RoXaN une nouvelle protéine cellulaire interagissant …...Table des matières. 1ÈRE PARTIE:...

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Université de Paris XI Unité de formation et de Recherche Faculté de Châtenay-Malabry Groupe de Formation doctorale: Microbiologie Option: Ecologie Microbienne, Pathogénie des Micro-Organismes, Agents anti-infectieux année 1999-2000 série doctorat: N°661 ___ Thèse Présentée à l'unité de Formation et de Recherche Université Paris XI Pour l'obtention du grade de Docteur de l'Université Paris XI par Pierre LINDENBAUM Titre de la thèse: RoXaN, une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine non-structurale NSP3 du Rotavirus. CloneIt ® : Un programme en ligne trouvant des stratégies de clonage. Soutenue le : Jury: Prof. A.M. Quero Examinatrice Prof. P. Pothier Rapporteur Prof. G. Verdier Rapporteur Prof. M. Termier Examinateur Dr. Didier Poncet Examinateur

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  • Université de Paris XI

    Unité de formation et de RechercheFaculté de Châtenay-Malabry

    Groupe de Formation doctorale: MicrobiologieOption: Ecologie Microbienne, Pathogénie des Micro-Organismes, Agents anti-infectieux

    année 1999-2000 série doctorat: N°661___

    Thèse

    Présentée à l'unité de Formation et de RechercheUniversité Paris XI

    Pour l'obtention du grade de

    Docteur de l'Université Paris XI

    par

    Pierre LINDENBAUM

    Titre de la thèse:

    RoXaN, une nouvelle protéine cellulaire interagissant avecla protéine non-structurale NSP3 du Rotavirus.

    CloneIt®: Un programme en ligne trouvant desstratégies de clonage.

    Soutenue le :

    Jury:Prof. A.M. Quero ExaminatriceProf. P. Pothier RapporteurProf. G. Verdier RapporteurProf. M. Termier Examinateur

    Dr. Didier Poncet Examinateur

    mailto:[email protected]

  • A mes parentsA Emmanuelle Borlot

    A ma meilleure Amie (de Longue Date)

  • RAPPEL DES LOIS DE MURPHY

    Avant d'étudier quelque chose, il est recommandé de connaître entièrement son sujet. • Chaque solution amène de nouveauxproblèmes • Dans le doute, soyez convaincant. • Dans toute série de mesures, celle qui paraît la plus juste est la plus fausse. • Desattentes négatives conduisent à des résultats négatifs. • Des attentes positives conduisent à des résultats négatifs • Dès que quelquechose fonctionne, toute amélioration l'empêche de fonctionner • Il est impossible de faire la différence entre la magie et unetechnologie de pointe • Il est parfaitement impossible de faire quoi que ce soit à l'épreuve des imbéciles, les imbéciles se montrenttoujours si ingénieux ! • L'erreur est humaine - l'attribuer à quelqu'un d'autre que soi est encore plus humain • La nature nous réservetoujours des pannes • (i) Si c'est vert ou si ça remue, c'est de la biologie. (ii) Si ça pue, c'est de la chimie. (iii) Si ça ne fonctionnepas, c'est de la physique. (iv)Si ça occupe des tableaux entiers de formules, c'est des mathématiques • Laissées à elles-mêmes, leschoses tendent à aller de mal en pis • Le modèle que vous voulez n'est jamais celui qui est à vendre • Les expériences doivent êtrereproductibles : elles doivent toutes planter de la même façon • Les gens accepteront plus facilement votre idée si vous leur dites queBenjamin Franklin l'a eue avant vous • Méfiez-vous de l'homme qui travaille dur pour apprendre quelque chose, l'apprend, et ne setrouve pas plus intelligent qu'avant, il est plein d'un ressentiment amer vis à vis de la société, car elle contient beaucoup de gens quin'ont pas eu à travailler dur pour rester ignorants • Ne jamais recommencer une expérience qui a fonctionné • Peu importe la quantitéde travail réalisé, elle n'est jamais suffisante • Peu importe où est l'erreur, quelqu'un savait qu'il y en aurait une • Pour découvrirquelque chose, il faut être en train de chercher quelque chose. • Quel que soit le résultat prévu, il se trouve toujours quelqu'un pressé de: (i).mal l'interpréter; (ii).le critiquer; (iii).croire que cela provient directement de sa propre théorie • Quoi que vous décidiez de faire,il y a autre chose à faire auparavant • Résoudre un problème le change • Rien n'est aussi simple qu'il y paraît. • S'il existe plusieursfaçons pour les choses de mal se passer, celle qui va arriver est aussi celle qui causera le plus de dégats. Corollaire: C'est au piremoment que les choses tourneront mal. • Même si quelque chose ne peut pas aller mal, cela ira mal quand même • Si ça marche dupremier coup, c'est que vous n'avez aucune idée de ce que vous avez fait • Si jamais vous décidez de faire quelque chose, il y auratoujours quelque chose d'autre à faire avant. • Si quelque chose ne peut tout simplement pas mal tourner, ca se tournera mal quandmême. • Si tout semble manifestement bien se passer, c'est que quelque chose vous a échappé. • Si une expérience marche, c'est quequelque chose ne va pas. • Si vous avez décelé quatre façons possibles pour les évènements de mal tourner, et si vous les avezcirconvenues, alors une cinquième apparaîtra spontanément. • Si vous faites suffisamment de recherches, elles tendront à prouvervotre théorie • Toujours conserver une trace de ses mesures - cela indique que vous avez travaillé. • Tout ce qui est susceptible de maltourner tournera nécessairement mal. • Tout ce qui peut aller mal ira mal • Tout prend plus de temps que ce que vous pouvez prévoir. •Toutes les grandes découvertes sont faites par erreur • Tracez la courbe avant de placer les points • Avant même de fonctionner, toutprogramme est déjà obsolète. • Chaque programme non trivial est bogué. Corollaire : une condition suffisante pour qu'unprogramme soit trivial est qu'il ne contienne pas de bogues. • De nouveaux systèmes génèrent de nouveaux problèmes • L'erreur esthumaine, mais pour empirer il faut un ordinateur • La complexité de tout programme croît jusqu'à excéder les capacités duprogrammeur chargé de sa maintenance. • La plus grave erreur d'un programme ne peut pas être découverte avant que le produit soiten vente depuis six mois. • N'importe quel programme finira par occuper toute la mémoire. • Pour estimer combien de tempsprendra l'écriture et le déboguage d'un programme, prendre son estimation la plus large, multiplier par deux, rajouter un, et passer àl'unité de temps supérieure • Quand rien ne marche, il est recommandé de lire les instructions • Quand un compilateur accepte unprogramme sans la moindre erreur au premier essai, le programme ne donnera pas les résultats attendus • Si l'on faisait en sorte queles programmeurs puissent programmer en Français, on se rendrait compte qu'ils ne savent pas écrire en Français. • Si le produit aété conçu pour rejeter toute entrée invalide, alors un idiot ingénieux découvrira une méthode pour rentrer quand même des donnéesinvalides. • Si le système de test fonctionne parfaitement, tous les autres systèmes auront des problèmes • Si un programme estinutile, il faudra augmenter la documentation le concernant. • Si un programme est utile, il faudra le changer. • Tout plantera aumoins une fois • Un programme informatique fait ce que vous lui avez dit de faire, pas ce que vous voulez qu'il fasse.

  • R E M E R C I E M E N T S Merci à tous les membres du Jury d'avoir accepté de lire et critiquer cemémoire.

    Mes plus vifs remerciements s'adressent à Didier Poncet ainsi qu'à Jean Cohenqui m'ont guidé tout au long de ce travail. Leur dynamisme et leur soutien,autant scientifique que moral, ont été déterminants pour le déroulement de cettethèse.Merci à tout l'équipe de Biologie Moléculaire des Rotavirus, oui toi aussiMaria, pour son aide précieuse et pour tous les bons moments passés ensemble.

