Soutenance Thèse Final

Dépollution d’effluents gazeux halogénés par des micro-organismes déshydratés en réacteur solide/gaz:

Etude de la stabilité du biocatalyseur

Pierre Marchand

Sous la direction du Pr. M-D Legoy et du Dr. I. Goubet

Agence De l’Environnement et de la Maîtrise de l’Energie

Région Poitou-Charentes

Introduction

Problématique

Résultats

Conclusions

Perspectives

Introduction

Les Composés Organiques Volatils (COV)

Traitements et intérêt de la catalyse solide/gaz

Définition et caractéristiques

Réglementation Sources

Les COV


Introduction

Composés de carbone et d’hydrogène

Hydrogène peut être substitué par un atome d’oxygène, d’azote, de soufre, d’halogène (chlore, brome ou fluor)

Ces composés ont une pression de vapeur > 0,01kPa à 293°K

Les COV

Effets sur la santé et l’environnement

Introduction

Effets sur la santé : • Irritations, troubles cardiaques, digestifs, rénaux, du système nerveux

• Certains sont Cancérigènes, Mutagènes, Reprotoxiques (CMR)

• Tous les COV halogénés : phrase de risque R40 (possibles effets

irréversibles pour la santé)

Effets sur l’environnement :

• Impliqués dans l’augmentation de l’effet de serre (O3 dans la troposphère)

• Toxiques pour les végétaux et l’environnement aquatique

Introduction

Les COV

Textes Européens et Internationaux

1050Plafond imposé pour la France en 2010

Émissions annuelles de COV (kt/an)

1972 - Conférence de Stockholm

1979 - Conférence de Genève

1992 - Conférence de Rio

Fixer des objectifs de limitation des rejets : Directive 2001/81/CE

Procédés industriels

Procédés industriels

Sources COV utilisés

Dégraissage Perchloroéthylène (PCE) Dichlorométhane (DCM) Tétrachloroéthylène (TCE)

Nettoyage de textiles PCE

Diluants de colles DCM/TCE

Solvants de peinture Chlorobenzène

Chimie/ pharmacie mono/multihalogénés

Chlorés/bromés

Plusieurs halogènes

Aliphatiques

Chlorés

Introduction

Les sources de COV halogénés

Les COV

Introduction

Les Composés Organiques Volatils (COV)

Traitements et intérêt de la catalyse solide/gaz


Réglementation Sources

Du type de COV et ses caractéristiques physicochimiques

Du débit et concentration de l’effluent

De l’humidité relative de l’air

De la présence d’autres molécules et/ou de poussières

…dépend :

Introduction

Les Traitements

Le choix de la méthode…

Traitements COVTraitements COV

DestructionDestruction RécupérationRécupération

Introduction

Les Traitements

Les grandes familles

• Convertir en CO2/H2O • Séparer le COV de l’effluent• Concentrer• Recycler

100

100

1 000 10 000 100 000

0,1

1

10

Adsorption

Oxydation thermique

et catalytique

Débit Nm3.h-1

Con

cen

trat

ion

g.N

m-3

10

Introduction

Les Traitements

Traitement des COV halogénés (industrie)

100

100

1 000 10 000 100 000

0,1

1

10

Adsorption

Oxydation thermique

et catalytique

Débit Nm3.h-1

Con

cen

trat

ion

g.N

m-3

10

Introduction

Relativement onéreux (régénérer l’adsorbat)

Rentable si récupération et réutilisation du solvant

Hydrolyse des COV halogénés

Les Traitements


100

100

1 000 10 000 100 000

0,1

1

10

Oxydation thermique

et catalytique

Débit Nm3.h-1

Con

cen

trat

ion

g.N

m-3

10

Introduction

Les Traitements

Besoin de procédés complémentaires

pour éliminer l’halogène


Alcool Alcool GazeuxGazeux

Biocatalyseur (Cellules entières déshydratées)Biocatalyseur (Cellules entières déshydratées)SolideSolide

COV halogénéCOV halogéné GazeuxGazeux

Introduction

La catalyse solide/gaz

Nouvelle génération de biofiltre (solide/gaz)

Polluant dégradé directement sous forme gazeuse

Procédé continu

Pas de problème de toxicité (à prouver)

PRESSION

TEMPERATURE

CPG

Introduction

La catalyse solide/gaz

Le réacteur solide/gaz

Formation du gaz pollué Dégradation du gaz pollué Analyse

COV EAU

(Lamare & Legoy 1993)

