SECTION 4 : PARTIE GENETIQUE MICROBIENNE

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SECTION 4 : PARTIE GENETIQUE MICROBIENNE. En relation avec le module de « Biologie moléculaire et génie génétique ». Revoir le cours et TD de bio1 de biologie moléculaire : module 1 : biologie moléculaire et génie génétique, section 1 : 1.4. mutations et réparation ADN - PowerPoint PPT Presentation

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  • SECTION 4: PARTIE GENETIQUE MICROBIENNE

  • En relation avec le module de Biologie molculaire et gnie gntique .

    INTITULE DU PROGRAMMECOMMENTAIRESCOURSTPCOURSTRAVAUX PRATIQUESMutations.Mise en vidence du caractre mutagnedune substance laide dune souchemicrobienne (par exemple test dAmes, SOS chromotest ).XTP/TD de cette semaineGntique des levures.On ralisera une manipulation de mutagense alatoire, par exemple la slection de mutants auxotrophes chez Saccharomyces cerevisiae suivie dune complmentation fonctionnelle.Ltude de la gntique des levures pourra faire lobjet de 2 sances au moins.X1er TP et dernier TP anneGntique des bactriesTransferts gntiquesTransformation,conjugaison,transduction.On ralisera une manipulation de conjugaison. TP avec joel dendaX XTP avant les vacances

  • CHAPITRE 1: MUTATION Revoir le cours et TD de bio1 de biologie molculaire : module 1: biologie molculaire et gnie gntique, section 1: 1.4. mutations et rparation ADN

    TP Mise en vidence du caractre mutagne dune substance laide sune souche microbienne: SOS Chromotest

    et TD test de Ames faire pour

    Voir site internet doc intressants consulter

    http://mas.stephanie.free.fr mot de pass : HACCP

  • CHAPITRE 2: GENETIQUE DES LEVURES Revoir le cours et TD de bio1 biologie molculaire :module 1: biologie molculaire et gnie gntique, section 1: 1.4. mutations et rparation ADN

    Revoir TP N1 sur les levures avec le test de complmentation fonctionnel

    TD test de complmentation fonctionnel des levures + DS N2

    TP N2: Manipulation de mutagense alatoire: action des rayons UV sur la souche S.cerevisiae ade2

    Voir site internet doc intressants consulter

    http://mas.stephanie.free.fr mot de pass : HACCP

  • CHAPITRE 3:

    GENETIQUE DES BACTERIES ET TRANSFERTS GENETIQUES

  • Dans la nature, il existe deux moyens pour les microorganismes de transfrer le patrimoine gntique: question 1 du TD le transfert vertical de gnes qui se fait entre un parent et sa descendance.

    le transfert horizontal de gnes qui a lieu entre deux organismes distincts.Transfert vertical de gnes Transfert horizontal de gnes

  • mutationsvariabilit du gnome bactrientransferts horizontaux de gnesvolution

  • les mutations:Si la rparation choue mutations vnements rares, stables, hrditairesapparition de mutants = cellules diffrentes du type sauvage par un ou plusieurs caractres permettant leur slection. ex: marqueur dauxotrophie ou rsistance un antibiotiqueStabilit caractres hrditairesSI MAINTIENIntgrit gnome bactrienagressions physiques et chimiquesAltration ADNSystmes enzymatiques de rparationrparation par : - excision-resynthse, - recombinaison - SOS

  • les transferts de gnes:phnomnes rares chez les bactriesIl existe : 3 grands mcanismes dchanges d'ADN entre bactries donatrices et bactries rceptrices

    cellule donatrice

    gnome de la cellule donatrice = exognotecellule rceptrice

    gnome de la cellule rceptrice = endognoteTransfert matriel gntique

  • Les diffrents transfert horizontaux de gnesconjugaisontransformationtransduction

  • La conjugaisontransfert gntique unidirectionnel

    dun fragment dADN chromosomique ou plasmidique

    par contact direct entre deux bactries sexuellement diffrencie:

    une donatrice = mle et une rceptrice = femelle

  • La transformationtransfert gntique au cours duquel un fragment dADNbicatnaire, libre, nu, en solution est capt par une bactrie rceptrice avant d'tre ventuellement intgr au chromosome

  • La transductiontransfert gntique dun fragment dADN chromosomique ou extrachromosomique dune bactrie une autre effectu par des bactriophages dits transducteurs

  • cellule rceptrice

    Devenir de lADN exognote dans la bactries rceptrice ???2 possibilitsse substituer une zone homologue du chromosome de la bactrie par recombinaisonet sintgrer au chromosome ne pas sintgrer et soit: se rpliquer de faon autonome: cas des plasmides

    ne pas se rpliquer et tre dilu dans le clone de cellule = transfert abortif

    tre dtruit par la bactrie rceptrice = phnomne de restriction de lhte

  • cellule rceptrice

    Mais attention!!!Les bactries ne restent pas indiffrentes lentre d'un ADN tranger