    Enfin, je suis très reconnaissant envers toutes les personnes de l'unité qui m'ontaidé, à n'importe quel niveau, au cours de ce travail.

  • Table des matières.

    1ÈRE PARTIE: RoXaN: UNE NOUVELLE PROTÉINE CELLULAIRE INTERAGISSANT AVEC LAPROTÉINE NON STRUCTURALE NSP3 DU ROTAVIRUS.

    1 INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 1.1 Le Rotavirus. ............................................................................................................................................ 4

    1.1.1 Historique.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41.1.2 Pathologie... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51.1.3 Epidémiologie... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

    1.1.3.1 Impact sur la santé publique...............................................................................................................61.1.3.2 Impact agronomique........................................................................................................................7

    1.1.4 Immunité... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71.1.5 Vaccination.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

    1.1.5.1 Sérogroupes & Sérotypes.................................................................................................................81.1.5.2 Vaccins utilisés... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81.1.5.3 Autres stratégies vaccinales............................................................................................................10

    1.1.6 Structure du rotavirus............................................................................................................................101.1.7 Cycle Viral... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

    1.1.7.1 Adsorption, pénétration et décapsidation............................................................................................141.1.7.1.1 Adsorption... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .141.1.7.1.2 Pénétration... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .141.1.7.1.3 Décapsidation.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14

    1.1.7.2 Réplication... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .141.1.7.3 Encapsidation et Assemblage..........................................................................................................15

    1.1.7.3.1 Une enveloppe transitoire........................................................................................................151.1.7.3.2 Les viroplasmes.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .161.1.7.3.3 Relargage... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16

    1.1.8 Génome.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .161.1.9 Protéines Structurales (VP)....................................................................................................................17

    1.1.9.1 Les protéines du Core....................................................................................................................171.1.9.1.1 La protéine structurale VP1.......................................................................................................181.1.9.1.2 La protéine structurale VP3.......................................................................................................181.1.9.1.3 La protéine structurale VP2.......................................................................................................19

    1.1.9.2 La capside interne: VP6..................................................................................................................191.1.9.2.1 La protéine virale VP6............................................................................................................19

    1.1.9.2.1.1 Immunologie... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201.1.9.2.1.2 Rôle structural........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .201.1.9.2.1.3 Rôle dans la transcription.................................................................................................20

    1.1.9.3 Les protéines de la capside externe....................................................................................................211.1.9.3.1 La protéine structurale VP4.......................................................................................................211.1.9.3.2 La protéine structurale VP7.......................................................................................................22

    1.1.9.3.2.1 VP7 et l’attachement à la cellule..........................................................................................231.1.10 Les Protéines Non Structurales (NSP)......................................................................................................23

    1.1.10.1.1 La protéine non-structurale NSP1.............................................................................................231.1.10.1.2 La protéine non-structurale NSP2.............................................................................................251.1.10.1.3 La protéine non-structurale NSP3.............................................................................................261.1.10.1.4 La protéine non-structurale NSP4.............................................................................................291.1.10.1.5 La protéine non-structurale NSP5.............................................................................................311.1.10.1.6 La protéine non-structurale NSP6.............................................................................................32

    1.2 L'initiation de la Traduction ....................................................................................................................... 32 1.2.1 Initiation de la traduction des ARNm: vue générale.......................................................................................321.2.2 La protéine eIF4GI...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35

    1.2.2.1 Identification des différents gènes codant pour eIF4G chez les eucaryotes....................................................351.2.2.1.1 EIF4GII... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .361.2.2.1.2 p97... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .361.2.2.1.3 PAIP... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36

    1.2.3 eIF4G est le support des protéines eIF4E, eIF3 et eIF4A, MnKI et PABP.............................................................361.2.3.1 Liaison à eIF3.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .381.2.3.2 Liaison à eIF4E............................................................................................................................381.2.3.3 Liaison à eIF4A..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38

  • 1.2.3.4 Liaison à MnKI..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .391.2.3.5 Liaison à la PABP.........................................................................................................................39

    1.2.4 Séparation des éléments du complexe eIF4F...............................................................................................411.2.4.1 eIF4GI est la cible des protéases de picornavirus et permet la traduction des ARNm non coiffés viraux.................411.2.4.2 Clivage de l'eIF4G lors de l'apoptose.................................................................................................421.2.4.3 Séparation des éléments de l'eIF4F "gène spécifique".............................................................................42

    1.2.5 La PABP et la terminaison de la traduction chez les eucaryotes.........................................................................43 2 BUT DU TRAVAIL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44 3 MATERIELS & METHODES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

    3.1.1 Cellules et virus..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .463.1.2 Plasmides... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .463.1.3 Extractions d'ADN, clonage...................................................................................................................473.1.4 Analyse des protéines..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49

    3.1.4.1 Anticorps... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .493.1.4.2 Peptides... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .493.1.4.3 Gels d'acrylamide......... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .493.1.4.4 Purification de protéines................................................................................................................493.1.4.5 Détermination de la solubilité d’une protéine exprimée en bactéries...........................................................523.1.4.6 Immunoprécipitations..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .523.1.4.7 Western Blot... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53

    3.1.5 Transcription/traduction in-vitro système TnT............................................................................................533.1.6 Interaction entre protéine recombinante et protéine traduite in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .533.1.7 Lipofection, transfection de cellules eucaryotes..........................................................................................543.1.8 Marquage des cellules infectées au 35 S... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .543.1.9 Criblage de banque d'ADNc en phage λ. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .543.1.10 Purification des ARN poly(A)...............................................................................................................553.1.11 Reverse Transcription (RT-PCR)...........................................................................................................553.1.12 Northern blot.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .553.1.13 Fluorographie... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .563.1.14 Double Hybride..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56

    3.1.14.1 Principe du double hybride............................................................................................................563.1.14.2 Levures... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .603.1.14.3 Plasmides utilisés en double-hybride................................................................................................61

    3.1.14.3.1 Vecteurs de type appât...........................................................................................................613.1.14.3.2 Vecteurs de type proie...........................................................................................................623.1.14.3.3 Vecteurs de type sandwich......................................................................................................63

    3.1.14.4 Préparation des levures compétentes................................................................................................633.1.14.5 Transformation des levures et sélection des transformants.....................................................................633.1.14.6 Test de la ßGalactosidase sur filtre...................................................................................................643.1.14.7 Transfection d'une banque.............................................................................................................643.1.14.8 Extraction des plasmides de levure et transfection en bactérie Hb101........................................................643.1.14.9 Vérification du phénotype apporté par le plasmide issu de la banque.........................................................64

    4 RESULTATS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 4.1 Etudes des interactions NSP/protéine et NSP/ARN chez le Rotavirus. ................................................................ 66

    4.1.1 Recherche d'interactions "ARN-NSP".......................................................................................................664.1.2 Recherche d'une protéine cellulaire interagissant avec NSP1...........................................................................684.1.3 Recherche d'une protéine cellulaire interagissant avec NSP2...........................................................................694.1.4 Caractérisation de l'interaction de NSP3 avec eIF4GI/eIF4GII..........................................................................694.1.5 Recherche d'une interaction de NSP3 avec eRF3...........................................................................................704.1.6 Etude de la dimérisation de NSP5 et de l'interaction NSP5-NSP2.......................................................................714.1.7 Recherche d'une protéine cellulaire interagissant avec NSP5...........................................................................73

    4.2 RoXaN une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine non-structurale NSP3 ................................... 75 4.2.1 Reconstitution de l'ADNc de RoXaN.........................................................................................................75

    4.2.1.1 Estimation de la taille de l'ARNm de RoXaN.........................................................................................774.2.1.2 Recherche de l'extrémité 5' de RoXaN.................................................................................................774.2.1.3 Recherche de l'extrémité 3' de RoXaN.................................................................................................78

