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Anne-Laure QUETTIER Dossier scientifique Anne-Laure QUETTIER Sommaire : Curriculum vitae p. 1 Activités de recherche p. 4 DEA p.4 Thèse p. 4 Post-doctorats p. 6

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Anne-Laure QUETTIER Dossier scientifique

Anne-Laure QUETTIER

Sommaire :

Curriculum vitae p. 1 Activités de recherche p. 4 DEA p.4 Thèse p. 4 Post-doctorats p. 6

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Anne-Laure QUETTIER Dossier scientifique

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Curriculum vitae

Informations personnelles

36 Rue Mirabeau 92160 Antony [email protected] 06 42 68 05 26

Née le 29 Mars 1978 à Angers (Maine et Loire) Nationalité : Française

Titres universitaires

Septembre 2006 : Doctorat de Physiologie Cellulaire et Moléculaire des Plantes, mention Très Honorable. Thèse soutenue le 22 Septembre 2006 à l’Ecole Doctorale « logique du vivant » de l’Université Pierre et Marie Curie -Paris 6. Titre de la thèse : Implication de protéines tyrosine phosphatases dans la signalisation de l’acide abscissique chez Arabidopsis thaliana. Composition du jury :

Directeur de thèse : M. Régis MALDINEY Président du jury : M. Michel RAYMONDJEAN

Rapporteur : Mme Annie MARION-POLL Rapporteur : M. Alain VAVASSEUR

Juillet 2002 : D.E.A. Signalisation et Interactions Cellulaires et Moléculaires, école doctorale « Santé, Sciences, Technologies » de l’Université de TOURS ; mention Bien.

Juillet 2001 : Maîtrise de Biologie Cellulaire et Moléculaire et Physiologie, mention Génétique Moléculaire et Physiologie Animale, U.F.R. de Sciences, Université d’ANGERS.

Juillet 2000 : Licence de Biologie Cellulaire, U.F.R. de Sciences, Université d’ANGERS.

Juillet 1998 : D.E.U.G. Sciences de la Vie, Institut d’Ecologie Appliquée, Université Catholique de l’Ouest, ANGERS.

Juin 1996 : Baccalauréat série S, spécialité Mathématiques. Lycée Ste Agnès, ANGERS.

Parcours de recherche

Février 2009- Août 2011 : Chercheur post-doctorant à l’Institut des Sciences du Végétal (CNRS - UPR2355) à Gif-sur-Yvette.

Projet : Modulation de la dégradation des protéines dépendante de l’ubiquitine par ABP1 dans la régulation du cycle cellulaire et de la signalisation de l’auxine.

Jan. 2007-Jan. 2009: Chercheur post-doctorant au Warwick HRI, University of Warwick en Grande Bretagne.

Projet : Dégradation des huiles de réserve lors de la germination des graines d’Arabidopsis.

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Oct. 2002-Sept. 2006: Doctorante au Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Moléculaire des Plantes, UMR7180, CNRS / Université Pierre et Marie Curie Paris 6.

Projet : Signalisation de l’acide abscissique chez Arabidopsis thaliana.

Jan. 2002-Juil. 2002: Stage de D.E.A. au sein de l’E.A. 2106: "Biomolécules et Biotechnologies Végétales", Université de Tours.

Projet : Biosynthèse des alcaloïdes indoliques monoterpèniques chez Catharanthus roseus.

Juil. 2000-Oct. 2000: Stage de Maîtrise à l’Unité d'Amélioration des Plantes et des Espèces Fruitières, I.N.R.A. Angers.

Projet : Analyse de Pelargonium transgéniques pour des gènes impliqués dans la morphogenèse et la pigmentation des fleurs.

Publications

Articles scientifiques:

1. Kelly AA, Quettier AL, Shaw E, Eastmond E (2011) Seed storage oil mobilisation is important

but not essential for germination or seedling establishment in Arabidopsis. Plant Physiology

157(2):866-75.

2. Quettier AL*, Eastmond PJ*, Kroon JT, Craddock C, Adams N, Slabas AR. (2010)

PHOSPHATIDIC ACID PHOSPHOHYDROLASE1 & 2 regulate phospholipid synthesis at the

Endoplasmic Reticulum in Arabidopsis. Plant Cell (8):2796-811. * These authors contributed

equally to this work.