    Mise en uvre des mcanismes de protection

    Restriction - Modification

    hydrolyse de lADN tranger non mthyl par les endonuclases

  • 1. LA CONJUGAISON3. LA TRANSFORMATION2. LA TRANSDUCTION

  • 1. LA CONJUGAISONtransfert gntique unidirectionnel

    dun fragment dADN chromosomique ou plasmidique

    par contact direct entre deux bactries sexuellement diffrencie:

    une donatrice = mle et une rceptrice = femelle

  • 1.1. Mise en vidence et caractristiques de la conjugaison1.1.1. La conjugaison implique un transfert de gnes et un phnomne de recombinaison 1.1.2. La conjugaison exige un contact physique direct entre les souches 1.1.3. La conjugaison implique une diffrence sexuelle entre les souches

  • En 1946, Lederberg et Tatum mnent une exprience sur :2 souches mutantes poly-auxotrophes dE.coli K12souche A thronine -leucine -souche B biotine -mthionine - thiamine -Aucune pousseAucune pousseEnsemencement sur milieu minimum sans Thr, leu, bio, Met et Thi 1 colonie pour 107 bactries ensemences pas du a une mutation spontane

    Il y a eu un transfert de matriel gntique entre les deux souches et recombinaison entre les gnes parentaux

  • Bernard Davis a utilis : lexprience du tube en UEnsemencement sur milieu minimum sans Thr, leu, bio, Met et Thi Aucune bactrie prototropheun tube en U spar la base par une membrane en verre poreuse (0.2m)

    empche un contact direct entre les souches

    laisse passer l'ADN libre, les phages ou les substances solubles (ADN)

    Les souches A et B sont places chacune dans une branche du tube, puis le milieu est aspir et refoul plusieurs foisIl y a donc ncessit d'un contact direct entre les souches A et B pour quil y est transfert du matriel gntique

  • Au microscope lectronique, on observe le phnomne:il y a contact direct entre les deux bactries,

    un pont cytoplasmique est tablit entre les bactries conjugantes

    grce au pili sexuelagitation vigoureusement

    souche A souche B Aucune bactrie prototropheLagitation rompt le contact

  • donatrice de gnes = bactries mles

    rceptrice de gnes = bactries femelle

    bactries donatrices de gnes= F+

    possdent un facteur de fertilit ou facteur Fbactries rceptrices de gnes= F-

    car dpourvues de facteur F

  • 1.2. Le facteur FLe facteur F = gros plasmide conjugatif (94 500 pb) qui contrle :

    sa propre rplication, son nombre de copies, la rpartition des copies dans les cellules filles son transfert Les nombreux gnes gouvernant le transfert sont situs dans l'opron tra:

    13 gnes codent la synthse de pili sexuels = cbles d'amarrage (2-3 pilis par F+) 2 gnes codent des protines dexclusion de surface qui empchent l'attachement des pili sexuels et donc l'appariement de deux bactries F+.

    5 gnes permettent la synthse et le transfert de l'ADN.

    3 gnes sont des gnes rgulateurs

  • 1.3. La conjugaison entre bactries F+ et F-Union F+/F- grce aux pili sexuelsTransfert de lADN partir de lorigine de transfert (ori T) et selon le modle du cercle roulantCration dun pont cytoplasmiquePermettant le transfert de lADNLe facteur F persiste dans la bactrie donatrice qui reste F+La bactrie rceptrice acquis une copie du facteur F elle devient F+Facteur F libre dans cellule donatriceOn isole trs peu de recombinants 10-6

  • 1.4. Les souches Hfr et la conjugaison entre bactries Hfr et bactries F-1.4.1. Les souches Hfr et transfert dADN chromosomique1.4.2. La chronologie du transfert des gnes chromosomiques: conjugaison interrompue

  • Formation d'une bactrie Hfr

    Les bactries Hfr drivent de bactries F+, le facteur F n'est plus autonome, il est intgr au chromosome bactrien, on parle dpisome.

    Hfr pour Haute frquence de recombinaison car elles sont capables de transfrer des marqueurs chromosomiques avec une frquence 1000 fois plus importante.

    Le facteur F et le chromosome de Escherichia coli contiennent des transposons et des squences d'insertion capables de recombinaison.

    L'intgration du facteur F dans le chromosome peut se faire diffrents endroits et dans diffrentes orientations.

  • conjugaison interrompue

    En 1957, Elie Wollman et Franois Jacob tudient la chronologie du transfert des gnes chromosomiques, lors d'un croisement Hfr x F-, par la technique des conjugaisons interrompues.

    Exprience:

    Dilution des chantillons pour viter de nouveaux contacts

    talement sur milieu .. + streptomycine pour tuer les bactries Hfr (mles)et sans certains facteurs de croissance absence de pousse des F- non recombines Agitation brve et intense

    107 bactries HfrStr S 108 bactries F- Str R et auxotrophesparation les bactries parentales et interruption du transfert de matriel gntique10 bactries femelles pour 1 bactrie mleprlve des chantillons intervalle de temps rgulier

  • Les rsultats obtenus sont les suivants:tablissement de la cartographie gntiqueNombre de bactries F- ayant reu un marqueur donn en fonction du temps de contact avec une souche Hfr On constateque :

    plus le temps de contact est long, plus le nombre de gnes transfrs est important

    Le transfert des gnes de la souche Hfr vers la bactrie donatrice se fait dans un ordre prcisIl commence partir dun point dorigine (oriT) = origine de transfert et s'effectue de manire oriente et progressive.coupure au niveau de lorigine de transfert

  • Comme le facteur F peut s'intgrer diffrent