP-2a. Celle-ci confère une faible affinité aux antibiotiques de la famille des bêta-

lactame contrairement à la protéine PBP, empêchant ainsi l’affaiblissement de la paroi

bactérienne par les antibiotiques, la lyse et la mort cellulaires (Conly & Johnston, 2003;

Lim & Strynadka, 2002; Lowy, 2003).

Aux États-Unis, il a été estimé que les infections par les SARMs sont plus létales que la

mortalité associée au VIH/SIDA (Bancroft, 2007; Peschel & Otto, 2013). Le taux de

maladies reliées aux SARMs est 17 fois plus élevé dans les hôpitaux du Canada depuis

http://www.cdc.org/

3

l’année 1995 jusqu’à l’année 2010 (Public Health Agency of Canada, 2013). Celles-ci sont

aussi très coûteuses. On note un coût total relié aux infections par les SARMs d’environ 33

à 85 millions de dollars dans les hôpitaux canadiens en l’an 2005 (Goetghebeur et al.,

2007) avec une moyenne annuelle de 36 millions de dollars jusqu’en 2013 (Public Health

Agency of Canada, 2013).

Il existe deux types de SARMs. Ceux acquis dans les hôpitaux (HA-SARM) et ceux

associés aux disséminations dans la communauté (CA-SARM). Au Canada, 10 souches

différentes majeures de SARMs ont été identifiées et isolées jusqu’à présent (Nichol et al.,

2011). Les HA-SARMs sont nosocomiales et surviennent des plaies de patients infectés, de

cathéters, d’une hospitalisation prolongée, mais aussi de la peau de porteurs sains (Furuya

& Lowy, 2006). Ils sont résistants à plusieurs types d’antibiotiques (érythromycine,

tétracyclines, etc.) alors que les CA-SARMs ne sont résistants qu’aux antibiotiques

composés de bêta-lactames (Furuya & Lowy, 2006). Ils sont à l’origine de cas de morbidité

et de mortalité (Chen et al., 2011) et se disséminent rapidement dans la communauté

(Goetghebeur et al., 2007; Nichol et al., 2011).

S. aureus est responsable de trois principaux types de maladies. La première est

caractérisée par des infections cutanées et superficielles comme les impétigos, les

furoncles, les ulcères, les blessures infectées et les abcès. Dans le cas des bovins, ce genre

d’infection est appelé une mammite (infection des glandes mammaires bovines). Ces

infections suppuratives sont traitées rapidement et facilement par l’incision et le drainage

de l’infection accompagnés d’antibiotiques ou par l’application d’une pommade

antibactérienne (Edwards & Massey, 2011; McCaig et al., 2006).

Le deuxième type de maladies rassemble les infections systémiques staphylococciques.

Ces dernières constituent l’une des plus communes et sérieuses infections bactériennes dans

le monde et peuvent causer la mort de l’individu suite à la multiplication et la propagation

de S. aureus dans le sang causant une bactériémie et un choc septique létal (Thwaites &

Gant, 2011). Une bactériémie aggravée mène à l’entrée de la bactérie dans les tissus

environnants et peut causer une endocardite, des abcès au niveau des organes, une arthrite,

une ostéomyélite vertébrale ou même une méningite (Edwards & Massey, 2011; Miller &

Cho, 2011). Plusieurs études montrent la façon par laquelle S. aureus est capable de

4

s’adapter à son hôte et de fuir le système immunitaire (Edwards & Massey, 2011).

Premièrement, la capsule polysaccharidique semble permettre à S. aureus de résister aux

mécanismes de défense de l’hôte comme l’opsonisation et la phagocytose (Gillaspy &

Iandolo, 2009). L’entrée et la persistance à l’intérieur des neutrophiles par phagocytose

paraissent aider S. aureus à fuir le système immunitaire (Edwards & Massey, 2011).

Deuxièmement, ce pathogène peut profiter de l’apport en fer en s’attachant aux globules

rouges humains. Le fer étant un nutriment essentiel pour sa survie et sa virulence, il utilise

son enzyme hémolysine pour s’emparer de l’hème et le dégrader en fer (Lowy, 2011).

Une caractéristique spécifique à S. aureus est sa capacité à envahir une cellule hôte non

phagocytaire. Une fois à l’intérieur de ces cellules, S. aureus peut induire une apoptose ou

une nécrose cellulaire en les endommageant par ses cytotoxines, ou bien, persister sous un

état semi-dormant. Ce phénotype, appelé variante de petite colonie (ou small colony

variant, SCV), est protégé contre les attaques du système immunitaire et contre l’effet des

antibiotiques (Foster et al., 2014; Tuchscherr et al., 2010). Une étude a montré que les

SCVs peuvent demeurer plusieurs semaines à l’intérieur de la cellule hôte. De plus, lorsque

ces bactéries se « réveillent », elles reprennent leur virulence et infectent rapidement et

dynamiquement d’autres cellules de l’hôte (Tuchscherr et al., 2011). Ce changement de

phénotype semble essentiel pour le processus d’infection de S. aureus et est à l’origine des

infections chroniques et récurrentes (Garzoni & Kelley, 2011) (Figure 1.1).

5

Figure 1.1. Fonctions des protéines de la paroi cellulaire de S. aureus. Figure tirée de

Foster et al. (2014).

Toutes ces stratégies de protection, de colonisation et de survie de S. aureus sont

rendues possibles grâce, principalement, aux protéines de sa paroi cellulaire ou

MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules)

(Tableau 1.1).

Un troisième type de maladie causée par S. aureus concerne les toxinoses, ou les

symptômes déclenchés par la sécrétion de toxines dans le milieu. C’est le cas des

exfoliatines (ETs), de la toxine Panton-Valentine leucocidine (PVL), de la toxine du

syndrome de choc toxique (TSST-1) et des entérotoxines (ESs) (Tableau 1.1).

6

Tableau 1.1. Protéines extracellulaires de S. aureus. Tableau adapté de Gillaspy &

Iandolo (2009).

Protéine Localisation du gène

Hémolysines

• Toxine Alpha Chromosome

• Toxine Béta Chromosome

• Toxine Gamma Chromosome

• Toxine Delta Chromosome

• Panton-Valentine Leucocidines Chromosome/îlots de pathogénicité

Entérotoxines

• ES A Bactériophage/chromosome

• ES B Chromosome/îlots de pathogénicité

• ES C Plasmide

• ES D Plasmide

• ES E Chromosome

• ES G Chromosome

• ES I Chromosome

Enzymes et autres toxines

Lipase Chromosome

Nucléase Chromosome

Protéase V8 Chromosome

Estérase Chromosome

Coagulase Chromosome

Hydrolase de la paroi cellulaire Chromosome

Hyaluronidase Chromosome

Staphylokinase Bactériophage/chromosome

Protéine A Chromosome

Protéases sériques Chromosome/îlots génomiques

Phospholipase C Chromosome

Leucotoxines Chromosome/îlots génomiques

Leucocidines Chromosome/îlots de pathogénicité

Exfoliatine A (ETA) Chromosome

Exfoliatine B (ETB) Plasmide

Toxine du syndrome du choc toxique-1 (ES F) Chromosome/îlots de pathogénicité

MSCRAAMs

Facteurs d’agglutination Chromosome

Protéines A/B liées à la fibronectine Chromosome

Protéine liée au fibrinogène Chromosome

Protéine liée au collagène Chromosome

Protéine liée à l’élastine Chromosome

Protéines liée à la matrice extracellulaire Chromosome

Protéines d’adhésion intercellulaire Chromosome

Les ETs dont ETA et ETB sont des protéases sécrétées par S. aureus qui entraînent la

disparition des vésicules intercellulaires. Et ce, en ciblant la glycoprotéine desmogléine-1

responsable du maintien de l’adhésion cellulaire. Ceci donne lieu à la formation d'une

7

couche liquide entre les couches granuleuse et superficielle de l’épiderme et se manifeste

macroscopiquement par le décollement intradermique. Lorsque ce phénomène est localisé

grâce à la présence d’anticorps, il prend le nom de syndrome bulleux épidermique alors

qu’il se nomme syndrome de la peau ébouillantée ou syndrome de Ritter lorsqu’il est

généralisé (Bukowski et al., 2010; Larkin et al., 2009; Podbielska et al., 2011).

La toxine PVL, codée par un prophage, est responsable de la formation de pores dans

les neutrophiles et les macrophages et entraîne une apoptose cellulaire et des infections

nécrotiques cutanées et pulmonaires. Cette toxine est composée de deux sous-unités, LukS-

PV et LukF-PV qui s’assemblent et agissent de façon synergique pour former des pores

(Kaneko & Kamio, 2004). Les toxinoses causées par la PVL sont plus fréquentes

prévalentes chez les nourrissons et les enfants, les personnes immunosupprimées, les

travailleurs du domaine de la santé, les patients hospitalisés et chez les personnes ayant des

infections staphylococciques suppuratives (Vandenesch et al., 2003). Les SARMs sont

aussi responsables de la transmission et de la propagation de cette toxine dans la

communauté, à travers le monde (Barnes & Sampson, 2011; Blanco et al., 2011; Boakes et

al., 2011; Chen et al., 2011; Nagao et al., 2010; Zhang et al., 2008).

Le syndrome du choc toxique est causé par la toxine TSST-1. Celle-ci porte aussi le

nom de ES F ou entérotoxine staphylococcique F. Tout comme les exfoliatines et les autres

types d’entérotoxines alimentaires, TSST-1 est superantigénique. Elle cause la stimulation

accrue d’un vaste nombre de lymphocytes T et le déclenchement inapproprié d’une

libération massive de cytokines affaiblissant le système immunitaire de l’individu (Kum et

al., 2001; Raulin et al., 2010). La TSST-1 se caractérise par une apparition soudaine de

fièvre, une hypotension artérielle, des rougeurs, une défaillance d’organes multiples et une

desquamation notamment des paumes des mains et des plantes des pieds (Podbielska et al.,

2011). Ce syndrome est causé aussi bien par S. aureus que par Streptococcus pyogenes du

groupe A (Lappin & Ferguson, 2009).

Une nouvelle classe de toxines a été identifiée depuis l’an 2000, celles des modulines

solubles au phénol ou PSMs. Ces peptides contribuent à la virulence de S. aureus et surtout

des CA-SARMs. Elles peuvent tout d’abord favoriser la structure, le développement et le

détachement des biofilms ainsi que faciliter la dissémination des infections

staphylococciques associées aux biofilms aux autres organes du corps. De plus, les PSMs,

8

n’étant pas dépendants d’un récepteur, ciblent presque toutes les membranes

cytoplasmiques eucaryotes avec un tropisme pour les leucocytes et les érythrocytes. Ces

peptides restent peu étudiés, mais font l’objet de cibles prometteuses pour le

développement de vaccins anti-staphylococciques (Peschel & Otto, 2013). Plus

particulièrement, le système de sécrétion de ces protéines responsables de la lyse des

neutrophiles, et essentiel à la croissance bactérienne, a été identifié récemment. Ce système

de sécrétion de toxine constitue une cible potentielle pouvant inhiber la croissance et la

virulence de S. aureus (Chatterjee et al., 2013).

D’autres types d’ESs superantigéniques se retrouvent dans la liste des facteurs de

virulence de S. aureus et seront traitées dans la section suivante. Celles-ci sont reliées aux

maladies d’origine alimentaire.

Danger alimentaire

S. aureus est aussi un pathogène alimentaire contaminant, entre autres, le lait et les

dérivés laitiers. En effet, le lait est un milieu riche et propice pour la croissance

d’organismes de par le fait qu’il contient une teneur en eau élevée, une abondance de

nutriments et un pH près de la neutralité (entre 6,4 et 6,8) (Touch & Deeth, 2009). Des

microorganismes d’altérations et pathogènes peuvent se retrouver dans tout type de lait, que

ce soit du lait cru, pasteurisé, à durée de conservation prolongée (ESL) ou traité à une ultra-

haute température (UHT). La majorité des intoxications liées à la consommation de lait cru

sont causées par les bactéries pathogènes Listeria monocytogenes, Escherichia coli,

Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Yersinia enterocolitica et S. aureus. Leur

prévalence dans le lait cru dépend de la région géographique, de la saison, du nombre

d’animaux dans la ferme et de l’hygiène du lieu et du personnel (Touch & Deeth, 2009).

Pour ce qui est de S. aureus, sa présence dans le lait cru et les produits laitiers peut être

due à plusieurs facteurs. Premièrement, une mammite ou inflammation des glandes

mammaires de ruminants peut conduire au transfert de S. aureus dans le lait cru. Une étude

a montré que presque 45 % des échantillons de lait cru bovin testés contenaient des souches

staphylococciques à coagulase positive (Rola Jolanta et al., 2013). Ces souches

staphylococciques retrouvées dans le lait sont généralement géographiquement différents

9

ou endémiques à la ferme et à la région dans laquelle elles ont été isolées (Piccinini et al.,

2010; Proietti et al., 2010).

Deuxièmement, un manque d’hygiène du personnel durant la traite ou durant la

manipulation du lait et ses dérivés et l’utilisation impropre d’appareils industriels peuvent

affecter l’innocuité du produit laitier. D’autre part, une acidification insuffisante et lente du

caillé peut mener à des épidémies staphylococciques associées à ces produits (Le Loir et

al., 2003). Dans le cas des produits laitiers pasteurisés, les souches de S. aureus sont

détruites après le traitement à la chaleur. Ainsi, une présence de S. aureus dans ces aliments

est considérée comme un indicateur d’une contamination après le traitement par la chaleur

et donc, un manque d’hygiène (Asao, 2003; Bennett et al., 2013). Ce critère non respecté

pourrait être à l’origine de la présence de SARMs dans ces aliments et de souches

hypermutables résistantes à plusieurs types d’antibiotiques et porteuses de facteurs de

virulence (Graham et al., 2006; Normanno et al., 2007; Soares et al., 2011; Wang et al.,

2013).

Le dernier facteur favorisant la présence de S. aureus dans l’aliment est le non-respect

des conditions de transformation de l’aliment ou l’utilisation de conditions inadéquates

durant les différentes étapes de fabrication, de stockage et de transport du produit fini.

Plusieurs facteurs comme la température, le pH, l’activité de l’eau (Aw), la concentration de

sel et la compétition nutritionnelle de la microflore du milieu affectent la croissance de

S. aureus et sa production de toxines. De plus, les conditions environnementales pendant la

phase initiale de production de fromage est presque optimale pour la multiplication de

S. aureus (Bennett et al., 2013; Rola Jolanta et al., 2013). Donc, S. aureus peut être présent

dans les produits laitiers issus de lait pasteurisé et cru (Coveney et al., 1994).

Plus particulièrement, certaines souches de S. aureus, à une concentration spécifique

dans l’aliment, peuvent sécréter des ESs dans un milieu à Aw élevée, à un pH entre 4,8 et

9,0 et à une température optimale entre 34 et 40 ºC. Environ 50 % des souches de S. aureus

sont productrices de ESs (Su & Lee Wong, 1997; Sutra, 1998). Il a été démontré qu’une

concentration de 105 unités formatrices de colonies staphylococciques (UFC) par millilitre

ou par gramme d’aliment sont nécessaires pour qu’il y ait production et sécrétion de ES

dans le milieu. Cependant, certaines souches virulentes de S. aureus sont capables de

libérer leurs ESs à une concentration de 103 UFC/ml (Meyrand et al., 1998).

10

Une fois sécrétées dans l’aliment, une concentration en entérotoxines de l’ordre du

nanogramme peut déclencher les symptômes d’une intoxication alimentaire (diarrhées,

fièvre, nausées, crampes abdominales, maux de tête) à la personne ingérant l’aliment

contaminé (Hennekinne et al., 2012; Krakauer & Stiles, 2013; Ostyn et al., 2010). Ces

symptômes peuvent être bénins comme mentionnés plus haut, mais, dans des cas rares, ils

se déclenchent par des variations de la pression artérielle et même par la mort de la

personne par entérotoxicose et déshydratation (Balaban & Rasooly, 2000; Do Carmo et al.,

2004). Ces derniers symptômes surviennent plus fréquemment chez les enfants et les

personnes âgées (Do Carmo et al., 2004).

Les ESs sont des protéines solubles dans l’eau et dans les solutions salines. Elles

tolèrent des conditions environnementales extrêmes (séchage, congélation) et maintiennent

leur activité biologique dans le tractus digestif après ingestion, en résistant à l’activité

protéolytique des enzymes digestives, comme la pepsine et la trypsine (Hennekinne et al.,

2012; Le Loir et al., 2003), contrairement aux cellules de S. aureus. De plus, elles sont

thermorésistantes et peuvent tolérer une température de 121 ºC pendant 28 minutes

(Balaban & Rasooly, 2000).

Il existe jusqu’à présent, 23 différentes ESs, dont les cinq principales ES A à E, de

nouveaux ESs (ES G à I) et des « ESs-like » (ESI J à X) (Alibayov et al., 2014; Hennekinne

et al., 2012). Les ESs et les « ESs-like » présentent tous deux un effet superantigénique

puisqu’ils activent les lymphocytes T et stimulent la prolifération cellulaire et le relargage

massif des cytokines. Ceci va déclencher une réponse pro-inflammatoire et affaiblir le

système immunitaire contre les infections bactériennes (Gillaspy & Iandolo, 2009; Larkin

et al., 2009; Podbielska et al., 2011). Ce qui diffère ces deux types est la capacité des ESs à

déclencher une réponse émétique ou vomitive suite à une intoxication, alors que les « ESs-

like » ne le sont pas ou n’ont pas encore été testés efficacement sur des primates (Lina et

al., 2004).

Les toxines communément rencontrées sont celles de type A, qui sont attribuables à des

souches virulentes chez l'humain et celles de types B et C, qui sont attribuables à des

souches isolées des bovins et caprins (Villeneuve et al., 2007). En effet, les souches de

S. aureus isolées d’échantillons de lait de chèvre et de vache sont, le plus souvent,

productrices de l’entérotoxine ES C (Ercolini et al., 2004; Jorgensen et al., 2005).

11

La première description d’intoxication alimentaire staphylococcique date de 1884. Elle

a été investiguée par Vaughan et Sternberg. Ces derniers ont montré que cette intoxication

est survenue à la suite de la consommation de fromages contaminés (Hennekinne et al.,

2012). Depuis, il y eut plusieurs épidémies d’intoxications alimentaires. Mentionnons celle

qui s’est déroulée en Osaka, au Japon, en l’an 2000 et lors de laquelle treize mille

personnes ont été intoxiquées à cause d’une quantité minime de ES A présente dans du lait

en poudre et liquide (Ikeda et al., 2005). Cette entérotoxine est la plus abondante des ESs.

Ceci s’explique par une différence entre les ESs au niveau de leur production et la

sécrétion. Une étude récente a étudié l’expression et la production des principales ESs lors

de la croissance bactérienne de souches staphylococciques isolées de milieux alimentaires

(Derzelle et al., 2009). Les auteurs ont observé une production de ES A durant toute la

phase exponentielle de croissance de S. aureus (Derzelle et al., 2009; Wallin-Carlquist et

al., 2010a). À l’opposé, les ES B, C et D sont produits seulement durant la transition entre

les phases exponentielle et stationnaire (Derzelle et al., 2009).

De plus, ces entérotoxines sont situées sur différents éléments génétiques mobiles

comme des prophages (le gène de l’entérotoxine staphylococciques A ou sea), des

plasmides (seb, sec, sed), des îlots de pathogénicité et aussi sur des transposons, facilitant

ainsi des transferts horizontaux de gènes. En effet, le gène seb est trouvé sur un îlot de

pathogénicité dans certaines souches et sur un plasmide dans d’autres (Hennekinne et al.,

2012). Cependant, la présence du gène de toxine dans le matériel génétique de S. aureus

n’implique pas nécessairement la production de la toxine (Loncarevic et al., 2005).

Bien que les intoxications alimentaires staphylococciques ne représentent pas une

maladie très sévère, elles peuvent mener à une panique sociale, touchent à la santé publique

et font l’objet d’une charge sociale considérable (Su & Lee Wong, 1997). De ce fait, des

limites de comptes bactériens staphylococciques ont été établies par les agences

gouvernementales de chaque région. Au Québec, la loi sur les produits alimentaires P-29

stipule que la concentration maximale acceptée de S. aureus ne doit pas excéder

2 000 UFC/ml dans le lait cru et 1000 UFC/g dans le fromage issu du lait cru. Pour ce qui

est du fromage issu de lait pasteurisé, celui-ci doit contenir une concentration maximale de

100 UFC/g pour passer le contrôle de qualité (Commission Canadienne du Lait, 2011). Un

12

non-respect de ces normes mène au rejet des lots de laits et de fromages contaminés et une

perte économique.

Identification du problème

S. aureus est à l’origine d’infections humaines et d’intoxications alimentaires. Ces deux

différents dangers staphylococciques peuvent être détectés suite à l’identification, au

génotypage et au phagotypage (ou lysotypie, typage par les phages) des souches de

S. aureus.

Effectivement, il existe des méthodes de typage qui regroupent les souches bactériennes

selon leur parenté génétique. Ceci permet de reconstruire la chaîne d’infection et les

possibles évènements de l’évolution d’une espèce bactérienne donnée se produisant sur de

courts délais, en considérant les taux élevés de recombinaisons génétiques (Feil et al.,

2004; Wolf et al., 2011).

L’une des méthodes permettant le génotypage des souches bactériennes est l’obtention

de séquence type par MLST (multilocus sequence type). Celle-ci est hautement

discriminatoire et caractérise les isolats bactériens sur la base de séquences d’une longueur

d’environ 450 paires de bases pour chacun des sept gènes domestiques ou « housekeeping

genes » sélectionnés. Chez S. aureus, ces sept gènes sont : arcC (Carbamate kinase), aroE

(Shikimate déhydrogenase), glpF (Glycérol kinase), gmk (Guanylate kinase), pta

(Phosphate acetyltransférase), tpi (Triosephosphate isomérase) et yqi (Acétyl coenzyme A

acétyltransférase). Les fragments des gènes glpF et gmk sont les plus uniformes parmi les

sept gènes utilisés dans la méthode de MLST alors que les gènes arcC et aroE sont les plus

variables. Chaque gène constitue un allèle ou un locus et la combinaison des 7 loci donne

lieu à un profil allélique ou séquence type (ST). Les variations nucléotidiques à l’intérieur

de chaque gène s’accumulent relativement lentement au cours de l'évolution de l'espèce,

permettant d’identifier l’ancêtre commun d’un ST et ses descendants. L’avantage de cette

méthode est la comparaison immédiate des données obtenues avec celles d’autres

laboratoires de recherche, et ce, sur la base de données accessible en ligne (Enright et al.,

2000).

Par la suite, un algorithme appelé eBURST a été développé permettant le

regroupement des STs en des complexes clonaux (CCs) (Feil et al., 2004). Un CC est

13

composé d’un ST prédominant et relié à des STs relativement proches, différant d’un (SLV

ou variant d’un seul locus) ou de deux loci (DLV ou variant de double loci). On présume

que plus la fréquence du ST prédominant augmente dans la population, plus il évolue

graduellement, se diversifie (suite à des évènements de recombinaison et des mutations

ponctuelles) et donne lieu à des STs proches. Cet algorithme peut être utilisé pour expliquer

l’émergence et la diversité des clones bactériens.

Plusieurs études ont adapté ces méthodes de génotypage et de regroupement pour

caractériser les souches staphylococciques isolées localement, qu’elles soient d’origine

humaine ou animale. Dans le cas de souches de SARMs ou de souches de S. aureus

sensibles à la méthicilline (SASMs), Enright et al. (2000) ont comparé 155 isolats de S.

aureus isolés d’infections nosocomiales et communautaires de la région d’Oxford

(Angleterre). Ceux-ci ont observé des clones majeurs de SARMs appartenant

majoritairement à ST36. Les membres de ce ST semblent provenir du groupe ST30

(comportant des SASMs). Ces clones ont supposément évolués en acquérant le gène mecA

par transfert horizontal leur conférant une résistance aux bêta-lactames et ont bifurqué dans

le groupe ST36. D’autres SASMs de la région sont rassemblés dans les groupes ST25, ST8,

ST39, ST1 et ST5. Une deuxième étude a comparé les CCs de souches staphylococciques

humaines et bovines et a identifié un transfert de souches humaines aux bovins. C’est le cas

de CC8 adapté aux bovins qui commence à se propager de la Suisse à travers l’Europe

(Sakwinska et al., 2011). D’autres CCs sont exclusivement d’origine bovine comme le

CC97 et le CC151 et sont distribués dans tout le globe (Wolf et al., 2011) alors que la

prédominance d’autres groupes est relative à la région de laquelle les souches ont été

isolées. Par exemple, une prédominance de ST126 est observée au Brésil et alors qu’en

Norvège, c’est le groupe ST133 qui est prédominant (Sakwinska et al., 2011). Ce dernier

ST est aussi observé dans des régions françaises et allemandes (Wolf et al., 2011).

L’identification du problème accentue l’importance de la recherche de procédés

pouvant éradiquer ou réduire significativement la concentration de S. aureus dans les divers

milieux tout en maintenant la biodiversité et l’écologie microbienne de ces environnements.

Par ce fait, l’utilisation de bactériophages comme agents de biocontrôle est envisagée au

cours de cette étude.

14

Les bactériophages, agents de biocontrôle potentiels

Comme leur nom l’indique, les bactériophages, ou phages, sont des virus qui

« mangent » ou attaquent les bactéries. Ces entités lysent entre 4 à 50 % des bactéries

produites chaque jour (Breitbart & Rohwer, 2005). Ce sont les entités biologiques les plus

abondantes sur la Terre et sont présentes dans tout type d’environnement incluant les

aliments (Brüssow, 2005). On estime qu’il existe plus de 1031

de phages sur la Terre

(Clokie et al., 2011). Un millilitre d’eau de mer peut contenir un million de bactéries et

environ 10 millions de phages (Breitbart & Rohwer, 2005). En effet, ceux-ci sont

régulièrement et accidentellement consommés à travers l’ingestion d’eau et d’aliments

(Mahony et al., 2011). Leur capacité à lyser spécifiquement une espèce bactérienne donnée,

à se répliquer exponentiellement, à être sécuritaires, à s’autoréguler et l’absence de

perturbation de la microflore normale font d’eux des outils potentiels pour le contrôle des

bactéries pathogènes (Garcia et al., 2010).

Tout au long de cette section, des exemples de phages staphylococciques seront traités

préférentiellement.

Historique des phages

Les phages ont été co-découverts par Frederick Twort, un bactériologiste anglais et

Félix d’Hérelle, un microbiologiste Franco-canadien entre les années 1915 et 1917 (Twort,

1915). La première application rapportée de phages contre les maladies infectieuses

humaines a pris place en 1921. Les phages ont été utilisés pour traiter les infections

cutanées staphylococciques. Après 24 à 48 heures d’injection de la préparation phagique,

les infections ont régressées et des patients ont été guéris (Sulakvelidze et al., 2001). Des

produits phagiques dont le Bacté-staphy-phage ont été commercialisés en France (par la

compagnie prenant aujourd’hui le nom de L’Oréal), aux États-Unis (par la compagnie Eli

Lilly, Indianapolis) et surtout en Géorgie et en Pologne (Sulakvelidze et al., 2001).

Cependant, avec l’introduction des antibiotiques dans les années 1940, les pays occidentaux

ont adopté ces derniers comme agents antimicrobiens et ce n’est qu’après l’émergence de

souches pathogènes résistantes aux antibiotiques, que l’intérêt et la recherche en

phagothérapie ont repris leur cours aux États-Unis et dans plusieurs pays occidentaux, dont

15

l’Angleterre, les Pays-Bas, le Portugal, l’Israël, l’Australie, le Canada, etc. (Housby &

Mann, 2009).

Classification des phages

Les phages connus jusqu’à présent sont majoritairement classés sous l’ordre des

Caudovirales ou phages à queue et se divisent en trois familles : Myoviridae, Podoviridae

et Siphoviridae. Ces phages à ADN double brin diffèrent par leur morphologie et la taille

de leur génome (Ackermann & Prangishvili, 2012). Les phages appartenant à la famille des

Myoviridae ont une longue queue contractile et la présence d’une forme de « cou » qui

sépare la capside de la queue. Avec une taille de génome supérieure à 120 000 paires de

bases (pb), les myophages ont habituellement le plus large génome des trois familles. Les

Siphoviridae possèdent une longue queue non contractile et une capside icosaédrique ou

allongée, dépendamment du morphotype, ainsi qu’un génome d’environ 40 000 pb. Enfin,

les Podoviridae ont une queue courte et une taille de génome plus petite que 20 000 pb

(Ackermann & Prangishvili, 2012; King et al., 2011; Kwan et al., 2005) (Figure 1.2).

16

Figure 1.2. Les morphotypes des bactériophages. Figure adaptée de King et al. (2011).

Les phages de S. aureus isolés jusqu’à présent sont nombreux et leurs génomes

constituent une large section dans les bases de données publiques du NCBI. Une

classification de ces phages a récemment été proposée et supplémente les travaux

précédents d’autres équipes (Daniel et al., 2007; Deghorain & Van Melderen, 2012; Kwan

et al., 2005). Quatre-vingt-cinq génomes de phages et de prophages dont 15 spécifiques aux

staphylocoques à coagulase négative, ont été regroupés en se basant sur leurs similarités

protéomiques respectives. Cette approche a donné lieu à 9 groupes distincts dont 7 groupes

sont composés de phages appartenant à la famille des Siphoviridae (classe II), un groupe

formé de Myoviridae (Classe III) et un dernier rassemblant les Podoviridae (classe I).

Parmi les phages appartenant à la classe II, 2 groupes sont composés de phages de

S. aureus et de phages d’autres espèces de Staphylococcus, montrant une certaine proximité

entre les phages staphylococciques (Deghorain & Van Melderen, 2012) (Figure 1.3).

17

Figure 1.3. Représentation du réseau entre les phages de staphylocoques basée sur le

contenu protéomique. Les cercles représentent les 9 groupes différents. Les couleurs

indiquent l’espèce de l’hôte (magenta: S. aureus; mauve: S. aureus et staphylocoques à

coagulase négative; bleu: staphylocoques à coagulase négative). Le nombre de génomes est

indiqué entre parenthèses. Le groupe 8 correspond à la classe I (Podoviridae), le groupe 7

correspond à la classe III (Myoviridae) et le reste, à la classe II (Siphoviridae). Les lignes

grises entre chaque groupe sont indicatrices d’une identité d’au moins 30 % en protéines

partagée entre deux génomes de phages et plus. Figure tirée de Deghorain & Van Melderen

(2012).

Cycles lytique et lysogénique

Les phages se divisent en deux groupes suivant le cycle adopté. Il existe des phages dits

virulents et des phages tempérés. Les phages virulents suivent un cycle lytique qui s’achève

par la lyse bactérienne et la libération de nouveaux virions dans le milieu allant infecter

d’autres cellules. De l’autre côté, les phages tempérés suivent un cycle lysogénique en

intégrant leur ADN dans le chromosome bactérien. Prenant le nom de prophages, ils se

répliquent passivement avec leur hôte jusqu’à ce qu’une induction quelconque déclenche

l’excision de leur matériel génétique et permette la continuation d’un cycle lytique résultant

en la lyse bactérienne et la libération de nouveaux virions (Housby & Mann, 2009)

(Figure 1.4).