3. Quettier AL, Shaw E, Eastmond PJ (2008) SUGAR-DEPENDENT6 encodes a mitochondrial FAD-

dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase, which is required for glycerol catabolism

and post-germinative seedling growth in Arabidopsis. Plant Physiol., 148(1):519-28. 4. Quettier AL, Bertrand C, Habricot Y, Miginiac E, Agnès C, Jeannette E, Maldiney R. (2006) The

phs1-3 mutation in a putative dual specificity protein tyrosine phosphatase gene provokes hypersensitive responses to abscisic acid in Arabidopsis thaliana. Plant J, 47(5): 711-719.

5. Zalejski C, Zhang Z, Quettier AL, Maldiney R, Bonnet M, Brault M, Demandre C, Miginiac E,

Rona JP, Sotta B, Jeannette E. (2005) Diacylglycerol pyrophosphate is a second messenger of

abscisic acid signaling in Arabidopsis thaliana suspension cells. Plant J., 42(2): 145-152. Mise au point:

1. Eastmond PJ, Quettier AL, Kroon JT, Craddock C, Adams N, Slabas AR. (2011) A phosphatidate phosphatase double mutant provides a new insight into plant membrane lipid homeostasis. Plant Signal Behav. 6(4):526-7.

2. Quettier AL, Eastmond PJ (2009) Storage oil hydrolysis during early seedling growth. Plant Physiology and Biochemistry, 47: 485-490. Plant Lipids Special Iss. Review Paper.

Communications

Communication orale:

Implication d’une protéine tyrosine phosphatase à double spécificité dans la signalisation de l’acide

abscissique. Journée scientifique de l’Institut de biologie intégrative (IFR 83), Université Pierre et

Marie Curie, Paris, Janvier 2005.

Posters:

1. Quettier A-L, Selden K, Tromas A, Muller P, Lechner E, Genschik P, Perrot-Rechenmann.

AMUCCAS: ABP1 Modulation of Ubiquitin mediated protein degradation in Cell Cycle and

Auxin Signalling. Des Molécules aux écosystems, Colloque ANR, Montpellier, Septembre 2011.

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2. Quettier A-L, Paque S, David K, Braun N and Perrot-Rechenmann C. Use of Cellular

Immunisation to Study the Functions of the Auxin Receptor ABP1 in Arabidopsis thaliana.

Plant Gene Discovery Technologies, Vienne, Fevrier 2011.

3. Paque S, Quettier A-L, Delbarre A, Perrot-Rechenmann C. Search for Auxin Signalling

Components Downstream of ABP1. International Conference on Plant Growth Substances,

Tarragone, Juillet 2010.

4. Quettier A-L., Eastmond PJ. Studying the regulation of the TAG lipase SDP1 in Arabidopsis

thaliana seeds and young seedlings. XVIIIth International Symposium on Plant Lipids,

Bordeaux, Juillet 2008.

5. Quettier A-L, Bertrand C, Habricot Y, Miginiac E, Agnès C, Jeannette E, Maldiney R.

Involvement of the dual specificity protein tyrosine phosphatase PHS1 in ABA signalling. XVth

congrès FESPB, Lyon, Juillet 2005.

6. Quettier A-L, Agnès C, Habricot Y, Miginiac E, Ghelis T, Maldiney R. Abscisic acid signalling in

the protein tyrosine phosphatase mutant phs1-3. 6ème conférence nationale de la SFBV,

Arcachon, Mai 2005.

7. Quettier A-L Involvement of the protein tyrosine phosphatases in ABA signalling in

Arabidopsis thaliana, Doctoriales de l’Université P. et M. Curie, Fréjus, Mai 2004.

8. Jeannette E, Zalejski C, Quettier A-L, Ghelis T, Brault M, Rona JP, Bonnet M, Maldiney R,

Miginiac E, Sotta B. Phospholipidic second messengers are involved in abscisic acid-induced

RAB18 expression in A. thaliana suspension cells. 5ème Conférence nationale de la SFBV,

Orsay, Juillet 2003.

Compétences techniques

Biologie moléculaire: Clonage (technologie GATEWAY et clonage enzymatique « classique »), extractions d’acides nucléiques, production d’ADNc, techniques de PCR, RT-PCR semi-quantitative et quantitative, Northern et Southern blotting, génotypage.

Biologie végétale: culture in vitro, tests de germination, tests d’ouverture des stomates, cinétiques de croissance, transgénèse et croisement chez Arabidopsis, sélection des transformants.

Biochimie: extraction de protéines, immunoprécipitation, SDS-PAGE et électrophorèse 2D, Western blotting, préparation de peptides pour la spectrométrie de masse, chromatographie en couche mince, extraction des acides gras et analyse en chromatographie en phase gazeuse (GC), mesures d’activité enzymatique.