    4.2.1.3.1 RT PCR.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .784.2.1.3.2 Crible de banque de phage (3' RACE)...........................................................................................784.2.1.3.3 ADN génomique...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .794.2.1.3.4 KIAA1031.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .794.2.1.3.5 RoXaN.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80

    4.2.2 Etude de la séquence de RoXaN................................................................................................................80

  • 4.2.3 RoXan est ubiquitaire dans les cellules......................................................................................................824.2.4 RoXaN1 interagit spécifiquement avec NSP3 dans le système double-hybride......................................................824.2.5 Analyse de l'interaction NSP3-RoXaN1.....................................................................................................834.2.6 NSP3 et RoXaN1 interagissent in vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .864.2.7 NSP3 et RoXaN1 co-immunoprécipitent in vivo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .864.2.8 Analyse du complexe eIF4GI/NSP3/RoXaN1..............................................................................................91

    4.2.8.1 Etude en triple hybride...................................................................................................................914.2.8.2 Etude par immunoprécipitation........................................................................................................91

    4.2.9 Obtention d'un anticorps dirigé contre RoXaN............................................................................................934.2.10 Recherche d'un partenaire cellulaire pouvant interagir avec RoXaN................................................................100

    5 DISCUSSION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105 5.1 Etudes d'interactions NSP/protéine et NSP/ARN chez le Rotavirus. .................................................................. 106

    5.1.1 Caractérisation des activités de liaison à l’ARN de trois protéines non structurales du rotavirus...............................1065.1.2 Interaction NSP3 - eIF4GII. Réduction du domaine d’interaction de eIF4G sur NSP3..............................................1065.1.3 Interaction eRF3-NSP3........................................................................................................................1075.1.4 Utilisation du système double hybride avec NSP1, NSP2 et NSP5....................................................................108

    5.1.4.1 NSP1... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1085.1.4.2 NSP2... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1095.1.4.3 NSP5... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .109

    5.1.5 Leçons tirées de l'utilisation de la technologie du double-hybride en levure........................................................110 5.2 RoXaN une nouvelle protéine cellulaire interagissant avec la protéine non-structurale NSP3. ................................. 111

    5.2.1 RoXaN contient un motif TPR...............................................................................................................1125.2.2 Autres motifs.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1155.2.3 Obtention d'un sérum dirigé contre RoXaN................................................................................................1175.2.4 Interaction de NSP3 avec RoXaN, étude du complexe NSP3/eIF4G/RoXaN.........................................................1175.2.5 Fonction de RoXaN, à la recherche de Cyrano: eIF3 ?...................................................................................1185.2.6 Note de dernière minute:.......................................................................................................................119

    6 PERSPECTIVES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121 6.1 Double Hybride ...................................................................................................................................... 122 6.2 Purification de RoXaN ............................................................................................................................. 122 6.3 Rôle de RoXaN ...................................................................................................................................... 122

    2ÈME PARTIE: CLONEIT®: UN PROGRAMME "EN-LIGNE" TROUVANT DES STRATÉGIES DECLONAGES EN UTILISANT DES ENZYMES DE RESTRICTION ET DES ADN POLYMÉRASES.

    1 INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124 1.1 Avant propos. ........................................................................................................................................ 125 1.2 Motivation et but du programme CloneIt ® . .................................................................................................. 125 1.3 Problèmes imposés par le clonage moléculaire utilisant les enzymes de restriction. .............................................. 126

    2 ALGORITHMES & METHODES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134 2.1 REBASE: La source des enzymes de restriction. ............................................................................................ 135 2.2 Séquences. ............................................................................................................................................. 137 2.3 Structures. ............................................................................................................................................. 138

    2.3.1 Structure ?..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1382.3.2 La structure ENZYME..........................................................................................................................1392.3.3 La structure Site.................................................................................................................................139

    2.4 Listes ................................................................................................................................................... 139 2.5 Langage de programmation et compilation. .................................................................................................. 141 2.6 Description des fonctions et procédures courantes. ......................................................................................... 141

    2.7 Recherche des sites de restriction..............................................................................................................145 3 RESULTATS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

    3.1 Page d'acceuil et paramètres. ...................................................................................................................... 147 3.2 Algorithmes. .......................................................................................................................................... 148

    3.2.1 Cartes de restriction............................................................................................................................1483.2.1.1 But.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1483.2.1.2 Algorithme.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1493.2.1.3 Résultats... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .149

    3.2.2 Intersections... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1503.2.2.1 But.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1503.2.2.2 Algorithme.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .150

  • 3.2.2.3 Résultats... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1503.2.3 Recherche de stratégies de sous-clonage...................................................................................................151

    3.2.3.1 But & Problématique du clonage......................................................................................................1513.2.3.1.1 Clonage par oligonucléotides complémentaires............................................................................1513.2.3.1.2 Clonage PCR...... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1513.2.3.1.3 Clonage par digestion d'insert..................................................................................................152

    3.2.3.2 Algorithme simplifié.... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1523.2.3.3 Résultats... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .153

    3.2.3.4 Recherche de délétions en phase..........................................................................................................1563.2.3.4.1 But.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1563.2.3.4.2 Algorithme simplifié........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1563.2.3.4.3 Résultats... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .157

    3.2.3.5 Recherche de décalages de phase..........................................................................................................1583.2.3.5.1 But.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1583.2.3.5.2 Algorithme simplifié........ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1593.2.3.5.3 Résultats... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .159

    3.3 Implantation. ......................................................................................................................................... 160 3.4 Dépôt de marque. .................................................................................................................................... 160 3.5 Utilisation et fréquentation du site. ............................................................................................................. 161

    4 DISCUSSION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

    B I B L I O G R A P H I E . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

    P U B L I C A T I O N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174

    R É S U M É . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 175

  • Table des illustrations.

    1ère partiefigure 1: Impact des maladies infectieuses majeures dans le monde en 1998 ________________________________________5figure 2 Représentation schématique de la structure du rotavirus _________________________________________________11figure 3: Le cycle du Rotavirus___________________________________________________________________________13figure 4 La protéine NSP3 interagit avec IF4GI et déplace la PABP______________________________________________28figure 5 Modèle simplifié de l'initiation de la traduction _______________________________________________________33figure 6 Représentation schématique des eIF4G homologues de mammifères _______________________________________35figure 7 eIF4GI est le support des protéines eIF4E, eIF3 et eIF4A, MnKI et PABP__________________________________37figure 8 principe des trois systèmes d'expression et de purification utilisés lors de notre travail_________________________50figure 9 Principe du système double hybride_________________________________________________________________57figure 10 Criblage d'une banque d'ADNc en double hybride_____________________________________________________59figure 11 Le système triple hybride________________________________________________________________________66figure 12 Le problème de la transactivation en double/triple hybride______________________________________________67figure 13: Séquences des eIF4GI et II utilisées lors de cette étude ________________________________________________70figure 14: Construction de NSP5 utilisées dans cette étude _____________________________________________________74figure 15 Carte du gène de RoXaN ________________________________________________________________________76figure 16: Northern BLOT contre RoXaN1__________________________________________________________________81figure 18: Détection d'un motif coiled-coil à l'extrémité C-terminale de RoXaN_____________________________________81figure 19: RT-PCR-ELISA utilisant KIAA1031 comme sonde sur divers tissus ____________________________________82figure 20 Localisation de la partie de NSP3 interagissant avec RoXaN1 en double hybride ____________________________84figure 21 Délimitation de la zone d'interaction RoXaN1-NSP3 en double hybride ___________________________________85figure 22 NSP3 et RoXaN1 interagissent in vitro ____________________________________________________________87figure 23 La construction pcDNA-FLAG-RoXaN1 est fonctionnelle in vitro et in vivo_______________________________88figure 24 NSP3 et RoXaN1 co-immunoprécipitent ___________________________________________________________90figure 25 NSP3, RoXaN1 et eIF4G peuvent former un complexe ternaire en triple hybride____________________________92figure 26RoXaN1 appartient au complexe NSP3-eIF4GI in vivo ________________________________________________93figure 27 A: Expression de RoXaN1 dans le système FastBac/Baculovirus_________________________________________95figure 28 Purification de RoXaN1 dans le système pET________________________________________________________96figure 29 Les sérums 725 et 814 obtenus au bout de la première saignée reconnaissent RoXaN1 exprimée en cellule COS___98figure 30 Les sérums 725 et 814 reconnaissent respectivement des protéines d'un poids moléculaire de 40kD et 100kD______99figure 31 Le sérum 814 fixe une protéine d'environ 100kD____________________________________________________100figure 32 Etude de l'interaction p170/RoXaN dans le système double hybride______________________________________102figure 33: Séquence annotée de l'ADNc de RoXaN___________________________________________________________104figure 34: Un modèle de dimérisation de NSP5._____________________________________________________________109figure 35 Alignements du TPR de RoXaN_________________________________________________________________113figure 36: Alignement de RoXaN à la position 36 avec le premier TPR de la protéine phosphatase humaine PP5_________114figure 37 Structure du premier TPR de la PP5______________________________________________________________116figure 38: Le modèle de fixation de la PABP au niveau du complexe d'initiation de la traduction tel qu'il a été décrit par