18

Figure 1.4. Cycles lytiques (gauche) et lysogéniques (droite) des phages virulents et

tempérés respectivement. La figure est adaptée et traduite de Labrie et al. (2010).

Les deux cycles lytique et lysogénique commencent par la reconnaissance et

l’adsorption du phage à un récepteur bactérien spécifique. Quelques études ont tenté

d’identifier les récepteurs bactériens et phagiques chez S. aureus. Toutefois, ceux-ci sont

loin d’être confirmés. Une étude a pu démontrer que les acides téichoïques de S. aureus

sont des polymères indispensables à l’interaction et l’adhésion de la bactérie aux cellules

épithéliales nasales humaines (Weidenmaier & Peschel, 2008). Par ce fait, ces éléments

pourraient jouer un certain rôle dans l’adhésion des phages à la surface bactérienne. Les

acides téichoïques sont des éléments majeurs de la paroi bactérienne présents à la surface

des bactéries à Gram positif. Ils se lient de façon covalente à la couche de peptidoglycanes

constituant 50 % du poids de la paroi bactérienne (Lowy, 1998). Du côté phagique, une

étude faite par Kaneko et al. (2009) a pu identifier un constituant de la structure du bout de

la queue du phage staphylococcique phiSLT de classe II, groupe 4 (ORF636). Celui-ci

19

pourrait être à l’origine de la reconnaissance et de l’adhésion du phage à la chaîne de

l’acide lipotéichoïque présent à la surface de S. aureus. Ce composant semble se lier

spécifiquement à S. aureus et ne peut se lier à aucune autre espèce de staphylocoque ou

bactérie à Gram positif (Kaneko et al., 2009). L’adsorption est l’une des étapes influençant

le spectre d’action phagique et expliquant, en partie, la spécificité des phages à une espèce

ou à une souche bactérienne donnée.

La seconde étape consiste en l’éjection de l’ADN dans la cellule hôte. Rashel et al.

(2008) ont démontré qu’une hydrolase à peptidoglycanes située à l’extrémité de la queue du

phage staphylococcique phiMR11, appartenant à la famille des Siphoviridae (classe II,

groupe 2, selon Deghorain & Van Melderen, 2012), favorise l’entrée de l’ADN phagique

dans le cytoplasme bactérien en formant des trous dans la couche de peptidoglycanes. Dans

le cas des phages de la famille des Myoviridae, le tube central de la queue du phage est

abaissé dans le pore formé jusqu’à ce qu’il ait un contact avec la membrane cytoplasmique

et l’ADN est injecté (Lobocka et al., 2012). La capside protéique, dépourvue d’ADN, reste

à l’extérieur de la cellule.

Une fois l’ADN phagique inséré, deux voies sont possibles selon les gènes disponibles :

le mode lytique et le mode lysogénique.

Le mode lytique peut se poursuivre par la transcription des gènes de phages, précoces,

intermédiaires et tardifs. Les gènes précoces détourne le métabolisme bactérien et initient la

réplication d’ADN phagique. Les gènes intermédiaires permettent la synthèse et la

réplication de l’ADN grâce à l’ADN polymérase cellulaire. Durant cette étape, de multiples

copies du génome phagique sont formées, et ce, 3 à 8 minutes après l’infection. Enfin, les

gènes tardifs, commençant environ 8 minutes après l’infection, codent pour les protéines

structurales, l’encapsidation de l’ADN dans la capside phagique (procapside) ainsi que

pour les protéines d’endolysine et d’holine (Ackermann, 1999).

L’encapsidation constitue la dernière étape dans la maturation de l’ADN des phages

caudés et est opérée à l’aide d’une terminase. Cette dernière coupe l’ADN et le transporte

dans la procapside. Il existe notamment deux modes principaux d’encapsidation selon le

type de phage. Dans le cas d’un phage de type « pac », l’encapsidation achève lorsque la

procapside est entièrement pleine. Le clivage de l’ADN par la terminase est alors produit à

une position quelconque donnant lieu à des concatémères de tailles différentes et des

20

extrémités redondantes. Pour ce qui est des phages de type « cos » ou à extrémités

cohésives, le site de clivage dépend d’un site « cos » reconnu par la terminase. Celle-ci

coupe à la même position donnant des copies complètes du génome de phage (Ackermann,

1999).

Le cycle lytique prend fin lorsque la holine et l'endolysine perforent la paroi bactérienne

et lyse la cellule hôte respectivement. La holine est une petite protéine qui cause des lésions

ou des trous non spécifiques en se polymérisant dans la membrane bactérienne. Ceci

permet à l'endolysine d’atteindre la couche de peptidoglycanes et de l’hydrolyser. Chacune

de ces protéines a une cible bien définie dans la couche de peptidoglycanes. Une fois la lyse

cellulaire réalisée, les nouveaux virions sont libérés dans l’environnement extracellulaire, et

s’apprêtent à infecter d’autres cellules bactériennes. Le nombre de particules virales

relarguées dépend de la souche de phage, de l’étape de croissance de la bactérie hôte lors de

l'infection, des composants nutritifs entourant la cellule et de plusieurs facteurs

environnementaux (Ackermann, 1999; Weinbauer, 2004; Wittebole et al., 2014).

Dans le cas d'un cycle lysogénique, et après l’étape d'entrée de l’ADN phagique dans le

cytoplasme bactérien, l'ADN est intégré dans le chromosome bactérien. Ce processus se

déroule grâce à un gène d’intégrase présent dans le génome phagique, à des sites

d’attachement marquant l’emplacement favorable à l’insertion du génome phagique et à un

gène répresseur empêchant la poursuite d’un cycle lytique. L'entité virale intégrée prend

alors le nom de « prophage » et se réplique passivement avec le chromosome bactérien. Il

est donc transféré verticalement avec le génome complet de son hôte à la progéniture de

chaque cellule fille bactérienne (Weinbauer, 2004). Un stimulus comme les rayons UV,

l’induction chimique ou thermale, et autres, peut causer l’excision du prophage et

déclencher un cycle lytique conduisant à la libération de nouveaux virions dans

l’environnement (Ackermann, 1999).

Critères de sélection des phages destinés à des fins de biocontrôle

Destiné aux utilisations à des fins médicales et alimentaires, un phage doit être bien

caractérisé et passer par plusieurs étapes de validation définissant son statut d’agent de

biocontrôle. La définition d’un produit phagique antimicrobien acceptable est un phage

21

strictement virulent, possédant un génome dépourvu de gènes de virulence, polyvalent

(infectant plusieurs souches de l'espèce ciblée), efficace dans tout type de matrice, in vitro

et in situ et maintenant une activité lytique stable à long terme. Il est à noter que ces critères

ne sont pas énumérés par ordre d’importance.

Un phage strictement virulent

Un phage strictement virulent est incapable d’intégrer ou d’insérer son ADN dans celui

de l’hôte bactérien, et ce, à cause de l’absence des fonctions génétiques requises pour

l’intégration (Klumpp et al., 2008) ou de la présence de mutations ponctuelles affectant le

module de lysogénie du phage (Garcia et al., 2009a).

Contrairement à ceux-ci, les phages tempérés peuvent s’intégrer dans le chromosome

bactérien suite à l’entrée de l’ADN dans la cellule de l’hôte. Par ce fait, ils contribuent et

favorisent le transfert horizontal du phénotype de virulence en transportant des gènes

codant pour la production de toxines, entre autres, entre les populations bactériennes

(Ackermann, 1999; Scharn et al., 2013).

Ce phénomène prend le nom de transduction et fait partie des trois méthodes employées

(conjugaison et transformation étant les autres) par les bactéries pour transférer ou recevoir

des gènes d’une cellule à une autre. Idéalement, ce matériel génétique exprimera la même

fonction dans la cellule réceptrice comme dans la cellule donneuse (Kelly et al., 2009).

L’avancement dans la technologie de séquençage de génomes bactériens complets et les

comparaisons phylogénétiques ont permis de confirmer l’occurrence de ce phénomène

(Thomas & Nielsen, 2005).

Une fois induit par un stress environnemental, le prophage est excisé et libéré du

génome bactérien, transportant à l’occasion des gènes bactériens, et les transférant à la

prochaine cellule hôte (Thomas & Nielsen, 2005). Cet échange génétique provoque une

évolution, une diversification naturelle et, parfois, une virulence plus accentuée à la cellule

hôte. En effet, des analyses bio-informatiques récentes de génomes de plusieurs souches

différentes de S. aureus confirment le développement de la pathogénicité de cette espèce

grâce à l’acquisition de gènes via des transferts horizontaux (Suzuki et al., 2012). Des

observations de transfert d’îlots de pathogénicité mobiles (ou SaPI) contenant plusieurs

facteurs de virulence (Novick, 2003), dont les gènes d’entérotoxines staphylococciques sea

et see présents dans des prophages (Balaban & Rasooly, 2000) et des gènes conférant une

22

résistance aux antibiotiques (Mašlaňová et al., 2013) ont été notées chez S. aureus. Chen &

Novick (2009) ont aussi observé un transfert d’îlots de pathogénicité entre une souche de S.

aureus et une souche de Listeria monocytogenes dans le lait cru à l’aide des phages 80α,

ɸ11, ɸNM2 et ɸNM4. Il suffit qu’une souche non pathogène ait acquis un gène de

virulence par l’intermédiaire d’un prophage pour qu’elle constitue un danger à la santé

publique (Skurnik et al., 2007).

Ces transferts horizontaux se font le plus souvent suite à une induction ou un stimulus.

Il a été montré que les antibiotiques induisent la réponse SOS chez S. aureus résultant en la

mobilisation de prophages et le transfert horizontal d’îlots de pathogénicité (Cirz et al.,

2007; Maiques et al., 2006). Il est intéressant de noter qu’en général, certains phages

transportent un seul facteur de virulence. Toutefois, il existe quelques exceptions, dont les

siphophages phiN315 (classe II, groupe 6) et phiSa3 (classe II, groupe non identifié) qui

encoderaient jusqu’à cinq facteurs de virulence (Malachowa & DeLeo, 2010).

Dans le cas des siphophages phi11 (classe II, groupe 1), phi80a (classe II, groupe 1) et

phi80 (classe II, groupe 2) de S. aureus, leur capacité à transporter des gènes du

chromosome bactérien, ainsi que des gènes retrouvés sur des éléments mobiles, est bien

documentée (Mašlaňová et al., 2013). Un autre exemple de phage qui ne répond pas à ce

critère de sélection est SA12, un phage tempéré de S. aureus appartenant à la famille des

Siphoviridae (classe II, groupe non identifié), qui a été isolé d’une infection clinique

staphylococcique (Chang et al., 2013). Le séquençage de son génome a permis la détection

du gène d’intégrase intact. Ce phage est considéré posséder un élément favorisant le

transfert horizontal de gènes de virulence (Chen & Novick, 2009).

Un phage ayant un génome dépourvu de tout facteur de virulence

Un agent de biocontrôle doit avoir un génome dépourvu de facteur de virulence.

L’utilisation d’un phage encodant des gènes de virulence lors des applications médicale et

alimentaire, provoquera sans doute le transfert de propriétés pathogènes aux bactéries de la

microflore normale humaine. Ainsi, il constituerait un risque à la santé humaine. De ce fait,

le génome d’un phage destiné au contrôle microbien devrait être séquencé afin d’assurer

son innocuité et l’absence de gènes de virulence potentiels.

Des exemples de phages non utilisables en thérapie ont été rapportés dans quelques

études. Ces phages possèdent des gènes de virulence dans leur génome encodant

23

notamment des toxines et autres, transportées habituellement par des prophages d’une

cellule donneuse à une cellule réceptrice. Comme mentionné déjà, plusieurs gènes codant

pour des facteurs de virulence ont été retrouvés dans les génomes de phages comme la

staphylokinase (sak ; responsable de la destruction tissulaire de l’hôte), les ESs (sea, see ;

responsables des intoxications alimentaires), le PVL (lukF-PV, lukS-PV; responsable de la

formation de pores dans les leucocytes et d’infections nécrotiques) et l’ETA (eta ; impliqué

dans des infections cutanées sévères) (Deghorain & Van Melderen, 2012).

De plus, il a été démontré que les phages tempérés de type pac sont parasités par les

îlots de pathogénicité, éléments mobiles et virulents de S. aureus. Ce phénomène semble

favoriser leur reproduction, leur empaquetage dans la capside phagique et leur transfert

d’une cellule à une autre. Il est basé sur l’utilisation du mécanisme de type pac du phage et

sur le blocage de la fonction de la terminase TerS leur permettant d’être encapsidés (Ram et

al., 2012). Cependant, récemment une étude a montré que non seulement les phages de type

pac sont à l’origine de ce transfert, mais de même, les phages de type cos participent à la

propagation de la virulence de ces éléments génétiques mobiles. L’empaquetage de type

cos médié par l’endonucléase HNH semble représenter un nouveau mécanisme impliqué

dans le transfert horizontal de gènes (Quiles-Puchalt et al., 2014).

Une solution alternative serait d’utiliser un hôte alternatif non pathogène pour

l’isolement et la propagation des phages. En plus de la facilité et la sécurité de

manipulation, cette approche minimise l’isolement de phages tempérés encodant des

facteurs de virulence. Par exemple, le phage P100 de L. monocytogenes peut être amplifié

avec succès sur la souche non pathogène de Listeria innocua (Carlton et al., 2005). De

même, le phage mycobactérien D29 est capable d’infecter le pathogène humain

Mycobacterium tuberculosis ainsi que la bactérie du sol Mycobacterium smegmatis (Gill &

Hyman, 2010).

Un phage polyvalent

La majorité des phages isolés ont des spectres lytiques restreints et sont spécifiques à

une ou deux souches d’une même espèce bactérienne (Ackermann et al., 1978; Garcia et

al., 2009b; Yuan et al., 2012), d’où leur utilisation pour la caractérisation et la classification

de souches par la méthode de typage par les phages. Cependant, récemment, de nombreuses

équipes ont isolé des phages à large spectre lytique. Ceux-ci appelés aussi des phages

24

polyvalents sont capables de lyser plusieurs souches d’une même espèce bactérienne ou

même de plusieurs espèces d’un même genre bactérien. Ce critère est recherché dans une

application de biocontrôle. La grande majorité des phages polyvalents appartiennent à la

famille des Myoviridae (classe III). On note les phages staphylococciques K, phi812, ISP,

SAH-1 et Stau2 dans cette catégorie (Han et al., 2013; Hsieh et al., 2011; O'Flaherty et al.,

2005b; Pantucek et al., 1998; Vandersteegen et al., 2011). Par exemple, les phages K et

phi812 infectent de multiples espèces staphylococciques à coagulase positive et négative

dont S. aureus, SARMs, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus epidermidis,

Staphylococcus capitis, etc. (O'Flaherty et al., 2005b; Pantucek et al., 1998). Les trois

autres phages sont considérés comme des phages « monovalents » vu qu’ils ne lysent que

des souches de S. aureus. Toutefois, leur spectre d’action est large puisqu’ils infectent

plusieurs souches de S. aureus de différentes sources dont celles résistantes et sensibles à la

méthicilline (Han et al., 2013; Hsieh et al., 2011; Vandersteegen et al., 2011).

Un phage efficace dans tout type de matrice

Un bon agent de biocontrôle est actif et efficace dans la matrice à l’étude (in situ) et

dans un milieu nutritif en laboratoire. En effet, une matrice complexe possède des

constituants qui pourraient interférer avec l’activité et l’efficacité du phage. Ceci s’applique

aussi bien dans une matrice alimentaire que dans le corps humain ou animal. Dans ce

dernier, les phages présents dans le sang, étant des virus « envahissants » pourraient être

considérés comme des « non-soi » ou des intrus et être attaqués par le système immunitaire.

Ceci causera possiblement une réponse immunitaire qui réduira l’efficacité des phages (Lu

& Koeris, 2011).

De même, la composition d’une matrice alimentaire, les conditions de températures et

de pH différents au niveau de la fabrication, la transformation et l’entreposage de l’aliment

peuvent diminuer l’activité phagique (Andreoletti et al., 2009; Mahony et al., 2011). Dans

une matrice laitière, par exemple, des composés protéiques pourraient interférer dans

l’interaction phage-hôte et inhiber l’activité phagique. Ceci résulterait en la multiplication

des souches pathogènes dans le lait et la présence inutile du phage protecteur dans l’aliment

(Gill et al., 2006; O'Flaherty et al., 2005a). Un exemple de ce phénomène a été observé par

plusieurs équipes travaillant sur l’activité du phage staphylococcique K dans le lait cru.

Dans ces études, les auteurs ont constaté que l’infection du phage K est fortement inhibée

25

dans le lait cru entier et ont déduit que cette inhibition pourrait être due à une agglutinine

ou une immunoglobuline (Korhonen et al., 2000; Loimarante et al., 1998). Cette protéine

viendrait s’attacher à la surface de S. aureus en la masquant et la rendant donc inaccessible

aux phages. Elle pourrait aussi modifier cette bactérie de manière à empêcher les phages de

s’y adsorber (Gill et al., 2006). Il est donc suggéré de sélectionner un phage isolé du milieu

à protéger. Un tel phage pourrait être plus adapté aux conditions du milieu et résister

davantage à ses changements (Brüssow, 2005).

Un phage ayant une activité stable et une bonne conservation à long terme

Un autre point important à considérer est la conservation de l’agent de biocontrôle et le

maintien de sa concentration élevée dans l’aliment ciblé. Certains phages sont sensibles aux

changements environnementaux (Balogh et al., 2005). Le maintien de la concentration de

ceux-ci en milieu liquide à 4 ºC ne dépasse pas une année (Merabishvili et al., 2013). Il

existe aussi des phages qui ne tolèrent pas un stockage à 4 ºC et qui voient leur

concentration chuter de 70 % après un an (Abshire et al., 2005).

Jusqu’à présent, les phages approuvés et vendus sur le marché mondial (Anonymous,

2012; Bren, 2007) sont administrés sous forme liquide. Il existe des méthodes de

conservation, de concentration et de protection des phages contre les conditions de

température, de dessiccation et d’autres changements, dont la méthode de

microencapsulation. Celle-ci est une méthode d’emballage de matériels solides, liquides ou

gazeux dans des capsules ou barrières physiques et dont la taille varie de 200 à 2000

micromètres. Ces capsules minimisent la possibilité de diffusion de facteurs

environnementaux et libèrent leur contenu sous des conditions spécifiques et contrôlées

(Kailasapathy, 2002). Il existe plusieurs méthodes d’encapsulation, cependant, l’une des

techniques les plus utilisées pour l’encapsulation des phages est l’extrusion.

L’extrusion est le fait de produire des gouttelettes du matériel à encapsuler couplé à un

polymère, en le forçant à passer à travers une tuyère (pour la production de microbilles) ou

un tuyau de petit diamètre (macrobilles), et ce, à l’aide d’une pompe électrique. Ces

gouttelettes sont trempées et durcies dans une solution de cations comme le calcium, le

sodium ou le magnésium (Ma et al., 2012). L’alginate est le polysaccharide le plus

communément employé lors du processus d’extrusion. Celui-ci est non toxique et sa nature

instable fait qu’il forme un gel ou un complexe en présence de cations et durcit les

26

gouttelettes en billes (de Vos et al., 2010). Un exemple d’utilisation de cette méthode est le

phage staphylococcique K qui a été encapsulé dans des microsphères d’alginate de 500 µm

couplées à du carbonate de calcium afin d’être ensuite mis en présence de pepsine et d’un

pH de 2,5. Les auteurs ont montré que la couche d’alginate/carbonate de calcium a favorisé

la préservation du phage K et sa libération sous forme intacte dans le fluide intestinal (Ma

et al., 2012) (Figure 1.5).

Figure 1.5. Micrographes par microscopie électronique à transmission de

microsphères d’alginate (A) et d’alginate/carbonate de calcium (B) remplies du phage

K (C). Les flèches montrent le phage K (coupe transversale). Photo adaptée de Ma et al.

(2012).

La lyophilisation constitue aussi une autre méthode pour la conservation à long terme

des phages. Pour ce faire, trois étapes sont effectuées. En premier lieu, l’entité à lyophiliser

est congelée à -30 ºC/-40 ºC (Merabishvili et al., 2013). Ensuite, la glace est retirée du

produit suite à une étape primaire de séchage sous une basse pression et une température

réduite de -30 ºC/-40 ºC. Finalement, une étape secondaire de séchage se manifeste par

l’introduction graduelle de chaleur sous pression (jusqu’à 25 à 30 ºC environ (Merabishvili

et al., 2013)) retirant l’humidité résiduelle et donnant lieu à de petites particules poudreuses

de l’entité (Akers, 2010; Zuidam & Shimoni, 2010). L’utilisation d’un cryoprotecteur est

très important durant cette méthode afin d’éviter toute dessiccation extrême.

27

Dans leur étude, Ma et al. (2012) ont testé plusieurs additifs stabilisants comme le

sucrose, le tréhalose, la maltodextrine et le lait écrémé et ont constaté que la maltodextrine

serait le meilleur additif protecteur du phage K. De leur côté, Merabishvili et al. (2013), ont

affirmé que le sucrose à 0,8 M et le tréhalose à 1,0 M confèrent une lyoprotection et

cryoprotection au phage ISP de S. aureus. Des études de stockage de différents phages

(Ackermann et al., 2004; Fortier & Moineau, 2009) incluant des phages de S. aureus

(Zierdt, 1988), à plusieurs températures et durant plus d’une décennie, ont confirmées la

stabilité de la majorité des phages lorsque ceux-ci sont lyophilisés en présence d’un

stabilisateur, à 4 ºC, -80 ºC et -196 ºC. Ackermann et al. (2004) ont comparé la stabilité de

plusieurs familles de phages pendant plus de 20 ans et ont montré que leur préservation ne

dépend pas de leur morphologie. Effectivement, la majorité des phages ont vu leurs

concentrations baisser d’une unité de log10 chaque année à 4 ºC alors qu’une fois

lyophilisés, la concentration de ceux-ci a chuté d’environ 3 unités de log10 en moyenne

après plus de 20 ans de stockage (Ackermann et al., 2004). D’un autre côté, Zierdt (1998) a

comparé dans son étude le titre de 27 phages staphylococciques avant et après la

lyophilisation à la suite d’un stockage de 10 ans. Ainsi, 12 des 27 phages testés ont gardé la

même concentration initiale, 14 phages ont vu leur concentration chuter d’une unité de

log10 directement après la lyophilisation et un seul phage a vu sa concentration chuter de 1

à 2 unités de log10. Ceci montre bien qu’avec les bonnes conditions, les phages peuvent

maintenir une concentration stable pendant plusieurs années et même décennies.

Cependant, les résultats varient d’un phage à l’autre et ne peuvent être généralisés

(Merabishvili et al., 2013; Shapira & Kohn, 1974).

Donc, un bon agent de biocontrôle phagique doit être polyvalent, incapable de

poursuivre un cycle lysogénique, être strictement virulent et se répliquer aux dépends de sa

cible bactérienne, sans être éliminé ou inactivé par une adaptation de l’hôte ou des

changements environnementaux. De plus, le produit phagique ne doit pas posséder des

caractéristiques nuisibles comme des facteurs de virulence bactériens ou des quantités

excessives d’impuretés potentiellement toxiques. Un dernier point couvre la maintenance

d’une stabilité et d’une durabilité du phage depuis sa production jusqu’à son application.

Toutefois, la totalité de ces critères n’est pas facilement retrouvable chez un seul phage et la

probabilité d’apparition de souches résistantes à ce phage augmente avec chaque utilisation.

28

Il serait alors souhaitable d’élaborer des cocktails de phages en sélectionnant des agents de

biocontrôle efficaces ayant des caractéristiques différentes, pour minimiser l’apparition

rapide de souches résistantes.

Cocktails de phages

Au fur et à mesure qu’un même phage est utilisé contre une souche hôte, celle-ci peut

s’adapter et évoluer avec le temps afin de bloquer l’action du phage. Par exemple, une

mutation dans le récepteur phagique empêchera l’adsorption phagique. Les autres étapes du

cycle lytique du phage pourraient aussi être « bloquées » par la cellule hôte (Labrie et al.,

2010). Afin de ralentir l’apparition de cette résistance, un autre phage appartenant

préférablement à une autre famille pourrait être utilisé en concomitance avec le premier

phage. En effet, il semblerait qu’un cocktail phagique a une plus grande efficacité sur

l’inhibition des souches bactériennes que l’action d’un seul phage. Il est capable de couvrir

une gamme d’hôtes plus large, réduisant la fréquence de l’apparition de résistance

bactérienne. Ceci s’explique par le fait que les récepteurs phagiques présents sur la surface

bactérienne sont spécifiques à chaque groupe de phages (Lu & Koeris, 2011). Il est donc

plus difficile que les bactéries puissent acquérir des mutations leur permettant de résister à

tous les phages contenus dans un cocktail. À noter par contre que ce n’est pas tous les

phages qui infectent une même souche, puisque plusieurs phages ont un spectre lytique

restreint. L’utilisation de cocktails de phages ayant des spectres lytiques différents et

chevauchants serait souhaitable (Figure 1.6) (Barrow & Soothill, 1997; Garcia et al., 2010;

Kutateladze & Adamia, 2010).

29

Figure 1.6. Exemple de l’efficacité des cocktails de phages (Lu & Koeris, 2011).

Toutefois, il est intéressant de noter une différence entre la résistance bactérienne aux

phages in vitro et in vivo. Capparelli et al. (2007) ont comparé la fréquence d’apparition de

résistance aux phages chez la souche S. aureus A170 in vitro et dans les souris. Les auteurs

ont observé une apparition de souches résistantes aux phages (BIM, bacteriophage-

insensitive mutants) in vitro avec une fréquence de 1,3×10-8

alors qu’aucun BIM n’a été

observé in vivo (Capparelli et al., 2007). Ceci indiquerait que la croissance bactérienne in

vitro n’est pas similaire que celle in vivo. Effectivement, la bactérie fait face à des

conditions et un milieu plus complexe in vivo (Lu & Koeris, 2011). De même, Abuladze et

al. (2008) n’ont retrouvé aucun BIM de E. coli dans divers types d’aliments en présence

d’un cocktail de trois phages. O’Flynn et al. (2004) ont observé une diminution de la

fréquence d’apparition de BIMs lors de l’utilisation d’un cocktail de phages anti-E. coli

comparé à un seul phage.

Des méthodes d’élaboration de cocktails de phages efficaces ont été suggérées par

quelques auteurs. Kelly et al. (2011), de leur côté, ont proposé le développement d’un

cocktail anti-S. aureus composé du phage polyvalent K ainsi que six dérivés de ce phage.

Ces mutants naturels ont été isolés après plusieurs propagations du phage K sur des souches

de S. aureus résistantes au phage sauvage. Ainsi, le cocktail de phages contenant sept

variants du phage K a lysé 24 des 29 souches de S. aureus résistantes au phage K sauvage.

Cette méthode a donc permis un élargissement du spectre lytique contre des souches de

provenance clinique, résistantes à une large gamme d’antibiotiques (Kelly et al., 2011).

30

Utilisant le même concept, Gu et al. (2012) ont développé une technique appelée SBS

(Step-By-Step) pour l’élaboration de cocktails de phages efficaces. Un phage a été isolé à

l’aide d’une souche de Klebsiella pneumoniae et testé contre sept souches de cette espèce

pathogène. La souche résistante à ce premier phage a été ensuite utilisée pour l’isolement

d’un deuxième phage pouvant lyser cette souche. Ce processus d’isolement s’est répété

jusqu’à ce que toutes les souches résistantes aient été lysées par l’un ou l’autre des phages.

Les auteurs ont utilisé trois phages, GH-K1, GH-K2 et GH-K3 pour former le cocktail anti-

K. pneumoniae. Ils ont constaté qu’une faible dose du cocktail de 104 unités formatrices de

plaques (UFP)/souris infectée par 108 UFC/souris suffisait pour réduire la concentration

bactérienne de plus de 7 unités de log10 et guérir les souris. En comparaison, chacun des

trois phages (GH-K1, GH-K2 et GH-K3), ajoutés séparément à des concentrations plus

élevées que le cocktail de phages, a réduit la concentration du pathogène de 5 à 6 unités de

log10 (Gu et al., 2012). Ces résultats suggèrent une meilleure efficacité des cocktails de

phages par rapport à celle d’un phage utilisé seul (Gill & Hyman, 2010). Une autre étude a

élaboré un cocktail de phages anti-E. coli en se basant sur une approche différente. Les

phages sélectionnés dans cette étude, SP21 et SP22 utilisent des récepteurs différents sur la

surface bactérienne. Leur sélection a permis de retarder l’apparition de souches résistantes

aux phages de plus de 20 heures comparé à l’activité de phages utilisant le même récepteur.

L’étude émet l’hypothèse que l’ajout d’un troisième phage dans le cocktail ciblant un

récepteur différent des deux autres phages permettra de retarder encore plus l’émergence de

résistance bactérienne aux phages (Tanji et al., 2004). De nombreuses autres études se sont

concentrées sur l’activité des phages (monophage ou cocktails de phages) contre des

souches pathogènes, et ce, autant au niveau médical qu’au niveau alimentaire. Dans la

section suivante, les stratégies phagiques anti-S. aureus seront ciblées et prendront le nom

de thérapies, d’assainissements, de biocontrôle et de bio-préservation.

31

Applications phagiques

Il existe plusieurs compagnies à travers le monde qui travaillent sur la

commercialisation de produits de phages (Housby & Mann, 2009). En effet, une panoplie

d’études ont été réalisées sur la thérapie phagique (Abuladze et al., 2008; Balogh et al.,

2005; Bigwood et al., 2008; Bigwood et al., 2009; Borie et al., 2008; Bruttin & Brussow,

2005; Leverentz et al., 2004). D’autres études présentent des produits de phages efficaces

pour la lutte contre les bactéries pathogènes approuvés par la FDA (Food and Drug

Administration) et Santé Canada (Anonymous, 2012; Bren, 2007), commercialisés et

utilisés de nos jours par les producteurs et les transformateurs.

Cette partie de l’introduction est axée sur les études ciblant l’utilisation de phages de S.

aureus dans les domaines médicale et alimentaire. L’usage de phages en médecine fait

l’objet d’une thérapie alors que dans les industries alimentaires et les hôpitaux, des

méthodes d’assainissement des surfaces inertes sont appliquées. Enfin, dans les industries

alimentaires exclusivement, des moyens de biocontrôle et de bio-préservation des aliments

par les phages sont à l’étude.

Thérapie par les phages

Conséquemment à l’augmentation continue de la résistance aux antibiotiques, le sujet

de la thérapie par les phages a repris de l’intérêt récemment dans les pays occidentaux et a

fait l’objet de plusieurs études. En effet, contrairement aux phages, les antibiotiques sont

des produits synthétiques ou semi-synthétiques et ont un large spectre d’action affectant

même la microflore normale. Si ceux-ci sont utilisés de façon intense, des effets

secondaires sévères peuvent se déclencher chez le patient. De plus, les antibiotiques ne

s’autorépliquent pas et ne s’autorégulent pas. En effet, une fois introduits dans l’organisme,

leur concentration diminue naturellement avec le temps. Les phages, eux, continuent à

s’amplifier au site d’infection bactérien, à condition que les hôtes bactériens y restent

sensibles (Housby & Mann, 2009). Il est aussi intéressant de noter que la fréquence

d’apparition de bactéries résistantes aux phages serait de 10-7

à 10-8

et donc

significativement moindre que celle de la résistance aux antibiotiques (environ 10-5

) (Merril

et al., 2006).

