Diversité et étude des métabolismes microbiens de

l’arsenic d’un ancien site minier, Sainte Marie aux Mines (68)

Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

Laboratoire Interaction Ecotoxicologie Biodiversité Ecosystèmes LIEBE UMR 7146

GDR 2909: Métabolisme de l’arsenic chez les Procaryotes

As (III) + soluble, + mobile, et plus toxique que l’As (V)

2 formes solubles prédominantes: As (III) ou arsénite et As (V) ou arséniate

Toxicité de l’arsenic

PitAqp

As III As V

SH Phosphorylation

As V

Pst

Les métabolismes bactériens influencent le statut Redox de l’arsenic

Métabolismes énergétiques

- Réduction dissimilatrice: As (V)= accepteur final d’e- en anaérobie gènes arr

- Oxydation de l’arsenic: As (III) donneur d’e- gènes aox/ aro/ aso

Métabolismes de résistance et de tolérance

- Méthylation de l’arsenic: production d’espèces généralement moins toxiques dont certaines volatiles gènes ars M

- Oxydation de l’arsenic: As (III) est oxydé en As (V) gènes aox

- Réduction expulsion: As(V) réduit en As (III) (gène ars C) puis sortie de l’As (III) par une pompe spécifique (ars B et analogues)

Illustrations: Silver et Phung,2005

As V

Pit

As VAs III

As III

As III

As V

Pit

As VAs III

As III

As III

As III As V

Réduction / expulsion Oxydation

Métabolismes de détoxification

Etude de la diversité des microorganismes capables de métaboliser l’arsenic sur le site de Sainte Marie aux Mines qui présente des conditions moins extrêmes que des sites précédemment étudiés comme Carnoulès.

Hypothèse: diversité taxonomique et fonctionnelle plus élevée.

But de l’étude: Comprendre le rôle des microorganismes dans la spéciation de l’arsenic

en milieu faiblement contaminé.

Site d’étude: Sainte Marie aux Mines, 68.

pH 6,9 / Carnoulès pH ≤ 3

Concentration en arsenic dans l’eau 6 – 23 µg/L / Carnoulès 350 mg/L

Concentration dans le sédiment 320 - 737 mg/kg

Concentration moyenne fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg)

Contamination en Aluminium (15150 mg/kg) et en Fer (23745 mg/kg)

Prélèvement du sédiment

Isolement souches cultivables Extraction ADN total

Etude de la diversité taxonomique bactérienne par amplification PCR de l’ADNr 16S bactérien

Etude de la diversité archéale par amplification de l’ADN r 16S archée

Démarche expérimentale

Etude de la diversité fonctionnelle par amplification gènes aox et transporteurs

Résultats: Diversité taxonomique

Diversité bactérienne des isolats cultivable

Diversité bactérienne totale

Diversité archéale

Diversité bactérienne des isolats cultivables

1%

33%

15%6%

6%

39%

Firmicutes

Actinobacteria

Bacteroidetes

Alphaproteobacteria

Betaproteobacteria

Gammaproteobacteria

1%

33%

15%6%

6%

39%

Firmicutes

Actinobacteria

Bacteroidetes

Alphaproteobacteria

Betaproteobacteria

Gammaproteobacteria

157 isolats aérobies

2%9%

89%

2%9%

89%

55 isolats anaérobies

212 isolats

Diversité bactérienne totale (248 clones séquencés)

Carnoulès dominance des Betaproteobactéries (38%) et Gammaproteobactéries ( 23%) et Acidobactéries seulement 3% (Thèse Giloteaux, 2009)

Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)

55%

5%

4%

12%

1%

23%

Thermoprotei

Non déterminé

Methanobacteria

Methanomicrobia

Thermococci

Non déterminé

Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)

55%

5%

4%

12%

1%

23%

Thermoprotei

Non déterminé

Methanobacteria

Methanomicrobia

Thermococci

Non déterminé

Euryarchaeota

40%

Crenarchaeota

60%

Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)

55%

5%

4%

12%

1%

23%

Thermoprotei

Non déterminé

Methanobacteria

Methanomicrobia

Thermococci

Non déterminé

Proportion des phyla Archaea obtenus par clonage / séquençage (83 clones)

55%

5%

4%

12%

1%

23%

Thermoprotei

Non déterminé

Methanobacteria

Methanomicrobia

Thermococci

Non déterminé

Euryarchaeota

40%

Crenarchaeota

60%

Diversité archéale (83 clones séquencés)

Diversité significative d’Archées

A Carnoulès uniquement Euryarchaeota amplifiés à partir d’échantillons d’eau (Bruneel et al., 2008)

Résultats: Diversité fonctionnelle

Répartition des gènes fonctionnels chez les isolats

Gènes de transporteurs + gènes aox

Diversité totale des gènes aox

Alignement des séquences des souches cultivables + clones

Répartition des gènes fonctionnels dans les isolats

arsB- 59 isolats acr3(1)- 75 isolats acr3(2)- 11 isolats aox- 22 isolats

Transporteurs d’arsénite Oxydation

Analyse croisée

Aucun gène de résistance: 38

1 gène de résistance: 100

2 gènes de résistance: 26

3 gènes de résistance: 7

A déterminer: 41

Diversité des gènes aox

Pas de gène aox affilié aux archées

Pas d’aox affiliés aux Gammaproteobactéries amplifiés à partir du sédiment

Présence de clones sans représentants cultivables associés

Présence chez Gram + et Flavobactéries

Possibilité de transferts horizontaux (souches soulignées)

