Skuldtech Manuel Utilisation DAVE 310811

INITIATION AUX TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE ASSOCIEES A LHYBRIDATION SUR MEMBRANEA partir de lutilisation dune

TROUSSE DE DETECTION POUR LA RECHERCHE SIMULTANEE DE DEUX PATHOGENES VIRAUX

24 ou 48 testsPour une utilisation in vitro uniquement. Stockage du kit entre +2 et +8C. SkuldtechTlphone : +33 (0)467 419 748 / Fax : +33 (0)467 457 726 Adresse : 134, rue du Curat Bt. Amarante 34090 Montpellier France Email : [email protected] Web : http://www.skuldtech.com/DAVE.html

SOMMAIRE

PRESENTATION DU KIT MINI-ARRAY ENSEIGNEMENT A- OBJECTIFS VISES B- DESCRIPTION, PRINCIPE ET PERFORMANCE DU KIT MINI-ARRAY C- COMPOSITION DU KIT ET MATERIELS NECESSAIRES 1. REACTIFS, MATERIELS ET CONDITIONNEMENT 2. MATERIELS ET PRODUITS CHIMIQUES NECESSAIRES NON FOURNIS PROTOCOLE ET ETAPES POUR LUTILISATION DU KIT MINI-ARRAY ENSEIGNEMENT A- PREPARATION DES ECHANTILLONS (~ 2 HEURES) B- REACTION DE POLYMERISATION EN CHAINE (PCR) (~ 2 HEURES 30)

3 3 3 5 5 6

7 8 10

C- ANALYSE PAR ELECTROPHORESE EN GEL DAGAROSE (CONTROLE DE LA REACTION DE PCR, FACULTATIF) 12 1. PREPARATION DUN GEL DAGAROSE A 1,2 % : 2. DEPOT DES ECHANTILLONS 3. LECTURE DES RESULTATS D- HYBRIDATION ET REVELATION COLORIMETRIQUE (~ 2 HEURES) 1. PROTOCOLE DHYBRIDATION 2. PROTOCOLE DE REVELATION COLORIMETRIQUE E- INTERPRETATION ET VALIDATION DES RESULTATS 1. INTERPRETATION DES RESULTATS DE LELECTROPHORESE EN GEL DAGAROSE 2. INTERPRETATION DES RESULTATS DE LHYBRIDATION SUR MEMBRANE ANNEXES TAMPONS DELECTROPHORESE TAMPON DE CHARGE COLORE DE DEPOT ACETATE DE SODIUM (3 M) ABREVIATIONS 12 13 13 14 14 14 19 19 20 21 21 21 22 22

Skuldtech Manuel Utilisation DAVE_310811

2 / 24

Prsentation du kit Mini-Array EnseignementA- Objectifs vissAfin de rpondre aux besoins des enseignants en matire d'initiation aux techniques de biologie molculaire associes lhybridation sur membrane, Skuldtech a adapt son kit Mini-Array (Dual Aqua Vir) permettant la dtection de deux pathognes viraux en une approche guide et pdagogique de ces techniques. Grce au kit Mini-Array version Enseignement permettant la dtection de deux ADN viraux, les techniques et notions suivantes sont abordes : Extraction et purification dacides nucliques, Amplification dacides nucliques par PCR (principe et mise en uvre de la Raction de Polymrisation en Chane), Analyse de fragments nucliques par lectrophorse en gel dagarose, Mise en uvre dune technique de dtection par hybridation molculaire ( laide de sondes froides ) sur membrane (mini puce ADN), Mise en uvre dune analyse ou dun contrle, Recherche et analyse de squences nucliques dans une base/banque de donnes.

B- Description, principe et performance du kit Mini-ArrayIl repose sur lamplification enzymatique de gnes par la technique de PCR (Polymerase Chain Reaction). Il utilise des amorces spcifiques des pathognes recherchs. Lextraction de lADN viral se fait par simple clarification. Un ADN tmoin positif de la raction de PCR et de lhybridation appel contrle interne est prsent dans chaque raction. La visualisation des produits amplifis seffectue par hybridation sur des membranes prtes lemploi, suivie dune rvlation colorimtrique immunoenzymatique. Le kit fournit les ractifs pour raliser 24 ou 48 tests. Les analyses peuvent tre ralises en parallle en moins de 5 heures. Grce un seuil de dtection trs lev (voir graphique ci-dessous), le kit Mini-Array est une mthode trs sensible de diagnostic permettant une dtection prcoce de pathognes.