Biologie cellulaire : Dosage qualitatif et quantitatif de gène rapporteur (GUS), observation de tissus au macroscope et au microscope confoncal.

Informatique: Très bonne maîtrise générale sur MAC et PC, maîtrise de la suite Office, bonne connaissance de Filemaker (bases de données), connaissances de bases en programmation et création de site Internet.

Langue : Anglais parlé, lu et écrit couramment (séjour de 2 ans en Angleterre).

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Activités de recherche

DEA

L’équipe d’accueil E.A. 2106 de l’Université de Tours, au sein de laquelle j’ai réalisé mon stage de

DEA, étudie la régulation du métabolisme des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) et des

isoprénoïdes chez la Pervenche de Madagascar.

L’isopentényl diphosphate (IPP) est le précurseur universel des terpènes. Sa biosynthèse dans les

végétaux implique deux voies distinctes, la voie du mévalonate et la voie du méthylérythritol

phosphate (MEP). A l’époque de mon D.E.A, la régulation des gènes de la voie du MEP était encore

mal connue et l’objectif de mon travail était d’identifier de nouveaux acteurs de la voie du MEP chez

Catharanthus roseus. Dans un premier temps, j’ai isolé un ADNc partiel du gène crgcpe qui code pour

une enzyme impliquée dans la conversion du dernier intermédiaire connu de la voie du MEP. J’ai

montré que l’expression du gène crgcpe dans des suspensions cellulaires C20D productrices ou non

d’alcaloïdes était corrélée à la production des AIM. J’ai également étudié l’impact de la lumière et du

développement sur la transcription des gènes codant pour les enzymes de la voie du MEP. J’ai ainsi

montré par northern blots que l’expression des gènes crdxs, crdxr et crmecs augmentait

transitoirement au cours du développement des plantules.

Thèse

J’ai réalisé mon travail de thèse au sein du Laboratoire de Physiologie Cellulaire et Moléculaire

des Plantes (UMR CNRS-Université de Paris6), dans l’équipe « Signalisation de l’Acide Abscissique ».

Le sujet de ma thèse était l’étude des protéines tyrosine phosphatases dans la signalisation de l’acide

abscissique chez Arabidopis thaliana.

L’acide abscissique (ABA) régule de nombreux aspects de la croissance et du développement des

plantes ; il est aussi produit lors de stress environnementaux et déclenche des réponses cellulaires de

protection contre ces stress. Les travaux menés par l’équipe « Signalisation de l’acide abscissique »

s’organisent autour de deux thématiques : le rôle de l’acide phosphatidique et de son produit de

dégradation, le diacylglycerol pyrophosphate (DGPP), dans la signalisation de l’ABA et la mise en

évidence de l’implication de protéines tyrosine phosphatases dans cette même voie de signalisation.

C’est dans cette dernière thématique que j’ai effectué mon travail de thèse. En effet, une étude

pharmacologique, menée au Laboratoire en 2001, avait permis de démontrer que des activités

Protéines Tyrosine Kinases (PTK) et Protéines Tyrosine Phosphatases (PTP) étaient nécessaires pour

transmettre le signal ABA dans les cellules en suspension. Au cours de ma thèse, j’ai tenté d’identifier

des PTK et PTP activées par l’ABA, ainsi que leurs substrats.

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Afin d’identier une protéines tyrosine phosphatase impliquée dans la signalisation de l’ABA, nous

avons choisi de développer une approche par génétique inverse. Il existe dans le génome

d’Arabidopsis, 19 gènes putatifs codant pour des PTP et j’ai obtenu des lignées d’insertion T-DNA

pour 17 de ces gènes.

L’analyse des phénotypes des mutants de PTP a été menée par rapport à plusieurs réponses à

l’ABA. Principalement, la germination, l’expression de gènes et les mouvements des stomates ont été

étudiés. En testant la germination des

mutants de PTP sur ABA, un mutant

hypersensible à l’ABA, nommé phs1-3, a

pu être isolé. Le gène muté,

PROPYZAMIDE HYPERSENSITIVE1

(PHS1), code pour une DsPTP putative

précédemment impliquée dans la

régulation des microtubules 1 . La

germination, l’expression des gènes

dans les graines et dans les plantules et

la croissance de la racine primaire ont été mesurées chez le mutant phs1-3, en présence d’ABA.

Enfin, l’ouverture des stomates du mutant a été étudiée, in planta et lors d’un traitement par l’ABA.

