Spectrométrie de masse à transformée de Fourier: notions de base et

quelques applications

Guillaume van der RestLaboratoire des Mécanismes Réactionnels

Ecole Polytechnique, Palaiseau

Déroulement du cours

1. Introduction: la place actuelle de la FTMS

2. Notions de base de FT-ICR

3. Quelques améliorations apportées au dispositif

4. Exemples d’applications

Une heure

40 minutes

Une large place pour vos questions, que ce soit pour éclaircir certains points ou aborder d’autre aspects de la technique.

Déroulement de l’exposé

1. Introduction: la place actuelle de la FTMS1. S’y retrouver dans les sigles.2. A quoi ressemble l’instrument ?3. Quel est son intérêt ?

2. Notions de base de FT-ICR3. Quelques améliorations apportées au

dispositif4. Exemples d’applications

1.1. S’y retrouver dans les s igles

• ICR : Ion Cyclotron Resonance

• FT-ICR (MS) : Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (Mass Spectrometry)

• FTMS : Fourier Transform Mass Spectrometry

Historiquement ces termes ne regroupaient pas exactement les mêmes significations, mais avec les instruments actuels ils sontdevenus presque synonymes.

• En français on trouve parfois RCI-TF.

1.2. A quoi ressemble l’i nstrument ? Source electrospray

Optique de transfert

Group e de pompage

Cellule (cachée)

Aimant supracondu cteur 7 T

1.3. Quel est son intérêt ?

• Plus de 300 instruments existaient dans le monde en 2000.

• Plusieurs vendeurs d’instrument investissent actuellement pour un retour sur ce marché.

• Précision en masse : on peut atteindre une précision de l’ordre de 2-3 ppm / 5 ppm.

• Résolution : des résolutions supérieures à 600 000 sont atteignables en routine.

Déroulement de l’exposé

1. Introduction: la place actuelle de la FTMS2. Notions de base de FT-ICR

1. Un peu de physique2. Piège de Penning3. Mesure de la fréquence cyclotronique4. Séquence menant à un spectre de masse5. Comment ajouter de la (MS)n ?6. Comparaison avec d’autres spectromètres de

masse

3. Quelques améliorations apportées au dispositif

4. Exemples d’applications

Fréquence de rotation cyclotron :

• indépendante de la vitesse initiale des ions,

• inversement propo rtionnelle au rappo rt m/z.

Une mesure précise de la fréquence cyclotron p ermett ra une mesure précise de la masse.

2.1. Un peu de phys ique

Mouvement d’un ion dans un champ magnétique :

Hz /

10535611.1

)/(2

7

zm

B

zm

eBc

×==π

ν

2.2. Piège de Penning

… ou comment piéger les ions suivant l’axe z ?• Idéalement on souhaiterait un potentiel de la forme :

Problème : Il faudrait des plaques infinies en xy et une grille n’interférant pas avec le mouvement des ions.

Conséquence : Toutes les solutions pratiques vont ajouter un terme électrostatique radial, lié à la taille finie du piège.

2.2. La cellule cubique

Le potentiel créé est de type quadrupolaire, comme dans un piège de Paul. Mais il n’y a pas de composantes non-continues sur les tensions.

L’extremum au centre de la cellule est minimal dans l’axe du champ magnétique mais maximal suivant les autres axes.

2.2. Le mouvement des ions

• Le mouvement des ions devient alors la superposition de trois mouvements :

On peut cependant négliger le mouvement magnétron, qui est de faible amplitude pour des ions piégés à proximité du centre de la cellule.

Dans la suite nous considérerons les ions piégés, et le seul mouvement d’intérêt sera la composante cyclotron.

Voir Figure 1 de L. Schweikhard, J. Ziegler, H. Bopp, K. Lützenkirchen, International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes 141, 77 (1995).

2.2. Modes d’ionisation

Pour l’instant: formation directe des ions dans la cellule, avec une énergie cinétique suffisamment faible.

Donc EI dans la cellule (ou MALDI dans la cellule à la limite).

e-

ou h�

2.3. Mesure de la fréquence cyclotron

• Comment passer d’un mouvement thermique non cohérent à un signal mesurable ?