3 / 24

+Dot Blot Mini-Array Electrophorse

dilutions logarithmiques

10 000 fois plus sensible que la mthode de Dot Blot. 100 fois plus sensible que la mthode de dtection des produits de PCR par lectrophorse en gel dagarose.


4 / 24

C- Composition du kit et matriels ncessaires1. Ractifs, matriels et conditionnement - 25 ou 50 membranes prtes l'emploi (Ready to use Mini-Array Membranes)Schma reprsentatif dune membrane prte lemploi avant utilisation. Seuls, apparaissent les spots colors de lorientation. Spot dorientation orange gauche Spot dorientation jaune droit

- 1 ou 2 microplaque(s) de 24 puits - 25 ou 50 tubes pour PCR (barrettes tubes de 0,2 ml) - Pince (manipulation des membranes) - Manuel dutilisation - Echantillons positifs et ngatifs dADN (plasmides) : Hemolymph infected by WSSV : 4 ml Hemolymph infected by IHHNV : 4 ml Not infected hemolymph : 4 ml Quantits 24 tests 48 tests 1 ml 30 l 75 ml 75 ml 75 ml 250 l 14 ml 8 ml 500 l 50 ml 60 l 75 ml 75 ml 75 ml 250 l 25 ml 15 ml 500 l 50 ml

Solutions/Ractifs Ractif d'Amplification 1 : Solution A1 Ractif d'Amplification 2 : Solution A2 Solution de Lavage 1 : Wash Solution 1 : W1 Solution de Lavage 2 : Wash Solution 2 : W2 Solution de Lavage 3 : Wash solution 3 : W3 Anticorps anti-digoxignine (100X) : Anti-DIG Ab Tampon de dilution de lanticorps : Antibody Dilution Buffer Solution de rvlation : TMB Substrate Eau strile : Sterile water Eau distille : Distilled Water

Flacon/Tube

2 x 1 ml solution bouchon jaune solution bouchon rouge solution translucide solution translucide solution bleu clair solution bouchon bleu solution bleu fonc flacon opaque solution translucide solution translucide

Tous les ractifs et solutions se conservent entre +2 et +8C.Skuldtech Manuel Utilisation DAVE_310811 5 / 24

2. Matriels et produits chimiques ncessaires non fournis Les produits doivent tre de qualit de biologie molculaire. - Thermocycleur - Micropipettes de 1-10 l, 20-200 l, 200-1000 l - Embouts striles filtres pour micropipettes - Microtubes striles de 1,5 ou 2 ml - Pilons en plastique pour le broyage des tissus (exemple : VWR, rf. 431-0098) - Gants non poudrs - Seringues et aiguilles striles - Bain-marie - Vortex - Centrifugeuse de paillasse - Centrifugeuse rfrigre (> 10000 g) - Agitateur orbital - Pompe vide (facultatif mais recommand) - Ethanol pur (min 95%) - Phnol/chloroforme/alcool isoamylique ultra pur (25:24:1) (not PCI) - Actate de sodium tri-hydrat (mini 99%) 3M, pH 5,2 - Glace Pour lanalyse par lectrophorse (contrle de la raction PCR, tape facultative) : - Agarose - Tampon dlectrophorse: TAE (ou TBE) - Bromure d'Ethidium (BET) - Tampon de charge 3X (BSU) - Appareil dlectrophorse Nous vous recommandons de lire lensemble du protocole avant de commencer les essais et de le respecter scrupuleusement. La raction de PCR gnre de grandes quantits dADN amplifi. Trs peu de molcules dADN contaminant suffisent gnrer aprs amplification un rsultat faussement positif. Il est donc important de bien sparer la zone danalyse des produits amplifis de la zone o sont manipuls les chantillons analyser.