Activité thermodynamique correspond à la disponibilité d’une molécule pour le catalyseur

ax=Ppx

Psatx

… pour l’eau aw

Introduction

Problématique

Résultats

Conclusions

Perspectives

Problématique

Stratégie

Réaction modèle (substrat/bactérie)

Conditions (préparation/réaction)

Travaux antérieurs

Objectifs

Problématique

Travaux antérieurs

Etude de faisabilité (B. Erable 2002 à 2005)

Rhodococcus erythropolis NCIMB 13064 (DhaA)

Xanthobacter autotrophicus GJ10 (DhlA)

Escherichia coli recombinant (DhaA ou DhlA)

+ H2O R-OH + H-X

Cellules déshydratées

( )halidohydrolase

R-X

Déhalogénases et souches étudiées


Travaux antérieurs

Bactéries déshydratées actives en réacteur solide/gaz

« Screening » sur de nombreux substrats (mono et multichlorés, bromés)

Etude de l’effet de différents paramètres physicochimiques (Température/activité thermodynamique de l’eau (aw)/pH)

Problématique

Problème : biocatalyseur instable

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120

Act

ivit

é ré

lati

ve (

%)

0

20

40

60

80

100

120


Travaux antérieurs

Problématique

Problème : biocatalyseur instable

Expliquée par l’effet de l’hydrohalogène

Problématique

Stratégie



Travaux antérieurs

Objectifs

Objectifs

Travaux antérieurs

Problématique

Déterminer et quantifier les phénomènes responsables de la perte de vitesse catalytique

Améliorer la stabilité (plusieurs semaines)

Proposer un procédé respectueux de l’environnement

Problématique

Stratégie



Travaux antérieurs

Objectifs

Cl + H2O OH + HCl

E. coli BL21 DE3 DhaA

1-chlorobutane 1-butanol

La réaction modèle

Stratégie

Problématique

Cl + H2O OH + HCl




Facile à cultiver (milieu riche)

ProductionInductible par l’IPTG

Bien décrite

Stratégie

Problématique

Cl + H2O OH + HCl




Stratégie

Problématique

Substrat référence

Stratégie

Problématique

Culture

LavagesSolution mère (SM)


Tampon Borate (pH 9,0)

Cellules entières

Dilution



Stratégie

Problématique

Culture

LavagesSolution mère (SM)

Cellules entières

Dilution

Lyophilisation

Tampon Borate (pH 9,0)40°Caw 0,7

+ 1-chlorobutane

Congélation


Introduction

Problématique

Résultats

Conclusions

Perspectives

Résultats

Paramètres responsables de la perte d’activité

Etude du lyophilisat

Effets des sels du tampon borate

Résultats (I)

Hypothèses


Inhibition par le 1-chlorobutane et 1-butanol

Lien entre viabilité des bactéries et activité de l’enzyme

Dénaturations liées au couple Température/aw

Inhibition par le HCl produit lors de la réaction (pH)

Inhibition par les substrat et produit organiques

Cl + H2O OH + HCl


Résultats (I)

Inhibition par les substrat et produit organiques

Cl + H2O OH + HCl

Après 48 heures de réaction Eau

(hydrophile) Décane

(hydrophobe)

Analyse CPG

Pas d’accumulation sur le lyophilisat


Résultats (I)





Hypothèses


Résultats (I)


Résultats (I)

Viabilité durant la préparation du biocatalyseurV

iabi

lité

en

%

0

20

40

60

80

100

120

140

Après récolte

Après lavages

Congelée

s (-20°C)

Lyophilisées

Viabilité en fonction du traitement

Mortalité > 90%

Pas de lien entre viabilité et activité

« réservoirs à enzymes »

protéases

0% bactéries revivifiables

Bactéries toujours actives


Résultats (I)

Viabilité durant la réaction

Effet de l’ajout d’antiprotéases

Pas d’activité protéolytique significative


Résultats (I)

Act

ivit

é re

lati

ve e

n %

0

20

40

60

80

100

120

140

(-) antiprotéases

(+) antiprotéases

Cellules entières Cellules soniquées Extraits cellulaires0

20

40

60

80

100

120

140

Activité après 2 heures en phase aqueuse + ou - antiprotéases

40°C; pH 9,0




Hypothèses


Résultats (I)


Effet du couple température/aw

40°Caw 0,7


Résultats (I)

Mesure de l’activité résiduelle

40°C; pH 9,0; 10mM 1-chlorobutane

0 heure

20 heures

50 heures

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

02

4 6 8 10 12 14 16

Temps en minutes

n(H

Cl)

en

µm

ol50 heures

t0

20 heures

Effet du couple température/aw

Dénaturations irréversibles dues au couple Température/aw


Résultats (I)

Conditions : 40°C et aw 0,7

Temps d’incubation (h)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat



Hypothèses


Résultats (I)



Devenir du HCl

Cl

+

HH22OO

OH

HCl ?

