SÉCRÉTION DES FACTEURS DE VIRULENCE CHEZ LES BACTÉRIES GRAM NÉGATIVES SOPHIE BLEVES, ROMÉ...
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SÉCRÉTION DESFACTEURS DEVIRULENCE CHEZ LESBACTÉRIES GRAMNÉGATIVESSOPHIE BLEVES, ROMÉ VOULHOUX
NAWEL ADJEROUD
Sécrétion
Protéines
Enzymes
Toxines
ExcrétionEliminatio
n de
Déchets
Survie et Adaptation
M. Externe
Périplasme
M. Interne
Cytoplasme
Extérieure
Processus Complexe Nécessite
six systèmes de sécrétion
Type VI
Vibrio cholerae
• Vibrio cholerae bactérie à gram négatif
(bacille virgule en français)
• Forme: bâtonnet incurvé, mobile
• responsable du choléra chez l‘homme, une maladie épidémique contagieuse, par sécrétion de toxines (altère le transport mbnaire).
Sécrétion membranaire de toxine
AB5
S/unité
A
S/unité
B5
Système de
sécrétion type 2
Type II secretion system of V. cholerae: . ATPase: EpsE . Plateforme MI: EpsE, L, F, M .
EpsD
PetidaseEps
O
Pseudopilins
Pseudopilus
(assemblageG)
Sécrétion
Exportation
TYPE II TYPE IV
Homologie T2SS-T4SS
Pseudopilus Pilus
Pseudopilins Pilins
Bibliographie: Rôle de EpsG
++++ +
Apparition Pseudopilus à la surface
eps G
All eps genes
Proteines Platforme
MI
ATPase:EpsE
epsOpero
n
[EpsG]
Surexpression G Constants
Comment?EpsG---EpsE
G G G
The Question is
EpsLLien
possible
Lien Direct/Indirect
???
Pourquoi L: Linker ?
Bibliographie: Mutation en E supprime mutation en G
Etude structurale E: a un site d’interaction avec L:
E interagit avec G via L
E
L
GLienE-G
? G-L
Méthodologie
Pour déterminer interaction EpsG-EpsL:
1- Pontage chimique (DSP)/Cross-Linking
2- Co-immunprécipitation
1. Pontage chimique (DSP)
Molécules en interaction « faible »
(difficile à détecter) (électrostatiques, hydrophobe...),
Ou simplement à proximité l’une de l’autre
Pontage covalent entre les 2 molécules
Agents de pontage
DSP,
imidoester bifonctionnel,
glutaraldéhyde, formaldéhyde.
Figer / immobiliser
ces molécules
Principe: N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primaires.
DSP+Pro1 Liaisons amides covalentes
DSP-Pro1
Libération NH-ester
DSP-Pro1(intermédiaire) Cross-Linked Product
+Pro2 Pro1-DSP-Pro2
Libération NH-ester
Crosslinker DSP (dithiobis succinimidyl propionate) = réactif de
Lomant
Réaction avec amine
primaire
DSP
EpsG
EpsL
1
2
2. Co-immunoprécipitation
Technique d’identification des interactions protéine-protéine:
Principe simple: montrer que les deux protéines EpsG-EpsL interagissent ensemble. Avec un anticorps dirigé contre G ou L pour purifier non seulement G mais aussi L, et inversement!
EpsG
EpsL
SDS-PAGE+Immunoblott AC anti G/L couplés à la
biotine
RESULTATS
Sans EpsG ou L
Absence G-L:
Il existe bien interaction
EpsL -- EpsG
60kDa
35kDaDimère EpsG
15Kda
Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG
Mutation résidu G: Gly-Val Asp-Glu Thr-Leu
Mutations epsL et epsG
pas de sécrétion de protéase: complexe
G-L nécessaire sécrétion
Contrôle:Mesure activité Protéase
Confirmation
Délétion d’epsG ou
epsL Absence du
complexe EpsL-EpsG
Cross-Linking, SDS-PAGE, Immunoblotting for EpsG
Co-immunoprecipitation 1. Anticorps anti-EpsG: Immunoblott pour EpsG
Lanes 4, 6Augmentation
EpsG et complexe G-L
Lanes 7, 9Apparition
EpsG-EpsL ???
ConfirmationL est lié à G
60kDa=EpsG-EpsL
2. Immunoblott pour EpsG
3. Immunoblott pour EpsL
Lanes 7, 9Augmentation
EpsL et complexe G-L
Lanes 4, 6Apparition
EpsG-EpsL ???
ConfirmationL est lié à G
60kDa=EpsG-EpsL
4. Immunoblott pour EpsL
1- Clivage par PilD: Immunoblott pour EpsG
Mutation pilDPas de
complexe G-L
EpsG non clivée de PM
élevé
Clivage PilDNécessaire
au G-L
2-Clivage par PilD: sur Mutant G
Clivage EpsG par PilD est
nécessaire au cross-link avec
EpsL
Dans pEpsGG-1V
Pas de G-L, pas de clivage sur G nonfonctionnel, pas de sécrétion
Lien direct/indirect1. Rôle des autres membres T2S….???
Seule EpsL est essentielle à la formation G-L
EpsL EpsGInteragissent Directement
2. Rôle de Protéines spécifiques à V. cholerae….???
Immunoblott pour G
E. coliG-L formé
En présence deEpsG EpsL
Aucune protéine de
V.cholerae est impliquée
G se lie de préférence à L
qd L est présent
3. Rôle Protéines spécifiques à V. cholerae….???
Immunoblott pour L
Association EpsG-EpsLspécifique
Liaisons HAsp91-Thr112
Effet Mutation T112, D91 de EpsG…???
G devient moins stable
Substitutions T112 D91de EpsGWT mutantG+Plasmides: Immunoblott pour EpsG
Absence G-L si résidus G substitués
(D91E, T112L)
Pas de Sécrétion si
Résidus substitués:domaines conservés
Chez ts homologues
Conclusion
Etude interactions EpsG-EpsL cross-
link(1pseudopilin
Majeur-le reste duT2SS)
Etudes antérieures: Interactions entre les 5 pseudopilins Interactions EpsE-EpsL
Apport de l’article…?
EpsL: Scaffoldtransduction de
signaux entre E-G ‘‘Linker’’ de
l’ATPase:EpsE-EpsG: conversion énergie
EpsG clivée par PilD devient mature et interagit avec EpsL.
L’association EpsL-EpsG est
spécifique: sans aucun autre
composé T2SS.
L’hydrolyse ATP:Changement
dynamique de EQui affecte LQui permet
assemblage de G
Rôle des G,L,E dans la sécrétion de toxines (GSP)
ATP ADP +Pi
OM
IM
EpsD
EpsE
EpsF EpsL
M
C
PeptidasePilD
TT
T
G
G
G
G
G
Clivage PilD
GG
G
G
Pseudopilins
Sec
The conversion of chemical energy to mechanical work:Polymérisation des G
Sécrétion
G G
Pseudopilus
filaments en Hélice
T
Exportation de toxine
Sécrétion de toxine chez V. cholerae
Piston
Futures Etudes.…?
Déterminer le site précis d’interactions entre EpsG et EpsL.
Déterminer le rôle des autres pseudopilins (H-K), sont ils ‘‘recrutés’’ eux aussi par EpsL par hydrolyse d’ATP? Pour être incorporer dans le pseudopilus.
Comprendre réelement l’implication des interactions EpsG-EpsL (hydrolyse d’ATP et ???)
Des questions???....Des commentaires???....
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