6 / 24

Protocole et tapes pour lutilisation du kit Mini-Array Enseignement(A) Prparation des chantillons (2 heures) (B) Raction de polymrisation en chane (PCR) (2 heures 30) (C) Contrle de la PCR (1 heure) (D) Rvlation colorimtrique (2 heures)


7 / 24

A- Prparation des chantillons (~ 2 heures)Utiliser des embouts striles avec filtres jetables pour chaque pipetage du surnageant. Manipuler soigneusement et viter les contaminations entre les chantillons. Diffrents chantillons peuvent tre utiliss pour effectuer ce protocole : chantillons fournis : inclus dans le kit enseignement, chantillons de tissus : crevettes du march de type Gambas (rayon surgel). Echantillons fournis 1. Identifier analyser. 2. Prlever 200 l de chacun des chantillons (positif et ngatif) dans un microtube strile. 3. Passer en A5 ci-dessous. chaque chantillon Echantillons de tissu 1. Identifier chaque chantillon analyser. 2. Prlever environ 3 mm3 ou 200 l dhmolymphe de tissu dans un (branchie, plopode, hpatopancras, il) microtube strile de 1,5 ml. 3. Ajouter 300 l deau strile (du kit) et broyer avec un pilon adapt. 4. Centrifuger 10000 g pendant 5 min, puis rcuprer 200 l de surnageant. Noter la taille du culot : si le culot est important, au moment de la PCR, diluer lchantillon (voir A7 ci-dessous).

Les tapes suivantes de prcipitation de lADN viral doivent tre ralises dans la glace + 4C. 5. Sous hotte chimique, ajouter 200 l de PCI (Phnol:chloroforme:alcool isoamylique, 25:24:1) aux 200 l de surnageant ou de chacun des deux chantillons fournis. Attention, le Phnol:chloroforme:(alcool isoamylique) est un produit toxique : il faut se protger les yeux et la peau (voir tableau phrases de risques , en fin de document). Centrifuger temprature ambiante 6500 g pendant 10 min. Aprs centrifugation, on observe une phase contenant le phnol/chloroforme, une interface et une phase suprieureSkuldtech Manuel Utilisation DAVE_310811 8 / 24

aqueuse. LADN se trouve exclusivement dans la phase aqueuse. Prlever 75% de la phase aqueuse dans un nouveau microtube strile. 6. Ajouter 2,5 volume dthanol pur (froid, 4C) et 0,1 volume dactate de sodium (3M, pH 5,2). Vortexer lchantillon et centrifuger 4C 15000 g pendant 30 min. Reprer le culot dADN. Enlever le surnageant la pipette. Laver le culot dADN avec 0,5 ml dthanol 75% (froid, 4C). Centrifuger 4C 15000 g pendant 5 min et enlever le surnageant. A la fin de la procdure, scher rapidement le culot dADN (Attention, bien enlever la totalit de lthanol) et le dissoudre dans 200 l deau strile prchauffe 65C (Echantillon dADN viral). 7. Si le culot est petit, utiliser pour la PCR, la solution pure dADN obtenu en A4. Si le culot est gros, faire une solution dilue de A4 au dixime dans de leau. Remarque : Conservation des ADN obtenus: entre +2C et +8C pendant 24 h, -20C pendant 6 mois, ou -80C pendant 2 ans.


9 / 24

B- Raction de polymrisation en chane (PCR) (~ 2 heures 30)La PCR permet damplifier les fragments dADN recherchs mais galement lincorporation de digoxignine. Utiliser des embouts striles filtres pour prparer le mlange ractionnel et pour ajouter les chantillons dans les tubes PCR. 1. Dterminer le nombre dchantillons tester et donc le nombre de ractions de PCR effectuer : prvoir n tubes pour n chantillons et un tube supplmentaire pour le tmoin ngatif de PCR. 2. Identifier chaque tube PCR. 3. Homogniser la solution damplification A1 au vortex puis centrifuger brivement. Prlever dans un microtube strile (n+1) x 39 l de la solution damplification A1. 4. Homogniser la solution damplification A2 au vortex puis centrifuger rapidement. Ajouter avec prcaution, l'aide d'une micropipette munie dun embout strile : (n+1) x 1 l de la solution d'amplification A2 la solution A1 dj prleve. Homogniser lensemble doucement au vortex, puis centrifuger brivement. 5. Rpartir 40 l du mlange A1 + A2 dans chaque tube PCR. 6. Ajouter avec un embout strile 10 l d'eau strile dans le tube contrle ngatif. Fermer le tube.

Sparer la zone B-7, de la zone damplification (B-8), de la zone danalyse des produits de PCR (C)

7. Pour chaque essai, ajouter avec un embout strile, 10 l dchantillon (solution dADN viral obtenue en A7) aux 40 l de mlange ractionnel.