+

Lyophilisat de E. coli DhaA


Résultats (I)

[Cl- libre]

Devenir du HCl

La totalité du HCl est retenue sur le biocatalyseur


Résultats (I)

Dosage du HCl sur le lyophilisat durant la réaction


0 10 20 30 40 50 60

[HC

l] e

n µ

mol

/g

0

500

1000

1500

2000

2500

Quantité totale d’HCl produit

Quantité mesurée sur le lyophilisat

Calculée par intégration du 1-butanol

Devenir du HCl

Cl

+

HH22OO

Gazeux

OH

Gazeux

HCl sorbé

pH


Résultats (I)

Effet du HCl


Résultats (I)



0 heure

20 heures

50 heures

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

02

4 6 8 10 12 14 16

Temps en minutes

n(H

Cl)

en

µm

ol50 heures

t0

20 heures

40°Caw 0,7

Effet du HCl


Résultats (I)



0 heure

20 heures

50 heures

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

02

4 6 8 10 12 14 16

Temps en minutes

n(H

Cl)

en

µm

ol50 heures

t0

20 heures

40°Caw 0,7

+ 1-chlorobutane

40°Caw 0,7

Effet du HCl


Résultats (I)



0 heure

20 heures

50 heures

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

02

4 6 8 10 12 14 16

Temps en minutes

n(H

Cl)

en

µm

ol50 heures

t0

20 heures

+ 1-chlorobutane

Effet du HCl (séparation)

(i) (ii) (iii)

(iv)

(v)(vi)

Mesure d’activité résiduelle


Résultats (I)

Effet du HCl


Résultats (I)

40°C/aw 0,7 avec 1-chlorobutane


0 20 40 60 80 100 120 140 160

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat

Effet du HCl

40°C/aw 0,7

40°C/aw 0,7 avec 1-chlorobutane

Inactivation par le HCl : réversible ?


Résultats (I)


0 20 40 60 80 100 120 140 1600

20

40

60

80

100

120

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

Mesure d’activité résiduelle du lyophilisat

Effet du HCl


Résultats (I)

(a) Activité résiduelle (b) Activité en phase gaz

Conclusion (Résultats I)


Résultats (I)


Lien entre viabilité et activité des bactéries

Dénaturations thermiques à 40°C/aw 0,7

Inactivation par accumulation du HCl

55%

45%

Aucun

Aucun

Irréversible

Réversible

EffetHypothèses Quantification

Pourquoi conserve-t-on une partie de l’activité?

Enzymes dénaturées Enzymes protégées

Hypothèse : 2 environnements pour les DhaA


Résultats (I)

40°C et aw 0,7

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

Résultats



Effets des sels de tampon borate

Observation au MEB


Résultats (II)

Photo MEB : bactéries après lyophilisation

La structure des bactéries semble conservée après lyophilisation

Observation au MEB


Résultats (II)

Tampon borate après lyophilisation X 1500

Sels du tampon borate = Support des bactéries

Bactéries + tampon après lyophilisation X 1500

Y a-t-il des échanges au travers des enveloppes bactériennes ?

50 % du lyophilisat est composé de sels

Localisation de l’activité déhalogénase


Une partie des enzymes n’est pas fortement maintenue à l’intérieur des bactéries

Résultats (II)

Act

ivit

é sp

écif

iqu

e (%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

Cellules après récolte

Cellules congelées (-20°C)

Cellules lyophilisées

CulotSurnageant

Mesure de l’activité en milieu aqueux après différents traitements

Résultats (II)

Réhydratation durant la réaction


Echanges probables au travers de l’enveloppe bactérienne

Réhydratation du lyophilisat durant la réaction (40°C/aw 0,7)

Après 4h de catalyseAvant catalyse

Après 100h de catalyseAprès 16h de catalyse


Conclusion

Matrice cellulaire

Sels de tampon borate

Quel environnement favorise la stabilité à 40°C et aw 0,7 ?

Deux environnements sont possibles pour les DhaA

Résultats (II)


Effet « thermostabilisateur » des sels

Quel environnement favorise la stabilité à 40°C et aw 0,7 ?