32

Plusieurs auteurs ont tenté d’éliminer ou de réduire significativement la concentration

de bactéries pathogènes multirésistantes dont fait partie S. aureus. Des phages tempérés ont

été isolés et utilisés contre S. aureus infectant des animaux. Matsuzaki et al. (2003) ont

induit un prophage staphylococcique appelé phiMR11 appartenant à la famille des

Siphoviridae et ont testé ce phage tempéré dans des souris injectées par 108 cellules de S.

aureus. Ce phage a réduit la létalité des souris causée par S. aureus. De mêmes résultats ont

été observés par Wills et al. (2005) suite à l’injection de 107 UFC de S. aureus et du

siphophage LS2a à une multiplicité d’infection (MOI, rapport phages/bactéries) de 100

dans des lapins présentant des infections de plaies. Le phage LS2a, isolé d’eaux d’égouts, a

été capable de prévenir la formation d’abcès tout en se multipliant dans les tissus. De plus,

une autre étude a permis l’obtention d’un mutant naturel du siphophage WSA

, nommé MSA

.

Ce dernier a été isolé de la circulation sanguine de souris après une exposition de 21 jours

au système immunitaire et à 108 cellules de S. aureus. M

SA a été capable de guérir 97 % de

souris malades (MOI de 10), en diminuant la formation d’abcès et conduisant à la lyse des

cellules de S. aureus présentes à l’intérieur des cellules eucaryotes, in vivo et in vitro, et ce,

après 4 jours de traitement. Bien que dérivé d’un phage tempéré, MSA

présente un large

spectre d’action et est capable d’infecter des souches virulentes de SARMs (Capparelli et

al., 2007). Cependant, l’utilisation de phages tempérés dans la thérapie n’est pas

souhaitable puisqu’elle favorise le cycle lysogénique et l’acquisition de gènes de virulence

via la transduction généralisée (Gill & Hyman, 2010).

D’autres exemples de thérapies par phages se présentent en termes de cocktails de

phages ciblant plusieurs bactéries pathogènes. Deux produits phagiques contre S. aureus et

d’autres bactéries pathogènes ont déjà passé la première étape d’approbation par les

autorités requises. C’est le cas du produit BFC-1 constituant un cocktail de trois phages,

PNM, 14/1 et ISP, anti-S. aureus et anti-Pseudomonas aeruginosa. ISP est un phage

appartenant à la famille des Myoviridae et infecte S. aureus alors que les deux autres

phages, 14/1 (Myoviridae) et PNM (Podoviridae) sont spécifiques à P. aeruginosa. Le

produit BFC-1 est présentement en cours d’essais cliniques dans un hôpital militaire à

Bruxelles (Belgique) et en cours d’approbation par le comité d’éthique. Il présente

plusieurs critères positifs dont des phages purifiés strictement virulents à large spectre

lytique, un maintien de l’activité phagique initiale après un an de conservation à 4 ºC, une

33

absence de toxicité et de pyrogénicité. Pour l’application clinique, ce cocktail a été

pulvérisé une seule fois sur la région infectée de 8 patients résultant en l’ajout d’au moins

100 phages pour chaque bactérie ciblée et aucun effet secondaire n’a été observé

(Merabishvili et al., 2009). Le deuxième cocktail de phages nommé WPP-201 a été

approuvé par la FDA et est utilisé contre les pathogènes S. aureus, E. coli et P. aeruginosa

et leur biofilms présents dans les infections chroniques de plaies (Rhoads et al., 2009).

L’innocuité de ce produit contenant 8 phages a été testée sur 39 patients, et ce, sur une

période de 12 semaines dans un centre de soins des plaies à Lubbock (Texas, États-Unis).

Les effets de l’utilisation de WPP-201 ont été suivis pendant 24 semaines. Aucun effet

secondaire n’a été noté lors de l’usage du produit. Ainsi, WPP-201 est présentement en

cours de son étude d’efficacité (Rhoads et al., 2009).

Vendu en République de la Géorgie, PhageBioDerm est un produit contenant plusieurs

phages lytiques infectant les bactéries P. aeruginosa, E. coli, S. aureus, Streptococcus sp. et

Proteus sp. Cette préparation est destinée au traitement d’infections de plaies et est

composée aussi d’un polymère biodégradable imbibé de phages et d’antibiotiques

(ciprofloxacine). PhageBioDerm a été testé pendant 90 jours sur des patients ayant des

plaies infectées et a réussi à guérir complètement 70 % de ceux-ci (96 patients)

(Markoishvili et al., 2002).

Une étude récente a montré l’efficacité d’un cocktail de phages anti-S. aureus chez des

patients atteints de rhino-sinusite chronique (Drilling et al., 2014). Le cocktail appelé CT-

SA, composé de quatre phages différents appartenant à la famille des Myoviridae, s’est

montré capable de détruire la majorité des souches cliniques de S. aureus isolées de

l’environnement hospitalier après un traitement in vitro de plus de 24 heures à 35 ºC. Une

concentration d’environ 109 UFP/ml a permis d’obtenir un meilleur rendement. De plus,

cette étude a confirmé que l’utilisation d’un cocktail de phages peut prévenir l’apparition de

souches résistantes comparée à l’action d’un phage seul (Drilling et al., 2014).

Assainissement par les phages

Une autre application des phages est leur utilisation dans l’assainissement et la

décontamination de surfaces inertes retrouvées communément dans les usines de

transformation des aliments comme les murs, le sol, les drains, le verre, l’acier inoxydable,

34

les plaques de plâtre, les équipements industriels, etc. ainsi que dans les hôpitaux comme

sur les cathéters. En effet, les phages pourraient être des substituts aux produits chimiques

employés dans les industries alimentaires comme moyen de décontamination. Bien qu’ils

soient efficaces, les désinfectants chimiques peuvent causer la corrosion des équipements,

tuer les bactéries commensales bénéfiques, avoir des effets toxiques lorsqu’en contact

direct avec l’aliment et endommager les propriétés organoleptiques de celui-ci

(Sulakvelidze, 2013). De plus, une étude faite par la BSSA (British Stainless Steel

Association) a montré que les produits à base d’hypochlorite peuvent causer des fissures

profondes dans l’acier inoxydable et faciliter l’adhésion bactérienne et la formation de

biofilms (Anonymous, 2001). Les phages sont capables de pénétrer dans les couches d’un

biofilm à travers les pores et les canaux et causer la destruction de la matrice du biofilm.

Une étude récente a montré que le phage K seul inhibe la formation de biofilms sur un

intervalle de 72 heures d’exposition alors que le mélange de phages (K et dérivés) a pu

complètement éliminer le biofilm bactérien en 48 heures sans l’apparition de résistance

bactérienne (Kelly et al., 2011).

Plusieurs études ont exposé le potentiel des phages à décontaminer les surfaces inertes

infectées par S. aureus ainsi que d’autres bactéries pathogènes dont L. monocytogenes

(Soni & Nannapaneni, 2010b), E. coli O157:H7 (Viazis et al., 2011) et Yersinia pestis

(Rashid et al., 2012). Le produit phagique P100 a été employé sur une surface d’acier

inoxydable contaminée par plusieurs sérotypes de L. monocytogenes. Indépendamment des

différentes souches de L. monocytogenes, P100 a diminué la concentration bactérienne de

3,5 à 5,4 d‘unités log10 après 24 heures de traitement à température ambiante (Soni &

Nannapaneni, 2010b). Un cocktail nommé BEC8 a été utilisé sur des surfaces d’acier

inoxydable, de céramique et de polyéthylène contaminées par E. coli O157:H7. À une

concentration de 106 UFP/ml et une MOI de 100, une élimination totale a été observée

après 10 minutes d’exposition à 37 °C et à 12 °C ainsi qu’après 1 heure d’exposition à

23 °C (proche de la température ambiante) sur les trois surfaces (Viazis et al., 2011). D’un

autre côté, après une exposition de 5 minutes à température ambiante au cocktail YPP-100

contenant 107 UFP/ml de 4 podophages et un myophage, 99,97 % des cellules de Y. pestis

ont été complètement éliminées des surfaces d’acier inoxydable, de plaques de plâtre et de

verre (Rashid et al., 2012). Enfin, Lungren et al. (2013) ont montré que le phage

35

staphylococcique K est capable de réduire la concentration de bactéries contaminant les

matériaux de cathéters veineux de 4 unités de log10, et ce, à une MOI de 1 et après 24

heures d’exposition au phage K.

Bien que notamment testés comme outils de décontamination dans la majorité des

études, ces résultats ci-haut suggèrent que les phages peuvent aussi constituer des agents de

prévention contre une éventuelle contamination des surfaces des industries alimentaires et

des hôpitaux.

Biocontrôle et bio-préservation par les phages

Les phages peuvent aussi être employés dans l’industrie alimentaire pour contrôler

l’innocuité des aliments en cours de transformation (méthode de biocontrôle) ainsi que pour

la préservation des produits finis ou d’aliments prêts-à-manger (méthode de bio-

préservation). Jusqu’à présent, aucun phage ou mélange de phages de bio-préservation n’a

été produit et reconnu comme sécuritaire pour lutter contre S. aureus dans l’industrie

alimentaire. Cependant, plusieurs produits ciblant d’autres bactéries pathogènes ont été

élaborés, approuvés par les autorités requises et commercialisés.

En 2002, l'agence de la protection environnementale des États-Unis (EPA) a autorisé

l’utilisation d’un pesticide composé de deux phages développé par Omnilytics™. Ce

produit est appliqué sur la surface des tomates et des poivrons pour éliminer les taches

causées par les pathogènes de plantes Xanthomonas campestris subsp. vesicatoria et

Pseudomonas syringae. Il peut aussi être appliqué sur le sol entourant les plantes (EPA

2007) (Goodridge & Bisha, 2011).

Dans le cas de l’inhibition de la croissance de L. monocytogenes, les additifs phagiques

Listex™ P100 et ListShield™ ont été approuvés par la FDA en 2006 et reconnus comme

étant sécuritaires (GRAS, genetically recognized as safe) pour leur pulvérisation sur la

surface de plusieurs aliments. Le produit ListShieldTM

ou aussi appelé mélange LMP-102

contient six phages lytiques et est capable de réduire la concentration de L. monocytogenes

jusqu’à 6,8 unités de log10 lorsqu’appliqué sur la surface de cantaloups et de pommes

entreposés pendant 7 jours (Leverentz et al., 2003). Listex™ est composé du phage P100 et

lorsqu’ajouté à une concentration de 108 PFU/g (MOI de 10 000), diminue le taux bactérien

de 3,5 unités de log10 après deux heures de traitement et empêche la recontamination sur

36

une panoplie d’aliments à différentes températures. Ceux-ci incluent le fromage, le poisson,

la dinde, le poulet, la laitue et le chou (Soni & Nannapaneni, 2010a).

La compagnie Intralytix, Inc. (Baltimore, MD, United States) a aussi élaboré un

cocktail de trois phages lytiques spécifiques contre E. coli O157:H7. EcoShield™ a été

approuvé par la FDA en 2011 et est efficace pour réduire cette bactérie de 2 unités de log10

sur la surface de feuilles de laitue et de viandes rouges. Ces résultats ont été obtenus suite à

la pulvérisation du produit à une MOI de 1 000 et après 5 minutes de contact. Cependant,

ce produit n’a pas empêché la recontamination de ces aliments par E. coli (Carter et al.,

2012).

En 2012, le produit AgriPhage-CMM contre le chancre bactérien Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis a été autorisé par Santé Canada à être pulvérisé sur la

surface des tomates de serre. Agriphage-CMM est composé d’un mélange de phages

lytiques spécifiques au pathogène bactérien attaquant les tomates (Anonymous, 2012).

Un dernier produit approuvé par la FDA en 2013 est nommé SalmoFresh™. Celui-ci est

constitué de six phages et est efficace pour réduire la concentration de plusieurs espèces

pathogènes de Salmonella à la surface de viandes de volailles avant leur envoi à l’étape du

hachage (Carol, 2013). De plus, bien que non approuvés par les autorités jusqu’à présent, le

phage FO1-E2 est capable d’éradiquer complètement la population de Salmonella

typhimurium lorsqu’ajouté à une concentration d’environ 108 UFP/g sur la surface

d’aliments prêts-à-manger (poissons, tranches de dinde, hot-dogs) réfrigérés et stockés à

8 ºC (Guenther et al., 2012).

D’autres études ont montré l’efficacité des phages à réduire la concentration des

pathogènes alimentaires dont Campylobacter jejuni, Cronobacter sakazakii et Shigella spp.

et à préserver l’innocuité de produits carnés, de volailles et de produits reconstitués pour

nourrissons (Sulakvelidze, 2013).

Pour ce qui est du contrôle de l’innocuité des aliments transformés, l’utilisation des

phages comme agents de biocontrôle a été testée dans les aliments contaminés par S. aureus

et plus spécifiquement dans les produits laitiers. Effectivement, des études ont analysé le

potentiel lytique des phages contre S. aureus dans du lait traité à la chaleur, du lait cru ainsi

que du lactosérum (Gill et al., 2006; O'Flaherty et al., 2005a). Les auteurs ont constaté que

l’infection du phage K, un phage polyvalent à large spectre lytique (Hagens & Offerhaus,

37

2008), est fortement inhibée dans le lait cru entier. Gill et al. (2006) ont tenté d’identifier la

cause de cette inhibition et ont déduit que le composé inhibiteur serait une protéine ou un

groupe de protéines qui s’attachent à la surface de S. aureus ou modifient cette dernière de

manière à empêcher les phages de s’y adsorber. Ils ont démontré que le phage n’a pas été

dégradé, mais que son activité a été inhibée en présence d’un composant du lactosérum cru.

Dans un même ordre d’idée, O’Flaherty et al. (2005a) ont montré que l’adsorption du

phage K est inhibée dans le lait cru comparé au lait chauffé où l’adsorption phagique est

restaurée. L’agglutination des cellules bactériennes dans le lait cru semblerait masquer la

surface des cellules la rendant inaccessible aux phages. Le composé causant cette

agrégation est thermosensible et pourrait être une agglutinine ou appartiendrait à la famille

des immunoglobulines (Korhonen et al., 2000; Loimarante et al., 1998).

Une équipe de chercheurs espagnols a isolé deux phages tempérés nommés ΦH5 et

ΦA72 à partir d’échantillons de lait cru en utilisant des souches de S. aureus isolées de la

mammite. Vu la capacité de ces phages à provoquer une conversion lysogénique et n’ayant

pas réussi à isoler des phages lytiques, les auteurs ont créé des dérivés de ces phages qu’ils

ont appelés phiIPLA88 et phiIPLA35 en traitant les lysats de phages avec du

pyrophosphate de sodium (Garcia et al., 2007). Cet agent chélateur déstabilise la capside

phagique et permet la sélection de phages ayant perdu des morceaux d’ADN. Deux des

phages formant des plages de lyse lisibles sur un tapis bactérien de S. aureus ont été choisis

au hasard et caractérisés (Garcia et al., 2007). Les phages phiIPLA88 et phiIPLA35

appartiennent à la famille des Siphoviridae (classe II, groupes 1 et 4 respectivement) et

présentent des génomes d’une taille de 45 000 paires de bases environ. Le séquençage de

leur génome respectif a permis d’observer une mutation ponctuelle dans leur module de

lysogénie expliquant leur comportement strictement lytique. Bien qu’appartenant à la

même famille de Caudovirales, ces phages font partie de groupes distincts. En effet, une

souche lysogénique contenant le prophage phiIPLA88 est résistante au phage phiIPLA88,

mais toujours sensible au phage phiIPLA35 et vice versa. De plus, la fréquence

d’apparition de mutants bactériens résistants aux phages a été réduite d’environ 2 unités de

log10 lors de l’utilisation des phages mutés en comparaison aux phages sauvages ɸH5 et

ɸA72 (Garcia et al., 2009b).

38

L’activité du mélange de siphophages phiIPLA35/phiIPLA88 a été testée dans du lait

entier chauffé à ultra haute température (UHT), du lait pasteurisé et dans le lait caillé, à des

températures de 25 °C, 30 °C et 37 °C (Garcia et al., 2007; Garcia et al., 2009b). Le

cocktail, ajouté à une MOI de 100 s’est bien adapté à l’environnement laitier et a

complètement inhibé la croissance de S. aureus après 2 heures d’incubation à 37 ºC dans du

lait UHT entier. Dans du caillé acide (contenant une souche de Lactococcus lactis subsp.

lactis), la population de S. aureus a été éradiquée après 4 heures d’incubation à 25 ºC et à

une MOI de 250 alors que dans du caillé enzymatique (contenant de la présure), ces mêmes

résultats ont été obtenus suite à l’ajout du mélange de phages à une MOI de 350 et une

incubation d’une heure à 30 ºC (Garcia et al., 2009b).

L’efficacité anti-staphylococcique de ce cocktail de phages a aussi été testée durant la

production de fromage à pâte molle et à pâte pressée. Ces fromages ont été contaminés par

106 UFC/g d’une souche de S. aureus et contrôlés par une MOI de 1 du cocktail de phages.

Après 6 heures de coagulation du lait, la concentration bactérienne a chuté en-dessous de la

limite de détection de 10 UFC/g dans le fromage à pâte molle. Pour ce qui est du fromage à

pâte pressée, dont l’exemple du fromage de type Cheddar, le cocktail de phages a permis la

réduction de la concentration de S. aureus de 2 unités de log10 à l’étape de l’obtention du

caillé non affiné. Cependant, la population staphylococcique n’a pas été complètement

éradiquée dans ce fromage puisqu’il contenait toujours une concentration de 1,24 unités de

log10 UFC/g après 30 jours d’affinage à 11 ºC (Figure 1.7) (Bueno et al., 2012).

39

Figure 1.7. Effet d’un cocktail de phages (phiIPLA35 et phiIPLA88) sur la croissance

de S. aureus Sa9 dans un fromage à pâte pressée durant l’affinage. (A) Fromage

contrôle (sans ajout de cocktail de phages) et (B) fromage test (ajout de cocktail de phages).

Symboles : (♦ ferment lactique); (■ S. aureus Sa9); (Δ pH); (× phages). Les résultats

reportés constituent les moyennes et écarts-type de trois essais indépendants. One-way

ANOVA a été utilisé pour chaque temps d’échantillonnage pour comparer les comptes de

S. aureus Sa9 dans les fromages contrôle et test. Figure adaptée et traduite de Bueno et al.,

(2012).

Suite à l’application de calculs statistiques, les auteurs suggèrent que l’ajout d’une

concentration phagique minimale de 108 UFP/ml est nécessaire pour l’inactivation de

S. aureus dans le lait, indépendamment du taux de contamination bactérien initial et de la

température employée. À cette concentration, l’interaction phage-hôte est davantage

favorisée et pourrait résulter en une meilleure efficacité du cocktail (Obeso et al., 2010).

Ces résultats néanmoins confirment l’utilisation potentielle des phages comme des

agents de biocontrôle dans cette matrice alimentaire. Cependant, il est possible de

40

perfectionner leur efficacité à éradiquer la population de S. aureus en milieu laitier. La

possibilité de développement de souches naturellement résistantes aux phages et la

fréquence de leur émergence font partie des inconvénients reliés à l’utilisation des phages.

Une opinion scientifique publiée par la EFSA signale qu’il n’est pas encore démontré si les

bactériophages peuvent protéger l’aliment contre une « recontamination » par des mutants

bactériens (EFSA, 2012). Ces mutants seraient une résultante d’une pression sélective et

d’un changement naturel au sein de la population bactérienne causés par l’utilisation

continue d’une même préparation phagique (Woolston et al., 2013). Bien que souvent

moins virulentes que les cellules sauvages et moins fréquentes lors de l’emploi d’un

cocktail de phages, ces cellules résistantes constituent un problème qui freine l’approbation,

la commercialisation et l’utilisation des produits de phages.

Une solution à ce problème serait d’utiliser une “rotation” continue de phages dans

l’industrie. Ceci implique l’isolement et la caractérisation complète de plusieurs phages

différents, strictement lytiques et spécifiques au pathogène ciblé. L’utilisation de phages

isolés du milieu à l’étude peut aussi être avantageux lors de la sélection d'un cocktail de

phages et permettre l'isolement de phages naturellement adaptés à ce milieu. Le

renouvellement des phages ou aussi la rotation de la préparation phagique permettrait de

surmonter et de réduire la probabilité d’émergence de bactéries résistantes tout en gardant

une efficacité phagique continue (Woolston et al., 2013).

Problématique, hypothèses et objectifs du projet

S. aureus constitue l’une des bactéries pathogènes affectant la santé publique. Elle peut

causer des infections cliniques allant d’une simple infection cutanée jusqu’à, dans des cas

très rares, une septicémie létale. Dans un contexte alimentaire, certaines souches de S.

aureus peuvent sécréter des entérotoxines dans le milieu suite à l’atteinte d’une

concentration de plus de 105 unités formatrices de bactéries par millilitre de milieu. Ces

protéines toxiques, à la base des intoxications alimentaires, sont résistantes aux

températures élevées et aux enzymes protéolytiques, critères qui ne s’appliquent pas aux

souches de S. aureus.

Dans ce projet, on propose l’utilisation des phages comme outils de biocontrôle

efficaces contre S. aureus. Trois hypothèses sont exposées dans chacun des trois chapitres

suivants. En un premier lieu, travaillant dans un milieu laitier, nous émettons l’hypothèse

que l’utilisation de phages isolés du lait serait plus efficace à réduire la croissance des

souches de S. aureus isolées de ce même milieu. Deuxièmement, la propagation des phages

sur une souche non pathogène serait plus appropriée pour diminuer les risques de transfert

de gènes de virulence. Enfin, l’utilisation de cocktails de phages respectant des critères de

sélection spécifiques serait efficace à diminuer la concentration de S. aureus dans la

transformation laitière ainsi qu’à prévenir la production et la sécrétion d’entérotoxines

staphylococciques dans le milieu. Ce chapitre présente aussi une technique de conservation

des phages, la microencapsulation. Cette technique pourrait être prometteuse pour répondre

à la problématique de la mise en marché des phages.

Le chapitre 2 résume l’isolement et la caractérisation de phages isolés du lait cru afin de

les ajouter aux cocktails de phages. Le deuxième objectif, exposé dans le chapitre 3 était de

vérifier l’identité des phages amplifiés sur S. aureus et sur une souche staphylococcique

non pathogène, Staphylococcus xylosus. Cette approche permettrait aussi d’assurer la

sécurité des phages employés dans le cocktail de phages. Enfin, le quatrième chapitre

développe des critères de sélection des phages utilisés pour l’élaboration de deux cocktails

de phages. L’efficacité et la sécurité de ces cocktails ont été testées et confirmées lors de

mini-productions en laboratoire de fromage de type Cheddar.

41

43

Chapitre 2. Characterization of a novel Panton-Valentine

leukocidin-encoding staphylococcal phage and its natural PVL-

lacking variant

Résumé

Un nouveau siphophage (LH1) a été isolé à partir du lait cru en utilisant la souche

Staphylococcus aureus ST352. Son génome (46 048 pb, 57 ORFs) comprend deux gènes

codant pour la toxine Panton-Valentine Leucocidine (PVL), un facteur de virulence

généralement hébergé par des prophages de S. aureus. Neuf protéines structurales ont été

identifiées, y compris une protéine de la queue générée par un changement de cadre de

lecture +1. Un phage lytique mutant a été isolé et son analyse a révélé la délétion des gènes

codant pour la PVL et une intégrase. La délétion s'est naturellement et probablement

produite par recombinaison entre des répétitions directes.

Avant-propos

Contribution des auteurs

J’ai réalisé les expériences et rédigé l’article au complet. Denise Tremblay a procuré les

photos en microscopie électronique. Le professeur Sylvain Moineau a co-rédigé le

manuscrit en plus d’avoir supervisé le projet.

Publication

Lynn El Haddad and Sylvain Moineau. 2013. Characterization of a novel Panton-Valentine

leukocidin-encoding staphylococcal phage and its natural PVL-lacking variant. Appl.

Environ. Microbiol. 79(8):2828-2832.

44

Abstract

A new siphophage (LH1) was isolated from raw milk using a Staphylococcus aureus

ST352 host. Its genome (46,048 bp, 57 open reading frames) includes the two genes

encoding Panton-Valentine leukocidin (PVL), a virulence factor usually harbored by S.

aureus prophages. Nine structural proteins were identified, including a tail protein

generated through a +1 frameshift. A phage lytic mutant was isolated, and its analysis

revealed the deletion of genes coding for the PVL and an integrase. The deletion likely

occurred through recombination between direct repeats.

Short-form paper

Staphylococcus aureus is a bacterial pathogen that can infect humans, animals, and

plants and may contaminate foods. Some strains harbor several pathogenic and virulent

components, including exotoxins, such as enterotoxins (SE), exfoliatins, toxic shock

syndrome toxin (TSST), hemolysins, and Panton-Valentine leukocidin (PVL) (Cao et al.,

2012; Dale, 2007). The genes coding for this toxin are located on prophages (Kaneko et al.,

1997). The PVL toxin belongs to the synergohymenotropic toxin family and is composed

of two subunits, named LukF-PV and LukS-PV (Lina et al., 1999; Panton & Valentine,

1932; Supersac et al., 1993). These secretory proteins act together by forming pores in cell

membranes and lysing neutrophils and macrophages, thus leading to pneumonia and

eventual cell death (Finck-Barbancon et al., 1993; Lipinska et al., 2011).

Since the discovery of the PVL toxin by Panton and Valentine in 1932 (Panton &

Valentine, 1932), at least eight PVL-encoding phages belonging to the Siphoviridae family

have been characterized (Kaneko et al., 1997; Ma et al., 2008; Narita et al., 2001; Zhang et

al., 2011). They can be classified into three different groups according to the

replication/transcription region and morphogenesis module as well as their host range

(Kaneko et al., 1998; Ma et al., 2008; Zhang et al., 2011). Members of groups 1 and 3 have

isometric capsids, and members of group 2 have elongated capsids. The presence of the

same toxin genes in morphologically distinct phages suggests that they can be readily

exchanged, possibly during co-infection.

45

Unlike temperate phages, virulent phages can be used as biocontrol agents against

pathogenic strains in medical and food applications. The presence of an integrase gene and

toxin genes in phage genomes leads to poor antibacterial efficacy and safety concerns,

respectively. Consequently, only virulent phages (or temperate phages replicating on

indicator strains) lacking any virulence factor have been used as biocontrol agents against

S. aureus in foods (Garcia et al., 2009b; Garcia et al., 2010; Gill J.J., 2006; O'Flaherty et

al., 2005a) and in animal models (Capparelli et al., 2007; Matsuzaki et al., 2003; Pantucek

et al., 1998). In an effort to isolate new virulent phages to control Staphylococcus

contaminations in dairy products, we analyzed raw milk samples for the presence of

staphylococcal phages.

One raw milk sample was obtained from each of six dairy farms. One hundred

microliters of an overnight culture of S. aureus 01 (ST352) grown in tryptic soy broth

(TSB) at 37°C was added to 5 ml of 2×TSB and 5 ml of the milk sample. The culture was

incubated overnight at 37°C. Five milliliters of the first amplification was added to 5 ml of

2×TSB, as well as 100 µl of the overnight bacterial culture, and incubated overnight at

37°C. The latter step was repeated once. Then the presence of phages was tested by

depositing 5 µl of the last amplification on a tryptic soy agar (TSA) plate containing S.

aureus 01. Phages infecting S. aureus 01 were isolated from only one sample out of the six

analyzed. Several clear phage plaques were picked, purified, and characterized. The same

restriction profile was obtained for all the isolates and one was randomly selected and

named phage LH1. The isolation of LH1 confirms raw milk as a source of staphylococcal

phages. The S. aureus strain used as the host was previously isolated from a raw milk

cheese.

While clear phage plaques were observed on TSA plates, LH1 did not produce a clear

lysate in TSB. However, while conditions for amplification of this phage in broth were

being tested, a clear lysate was spontaneously obtained following incubation of infected

cells at 37°C for 8 h, overnight storage of the infected cells at 4°C, and re-incubation of the

mixture at 37°C. Analysis of several plaques from this clear lysate led to the isolation of a

phage variant with a different restriction profile. This phage was named LH1-MUT.

46

Phage LH1 has an elongated capsid with a length of 96 ± 19nm and a width of 45 ± 2

nm. It also has a noncontractile tail 323 ± 11 nm in length, with a width of 11 ± 1 nm (see

Fig. S2.1 in the supplemental material). Similar measurements were obtained for LH1-

MUT, suggesting that the mutation(s) did not occur in the morphogenesis genes. These two

phages belong to group B2 of the Siphoviridae family (Ackermann, 2009).

The infection cycles of both phages LH1 and LH1-MUT were evaluated during growth

on the host strain at 37°C in TSB as described elsewhere (Samson & Moineau, 2010). The

latent period of LH1 was estimated at 70 min and the burst size at 5 ± 1 PFU per infected

cell. The low burst size of phage LH1 may explain the difficulty in obtaining a clear lysate

during amplification in TSB. On the other hand, LH1-MUT had a slightly longer latent

period of 80 min but the burst size was 4-fold higher, with 21 ± 4 new virions per infected

cell. Other reported S. aureus phages have shorter latent periods (25 to 45 min) and larger

burst sizes (27 to 100) (Garcia et al., 2009a; Matsuzaki et al., 2003; Pantucek et al., 1998).

LH1 and LH1-MUT were further characterized by determining their host ranges on a

panel of 14 strains of S. aureus. Two of the 14 S. aureus strains were isolated from

Canadian raw cheeses, six strains were obtained from the Canadian Bovine Mastitis

Research Network, four reference strains were obtained from the Félix d’Hérelle Center

(www.phage.ulaval.ca), and the last two were MRSA strains obtained from the Public

Health Agency of Canada. Both phages infected the two raw cheese isolates as well as two

strains isolated from mastitis. Phage LH1-MUT infected three additional mastitis isolates

(total of 7/14 strains). It seems that these two phages preferably infect S. aureus strains

isolated from milk environments, with phage LH1-MUT having the wider host range.

However, compared to staphylococcal phages belonging to the two other Caudovirales

families (Myoviridae and Podoviridae), siphophages LH1 and LH1-MUT have a narrow

host range (O'Flaherty et al., 2005c; Synnott et al., 2009).

In order to determine if phages LH1 and LH1-MUT carry characteristics that are

undesirable for biocontrol purposes, we sequenced their genomes. The protocols for DNA

isolation, sequencing, and analysis are reported elsewhere (Samson & Moineau, 2010). The

linear genome of LH1 is 46,048 bp. It has a GC content of 33.2%, which is similar to that

http://www.phage.ulaval.ca/

47

of other PVL phages (Kaneko et al., 1998; Narita et al., 2001) and of its S. aureus hosts

(32.8%) (Kuroda et al., 2001). The genome possesses cohesive extremities (cos type),

consisting of 10 complementary bases (5’-CCGGAGAGGC-3’). No tRNA was found in

the genome. Using various bioinformatic tools, putative functions were attributed to 26 of

the 57 open reading frames (ORFs) (46%) identified in the genome of LH1 (see Table S2.1

in the supplemental material). Of interest was the presence of a gene likely coding for an

integrase as well as two genes coding for the subunits of the PVL toxin, LukS-PV and

LukF-PV, indicating that phage LH1 belongs to the group of PVL-encoding staphylococcal

phages. With its elongated capsid, it also belongs to group 2 of the PVL phages (Canchaya

et al., 2003; Zhang et al., 2011).