S’ils sont produits à température ambiante, les ions auront une vitesse initiale telle que leur mouvement cyclotron sera sur uneorbite de rayon inférieur à un millimètre.

Il sera nécessaire de les exciter, en phase, sur une orbite de rayon plus grand pour détecter un signal sur les plaques de détection.

m/z(ou 1/�)

Int?

2.3.2. Excitation des ions

• Première étape : accroître leur rayon de façon à créer des paquets d’ions cohérents.

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

302520151050x10

3

12

10

8

6

4

2

0

x1

03

280260240220200180160140

1200

1000

800

600

400

200

0

4003002001000

1.0

0.5

0.0

-0.5

-1.0

302520151050x10

3

Excitation mono-fréquence

Excitation en balayage de fréquences

Transformée de Fourier

2.3.4. Détection du courant induit

• Conversion du mouvement cohérent du paquet d’ions en un courant électrique mesurable sur les plaques de détection.

4000

3000

2000

1000

0

4035302520

1.0

0.5

0.0

-0.5

302520151050x10

3

Transformée de Fourier

L’amortissement pseudo-exponentiel est dû en grande majorité à des collisions avec du gaz résiduel, qui entraînent une perte decohérence du mouvement des ions.

La largeur du pic dépend directement de la constante de temps de cet amortissement exponentiel.

Le vide doit être aussi bon que possible (~10-9 mbar).

2.3.6. Digitalisation et t ransformée de Fourier• Le signal digitalisé (un interférogramme) est traité par

transformée de Fourier pour obtenir le spectre des fréquences cyclotron (donc les m/z) des ions excités sur une orbite haute.

4000

3000

2000

1000

0

100806040200

-2

-1

0

1

302520151050x10

3

14

12

10

8

6

4

2

0

x1

03

100806040200

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

302520151050x10

3

aqT10

1=τ

aqT4=τ

Transformée de Fourier

2.3.6. Avantages de la transformée de Fourier• Détection simultanée de l’ensemble des ions, de

masses différentes, présents dans la cellule.• Accumulation de spectres pour augmenter le rapport

S/N.– S croît en n (n = nombre de spectres accumulés)– N croît en ¥n ; donc S/N croît en ¥n.

• Traitement du signal digitalisé.– On dispose de toute l’artillerie de traitement du signal par

FFT, notamment au niveau de la déconvolution de fonctions d’appareil (apodisation).

– On peut envisager des expériences de type 2D analogues de celles de la RMN.

2.4. Séquence menant à un spectre de masse• La succession de ces différents évènements successifs dans le

temps forme la séquence permettant de passer de l’ionisation au spectre de masse.

• La boucle principale correspond aux n accumulations, le traitement du signal résultant a lieu après la « FIN ».

50 ms 100 ms 1 ms

Qu

ench

Ion

isat

ion

250 ms

Total : 500 à 1000 ms

Début

FinE

xcit

atio

n

Dét

ecti

on

2.5. Comment ajouter de la (MS)n

• Sélection d’un ion par éjection radio-fréquence des autres ions présents :

Neutralisation (et disparition) des ions excités au-delà du rayon de la cellule sur les parois de celle-ci.

Avant Après

Les paramètres d’éjection sont critiques pour ne pas exciter trop les ions que l’on souhaite conserver.

2.5.2. Exc itation sélective résonante

• Par la durée et l’intensité de la radio-fréquence d’excitation on peut contrôler l’énergie cinétique apportée à un ion.

• Pour obtenir une fragmentation par collision, l’introduction d’un gaz de collision sera nécessaire.

Eje

ctio

nsé

lect

ive

Fin

Exc

itat

ion

(bal

ayag

e)

van

ne

pu

lsée

Ou

vert

ure

Exc

itat

ion

mo

no

fréq

.50 ms

Qu

ench

Début

100 ms

Ion

isat

ion

250 ms1 ms

Dét

ecti

on

Po

mp

age

Co

llisi

on

s

50 ms10 ms100 ms 1000 ms

Total : 1500 à 2000 ms

2.6.1. Précision en masse et résolution

• En fréquence, la largeur des pics dépend :– de la durée de digitalisation ( û�min = 1/Tacq )– de l’amortissement du signal suite aux collisions

û�haute pression = 2 ¥3 / 2

La largeur des pics est donc indépendante de la fréquence.14

12

10

8

6

4

2

0

121086420

14

12

10

8

6

4

2

0

1.00.80.60.40.20.0Hz m/z

νB

zm ∝/

En m/z, la largeur des pics est proportionnelle à (m/z)2.