10 / 24

8. Ds que tous les tubes ont t prpars, raliser lamplification par PCR en programmant le thermocycleur comme ci-dessous : 1 cycle 40 cycles 1 cycle Pause (hold) 95C 5 min 95C 30 sec 60C 30 sec 72C 1 min 72C 3 min 10C

En fin de PCR, prlever 5 l de chaque amplifiat/amplicon pour vrifier par lectrophorse en gel dagarose la raction de PCR. Conserver les chantillons entre +2C et +8C.


11 / 24

C- Analyse par lectrophorse en gel dagarose (contrle de la raction de PCR, facultatif)Migration lectrophortique des amplicons sur gel dagarose : sparation des fragments dADN et coloration au bromure dthidium (BET) Cette tape a pour but de sparer dans un champ lectrique des fragments d'ADN en fonction de leur taille (ADN gnomique ou ADN plasmidique, digrs par des enzymes de restriction ou produit damplification PCR). La sparation se fait dans une matrice d'agarose, polymre linaire extrait d'algues. Le bromure dthidium (BET) est la molcule la plus communment utilise pour colorer lADN dans un gel dagarose. Le BET sintercale entre les doubles brins dADN et dARN. Sous illumination Ultra-Violette (254 312 nm), le complexe BET/ADN double brin est visualis en couleur orange. 1. Prparation dun gel dagarose 1,2 % : Peser 1,2 g dagarose, ajouter 100 ml de TAE 0,5X ou TBE 0,5X (composition cf. annexes). Faire fondre au four micro-onde (par courtes priodes de chauffage) en mlangeant doucement de temps en temps, en prenant garde dviter une trop forte vaporation. Refroidir jusqu une temprature voisine de 55C en agitant modrment (avec un barreau aimant sur un agitateur magntique), tout en vitant la formation de bulles. Introduire le BET la concentration finale de 0,1 g/ml. Attention, le BET est un produit potentiellement mutagne, il faut se protger les yeux et la peau et travailler dans une pice rserve (voir le tableau phrases de risques en fin de document). Couler le gel. Attendre quil polymrise.


12 / 24

2. Dpt des chantillons Dposer 5 l de chaque chantillon de PCR additionns de 5 l dH2O et de 5 l de BSU 3X (tampon color de dpt, composition cf. annexes). Dposer galement un ADN marqueur de poids molculaire. Faire migrer. 3. Lecture des rsultats La lecture du gel dlectrophorse se ralise sur une plaque UV, soit en lecture directe, soit avec une prise dimages si le matriel ncessaire est disponible.


13 / 24

D- Hybridation et rvlation colorimtrique (~ 2 heures)1. Protocole dhybridation Pour chaque essai, le dpt des produits de PCR sur les membranes Mini-Array doit se faire avec un embout strile. 1. Dposer l'aide de la pince les membranes dans les puits dune plaque 24 puits en les orientant selon le schma suivant :Spot dorientation orange gauche Spot dorientation jaune droit

Veillez tout au long du protocole ce que les membranes ne se retournent pas. 2. Identifier chaque puits. 3. Dnaturer les produits de PCR restant par chauffage (programmer le thermocycleur 10 min 95C) et refroidir immdiatement sur de la glace pendant 5 min. 4. Dposer doucement la totalit des produits de PCR dnaturs (45 l restant) sur leurs membranes respectives en utilisant un embout strile par essai. ATTENTION de ne pas toucher les membranes avec lembout. 5. Laisser hybrider pendant 15 20 min temprature ambiante, sans agitation. 6. Pendant ce temps, chauffer la solution de lavage 1 (W1) au bain-marie 60C. et l'y maintenir tout le temps de son utilisation (ne pas s'inquiter si froid (+4C), il existe un prcipit, ce dernier disparat en chauffant). 2. Protocole de rvlation colorimtrique Commentaires : Lors des tapes de lavage, lutilisation dune pompe vide est recommande pour enlever les solutions des diffrents puits. Vous pouvez aussi les liminer en utilisant une micropipette (sans changer lembout entre chaque pipetage). Lors du lavage, la vitesse dagitation de lagitateur rotatif doit tre suffisante pour obtenir une rotation des membranes dans les puits. Nhsitez pas augmenter la vitesse dagitation pour obtenir un lavage plus stringent.