    Otero & al. (1999)_______________________________________________________________________________120

    tableau 1 Principales propriétés des protéines du rotavirus______________________________________________________12tableau 2: Combinaisons de plasmides transfectés dans la souche de levure L40c et utilisés lors d'une recherche d'interaction

    ARN-NSP dans le système triple hybride ARN._________________________________________________________67tableau 3: Combinaisons de plasmides dans la souche de levure HF7c utilisées lors de la recherche d'un appât NSP1 ne

    transactivant pas le système double hybride ____________________________________________________________68tableau 4: eIF4GII interagit avec NSP3 ____________________________________________________________________70tableau 5: NSP3 et ERF3 n'interagissent pas en double-hybride _________________________________________________71tableau 6: NSP2 et NSP5 interagissent en double-hybride______________________________________________________71tableau 7 La forme NSP5∆5 transactive plus dans le système double-hybride et multimérise___________________________72tableau 8: Recherche de protéines pouvant interagir avec RoXaN1 en double hybride_________________________________83tableau 9: Etude de l'interaction p170/RoXan1 dans le système double-hybride_____________________________________101

  • 2ème partie

    figure 39 Principes de clonages utilisant des enzymes de restriction _____________________________________________125figure 40 Les enzymes clivent l'ADN en libérant des extrémités différentes _______________________________________127figure 41 Illustration de la complémentarité des bouts collants._________________________________________________128figure 42 Illustration du problème de la circularisation des plasmides ____________________________________________129figure 43 Illustration des propriétés des ADN polymérases ____________________________________________________130figure 44 Illustration du problème du clonage d'un fragment d'ADN en phase avec la séquence d'un plasmide. ____________131figure 45 Illustration du problème des digestions partielles ____________________________________________________131figure 46 Extrait d'un fichier REBASE. ___________________________________________________________________135figure 47: carte de restriction du plasmide pGBT9 par AluI (AG^CT).____________________________________________136figure 48 Extrait du fichier "polylinker"___________________________________________________________________137figure 49: Utilisation des listes et des structures dans CloneIt® _________________________________________________140figure 50: Détermination de la distance entre le début du site et le site de clivage___________________________________144figure 51 La page d'acceuil de CloneIt: http://topaze.jouy.inra.fr/cgi-bin/CloneIt/CloneIt ____________________________147figure 52 Exemple d'une carte de restriction obtenue grâce à CloneIt® ____________________________________________149figure 53 Exemple d' intersection ________________________________________________________________________150figure 54 Une stratégie de sous-clonage obtenue par CloneIt® __________________________________________________154figure 55 Récapitulatif des enzymes utilisés. _______________________________________________________________155figure 56: Une stratégie de délétion en phase obtenue par CloneIt® ______________________________________________158figure 57 Principe de la création de décalage de phase en utilisant des enzymes de restrictions._________________________158figure 58: Une stratégie de décalage de phase obtenue par CloneIt® ______________________________________________159figure 59: Le compilateur transforme la source en programme exécutable_________________________________________160

    tableau 10: Efficacité de coupure de trois enzymes de restriction ________________________________________________.

    http://topaze.jouy.inra.fr/cgi-bin/CloneIt/CloneIt

  • 1

    Abbréviations

    3AT 3-amino-triazoleACP Amplification en chaîne par la polyméraseADNc ADN complémentaireANSI American National Standards InstituteARNm ARN messagerARNt ARN de transfertBD binding domainBSA Bovine serum albumineBTV Blue Tongue VirusC langage 'C'CAPS Acide cyclohexilamine propanesulfoniqueCAT Chloramphénicol acétyl-transféraseCGI Common Gateway InterfaceCi CurieDMSO DiméthylsulfoxideDO600 Densité optique à 600 nmDTT DithiotréitolE.coli Escherichia coliEDTA Acide éthylène diamine tétraacétiqueeIF Eucaryotic initiation factorEST Express Sequence TagGAD GAL4 activating domainGCG Genetic Computer GroupHepes Acide N-2-hydroéthylpiperazine-N'-

    2éthanosulfoniqueIg ImmunoglobulineINSIT Institut National de la Propriété IndustrielleIP ImmunoprécipitationIPTG Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosideIRES Internal Ribosome Entry Sitekb Kilobasekd KilodaltonMet MéthionineMI Multiplicité d'infectionNEM N-éthylmaléimideNSP Non structural ProteinORF Open reading framep.i. Post-infectionPABP Poly(A) binding proteinPAGE Polyacrylamide gel electrophoresisPBS Phosphate buffered salinePEG Polyéthylène glycolpfu Plage forming unitPM Poids moléculairePVC Polyvinyl chloridePVDF Polyvinylidène difluorideRE Reticulum endoplasmiqueREBASE Restriction Enzyme dataBASERIPA Radio immunoprecipitation protein assayRNase RibonucléaseRNP RibonucléoprotéineRoXaN Rotavirus 'X' Associated Non Structural ProteinRRM RNA recognition motifRU Resonance unit

    SDS Sodium dodécyl sulfateSPR Surface plasmon resonanceTemed Tétraméthyléthylène diamineTMGK Tris-MgCl2-KClTPR TetratricopeptideTris Tris-hydroxyméthyl-aminométhaneTween Polyoxyéthylènesorbitan monopalmitateu Unitéufp Unité formant plageURL Uniform Resource LocatorUV Ultra violetVP Viral proteinWWW world wide web

  • 2

    1ère Partie:RoXaN: Une nouvelle

    protéine cellulaireinteragissant avec la protéine

    non structurale NSP3 duRotavirus.

  • 3

    1 I N T R O D U C T I O N .

  • 4

    Cette introduction sera divisée en deux parties. Dans un premier temps nous ferons quelques

    rappels sur le Rotavirus puis dans un deuxième temps, nous rappelerons quelles sont les étapes de

    l'initiation de la traduction, un processus dans lequel est impliquée la protéine NSP3 du rotavirus.

    1.1 Le Rotavirus.

    Les Rotavirus sont la principale cause des

    gastro-entérites sévères touchant les jeunes

    enfants dans le monde.