Les limites instrumentales en termes de résolution et de précision en masse dépendent de m/z.

2.6.1. Résolution

• Résolutions typiques (7.0 T) à m/z 1 000Tacq : 500 ms 45 000 ± 0.02 umaTacq : 1 000 ms 90 000 ± 0.01 umaTacq : 4 000 ms 360 000 ± 0.003 uma

Il faudrait digitaliser pendant 10 s pour atteindre une résolution de 1 000 000.

• Pour m/z 5 000 :Tacq : 1 000 ms 17 800 ± 0.3 uma

FT-ICR particulièrement bien adaptée aux ions multichargés, qui se placeront à des bas m/z.

6.2.1. Précision en masse

• Un grand atout du FT-ICR, lié à la résolution, sa capacité à mesurer très précisément des masses.

A m/z 1 000, avec un aimant de 7.0 T, on peut attendre :

Calibration interne : précision ~ 2-3 ppm.

Calibration externe : précision ~ 5-10 ppm.

• Attention cependant aux effets de charge d’espace : la présence d’ions abondants à des masses voisines peut déplacer la fréquence cyclotron des ions.

2.6.2. Sensibil ité et gamme dynamique

• Limite de détection d’un signal : ~ 200 charges / (m/z) / scan

Le rapport entre cette valeur et la quantité d’espèce neutre initiale doit inclure l’efficacité d’ionisation (et de transport), le nombre de valeurs de m/z différents (fragmentations, multichargés, …) et le nombre de scans nécessaires à l’obtention d’un S/N correct.

• Sensibilité « record »10 atomoles de peptide injecté.

• Gamme dynamique : Il faut concilier l’effet de charge d’espace (lié à des ions majoritaires abondants) qui va déplacer les m/z mesuréset la limite de détection du signal (pour les ions minoritaires).

2.6.3. Gamme de masse

• Limite inférieure :Donnée par la fréquence de digitalisation.Pour 8 MHz et 7.0 T : m/z 29.

• Limite supérieure :Limite de piégeage, liée à l’accroissement du mouvement magnétron (donc dépend de VT) :

7.0 T, VT 0.5 V: m/z 274 000 (mais précision : 5 000 ppm!)

Cependant il faut pouvoir exciter les ions avant détection, doncen pratique on se situe à une limite 10 fois plus faible:

7.0 T, VT 0.5 V: m/z 27 400

Déroulement de l’exposé

1. Introduction: la place actuelle de la FTMS2. Notions de base de FT-ICR3. Quelques améliorations apportées au

dispositif1. Différents types de cellules2. Sources d’ionisation externe3. Méthodes d’activation des ions

4. Exemples d’applications

3.1. Différents types de cellules

• Pour se rapprocher du cas idéal, plusieurs cellules ont été développées.

Voir Figure 12 de A.G. Marshall, C.L. Hendrickson, G.S. Jackson, Mass Spectrometry Reviews 17, 1 (1998).

3.2. Sources d’ion isation externe

• Apport très important :– Ajout des modes d’ionisation modernes (ESI ou MALDI) au

détecteur FT-ICR.– FT-ICR particulièrement bien adapté à l’étude d’ions

multichargés.

• Difficultés :– Adaptation à un mode de détection pulsé.– Piéger efficacement des ions produits loin de la cellule.

3.2.1. Transport des ions : multipô les

Voir Figure 1 de Michael A. Freitas, Christopher L. Hendrickson, Mark R. Emmett and Alan G. Marshall, International Journal of Mass Spectrometry, 185-187, 565 (1999).

3.2.1. Guides électrostatiques

Voir documentation Bruker sur l’APEX III.