Starting from one extremity (the cos site), the linear genome of phage LH1 was divided

into five regions (Fig. 2.1A), including (i) genes for morphogenesis and structural proteins

(packaging, capsid, and tail), (ii) the lysis module, (iii) genes for virulence factors (two

subunits of the PVL toxin, LukS-PV and LukF-PV), (iv) the lysogeny module, and (v) the

replication/transcription region. This genome organization is conserved among the PVL-

encoding phages (Zhang et al., 2011). Figures S2.2 and S2.3 in the supplemental material

provide an alignment of the PVL phage genomes available on the NCBI website, showing

the five regions and a phylogenic tree of staphylococcal phages, respectively.

48

Figure 2.1. A) Genome alignments of LH1 and LH1-MUT. The genomes are divided into

five regions including the structural module, host lysis, the genes coding for LukS-PV and

LukF-PV (in LH1 genome), the lysogeny module (in LH1 genome), and the replication-

transcription region. Each arrow represents an ORF. The two ORFs that encode for LukS-

PV (left) and LukF-PV (right) are shown in dark gray. A light grey shadow shows the

deletion of the three genes LukS-PV, LukF-PV, and int in LH1-MUT genome compared to

LH1. The ORFs that encode for the structural proteins of LH1 identified by LC/MS-MS are

numbered and presented in bold. B) Proteins bands shown on a SDS-PAGE followed by

Coomassie blue staining (Protein Ladder 10-250 kDa, New England Biolabs). C)

Identification of the different structural proteins by mass spectrometry.

The structural proteome of phage LH1 was determined by separating a CsCl-purified

phage preparation on a 12% SDS-polyacrylamide gel. The 11 bands visualized using

Coomassie blue were sent for identification by liquid chromatography-tandem mass

spectrometry (LC/MS-MS) along with the complete purified phage (Fig. 2.1B). Overall, 8

structural proteins were identified, namely, those encoded by ORF3 (portal), ORF5 (major

49

capsid protein [MCP]), ORF8, ORF10 (major tail protein [MTP]), ORF11, ORF14 (tape-

measure protein), ORF16, and ORF18 (receptor-binding protein [RBP]) (Fig. 2.1B and C).

No new protein was detected when the complete phage sample was analyzed. Most of the

observed molecular masses of the phage proteins matched the theoretical values, except

those of the MCP and the MTP. The ORF5 product (MCP), with a calculated molecular

mass of 45 kDa, was associated with two protein bands with estimated molecular masses of

32 and 28 kDa (Fig. 2.1B and C). This suggested that the major capsid protein was likely

processed (Briggiler Marcó et al., 2012). The ORF10 product (MTP) was also found in two

protein bands (bands 8 and 9) with molecular masses of 26 and 22 kDa, respectively. The

shorter version corresponds to the expected size (23 kDa) of the ORF10 product, based on

bioinformatic analysis. The longer version could be explained by a +1 frameshift, which

added 19 amino acids to the protein. This extra peptide was found by LC/MS-MS analysis

of band 8 but was not found in band 9. The frameshift was likely facilitated by a “slippery

zone” with the sequence CCC AGC (Zimmer et al., 2003). Furthermore, ORF18 was

recognized as the receptor-binding protein because of its high similarity to ORF636 of

phage phiSLT, which acts as an adhesion protein for a chain of lipoteichoic acid on the cell

surface of S. aureus (Kaneko et al., 2009). Altogether, our proteomic data resembled those

of phage phiSLT (Narita et al., 2001). In fact, there is 75% identity between phiSLT and

LH1 at the genomic level.

The lysis module and the region containing the subunits LukS-PV and LukF-PV are

highly conserved among the PVL-encoding phages (Zhang et al., 2011). The lysis module

was composed of a 115-amino-acid holin, which was characterized by (i) the presence of

two hydrophobic transmembrane domains (TM), which puts it in the class II holins, (ii) a

highly charged hydrophilic C-terminal domain, and (iii) no dual-start motif. This module

also contains its associated endolysin having a catalytic domain (N terminal) and a cell-wall

binding domain (C terminal). The former contains a CHAP domain (cysteine- and

histidine-dependent amidohydrolases/peptidase) that cleaves the peptidoglycan peptide

chain between the acetyl group of the N-acetylmuramic acid and the proximal L-alanine

(EC 3.5.1.28). Based on sequence similarity, this endolysin is likely an N-acetylmuramoyl-

L-alanine amidase.

50

Figure 2.2. Part of the LH1 genome showing 1) a magnified view of both extremities of the

deleted region in LH1-MUT genome compared to LH1 genome (on the left). The alignment

was made using ClustalW2 software. The direct repeats are underlined and the palindromic

sequence forming a stem loop is boxed; 2) the nucleotide sequence of the attachment site

attP (on the right). The attachment site is numbered according to its position on LH1

genome. It is located between the lukF-PV gene (lukF-PV) and the integrase gene (int). The

five direct repeats are shown in bold characters and the core sequence of 29 nucleotides is

underlined and in bold characters.

We compared the genes for the subunits LukS-PV and LukF-PV in all the PVL-

encoding phages (see Fig. S2.2 in the supplemental material). The PVL genes are located in

the same genomic region for all the PVL phages, between the lysis module and the

attachment site (attP) within the lysogeny genes (Fig. 2.1). It is unclear at this time why

these virulence factor genes are anchored in this region, although it is likely optimal for

toxin expression.

Genome analysis of the virulent phage LH1 also led to the unexpected identification of

a lysogeny module. This region was found to contain an integrase gene, int (orf27), a

51

repressor gene, rep (orf30), and an anti-repressor gene, ant (orf32). This region is highly

homologous among PVL prophages. Downstream of the int gene was a possible phage

attachment site, attP (Fig. 2.2), which is identical to the attP of phage phiPVL (Kaneko et

al., 1998). It included five direct repeats of 5’-AGGGCNN-3’, where NN stands for AA,

AG, or GG, as well as the 29-nucleotide core attachment site. Furthermore, a 9-base

inverted repeat with a 3-base loop (ATTTAGTACtagGTACTAAAT) was found between

the integrase (orf27) and orf28. This sequence is observed in other staphylococcal

siphophages, suggesting a regulatory function (Iandolo et al., 2002).

We could not obtain any PCR products using LH1-specific primers and DNA isolated

from the bacterial host, indicating that this phage did not originate from S. aureus strain 01.

In addition, the remaining S. aureus 01 cells in the turbid broth during the amplification of

phage LH1 were not lysogenized by this phage and they were still phage sensitive (data not

shown). Nonetheless, the presence of the genes lukS-PV and lukF-PV along with int, rep,

and ant suggests that the ancestor of LH1 may have been a prophage.

Finally, the DNA replication module, along with the transcriptional regulation module,

included mostly genes coding for DNA binding proteins, a DNA polymerase gene, a gene

coding for VirE found in other staphylococcal phages (Garcia et al., 2009b; Ma et al.,

2008), a helicase gene, a transcriptional regulator (RinA type), and a gene for HNH

(histidine-asparagine-histidine) endonuclease. Altogether, the most conserved regions

among the three groups of PVL-encoding phages were the lysis module, the toxin genes,

and the integrase gene.

The genome of LH1-MUT was also sequenced for purposes of comparison with phage

LH1. It has 41,949 bp and a GC content of 33.6%. Phage LH1-MUT lost a 4,099-bp region,

while the rest of its genome was 100% identical to that of LH1. A detailed analysis of this

deleted region (from position 23,711 to 27,810 of the LH1 genome) indicated the loss of

three genes, namely, those coding for the two PVL subunits as well as the putative

integrase. The deletion site was precisely flanked by a heptanucleotide direct repeat,

TTTTACA, and only one repeat was retained in LH1-MUT. In fact, these two repeats may

even be expanded to 12 nucleotides (TTAACTTTTACA) with only one mismatch (Fig.

2.2). This suggests that the deletion may have occurred through intramolecular

52

recombination between direct repeats of homologous DNA (Pierce et al., 1991).

Interestingly, the conserved inverted repeats are located in vicinity of one of the repeats.

Many spontaneous deletions between short dispersed DNA sequence repeats are found

associated with nearby inverted repeat sequences (Bzymek & Lovett, 2001).

Nonetheless, the entire lukS-PV–lukF-PV–int sequence was removed from the LH1

genome, generating a lytic mutant phage lacking the PVL subunits and possibly incapable

of integrating into the bacterial chromosomes of some strains. This deletion somehow led

to an increased burst size and host range. Unlike the wild-type phage LH1, LH1-MUT may

be a potential candidate for use as a biocontrol agent against specific S. aureus strains. Our

study also indicates that raw milk may carry staphylococcal phages encoding virulence

factors.

Nucleotide sequence accession number. The genome sequence of phage LH1 has

been deposited in GenBank under accession number JX174275.

Acknowledgments

We thank B. D. Conway for editorial assistance, S. Labrie for milk samples, D.

Tremblay for electron microscopy, and J. Dumaresq for insightful discussion. We are

grateful to the MAPAQ, CBMRN, and NML of Canada for staphylococcal strains. L.H.

was a recipient of a scholarship from the CIDA. This work was funded by the FQRNT,

MAPAQ, AAC, and Novalait. S.M. is the holder of the Canada Research Chair in

Bacteriophages.

53

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56

Supplemental materials

Table S2.1. ORF identification, putative function, and comparison of LH1 genome

with sequences available in public databases.

ORF Start End Length

(a.a.)

pI/Mw

(kDa)

SD sequence

5’- AGGAGG - 3’

Putative function of

the deduced protein

Best hit

with

BLAST

Number of

identical

a.a./total

number of

a.a. (%)

Length

(a.a.) E-value

Accession

number

(GenBank)

1 48 353 101 7.8/11.72 AGGGGGtctttatATG Small subunit of the

terminase

3A,

ORF037 101/101 (100) 101 2e-51 YP_239934.1

2 334 2034 566 5.7/65.5 AGAAGAagGTG Large subunit of the

terminase

3A,

ORF005 562/563 (99) 563 0 YP_239935.1

3 2039 3277 411 5.8/47.7 ATGCGTtaaggagGTG Portal protein phiSLT,

gp40 411/412 (99) 412 0 NP_075502.1

4 3249 4034 261 5.0/29.6 AGAAAAtctttgaaagGTG

Protease associated

with the capsid

maturation

phiSLT,

gp41 256/257 (99) 257 1e-145 NP_075503.1

5 4001 5209 402 5.1/45.2 AAGAGAaaaaattaaacgcga

ATG Major capsid protein

phi2958P

VL, gp38 397/402 (98) 402 0 YP_002268008.1

6 5278 5556 92 5.1/10.9 AGGGGTgatgaaATG phiSLT,

gp43 92/92 (100) 92 8e-46 NP_075505.1

7 5748 5900 50 8.06/5.9 AGGACTaaccataattATG 3A,

ORF036 50/50 (100) 110 6e-21 YP_239941.1

8 5897 6298 133 9.7/15.2 AGTGGTtttatcagaaaaATG Minor structural

protein

3A,

ORF028 133/133 (100) 133 2e-71 YP_239942.1

9 6299 6694 131 5.6/15.7 AGGAGTtggccagataaATG 3A,

ORF029 131/131 (100) 131 5e-68 YP_239943.1

10 6729 7370 213 5.0/23.4 AGGAGGaaataagcaATG Major tail protein phi12,

gp37 213/213 (100) 213 3e-120 NP_803343.1

11 7462 7917 151 4.6/16.0 AGGAGAataatttATG Major tail protein phi12,

gp38 151/151 (100) 151 3e-80 NP_803344.1

12 7975 8325 116 4.6/13.6 AGGAGCtaatacaATG phiSLT,

gp49 115/116 (99) 116 1e-58 NP_075511.1

13 8367 8525 52 4.9/6.2 AGAAAAtacaacgtttctgtAT

G

phi2958P

VL, gp45 52/52 (100) 52 5e-21 YP_002268016.1

14 8539 14739 2066 9.8/22.6 AGGAGGttaatATG Tail-length tape

measure protein

47,

ORF001

2062/2066

(99) 2066 0 YP_240016.1

15 14739 15563 274 5.1/31.2 GGGAGGtttgactaattaATG phi12,

gp41 274/274 (100) 274 3e-156 NP_803347.1

16 15572 17155 527 5.7/60.9 AGGTAGgtgatttaATG Minor structural

protein

phiSLT,

gp53 526/227 (99) 527 0 NP_075515.1

17 17155 17445 96 5.2/10.5 AGGGAGtgtattaatataATG 3A,

ORF044 96/96 (100) 96 5e-48 YP_239952.1

18 17461 19371 636 5.8/73.1 AGGAAGgtgcattATG Receptor binding

protein

phiSLT,

ORF636 634/636 (99) 636 0 NP_075517.1

19 19371 20837 488 5.5/54.2 AGGGAGaattataagttaATG phiIPLA

35, gp55 480/488 (98) 488 0 YP_002332418.1

20 20837 21226 129 4,8/14,8 AGGAGTgagaaaataATG phi12,

gp46 129/129 (100) 129 3e-68 NP_803352.1

21 21219 21383 54 4.3/6.5 AGGAGAgactgaaaATG phi12,

gp47 54/54 (100) 54 2e-22 NP_803353.1

22 21417 21728 103 6.8/12.4 AATTTGaataaaGTG phiSLT,

gp58 99/99 (100) 99 1e-48 NP_075520.1

23 21819 22166 115 9.6/13.1 AAGAGTcaGTG Holin PVL,

gp23 99/100 (99) 100 1e-50 NP_058462.1

24 22177 23631 484 9.3/53.8 AGGTGTtgaccaATG Amidase 3A,

ORF007 479/484 (98) 484 0 YP_240025.1

25 24012 24959 315 9.1/35.7 AGAAAGgaaATG

Panton-Valentine

leukocidin chain S

precursor

PVL,

ORF027 312/312 (100) 312 0 NP_058465.1

26 24961 25938 325 9.1/36.9 AGGACAtaattgatATG Panton-Valentine

leukocidin subunit F

PVL,

ORF028 325/325 (100) 325 0 NP_058466.1

27 27485 26280 401 9.9/47.5 AGGAGGgatgtaaaATG Integrase 47,

ORF011 396/401 (99) 401 0 YP_240030.1

28 27868 28218 116 9.1/14.0 AGAATTcGTG phiIPLA

35, gp2 116/116 (100) 207 5e-59 YP_002332365.1

29 29561 28641 306 5.8/35.2 AAGGGGctgattataATG DNA polymerase III

subunit epsilon

47,

ORF013 306/306 (100) 306 4e-179 YP_240034.1

30 30191 29577 204 7.8/22.9 AGGAGGaaatttaaaATG Transcriptional

repressor

47,

ORF020 204/204 (100) 204 2e-112 YP_240035.1

31 30396 30590 64 8.0/8.8 ATTCTGctttagcgATG 47,

ORF060 64/64 (100) 75 4e-29 YP_240036.1

32 30616 31392 258 5.7/29.5 AGGAGGcataaacaaATG Anti-repressor protein 47,

ORF017 258/258 (100) 258 2e-149 YP_240038.1

33 31408 31626 72 4.6/8.4 AGGAGGacttaaaaATG 47,

ORF065 72/72 (100) 72 3e-33 YP_240039.1

57

Figure S2.1. Electron micrograph of S. aureus phage LH1. The bar scale indicates 50

nm.

34 32310 32525 71 8.0/8.1 AGGAGCataaacaaATG phiSLT,

gp11 71/71 (100) 71 1e-32 NP_075474.1

35 32552 32815 87 9.0/10.4 AGGAAAagatagaaATG DNA binding protein 3A,

ORF048 84/87 (96) 87 1e-42 YP_239975.1

36 33068 33391 107 6.3/12.6 AGGAGTtattaatATG phi2958P

VL, gp15 107/107(100) 107 5e-55 YP_002267985.1

37 33406 33768 120 4.8/13.8 AGGAGGagttaatcaATG tp-310-2,

gp18 116/120 (96) 120 2e-60 YP_001429913.1

38 33765 34931 388 5.5/44.3 TGGAAGcgagaattaatgcAT

G

3A,

ORF012 382/388 (98) 388 0 YP_239979.1

39 34912 35514 200 5.2/21.9 AGCAATctgctgaagATG

phi2958

PVL,

gp18

184/185 (99) 185 5e-102 YP_002267988.1

40 35582 37534 650 6.8/73.5 AGGTGTcaagaatttgagatttA

TG

DNA polymerase

domain A

47,

ORF003 640/650 (98) 653 0 YP_240050.1

41 37700 37885 61 4.4/7.4 AGGAAGtgatttaATG 29,

ORF083 57/61 (93) 61 2e-24 YP_240593.1

42 37886 38242 118 10.1/13.9 AGGTGGaataaATG 71,

ORF044 118/118 (100) 118 3e-62 YP_240440.1

43 38246 38488 80 6.5/9.6 AAGAAGtagatcATG 71,

ORF065 77/80 (96) 80 4e-38 YP_240441.1

44 38493 38756 87 4.1/9.8 TTGAGGagATG 69,

ORF060 84/84 (100) 85 2e-40 YP_239630.1

45 38725 38913 62 3.9/6.6 AAGTGGtctataaatATG tp310-2,

gp31 52/56 (92) 56 1e-22 YP_001429926.1

46 38906 39442 178 4.6/20.8 AGGTGGaacaggaaaATG

phi2958

PVL,

gp25

177/178 (99) 178 3e-99 YP_002267995.1

47 39548 39652 34 9.5/7.0 ACAGGGtaaaaatATG 69,

ORF089 32/34 (94) 57 4e-09 YP_239633.1

48 39669 39905 78 5.1/8.9 AGGAGTgatgagaaGTG phiPV83

, gp31 68/78 (87) 78 2e-22 NP_597920.1

49 39930 40166 78 4.7/9.1 AAGAGGggagataataATG phiSLT,

gp32 78/78 (100) 78 2e-38 NP_075494.1

50 40150 40311 53 4.6/6.3 TACAGGagATG

phi2958

PVL,

gp27

53/53 (100) 53 1e-22 YP_002267997.1

51 40448 40579 43 6.2/5.2 AGTAGCatttctcataagATG 3A,

ORF059 43/43 (100) 66 1e-16 YP_239993.1

52 40631 43078 815 5.2/94.4 AGGAGCcgaacATG Virulence associated

protein E

47,

ORF002 800/815 (98) 815 0 YP_240066.1

53 43419 43709 96 9.5/11.3 AGGTGAatatATG phiIPLA

35, gp33 94/96 (97) 96 1e-49 YP_002332396.1

54 43690 44493 267 6.4/31.4 AGAATGgtagGTG Protein SNF2,

Helicase

3A,

ORF009 262/265 (98) 455 7e-154 YP_239997.1

55 44946 45056 36 9.6/4.3 ACGACTattattcatcacatcAT

G

Protein SNF2,

Helicase

phi2958

PVL,

gp31

36/36 (100) 423 4e-12 YP_002268001.1

56 45069 45506 145 9.4/17.0 TGGAGGtataagATG Transcriptional

regulator RinA

3A,

ORF025 145/145 (100) 145 4e-79 YP_239999.1

57 45663 45977 104 8.9/12.6 AAGAGGtgtaagagATG HNH endonuclease 47,

ORF039 104/104 (100) 104 2e-53 YP_240072.1

58

Figure S2.2. Genome alignments of all PVL-carrying phages available including LH1.

Phage LH1-MUT is also represented in this figure for comparison purposes. The genomes

are divided into five regions including the structural module, host lysis, the genes coding

for LukS-PV and LukF-PV, the lysogeny module, and the replication-transcription region.

Each arrow represents an ORF. The two ORFs that encode for LukS-PV (left) and LukF-

PV (right) are shown in dark gray. The ORF coding for the major tail protein is presented

in light grey. These ORFs share more than 90% amino acid identity unless noted otherwise.

The ORFs that encode for the structural proteins of LH1 identified by LC/MS-MS are

numbered and presented in bold. A dark grey shadow shows the deletion of the three genes

LukS-PV, LukF-PV, and int in LH1-MUT genome compared to all the other PVL-encoding

phages.

59

Figure S2.3. Comparison of staphylococcal phage complete proteome and phylogenic

tree constructed using MEGA 5 software and optimized with the iTOL software and the

neighbor-joining method. All phages available on the NCBI website are presented in this

tree. The model used was the number of differences, the tree was constructed to be

unrooted, and the parameters used to test the phylogeny were bootstraps from 1000

replicates with a random seed. The bar shows the difference between the phages in amino

acids.

61

Chapitre 3. Improving the safety of a Staphylococcus aureus

polyvalent phage by their production on a Staphylococcus

xylosus strain

Résumé

Team1 (vB_SauM_Team1) est un phage staphylococcique polyvalent appartenant à la

famille Myoviridae. Le phage Team1 a été amplifié sur une souche de Staphylococcus

aureus et une souche non pathogène de Staphylococcus xylosus utilisée dans la

fermentation industrielle de la viande. Les deux préparations du phage Team1 ont été

comparées en ce qui concerne leurs propriétés microbiologiques et génomiques. Les tailles

de la progéniture, les périodes de latence et les spectres lytiques des deux dérivés sont

identiques, tout comme leurs séquences génomiques. Le phage Team1 possède 140 903 pb

d'ADN double brin codant pour 217 cadres de lecture ouverts et 4 ARN de transfert. Une

comparaison des analyses génomiques a révélé des similitudes avec les phages de

staphylocoques ISP (97 %) et G1 (97 %). Le spectre lytique du phage Team1 a été comparé

à celui des phages staphylococciques polyvalents phi812 et K en utilisant un panel de 57

souches de S. aureus provenant de diverses sources. Ces souches bactériennes ont été

regroupées en 18 séquences types (MLST) et 14 complexes clonaux (eBURST). Au total,

les trois phages amplifiés sur S. xylosus ont pu lyser 52 des 57 souches distinctes de S.

aureus. L'identification de souches résistantes aux phages souligne l'importance d’élaborer

des cocktails de phages à spectres lytiques larges, différents et chevauchants. Notre étude

suggère que certains phages de staphylocoques peuvent être propagés sur des bactéries de

qualité alimentaire, et ce, à des fins de biocontrôle et de sécurité.

Avant-propos


Nour Ben Abdallah a élaboré la courbe de croissance du phage Team1-SMQ121. Pier-Luc

Plante a conçu la figure comparant les génomes des trois phages Team1, G1 et ISP en

utilisant le logiciel Circos. J’ai réalisé le reste des expériences. Jeannot Dumaresq et Ramaz

62

Katsarava ont fourni les phages. Steve Labrie, Jacques Corbeil et Daniel St-Gelais ont

supervisé les travaux de Nour et de Pier-Luc. J’ai rédigé l’article au complet. Le professeur

Sylvain Moineau a co-rédigé le manuscrit en plus d’avoir supervisé le projet.

Publication

Lynn El Haddad1, Nour Ben Abdallah

2, Pier-Luc Plante

3, Jeannot Dumaresq

4, Ramaz

Katsarava5, Steve Labrie

6, Jacques Corbeil

3, Daniel St-Gelais

2,6, and Sylvain Moineau

1.

2014. Improving the safety of Staphylococcus aureus polyvalent phages by their production

on a Staphylococcus xylosus strain. PLoS One, in press.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0102600.

Abstract

Team1 (vB_SauM_Team1) is a polyvalent staphylococcal phage belonging to the

Myoviridae family. Phage Team1 was propagated on a Staphylococcus aureus strain and a

non-pathogenic Staphylococcus xylosus strain used in industrial meat fermentation. The

two Team1 preparations were compared with respect to their microbiological and genomic

properties. The burst sizes, latent periods, and host ranges of the two derivatives were

identical as were their genome sequences. Phage Team1 has 140,903 bp of double stranded

DNA encoding for 217 open reading frames and 4 tRNAs. Comparative genomic analysis

revealed similarities to staphylococcal phages ISP (97%) and G1 (97%). The host range of

Team1 was compared to the well-known polyvalent staphylococcal phages phi812 and K

using a panel of 57 S. aureus strains collected from various sources. These bacterial strains

were found to represent 18 sequence types (MLST) and 14 clonal complexes (eBURST).

Altogether, the three phages propagated on S. xylosus lysed 52 out of 57 distinct strains of

S. aureus. The identification of phage-insensitive strains underlines the importance of

designing phage cocktails with broadly varying and overlapping host ranges. Taken

altogether, our study suggests that some staphylococcal phages can be propagated on food-

grade bacteria for biocontrol and safety purposes.

http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0102600

63

Introduction

Staphylococcus aureus is one of the main causes of hospital associated infections

(Lowy, 1998) and foodborne contaminations (Le Loir et al., 2003). Despite being found on

the skin and in mucous membranes of healthy carriers, S. aureus is responsible for a wide

range of diseases, including mild to severe skin infections, sepsis, endocarditis, and other

life-threatening infections. Methicillin-resistant S. aureus (MRSA) are often found in a

hospital or a community outbreak and their emergence is becoming a global concern

(Golding et al., 2008). In addition, some S. aureus strains cause food poisoning which

results from the ingestion of staphylococcal enterotoxins secreted during growth in foods

(Le Loir et al., 2003). To combat the detrimental effects of staphylococcal growth, phages

are being investigated as an alternative strategy.

However, certain staphylococcal phages encode virulence genes such as Panton-

Valentine leukocidin, exfoliative toxin, and enterotoxin genes (Deghorain & Van Melderen,

2012; El Haddad & Moineau, 2013; Endo et al., 2003; Kaneko et al., 1997; Tinsley et al.,

2006). In fact, many temperate phages are a source of lysogenic conversion as they can

integrate into the bacterial genome upon infection through the expression of lysogeny-

related genes. When phages exist in a prophage state, an induction phenomenon can

reactivate and excise their genome from the bacterial chromosome, to initiate a lytic cycle.

Temperate phages can ultimately play a role in the horizontal transfer of virulence factors

from a donor host to a recipient cell (Fortier & Sekulovic, 2013). Therefore, it is more

suitable to use only virulent phages in a biocontrol application in order to ensure the

absence of genes coding for unwanted traits.

To avoid the transfer of virulence genes, the use of a non-pathogenic bacterial strain or

a “surrogate” to propagate these phages is preferable, as long as it does not induce changes

in the characteristics of the phage. For example, the anti-Listeria monocytogenes phages are

propagated on strains of non-pathogenic Listeria innocua (EFSA, 2012; Carlton et al.,

2005; Chibeu et al., 2013). Others showed that the propagation of polyvalent Salmonella

phage phi PVP-SE1 on a non-pathogenic Escherichia coli strain did not change the

microbiological properties and the DNA restriction profile of that phage. The availability of

such non-pathogenic phage-production hosts will facilitate the purification process leading

to a safer phage product (Santos et al., 2010).

64

Recently, the use of virulent staphylococcal phages as biocontrol agents has been

further investigated prompted by the increasing emergence of strains resistant to antibiotics.

Some polyvalent staphylococcal phages have been isolated and characterized in the last

decade (Capparelli et al., 2007; Cui et al., 2012; Garcia et al., 2009a; Gu et al., 2012;

Kvachadze et al., 2011; Vandersteegen et al., 2011). Of particular interest are the

staphylococcal phages belonging to the Myoviridae family (dsDNA genome, icosahedral

capsid, and contractile tail) known for their broad host range (Han et al., 2013; Hsieh et al.,

2011; O'Flaherty et al., 2005b; Pantucek et al., 1998) and their ability to infect coagulase

positive and negative staphylococci (CoPS and CoNS) of animal and human origins

(Krzywinski et al., 2009; O'Flaherty et al., 2005b).

In this study, a new polyvalent phage called Team1 (vB_SauM_Team1) belonging to

the Myoviridae family was characterized following propagation on a CoPS strain of S.

aureus and on a non-pathogenic CoNS strain of Staphylococcus xylosus. S. xylosus is a

coagulase-negative staphylococcal species that has long been used as starter culture in

Greek, Spanish, Italian and other traditional fermented sausage processes (Dordet-Frisoni et

al., 2007). S. xylosus contributes to the aroma and color stability of the final product by

minimizing rancidity and, in some cases, providing a bioprotective effect against microbial

contamination (Barriere et al., 2001; Benito et al., 2008). We also compared the

microbiological and genomic properties of phage Team1 with those of two well-known

polyvalent staphylococcal phages K and 812. In parallel, we genotyped a wide range of S.

aureus strains isolated from different sources and verified the polyvalent nature of the three

phages.

Materials and Methods

Bacterial strains and media

The CoPS strain S. aureus SA812 and CoNS strain S. xylosus SMQ-121 were used to

propagate the phages (Table 3.1). S. xylosus SMQ-121 is a commercially available meat

starter. The strains were obtained from the Félix d’Hérelle Reference Center for Bacterial

Viruses (www.phage.ulaval/ca/). We established the host ranges of the phages using fifty-

http://www.phage.ulaval/ca/

65

six additional S. aureus strains isolated from different sources. Tryptic Soy Broth (TSB)

was used for culture of all staphylococcal cells.

Bacterial strain identification and genotyping

The staphylococcal species of all strains was first confirmed through 16S analysis and

the API Staph kit (BioMérieuxTM

). We amplified the 16S ribosomal RNA gene by

extracting the bacterial genomic DNA (Enright et al., 2000) and performing a Polymerase

Chain Reaction using universal primers 27 forward and 1492 reverse, carried out with a

PTC-200 machine (MJ Research, Peltier thermal cycler) as follows: 1 hold at 94°C for 3

min then 35 cycles of 94°C for 1 min, 58°C for 1 min, and 73°C for 1 min 45 s. A final

elongation step at 73°C for 5 min was performed after the final cycle. The PCR products

were sequenced at the genomic platform of the Centre Hospitalier de l'Université Laval

using an ABI Prism 3100 apparatus (Applied Biosystems, Foster City, CA). DNA

sequences were compared with sequences available in the GenBank database from the

National Center of Biotechnology Information (NCBI) using BLAST analysis

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) as well as the Ribosomal Database Project

(Maidak et al., 1996). Furthermore, we genotyped all S. aureus strains using the MLST

method (Enright et al., 2000).

This method targets the sequencing of seven housekeeping genes of ~450 bp. The PCR

reactions consisted of: 5-min denaturation at 95°C, followed by 30 cycles of annealing at

55°C for 1 min, extension at 72°C for 1 min, and denaturation at 95°C for 1 min, followed

by a final extension step at 72°C for 5 min and sequencing of the PCR products. Each gene

sequence obtained was given an appropriate allele number. The combination of the 7 alleles

defined the allelic profile, which corresponded to its Sequence Type (ST). This was

identified using the MLST database website (Enright et al., 2000). Moreover, the different

STs acquired were clustered into clonal complexes (CC) using the eBURST algorithm. This

algorithm is programmed to assemble the STs that have 6 or 7 alleles in common under the

same CC (Feil et al., 2004).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

66

Table 3.1. Genotyping of the 57 S. aureus strains used in this study.