Résultats (II)

En solution aqueuse ou en milieu non-conventionnel (disponibilité en eau restreinte)

Anderson & Hahn-Hagerdal 1987 Combes et al., 1989 et 2003Triantafillou et al., 1997Lindsay et al., 2004Yu et al., 2005

En réacteur solide/gaz Sels de tampon phosphate (ADH de Thermoanaerobacter)

Trivedi et al., 2006


Première approche

Lavages

Cellules entières

Solution mère (SM)

Dilution

Culture

Résultats (II)

Cellules soniquées

Dilution

Traitement aux ultrasons

Observation du lyophilisat de cellules soniquées(a) X3000 (b) X800

Augmentation de la proportion d’enzymes directement en contact avec les sels de tampon borate

Résultats (II)


75% de lyse après sonication

Cellules soniquées

Effet de la sonication et de la quantité de sels

Résultats (II)


Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120

Act

ivit

é en

UI/

g de

bac

téri

es

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules entières Cellules soniquées

50% de sels de tampon 70% de sels de tampon


La sonication et l’augmentation de sels semblent stabiliser l’activité

Résultats (II)


40°C/aw 0,7

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120A

ctiv

ité

en U

I/g

de b

acté

ries

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules entièresCellules soniquées

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120

Act

ivit

é en

UI/

g de

bac

téri

es

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules entières Cellules soniquées



Résultats (II)


40°C/aw 0,7

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120A

ctiv

ité

en U

I/g

de b

acté

ries

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules soniquées

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120

Act

ivit

é en

UI/

g de

bac

téri

es

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules entières


?


Réelle amélioration de la stabilité liée à l’augmentation de la proportion de DhaA au contact des sels de tampon borate

Résultats (II)


40°C/aw 0,7

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120A

ctiv

ité

en U

I/g

de b

acté

ries

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules soniquées

Temps (h)

0 20 40 60 80 100 120

Act

ivit

é en

UI/

g de

bac

téri

es

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Cellules entières


La totalité recondense

= =

Résultats



Effet des sels de tampon borate

Effets des sels

Vis-à-vis des dénaturations thermiques

Vis-à-vis du HCl

Effet de la proportion de sels

Résultats (III)

Conditions optimales et expérience à l’échelle supérieure

Lyophilisats d’extraits cellulaires


Lyophilisat d’extraits cellulaires

Lavages

Cellules entières

Solution mère (SM)

Dilution

Extrait cellulaire

17000 g30 minutes4°C

Surnageant

Cellules soniquées

Culture

Dilution

Résultats (III)

Traitement aux ultrasons


Lyophilisat d’extraits cellulaires

Extrait cellulaire

Résultats (III)

DhaA directement au contact des sels de tampon borate

Elimination des enveloppes bactériennes et des cellules entières

Effets des sels


Vis-à-vis du HCl


Résultats (III)




Stabilité thermique (cellules/extraits)

Résultats (III)

aw 0,7

Activité résiduelle après 150 heures à 40°C

Cellules entières Extraits cellulaires

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

Réhydratation ?

Aucune perte d’activité


Résultats (III)

Isotherme de sorption (cellules/extraits)

Extrait cellulaire

Cellules entières

aw

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

Hyd

rata

tion

du

lyop

hili

sat %

0

10

20

30

40

50

La résistance du lyophilisat d’extrait cellulaire n’est pas liée à une réhydratation inférieure

Réhydratation du lyophilisat durant la réaction à 40°C


Résultats (III)

Interactions sels-protéines

Modification de la disponibilité de l’eau autour de la protéine

Effets des sels : protection contre les dénaturations thermiques

Le mécanisme exact de l’effet « thermostabilisateur » des sels reste à élucider

Explications en milieu non-conventionnel


Résultats (III)


aw 0,65


Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

aw 0,7




Résultats (III)


Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

aw 0,65


Limiter au maximum le risque de dénaturations thermiques


Effets des sels


Vis-à-vis du HCl


Résultats (III)


Effet des sels : en réacteur solide/gaz

Résultats (III)


Activité déhalogénase en réacteur solide/gaz (40°C/aw 0,65)

Temps (h)

0 20 40 60 800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

50% de sels

Act

ivit

é sp

écif

ique

(U

I/g

de p

roté

ines

)


Effets des sels

Effet de la proportion des sels

Résultats (III)


Vis-à-vis du HCl


Effet des sels : en réacteur solide/gaz

Résultats (III)


Temps (h)

0 20 40 60 800,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

50% de sels31% de sels20% de sels4% de sels

Act

ivit

é sp

écif

ique

(U

I/g

de p

roté

ines

)



Résultats (III)


% de sels au sein du biofiltre0 20 40 60 80

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Sans 1-chlorobutane

Activité résiduelle après 80 heures (40°C/aw 0,65)