Be

tapro

teobacté

ries

Ga

mm

apro

teoba

ctéries

Chloroflexi

Alphap

roteobactéries

Be

taproteobactéries

Gam

ma

proteob

actériesChloroflexis

Archaea

Be

tapro

teobacté

ries

Ga

mm

apro

teoba

ctéries

Chloroflexi

Alphap

roteobactéries

Be

taproteobactéries

Gam

ma

proteob

actériesChloroflexis

Archaea

Conclusion et perspectives

Mise en évidence dans le milieu d’organismes capables de réduire/ oxyder l’arsenic.

Recherche des gènes arr (respiration) et ars M (méthylation)

Réalisation de microcosmes abiotiques ou avec un inoculum bactérien contrôlé ou naturel sous différentes conditions :

-Différentes phase minérale

- pH

- Statuts redox

- As (III)/As (V)

- Donneur/ Accepteur d’e-

Suivi de l’expression des gènes fonctionnels et de la spéciation de l’arsenic

Séminaire RP2E - Audrey CORDI le 28 janvier 2010

Physicochimie du site: (eau et sédiments)

  Water Sediments

pH 6.9 -

Density (Kg/l) - 2.07

Moisture 20° (%) - 18

Moisture 105° (%) - 19.3

Fraction <2mn (%) - 57.8

Fraction >2mn (%) - 42.2

OM on <2mn (%) - 2

P total - 0.08

Al 98 µg/l 15150 µg/g

As 6 µg/l 320 µg/g

Cd ND 0.3 µg/g

Cr ND 40 µg/g

Cu 1 µg/l 103 µg/g

Fe ND 23745 µg/g

Mn ND 510 µg/g

Ni ND 23 µg/g

Pb ND 49 µg/g

Zn 2 µg/l 88 µg/g

pH (6,9) proche de la neutralité (diffère par rapport aux autres sites d’études)

Concentration en arsenic faible dans l’eau (6 µg/L) et modérée dans sédiment (320 mg/kg) mais plus élevée que la concentration moyenne provenant du fond géochimique dans les Vosges (48 mg/kg).

Contamination en Aluminium et en Fer non négligeable dans sédiments.

Résultat de diversité des gènes de transport d’arsénite Pas de gènes d’Archées amplifiés alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.

Séquences ars B clonées et isolats phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries

Mise en évidence par clonage de nouveaux groupes sans représentants cultivables

Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés.

2 clusters: le premier associé aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones).

Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais

possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes.

Divisé en deux clusters:

Premier cluster: Actinobactéries (clones et isolats) et Gemmatimonadetes (clones).

Second cluster: Bacteroidetes (isolats), Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries.

Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés.

Même si phylogénie respectée par rapport au 16S cas de transferts horizontaux

ars B acr3(1) acr3(2)

Diversité des gènes arsB

Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes

Séquences ars B clonées proviennent des mêmes groupes que les isolats porteurs de arsB phylogénétiquement proche des arsB des Gammaproteobactéries Mise en évidence de nouveaux groupes sans représentants cultivables par clonage

Phylogénie non respectée nombreux transferts horizontaux suspectés.

Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.

Diversité des gènes acr3(1) (1/2)

Divisé en deux clusters: ici est représenté le premier qui comprend les Actinobactéries et les Gemmatimonadetes (clones).

Transferts horizontaux à des Gammaproteobactéries, Betaproteobactéries et Flavobactéries.

Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes

Actinobactéries

Diversité des gènes acr3(1) (2/2)

Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes

Bacteroidetes

Verrucomicrobia

Clo

rofle

xi- De

ltap

rote

ob

acté

ries

Ga

mm

ap

rote

ob

acté

ries

Second cluster, comprenant les Bacteroidetes, Verrucomicrobia (clones), Chloroflexi- Deltaproteobacteries (clones) , et Gammaproteobactéries.

Nombreux clones proches des Chloroflexi- Deltaproteobacteries mais sans représentants cultivables connus associés.

Cas de transferts horizontaux

Phylogénie conservée par rapport au 16S.

Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.

Diversité des gènes acr3(2)

2 clusters: le premier composé des acr3(2) associés aux Proteobactéries et le second associé aux Verrucomicrobia (clones).

Transporteur généralement trouvés chez Alpha- et Betaproteobactéries mais possibilité de transferts horizontaux chez Gammaproteobactéries, Actinobactéries et Firmicutes.

Pas de gènes d’Archées amplifiées alors que séquences utilisées pour dessin des amorces.

Firmicutes Actinobactéries Alphaproteobactéries Betaproteobactéries Gammaproteobactéries Bacteroidetes

Proteobactéries

Verrucomicrobia