Phage preparations

Phage Team1 was isolated as a virulent phage in the Republic of Georgia following a

hospital staphylococcal infection (Jikia et al., 2005; Markoishvili et al., 2002). Phage

Team1 was propagated for four passages in TSB medium at 37ºC on its host strain S.

aureus SA812 (i.e., Team1-SA812) as well as on S. xylosus SMQ-121 (i.e., Team1-

SMQ121). Two well-known polyvalent staphylococci phages, phi812 (Pantucek et al.,

1998) and K (O'Flaherty et al., 2005b) were also propagated on both of these strains. The

phage preparations were named 812-SA812, 812-SMQ121, K-SA812, and K-SMQ121 for

phages phi812 and K, respectively. To propagate the phages, bacteria were grown at 37°C

to an optical density at 600 nm of 0.1, and then approximately 105 phages were added to the

Strains Source of isolation ST (CC) References

SA812 Unknown (Czech Republic) ST30 (CC30) Pantucek et

al., 1998

HER1101 Unknown ST707 (CC47)

This study HER1049 Unknown ST25 (CC25)

HER1225 Unknown ST9 (CC9)

A170 Infected wounds (Italy) ST45 (CC45) Capparelli

et al., 2007

SMQ1281,

SMQ1282 Raw cheese samples (MAPAQ, Canada) ST352 (CC97)

This study

SMQ1283

to SMQ1299 Mastitis infections (CBMRN, Canada) ST352 (CC97)

SMQ1300,

SMQ1301 Mastitis infections (CBMRN, Canada) ST2187 (CC97)

SMQ1302

to SMQ1319 Mastitis infections (CBMRN, Canada) ST151 (CC151)




CMRSA1 Health-care associated (HA) ST45 (CC45)

Golding et

al., 2008






CMRSA7 Community acquired (CA) ST1 (CC1)



CMRSA10 Community acquired (CA) ST8 (CC8)

67

medium. Incubation continued at 37ºC until complete bacterial lysis, and the resulting

lysate was filtered using a 0.45-μm syringe filter.

Electron microscopy

A 1.5-ml sample of phage lysate (titer of at least 109 PFU/ml) was centrifuged at

23,500 × g for 1 h at 4°C. The supernatant was removed, leaving approximately 100 μl in

the tube. The phage pellet was washed twice with 1.5 ml of ammonium acetate (0.1 M, pH

7.5). The residual volume (100 μl) was used to prepare the observation grid as follows: 10

μl of the staining solution (2% phosphotungstic acid, pH 7.0) was deposited on a Formvar

carbon-coated grid (200 mesh; Pelco International). After 30 s, 10 μl of the washed lysate

was mixed with the stain by pipetting up and down. After 90 s, the residual liquid was

removed from the grid by touching the edge with blotting paper. Phages were observed at

80 kV using a JEOL 1230 transmission electron microscope available at the Institut de

Biologie Intégrative et des Systèmes (IBIS) of the Université Laval.

Microbiological assays

The one-step growth curve assays of Team1-SA812 and Team1-SMQ121 were carried

out in triplicate as previously described (Moineau et al., 1993) with a multiplicity of

infection of 0.05 and at a temperature of 37°C. The burst size was calculated by dividing

the average phage titer after the exponential phase by the average titer before the infected

cells began to release virions (Moineau et al., 1993). Phage counts of Team1, phi812, and

K propagated on both species, expressed as EOP values, were obtained using a double-

layer plaque titration method. In brief, 5 μl of a phage preparation ((undiluted lysate and

serially diluted (10-1

to 10-8

)) were spotted on TSB soft agar containing 100 to 200 μl of a

staphylococcal culture previously grown overnight. Two biological and two technical

repetitions were done for each phage and strain. The EOP values were calculated by

dividing the titer of the phage on the tested strain by the phage titer on its host strain. In

total, 58 strains (57 S. aureus and 1 S. xylosus) were tested against the three phages and

their derivatives.

68

Phage DNA preparation and sequencing

Phage Team1-SA812, Team1-SMQ121, 812-SA812, 812-SMQ121, K-SA812, and K-

SMQ121 genomic DNAs were isolated using a Lambda Maxi kit (Qiagen) with

modifications reported elsewhere (Deveau et al., 2002). The EcoRV (Roche Diagnostics)

restriction profile of the six phages were compared to confirm differences between phages

Team1, phi812, and K, as well as identities with their respective derivatives amplified on

the other strain. The DNA fragments were separated in a 0.8% agarose gel, stained with

EZVision (Amresco), and photographed under UV illumination. The sequencing was

performed using pyrosequencing technology on a 454 FLX instrument available at the

Plateforme d'analyses génomiques of the IBIS. Reads were assembled into a single contig

with 32-fold coverage for Team1-SMQ121 and 86-fold coverage for Team1-SA812. For

phages phi812-SA812 and phi812-SMQ121, reads were assembled into a single contig with

32-fold and 71-fold coverage, respectively. Finally, for phages K-SA812 and K-SMQ121,

the coverage was 72-fold and 62-fold coverage, respectively.

Bioinformatic analysis

The genomes were analyzed using Staden (Bonfield et al., 1995) and BioEdit 7.0.9.0

(Hall, 1999). Open reading frames (ORF) were identified using the ORFinder tool (Rombel

et al., 2002) and GeneMarkS (Besemer et al., 2001). Each ORF begins with a starting

codon (AUG, UUG or GUG) and most are preceded by a Shine-Dalgarno sequence specific

to staphylococci and optimally placed approximately 10 nucleotides upstream of the start

codon (Kwan et al., 2005). The putative function of each protein was deduced by homology

searches using blast2GO (Conesa et al., 2005). The theoretical isoelectric point (pI) and the

molecular mass (MM) of each deduced phage protein was obtained using Compute pI/Mw

available on the ExPASy Web page (http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html). Finally,

tRNAs were identified using the tRNAscan-SE server (Lowe & Eddy, 1997) and the

ARAGORN program (Laslett & Canback, 2004). The genome of phage Team1 was

compared with the database on NCBI using BLAST. The two phages sharing the highest

nucleotide similarity with phage Team1 were selected. The genomes of these three phages

were compared at the DNA level and results were presented in circular alignments using

Circos software (Krzywinski et al., 2009). Codon usage was determined using the codon

http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html

69

usage tool accessible through the DNA 2.0 Web server (DNA 2.0, Menlo Park, CA) and the

Countcodon program available on the Kazusa DNA Research Institute Web page

(http://www.kazusa.or.jp/codon/). The percentages of synonymous codon usage were

calculated for each amino acid. The bacterial codon usage of S. aureus JH1 was obtained

from the Kazusa DNA Research Institute database for comparison purposes.

Nucleotide sequence accession number.

The genome sequence of S. xylosus Team1-SMQ121 phage was deposited in GenBank

under accession number KC012913.

Results and Discussion

Growth curves comparison of phages Team1-SA812 and Team1-SMQ121

Team1 has an icosahedral capsid with a diameter of 90.4 ± 4.1 nm and a long

contractile sheath 227.2 ± 7.6 nm in length and 21.6 ± 1.5 nm in width, a morphology

resembling other staphylococcal Myoviridae (Hsieh et al., 2011; Pantucek et al., 1998)

(Fig. 3.1). Before propagating Team1 on S. xylosus, the species identity was confirmed

using 16S rRNA analysis and API-Staph kit detection. Strain SMQ121 had 99% identity

with S. xylosus strains through 16S rRNA analysis and 96.7% identity using the API-Staph

kit, confirming that this strain belongs to the S. xylosus species.

Figure 3.1. Electron micrograph of phage Team1. The bar scale indicates 50 nm.

The impact of propagating phage Team1 on both S. aureus and S. xylosus species was

determined by comparing their respective growth curves (Fig. 3.2). The burst size of

Team1 was similar on both hosts, with 31 ± 7 PFU per infected S. aureus SA812 cell and

37.5 ± 3 pfu per infected S. xylosus SMQ-121 cell after approximately 35 minutes. The

http://www.kazusa.or.jp/codon/

70

latency periods (defined as the time interval between the absorption and the beginning of

the first burst) were also identical at approximately 20 minutes when grown at 37ºC.

Figure 3.2. One-step growth curves of both Team1-SA812 (▲) and Team1-SMQ121

(×). Error bars indicate the standard deviation for three trials. The first phage count (time

zero) occurred approximately 10 min after adding the phage to the cells (Moineau et al.,

1993).

These values are similar to other Myoviridae staphylococcal phages such as the

myophage phi812 that has a longer latent phase and a lower burst size (Pantucek et al.,

1998) and the newly isolated phages SAH-1 and Stau2 that have shorter latent periods, in

the order of 20 minutes, and larger burst sizes of 100 pfu per infected cell (Han et al., 2013;

Hsieh et al., 2011).

Genome analyses

Phages Team1-SA812 and Team1-SMQ121 DNA were extracted, sequenced, and

compared. The complete genome of Team1 is a 140,493 bp, linear double-stranded DNA.

In addition, the Team1 genome has a GC content of 30.3%, which is lower than the

estimated GC contents of S. aureus and S. xylosus, which have GC contents of 32.8% and

34.2%, respectively (Dlawer & Hiramatsu, 2004; Dordet-Frisoni et al., 2007; Kloos &

Schleifer, 1975). However, this GC content is similar to other staphylococcal Myoviridae

phages (Lobocka et al., 2012). The ends of the phage Team1 genome contain 8,053 bp of

long direct terminal repeats (LTRs) separated from the non-redundant part of the virion

DNA by 12 bp inverted repeat sequences 5’-TAAGTACCTGGG- 3’ and 5’-

CCCAGGTACTTA-3’, which are characteristic features of Twort-like viruses (Lobocka et

7,5

8

8,5

9

9,5

10

10,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Ph

ag

e c

on

ce

ntr

ati

on

(P

FU

/ml)

Time (min)

T1-SMQ121

T1-SA812

71

al., 2012). Homologous recombination between the LTRs permits circularization of

infecting phage DNA. Phage Team1 encodes 217 predicted ORFs, 44 of which have a

putative function (20%) (Supp. Table S3.1). As with most phages, the Team1 genome can

be divided into several modules, including two DNA replication modules and two lysis

modules separated by DNA packaging and morphogenesis modules. This modular

organization is common among phages belonging to the Myoviridae family (Deghorain &

Van Melderen, 2012). The Team1 genome also encodes four tRNAs. The tRNAMet

(ATG)

is located between ORF33 and ORF34, whereas the three others (tRNATrp

- TGG, tRNAPhe

- TTC and tRNAAsp

- GAC) are located between ORF76 and ORF77 in proximity to a lysis

module. No known virulence factors were found in the phage Team1 genome establishing

its safety. Moreover, no lysogenic module or known integrase-related genes were found in

its genome, confirming its strictly virulent nature. Finally, comparative analysis of

restriction profiles using the enzyme EcoRV and genome sequences indicated 100%

identity between phages Team1-SA812 and Team1-SMQ121, showing that propagating

this phage on two distinct staphylococcal species did not lead to genomic changes.

Comparative genomics

The genome of phage Team1 was found to be 97% identical to the published genomes

of staphylococcal phages ISP (Vandersteegen et al., 2011) as well as G1 (Kwan et al.,

2005). In fact, most staphylococcal myophages, except phage Twort, share identity at the

DNA level between each other, ranging from 88.3% to 99.9% (Lobocka et al., 2012).

When comparing phage Team1 with G1 and ISP genomes, deletions of 375 bp, 379 bp, and

96 bp were observed in the Team1 genome at positions 7,535 and 39,917 respectively (Fig.

3.3). All deletions were flanked by direct repeat sequences, suggesting that the deletions

may have occurred through intramolecular recombination between direct repeats of

homologous DNA. The second deletion corresponded to non-coding regions. However, the

375-bp deletion led to the removal of a gene coding for a putative DNA terminal protein

which may explain the shorter LTR sequence in Team1 genome as compared to that of

phages G1 and ISP (Lobocka et al., 2012). Insertions of 1,348 bp, 1,375 bp, 146 bp

(compared to phage G1), and 260 bp (compared to phage ISP) were also identified at

positions 42,626, 111,668, and 140,903 in Team1 genome (Krzywinski et al., 2009). Two

72

genes were added with these insertions, orf86 and orf155. The former is a hypothetical

gene whereas orf155 encodes a putative intron-encoded endonuclease (Vandersteegen et

al., 2013). The last insertions constituted repetitive non coding sequences.

Figure 3.3. Circular genome comparison of phages Team1, G1, and ISP. Phages

Team1, G1, and ISP genomes and GC content are represented, respectively, using the

colors purple (upper right), red (center), and green (upper left). For each phage genome,

coding regions in minus (blue) and plus (orange) strands are shown in their respective

frames. Yellow lines show the additional acquired sequences between these three genomes.

The width of the line depends on the length of the acquired sequences (Krzywinski et al.,

2009).

The three phages possess the same four tRNAs including two matching the unique

codons for methionine and tryptophan. We also investigated phage codon usage (Stothard,

2000) and compared it to S. aureus codon usage obtained from the Countcodon program.

The codon usage is highly similar between the three phages. While the four tRNAs encoded

by the phages are similar to the host tRNAs, significant differences in codon usage were

73

noted between these myophages and the S. aureus strain analyzed (Table 3.2), which likely

favors specific phage protein production (Briggiler Marcó et al., 2012).

Table 3.2. Codon usage of S. aureus JH1 and phages G1 and ISP for the amino acids

encoded by the Team1 tRNAs (in bold). Amino-

acid Codon Team1 G1 ISP S. aureus JH1

Cys TGT 74.0 67.0 66.0 80.6

TGC 26.0 33.0 34.0 19.4

Asp

GAC

28.0

28.0

27.0

22.0

Glu

GAG

34.0

32.0

31.0

16.4

Phe

TTC

30.0

32.0

34.0

27.2

Gly

GGC

7.0

8.0

9.0

15.4

Ile

ATA

46.0

41.0

41.0

22.0

ATT 39.0 43.0 42.0 60.6

Lys

AAG

38.0

37.0

36.0

19.0

Leu

TTA

40.0

37.0

38.0

59.0

CTA 19.0 18.0 17.0 9.5

Met

ATG

100.0

100.0

100.0

100.0

Pro

CCA

28.0

32.0

31.0

50.6

Gln

CAA

62.0

64.0

63.0

87.9

Arg

AGG

24.0

26.0

27.0

4.3

AGA 59.0 57.0 58.0 33.7

CGT 7.0 7.0 5.0 37.7

Thr

ACC

18.0

20.0

21.0

4.6

Trp

TGG

100.0

100.0

100.0

100.0

End

TAA

49.0

51.0

50.0

73.5

Genotyping of S. aureus strains

In the next step, we determined the host range of phages Team1-SA812 and Team1-

SMQ121. Before comparing the host ranges of these phages, we collected a panel of 57 S.

aureus from various sources such as raw cheese, mastitis infections, clinical and hospital

associated infections, and community acquired infections. We typed these hosts to assess

74

the diversity of this bacterial set of strains. The typing was done using the MLST method,

assigning each strain an ST number, and clustering them into CCs using the eBURST

algorithm (Table 3.1).

The genotypes of the strains differed according to the origin of isolation. S. aureus

strains isolated from raw cheese or from mastitis infections were found to share some

similarities in their CC groups. S. aureus is the most common cause of bovine mastitis and

often found in raw milk (Barkema et al., 2009). Mastitis is characterized by the

inflammation of mammary glands inducing bacterial infections that result in global

economic losses to the dairy industry. The studied S. aureus strains isolated from milk

could be divided into six groups according to their ST numbers (352, 151, 351, 2270, 2187,

and 126). However, when applying the eBURST algorithm and assembling STs sharing at

least 6 alleles out of 7, the S. aureus strains isolated from milk were divided into three

groups or three CCs, i.e., CC97, CC126, and, CC151. The majority of these strains belongs

to CC97 (47.5%) and CC151 (47.5%). Other studies showed that the latter CCs are

distributed worldwide and constitute the major groups causing mastitis infection outbreaks,

mainly in North and South America and Europe (Hata et al., 2010; Wolf et al., 2011).

However, CC126 is most predominant in Brazil, along with CC97 (Rabello et al., 2007).

Unlike CC97, CC151 and CC126 are exclusively confirmed in bovine isolates. It is also

hypothesized that bovine strains worldwide derived from CC97. The CC97 lineage has

existed for more than 50 years and emerged earlier than CC151 (Hata et al., 2010).

The other strains, whether MSSA (methicillin-sensitive S. aureus) or MRSA, had

different STs and CCs, demonstrating source-dependent genotypes. The MSSA strains,

HER1101, HER1049, HER1225, A170, and the host strain SA812, belong to CC707,

CC25, CC9, CC45, and CC30 respectively. Conversely, the Canadian MRSA (CMRSA),

hospital and community-acquired, have their own separate clustering and belong to

different clonal complexes, i.e., CC1, CC5, CC8, CC22, CC36, CC45, CC239. Two clonal

complexes share some similarities between the MSSA and MRSA strains studied. Strains

CMRSA1 and A170 belong to CC45. Furthermore, CC30 (S. aureus SA812) and CC36

(CMRSA4 relevant to EMRSA-16 and USA200) have only two loci of difference in their

allelic profile. Additionally, virulent MRSA strains belonging to CC1, CC5, and CC8 are

75

responsible for several outbreaks in North America (Golding et al., 2008; Montgomery et

al., 2008) and are shifting to animal hosts as well (Sakwinska et al., 2011).

Host range comparisons of phages

After typing the 57 S. aureus strains, the host ranges of phages Team1-SA812 and

Team1-SMQ121 were examined. We also tested the host ranges of the known polyvalent

staphylococcal phages phi812 and K to compare with Team1. These two phages were also

amplified on S. aureus SA812 and S. xylosus SMQ-121 and their genome sequenced to

confirm their identity. No mutation was found when amplified on both hosts, as observed

for Team1 (data not shown).

The results of the host ranges of the wild-type phages Team1, phi812, and K

propagated on both S. aureus SA812 and S. xylosus SMQ-121 are reported in Table 3.3.

Each of the three phages propagated on S. aureus SA812 infected 52 of the 57 S. aureus

tested. In fact, 56 out of the 57 strains could be infected by at least one myophage. Only

strain 1049 (ST25, CC25) was resistant to all three myophages. Of note, this strain is

sensitive to Podoviridae phages P68 and 44AHJD (data not shown). When the same phages

were propagated on S. xylosus SMQ-121, phages Team1 and phi812 infected 53 strains,

while phage K infected 51 strains. Overall, 55 out of the 57 strains could be infected by at

least one myophage propagated on S. xylosus SMQ-121. Only the phage sensitivity of

strain SMQ1321 (ST126, CC126) was affected by the propagating host, suggesting the

presence of host factors that modify the phage behavior in this unique case (Briggiler

Marcó et al., 2012).

While the general host ranges remained unchanged, the level of sensitivity as

determined by EOP values varied in only a few cases. For example, the three phages had a

reduced an EOP (<10-4

) when plated on S. aureus SMQ1292 (ST352, CC97), SMQ1321,

and SMQ1322 (ST2270, CC126). Similarly, phage K propagated on S. xylosus had reduced

EOP values (10-3

to 10-5

) when plated on SMQ1286, CMRSA1, CMRSA3 and CMRSA8

strains. The EOP of phage K propagated on S. aureus SA812 dropped also to 10-7

and 10-6

when plated on CMRSA3 and CMRSA8 strains, respectively (Table 3.3). A similar phage

K behavior was observed in another study (O'Flaherty et al., 2005b).

76

Table 3.3. Host range of phages Team1, phi812, and K propagated on S. aureus SA812 and on S. xylosus SMQ121. The results are expressed as EOP values. Bold characters indicate host strain.

S. aureus SA812 S. xylosus SMQ121

Team1 phi812 K Team1 phi812 K

Oth

er s

train

s SA812 1.0 1.0 1.0 1.0 1.6 6.7

SMQ121 0.2 1.6 1.3 1.0 1.0 1.0

1101 1.0 0.3 0.3 0.3 0.2 0.3

1049 0* 0 0 0 0 0

1225 0.9 0.1 9.4E-2 0.5 0.3 0.7

A170 1.4 3.8E-2 0 5.7 1.9E-2 0.7

Ra

w

mil

k

SMQ1281 2.5 3.2 1.4 1.0 0.3 1.2

SMQ1282 2.8 4.5 1.9 6.1 0.4 0.5

Ma

stit

is

SMQ1283 1.3 1.1 1.5 2.8 3.6 6.7

SMQ1284 2.3 1.8 2.1 1.6 4.0 10.0

SMQ1285 1.4 1.6 1.7 2.6 2.7 13.0

SMQ1286 1.4 2.7 1.8 1.6 2.7E-2 3.3E-3

SMQ1287 1.0 0.7 1.9 1.2 5.7 9.2

SMQ1288 1.3 1.3 1.6 0.7 3.7 5.0

SMQ1289 1.5 2.2 1.5 0.9 1.3 8.3

SMQ1290 1.2 2.0 1.5 1.9 3.6 11.0

SMQ1291 1.5 1.8 1.4 2.6 6.0 7.5

SMQ1292 7.7E-7 1.1E-5 6.0E-6 2.3E-4 4.8E-5 0

SMQ1293 1.9 1.6 1.7 2.8 8.4 11.0

SMQ1294 1.7 0.9 1.0 1.9 6.0 6.7

SMQ1295 1.3 1.3 0.9 2.0 0.4 1.1

SMQ1296 2.4 3.1 4.1 1.3 1.2 1.6

SMQ1297 2.5 1.3 1.0 0.9 0.9 3.8

SMQ1298 0.3 1.5 0.7 3.0 0.7 0.2

SMQ1299 0.5 2.3 1.8 1.5 0.6 1.3

SMQ1300 0. 1.7 0.8 1.5 0.3 0.9

SMQ1301 0.2 1.8 0.2 2.0 0. 0.5

SMQ1302 4.0 2.3 0.4 0.9 0.8 1.2

SMQ1303 0.5 2.0 1.4 1.7 0.5 3.3

SMQ1304 2.0 1.6 2.9 1.9 7.2 9.2

SMQ1305 1.7 1.6 1.4 2.1 8.4 7.5

SMQ1306 2.4 2.9 2.0 2.3 3.3 11.0

SMQ1307 0 0.4 0.6 0 0.5 0.7

SMQ1308 2.0 1.8 1.6 1.9 2.5 18.0

SMQ1309 2.4 3.7 5.9 1.4 2.2E+2 41.0

SMQ1310 1.6 3.1 0.4 1.4 6.1 19.0

SMQ1311 1.9 2.7 1.6 2.1 1.9 14.0

SMQ1312 2.4 2.7 1.5 3.0 4.8 10.0

SMQ1313 1.6 2.5 1.3 3.5 6.0 6.7

SMQ1314 0.8 1.6 0.9 2.8 12.0 7.5

SMQ1315 0.8 2.5 1.4 1.4 9.6 5.0

SMQ1316 1.1 2.7 1.5 1.4 13.0 11.0

SMQ1317 1.5 1.5 1.4 2.6 12.0 9.2

SMQ1318 1.5 3.8 1.9 2.4 0.7 0.4

SMQ1319 0.1 2.5 2.2 2.0 1.0 0.7

SMQ1320 2.5 8.2 4.4 2.8 0.9 1.9

SMQ1321 1.9E-5 3.6E-6 2.2E-6 0 0 0

SMQ1322 1.5E-4 4.0E-4 6.0E-5 1.4E-3 1.4E-4 0

MR

SA

MRSA1 1.6 0.1 3.8 1.4 7.5E-2 1.3E-5

MRSA2 0 1.2 0.8 0 0.2 0.4

MRSA3 1.9 2.7E-2 3.1E-7 1.6 4.5E-3 1.3E-5

MRSA4 2.2 1.1 1.0 1.4 1.1 0.5

MRSA5 1.8 0 0 0.9 0 0

MRSA6 0.9 0 0 6.9 0 0

MRSA7 6.3E-2 0.3 0.3 0.1 0.1 0.1

MRSA8 3.8 1.0 3.4E-6 0.2 0.2 1.9E-4

MRSA9 0.9 4.2 1.5 1.1 0.4 0.5

MRSA10 4.4E-2 2.0E-2 5.0E-3 1.8 8.5E-3 6.2E-2

* 0 indicates that no plaque was observed with high titer phage

preparations

77

.Taken altogether, the host ranges and EOP values were mostly similar when

comparing phages amplified on both hosts, indicating that S. xylosus SMQ-121 is a suitable

host to produce these myophages. Although the results demonstrate the polyvalent nature of

the three phages tested, at least one S. aureus strain was resistant to these polyvalent

phages, illustrating the importance of using phage cocktails to cover a wider range of

strains. It also suggests that such strain should be used to uncover novel phages.

In conclusion, a new polyvalent staphylococcal phage was characterized. We found

that phage Team1, as well as the well-known phages K and phi812, can also be propagated

on a non-pathogenic S. xylosus strain and be highly effective in killing a large panel of S.

aureus strains obtained from various sources and belonging to different genotypes. This

study proposes the use of food-grade bacteria to amplify virulent and polyvalent

staphylococcal phages in order to increase the safety of these promising biocontrol agents

for both medical and food applications.

Acknowledgments

We would like to thank the Ministère de l'Agriculture, des Pêcheries et de

l’Alimentation du Québec (MAPAQ), the Canadian Bovine Mastitis Research Network,

and the National Microbiology Laboratory of the Public Health Agency of Canada for

providing the S. aureus strains. L.H. was the recipient of a scholarship from the Canadian

International Development Agency. This work was funded by the FQRNT, MAPAQ,

Agriculture et Agroalimentaire Canada, and Novalait. J.C. holds the Canada Research

Chair in Medical Genomics. S.M. holds the Canada Research Chair in Bacteriophages.

78

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82

Supplemental material

Table S3.1. ORF identification, putative function, and comparison of Team1 genome

with sequences available in public databases.

ORF Start End Length

(a.a.)

pI/Mw

(KDa)

SD sequence

5' - AGGAGG -3'

Putative function

of the deduced

protein

Best hit

with

BLAST

Number

of

identical

a.a./total

number of

a.a.(%)

Length

(a.a.) E-value

Accession

number

(GenBank)

1 496 795 99 4.4/11.6 AGGAGAtgaaatagAT

G

G1,

ORF150

99/99

(100) 99 4.0E-64 YP_241022.1

2 811 996 61 5.7/6.8 AGGAGGataagtaatcA

TG

G1,

ORF231

61/61

(100) 61 3.0E-30 YP_241023.1

3 1103 1393 96 4.1/11.3 AGGAGAgatataATG G1,

ORF156

96/96

(100) 96 1.0E-60 YP_241024.1

4 1393 1680 95 7.6/10.9 AGGAGAtgttataATG G1,

ORF158

95/95

(100) 95 2.0E-60 YP_241025.1

5 1680 1973 97 4.3/11.5 AGGAGAgattataATG G1,

ORF154

97/97

(100) 97 3.0E-63 YP_241026.1

6 1977 2234 85 6.1/10.2 AGGAGAtgtaactaATG G1,

ORF175

85/85

(100) 85 3.0E-54 YP_241027.1

7 2312 2551 79 6.0/9.2 AGGGGGaagttaggAT

G

G1,

ORF183

79/79

(100) 79 1.0E-49 YP_241028.1

8 2562 2909 115 4.5/13.7 AGGAGGgataggATG K,

ORF118

115/115

(100) 115 2.0E-76 YP_024546.1

9 3458 3120 112 4.5/13.5 AAAAGGatttgatttaaA

TG

G1,

ORF128

112/112

(100) 112 1.0E-70 YP_241030.1

10 3769 4077 102 4.7/11.8 TGGAGAtgatttaaATG G1,

ORF145

102/102

(100) 102 1.0E-68 YP_241031.1

11 4283 4570 95 5.2/11.0 AGGATTtgattattATG GH15,

ORF003 92/95 (97) 95 5.0E-61

YP_00700212

6.1

12 4620 4811 63 9.8/7.7 AGGATAtgataatATG G1,

ORF221

63/63

(100) 63 5.0E-37 YP_241033.1

13 5615 5127 162 9.7/19.6 AGGAGGagtaaaaaaAT

G Endonuclease

G1,

ORF085

162/162

(100) 162

7.0E-

114 YP_241035.1

14 5783 5941 52 10.4/6.1 AGGGATtgaacaaaAT

G

ISP,ORF1

44

52/52

(100) 52 1.0E-26 CCA65876.1

15 6011 6142 43 10.0/5.1 AGGAAAtgataaaaAT

G

G1,

ORF297

43/43

(100) 43 5.0E-21 YP_241036.1

16 6309 6632 107 4.8/12.4 AGGAATtgattataATG ISP,

ORF146

107/107

(100) 107 3.0E-71 CCA65878.1

17 6732 6968 78 4.2/9.1 AGGAATtgatacaaATG A5W,

ORF194

78/78

(100) 78 9.0E-47 ACB89187.1

18 7048 7518 156 3.6/17.8 AGGATTtgattattATG A5W,

ORF001

156/159

(98) 159

4.0E-

104 ACB88992.1

19 7548 7673 41 4.1/4.6 AAGCGGaacaatacagA

TG

G1,

ORF166 41/89 (46) 89 5.0E-20 YP_241041.1

20 7758 7940 60 5.4/7.4 AGGAAAtgatgaacAT

G

SA5,

ORF151 60/62 (97) 62 6.0E-33 AFV80806.1

21 8506 8270 78 4.8/9.6 AGGAGAataagtaatAT

G

SA5,

ORF152

78/240

(32.5) 240 2.0E-49 AFV80807.1

22 8993 8508 161 7.7/19.1 AGGAGGattaagtATG G1,

ORF088

161/161

(100) 161

4.0E-

110 YP_241045.1

23 9413 9006 135 5.2/16.5 AGGAGGaaaaataATG G1,

ORF109

135/135

(100) 135 3.0E-93 YP_241046.1

24 9844 9413 143 4.5/17.3 AGGAGGgataaataataA

TG

G1,

ORF103

143/143

(100) 143 6.0E-95 YP_241047.1

25 10038 9847 63 9.9/7.9 AGGAGGactcacaATG G1,

ORF224

63/63

(100) 63 7.0E-36 YP_241048.1

26 10520 10035 161 9.4/18.3 AGGAGGaagaagATG Sb-1,

ORF008

161/161

(100) 161

2.0E-

109 AEJ79651.1

27 10944 10513 143 4.2/16.7 AGGAGAgttaaaATG K,

ORF002

143/143

(100) 143 2.0E-97 YP_024433.1

28 11500 10958 180 9.2/21.5 AGTAGGtaattataaaAT

G

G1,

ORF073

180/180

(100) 180

6.0E-

125 YP_241051.1

29 12000 11512 162 9.6/19.5 AGGAGAaatattATG K,

ORF004

162/162

(100) 162

1.0E-

116 YP_024435.1

30 12411 12013 132 8.8/16.1 TGGAGGttaagaaATG K,

ORF005

132/132

(100) 132 2.0E-88 YP_024436.1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/66395090?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=1&RID=07PAJCRK014