    1.1.1 Historique.

    Bien avant la découverte du rotavirus en 1973 plusieurs équipes avaient déjà mis en évidence chez

    diverses espèces animales atteintes de diarrhées, des particules virales caractéristiques. En 1963

    Adams et Kraft décrivent des particules virales présentes dans l'intestin de souriceaux infectés par

    le virus EDIM (Eizootic Diarrhea of Infant Mice). En 1967 Malherbe et son équipe isolent, chez le

    singe, des virions de 70nm de diamètre désignés SA11 (Simian Agent 11)(Malherbe et Stricklend-

    Chomley, 1967). C'est en 1969 que Mebus (Mebus et al., 1969) et ses collaborateurs montrent la

    présence de particules virales de même diamètre, évoquant celles des réovirus dans les fèces de

    veaux diarrhéiques. Finalement en 1973, Bishop et son équipe observent en microscopie

    électronique, dans des biopsies humaines, des particules similaires à celles retrouvées chez les

    animaux, et les attribuent au genre orbivirus (Bishop et al., 1973). Plusieurs travaux mettent

    ensuite en évidence les mêmes particules dans les fèces d'enfants diarrhéiques. En 1974 Flevet et

    son équipe démontrent des similitudes antigéniques et morphologiques entre les virus humains et

    bovins et proposent alors de les regrouper dans un genre distinct de celui des orbivirus et des

    réovirus (Flewet et al., 1974). Ils suggèrent le nom "rotavirus" (du latin rota : roue) inspiré de leur

    forme de roue observée en microscopie électronique et c'est en 1979 que le genre Rotavirus est

    officiellement créé au sein de la famille de Reoviridae1.

    1 Voir aussi le taxon des reoviridae: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?id=10880&lvl=3

    http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?id=10880&lvl=3

  • 5

    1.1.2 Pathologie.

    Les rotavirus infectent les entérocytes matures du sommet des villosités de l'épithélium intestinal.

    L'infection résulte en une lyse des entérocytes et conduit à des altérations microscopiques telles

    que le raccourcissement et l'atrophie des villosités intestinales et une dilatation du réticulum

    endoplasmique des entérocytes (Davidson et al., 1977). Elle s'accompagne d'une diminution de

    l'activité de certaines disaccharidases (Bishop et al., 1973) avec pour conséquence l'augmentation

    de la concentration en lactose dans la lumière intestinale.

    Des études récentes de Jourdan et al. (Jourdan et al., 1998; Jourdan et al., 1997) proposent que

    l'infection perturbe le cytosquelette associé aux microvillosités épithéliales et bloque le transport

    des hydrolases (dans ce cas, le transport de la sucrase isomaltase) vers la surface apicale des

    entérocytes, sans provoquer de lyse cellulaire.

    Chez l'homme, l'incidence de la maladie est maximale chez les enfants âgés d'environ 3 à 15 mois

    (Davidson et al., 1975) , elle survient après une période d'incubation allant de 24 à 48h chez le

    jeune enfant. Les premiers jours, la maladie à rotavirus provoque une augmentation de la sécrétion

    d'eau et d'électrolytes se traduisant par une gastro-entérite fébrile, des vomissements et une

    déshydratation.

    Généralement, le patient, de 2 mois à 5 ans,

    guérit mais dans certains cas, la maladie

    peut être fatale si elle n'est pas compensée

    par un apport de solutions aqueuses

    équilibrées en électrolytes. Un traitement

    efficace permet une guérison en 3 à 4 jours.

    Chez l'adulte lorsque les défenses

    immunitaires sont normales, les rotavirus

    provoquent des infections asymptomatiques

    ou sans gravité.

    Mais si la résistance de l'hôte diminue avec l'âge (Halvorsrud et Orstavik, 1980) ou si le système

    immunitaire de l'organisme s'affaiblit (Flewett, 1982), les infections par le rotavirus peuvent alors

    devenir sévères. Tout comme chez l’adulte l'infection, chez les nourissons de moins de 3 mois, est

    souvent sans gravité ou asymptomatique. Plusieurs hypothèses ont été avancées pour expliquer ce

    phénomène (Kapikian et R.M., 1996): le transfert passif d'anticorps maternels pourrait conférer

    une relative résistance aux infections à rotavirus ou les récepteurs du virus sur la muqueuse

    pourraient être absents. Les rotavirus semblent se transmettre principalement par voie féco-orale et

    l'existence d'un cycle impliquant l'homme et l'environnement semble déterminante pour assurer

    l'efficacité de la transmission. Le rotavirus est par ailleurs très résistant (il n'est inactivé que par

    chauffage à 50°C pendant 1h (Estes et al., 1979)) et peut survivre plusieurs heures sur denombreuses surfaces environnementales ce qui favorise sa dissémination rapide. Les rotavirus sont

  • 6

    aussi par voie de conséquence une importante source de maladies nosocomiales dans les

    maternités, les crèches et les services pédiatriques.

    1.1.3 Epidémiologie.

    Divers agents infectieux sont à l'origine des gastro-entérites chez les enfants. Ces agents peuvent

    être des virus (Calicivirus, Adénovirus, Astrovirus ou Rotavirus), des bactéries (Salmonella,

    Campylobacter, E.coli…) ou des parasites. Parmi tous ces agents, le rotavirus est considéré

    comme étant la principale cause des gastro-entérites d'origine virale touchant l'Homme (cf. figure

    1) et les animaux en bas âge. Il engendre des pertes économiques considérables, tant dans le

    secteur de la santé publique que dans le secteur agronomique.

    0

    0,5

    1

    1,5

    2

    2,5

    3

    3,5

    Infections

    respiratoires

    (pneumonie &

    influenza)

    SIDA

    gastro-

    entérites

    Tuberculose

    Malaria

    Rougeole

    morts (million)

    +5 ans

    - 5ans

    Ages

    figure 1: Impact des maladies infectieuses majeures dans le monde en 1998 (source: O.M.S.)

    1.1.3.1 Impact sur la santé publique

    Le rotavirus est un virus infectant aussi bien les enfants des pays industrialisés que ceux des pays

    du tiers monde. Mais dans les pays en développement, les rotavirus apparaissent comme l'une des

    causes les plus importantes de mortalités infantiles. Ils sont retrouvés chez 40% des enfants de

    moins de cinq ans atteints de diarrhées et seraient la cause de 870 000 décès par an (Glass et al.,

    1994; Hoshino et Kapikian, 1994; Kapikian et R.M., 1996)2.

    2 Voir aussi les données fournies par l’organisation mondiale de la santé:http://www.who.int/infectious-disease-report/media/graph05.gifhttp://www.who.int/infectious-disease-report/pages/grfindx.html

    http://www.who.int/infectious-disease-report/media/graph05.gifhttp://www.who.int/infectious-disease-report/pages/grfindx.html

  • 7

    Dans les pays développés, le rotavirus a des conséquences moindres sur la mortalité infantile (75 à

    125 décès par an aux USA). Cependant, aux Etats-Unis le rotavirus est associé à 3% des

    hospitalisations des enfants de moins de 5 ans, ces enfants sont en moyenne sujets à 1,3 épisodes

    de diarrhées par an, ce qui représente annuellement plus de 20 millions de visites médicales et

    200000 hospitalisations. L'impact économique est énorme puisque le coût médical direct est estimé

    à 300 millions de dollars par an et le coût social total serait estimé à 1 milliard de dollars (Glass et

    al., 1996a; Glass et al., 1996b; Parashar et al., 1998).

    1.1.3.2 Impact agronomique

    En ce qui concerne les animaux, les gastro-entérites entraînent une morbidité élevée et une mortalité

    qui peut atteindre 93% dans certains élevages (Woode et al., 1982). Le rotavirus est responsable

    de diarrhées chez de nombreuses espèces animales et des souches bovines, porcines, ovines,

    aviaires, simiennes, murines, félines, équines et canines ont été identifiées. En 1978 il était estimé

    que le rotavirus était responsable d'une perte économique d'environ 9 millions de dollars aux USA

    en l'espace de 6 ans (House, 1978). C'est l'une des rares estimations publiée sur le sujet, mais

    compte tenu de la place des diarrhées animales dans le secteur agronomique, ce chiffre doit être

    aujourd'hui beaucoup plus important.