14 / 24

En agitation faible : sans rotation des membranes dans les puits. En agitation forte : avec rotation des membranes dans les puits. Sans agitation. ATTENTION la membrane est fragile : ne jamais dposer la solution directement sur la membrane, mais la dposer sur le bord du puits. 7. Ajouter directement 0,5 ml de la Wash solution 1 (W1) (pr-chauffe au bain-marie 60C). Placer la microplaque sur l'agitateur rotatif et laver 1 min temprature ambiante, en agitation forte. Rpter 2 fois cette tape de lavage. 8. Laver 3 fois 1 min avec 0,5 ml de la Wash solution 2 (W2) temprature ambiante en agitation forte. 9. Prparation de la solution d'anticorps : elle seffectue au dernier moment. Diluer 100 fois lanticorps anti-Digoxignine (Anti-DIG Ab) dans le Antibody Dilution Buffer (tampon de dilution de l'anticorps) : par raction, prparer 5 l de lanticorps dans 500 l du tampon de dilution. Cette solution dilue n'est stable que peu de temps +4C, et doit donc tre utilise dans lheure suivant sa prparation. 10. Ajouter 450 l de la solution d'anticorps par puits. Incuber 30 min temprature ambiante avec une agitation faible. 11. Eliminer la solution danticorps. 12. Laver 3 fois 1 min temprature ambiante avec 0,5 ml de la Wash solution 3 (W3) en agitation forte. 13. Ajouter 300 l de la solution de rvlation TMB (TMB Substrate), pralablement porte temprature ambiante. Incuber entre 15 et 20 min temprature ambiante et lobscurit (surtout ne pas agiter et ne pas excder le temps de rvlation). NB : La solution de TMB peut, dans certains cas, prsenter des particules blanchtres, mais ceci n'altre pas son efficacit. MAIS, si le TMB est bleut il ne faut pas lutiliser : il y a une contamination du TMB par lanticorps, le substrat est donc puis. 14. Eliminer la solution de TMB.Skuldtech Manuel Utilisation DAVE_310811 15 / 24

15. Laver les membranes l'eau distille (0,5 ml) pendant 5 min en agitation forte (utiliser l'eau distille fournie dans le kit). 16. Bien enlever leau distille. 17. Procder l'interprtation des rsultats (voir partie E). 18. Les membranes Mini-Array peuvent tre scannes pour tre archives, Ou conserves au conglateur, Ou, aprs schage, tre conserves sous scotch et labri de la lumire.


16 / 24

Suivi des tapes ralises A- Prparation des chantillons (~ 2 heures)Extraction et purification dADN

B- Raction de polymrisation en chane (PCR) (~ 2 heures 30)Mlange des solutions A1 et A2 Ajout de lADN de ltape A PCR

C- Contrle de la raction PCR (facultatif)Prparation gel et cuve pour llectrophorse Mlange du produit PCR et du tampon de charge (de dpt) Migration Lecture

D- Hybridation et rvlation colorimtrique (~ 1 heure)Protocole dhybridation

Dnaturation de lADN amplifi par PCR Dpt du produit PCR dnatur sur la membraneProtocole de rvlation colorimtrique

Chauffage de la solution de lavage W1 Lavage avec la solution de lavage W1 Lavage avec la solution de lavage W2 Dilution et incubation avec lanticorps Lavage avec la solution de lavage W3 Rvlation au TMB Lavage leau distille Lecture


17 / 24

Tableaux pour l'identification des chantillons analyser sur microplaque.

1 A B

2

3

4

5

6

C

D

1 A B

2

3

4

5

6

C

D


18 / 24

E- Interprtation et validation des rsultats1. Interprtation des rsultats de llectrophorse en gel dagarose Puits 1 : Echelle de poids molculaire (Promega, 100 pb). Puits 2 : Echantillon ngatif, seule est observable une bande denviron 350 pb correspondant au contrle interne. Puits 3 : Echantillon positif : prsence du virus IHHNV : amplification dune bande spcifique denviron 600 pb. Puits 4 : Echantillon positif : prsence du virus WSSV : amplification dune bande spcifique denviron 500 pb. Amplification dune bande de 350 pb correspondant au contrle interne. Puits 5 : Echantillon positif : prsence des virus IHHNV et WSSV: amplification de 2 bandes spcifiques de 600 pb et de 500 pb. Amplification dune bande de 350 pb correspondant au contrle interne. 11500 1000 700 500 400 300 bp IHHNV WSSV Contrle interne

2

3*

4

5

* Remarques : dans le puits 3, on peut remarquer labsence de lamplicon du contrle interne. Ce phnomne peut se produire dans le cas o les chantillons sont fortement infects. En effet, la PCR multiplex est une PCR comptitive dans laquelle lavantage de lamplification aux squences cibles des virus a t donn. Labsence du spot sur la membrane ou dans le gel dagarose n'implique pas pour autant une non-validation de la PCR.