83

31 13115 12408 235 4.9/27.7 AGGAGGagattagATG G1,

ORF051

235/235

(100) 235

1.0E-

170 YP_241054.1

32 13766 13215 183 4.5/21.1 AGGAGAtttaaatgATG K,

ORF007

183/184

(99) 184

2.0E-

128 YP_024438.1

33 14102 13785 105 6.3/11.8 AGGAGAtaaaatttGTG Major tail protein G1,

ORF138

105/105

(100) 105 5.0E-67 YP_241056.1

34 15636 15088 182 4.5/22.0 GGGAGTaatatATG K,

ORF008

182/182

(100) 182

1.0E-

123 YP_024439.1

35 15858 15640 72 4.4/8.4 AGGAGAggttatgtaaA

TG

G1,

ORF201

72/72

(100) 72 3.0E-43 YP_241058.1

36 16053 15859 64 4.6/7.6 CGGAGGtctataATG G1,

ORF218

64/64

(100) 64 1.0E-37 YP_241059.1

37 16780 16043 245 6.2/28.7 AGGAGGatgttataATG K,

ORF009

245/245

(100) 245

5.0E-

174 YP_024440.1

38 16947 16843 34 4.7/4.1 AGGAGGattgctATG G1,

ORF437

34/34

(100) 34 3.0E-14 YP_241061.1

39 17198 16959 79 4.7/9.3 AGGATGagtaatATG A5W,

ORF020 79/82 (96) 82 2.0E-50 ACB89011.1

40 17589 17200 129 5.0/15.2 AGGAGAtgactaattAT

G

K,

ORF010

129/129

(100) 129 8.0E-89 YP_024441.1

41 17861 17688 57 5.1/6.8 AGGAGGaataaaccctA

TG

G1,

ORF245

57/57

(100) 57 4.0E-34 YP_241064.1

42 18384 17902 160 4.5/18.9 AGGAGGttggtatATG K,

ORF011

160/160

(100) 160

1.0E-

109 YP_024442.1

43 18976 18434 180 4.8/20.4 AGGAGAggttaagtaAT

G

K,

ORF012

180/180

(100) 180

7.0E-

123 YP_024443.1

44 19509 18976 177 4.3/20.7 AGGAGAttaaataaatAT

G

K,

ORF013

177/177

(100) 177

2.0E-

123 YP_024444.1

45 19676 19512 54 9.5/6.3 AGGAGTtagagtaactA

TG

G1,

ORF256

54/54

(100) 54 3.0E-29 YP_241068.1

46 19954 19679 91 5.0/10.9 CGGAGGtaggttgtaAT

G

G1,

ORF163

91/91

(100) 91 6.0E-53 YP_241069.1

47 20799 19954 281 9.2/31.7 AGGAGGaaaatcaATG K, 0RF014 281/281

(100) 281 0 YP_024445.1

48 21929 20811 372 4.7/42.2 AGGAGAatgataaatAT

G

G1,

ORF024

372/372

(100) 372 0 YP_241071.1

49 22409 22083 108 4.7/13.0 CGGAGAtagtactcGTG G1,

ORF134

108/108

(100) 108 7.0E-73 YP_241072.1

50 22818 22402 138 5.1/16.0 AGGAGGgtattacATG K,

ORF016

138/138

(100) 138 6.0E-95 YP_024447.1

51 23253 22951 100 4.8/11.3 AGGAGAtatagaataAT

G

DNA binding

protein

K,

ORF017

100/100

(100) 100 6.0E-64 YP_024448.1

52 23441 23253 62 4.3/7.3 AGGAAGttagaaATG G1,

ORF228

62/62

(100) 62 1.0E-34 YP_241075.1

53 23646 23485 53 4.6/6.4 AGGAGGttgcctaATG G1,

ORF259

53/53

(100) 53 3.0E-29 YP_241076.1

54 25694 23646 682 6.3/79.8 AGGAGTgattttaaATG K,

ORF018

682/682

(100) 682 0 YP_024449.1

55 26035 25772 87 5.6/10.1 AGGAGGtttataaATG 676Z,

ORF038 86/87 (99) 87 8.0E-55 AFN38278.1

56 26225 26052 57 6.6/6.7 AGAGGGtaggtaataTT

G

JD007,

ORF103

57/57

(100) 57 70E-32

YP_00711281

2.1

57 26810 26232 192 8.5/21.4 AGGGGAacaagATG K,

ORF019

192/192

(100) 192

1.0E-

129 YP_024450.1

58 27429 26803 208 4.6/23.8 AGGAGAtactatagATG K,

ORF020

208/208

(100) 208

3.0E-

150 YP_024451.1

59 28318 27422 298 5.4/35.0 AGGAGGataattaATG DNA ligase K,

ORF021

298/298

(100) 298 0 YP_024452.1

60 28542 28318 74 8.2/8.2 AGGAGGatttttttATG JD007,

ORF107

74/74

(100) 74 5.0E-40

YP_00711280

8.1

61 29351 28611 246 5.2/28.6 AGGGGAactttaaaatAT

G

K,

ORF022

246/246

(100) 246 0 YP_024453.1

62 30017 29403 204 4.0/23.0 AGGAGAaaatattATG K

,ORF023

204/204

(1000 204

6.0E-

144 YP_024454.1

63 30458 30033 141 6.7/15.8 TGGAGGattataagtAT

G Ribonuclease

K,

ORF024

141/141

(100) 141

3.00E-

94 YP_024455.1

64 30639 30448 63 5.7/7.5 TGGAGGtatttgttttATG G1,

ORF222

63/63

(100) 63

3.00E-

37 YP_241086.1

65 31303 30662 213 4.0/24.6 TGGAGGaagacgATG K,

ORF025

213/213

(100) 213

2.0E-

143 YP_024456.1

66 31523 31293 76 8.0/8.8 AGGAGAaataattATG Transcriptional

regulator

G1,

ORF187

76/76

(100) 76

1.00E-

46 YP_241088.1

67 31753 31526 75 10.0/9.2 AGGAGGataatgaATG G1,

ORF190

75/75

(100) 75

7.00E-

45 YP_241089.1

68 32555 31863 230 5.0/24.8 AGGAGTtttaaatttATG K,

ORF026

230/230

(100) 230

6.0E-

167 YP_024457.1

84

69 33377 32742 211 9.2/24.8 AGGAGGagatattATG K,

ORF027

211/211

(100) 211

2.0E-

151 YP_024458.1

70 34235 33444 263 8.9/29.3 AGGAGAaatgtaATG K,

ORF028

263/263

(100) 263 0 YP_024459.1

71 34543 34235 102 8.8/12.1 AGGAGGaattacATG K,

ORF029

102/102

(100) 102 7.0E-65 YP_024460.1

72 35285 34656 209 9.7/23.1 AGTCTGtcaatcaATG Amidase G1,

ORF060

209/209

(100) 209

5.0E-

154 YP_241094.1

73 36056 35556 166 9.3/19.2 AGGAGAtgttattATG Endonuclease K,

ORF031

166/166

(100) 166

3.0E-

116 YP_024462.1

74 37019 36216 267 9.5/29.8 AGGAGGaagttaagtaA

TG CHAP domain

G1,

ORF042

267/267

(100) 267 0.0E+00 YP_241096.1

75 37522 37019 167 4.1/18.1 AGGTCGgttttttaATG Putative holin K,

ORF033

167/167

(100) 167

7.0E-

116 YP_024463.1

76 37792 37607 61 5.0/7.1 AGGAGAgatacaaATG G1,

ORF233

61/61

(100) 61 1.0E-33 YP_241098.1

77 39557 39339 72 9.2/8.7 AGGAATtgattaattATG G1,

ORF200

72/72

(100) 72 4.0E-45 YP_241099.1

78 40244 40035 69 5.7/8.1 AGGAGAgattgtagAT

G

G1,

ORF207

69/69

(100) 69 2.0E-42 YP_241100.1

79 40589 40257 110 5.0/12.5 AGGTGAttctagTTG G1,

ORF209

110/110

(100) 110 3.0E-69 YP_241101.1

80 40928 40602 108 5.6/13.0 AGGAGGttaccactTTG Membrane protein GH15,

ORF077

108/108

(100) 108 6.0E-71

YP_00700220

0.1

81 41227 40961 88 9.4/10.1 AGGTGTttaacaATG G1,

ORF169

88/88

(100) 88 4.0E-50 YP_241102.1

82 41368 41754 128 9.1/14.8 AGGAGGttaaagtggTT

G

G1,

ORF168

128/128

(100) 128 7.0E-82 YP_241103.1

83 41732 42010 92 9.7/10.6 AGGAAGattacaATG G1,

ORF161

92/92

(100) 92 2.0E-60 YP_241104.1

84 42007 42417 136 4.4/15.6 AGGTGAaatggaTTG G1,

ORF133

136/136

(100) 136 2.0E-91 YP_241105.1

85 42432 42629 65 9.6/7.7 AGGAGAaagatataaAT

G

Small subunit of

the terminase

Twort,

ORF151 64/79 (81) 79 4.0E-38 YP_238726.1

86 42923 43894 323 9.1/38.6 AGGTGAaaacagTTG MSA6,

ORF058

323/323

(100) 323 0. AFN38731.1

87 44035 45582 515 5.8/59.7 AGGTCTtagtgaaATG Large subunit of

the terminase

K,

ORF035

515/605

(85) 605 0 YP_024465.1

88 45575 46396 273 5.1/30.6 AGAAGGaaataaacaatt

ctactttgATG

ISP,

ORF002

273/273

(100) 273 0 CCA65732.1

89 46383 46556 57 9.4/6.7 AGGTGAttataGTG JD007,

ORF129

57/57

(100) 57

9.00E-

30

YP_00711278

4.1

90 46553 47032 159 4.8/18.5 AGGAAGaaataaATG K,

ORF037

159/159

(100) 159

2.0E-

109 YP_024467.1

91 47125 48243 372 4.1/40.8 ATGAGGtaatcataaccat

aataacggttATG

K,

ORF038

370/397

(93) 397 0 YP_024468.1

92 48320 48670 116 9.3/13.1 CGGTGGtgaaaactTTG G1,

ORF120

116/166

(100) 116

1.00E-

73 YP_240898.1

93 48688 49059 123 5.7/14.5 AGACGGtgaataggTT

G

K,

ORF040

123/123

(100) 123

9.00E-

83 YP_024470.1

94 49063 50754 563 6.1/64.1 AGGTGActagtaaTTG Portal protein K,

ORF041

563/563

(100) 563 0 YP_024471.1

95 50948 51721 257 4.9/28.6 TGGAGGtgtagacacctT

TG Prohead protease

K,

ORF042

257/257

(100) 257 0 YP_024472.1

96 51740 52696 318 4.4/36.0 AGGAGAatacattctAT

G

G1,

ORF029

318/318

(100) 318 0 YP_240902.1

97 52812 54203 463 5.1/51.2 AGGTGAtaaatttatATG Major capsid

protein

K

,ORF044

463/463

(100) 463 0 YP_024474.1

98 54295 54591 98 9.4/11.3 AGGGATttaataaatAT

G

G1,

ORF151

98/98

(100) 98

1.00E-

59 YP_240904.1

99 54604 55512 302 5.1/34.2 AGGGTGaattaaATG K

,ORF045

302/302

(100) 302 0 YP_024475.1

100 55526 56404 292 5.6/33.8 AGGAGGgttagaaaAT

G Capsid protein

K

,ORF046

292/292

(100) 292 0 YP_024476.1

101 56404 57024 206 10.3/23.

8

CGGAGGtgcatttaaataA

TG

K,

ORF047

206/206

(100) 206

2.0E-

148 YP_024477.1

102 57043 57879 278 4.7/31.8 AGGAGGgttagtattaaA

TG

K

,ORF048

278/278

(100) 278 0 YP_024478.1

103 57881 58096 71 8.0/8.3 TGGAAGtaggATG G1,

ORF202

71/71

(100) 71 2.0E-45 YP_240909.1

104 58123 59886 587 4.9/64.5 AGGAGAattaaatATG Tail sheath protein K

,ORF049

586/587

(99) 587 0 YP_024479.1

105 59959 60387 142 5.4/16.0 AGGAGAgtgaatacagA

TG Structural protein

K

,ORF050

142/142

(100) 142 1.0E-99 YP_024480.1

106 60484 60624 46 10.7/5.4 AGGAGAtgtactagATG

G1,

ORF293

43/43

(100) 43 4.0E-23 YP_240912.1

85

107 60667 61125 152 9.6/18.1 AGGAGAtgggtatATG K,

ORF051

152/152

(100) 152

1.0E-

107 YP_024481.1

108 61138 61332 64 9.5/7.1 AGGAGGtattataATG G1,

ORF215

64/64

(100) 64 2.0E-34 YP_240914.1

109 61414 61725 103 5.9/12.3 AGGAGAagatataaaAT

G

K

,ORF052

103/103

(100) 103 8.0E-66 YP_024482.1

110 61928 62314 128 4.7/15.3 AGATGTtagtaaaATG K

,ORF053

128/152

(84) 152 2.0E-88 YP_024483.1

111 62358 62894 178 4.2/21.0 AGAACGattgggcggtA

TG RNA polymerase

K

,ORF054

178/178

(100) 178

1.0E-

125 YP_024484.1

112 62950 63093 47 4.0/5.3 TGGATGgtgaataatgAT

G

GH15,

ORF107

46/1352

(0.03) 1352 2.0E-21

YP_00700223

0.1

113 63132 67004 1290 9.2/137.

0 AGAACGcaATG

Tail measure

protein

G1,

ORF001

1290/1352

(95) 1352 0 YP_240918.1

114 67083 69509 808 6.3/91.2 AGGAAGtatgtgtatAT

G Tail endolysin

K,

ORF056

808/808

(100) 808 0 YP_024486.1

115 69523 70410 295 4.5/34.6 AGGAGGatagtctATG K,

ORF057

295/295

(100) 295 0 YP_024487.1

116 70410 72956 848 4.8/96.1 AAGAGGtgtatatttaAT

G

G1,

ORF004

848/848

(100) 848 0 YP_240923.1

117 73062 73853 263 7.8/29.3 AGGAGAggataaaATG K,

ORF059

263/263

(100) 263 0 YP_024489.1

118 73853 74377 174 4.5/20.0 TGGAGGtgtatctagctaA

TG

G1,

ORF078

174/174

(100) 174

3.0E-

121 YP_240925.1

119 74377 75081 234 4.6/26.6 AGGAGGctaacgtataA

TG Baseplate protein

K,

ORF061

234/234

(100) 234

5.0E-

171 YP_024491.1

120 75096 76142 348 4.7/39.2 AGGATTaaattATG Tail protein K,

ORF062 348/348 348 0 YP_024492.1

121 76163 79222 1019 5.0/116.

3

AGGTGAaacttaagtcGT

G

G1,

ORF003

1019/1019

(100) 1019 0 YP_240928.1

122 79333 79854 173 5.3/19.2 AGGAATtaaaaaatATG Structural protein K,

ORF064

173/173

(100) 173

3.0E-

122 YP_024494.1

123 79875 83333 1152 5.1/129.

1

GGGAGAtaattctaaAT

G

Adsorption

associated protein

K,

ORF065

1152/1152

(100) 1152 0 YP_024495.1

124 83382 83540 52 8.0/6.2 AGGAGAgatttatATG G1,

ORF262

52/52

(100) 52 8.0E-27 YP_240931.1

125 83541 85463 640 6.3/72.6 AGGAGAaaaatagATG G1,

ORF009

639/640

(99) 640 0 YP_240932.1

126 85486 85860 124 4.7/14.6 AGGTGGaataaaaaaact

ATG

K,

ORF067

124/124

(100) 124 10E-83 YP_024497.1

127 85867 87243 458 5.9/50.4 AGGGGTaattataaATG G1,

ORF017

458/458

(100) 458 0 YP_240934.1

128 87334 89082 582 5.6/67.2 AGGAGAttaaaATG Helicase K,

ORF069

582/582

(100) 582 0 YP_024499.1

129 89094 90707 537 8.0/63.2 AGGAGGgtaagagATG K

,ORF070

537/537

(100) 537 0 YP_024500.1

130 90700 92142 480 5.5/54.6 AAGAGGttaataactAT

G DNA helicase

K,

ORF071

480/480

(100) 480 0 YP_024501.1

131 92221 93258 345 4.7/40.1 AGGAGAgattaataATG Exonuclease K,

ORF072

345/345

(100) 345 0 YP_024502.1

132 93258 93635 125 5.2/14.9 AGGAGGttttataATG K,

ORF073

125/125

(100) 125 2.0E-85 YP_024503.1

133 93635 95554 639 5.1/73.4 AGGGGAtaagtaATG Exonuclease K,

ORF074

639/639

(100) 639 0 YP_024504.1

134 95554 96150 198 6.3/23.2 TGGAGGaaaaataATG K,

ORF075

198/198

(100) 198

5.0E-

142 YP_024505.1

135 96165 97232 355 8.5/40.9 AGGAAGgatattATG DNA primase K,

ORF076

355/355

(100) 355 0 YP_024506.1

136 97298 97636 112 4.2/13.0 AGGAGAaaaaaataAT

G

G1,

ORF127

112/112

(100) 112 1.0E-71 YP_240943.1

137 97636 98088 150 4.8/17.1 AGGAGAacaagaataAT

G

Sb-1,

ORF120

150/150

(100) 150

4.0E-

100 AEJ79755.1

138 98075 98683 202 5.5/23.6 AGTTGaagaaaaATG Resolvase G1,

ORF064

202/202

(100) 202

1.0E-

147 YP_240945.1

139 98661 99092 143 9.8/16.2 ATGAATtgattaATG A5W,

ORF109

143/143

(100) 143 4.0E-97 ACB89102.1

140 99107 101221 704 5.6/80.1 AGGATGagagatatAT

G

G1,

ORF006

702/704

(99) 704 0 YP_240947.1

141 101235 102284 349 4.7/40.5 AGGAAAtagatATG K,

ORF081

349/349

(100) 349 0 YP_024511.1

142 102302 102631 109 4.5/12.4 AGGAGAaaagatattAT

G

K,

ORF082

109/109

(100) 109 2.0E-72 YP_024512.1

143 102615 102935 106 4.8/12.1 AGGATGattcagaagAT

G

K,

ORF083

106/106

(100) 106 6.0E-69 YP_024513.1

144 103178 103738 186 6.5/22.1 AGAAGAtatatcATG K,

ORF084

186/198

(94) 198

1.0E-

131 YP_024514.1

145 103748 104053 101 5.8/11.9 AGGTGAttatATG Integration host

factor

K,

ORF085

101/101

(100) 101 4.0E-66 YP_024515.1

86

146 104129 105001 290 5.9/33.2 AGGAGAggaattaaAT

G DNA polymerase

G1,

ORF035

290/290

(100) 290 0 YP_240953.1

147 105167 105679 170 9.7/20.3 AGGTGAgacataGTG G1,

ORF081

170/170

(100) 170

3.0E-

118 YP_240954.1

148 105815 107158 447 5.3/52.8 ATTAAGttcttaATG DNA polymerase K, ORF86 445/1072

(41) 1072 0 YP_024516.1

149 107426 108133 235 9.6/27.5 AGGAGAgttatATG HNH

endonuclease

K,

ORF089

235/269

(87) 269

4.0E-

169 YP_024518.1

150 108367 109227 286 4.9/32.9 AGGGTCcgactatagcgc

cctagagATG DNA polymerase

G1,

ORF037

286/286

(100) 286 0 YP_240958.1

151 109296 109538 80 4.2/9.1 AGGAGGaaaaagaGTG G1,

ORF181

80/80

(100) 80 7.0E-50 YP_240959.1

152 109555 110037 160 5.5/18.9 AGGAGGaactgataaAT

G

G1,

ORF091

160/160

(100) 160

1.0E-

114 YP_024519.1

153 110124 111395 423 4.6/46.9 AGGAGAaaagataattA

TG

K,

ORF092

423/423

(100) 423 0 YP_024520.1

154 111455 111679 74 6.1/7.9 AGGAGGatattaaATG Recombinase K,

ORF093

71/418

(17) 418 1.0E-39 YP_024521.1

155 112024 112992 322 9.3/38.3 TGGAGAgtagtataatAT

G Endonuclease

SA11,

ORF083

282/322

(88) 322 0

YP_00700555

8.1

156 113140 114087 315 5.1/35.7 AGCAGAtaacaatcgtA

TG Recombinase

K,

ORF093

315/418

(75) 418 0 YP_024521.1

157 114091 114444 117 5.1/13.4 TGGAGAttaagcttATG G1,

ORF121

117/117

(100) 117 5.0E-79 YP_240963.1

158 114431 115093 220 5.3/26.6 AGGGGGctaatccttAT

G

K,

ORF094

220/220

(100) 220

9.0E-

156 YP_024522.1

159 115221 115853 210 4.7/23.2 TGGAGAttaagcttATG K

,ORF095

210/210

(100) 210

2.0E-

149 YP_024523.1

160 115876 116388 170 4.3/17.9 AGGATGgtaaatTTG Major tail protein G1,

ORF080

170/170

(100) 170

1.0E-

113 YP_240966.1

161 116403 116630 75 4.4/7.8 AGGAGGacaataaagaA

TG Major tail protein

G1,

ORF189

75/75

(100) 75 8.0E-45 YP_240967.1

162 116726 116986 86 5.6/10.3 AGGAGGggaaagtaAT

G

G1,

ORF174

86/86

(100) 86 1.0E-54 YP_240968.1

163 116990 117745 251 4.4/29.2 AGTAGGtgagtagggtA

TG

K,

ORF097

251/251

(100) 251

6.0E-

180 YP_024525.1

164 117738 118988 416 5.7/47.5 AGGAAGcagttATG DNA polymerase K,

ORF098

416/416

(100) 416 0 YP_024526.1

165 119002 119370 122 5.6/14.0 AGGATGgttaataaATG K,

ORF099

122/122

(100) 122 2.0E-80 YP_024527.1

166 119357 119668 103 4.6/12.0 AGGAGGataataATG K,

ORF100

103/103

(100) 103 6.0E-68 YP_024528.1

167 119732 120268 178 6.9/20.8 AGGTGActtaaaaATG G1,

ORF075

178/178

(100) 178

5.0E-

127 YP_240973.1

168 120261 121028 255 9.6/30.1 AGGAGAtaggttaaATG G1,

ORF045

255/255

(100) 255 0 YP_240974.1

169 121006 121398 130 9.6/15.1 AAGAGTaattaATG SA5,

ORF080

130/130

(100) 1630 2.0E-88 AFV80741.1

170 121451 122314 287 5.5/32.4 AGGAAAgataaataAT

G

G1,

ORF036

287/287

(100) 287 0 YP_240976.1

171 122686 123417 243 5.2/28.4 AGGAGAgctatataATG K,

ORF103

243/243

(100) 243

1.0E-

172 YP_024531.1

172 123435 123893 152 4.8/17.8 GTGAGGtatagagtaAT

G

G1,

ORF094

152/152

(100) 152

5.0E-

105 YP_240978.1

173 123958 124401 147 6.0/17.5 AGGAGCtaacaattATG K,

ORF105

147/147

(100) 147 2.0E-98 YP_024533.1

174 124418 125122 234 4.6/27.4 AAGAGGttataatATG K

,ORF106

234/234

(100) 234

5.0E-

168 YP_024534.1

175 125184 125582 132 8.9/15.4 TAGAGGtgttaattATG K,

ORF107

132/132

(100) 132 5.0E-90 YP_024535.1

176 125729 125971 80 9.3/9.4 AGGAGAgattaactATG G1,

ORF182

80/80

(100) 80 3.0E-48 YP_240982.1

177 125976 126140 54 6.2/6.3 AGGAGAtaggacaATG G1,

ORF252

54/54

(100) 54 2.0E-29 YP_240983.1

178 126127 126306 59 9.3/7.1 ATTAGAttctattatggTT

G

A5W,

ORF146

59/59

(100) 59 2.0E-33 ACB89139.1

179 126342 126518 58 4.6/7.0 AGGAGGagagatattAT

G

G1,

ORF240

58/58

(100) 58 2.0E-32 YP_240984.1

180 126924 127043 39 8.0/4.9 TGGAAAaaccaaTTG G1,

ORF076

38/177

(22) 177 2.0E-16 YP_240985.1

181 127058 127306 82 4.7/9.1 AGGTGGaaagcaATG ISP,

ORF92

82/82

(100) 82 7.0E-45 CCA65823.1

182 127318 127494 58 9.9/7.0 AGGAGAtttactATG

G1,

ORF241

58/58

(100) 58 6.0E-31 YP_240986.1

87

183 127487 127783 98 6.6/11.3 AGGAGAaaaagaaATG G1,

ORF152

98/98

(100) 98 3.0E-63 YP_240987.1

184 127831 128013 60 8.2/7.2 AAGAGGaatgattattAT

G

G1,

ORF219 59/60 (98) 60 2.0E-32 YP_240988.1

185 128026 128394 122 4.4/14.2 AGGAGGttgtatagATG G1,

ORF119

122/122

(100) 122 1.0E-81 YP_240989.1

186 128407 128754 115 4.6/13.0 AGGAGGaaatagaATG G1,

ORF124

115/115

(100) 115 2.0E-76 YP_240990.1

187 128754 129032 92 4.3/10.2 TGGAAGactggaactggg

attaATG

G1,

ORF162

92/92

(100) 92 5.0E-56 YP_240991.1

188 129102 129407 101 9.2/12.1 AGGAGAtgattactATG G1,

ORF140

101/101

(100) 101 7.0E-67 YP_240992.1

189 129422 129772 116 10.0/13.

7 AGGAGGtggaaagATG

G1,

ORF122

116/116

(100) 116 4.0E-76 YP_240993.1

190 129772 130374 200 9.7/23.4 AGGAGGaaaaataATG G1,

ORF065

200/200

(100) 200

2.0E-

144 YP_240994.1

191 130388 130567 59 9.0/7.3 AGGTGGttatataaATG G1,

ORF237

59/59

(100) 59 2.0E-34 YP_240995.1

192 130793 131194 133 4.9/15.0 AGGAGTggttgtaATG G1,

ORF107

133/133

(100) 133 2.0E-86 YP_240996.1

193 131196 131456 86 4.4/10.1 AGGAGGaaattaaaAT

G

G1,

ORF173

86/86

(100) 86 4.0E-53 YP_240997.1

194 131508 131795 95 9.2/10.5 AGGAGGaaattaatATG G1,

ORF157

95/95

(100) 95 5.0E-59 YP_240999.1

195 131806 131922 38 4.8/4.6 AGGAGGaattctATG Transcription

factor

G1,

ORF362

38/38

(100) 38 8.0E-15 YP_241000.1

196 131912 132175 87 10.1/9.9 AGGAGGaaaaacaaaag

ATG

G1,

ORF170

87/87

(100) 87 7.0E-53 YP_241001.1

197 132252 132431 59 10.1/6.4 AGGAGGttaatttATG G1,

ORF236

59/59

(100) 59 3.0E-29 YP_241002.1

198 132446 132709 87 4.8/10.3 AGGAGGaactataaAT

G

G1,

ORF171

87/87

(100) 87 1.0E-55 YP_241003.1

199 132712 133029 105 5.0/12.0 AGGAGGaaaattaattAT

G

G1,

ORF137

105/105

(100) 105 7.0E-68 YP_241004.1

200 133030 133128 32 8.2/3.6 AGGAGGaaaaataaGT

G

G1,

ORF055

32/226

(14) 226 9.0E-13 YP_241006.1

201 133396 133710 104 5.1/11.6 ATGAATattattcaATG G1,

ORF055

104/226

(46) 226 4.0E-66 YP_241006.1

202 133799 133957 52 5.8/5.7 AGGAGGtaatataATG G1,

ORF263

52/52

(100) 52 3.0E-23 YP_241007.1

203 133992 134192 66 5.1/7.6 AGGAGAggtaaatATG G1,

ORF211

66/66

(100) 66 4.0E-41 YP_241008.1

204 134193 134483 96 8.9/11.1 CGGAGGggttataaATG G1,

ORF155

96/96

(100) 155 5.0E-59 YP_241009.1

205 134575 134883 102 5.5/12.0 AGGAGAtgaacaattAT

G

K,

ORF109

102/102

(100) 102 2.0E-63 YP_024537.1

206 134880 135788 302 5.1/35.2 AGGAGCtatcaacaaaA

TG

K,

ORF110

302/302

(100) 302 0 YP_024538.1

207 135806 137275 489 5.3/56.1 AGGAGAaaaataaattA

TG

K,

ORF111

489/489

(100) 489 0 YP_024539.1

208 137354 137599 81 8.8/10.0 AGGAGTgaaagaaATG G1,

ORF178

81/81

(100) 81 2.0E-51 YP_241013.1

209 137619 138011 130 5.1/15.4 AGGAGAgaaataaaAT

G

K,

ORF113

130/130

(100) 130 2.0E-86 YP_241014.1

210 138013 138234 73 4.5/8.9 AGGAGAgaaatagcAT

G

G1,

ORF194 72/73 (99) 73 2.0E-43 YP_241015.1

211 138300 138611 103 5.1/11.6 AGGAGAtgaaaatATG G1,

ORF142

103/103

(100) 103 1.0E-65 YP_241016.1

212 138614 139123 169 9.3/20.3 AGGAGActaactATG G1,

ORF082

169/169

(100) 169

6.0E-

118 YP_241017.1

213 139125 139454 109 5.3/12.6 AGGAAGtgtttaagtaatA

TG

G1,

ORF131

109/109

(100) 109 3.0E-73 YP_241018.1

214 139460 139654 64 7.8/7.8 GGGAGTaattataATG A5W,

ORF179

64/64

(100) 64 1.0E-36 ACB89172.1

215 139678 139992 104 4.1/12.0 AGGAGGagtaaactattA

TG

G1,

ORF139

104/104

(100) 104 2.0E-66 YP_241019.1

216 139986 140174 62 4.3/7.3 AGCAGGgttagattactta

aatattaaATG

A5W,

ORF181

62/62

(100) 62 3.0E-35 ACB89174.1

217 140211 140312 33 5.1/3.7 AGGAGGaaacatATG G1,

ORF445

33/33

(100) 33 2.0E-13 YP_241021.1

89

Chapitre 4. Efficacy of two Staphylococcus aureus phage

cocktails in a small-scale laboratory-based cheese production

Résumé

Staphylococcus aureus est l'une des bactéries pathogènes les plus fréquemment

retrouvées dans les produits laitiers. Dans un but de réduire les problèmes de sécurité

alimentaire, les phages virulents sont étudiés comme agents antibactériens pour le contrôle

des pathogènes d'origine alimentaire. L’objectif de cette étude était de sélectionner un

ensemble de phages virulents et les utiliser dans un cocktail pour contrôler les

staphylocoques dans le fromage. Les phages sélectionnés, appartenant aux trois familles de

Caudovirales (Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae), étaient virulents et ne possèdent

pas de gènes encodant des facteurs de virulence dans leur génome. De plus, ils ont un large

spectre d'hôte et sont stables depuis leur production jusqu'à leur application de biocontrôle.

Leur utilisation n'a pas déclenché la surproduction de l’entérotoxine C de S. aureus. Deux

cocktails de phages anti-S. aureus, contenant chacun trois phages et un phage par famille,

ont été confirmés comme efficaces suite à l'élimination de la population de S. aureus après

14 jours de maturation fromagère à 4 ºC. L'utilisation de cocktails de phages en rotation

devrait empêcher l'émergence de souches bactériennes résistantes aux phages.