Le phénotype de phs1-3 est semblable à celui du sauvage en ce qui concerne la croissance des

racines et l’expression des gènes dans la plantule. En revanche, phs1-3 est hypersensible à l’ABA au

cours de la germination et du développement post-germinatif ainsi que pour le fonctionnement des

stomates (figure 1). Ainsi, j’ai identifié un nouveau régulateur négatif de la signalisation de l’ABA

codée par le gène PHS1. Cet aspect de mon travail de thèse a été publié dans « The Plant Journal »

en 20062.

Pour mettre en évidence des changements de phosphorylation consécutifs à la perception de

l’ABA, j’ai aussi développé une stratégie d’étude mettant en œuvre plusieurs techniques

biochimiques. Deux approches ont été mises en œuvre en parallèle. La première approche consistait

à enrichir des extraits de protéines totales en protéines phosphotyrosylées avant une détection par

western blot. Pour cela, les échantillons extraits de cellules en suspension non traitées ou traitées

par 10 µM d’ABA ont été immunoprécipités avec un anticorps dirigé contre les phosphotyrosines. La

deuxième approche consistait à détecter directement les protéines phosphotyrosylées par western

blot, sans étape d’enrichissement. Pour cette approche, les protéines totales étaient séparées par

électrophorèse en 1 dimension (E1D) ou 2 dimensions (E2D). Cette étude pourrait être définie

comme l’étude du phosphoprotéome des cellules en suspension d’Arabidopsis et du changement

intervenant dans celui-ci lors de la perception du signal ABA. La révélation des protéines

1 Naoi K and Hashimoto T (2004) Plant Cell 16: 1841-1853 2 Quettier AL, Bertrand C, Habricot Y, Miginiac E, Agnes C, Jeannette E, Maldiney R (2006) Plant J 47: 711-719

Figure 1 : Caractérisation du mutant phs1-3. A) Taux de germination à 3j sur MS 0.5X supplémenté en ABA. B) Expression du gène RAB18 dans des graines semées sur ABA. Mesure par RT-qPCR. C) Ouverture des stomates 4h après de début de la période d’illumination.

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phosphotyrosylées par western blot après séparation des protéines totales en E2D m’a permis de

localiser 7 protéines dont le niveau de phosphorylation variait après un traitement de 10 min avec

100 µM ABA. Deux de ces protéines étaient moins phosphorylées après traitement et les 5 autres

étaient plus phosphorylées. Ces résultats encourageants n’ont pas pu être répétés dans le temps qui

m’était imparti pour effectuer ma thèse. L’étape suivante aurait été d’identifier ces protéines grâce à

la spectrométrie de masse. Les résultats que j’ai obtenus montraient toutefois que l’approche

envisagée pouvait apporter des résultats et méritait d’être poursuivie et exploitée dans le cadre de

l’étude de la signalisation de l’ABA.

J’ai aussi participé à l’autre thématique du Laboratoire, l’étude du rôle de l’acide phosphatidique

et de son produit de dégradation, le DGPP dans la signalisation de l’ABA. J’ai confirmé que l’ajout de

DGPP sur les cellules en suspension pouvait moduler l’expression de gènes répondant à l’ABA. Ce

résultat apportait un argument supplémentaire permettant d’affirmer que le DGPP est un

messager secondaire de l’ABA. Cette participation au travail de thèse de C. Zalejski m’a permis

d’être troisième auteur d’un article paru en 2005 dans « Plant Physiology »3.

Post-Doctorats

1er post-doc : 2 ans en Angleterre à Warwick.

Suite à ma thèse, j’ai été recrutée par Peter Eastmond au Warwick HRI, un centre de recherche

associé à l’Université de Warwick en Angleterre, pour étudier la régulation de la biosynthèse et de la

dégradation des phospholipides dans les graines.

La germination est suivie par une phase de croissance rapide de la plantule qui doit établir un

système racinaire et acquérir sa capacité de photosynthèse. Pour permettre cette croissance, la

plantule dégrade les réserves qui ont été stockées dans la graine au cours de la maturation de celle-

ci. Ces réserves peuvent être de nature protéique, glucidique ou lipidique mais le type le plus

commun est constitué par les huiles, stockées sous la forme de triacylglycérols (TAG). La plante

modèle Arabidopsis thaliana possède une graine à réserves lipidiques et constitue donc un bon

modèle d’étude du catabolisme des lipides au cours de la germination et de l’établissement de la

plantule. L’étape initiale de la dégradation des TAG est catalysée par une lipase qui hydrolyse les TAG

en acides gras et glycérol. Les acides gras sont transportés dans le glyoxysome où ils sont activés en

acyl-coA, lesquels sont catabolisées par la β-oxydation des acides gras. L’acétyl-coA produit est enfin

converti en glucides via le cycle du glyoxylate et la néoglucogenèse. Le développement de mutants

-oxydation des acides gras est compromis et s’arrête avant la germination ou

précocement au cours de la croissance post-germinative. Cette croissance peut être rétablie en

enrichissant le milieu de culture avec une autre source de carbone, tel que le saccharose. Ce

phénotype dépendant du sucre (sugar dependant, sdp) a été utilisé pour cribler une population de

mutant EMS dans le but d’identifier de nouveaux loci essentiels à l’utilisation des huiles de réserve.

