Spectroscopie RMN appliquée aux...

08/10/2010

1

Spectroscopie RMN appliquée aux protéines

Attribution et informations structurales

47

RMN 1D�2D�3D�4D…

08/10/2010

2

48

De la 1D à la 2D

1D

ns foisns= nombre de scans

augmentation du rapport signal sur bruit (S/N) : S/N = k* √ns

on augmente le temps d’expérience d’un facteur 4 (ns*4) � S/N augmente d’un facteur 2

2D

x ns

permet le retour à l’équilibre de l’aimantation des noyaux

entre 2 scans

t2

49

RMN 2D

08/10/2010

3

50

Temps de mélange (mixing time, en ms)

51

Principe d’une expérience 2D homonucléaire basée sur un transfert d’aimantation

08/10/2010

4

52

Spectroscopie de corrélation…

…scalaire (COSY, TOCSY) …dipolaire (NOESY, ROESY)

53

COSY et TOCSY : couplages scalaires

� COSY : couplages homonucléaires 1H-1H

� 3J (3 liaisons chimiques)

� TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H

� 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)

O

NH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

NH2

α

β γ

δε

08/10/2010

5

54


� COSY : couplages homonucléaires 1H-1H

� 3J (3 liaisons chimiques)

� TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H

� 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)

α

β γ

δε

3J4J

5J6J

Couplages H N-Hαααα, HN-Hββββ, HN-Hγγγγ…

Couplages entre protons aliphatiques

1H

1H

O

NH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

NH2

55

O

NH

H

H

H

H

H

H

H

H

H

NH2


� tables des valeurs δ HN, Hα, Hβ, Hγ, Hδ, Hε,… :

� peptides non structurés GGXGG

� moyennes de l’ensemble des protéines répertoriées dans la BioMagResBank (BRMB)

α

β γ

δε

Couplages H N-Hββββ, HN-Hγγγγ…TOCSY

COSY

Couplages H N-Hαααα

� identification d’un type de résidu

1H

1H

3J

4J 5J

08/10/2010

6

56

Nuclear Overhauser Effect spectroscopy : couplages dipolaires

� NOESY : pas adapté aux molécules de masse moléculaire de 800 – 1500 Da (NOE ≈ 0)

� ROESY : signaux moins intenses mais toujours ≠0

57

NOESY/ROESY : couplages dipolaires

molécule MW 334 Da

• pics diagonaux : intensité < 0

• pics de corrélation : intensité > 0

phase des signaux avec une diagonale négative :

Icross : proportionnelle à 1/r 6 où r est la distance entre 2 noyaux

08/10/2010

7

58

Des couplages dipolaires à la structure tridimensionnelle

1H

1H

conformation étendue

attribution de toutes les résonances 1H

+ interprétation des distances 1H-1H

(contraintes NOEs)

ensemble de structures 3D

NOESY

59

Des couplages dipolaires à la structure tridimensionnelle

Entrée: table des distances de ville à ville

Pour la RMNEntrée: Sortie:

table des distances interprotons s tructure de la molecule

Sortie : carte des Etats-Unis

08/10/2010

8

60

NOESY : couplages dipolaires

� NOESY : couplages homonucléaires 1H-1H

� protons proches dans l’espace (d< 5-6 Å)

� ne passent pas nécessairement par les liaisons chimiques

1H

1H

Couplages HN-HN

61

Domaine WW : distances < 2 Å

08/10/2010

9

62


63


08/10/2010

10

64


65

Interprétation du NOESY

1H

1H > 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å

� 10 000 contacts NOEs ?

environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour

une protéine de 40 aa!

08/10/2010

11

66

Interprétation du NOESY

ensemble de conformères possibles, répondant aux contraintes expérimentales

> 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å

� 10 000 contacts NOEs ?

environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour

une protéine de 40 aa!

trop peu de contacts NOEs pour établir une structure

unique

67

Solvant

Rôle du solvant :

• solubilisation des composés / résolution des signaux

• lock et shim (deutération totale ou partielle)

� mais signaux intenses car [1H de H2O] = 111 M (1.11 M si 1% H2O)

� [protéine] = 10 µM – 1 mM

� éliminer les signaux du solvant qui peuvent gêner l’acquisition :

• signaux résiduels de solvant protoné quand on travaille en solvant deutéré

• signaux du solvant quand on travaille en solvant protoné (par ex. H2O pour l’étude des protéines)

08/10/2010

12

68

Largeur de raie de l’eau

� radiation damping : la forte magnétisation du signal de l’eau induit des courants dans la bobine du spectromètre RMN qui génèrent des champs magnétiques qui affectent la largeur des raies

� dépend de la quantité d’eau, de l’accord de la sonde, de la force du champ magnétique B0, …