    Des enquêtes sur le terrain ont montré que le rotavirus est largement prédominant dans les

    diarrhées des veaux ayant entre 1 et 30 jours, soit 16,4% des cas aux Etats-Unis, 53% des cas en

    Argentine, et 22,8% en Tunisie. La plupart des animaux atteints de gastro-entérites montrent des

    amaigrissements brutaux, des anorexies, des vomissements occasionnels, parfois de la fièvre et

    des diarrhées. La mort survient parfois après 3 à 7 jours de diarrhée (Saif et Jiang, 1994).

    1.1.4 Immunité.

    Les enfants infectés par le rotavirus sont protégés contre la forme sévère de la maladie lors d'une

    réinfection (Ward, 1996). Alors que les symptômes les plus graves semblent n'apparaître que lors

    d'une infection primaire, des réinfections asymptomatiques sont fréquemment observées, leur

    importances diminuant avec l'âge. Ces observations suggèrent qu'une réponse immunitaire

    protectrice contre le rotavirus se développe mais qu'elle semble ne s'installer que progressivement,

    à la suite de plusieurs infections. Même si les mécanismes immunologiques mis en œuvre ne sont

    pas totalement connus, il est vraisemblable que la muqueuse ainsi que la réponse cellulaire soient

    impliquées dans la protection à la maladie. Chez l'Homme, les mécanismes impliqués dans le

    développement de la réponse immunitaire au niveau des muqueuses ou anti-rotavirales sont encore

    mal connus. La protection contre le rotavirus a été corrélée à plusieurs reprises avec la présence

    d'anticorps dans le sérum et les fèces. Cependant, des résultats très contradictoires ont été publiés

    sur la corrélation entre la protection et les anticorps neutralisants spécifiques de sérotypes:

    La souris est le modèle le plus utilisé pour étudier l'immunité anti-rotavirus. Le transfert passif de

    cellules CD8+ peut conduire à l'élimination du virus chez des souris immunodéprimées infectées

  • 8

    par le virus murin (Dharakul et al., 1990). Les lymphocyes CD8+ peuvent également protéger des

    souriceaux nouveaux nés contre une infection virale (Offit et Dudzik, 1990). Ces résultats

    montrent donc l'importance de l'immunité cellulaire dans la guérison et la protection des souris

    contre une infection expérimentale à rotavirus (Franco et al., 1997). Plusieurs études ont pu aussi

    mettre en évidence, chez la souris, une corrélation entre la présence d'anticorps de type IgA et le

    développement d'une réponse protectrice (Burns et al., 1996; Ruggeri et al., 1998).

    En se basant sur des essais de neutralisation in vitro, certains auteurs ont d'abord suggéré que les

    protéines externes du virus, VP4 et VP7 (voir p. 21 et 22) étaient les seules cibles de la réponse

    immune protectrice. Néanmoins, aucune corrélation n'a pu être mise en évidence entre la protection

    immunitaire et le taux d'anticorps neutralisants (Ward et al., 1992). De plus, il a été montré que les

    IgA dirigées contre VP6 pouvaient induire une protection chez la souris, ce qui suggère que la

    reconnaissance des épitopes des protéines internes du virus jouerait aussi un rôle dans la protection

    (Burns et al., 1996).

    1.1.5 Vaccination.

    1.1.5.1 Sérogroupes & Sérotypes.

    Les rotavirus sont répertoriés en 7 groupes notés de A à G , les rotavirus d'un même groupe

    partagent le même antigène de groupe, majoritairement porté par la protéine virale VP6. Les

    groupes sont définis dans des tests ELISA ou d'immuno-fluorescence, les types dans un test de

    neutralisation in vitro. Les rotavirus de groupes A, B et C sont ceux qui infectent habituellement

    les hommes et les animaux, alors que les autres groupes n'ont été observés que chez les animaux.

    Les rotavirus de groupe A sont clairement les plus étudiés car les plus courants. De plus, très peu

    de souches d'autres groupes ont été adaptées à la culture cellulaire, ce qui a limité leur étude. A

    l'intérieur de chaque groupe, différents sérotypes ont été identifiés à partir d'antigènes induisant

    des anticorps neutralisants. Ces épitopes ont été localisés sur la glycoprotéine virale VP7, la

    protéine majeure de la capside externe, pour le sérotype G (de la Glycoprotéine), et sur la protéine

    virale VP4, constituant mineur de la capside externe pour le sérotype P (VP4 sensible aux

    Protéases). Plusieurs sérotypes distincts associés à VP7 (G type) et associés à VP4 (P type) ont été

    décrits chez les animaux et chez l'Homme (Hoshino et Kapikian, 1994). Chez l'Homme, ce sont

    les sérotypes G1 et G4, et P4 et P8 qui sont les plus fréquents. (Glass et al., 1994).

    1.1.5.2 Vaccins utilisés.

    Plusieurs méthodes ont été employées afin d'élaborer un vaccin efficace. Ainsi des approches

    Jenneriennes (utilisation chez l'Homme de souches animales vivantes) ont été utilisées. Trois

    générations de vaccins anti-rotavirus ont été ainsi décrits (Glass et al., 1994; Hoshino et Kapikian,

    1994):

  • 9

    • Approche jennerienne telles que les souches bovines RIT (G6, P6) et WC3, ou la souche

    simienne RRV (G3). Ces vaccins n'ont pas dépassé les études cliniques de phase III car leur

    efficacité était très limitée.

    • Approche jennerienne modifiée : utilisation de souches animales dans lesquelles a été introduit un

    gène codant pour la protéine VP7 d'un rotavirus humain. L'efficacité serait de l'ordre de 50% mais

    atteindrait 70% dans les cas de diarrhées graves à rotavirus.

    C'est un vaccin de ce dernier type qui était disponible aux USA en septembre 1998. Kapikian et

    son équipe ont développé ce vaccin en utilisant la souche bovine RRV MMU 18006 (sérotype 3)

    comme souche parentale animale de départ, et trois souches virales humaines de sérotype 1,2 et 4

    (Kapikian et al., 1992). Ce vaccin est donc un vaccin vivant, administré oralement et dit

    "tétravalent" puisqu'il vise à induire une réponse immunitaire contre les 4 sérotypes les plus

    courants chez l'Homme. Des études réalisées en Finlande, aux USA et au Venezuela ont montré

    l'efficacité du produit: trois doses administrées avant l'âge de 6 mois ont permis d'éviter les

    diarrhées sévères chez 70% à 95% des enfants vaccinés (Kapikian et R.M., 1996; Perez-Schael et

    al., 1997; Vesikari, 1997).

    25 ans après la découverte du rotavirus humain, la communauté

    scientifique a donc délivré le premier vaccin capable de protéger

    des enfants contres des diarrhées à rotavirus. Le but du vaccin

    contre le rotavirus n'était pas d'empêcher le virus d'infecter les

    individus mais de minimiser les effets de l'infection. Il faut aussi

    noter que les vaccins vétérinaires utilisant des virus inactivés sont

    disponibles depuis une vingtaine d'années mais leur efficacité

    reste douteuse (Saif et Fernandez, 1996).

    Le dernier vaccin de Kapikian a donc été retiré du marché. Quinze cas d'intussusception parmi les

    enfants qui avaient récemment reçu le vaccin anti-rotavirus ont été enregistrés parmi

    approximativement 10.000 enfants qui avaient reçu diverses formulations du vaccin.