Six nouveaux loci, dénommés sdp1 à sdp6, ont été isolés au cours de ce crible4. Le gène SDP1 code

pour une triacylglycérol lipase et est le premier gène végétal pour lequel on a pu démontrer un rôle

3 Zalejski C, Zhang Z, Quettier AL, Maldiney R, Bonnet M, Demandre C, Miginiac E, Rona JP, Sotta B, Jeannette E (2006) Plant

Physiol 42 : 145-152 4 Eastmond PJ (2006) Plant Cell 18: 665-675

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physiologique dans la dégradation des lipides de réserve4,5. La protéine SDP1 est une TAG lipase de

type PATATIN-like (PTL). Elle hydrolyse les TAG préférentiellement au di-acylglycérols et mono-

acylglycérols. Les mutants sdp1 ne sont pas entièrement déficients pour la dégradation des TAG, ce

qui suggère une redondance moléculaire partielle. Or, le génome d’Arabidopsis comporte 3 gènes

codant potentiellement pour des PTL: SDP1, SDP1-like et ATGL-like. De plus, la protéine CGI58-like a

été décrite chez A. thaliana comme possédant des activités enzymatiques de type TAG lipase,

phospholipase A et acide lysophosphatidique acyltransferase.

J’ai participé à un travail développé au laboratoire visant à déterminer si les protéines SDP1-Like,

ATGL-like et CGI58-like étaient, comme SDP1, impliquées dans la dégradation des TAG. Pour cette

étude, j’ai participé à la caractérisation des mutants d’insertion sdp1L-1 et sdp1L-2 ainsi qu’à celle du

double mutant sdp1-5 sdp1L-2. D’autre part, j’ai produit les constructions pSDP1::SDP1-HA et

p35S ::SDP1-TAP utilisées pour complémenter les mutants sdp1-5 et sdp1L-2. Les conclusions de ce

travail sont décrites dans un article publié au journal « Plant Physiology »6. Les constructions

utilisées dans l’article décrit ci-dessus ont été réalisées, avec d’autres, dans le but de fournir au

laboratoire de Peter Eastmond les outils qui lui permettraient d’étudier les régulations du gène

SDP1 et de la protéine qu’il code. En effet, certains résultats suggèrent que SDP1 est régulée au

niveau post-traductionnel ou post-transcriptionnel. Afin d’être à même de suivre à la fois l’activité du

promoteur SDP1 et l’accumulation de la protéine SDP1, j’ai créé des lignées gène-rapporteur

(pSDP1::GUS), et des lignées de fusions traductionnelles (pSDP1::SDP1-HA, pSDP1::SDP1-GFP,

p35S::SDP1-TAP).

Parallèlement à ce travail, je me suis appuyée sur les données de clonage positionnel disponibles

à mon arrivée pour identifier le gène muté dans les plantes sdp6. Le phénotype sdp6 est lié à une

mutation dans le gène At3g10370 codant une glycerol-3-phosphate déshydrogénase dépendante de

la flavine (FAD-GPDH). Des études précédentes ont proposé l’implication de la FAD-GPDH dans la

dégradation du glycérol et l’homéostasie du NAD+/NADH7. Les données biochimiques que nous avons

obtenues dans les mutants sdp6 confirment ces rôles mais pour expliquer le phénotype sugar

dependant de sdp6, l’absence de dégradation du glycérol n’est pas suffisante. En revanche, j’ai

montré que les plantules sdp6 accumulaient un taux important de glycerol-3-phosphate qui peut

bloquer la néoglucogenèse via l’inhibition de la phosphoglucose isomérase8,9 (figure 2). De plus,

l’altération de l’état redox des plantules sdp6 entraîne une hypersensibilité du mutant à l’ABA et au

stress salin. Ces résultats sont décrits dans un article publié au journal « Plant Physiology »8.