Résultats (III)



0

20

40

60

80

100

120

140

160

Avec 1-chlorobutaneSans 1-chlorobutane

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)


Une proportion de sels inférieure à 50% n’est pas suffisante pour neutraliser le HCl accumulé


Effets des sels

Effet de la proportion des sels


Résultats (III)


Vis-à-vis du HCl


Résultats (III)



0

20

40

60

80

100

120

140

160

Avec 1-chlorobutaneSans 1-chlorobutane

Act

ivit

é ré

sidu

elle

(%

)


Temps (jours)

0 20 40 60 80 100 120

Act

ivit

é en

UI

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

Extrait cellulaire (2,8 g)

Expérience à une échelle supérieure

Résultats (III)

Les sels semblent tamponner le microenvironnement des DhaA jusqu’à saturation



Introduction

Problématique

Résultats

Conclusions

Perspectives

Conclusions

Lyophilisat de cellules entières

Stabilité

Cellules entières

Viabilité

Substrat et produit organiques(1-chlorobutane et 1-butanol) Protéases

bactériennes

HCl produit Sels du tampon borate

Eau

Pas de sorptionX

Pas d’activité protéolytique

X

Contact direct avec les DhaA

(+)

« Réservoir à enzyme »

X

Sorption importante (20%)

(-) 55%Sorption totale

(-)45%

Conclusions

(+)Participe aux échanges

Lyophilisats de cellules entières

Stabilité

Cellules entières

Conclusions


Stabilité

Extraits cellulaires

ViabilitéProtéases

bactériennes

HCl produit Sels du tampon borate

EauContact direct avec les DhaA

(+)

Sorption importante (20%)

Sorption totale

Conclusions


Stabilité

Extraits cellulaires

(+)

X150 heures

(+)

XJusqu’à saturation

Pas d’activité protéolytique

XPas de bactéries

entièresX

Introduction

Problématique

Résultats

Conclusions

Perspectives

Perspectives

Travailler sur des substrats communément utilisés en industrie(TCE/DCM/PCE)

Développer l’effet des sels en catalyse solide/gazOptimiser le système en vue d’une applicationOptimiser le système en vue d’une application

Déterminer quelle est l’influence du ratio sels/enzyme Tester d’autres sels (KCl, LiCl, NaCl) Travailler avec des lyophilisats dépourvus totalement de sels

Comprendre l’effet des sels pour optimiser l’activité et la stabilité du

biocatalyseur

Optimiser la géométrie du réacteur

Régénérer le biocatalyseur Par évaporation (ne fonctionne pas car le HCl est neutralisé par les sels) Dialyse (pas viable économiquement) Trouver une autre méthode

Perspectives

Développer l’effet des sels en catalyse solide/gaz

Tester d’autres sels sur d’autres réactions avec des enzymes sensibles aux

dénaturations thermiques

Tester des enzymes d’intérêt sensibles à des aw élevées (ADH/Lipase pour des

réactions d’hydrolyse)

Effet des sels sur les dénaturations thermiques en réacteur solide/gaz Utiliser le réacteur solide/gaz comme outil

pour extrapoler aux milieux non-conventionnels

Développer l’étude de l’effet des sels en catalyse solide/gaz

Perspectives

Développer l’effet des sels en catalyse solide/gazPublications

Marchand P., Lamare S., Legoy M.-D. and Goubet I.Dehalogenation of gaseous 1-chlorobutane by dehydrated whole cells: influence of the microenvironment of the halidohydrolase on the stability of the biocatalyst.

Marchand P., Crémont M., Lamare S. and Goubet I.Dehalogenation of a gaseous effluent by dehydrated whole cells in a solid/gas reactor: Study of the catalyst’s stability

Marchand P., Rosenfeld E., Lamare S., Maugard T., Erable B., Goubet I.Coupled oxidation–reduction of butanol–hexanal by resting Rhodococcuserythropolis NCIMB 13064 cells in liquid and gas phases (Volume 43, Issue 6, 6 November 2008, Pages 423-430)

Remerciement

Le Pr Sylvain Lamare : Directeur du laboratoire LIENSs

Le Pr Marie-Dominique Legoy : Directeur de thèse

Les Pr Stéphane Vuilleumier et Didier Combes : Rapporteurs

Mme Anne Paillier et Dr Anne-Sophie Lepeuple : Examinatrices

Dr Isabelle Goubet : Directeur Scientifique

Et tous ceux qui ont participé à ce travail de près ou de loin

Développer l’effet des sels en catalyse solide/gazRemerciements

Soutenance Thèse Final

Career

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