    L'intussusception est un type relativement rare d'obstruction qui se produit quand l'intestin se

    replie. Elle est plus commune parmi les enfants en bas âge. Les études n'indiquent pas si une

    infection au rotavirus antérieure ou postérieure à la vaccination a causé l'intussusception. Il faut

    aussi noter que le nombre de cas d'intussusceptions n'augmente pas pendant l'hiver comme la

    gastro-entérite à rotavirus , suggérant que si le rotavirus cause l'intussusception, il le fait rarement

    (source: O.M.S.3).

    3 Données fournies par l’organisation mondiale de la santé: ://www.who.int/gpv-safety/infobank/Q&A%20Rotavirus%20&%20Intussusception.htm

  • 10

    1.1.5.3 Autres stratégies vaccinales.

    D'autres stratégies vaccinales sont en cours d'évaluation ou ont été envisagées:

    • L'utilisation de pseudo particules virales (VLP virus like particle) recombinantes exprimées dans

    le système baculovirus. Ces particules ressemblent en tous points au rotavirus mais ne contiennent

    pas d'information génétique (Conner et al., 1996). Il a été récemment montré que des VLP

    composées des protéines bovines VP2/6/7 injectées à des souris semblent avoir la même

    immunogénicité que des virus inactivés de la souche SA11 (Madore et al., 1999);

    • L'administration directe, par différentes voies , de gènes de rotavirus codants pour les protéines

    virales antigèniques VP4, VP5 et VP6 (vaccins à ADN) (Chen et al., 1997; Choi et al., 1997;

    Herrmann et al., 1996)

    • l'utilisation de microcapsules contenant des virus infectieux. Lors de l'administration orale, cette

    préparation persisterait dans l'intestin et induirait une forte immunité locale (Khoury et al., 1995)

    • L'utilisation de peptides synthétiques et de protéines recombinantes a été envisagée. Ainsi Arias

    et al. (Arias et al., 1989) ont montré que le peptide compris entre les acides aminés 220-233 de la

    protéine VP4 est capable d'induire une réponse dirigée contre les souches SA11 et ST3 du

    rotavirus. Cette région est hautement conservée et est très proche du site de clivage tryptique de

    VP4 (voir page 21).

    1.1.6 Structure du rotavirus.

    Les rotavirus sont des virus non enveloppés, de symétrie icosahédrique à triple-capside

    couverte de spicules dont le diamètre, sans tenir compte des spicules, est de 76nm. Le génome est

    composé de 11 segments d'ARN double-brin coiffés, non-polyadénylés, qui codent

    chacun pour au moins une protéine: six protéines structurales (VP 1 à 6) qui sont présentes

    dans la particule virale, et six protéines non structurales (NSP1 à 6) synthétisées lors de

    l’infection mais ne faisant pas partie de la particule virale (Duarte, 1999; Estes et Cohen, 1989) (cf.

    figure 2). Les différentes propriétés caractéristiques des protéines du rotavirus sont présentées sur

    le tableau 1 page 12.

  • 11

    1

    234

    5

    6

    9

    10

    11

    78

    VP4

    VP7

    VP2

    VP6

    CORE

    Protéine

    VP1

    VP2VP3VP4

    NSP1

    VP6

    NSP3NSP2VP7

    NSP4

    NSP5, NSP6

    A B C

    Segmentd'ARNdb

    figure 2 Représentation schématique de la structure du rotavirus: A: Séparation sur gel d'acrylamide des 11 segments d'ARN double-brin génomiques du rotavirus de la souche RF. B:Schéma simplifié de l'organisation de la particule virale. C: Modèle de la particule virale reconstitué à partir d'études de cryoélectromicroscopie (V. Prasad, Baylor College ofMedicine, Houston http://ncmi.bioch.bcm.tmc.edu/~aepstein/).

    http://

  • 12

    NOM SEGMENT p a g e TAILLE PROPRIETESVP1 1 18 125 kD ARN polymérase virale.VP2 2 19 102 kD Compose la capside interne virale, fixe les acides nucléiques, interagit avec

    VP1, VP3. Rôle structural dans la transcription et la réplication.VP3 3 18 98 kD Guanyltransférase.VP4 4 21 86,5 kD Protéine de spicule, dimérise. Oligomérise avec VP7 et NSP4. Liée à la

    virulence. Induit des anticorps neutralisants. Clivée en VP5*et VP8*(protéine d'hémagglutination). Impliquée dans l'attachement du virus auxcellules. Induit la perméabilisation membranaire après traitement à latrypsine.

    VP6 6 19 44,8 kD Protéine majoritaire. Compose la capside intermédiaire. Antigénique, n'induitpas d'anticorps neutralisants. Trimérise. Interagit directement avec VP2.Impliquée dans l'activité transcriptase du virus.

    VP7 9 22 37,3/34kD

    Antigénique, induit des anticorps neutralisants. Clivée, elle induit laperméabilisation membranaire (in vitro, comme VP4). Glycosylée, inséréedans la membrane du reticulum endoplasmique. Fixe vraisemblablement lecalcium.

    NSP1 5 23 58,6 kD Motif en doigt de Zinc N-terminal, fixe le zinc. Lie les ARNm viraux.NSP2 8 25 36,7 kD Fixe les ARN double-brin du virus. Multimérise. Intervient dans la

    réplication. Impliquée dans la formation des viroplasmes. Activité NTPase.NSP3 7 26 34,6 kD Fixe les ARNm viraux sur la séquence consensus 3'. Dimérise. Non

    viroplasmique. Interagit avec l'eIF4G.NSP4 10 29 28 kD Glycoprotéine. Ancrée dans la membrane du reticulum endoplasmique.

    Récepteur intracellulaire des particules immatures. Tétramérise.Déstabilisation de la membrane plasmique. Entérotoxine virale.

    NSP5 11 31 21,7 kD Impliquée dans la formation des viroplasmes. Interagit avec NSP2. O-glycosylée, phosphorylée. S'autophosphoryle.

    NSP6 11 32 12 kD Viroplasmique. Interagit avec NSP5.tableau 1 Principales propriétés des protéines du rotavirus (souche SA11, groupe A).

    La particule de rotavirus triple-

    capside vue en microscopie

    éléctronique en coloration

    négative. ∅ 76nm

    La protéine VP2 (60 dimères) forme le "core" qui renferme le génome et les

    protéines VP1 et VP3, la protéine VP6 (260 trimères) couvre le core et constitue la

    deuxième capside du virion.La capside externe se compose de la protéine VP7

    (260 trimères) ainsi que de la protéine VP4, qui forme des spicules s'étendant vers

    l'extérieur de la particule (60 dimères).

    Trois types de particules sont observées en microscopie électronique: (i) la

    particule entière, lisse, triple capside, infectieuse, (ii) la particule double capside,

    d'aspect rugueux, dépourvue de la capside externe (VP7 et VP4), non infectieuse,

    et (iii) moins fréquemment, le core dépourvu aussi de la capside intermédiaire

    formée de VP6.

    Il existe entre ces capsides un réseau de cavités qui permet le passage des métabolites ou des

    nucléotides nécessaires à la transcription des ARN dans le core. Au niveau de la capside interne

    (core), seuls les 12 canaux sur les axes icosahédriques d'ordre 5 sont présents. Les études de

    Prasad et al. indiquent que l'ARN génomique est localisé au niveau de ces 12 pores de la capside

    interne (Prasad et al., 1996). Ce réseau de cavités pourrait jouer un rôle dans l'importation de

    métabolites nécessaires à la transcription de l'ARN et dans l'exportation des ARN messagers

    synthétisés par la transcriptase.

  • 13

    1.1.7 Cycle Viral.

    A ce jour de nombreuses étapes du cycle viral ne sont pas connues en détail. D'autres , telle le

    relargage de la particule virale, sont depuis peu remises en question. Les étapes du cycle viral sont

    schématisées sur la figure 3.

    c

    ccc

    c

    c

    c

    c

    c

    Noyau

    VP1VP2VP3VP4VP6

    NSP1VP7

    NSP2

    NSP3

    NSP4

    NSP5

    c

    c

    1

    2

    3

    4

    6

    VIROPLASME

    ? ?