5 Quettier AL, Eastmond PJ (2009) Plant Physiol Biochem 47:485-490 6 Kelly AA, Quettier AL, Shaw E, Eastmond PJ. (2011) Plant Physiol 157(2):866-75. 7 Shen W, Wei Y, Dauk M, Tan Y, Taylor DC, Selvaraj G, Zou J (2006) Plant Cell 18: 422-441 8 Quettier, A. L., E. Shaw, et al. (2008). Plant Physiol 148(1): 519-28. 9 Aubert S, Gout E, Bligny R, Douce R (1994) J Biol Chem 269: 21420-21427

Figure 2: Modèle décrivant le rôle de SDP6 dans le catabolisme du glycérol et l’homéostasie NADH/NAD+ dans les plantules d’Arabidopsis. Gly : glycérol, FA : acides gras, G3P : glycérol-3-phosphate, DHAP : dihydroxyacetone phosphate, F6P : fructose 6 phosphate, G6P : glucose 6 phosphate, suc : saccharose, Q représente le pool d’ubiquitone mitochondrial. SDP1 : TAG lipase, GLI1 : glycérol kinase, SDP6 : GPDH FAD-dépendente, GPDHc : GPDH NAD-dépendente cytosolique, PGI : phosphoglucose isomerase.

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Le troisième projet sur lequel j’ai travaillé était réalisé en collaboration avec le laboratoire du Pr

Slabas à Durham. La biosynthèse des phospholipides est essentielle à la construction de la plupart

des membranes cellulaires chez les eucaryotes. Toutefois, la régulation de ce processus est encore

mal comprise chez les plantes. Le but de ce projet était de caractériser deux gènes codant pour des

phosphatidates phosphatases dépendantes du Mg2+. Chez la levure (Saccharomyces cerevisiae),

l’acide phosphatidique (PA) joue un rôle clef dans la régulation transcriptionnelle de la biosynthèse

des phospholipides et il a été démontré que le taux de PA dans la cellule est contrôlé par une

phosphatidate phosphatase dépendante du Mg2+, Pah1p10. Nous avons montré chez Arabidopsis, que

deux phosphatidate phosphatases dépendantes du Mg2+ (PAPH1 et PAPH2) agissent en redondance

pour réprimer la biosynthèse des phospholipides au niveau de la membrane du réticulum

endoplasmique (RE). Les feuilles du double mutant paph1 paph2 contiennent près de 2 fois plus de

PA, de phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamide (PE) et phosphatidylinositol que celles

des plantes sauvages (figure 3A). De plus, le double mutant incorpore la [14C] choline dans la PC deux

fois plus vite que chez le sauvage. J’ai pu observer par microscopie confocale que le double mutant

présentait une production accrue de membrane du RE (figure 3B). J’ai aussi démontré que le taux

de transcrits de trois gènes qui codent pour des enzymes clefs de la synthèse de la phospho-

choline, PC et PE est accru chez le double mutant. Notre étude montre que bien que les

phosphatidates phosphatases sont des éléments clefs de la régulation de la biosynthèse des

phospholipides, conservés chez la levure et chez les plantes. Un article décrivant ces travaux et pour

lequel je suis co-premier auteur a été publié dans « The Plant Cell » en 201011.

2d post-doc : depuis Février 2009, à Gif-Yvette, Paris-France.

Depuis Février 2009, je travaille dans l’équipe « Signalisation de l’auxine » au sein de l’ISV (UPR

2355-CNRS) sous la direction de Catherine Perrot-Rechenmann. Je participe à un projet ANR blanc

(AMUCCAS) pour lequel j’analyse la régulation par protéolyse des effecteurs du cycle cellulaire, en

réponse à l’auxine et dans un contexte d’inactivation du récepteur de l’auxine, ABP1.

L’auxine contrôle de nombreux aspects de la croissance et du développement des plantes. Au

niveau cellulaire, l’auxine agit en influençant l’élongation, la division et la différenciation cellulaires.

La perception de l’auxine par la cellule se fait via deux types de récepteurs. La famille des TIR/AFBs

comporte 6 gènes codant des protéines F-BOX entrant dans le complexe ubiquitine ligase E3 SCFTIR/ABF

qui dégrade les inhibiteurs transcriptionnels AUX/IAAs. La fixation de l’auxine par les TIR/AFB et leurs

10 Carman, G.M. and Henry, S.A. (2007) J Biol. Chem. 282, 37293-37297. 11 Eastmond PJ, Quettier AL, Kroon JT, Craddock C, Adams N, Slabas AR. (2010) Plant Cell.22(8):2796-811

Figure 3 : A) Quantité relative des différentes classes de lipides polaires extraits des feuilles du double mutant pah1 pah2. B) Morphologie du réticulum endoplasmique du double mutant. 1 et 2 : plante sauvage ; 3 et 4 : double mutant pah1 pah2. Le RE a été visualisé grâce à l’expression transitoire d’une GFP adressée au lumen du RE.