69

Spectres RMN d’une protéine-modèle, l’ubiquitine

H2O

08/10/2010

13

70


‘irradiation’ du signal de l’eau

71


les protons échangeables ne sont plus visibles

08/10/2010

14

72

Suppression des signaux du solvant

Watergate

WET (rectangular pulses)

WET (shape pulses)

700 Hz soit 1.4 ppm @ 500 MHz

73

Expérience 2D hétéronucléaire (1H-15N ou 1H-13C HSQC) avec détection en proton

détection en proton car le proton est le

noyau le plus sensible

08/10/2010

15

74

Corrélations hétéronucléaires 15N-1H (13C-1H) HSQC

75

Qu’est-ce qu’une irradiation sélective ?

différences entre les spectres avec et sans

irradiation

spectre de(s) fréquence(s) excitée(s)

impulsion sélective : durée longue, puissance faible

≠ impulsion 90°(large gamme de fréquences excitées) : impu lsion courte, forte puissance

08/10/2010

16

76

Découplage

HC-(CH2CH3)3

HC-(CH2CH3)3HC-(CH2CH3)3

HC-(CH2CH3)3

77

RMN 13C : découplage proton

CH3I

quadruplet : 1 3 3 1

découplage

singulet : 1+3+3+1=8

08/10/2010

17

78


79


découplage de X durant le temps d’acquisition de A

08/10/2010

18

80

découplage de X durant le temps d’acquisition de A

découplage de A durant le temps d’évolution


pic de corrélation (δA, δX)

81

Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 15N-1H HSQC

1H (ppm)

15N (ppm)

� The 1H-15N HSQC� 2D proton-nitrogen correlation spectrum

� One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.

08/10/2010

19

82


1H (ppm)

15N (ppm)



83


1H (ppm)

15N (ppm)



08/10/2010

20

84


1H (ppm)

15N (ppm)



85


1H (ppm)

15N (ppm)



08/10/2010

21

86

Expériences 3D : 15N-HSQC-NOESY (1H-1H) et 15N-HSQC-TOCSY (1H-1H) ou HNCA (1H/15N/13C)

87

RMN des protéines

� RMN 2D : 2e dimension = 1H ou 15N ou 13C

� enrichissement des protéines en 15N et/ou 13C : isotopes stables, non radioactifs!

� par exemple : détection des couples 15N-1H dans les protéines (tous les NH du squelette + ceux présents dans les chaînes latérales)

� deux 1H qui auraient la même fréquence de résonance proton peuvent avoir deux fréquences de résonances 15N différentes

% 1H 99,9885

% 2H 0,0115

% 3H 0

% 12C 98,93

% 13C 1,07

% 14C 0

% 14N 99,632

% 15N 0,368

ν 1H1H

15N

ν (1H)

ν1 (15N)

ν2 (15N)

08/10/2010

22

88

1H

15N

ν (1H)

ν1 (15N)

ν2 (15N)

1H

15N

15N-1H HSQC : identification de tous couples 15N-1H d’une protéine

NH

O

R

NH

O

R

NH

O

RH H

H

ii+1

RMN des protéines

89

Attribution des spectres RMN

1H

15N

attribution = identifier à quel atome correspond quel signal

NH

O

R

NH

O

R

NH

O

RH H

H

ii+1

?

?

08/10/2010

23

90

RMN tridimensionnelle : attribution séquentielle d’une protéine

1H13C

15N

plan HSQC

. . .. .. .. . ...

. ...

.. ..

. ...

15N

91

1H

15N


15N

i-1 i

extraction d’un plan 13C-1H

08/10/2010

24

92

1H

15N

13C


15N

extraction d’un plan 13C-1H

1H

13C

� signaux intenses : Cα , Cβ du résidu i

� signaux moins intenses : Cα , Cβ du résidu i-1

HNCACB

i-1 i

2009 Structures des protéines – MO293


1H

15N

13C

Cα (i)

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cβ (i)

08/10/2010

25

94


(Cα i, Cβ i) � i = Gln (Q)

(Cα i-1, Cβ i-1) � i-1 = Ser (S)

� paire Ser-Gln (SQ)

� séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq 33werpsgns

1H

13C

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Q

S

Cα (i)

Cβ (i)

Q33

95


1H

15N

13C

Cα (i)

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cβ (i)

Q33

08/10/2010

26

96


(Cα i, Cβ i) � i = Gln (Q)

(Cα i-1, Cβ i-1) � i-1 = Ser (S)

� paire Ser-Gln (SQ)

� séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq 33werpsgns

1H

13C

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cα (i-1)

Cβ (i-1)

Cα (i)

Cβ (i)

Q

S

A

Cα (i)

Cβ (i)

Q33 S32

2009 Structures des protéines – MO297

Cα (i-1)

Cβ (i)

Cα (i)

Cβ (i-1)

S32


1H

15N

13C

Q33

Spectroscopie RMN appliquée aux...

Documents

Transcript of Spectroscopie RMN appliquée aux...