Avant-propos


Marie-Josée LeMay a participé aux résultats de l’encapsulation des phages en plus d’avoir

testé la résistance du phage Team1, conservé pendant 3 mois à 4 ºC et à -20 ºC sous forme

micro-encapsulé et libre. J’ai réalisé le reste des expériences. Claude P. Champagne et

Steve Labrie ont supervisé les travaux. J’ai rédigé l’article au complet. Le professeur

Sylvain Moineau a co-rédigé le manuscrit en plus d’avoir supervisé le projet.

90

Publication

Lynn El Haddad1, Marie-Josée LeMay

2, Claude P. Champagne

2, Steve Labrie

3, and Sylvain

Moineau1. Efficacy of two Staphylococcus aureus phage cocktails in a small-scale

laboratory-based cheese production. In preparation for submission.

Abstract

Staphylococcus aureus is one of the most prevalent pathogenic bacteria found in dairy

products. In an effort to reduce food safety concerns, virulent phages are investigated as

antibacterial agents to control foodborne pathogens. The aim of this study was to select a

set of virulent phages and use them in a cocktail to control pathogenic staphylococci in

cheese. Selected phages belonging to the three Caudovirales families (Myoviridae,

Siphoviridae, Podoviridae) were virulent and did not carry genes coding for virulence traits

in their genomes. In addition, they had a broad host range and were stable from the time of

production to biocontrol application. Their use did not trigger over-production of S. aureus

enterotoxin C. At MOIs levels between 15 and 150, two anti-S. aureus phage cocktails,

each containing three phages, one from each of the three phage families, efficiently

eradicated a 106 CFU/g S. aureus population after 14 days of cheese ripening at 4ºC. The

use of phage cocktails in rotation should prevent the emergence of phage resistant bacterial

strains. In the aim of commercial distribution of the phages to the cheese industry, assays

on phage concentration and storage stability were also carried out. Microencapsulation in

alginate gel beads enabled a 6 fold concentration of phages. Microencapsulation improved

at least 100-fold the stability of phages during storage at 4ºC, and stability was better at -20

ºC than at 4ºC.

Introduction

Bacteriophages (or phages) are the most abundant and diversified biological entities on

Earth. These bacterial viruses are found everywhere their bacterial hosts are present

(Breitbart & Rohwer, 2005; Clokie et al., 2011; Sulakvelidze, 2011). Because of their

ubiquitous nature, phages are regularly consumed when eating and drinking (Mahony et al.,

91

2011). Phages can also lyse specific bacterial strains without affecting the remaining

microflora (García et al., 2010). Accordingly, some virulent phages have been successfully

tested in different medical and food settings to prevent and control the proliferation of

bacterial pathogens (Goodridge & Bisha, 2011; Sulakvelidze, 2013). These phage-based

strategies improve the safety of processed foods, preserve ready-to-eat foods, and sanitize

medical and factory equipment as well as environments.

However, not all phages can be used as efficient biocontrol agents. Several desirable

properties are needed. First, the phage must be strictly virulent without containing a

lysogeny module and the ability to integrate into the host genome. Second, the phage

genome sequence must be known and be free of any known virulence genes. Third, the

phage should have a broad host range, thereby infecting several strains of the target

bacterial species. In addition, the efficacy of the phage should be maintained over long

periods of storage or product shelf-life (Goodridge & Bisha, 2011; Hagens & Loessner,

2010). All of these features may not necessarily be found in a single phage, and phage

cocktails (multiple phages) can be designed to compensate. Moreover, the use of virulent

phage cocktails was shown to limit the emergence of phage resistant bacterial strains

(Garcia et al., 2007; O'Flynn et al., 2004).

Some phage products have been approved and commercialized to prevent the growth of

Listeria monocytogenes (Leverentz et al., 2003; Soni & Nannapaneni, 2010), E. coli (Carter

et al., 2012), and Salmonella (Carol, 2013) in foods. Milk products have been among the

preferred foods for testing the efficacy of virulent phages as biocontrol agents, likely

because this industry is highly familiar with the destructive effect of virulent phages

(Samson & Moineau, 2013). Several phages have been tested in dairy products to reduce

the occurrence of the above foodborne pathogens (Guenther & Loessner, 2011; McLean et

al., 2013; Modi et al., 2001), as well as S. aureus (Bueno et al., 2012).

An anti-S. aureus cocktail containing two phages (phiIPLA35 and phiIPLA88) of the

Siphoviridae family (non-contractile tail and double-stranded DNA genome) was recently

found to synergically reduce the S. aureus concentration during fresh and hard-type cheese

productions (Bueno et al., 2012; Garcia et al., 2007; Garcia et al., 2009). However, they did

not completely eliminate the bacterial population in hard-type cheeses. Phage cocktails

have also been designed to target biofilms and chronic infections caused by S. aureus

92

(Markoishvili et al., 2002; Merabishvili et al., 2009; Rhoads et al., 2009; Drilling et al.,

2014).

Commercialization of phages for the cheese industry, presumably by specialized

suppliers, would require that technologies for their concentration and storage be developed.

Microencapsulation (ME) has been used for these purposes with lactic starters and

probiotic cultures (Champagne, 2006) but no study has been done on the benefits of ME for

phages of S. aureus.

In a previous study, we characterized and compared three very broad host range

staphylococcal phages belonging to the Myoviridae family (contractile tail and dsDNA

genome) and found one S. aureus strain resistant to all three polyvalent phages. This strain

was, however, sensitive to phages of the Podoviridae family (short tail and dsDNA

genome) (El Haddad et al., 2014).

Here, we tested the efficacy of two cocktails of three staphylococcal phages in reducing

S. aureus cells in cheeses. Phages were selected according to the different criteria cited

above and tested during a small-scale, laboratory-based Cheddar-like cheese production.

Moreover, their stability in various production and storage conditions was determined as

well as their safety using several means.

Materials and Methods

Bacterial strains and culture media

Fifty-seven strains of S. aureus were used to determine the host ranges of

staphylococcal phages. These 57 strains were identified, genotyped and clustered into 14

groups according to their clonal complexes, sequence type numbers, and sources of

isolation (El Haddad et al., 2014). Strains were obtained from various sources including the

Félix d’Hérelle Reference Center for Bacterial Viruses (www.phage.ulaval.ca), the

Ministère de l’Agriculture, des Pêcheries et de l’Alimentation du Québec, and the Canadian

Bovine Mastitis Research Network. Strains were grown in Tryptic Soy Broth (TSB)

medium at 37ºC. Baird-Parker medium supplemented with egg yolk-tellurite (BD™) was

used for counting. The bacterial strains were maintained as frozen stocks in TSB broth

containing 150 g/L glycerol. The presence of the five enterotoxin genes (sea, seb, sec, sed,

and see) in these S. aureus strains was tested using the PCR primers developed elsewhere

http://www.phage.ulaval.ca/

93

(Hait et al., 2012). S. aureus SMQ1320, the strain added in the cheese assays (see below)

was isolated from a mastitis infection in Ontario (Canada), while the starter culture used is

a Lactococcus lactis subsp. cremoris strain CUC-222 (Cargill, Dairyland®

) that was grown

in 120 g/L sterile skimmed milk at 21ºC for 16 hours.

Bacteriophages

All phages used in this study are stored at the Félix d’Hérelle Reference Center for

Bacterial Viruses. Eleven phages belonging to the three families of the Caudovirales order

(tailed phages) were used (Table 4.1). The genome of the phages not previously available

(El Haddad & Moineau, 2013; Vybiral et al., 2003) were sequenced using the Illumina

Technology as described elsewhere (El Haddad et al., 2014). Tryptic-Soy Agar (TSA) and

TSB soft agar (7.5 g/L agar) were used for counting phages. Phages used in cocktail during

cheesemaking assays were concentrated with polyethylene glycol (PEG) and purified using

two CsCl gradients (Sambrook & Russell, 2011). Purified phages were recovered by

ultracentrifugation using a Beckman SW41 Ti rotor at 35,000 rpm (210,053 × g) for 3 h,

followed by a second ultracentrifugation using a Beckman NVT65 rotor at 60,000 rpm

(342,317 × g) for 18 h. The phage preparations were then dialyzed against phage buffer

(0.05 M Tris-HCl [pH 7.5], 0.1 M NaCl, 8 mM MgSO4).

Table 4.1. Phages used in this study. Name Classification Origin of isolation Publication

Pyophage Myoviridae, Twort-like Wound infection This study

Team1 Myoviridae, Twort-like Wound infection El Haddad et al., 2014

Team2 Myoviridae, Twort-like Wound infection This study

Phi812 Myoviridae, Twort-like Clinical infection Pantucek et al., 1998

K Myoviridae, Twort-like Unknown O’Flahery et al., 2005

P68 Podoviridae, 44AHJD-like Unknown Vybiral et al., 2003

44AHJD Podoviridae, 44AHJD-like Unknown Vybiral et al., 2003

LH1 Siphoviridae, B2 Raw milk El Haddad & Moineau, 2013

LH1-MUT Siphoviridae, B2 Raw milk, natural mutant of

LH1

El Haddad & Moineau, 2013

Phi2 Siphoviridae, Raw milk This study

MSA

Siphoviridae, B2 Clinical infection, natural

mutant of WSA

Capparelli et al., 2007

94

Phage resistance to heat treatment

The Pyophage and Team2 phages were discarded due to redundancy whereas the toxin

PVL-encoding phage LH1 was substituted with its mutant LH1-MUT (lacking lysogenic

and virulence-related genes) (El Haddad & Moineau, 2013). Thus, eight of the 11 phages

were tested for their resistance to an extended pasteurization treatment by exposing them to

73ºC for 20 seconds in milk as follows. Ultra-filtered pasteurized milk (2% M.F.) was

heated in tubes at 73ºC. Each phage was then added at a concentration of 107 PFU per ml of

heated milk and incubated for 20 seconds at 73ºC. After treatment, milk samples were put

on ice and the phages enumerated. The titers of the nine phages were compared before and

after the treatment to quantify the phage count reduction, expressed as log10 PFU/ml. Phage

titers were obtained on TSA overlaid with TSB soft agar containing 100 μL of the S. aureus

host strain and 100 μL of the phage dilution.

Phage stability in a model Cheddar cheese curd

As a semi-solid medium with a low pH, cheese curd can limit the efficiency of phages.

Two phages from each family were tested for their resistance in a Cheddar curd model

under 39% humidity and 1.77% salt. First, a lyophilized Cheddar-like cheese curd (Lacroix

et al., 2010) was mixed with 1.77% salt and acidified water (pH 2.6 obtained with 85%

lactic acid) in order to obtain a pH of 5.2. Then, the phage being tested was added at a

concentration of 107 PFU/ml and mixed manually with the model curd for 5 minutes. Ten

grams of reconstituted curd were removed and initial (T=0) phage counts were determined.

The remaining model curd was divided into 10-gram aliquots, vacuum-packed at 95%, and

stored at 4ºC. These curds were sampled at 4, 7, 14, and 28 days. Each 10-gram curd

sample was homogenized in 90 mL of sterile 2% sodium citrate solution pre-warmed to 45

ºC, using a Stomacher Lab-Blender (Seward Stomacher 400 Circulator). Dilutions ranging

from 100 to 10

-5 were made in 0.1% phage buffer. Phage titers were obtained on TSA

overlaid with TSB soft agar containing 100 μL of S. aureus SMQ1320 and 100 μL of the

phage dilution.

95

Host range of the phages

The host range of two podophages (P68, 44AHJD) and three siphophages (LH1-MUT,

phi2, and MSA) were determined in this study. The host range of phages LH1, Team1,

phi812, and K were previously reported (El Haddad et al., 2014). Phages were propagated

on their respective host strains and tested for their polyvalent nature on different strains of

S. aureus. Strains of S. aureus were grown at 37°C to an OD600nm of 0.1 and approximately

105 phages were added to the medium. The cultures were incubated at 37ºC to complete

bacterial lysis, and the resulting lysate was filtered using a 0.45 μm syringe filter. The host

range, expressed by phage efficiency of plaquing (EOP), were determined by spotting 5 μL

of the phage lysate serially diluted (10-1

to 10-8

) in phage buffer on TSB soft agar

containing 100 to 200 μL of a staphylococcal strain. At least, two biological and two

technical repetitions were done per phage-host. The EOP values were calculated by

dividing the titer of the phage on the tested strain by the titer of the phage on its host strain.

Use of phage cocktails to control S. aureus during a small-scale Cheddar-like production

Two phage cocktails (Team1/P68/LH1-MUT and phi812/44AHJD/phi2) were

investigated separately in a small-scale laboratory-based Cheddar cheese production. For

each trial, 200 ml of whole pasteurized ultra-filtered milk was heated to 32ºC. Starter

culture (L. lactis) grown overnight was added to the milk at 1% (107 colony forming units

per mL (CFU/mL)) along with 106 of S. aureus SMQ1320. Milk was supplemented with

CaCl2 (0.4 g/L) and phage cocktails were added to a multiplicity of infection (MOI) of 15,

45, and 150. We thus tested single phage at MOIs of 5, 15, and 50 respectively. A

maturation step took place at 32ºC until the pH dropped to 6.5. Then, 0.01% rennet (v/v)

was added to the mixture and incubated at 32ºC for 50 minutes to allow coagulation to

occur. When the pH dropped to 6.4, the coagulum was cut into cubes and rested for 10

minutes. The curd-in-whey suspension was then heated and stirred at 38ºC and the whey

was drained. The resulting curd was vacuum-packed at 95% and ripened at 4ºC for 2

weeks.

Cheeses containing only the phage cocktail were also performed as a control for any

potential changes in phage concentration in the absence of S. aureus. The second control

condition included cheeses containing S. aureus but without phages to measure changes in

96

S. aureus population without viral addition. Finally, a third control condition contained

only the starter culture to monitor pH and temperature during the normal cheese process.

Sampling took place during the initial addition of bacteria and phages, and after the steps of

maturation, coagulation, curd formation, and ripening. Samples were homogenized in

sterile 20 g/L sodium citrate solution pre-warmed to 45ºC, using a Stomacher Lab-Blender.

Phage titers were obtained on TSA overlaid with TSB soft agar containing 100 μL of S.

aureus SMQ1320 and 100 μL of the sample dilution. Baird-Parker medium was used for

staphylococcal counts. Five biological independent trials as well as three technical

replicates for each trial were performed.

Enterotoxin production tests

Staphylococcal enterotoxin C (SEC) detection was performed using the

RIDASCREEN® SET Total Art. No. R4105 (r-biopharm, Darmstadt, Germany). It is based

on an enzyme immunoassay using anti-enterotoxin monoclonal antibodies, with a minimum

detectable limit of 0.25 ng/mL in liquid samples. The enterotoxin assay was performed

according to the manufacturer’s instructions. S. aureus SMQ1320 grown to early stationary

phase was added to i) pasteurized milk supplemented with the starter culture CUC-222 and

incubated at 37ºC, ii) raw milk incubated at 37ºC, and iii) Cheddar cheese productions.

These media were supplemented with phage cocktails, if applicable, and incubated for 2

hours to perform the ELISA assay. Testing for the presence of SEC during bacterial-phage

challenges used 100 µL of the resulting filtrate or centrifuge product. The OD450 values for

each well were obtained using a Synergy 2 plate reader (BioTek Instruments, Inc.) and

compared.

Phage encapsulation

An encapsulation procedure was selected as a method of phage concentration and

conservation. The myophage Team1 was selected as a representative and was encapsulated

in macro-beads (~2 mm) and micro-beads (~0.5 mm) and then frozen (-20 ºC) and freeze-

dried. For both series of beads, 109 PFU/mL of Team1 was mixed with 20 g/L sodium

alginate. To obtain the macro-beads, the mixture was then pumped (silicone tube #14) at 11

rpm at a rate of ~ 20 mL/min, in a solution of 1 mole/L calcium chloride at room

97

temperature. Formed beads were then dipped in a medium containing 100 g/L maltodextrin,

100 g/L glycerol, 2 g/L tryptone, and 4 g/L sodium ascorbate for 20 minutes. The liquid

medium was discarded and the phage count was determined in 1 g of fresh beads. One

gram of beads was frozen at -20ºC overnight and tested the next day for phage stability.

The remaining beads were freeze-dried for 48 hours (24 hours programmed at 4ºC) and

phage counts were compared.

The same procedure and parameters were used for the micro-beads except for the

pump employed (Smaller diameter Cole Parmer #14 tube) which was operated at a rate of 6

mL/min into a Var-J1 Open coaxial air flow driven single nozzle unit (Nisco Engineering

AG, Zurich, Switzerland). The co-axial air flow settings on Var-J1 unit were at 35 mm and

1.25 bar. Conservation of free phages was also tested as 109 PFU/mL of phage lysate was

mixed with the solution containing maltodextrin and glycerol described above. One ml was

used for initial phage counts, 1 mL was frozen at -80°C and tested, and the remaining

volume was freeze-dried and compared to the other conditions and samples.

For phage titres, beads were first dissolved by homogenization in a sterile 20 g/L

trisodium citrate solution, using a Stomacher Lab-Blender for 1 minute, followed by a 15

min incubation at 25°C. Phage counts of Team1 (log10 PFU/mL), were obtained on TSA

overlaid with TSB soft agar containing 300 μL of S. xylosus SMQ121 culture and 100 μL

of the phage dilution. Phage stability as determined by plaques assays on samples stored

during 24 hours, 1 week, 2 weeks, 1 month, 2 months, and 3 months. Two storage

conditions were carried out: 4°c and -20°C. Three biological and three technical repetitions

were carried out to obtain the means of the phage titers.

Statistical analyses

Statistical analysis was conducted using STATA version 12. We compared the

conditions to each other as well as the change in staphylococcal and phage concentrations

during cheese production. For each of the two cocktails, two separate 4 (conditions) × 5

(steps of cheddar cheese production) factorial designs were investigated with respect to (1)

staphylococcal concentration (log10 CFU/ml) and (2) phage concentration (log10 PFU/ml),

using repeated-measures analysis of variance (ANOVA). For each relevant statistically

significant finding, we reported the contrast term B with a p value and the 95% confidence

98

interval (95% CI). When appropriate, the ANOVA F coefficient was reported with its p

value. A p value lower than 0.05 was considered statistically significant.

Results and Discussion

Phage resistance in cheese production

Eight staphylococcal phages were tested for their resistance to a heat treatment

mimicking milk pasteurization (Table 4.2).

Table 4.2. Log10 reduction of phage concentration, added at 107 PFU/ml after heat

treatment at 73ºC for 20 seconds.

Most of the phages were sensitive to the heat treatment applied, with phage Team1 as

the most sensitive with a 4 log10 reduction. However, two phages were less affected by the

conditions tested (Table 4.2). The titers of siphophages LH1-MUT and phi2 dropped by

only 1.4 ±0.5 and 0.6 ±0.1 log10 units. The heat resistance phenotype was not family-

dependent since phages from all three families were sensitive (reduction of more than 3

log10) to the heat treatment. However, it seems related to the source of isolation of the

phages. LH1-MUT and phi2 were the only phages isolated from a dairy environment, and

thus may be more adapted to proliferate and be stable in this environment (Brüssow et al.,

2004; Koskella & Meaden, 2013). A similar result was previously obtained with S. aureus

phages ɸH5 and ɸA72, two phages isolated from raw milk samples. When added to milk,

these two phages resisted (98%-99%) to a heat treatment (72ºC for 15 seconds) (Garcia et

al., 2009b).

Two members of each of the three families of phages were also tested for stability

during simulated curd ripening conditions (pH 5.2, 39% humidity, 17.7 g/kg salt, and

vacuum-packing at 95% N2) at 4ºC.

Myoviridae Podoviridae Siphoviridae

Team1 phi812 K P68 44AHJD LH1-MUT phi2 MSA

4.0 ±1.0

2.6 ±0.5

3.5 ±0.2

2.7 ±0.1

3.6±0.7

1.4±0.5

0.6±0.1

2.9 ±0.4

99

Figure 4.1. Monitoring phage concentration in a model Cheddar cheese curd stored

at 4ºC for 28 days. Error bars represent standard standard deviation.

A statistically significant change in concentration was noted with some of the phages.

In particular, a significant 1 log10 unit drop was observed with phages P68, 44AHJD, and

LH1-MUT from day 0 to day 4. However, in all these cases, the phage titers subsequently

remained relatively stable over the 28-day period. None of the phage counts dropped below

5 log10 PFU/ml after 28 days of ripening, showing that all phages were resistant to these

conditions. Similar observations were also noted for S. aureus phages phiIPLA35 and

phiIPLA88. These phages were resistant in enzymatic curd manufacturing (calf rennet) at

30ºC for 6 hours, and their concentration dropped by 2 log units in an acid curd at 25ºC

over a period of 12 hours (Garcia et al., 2007).

Taken altogether, our results suggest that, with the exception of phi2 (Table 4.2),

staphylococcal phages should be added after the pasteurisation step and before curd

formation in order to maximise phage-host interaction and potentially control S. aureus.

Since phage phi2 was also stable during ripening Figure 4.1), it appeared to be the best

choice to be used under the technological conditions of model Cheddar cheese.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

Team1 K P68 44AHJD LH1-MUT phi2

Ph

age

co

nce

ntr

atio

n (

Log 1

0 P

FU/m

l)

T=0

T=4 days

T=7 days

T=14 days

T=28 days

100

Host range

The host range of phages K, 812 and Team1 on 57 S. aureus strains and one

Staphylococcus xylosus strain were reported previously (El Haddad et al., 2014). The host

range (EOPs) of the remaining five phages on the same staphylococcal strains is reported in

Table 4.3. An EOP value close or equal to 1 means that the phage lyses the tested strain

with equal efficiency as its host. Conversely, an EOP value of below 10-5

or 0 indicates that

the strain is partially resistant or insensitive to the phage, respectively. The mastitis strain,

SMQ1320, selected for use in the Cheddar cheesemaking (see below), is sensitive to all

phages tested. In addition, it is the only enterotoxin-producing strain among all 57 S. aureus

strains. In fact, it produces and secretes SEC.

101

Table 4.3. EOP values of the 5 phages infecting 57 strains of S. aureus and S. xylosus

SMQ121. Bold numbers indicate EOP values obtained using respective host strains of the

phages.

Podoviridae Siphoviridae

P68 44AHJD LH1-MUT phi2 MSA

Féli

x d

'Hérel

le

Co

llecti

on

SA812 2.1E-2 0.2 0 2.9E-4 0

SMQ121 0 0 0 4.0E-5 0

1101 5.2E-3 0.8 0 0 1.0E-5

1049 1.2E-2 1.7E-2 0 0 0

1225 0.2 5.8 0 0 1.0E-4

A170 2.4E-2 0.2 0 0.2 1.0 R

aw

mil

k

SMQ1281 1.0 1.0 1.0 7.7E-3 0.1

SMQ1282 0.8 0.4 0.9 8.5E-3 0.1

Ma

stit

is

SMQ1283 0.9 0.2 0.2 6.7E-7 5.2E-3

SMQ1284 0.3 0.2 0.1 0 1.2E-2

SMQ1285 0.6 0.3 0.5 5.0E-7 9.7E-3

SMQ1286 0.7 0.2 5.3E-2 1.5E-4 7.5E-3

SMQ1287 0.5 6.4E-2 0.4 2.5E-2 6.7E-3

SMQ1288 0.7 0.2 8.0E-2 5.3E-4 7.5E-3

SMQ1289 0.3 0.2 0.2 1.2E-3 1.3E-2

SMQ1290 0.4 7.0E-2 0.5 0 2.5E-3

SMQ1291 0.2 3.6E-2 8.0E-3 0 1.8E-3

SMQ1292 1.8 0.2 0.3 0 1.2E-2

SMQ1293 0.5 0.2 0.4 0 1.4E-3

SMQ1294 0.1 6.1E-2 0.3 5.0E-7 6.7E-3

SMQ1295 5.5E-2 7.3E-2 0.3 2.8E-6 5.2E-3

SMQ1296 0.3 0.4 0 0 1.3E-4

SMQ1297 0.1 8.5E-2 0.1 0 6.7E-3

SMQ1298 0.1 3.6E-2 0.3 0 5.4E-3

SMQ1299 0.6 7.9E-2 0.3 5.0E-7 7.5E-3

SMQ1300 1.2 0.4 0 0 1.7E-5

SMQ1301 0.6 0.8 0 5.0E-7 4.2E-5

SMQ1302 0.6 0.8 3.7E-4 1.0 4.0E-4

SMQ1303 2.3 0.5 1.3E-4 7.2E-6 1.3E-4

SMQ1304 1.3 0.3 6.7E-6 1.2 1.2E-4

SMQ1305 1.5 0.5 6.7E-6 0.3 5.0E-5

SMQ1306 1.8 0.2 1.5E-3 0.3 9.2E-5

SMQ1307 5.8 1.4 0 0 0

SMQ1308 2.0 0.1 2.8E-4 1.8 3.3E-5

SMQ1309 1.5 0.4 7.3E-5 1.8 5.0E-5

SMQ1310 1.0 0.7 9.3E-5 0.3 1.8E-4

SMQ1311 2.0 0.3 6.0E-4 0.7 1.5E-3

SMQ1312 1.8 0.2 1.3E-6 0 7.6E-4

SMQ1313 3.0 0.2 9.3E-5 1.0 3.3E-5

SMQ1314 1.1 0.2 0 0.8 0

SMQ1315 1.8 0.3 2.7E-4 3.3 0

SMQ1316 2.1 0.3 1.7E-5 5.0 9.2E-5

SMQ1317 1.5 0.4 1.0E-4 1.2 0

SMQ1318 0.7 0.2 0 0 4.4E-4

SMQ1319 1.0 0.2 2.1E-4 5.0E-2 1.3E-3

SMQ1320 0.4 0.2 1.1E-4 0.5 3.9E-4

SMQ1321 0 0 1.7E-6 0 0

SMQ1322 3.0E-4 1.2E-2 3.3E-6 0 1.0E-3

CM

RS

A

CMRSA1 0 0 0 0 1.9

CMRSA2 0 0 0 1.0E-5 8.3E-5

CMRSA3 0 0 0 0 0

CMRSA4 7.5E-3 3.0E-2 6.7E-5 0 0.7

CMRSA5 0 0 0 0 0

CMRSA6 0 0 0 0 0

CMRSA7 5.0E-2 0.1 5.3E-4 0 5.8E-2

CMRSA8 0 0 0 0 0

CMRSA9 0 0 0 0 0

CMRSA10 0 0 0 3.8E-6 5.8E-3

EOP=1 EOP=0

EOP=0

102

The data in Table 4.3 showed that the podophages P68 and 44AHJD lysed 48 out of

the 57 S. aureus strains (84%) and thus have a broad host range, although they do not infect

the S. xylosus strain. They also infect very few CMRSA (Table 4.3). We previously showed

that myophages Team1 and phi812 lysed 53 strains out of 57 (93%) while phage K infects

50 (88%) of these strains (El Haddad et al., 2014). Phages belonging to the Siphoviridae

family were more specific and had narrower lytic spectra, ranging from 23 to 35 strains

infected. Of interest, phages belonging to the Myoviridae and the Podoviridae families

have overlapping but different host ranges. In fact, strains HER1049, SMQ1292,

SMQ1321, and SMQ1322 were either totally or partially resistant to all myophages (El

Haddad et al., 2014). The podophages can infect strains HER1049, SMQ1292, and

SMQ1322 (Table 4.3). It seems that SMQ1321 is the most phage resistant among the S.

aureus strains tested.

Our data strongly support the use of a phage cocktail to cover a wider range of S.

aureus strains. Moreover, if the virulent phages used in such cocktail have overlapping host

ranges, it may reduce the probability of the emergence of phage resistant strains (Garcia et

al., 2007; Gill & Hyman, 2010).

Design of two phage cocktails

Taking into consideration all the above results, two anti-staphylococcal cocktails were

designed according to several criteria. First, we elected to design a cocktail with three

virulent phages, one from each family (Myoviridae, Podoviridae, and Siphoviridae). It is

presumed that these very distinct phages use different host receptors and should minimize

the development of phage resistance mutants (Kutateladze & Adamia, 2010; Lu & Koeris,

2011). Second, while the members of the Siphoviridae family used in this study have the

narrowest host range when compared to the members of the other two families, two of them

used in this study (LH1-MUT and phi2), appear to be more adapted to the milk

pasteurization (Table 4.2). Third, the selected phages have broad, different, and overlapping

host ranges. Thus, these preliminary assays led us to design two phage cocktails

(Team1/P68/LH1-MUT and phi812/44AHJD/phi2) to test during a Cheddar cheesemaking

process contaminated with a S. aureus strain.

103

Efficacy of anti-staphylococcal cocktails

Staphylococcal and phage concentrations were monitored in a small-scale laboratory-

based Cheddar cheese production contaminated with SEC-producing S. aureus strain

SMQ1320. Using repeated-measures ANOVA, we obtained four graphs comparing the

conditions during the steps of cheese production (Fig. 4.2). A control cheese containing S.

aureus and the starter culture L. lactis allowed monitoring the staphylococcal growth in the

presence of a competitor in the medium. L. lactis ferments milk’s lactose mostly into lactic

acid, leading to acidification of the milk medium. It was previously shown that the

competitive presence of L. lactis could inhibit the growth of S. aureus because of the

decrease in pH of the milk and the increase of lactic acid concentration itself (Charlier et

al., 2009; Le Marc et al., 2009).

Cocktail 1 (Team1/P68/LH1-MUT) was tested against S. aureus SMQ1320 (Fig. 4.2A

and B), the latter inoculated at 106 CFU per mL of milk. At the initial milk maturation and

coagulation steps, no significant staphylococcal reduction was obtained with the control

group, or when an MOI of 15 was applied. It took until the coagulation step to observe a

significant decrease of 1 and 2 log10 units of the staphylococcal counts when adding the

phage cocktail 1 at an MOI of 45 (B = –0.92, p < 0.05, 95%CI: –1.65 - –0.20) and an MOI

of 150 (B = –1.54, p < 0.001, 95%CI: –2.27 - –0.82), respectively (Fig. 4.2A). Also, at the

coagulation stage, a significant difference was observed between the control condition and

the conditions with phage added at an MOI of 45 (B = –1.56, p < 0.001, 95% CI: –2.35 - –

0.77) or an MOI of 150 (B = –2.27, p < 0.001, 95%CI: –3.06 - –1.47). The whey removal

and the cheddaring step helped increase phage efficiency and dropped the staphylococcal

concentration by 1, 3, and 4 log10 units compared to the control. After a 14 day-ripening, all

cheeses with added phages did not contain S. aureus cells as no colonies were detected

above the limit of detection of 100 CFU/ml.

104

A B

C D

Figure 4.2. Effect of MOI on staphylococcal (log10 CFU/mL) and phage counts (log10

PFU/mL) over time during a small-scale, laboratory-based Cheddar cheese production.

when adding phage cocktail Team1/P68/LH1-MUT (A and B) or phage cocktail

phi812/44AHJD/phi2 (C and D).