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substrats AUX/IAA et la dégradation consécutive de ces derniers permet la transcription des gènes de

réponse à l’auxine12. La protéine ABP1 quant à elle, lie l’auxine au niveau de la membrane plasmique

et est probablement à l’origine d’une cascade de signalisation faisant intervenir plusieurs

intermédiaires encore inconnus. L’étude du rôle d’ABP1 in vivo a été longtemps bloquée par le

caractère létal au stade embryonnaire de la mutation nulle pour ABP113.

Cependant, l’équipe de Catherine Perrot-Rechenmann a mis au point un système inductible

permettant l’inactivation de la protéine ABP1 par une approche d’immunisation cellulaire.

L’immunisation cellulaire consiste à faire produire par les cellules de la plante un fragment

d’anticorps de type scFv (single chain variable fragment). Ce scFv a été construit à partir d’un

anticorps monoclonal anti-ABP1 qui bloque la protéine ABP1 dans une configuration inactive. Enfin,

la construction scFv introduite dans les plantes est sous le contrôle d’un promoteur inductible par

l’éthanol ce qui a permis d’obtenir une lignée de plantes conditionnelles pour ABP1.

L’inactivation d’ABP1 affecte fortement le développement et la croissance des plantes quelque

soit le stade de développement de la plante au moment de l’inactivation14, 15. Au niveau moléculaire,

il a été montré qu’ABP1 interférait avec la régulation transcriptionnelle des AUX/IAA, sans doute au

niveau d’une boucle de rétrocontrôle déjà caractérisée15. Afin d’approfondir cette hypothèse, la

stabilité des protéines AUX/IAA a été étudiée dans le fond inactivé pour ABP1 grâce aux rapporteurs

moléculaires AXR3NT-Gus et axr3.1NT-Gus (protéine mutée qui n’est pas reconnue par la F - box

TIR1). Il a été observé que la protéine axr3.1NT-Gus était exprimée normalement et s’accumulait

dans les mutants comme dans le sauvage. En revanche, la vitesse de dégradation du rapporteur

AXR3NT-Gus était grandement augmentée dans le fond inactivé pour ABP1. Il en a été conclut

qu’ABP1 modulait la dégradation des AUX/IAA. Afin de déterminer quelle pouvait être la nature de

cette modulation, plusieurs pistes ont été envisagées : 1) soit ABP1 régulait spécifiquement la

signalisation auxinique via une modification de TIR1, 2) soit cette modulation avait lieu via la

modification post-traductionnelle des AUX/IAA, 3) soit l’action d’ABP1 était plus générale et modifiait

l’activité des complexes SCF ou des E3 ligases de type CULLIN.

J’ai intégré l’équipe de Catherine Perrot-Rechenmann alors que ces différentes pistes étaient en

cours d’investigation et mon investissement dans ce projet a permis d’apporter quelques éléments

de réponse. Des complexes SCF sont essentiels pour la signalisation hormonale non seulement de

l’auxine mais encore du jasmonate et des gibbérellines. Dans le cas du jasmonate dont la

signalisation semble très proche de celle de l’auxine, la quantification du rapporteur JAZ1-GUS m’a

permis de montrer que la vitesse de dégradation des JAZ n’est pas différente dans les plantules

inactivées pour ABP1 par rapport aux plantules sauvages. Pour la voie des gibbérellines, j’ai montré

qu’un rapporteur de protéine DELLA, RGA1-GFP s’accumulait plus dans les plantules inactivées pour

ABP1. Les résultats que j’ai obtenus, en corrélation avec d’autres résultats du laboratoire,

suggèrent qu’ABP1 n’agit pas sur la stabilité de tous les substrats de complexes SCF, ce qui exclut

un effet générique sur les complexes ligase E3 CULLIN1 et milite en faveur d’un effet spécifique sur

les substrats dépendants de l’auxine. Ces résultats, ainsi que d’autres travaux s’intègreront dans un

article actuellement en cours de préparation.

12 Mockaitis K, Estelle M. Annu Rev Cell Dev Biol. 2008;24:55-80. 13 Chen JG, Ullah H, Young JC, Sussman MR , Jones AM (2001). Genes Dev. 15, 902-911. 14 Braun N, Wyrzykowska J, Muller P, David K, Couch D, Perrot-Rechenmann C , Fleming AJ (2008). Plant Cell. 20, 2746-2762. 15 Tromas A, Braun N, Muller P, Khodus T, Paponov IA, Palme K, Ljung K, Lee J-Y, Benfey P, Murray JAH, Scheres B ,

Perrot-Rechenmann C (2009). PLoS ONE. 4, e6648.