3.2.2. Piégeage des ions

• Piégeage statique avec gaz de collision

+ 1.0 V+ 1.0 V

E kin

E kin

3.2.2. Piégeage des ions

• Piégeage SideKick™+ 1.0 V

+ 1.0 V+ 1.0 V

+ 1.0 V

− 1.0 V

E kin

3.2.2. Piégeage des ions

• Piégeage dynamique − 1.0 V

− 1.0 V

+ 1.0 V+ 1.0 V

+ 1.0 V

+ 1.0 V

3.3. Méthodes d’activation d es ions

• SORI-CAD (Sustained Off-Resonance Irradiation –Collision Activated Dissociation)

12

10

8

6

4

2

0

x1

03

280260240220200180160140

Ion à exciter

3.3. BIRD et IRMPD

• L’absorption successive de plusieurs photons infra-rouge (thermiques pour le BIRD, d’un laser pour l’IRMPD) mène à la dissociation.

DissociationE

3.3. ECD

• Electron Capture Dissociation• Capture exothermique d’un électron par une

molécule multichargée :

[M, nH]n+ [M, nH](n-1)+• F1m+ + F2

k+•e-

O

R NH

CHR'

HOH

R NH

CHR'

OH

R NH

CHR'

c z.

Spécifique de la liaison amide et de liaisons S-S. Pas ou peu de fragmentations de glycosylations ou de phosphorylations.

Déroulement de l’exposé

1. Introduction: la place actuelle de la FTMS2. Notions de base de FT-ICR3. Quelques améliorations apportées au

dispositif4. Exemples d’applications

1. Mesure de masses exactes2. Mélanges complexes3. Dissociation par capture d’électrons4. Réactions ion-molécule

4.1. Mesure de masses exactes

• Problème de la distribution isotopique

([HPSO � ��3URLQVXOLQH ERYLQ � �&���+���1���2���6��

R=10 000

R=1 000

5pVROXWLR � � 0�∆0

Masse moyenne

Masse monoisotopique

� � ��� � �� � � ��� � � ��

/D = /D A T A /J P L C /e n k O H /1 /p d a ta /1 A d m in is tra to r F ri J a n 1 7 0 9 :0 9 :0 2 2 0 0 3

4.1. Séparation d ’espèces proches

(Leu-Enk-NH2)H+:Mmono 555.29313 (Leu-Enk-OH)H+: Mmono 556.27713

Mmes 555.29268 Mmes 556.27694

Leu-Enk-OH

Leu-Enk-NH2

Mélange 50/50

0.019 Da d’écart.

Résolution >> 30 000

� ���� � � ���� � � ��

� � ! ! " " # $% % #& % % ' ()

*�+ *,- * *

. + *,- */

0�1 234 25

6�1 234 25

71 234 25

8�1 234 25

5 1 234 25

91 234 25

:�1 234 25

/D = /D A T A /J P L C /m yo _ 1 p m /2 /p d a ta /1 A d m in is tra to r F ri J a n 1 7 0 9 :1 5 :2 0 2 0 0 3

4.1. Résolution et massifs isotopiquesMyoglobine: Mmono théorique 19 940.965 Mav théo 19 954.499

Mmesurée majoritaire 19 952.2

Hème

17+

16+

15+

14+

18+

19+

19 952.2

; ;<= < ; ; <= ; > >?�@ A B BC�D E F FG�H I F FG�H J F F GH F

/D = /D A T A /J P L C /m y o _ M S M S /5 /p d a ta /1 A d m in is tra to r F ri J a n 1 7 0 9 :1 2 :0 2 2 0 0 3

4.1. Sélection pour la MS/MS

Sélection de l’état de charge 17+

Sélection d’un pic isotopique de l’état de charge 17+

On atteint une résolution d’au moins 17000 sur la sélection.

Cela pourra servir en MS/MS dans des mélanges complexes.

4.2. Mélanges complexes

• Pouvoir de résolution élevé et mesure de masse précise permettent d’extraire beaucoup d’information d’un seul spectre de masse.

Lorsque plusieurs espèces sont présentes, il est possible de mesurer simultanément toutes les masses sans besoin de séparation préalable.