A and C: “ -○- S. aureus” represents bacterial population without phages

B and D: “-○- 68/LH1-MUT” and “-○- phi812/44AHJD/phi2” represent phage

controls without S. aureus host cells

For cocktail 2 (phi812/44AHJD/phi2), a significant decrease in the concentration of S.

aureus began at the maturation stage, when phage was added at an MOI of 45 (B = –1.03, p

< 0.001, 95%CI: –1.37 - –0.68) and an MOI of 150 (B = –2.02, p < 0.001, 95%CI: –2.37 -

–1.67) (Fig. 4.2C). Similarly to the phage cocktail 1, no colonies were detected above the

limit of detection of 100 CFU/ml in all cheese with the added phage cocktail 2 after 14

days. The control condition did not show any significant change from the milk stage to

ripening (B = –0.36, p = 0.06).

105

The phage counts were also followed during the cheese manufacturing process (Fig.

4.2B and D). No increase was noticed when phages were added to an MOI of 15, 45 or 150.

This could be explained by low burst size of these phages (El Haddad et al., 2014).

These results show the efficiency of both phage cocktails in reducing S. aureus

SMQ1320 concentration by more than 4 log10 units (under the limit of detection of 100

CFU/ml) in cheese after a 14 day-ripened period, transforming a severely contaminated

milk to a controlled ripened, pasteurized Cheddar cheese.

Phage safety and production of enterotoxin C

Under stress, some S. aureus strains induce the overexpression of virulence genes and

the environmental conditions play an important role in the virulence expression (Even et

al., 2009). In some cases, when co-cultured with L. lactis antagonism, S. aureus can

overexpress the enterotoxin A gene (sea) (Cretenet et al., 2011; Wallin-Carlquist et al.,

2010b), which might result in the presence of a larger dose of toxin in the medium (Dinges

et al., 2000). Because S. aureus SMQ1320 produces enterotoxin C, we tested if the use of

phages favoured toxin production. Pasteurized milk, raw milk, and un-ripened Cheddar

cheese contaminated with S. aureus SMQ1320 and phage cocktail 1 or 2 were tested for the

presence of SEC using an ELISA test.

In pasteurized milk, we observed the production of approximately 0.9 ng/mL of SEC

(OD450nm value of 1.1 ± 0.18) in the absence of phages while no toxin were detected

(<0.0625 ng/mL of SEC) when phage cocktails 1 (OD450nm of 0.045 ± 0.01) or 2 (OD450nm

of 0.043± 0.01) were added. In raw milk, SEC was detected at 1.5 ng/mL (OD450nm of 1.7 ±

0.09) without phages and dropped to 0.3 ng/mL (OD450nm of 0.35 ± 0.1) and 0.5 ng/mL

(OD450nm of 0.68 ± 0.3), when phage cocktails 1 and 2 were added, respectively. It is worth

mentioning that the starter culture L. lactis was also added in the above assays, indicating

that this strain does not prevent SEC production. During the Cheddar cheese productions,

no SEC was detected, even in the control cheeses contaminated with S. aureus and without

phages. Others have also observed reduction of staphylococcal enterotoxins production in

cheese and may be related to the water activity (Cretenet et al., 2011).

Taken altogether, our results suggest that the use of these virulent staphylococcal

phages does not lead to an increase in SEC production. To our knowledge, this is the first

106

study that addresses the impact of phages on the staphylococcal enterotoxin production.

Further investigations are needed with other SEC-producing strains as well as strains

producing other staphylococcal enterotoxins (SEA, SEB, SED, and SEE) to confirm and

expand our findings.

Phage storage and conservation conditions

No cheesemaking plant will prepare its phage suspensions. Rather, cheese processors

will rely on specialized suppliers of bacteriophages. In order to assess the feasibility of S.

aureus phages as biocontrol agents, data on long-term stability in shipping and storage

conditions at the plant are needed.

Phage Team1 was selected as a model to test storage conditions. An encapsulation

method was used to concentrate, protect, and conserve the phage over a longer period of

time.

When comparing phage counts of free phages and encapsulated phages, we noticed

that the encapsulation procedure slightly concentrated phage Team1 (Fig. 4.3). A 6-fold

increase was noted when phages were encapsulated in gel alginate/calcium micro-beads,

which was due to bead contraction in the CaCl2 solution. Free phages and encapsulated

phages were then frozen at -20ºC and their titers tested the next day. Phage counts were

reduced in all samples with the main decrease observed with free, non-encapsulated phages

(0.8 log10 units).

107

Figure 4.3. Monitoring phage concentration with or without encapsulation in beads in

fresh, freezed, and lyophilised states (log10 PFU/ml). Asterisks indicate a concentration

under the limit of detection of 2,000 PFU/ml.

Then, these phage preparations were freeze-dried. Free and macro-bead phage counts

dropped below the limit of detection of 2,000 PFU/ml, whereas micro-bead counts dropped

5 log10 units to a final concentration of ~104 PFU/ml compared to the initial concentration

of 6×109 PFU/ml. These results could have been due to an inappropriate lyophilisation

protective medium used in our study, or to the freeze-dried conditions applied. In another

study, stabilizing additives such as sucrose and trehalose showed the best phage protection,

causing a decrease of 1 log PFU/ml of lyophilized S. aureus phage ISP and phage counts

were stable for up to 27 months of storage at 4ºC (Merabishvili et al., 2013). Others have

observed a better protection of phage K when only using maltodextrin as protectant (Ma et

al., 2012). In our study, the phage-containing alginate/calcium micro-beads of

approximately 0.5 mm diameter were protected by 10% glycerol and 10% maltodextrin.

Based on the above, Team1 phage counts (free and in micro-beads) were monitored for

3 months of storage at 4ºC and -20ºC (Fig. 4.4). Counts of free phages stored at 4ºC

dropped drastically (more than 6 log10) to below the limit of detection (<1,000 PFU/ml)

after only one month of storage. Counts of phages in micro-beads also significantly

decreased by 4.3 log10 units, but after 3 months of storage (Fig. 4.4). Conversely, when

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Free Macro-beads Micro-beads

Ph

age

co

nce

ntr

atio

n (

Log 1

0 P

FU/m

l)

Fresh

Freezed

Lyophilised* * * *

108

stored at -20ºC, only 0.9 to 1.8 log10 units reduction were observed, but microencapsulation

was not helpful in preventing PFU losses (Figure 4.4). Thus, storage of phages is better at -

20˚C in free and encapsulated forms but micro-beads are better if phage Team1 is stored at

4˚C. These data confirm that, under certain conditions, microencapsulation is an efficient

method for storing phages over a long period of time. Others have shown that the

microencapsulation of S. aureus phage K led to a better protection to simulated gastric fluid

at pH 2.5 (Ma et al., 2012). And this benefit of microencapsulation adds to that of the

concentration methodology.

Figure 4.4. Free phage and encapsulated phage concentration monitoring during 3

months of storage at 4ºC and -20ºC. Asterisks (*) show maximum potential PFU because

reading is under the detection limit of 1,000 PFU/ml. <

In conclusion, we designed two staphylococcal phage cocktails, each containing three

virulent phages representing the three main phage families of the Caudovirales order.

These two phage cocktails are safe, have a broad host range and were found to be highly

efficient in controlling S. aureus cell population and enterotoxin production during cheese

production.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Free 4° Beads 4° Free -20° Beads -20°

Ph

age

co

nce

ntr

atio

n (

Log 1

0 P

FU/m

l)

0

1 day

1 week

2 weeks

1 month

2 months

3 months

* * *

109

Acknowledgments

We would like to thank Yves Raymond, Catherine Viel, and Denise Tremblay for technical

support as well as Georges E. Khalil for his assistance in the statistical analysis. We also

would like to thank the MAPAQ and the CBMRN for providing the staphylococcal strains

used in this study. Finally, we thank Jean-Pierre Roy for isolating and providing phage

phi2. L.H. was the recipient of a scholarship from CIDA. This work was funded by the

FQRNT, MAPAQ, Agriculture et Agroalimentaire Canada, and Novalait. S.M. is

chairholder of the Canada Research Chair in Bacteriophages.

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113

Chapitre 5. Discussion, conclusion et perspectives

La présence de souches virulentes de S. aureus dans plusieurs types d’environnements

constitue un danger à la santé publique. Durant ce projet de doctorat, l’option d’utiliser des

phages a été développée pour éliminer S. aureus. Pour ce faire, plusieurs points ont été

détaillés afin d’élaborer et d’évaluer l’efficacité de deux cocktails de phages différents

durant une mini-production en laboratoire de fromage de type Cheddar.

Problématique de S. aureus

Les problèmes de santé associés à S. aureus dépendent de plusieurs souches très

différentes. Tout d’abord, une étude de génotypage de S. aureus a été adoptée au cours de

cette étude. Cinquante-sept souches de S. aureus ont été obtenues de plusieurs

environnements et ont été regroupées à l’aide de la méthode de MLST ainsi que de

l’algorithme eBURST. Ces deux méthodes permettent la classification des souches par

numéros de STs et de CCs respectivement. Un ST est défini par la combinaison de 7 gènes

domestiques hautement conservés et aussi nommés allèles. Deux STs appartiennent au

même CC si elles partagent au moins 6 allèles en commun. Ces stratégies de classification

ont permis de regrouper les 57 souches en 18 groupes de STs rassemblés sous 14 CCs (voir

annexe).

Une comparaison des CCs avec les sources d’isolement de chaque souche de S. aureus

a permis de définir une relation entre le génotypage et les sources d’isolement. En effet, la

répartition des CCs est dépendante du milieu d’isolement des souches. Les souches isolées

du milieu laitier canadien se sont principalement regroupées en trois CCs soit CC97,

CC151 et CC126. Ces trois CCs sont dominants dans plusieurs pays et sont communément

associés à la mammite bovine et caprine au Brésil, aux États-Unis, en Irlande, en Espagne

et en Italie (Rabello et al., 2007; Smith et al., 2005; Smyth et al., 2009). Du côté des

souches de S. aureus isolées du milieu clinique et de la collection Félix d’Hérelle, les CCs

tendent à être plus diversifiés.

Un autre point à mentionner est l’absence de relation entre le numéro de CC et la

lysotypie des souches. En effet, les souches appartenant à un même CC peuvent avoir des

114

sensibilités phagiques différentes. De même, des souches peuvent avoir une sensibilité

semblable aux onze phages testés indépendamment du CC auquel elles appartiennent.

Ensuite, les génomes des 57 souches ont été testés pour la présence d’un ou de plusieurs

des gènes d’entérotoxines principales, sea à see. À la suite du criblage, le génome d’une

seule souche de S. aureus, soit SMQ1320, contenait le gène d’entérotoxine C. L’ES C est

une cause importante d’intoxication alimentaire et est souvent produite par des souches de

S. aureus isolées du lait de vache et de chèvre (Ercolini et al., 2004; McLauchlin et al.,

2000). SMQ1320 est donc la seule souche isolée du milieu laitier canadien et productrice

d’entérotoxines dans notre groupe de souches de S. aureus. De plus, elle fait partie d’une

minorité de souches capable d’être lysée par les onze phages staphylococciques recueillis

de la collection Félix d’Hérelle. Finalement, elle appartient au complexe clonal retrouvé

partout dans le monde et exclusivement confirmé dans les isolats bovins, soit CC151 (Hata

et al., 2010). Considérant tous ces points, la souche S. aureus SMQ1320 a été sélectionnée

pour l’application alimentaire.

Une des forces de cette étude est le fait d’utiliser des souches différentes de S. aureus

en termes de sources d’isolement, de génotypage et de lysotypie. La disponibilité de

complexes clonaux internationaux comme CC97 et CC151 (Hata et al., 2010; Smith et al.,

2005) ainsi que de souches provenant de différents territoires canadiens constituent des

outils et des cibles parfaits pour l’élaboration de cocktails de phages polyvalents et pour la

consolidation de leur efficacité anti-staphylococcique. Vu que la majorité des souches

ciblées par les cocktails de phages élaborés dans cette étude sont de provenance

canadienne, il serait intéressant de voir si ces cocktails seraient efficaces contre des souches

isolées de d’autres régions géographiques afin de confirmer leur utilisation généralisée.

Stratégie de sélection et d’élaboration de bons agents de biocontrôle

staphylococciques

Le but principal de cette étude était de sélectionner des outils de biocontrôle efficaces

contre S. aureus dans les produits laitiers et plus précisément dans la production de

fromage. Pour ce faire, une stratégie de sélection de phages a été définie en se basant sur

des critères précis. Onze phages de staphylocoques ont été collectés de différents

115

environnements et ont été caractérisés afin d’élaborer des cocktails anti-S. aureus composés

de phages différents répondant à divers critères de sélection. L’utilisation d’un cocktail de

phages a déjà été prouvée comme étant plus efficace que l’action d’un phage seul et permet

la réduction, ou l’élimination dans certains cas, de la croissance de souches résistantes aux

phages (Carlton et al., 2005; Drilling et al., 2014).

Le premier point de caractérisation se repose sur la confirmation du caractère virulent

strict du phage. Un phage strictement virulent ne possède pas les gènes responsables de son

intégration dans le chromosome de l’hôte. Dans certains cas, ces gènes sont mutés et leurs

fonctions sont réprimées les rendant incapables de s’intégrer (Garcia et al., 2009a). De plus,

il est important que le génome d’un agent de biocontrôle phagique ne contienne pas de gène

de virulence pouvant affecter son caractère sécuritaire. Les génomes des 11 phages ont été

séquencés et aucun gène de virulence ou lysogénique connu n’a été retrouvé dans les

génomes phagiques sauf pour le phage LH1. Ce dernier a été isolé à partir d’un échantillon

de lait cru québécois. Notons qu’un protocole simple a été développé au cours de ce projet

pour isoler des phages du lait cru dont le phage LH1 et le phage phi2. Après l’analyse

complète de son génome, un module de lysogénie a été retrouvé, soit la présence de gènes

codant possiblement pour une intégrase et un répresseur, en plus de gènes codant pour les

deux sous-unités de la toxine PVL, LukS-PV et LukF-PV. Le phage LH1 est probablement

un prophage ou un variant devenu virulent suite à une mutation. La présence de gènes

codant pour une toxine ainsi que d’un module lysogénique dans le génome du phage LH1

fait de lui un phage non utilisable dans toute application. D’un autre côté, un mutant naturel

de ce phage, appelé LH1-MUT, a été isolé par hasard suite à la caractérisation du phage

LH1. Une comparaison entre LH1 et LH1-MUT a permis de remarquer la délétion

complète du gène d’intégrase ainsi que des gènes encodant les deux sous-unités de la toxine

PVL. Il semble qu’un choc thermique a mené à une délétion possiblement suite à une

recombinaison intramoléculaire entre des répétitions directes d'ADN homologue. Ces

constatations ont permis de rejeter le phage LH1 et de considérer son mutant naturel pour la

suite des expériences. Dix phages ont donc été considérés dans la suite du projet.

Cinq phages appartenant à la famille des Myoviridae ont été amplifiés sur un simulant

de S. aureus, une souche staphylococcique non pathogène de S. xylosus. Les phages

116

Pyophage, Team1, Team2, phi812 et K sont les seuls phages pouvant lyser cette espèce.

Une approche similaire a déjà été utilisée pour amplifier le produit phagique anti-L.

monocytogenes ainsi que le phage mycobactérien D29 amplifié sur la bactérie du sol

Mycobacterium smegmatis (Gill & Hyman, 2010). Pour vérifier la reproductibilité de cette

approche ainsi que l’identité des phages amplifiés sur l’une ou l’autre des espèces

staphylococciques, une étude approfondie du phage Team1 amplifié sur S. aureus et S.

xylosus a été produit autant au niveau microbiologique qu’au niveau génomique. La

confirmation de l’identité des deux dérivés du phage Team1 permet de considérer cette

démarche afin de sécuriser la santé du personnel manipulateur ainsi que l’innocuité du

produit phagique et de l’aliment.

Ensuite, l’élaboration des cocktails anti-S. aureus s’est basée sur la sélection de phages

à large spectre lytique. Pour ce faire, les 57 souches de S. aureus identifiés ont été utilisées

pour définir le caractère polyvalent des phages. Les phages appartenant à la famille des

Myoviridae et des Podoviridae ont les plus larges spectres lytiques autant contre des

souches de S. aureus isolées du milieu laitier que contre des souches cliniques et résistantes

aux antibiotiques. Pour ce qui est des myophages, les spectres lytiques des phages

Pyophage, Team1 et Team2 sont identiques. Afin d’éliminer toute redondance dans les

cocktails de phages, les phages Pyophage et Team2 ont été écartés puisque le phage Team1

a été caractérisé en profondeur. Le total des agents de biocontrôle phagiques potentiels a été

réduit à 8 phages. D’un autre côté, les phages Team1, phi812 et K ont des spectres lytiques

différents tout comme les deux podophages P68 et 44AHJD. Parmi les myophages, le

phage K a le plus étroit spectre lytique allant jusqu’à lyser 50 des 57 souches de S. aureus

testées. De plus, lorsque ce phage a été amplifié sur S. xylosus ou sur S. aureus, son

efficacité s’est restreinte suite à la chute de sa concentration de 4 à 5 unités de log10 par

rapport à celle obtenue sur sa souche hôte. Ce phénomène observé pour le phage K a aussi

été montré dans une autre étude (O'Flaherty et al., 2005b). Pour ces raisons, le phage K n’a

pas été considéré dans l’élaboration des cocktails de phages.

La présence de souches de S. aureus résistantes aux myophages et sensibles aux

podophages et vice versa ont permis de consolider l’idée d’utilisation de cocktails

composés de phages appartenant à des familles différentes de Caudovirales. Cette approche

117

minimise l’apparition de souches résistantes aux phages et la possibilité d’une

recontamination du produit alimentaire.

Considérant l’utilisation industrielle des phages, deux aspects nécessitent l’acquisition

de connaissances : 1) quelles sont les méthodes de production, de conservation et

d’inoculation des phages et 2) quelle est leur activité en matrice fromagère.

Un point important à évaluer est donc l’efficacité de l’agent de biocontrôle dans le

milieu de culture in vitro ainsi que dans la matrice alimentaire in vivo. Dans cette étude, les

phages ont été testés pour leur efficacité dans le lait et les produits laitiers dont le fromage

de type Cheddar. Lors de la production de ce dernier, des étapes de pasteurisation et

d’affinage ont été réalisés. Ces étapes se différencient par des conditions de températures

élevées et de bas pH couplés au milieu semi-solide du caillé.

En ce qui a trait à la méthode d’inoculation, il fallait déterminer si les phages pouvaient

être ajoutés au lait cru. Les phages ont donc été tout d’abord testés pour leur résistance à la

pasteurisation. Deux phages ont résisté le plus à cette condition, soit les phages LH1-MUT

et phi2, tous deux isolés du lait cru. Il est tentant d’assumer que la résistance des phages à

cette température dépend de leur source d’isolement. Isolés du milieu laitier, il est suggéré

que les phages LH1-MUT et phi2 sont plus adaptés à cet environnement, ses changements

et sa population staphylococcique (Brüssow, 2005; Koskella & Meaden, 2013). Des

conclusions similaires ont été tirées suite à l’étude de la résistance au traitement de 15

secondes à 72 ºC de deux phages staphylococciques de Siphoviridae isolés du milieu laitier

(Garcia et al., 2009b). D’un autre côté, le phage MSA

appartenant à la famille des

Siphoviridae semble avoir un spectre lytique large par rapport aux autres membres de cette

famille. Ceci pourrait être dû au fait qu’il s’agit d’un mutant naturel d’un phage tempéré

isolé après sa persistance de plus de 20 jours dans la circulation sanguine (Capparelli et al.,

2007). Suite à cette approche, le phage MSA

est capable de lyser plusieurs souches cliniques

de S. aureus dont celles résistantes aux antibiotiques. Ce phage pourrait être considéré pour

son utilisation dans un cocktail à retombée médicale. Bien qu’appartenant à la famille des

Siphoviridae et possédant des spectres lytiques restreints par rapport aux membres des

autres familles, les phages LH1-MUT et phi2 ont été considérés pour leur ajout dans les

cocktails de phages.

118

Par ailleurs, une résistance de tous les phages testés dans un caillé modèle reconstitué

de type Cheddar après 28 jours d’affinage a permis de conclure sur l’étape optimale à

laquelle le cocktail de phages doit être ajouté durant la production de ce type de fromage.

L’addition de ce dernier s’est réalisée après la pasteurisation du lait et avant l’étape de

formation du caillé afin de protéger tous les phages de la chaleur, d’augmenter les

probabilités d’interactions phages-hôte bactérien et d’atteindre une efficacité anti-

staphylococcique maximale.

Un dernier critère à considérer pour la sélection de bons agents de biocontrôle

phagiques est le maintien de l’efficacité du phage du moment de sa production, par des

fournisseurs spécialisés, jusqu’à son utilisation en fromagerie. Idéalement, la concentration

des phages devrait demeurer stable durant une longue période de temps indépendamment

des changements de l’environnement. Afin d’atteindre ce but, la méthode d’encapsulation

en billes d’alginate a donné lieu non seulement à une protection phagique contre la

congélation mais aussi à la concentration de phages. La concentration des phages

encapsulés est due à l’expulsion de liquide, lors de la période de raffermissement du gel en

CaCl2, générant un nombre plus élevé de phages emprisonnés dans la bille. L’encapsulation

des phages dans des microparticules de 0,5 mm de diamètre composés de gel d’alginate

couplé au calcium et leur trempage dans une solution contenant 10 % de glycérol et 10 %

de maltodextrine s’est avérée la meilleure méthode de conservation phagique à 4°C.

À la suite de l’étude de ces critères, six des onze phages répondant à tous ces

paramètres ont été sélectionnés pour l’élaboration de cocktails, dont deux phages différents

de chaque famille de Caudovirales : i) Myoviridae, phages Team1 et phi812, ii)

Podoviridae, phages P68 et 44AHJD et iii) Siphoviridae, phages LH1-MUT et phi2.

Afin de minimiser la probabilité d’apparition de souches résistantes aux phages, les

cocktails ont été élaborés de façon à être composés de trois phages, dont un phage de

chaque famille. Huit combinaisons différentes ont été envisagées. Dans des travaux

précédents non présentés dans cette thèse, le cocktail Pyophage/P68/LH1-MUT a fait

preuve d’efficacité dans du lait pasteurisé contre la souche S. aureus SMQ1282 isolée du

milieu laitier sans permettre la croissance de souches résistantes aux phages. Le phage

Pyophage étant identique au phage Team1, ceci a poussé à la sélection de deux

119

combinaisons de cocktails de phages, soit les cocktails Team1/P68/LH1-MUT et

phi812/44AHJD/phi2.

Évaluation de l’efficacité et de la sécurité de deux cocktails de phages

staphylococciques

Des mini-productions de fromage de type Cheddar ont été réalisées en laboratoire en

mimant toutes les conditions de température et de pH industrielles. L’ajout de cocktail de

phages s’est fait après l’étape de pasteurisation dans du lait contaminé par 106 UFC/ml de

S. aureus SMQ1320 (Ben Abdallah et al., in preparation; Bueno et al., 2012) et

supplémenté par 107 UFC/ml de ferment lactique. Une réduction de plus de 3 unités de

log10 de la concentration staphylococcique a été notée dans le caillé non-affiné et sous la

limite de détection de 1000 (??) UFC/ml après un affinage de 14 jours à 4 ºC. Et ce, avec

l’un ou l’autre des cocktails et à une MOI de 15 et plus. L’efficacité de ces cocktails de

phages a donc été confirmée. Des concentrations phagiques plus basses pourraient être

testées ultérieurement afin d’identifier la MOI optimale pour la réduction maximale de la

concentration staphylococcique.

La dernière étape a été de s’assurer de la sécurité d’utilisation des cocktails dans un

milieu laitier. Tout d’abord, des purifications de phages ont été utilisées lors de ces

expériences éliminant les impuretés ou les débris bactériens pouvant altérer l’innocuité du

produit phagique. Ensuite, utilisant une souche staphylococcique productrice

d’entérotoxines C, nous avons vérifié l’absence de surproduction de cette toxine et de sa

sécrétion dans le milieu suite à l’ajout de phages. La présence de ces derniers pourrait

déclencher ce phénomène en causant une situation de stress. Une autre supposition serait

que la lyse bactérienne par les phages conduirait au relargage de tout le contenu du

cytoplasme bactérien dans le milieu accompagné des entérotoxines actives. Ce dernier point

non mentionné dans aucune des études antérieures pourrait constituer un danger à

l’utilisation généralisée des phages dans toute application. Une technique immuno-

enzymatique de détection a été utilisée afin de vérifier la présence ou l’absence de la toxine

ES C dans du lait pasteurisé, du lait cru et une production complète de fromage de type

Cheddar. Une approche de vérification de la surproduction de toxine au lieu de la

120

surexpression du gène sec a été abordée vu la simplicité et la disponibilité de la méthode de

détection des toxines. De plus, la présence du gène de toxine dans le génome bactérien

n’implique pas nécessairement la production et la sécrétion définitives de la toxine

(Loncarevic et al., 2005). Suite aux différents tests appliqués, il a été observé que la

présence de phages ne mène pas à la surproduction de la toxine ES C. Toutefois, dans

certains cas, leur présence a même permis de réduire la production d’ES C. Ceci pourrait

être le résultat de la lyse de certaines cellules productrices d’ES C dans le milieu. Par

conséquent, la sécrétion de toxines s’est arrêtée suite à la chute de la concentration

staphylococcique au-dessous du seuil minimum permettant la production de toxines (<105

UFC/ml ou <103 UFC/ml pour certaines souches de S. aureus hautement virulentes). Cette

manipulation a permis de confirmer l’utilisation sécuritaire des phages dans toute

application pour ce qui est de la toxine ES C. Toutefois, ceci ne donne pas une

confirmation générale. Il serait donc important de vérifier ultérieurement la reproductibilité

de ces résultats pour ce qui est des autres entérotoxines staphylococciques principales (ES

A, B, D et E) ainsi que toute protéine ou toxine staphylococcique pouvant altérer

l’innocuité et la sécurité, autant alimentaire que médicale. Ceci pourrait de même être

vérifié pour tout procédé antibactérien plaçant S. aureus dans une situation de stress et

déclenchant son mécanisme de défense.

Au final, l’utilisation des phages comme additifs pour le biocontrôle de fromages de

type Cheddar a été prouvée comme étant efficace et sécuritaire.

Afin d’augmenter l’efficacité des phages et de diminuer l’émergence de résistance

bactérienne aux phages, les cocktails de phages devraient sans doute être constamment mis

à jour à l’aide de nouveaux phages répondant à des critères de sélection (Kutateladze &

Adamia, 2010; Sulakvelidze, 2013). Ayant élaboré et testé deux cocktails de phages

efficaces contre S. aureus, il sera possible aussi de faire une « rotation » des cocktails de

phages afin d’inhiber la probabilité d’occurrence de souches résistantes aux phages et

d’assurer ainsi l’innocuité du produit final.

121

Conclusions et perspectives

S. aureus est un pathogène alimentaire et médical dangereux de par ses facteurs de

virulence multiples nécessaires pour sa propagation et son évolution. Dans le contexte de

cette thèse de doctorat, la production et la sécrétion d’entérotoxines staphylococciques ont

été ciblées dans une production de fromages de type Cheddar en procédant à la réduction de

la population de S. aureus. Pour ce faire, l’alternative anti-S. aureus proposée est

l’utilisation de cocktails de phages. Les phages sont des virus capables de lyser

spécifiquement une souche ou une espèce bactérienne donnée sans affecter la microflore du

milieu tout en étant non nocifs pour l’homme.

À la suite des résultats obtenus, on peut conclure, premièrement, que les phages isolés

du lait, LH1-MUT et phi2, ont fait preuve d’une meilleure résistance aux changements de

l’environnement laitier, soit au traitement à la chaleur. Deuxièmement, l’utilisation d’un

simulant non pathogène de S. xylosus pour l’amplification des phages pourrait éliminer la

probabilité de transfert de gènes de virulence d’une bactérie à l’autre à travers les phages.

Troisièmement, une approche stratégique de sélection d’agents de biocontrôle phagique

efficaces a été mise en place. Deux cocktails ont été testés durant une mini-production de

fromages de type Cheddar mimant les conditions de température et de pH industrielles.

L’efficacité des deux cocktails a été confirmée suite à la réduction de la concentration

bactérienne en-dessous de la limite de détection de 100 UFC/ml après 14 jours d’affinage à

4 ºC sous vide. Il serait tentant de tester ces deux cocktails de phages dans un contexte

alimentaire ou industriel différent ou bien dans un but de thérapie à volet médical. De

même, un test d’efficacité de ces cocktails contre d’autres souches de S. aureus de d’autres

sources et de d’autres régions géographiques permettront de confirmer leur caractère

« universel » et leur application dans tout environnement. Enfin, la production commerciale

des phages peut s’effectuer sous forme encapsulée et congelée dans des microparticules

d’alginate/calcium de 0,5 mm de diamètre. Cette dernière approche a été testée avec le

myophage Team1 seulement. Une reproduction de ces résultats avec des phages

appartenant aux deux autres familles de Caudovirales ou même avec les deux cocktails de

phages élaborés durant cette étude pourront consolider les conclusions retirées dans cette

partie.

122

La limitation principale de l’utilisation de phages dans toute application est la

probabilité d’occurrence de souches résistantes aux phages. Bien que celles-ci ont été

montrées moins virulentes que les souches sauvages et que la probabilité d’apparition de

souches résistantes in vivo est plus rare que celle in vitro, la persistance de ces souches dans

le milieu constitue un problème de santé publique. Il serait intéressant d’étudier plus

profondément cette émergence bactérienne, que ce soit au niveau des mécanismes de

résistances aux phages chez S. aureus ou plus précisément au niveau des récepteurs de

phages. Ces informations pourraient identifier des cibles potentielles réduisant la

probabilité d’apparition de résistance bactérienne aux phages.

Afin de traiter ce problème et de réduire ou d’éliminer cette option, deux approches ont

été mises en place au cours de ce projet de doctorat. D’un côté, des cocktails de phages

polyvalents composés de trois phages différents ont été élaborés et utilisés au lieu d’utiliser

un seul phage, augmentant ainsi le spectre d’hôtes. D’un autre côté, prendre de l’avance sur

l’émergence de souches résistantes et l’option de procéder par une rotation du produit

phagique sont possibles vu la disponibilité de deux cocktails de phages anti-S. aureus

différents.

Ayant deux cocktails de phages anti-staphylococciques efficaces et sécuritaires et vu

l’approbation de ces agents antimicrobiens par la FDA, l’organisme de réglementation des

États-Unis et Santé Canada, il serait tentant à long terme de pousser ces résultats vers un

contexte de brevetage et de suivre les étapes requises afin d’approuver et d’initier leur

utilisation anti-staphylococcique dans le lait et le fromage canadiens.

Nous pensons que ces cocktails sont les premiers mélanges anti-staphylococciques

efficaces et sécuritaires contre une grande majorité des souches de S. aureus canadiennes

dans le lait. Ils permettent de diminuer le risque d’apparition de souches bactériennes

résistantes aux phages et de ce fait, réduisent la contamination causée par S. aureus et

préservent l’innocuité et la qualité du lait et du fromage.

123

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141

Annexe

Arbre phylogénétique regroupant les 57 souches de S. aureus étudiées selon leur

numéro de complexe clonal respectif. Il a été générée à l’aide du logiciel MEGA5

(Maximum likelihood, 1000 bootstraps). L’échelle indique une différence d’un nucléotide.

"Staphylococcus aureus" dans les produits laitiers

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