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Les données obtenues au Laboratoire sur les cellules en suspension de tabac et les méristèmes

racinaires d’Arabidopsis indiquent qu’ABP1 contrôle l’entrée dans le cycle cellulaire à la transition

G1/S15,16. La surexpression d’un régulateur positif de la transition G1/S, la cycline D 3.1 (CYCD3.1) ou

l’inactivation d’un régulateur négatif, Retinoblastoma-related (RBR), permettent de réactiver le cycle

cellulaire dans certaines cellules souches de la racine de plantes inactivées pour ABP1. Néanmoins,

l’intégrité du méristème apical racinaire n’est pas restaurée ce qui suggère que d’autres effecteurs

du cycle peuvent être les cibles d’ABP115. La régulation du cycle cellulaire a été largement étudiée

chez les animaux et chez les végétaux et il est désormais bien admis que la régulation fine du cycle a

lieu via l’adressage des acteurs du cycle au protéasome. Les données sur la stabilité des protéines

mais aussi l’expression génique montrent que l’auxine agit sur des régulateurs positifs (les E2Fa/b et

leur partenaire DPa, qui induisent l’expression des gènes de la phase S) mais aussi sur les régulateurs

négatifs du cycle (les Kip Related Proteins –KRP- qui inhibent les complexes CDK-CYC et le complexe

E2Fc-DPb qui réprime l’expression des gènes de la phase S) 17,18,19. Les résultats présentés plus haut

suggérant qu’ABP1 agit sur la stabilité des protéines régulées par l’auxine, il apparaissait important

de déterminer si l’effet positif d’ABP1 sur l’entrée dans le cycle cellulaire pouvait être corrélé au

contrôle de la stabilité protéique des régulateurs positifs (E2Fa ou b) ou négatifs (E2Fc, KRP1, KRP2)

du cycle cellulaire (figure 4).

Des essais préliminaires réalisés avec des anticorps dirigés contre certaines de ces protéines ont

été infructueux. En effet, les anticorps utilisés n’étaient pas suffisamment performants pour détecter

les protéines endogènes. J’ai donc cloné les régulateurs du cycle cellulaire potentiellement ciblées

par ABP1. Toutes les protéines clonées ont été exprimées sous le contrôle de promoteurs forts mais

inductibles ou ayant des profils d’expression différents ce qui devrait me permettre d’obtenir des

plantes viables même en cas d’association de plusieurs constructions. De plus, les protéines ont été

fusionnées à des étiquettes qui me permettront de suivre leur accumulation dans les plantules par

western blot. A l’heure actuelle, j’ai obtenu des plantes exprimant les constructions pour les

protéines KRP1, E2Fa, E2Fc, DPa, DPb et SKP2A et je réalise la caractérisation phénotypique des

16 David KM, Couch D, Braun N, Brown S, Grosclaude J , Perrot-Rechenmann C (2007). Plant J. 50, 197-206. 17 del Pozo JC, Boniotti MB , Gutierrez C (2002). Plant Cell. 14, 3057-3071. 18 Jurado S, Díaz-Triviño S, Abraham Z, Manzano C, Gutierrez C , del Pozo JC (2008). The Plant Journal. 53, 828-841. 19 Magyar Z, De Veylder L, Atanassova A, Bako L, Inze D , Bogre L (2005). Plant Cell. 17, 2527-2541.

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plantes homozygotes ayant une expression stable. Le gène SKP2A code pour la F-box responsable de

l’adressage d’E2Fc au proteasome. Récemment, il a été démontré que SKP2A est capable de lier

l’auxine et que cette liaison favorise l’interaction avec E2Fc et DPb et leur adressage au

protéasome20. Ces résultats font de SKP2A et de ses cibles des candidats prioritaires pour mon étude,

c’est pourquoi je concentre actuellement mon effort sur la caractérisation d’une lignée surexprimant

la construction MYC::SKP2A. De plus, j’ai introduit par croisement une construction

p35S::GFP::6HA::KRP2 dans les plantes conditionnelles pour ABP1. Dans ces plantes, j’ai observé que

la surexpression de la protéine KRP2 entraine une réversion du phénotype de perte de fonction

d’ABP1, au moins dans certaines conditions de croissance.

20 Jurado S, Abraham Z, Manzano C, Lopez-Torrejon G, Pacios LF, Del Pozo JC (2010) Plant Cell 22: 3891-3904