• Jusque 20 000 pics distincts dans un seul spectre.

4.2. Mélanges complexes

• Des extraits de pétrole bruts en ESI

Voir les figures et le contenu de Christine A. Hughey, Ryan P. Rodgers, Alan G. Marshall, Kuangnan Qianand Winston K. Robbins, Organic Geochemistry, 33, 743 (2002).

KLM NOP QRS T UV

W X X Y Z Z Z Y[ Z Z \] ] ] \^ ] ] _ `a

bdc be f b b

g c be f bh

idc be f bh

j c be f bh

kml no p nq

r l no p nq

q l no p nq

s l no p nq

tdu vw x vy

/D =/D A TA /JP LC /160103/cytC /2/pdata/1 A dm inistrator Fri Jan 17 09:06:06 2003

4.2. « Peptide mass fingerprinting »Exemple avec le cyctochrome c

4.2. Peptide mass fingerptinting

76% de couverture de la protéine. Seuls les peptides de faible masse moléculaire manquent

4.2. Analyse de mélanges complexes

• Analyse par ESI/MS d’un mélange d’une protéine (domaine Hck SH2) et de 324 ligands potentiels.

M. Wigger et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13, 1162 (2002)

4.3. ECD sur des peptides ou protéines

• Mécanisme « qualitatif »– Capture de l’électron au niveau d’un ammonium quaternaire:

– Déplacement rapide de l’atome d’hydrogène, ralenti progressivement par collisions avec la chaîne peptidique.

O

R NH

CHR'

HOH

R NH

CHR'

OH

R NH

CHR'

c z.

HN CH C NH

O

NH3

R'R+ e-

HN CH C NH

O

NH3

R'R

4.3. Caractéristiques des fragmentations

• Mécanisme « non ergodique » i.e. sans redistribution de l’énergie interne dans l’intermédiaire excité :– Pas de fragments de type b / y typiques de CID ou IRMPD.– Pas de rupture de liaisons fragiles, même non-covalentes :

A B IRMPDECD

[ A, B, nH ]n+ [ A, B, nH ](n-1)+

c.

z

A + c. + z

Activated Ion ECD

4.3. Sites de fragmentation

• Liaisons S-S :– Affinité pour H• ?– Etats de Rydberg dissociatifs pour S-S-• ?

Nécessité de réduire les ponts disulfure avant analyse.

• Favorisées en C-terminal des tryptophanes.

• Pas de fragmentation de C-O éther ou C-N amines :– La présence d’un groupe accepteur de H• (tel que C=O) à

proximité est nécessaire.– Les O- et N-glycosylations de chaînes latérales ne sont pas

coupées par l’ECD.

4.3. Localisation de sites de glycosylation

Une seule fragmentation (z202+) correspond à la perte d’un glycane.

E. Mirgorodskaya, P. Roepstorff, R.A. Zubarev, Anal. Chem. 71, 4431 (1999)

4.3. Approche top-down sur protéine entière• Développée par le groupe de F.W. McLafferty.• Augmentation nette de la fragmentation d’où une

information de séquence sur une protéine entière.

Cytochrome c

D.M. Horn et al. Anal. Chem. 72, 4778 (2000)

4.4. Réactions ion-molécule

• La cellule FT-ICR, un « réacteur » pour la chimie des ions en phase gazeuse?

SubstratMélange de produits

RéactifPurification

Produit pur

Analyse Caractérisation

Ion initialIons produits

Gazneutre

Sélection Ion isolé

Excitation /

détectionSpectre de masse

…

…

4.4. Exemple de réaction étudiée

HC

O

NH2

HC

O

NH2

- e- + H2O

- CO[ NH3, H2O ].+

R

R'

R

R'

NH3

et/ou

R

R'

NH3 (NH3)2.+

O Oet

OHNH3

• Etude du mécanisme détaillé des réactions d’ions.

• Propriétés thermochimiques d’espèces ionisées (affinités protoniques, basicités, énergies de complexation ou de solvatation…)

• Réactions caractéristiques à buts analytiques (échanges H/D surdes peptides ou protéines).