    Traduction desprotéines Virales.

    Réplication.

    c

    5

    RETICULUM

    figure 3: Le cycle du Rotavirus. (1)La pénétration du rotavirus dans la cellule pourrait se faire soit par endocytose, soit parune pénétration directe du virus. Après le passage du virus à travers la membrane plasmique et perte de la capside externe, laparticule à double-capside se retrouve dans le cytoplasme. (2) Les ARNm servent alors de matrice pour la réplication du génomeviral et (3) à la synthèse des protéines virales. (4) Au cours de la réplication, des inclusions (viroplasmes) contenant desprotéines virales sont le siège de l'assemblage du rotavirus. (5) Après réplication de l'ARN, les particules à double-capside sefixent sur NSP4 au niveau des membranes du réticulum où elles vont bourgeonner et acquérir une enveloppe transitoire ainsique leur troisième capside formée des protéines VP7 et VP4. (6) Les particules virales sont relarguées par la lyse de la cellule.Des éléments récents indiquent que la lyse de la cellule n'interviendrait que tardivement (24H p.i.), c'est-à-dire lorsque denombreux virus sont déjà sortis (dans des cellules differentiées Caco 2).

  • 14

    1.1.7.1 Adsorption, pénétration et décapsidation

    La première étape de l'infection par le rotavirus est la reconnaissance et l'attachement aux

    entérocytes différenciés à bordure en brosse (Kapikian et R.M., 1996). Le récepteur cellulaire

    permettant l'entrée du virus dans la cellule n'a pas été identifié.

    1.1.7.1.1 Adsorption

    On a longtemp pensé que l'attachement initial des souches animale était dépendant de l'acide

    sialique (présent sur un récepteur cellulaire), comme c'est le cas pour de nombreux virus (Weis et

    al., 1988). Ces travaux ont toutefois été contredits par une étude de Ciarlet (Ciarlet et Estes, 1999)

    qui a montré que la plupart des souches animales ou humaines sont capables d'infecter les cellules

    de façon indépendante de l'acide sialique.

    Les protéines VP4 et VP7 portent des motifs de reconnaissance des integrines qui seraient

    potentiellement reconnues par le rotavirus (Coulson et al., 1997; Hewish et al., 2000). Notons par

    ailleurs que le virus adapté à la culture cellulaire doit être préalablement traité à la trypsine (clivage

    de la protéine VP4 en VP5* et VP8*) pour être infectieux. Ce clivage, qui semble être associé au

    passage du virus à travers la membrane plasmique, provoque une augmentation de l'infectivité du

    virus (Mackow et al., 1989).

    1.1.7.1.2 Pénétration.

    Le mode d'entrée du virus est sujet à controverse. Deux voies d'entrée ont été décrites à partir de

    résultats obtenues en microscopie électronique ou biochimiques: entrée directe du virus par la

    membrane plasmique cellulaire (Kaljot et al., 1988) ou entrée par endocytose (Ludert et al., 1987).

    Certains auteurs ont suggéré que les deux voies d'entrées seraient utilisées par le virus.

    1.1.7.1.3 Décapsidation.

    Plusieurs faits font cependant l'unanimité: l'entrée du virus est pH-indépendante et elle

    s'accompagne de la perte de la capside externe. La décapsidation semble dépendante de la faible

    concentration cytoplasmique en calcium (Ludert et al., 1987), et est reconstituée in vitro par la

    chelation du calcium (Cohen et al., 1979; Gajardo et al., 1997).

    1.1.7.2 Réplication.

    Une fois le virus entré dans la cellule et après la perte de sa capside externe, des particules double-

    capside sont présentes dans le cytoplasme de la cellule. La polymérase virale VP1 est activée et

    synthétise des ARN non polyadénylés, coiffés en 5' par la guanyltransférase VP3. Les ARNm ont

    deux rôles: ils servent à la synthèse des protéines virales et à la réplication du génome.

  • 15

    L'ARNdb n'étant jamais retrouvé libre dans le cytoplasme des cellules infectées (Patton, 1990), la

    transcription a donc lieu à l'intérieur des particules à double-capside.

    La plupart des protéines virales, structurales ou non structurales, sont synthétisées à partir de

    ribosomes libres du cytoplasme. Cependant les glycoprotéines VP7 et NSP4 sont synthétisées sur

    des ribosomes associés aux membranes du réticulum endoplasmique et sont insérées

    progressivement dans la membrane du réticulum grâce à leur séquence signal N-terminale (Ericson

    et al., 1983; Kabcenell et Atkinson, 1985).

    Particules de rotavirus vues en microscopie electronique.

    Le système de régulation de la

    traduction n'est pas encore totalement

    connu mais la protéine NSP3 joue un

    très grand rôle dans la synthèse des

    protéines virales et l'arrêt de la

    traduction des protéines cellulaires (cf.

    page 26).

    1.1.7.3 Encapsidation et Assemblage.

    Chez le rotavirus, il semble qu'une seule copie de chacun des 11 segments soit sélectivement

    répliquée et encapsidée (Estes et Cohen, 1989). Il existe donc un système très complexe de

    signaux de reconnaissance et d'interaction ARN-protéine et ARN-ARN pour opérer ce choix.

    Ainsi chacun des ARNm du rotavirus devrait-il être sélectivement reconnu puis incorporé dans la

    particule virale en cours de formation. Cette reconnaissance pourrait impliquer les parties non

    traduites conservées des 11 ARNm viraux.

    1.1.7.3.1 Une enveloppe transitoire.

    Après réplication de l'ARN, les particules à double-capside constituées de VP1, VP2, VP3 et VP6

    se fixent sur NSP4 au niveau des membranes du réticulum où elles vont bourgeonner et acquérir

    ainsi une enveloppe transitoire (Schulze et Schumacher, 1984). Le rotavirus est le seul virus

    non enveloppé qui comporte une enveloppe au cours de sa maturation.

    La particule perd son enveloppe transitoire en même temps que NSP4, VP7 et VP4 s'assemblent

    pour former la capside externe du virion. La localisation récente de VP4 à la surface des cellules et

  • 16

    non pas dans le réticulum endoplasmique pose le problème de l'acquisition de la capside externe

    (Nejmedine, 1999).

    1.1.7.3.2 Les viroplasmes.

    Les lieux d'encapsidation, réplication virale et assemblage sont vraisemblablement les inclusions

    virales (viroplasmes) présentes dans le cytoplasme de la cellule infectée au voisinage du

    réticulum endoplasmique (Kabcenell et al., 1988; Petrie et al., 1984). Le mécanisme de formation

    de ces viroplasmes était encore mal défini jusqu’à ce que Fabretti (Fabbretti et al., 1999) découvre

    que les gènes codant protéines NSP2 et NSP5 peuvent produire des inclusions identiques aux

    viroplasmes lorsqu'ils sont co-transfectés dans des cellules eucaryotes.

    1.1.7.3.3 Relargage.

    Les nouvelles particules virales sont ensuite relarguées de la cellule. Jourdan et al. (Jourdan et al.,

    1997) ont observé un relarguage des particules virales sans lyse des cellules infectées (cellules

    intestinales humaines Caco-2, souche simienne RRV). Un nouveau mode de sortie du virus a été

    évoqué, indépendant du transport vésiculaire classique impliquant l'appareil de Golgi. La lyse de la

    cellule n'interviendrait que tardivement (24H p.i.), c'est à dire lorsque de nombreux virus sont

    déjà sortis.

    1.1.8 Génome.

    La taille totale du génome du rotavirus est de 18,5 kb répartis en 11 segments d'ARN

    double-brin coiffés à l'extrémité 5' et non polyadénylés (Imai et al., 1983). Leur taille varie