19 / 24

2. Interprtation des rsultats de lhybridation sur membrane Les spots orange et jaune donnent lorientation de la membrane pour linterprtation des rsultats. Le spot central correspond au contrle interne de PCR (contrle positif). Validation du test Le test est considr comme valide si le spot correspondant au contrle interne de PCR se rvle sur la membrane.Orientation gauche (spot orange) Contrle interne Spot spcifique du IHHNV Orientation droite (spot jaune) Spot spcifique du WSSV

Non infect & tmoin ngatif (correspondant leau)

La PCR est valide : contrle interne positif. Lchantillon est non infect. Pas de contamination.

WSSV & IHHNV positifs

Lchantillon est doublement positif.

Lchantillon est positif WSSV positif uniquement pour le virus WSSV. Lchantillon est positif IHHNV positif uniquement pour le virus IHHNV. Lchantillon est inhib si aucun spot napparat sur la Non dtermin membrane. Il est conseill de refaire le test en utilisant lchantillon dilu au dixime dans de leau strile.Skuldtech Manuel Utilisation DAVE_310811 20 / 24

AnnexesPossibilit dachat de produits prts lemploi de qualit biologie molculaire .

Tampons dlectrophorseTBE 0,5 X : 0,045 M Tris-borate, 0,001 M EDTA (conservation temprature ambiante pendant 6 mois) TBE 5X Composition Tris base EDTA 0,5 M pH 8 Acide borique Eau Ultra Pure Dilution dans de leau Ultra Pure au 1/10me. TAE 1 X : 0,04 M Tris-actate, 0,001 M EDTA (conservation temprature ambiante pendant 6 mois) TAE 50X pH 8,3 Composition Tris base EDTA 0,5 M pH 8 Acide actique glacial 100% Eau Ultra Pure Dilution dans de leau Ultra Pure au 1/50me. Quantit 242 g 100 ml 57,1 ml qsp 1 l Quantit 54 g 20 ml 27,5 g qsp 1 l

Tampon de charge color de dptBSU 3X (Bleu, Saccharose, Ure) conservation 1 an temprature ambiante. BSU 3X Composition Ure Saccharose EDTA 5 mM pH 8 BBP Eau Ultra PureSkuldtech Manuel Utilisation DAVE_310811

Quantit 42 g 50 g 1 ml 0,01 g qsp 100 ml21 / 24

Actate de sodium (3 M)Actate de sodium 3 M pH 5,2 Composition Quantit NaOAc, 3H2O 40,8 g Eau Ultra Pure 80 ml - Dissoudre dans 80 ml deau ultra pure. - Ajuster le pH 5,2 avec de lacide actique glacial. - Complter 100 ml avec leau ultra pure. - Homogniser. - Striliser la solution sur filtre de 0,22 m de diamtre. - Aliquoter et conserver -20C.

AbrviationsTBE: Tris Borate EDTA TAE: Tris Actate EDTA BSU: Bleu Saccharose Ure BBP: Bleu de bromophnol EDTA: Acide thylne-diamine-ttraactique BET: Bromure dthidium WSSV: White spot syndrome virus IHHNV: Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus PCI: Phnol chloroforme alcool isoamylique PCR: Polymerase chain reaction ADN: Acide dsoxyribonuclique TMB: Ttramthylbenzidine


22 / 24


23 / 24

Mini-ArrayVersion Enseignement

Pour une meilleure utilisation de notre kit, il est conseill de rcuprer l'ensemble de la documentation disponible. Pour ce faire, accdez la page web: http://www.skuldtech.com/DAVE.html. Puis, cliquez sur le lien student training kit , Le nom dutilisateur et le mot de passe sont les suivants : Nom dutilisateur : DAVE Mot de passe : whitespot

SkuldtechTlphone : +33 (0)467 419 748 / Fax : +33 (0)467 457 726 Adresse : 134, rue du Curat Bt. Amarante 34090 Montpellier France Email : [email protected] - Web : http://www.skuldtech.com/DAVE.html

Skuldtech Manuel Utilisation DAVE 310811

Documents

Transcript of Skuldtech Manuel Utilisation DAVE 310811