RÔLE DES PROBIOTIQUES LORS D’INFECTIONS ......For decades, the use of certain lactic acid...

MÉLANIE GAGNON RÔLE DES PROBIOTIQUES LORS D’INFECTIONS

ENTÉRIQUES D’ORIGINE BACTÉRIENNE ET VIRALE : ANALYSES IN VITRO ET ÉTUDES

IN VIVO CHEZ DES MODÈLES MURINS

Thèse présentée à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval

dans le cadre du programme de doctorat en sciences et technologie des aliments pour l’obtention du grade de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

DÉPARTEMENT DES SCIENCES DES ALIMENTS ET DE NUTRITION FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC

2007 © Mélanie Gagnon, 2007

i

Résumé

Afin de stabiliser le microbiote intestinal et prévenir ou traiter les infections entériques,

il est suggéré depuis des décennies d’utiliser certaines bactéries lactiques dites ‘probiotiques’.

La consommation de ces bactéries, qui sont des composants normaux du microbiote intestinal,

aurait des effets bénéfiques sur la santé. Cependant, leur éventuel rôle prophylactique ou

thérapeutique n’a été que très peu étudié. Dans une première partie, cinq bifidobactéries

probiotiques isolées de fèces de nouveaux-nés ont été sélectionnées et caractérisées. Parmi

celles-ci, une souche de Bifidobacterium thermacidophilum (RBL71) démontrant une forte

résistance aux conditions retrouvées dans le tractus intestinal, une forte adhésion aux cellules

intestinales Caco-2 et une inhibition de l’adhésion d’Escherichia coli O157:H7 (50%) aux

cellules Caco-2 a été administrée par voie orale à des souris BALB/c. Ce gavage probiotique

avant infection à E. coli O157:H7 a diminué les comptes fécaux de ce pathogène ainsi que les

dommages histologiques intestinaux comparativement au groupe témoin. Une plus forte

production d’anticorps spécifiques anti-E. coli O157:H7 a également été détectée chez les

souris recevant la souche probiotique. Dans une seconde partie, l’efficacité de trois autres

souches de bifidobactéries a été vérifiée contre des entéropathogènes viraux. Une souche de

B. thermophilum (RBL67) démontrant la plus forte inhibition de l’attachement du rotavirus

(98%) aux cellules intestinales Caco-2 et HT-29 a été administrée par voie orale à des souris

néonatales CD-1 infectées par un rotavirus. La concentration de virus dans le contenu intestinal

était significativement moins élevée à 48 heures post-infection chez le groupe recevant des

probiotiques avant infection par rapport au groupe témoin. De plus, la durée de la diarrhée a été

plus courte et une production d’anticorps spécifiques anti-rotavirus a été détectée chez les

souris recevant des probiotiques avant l’infection. Ces résultats suggèrent que la souche RBL67

pourrait avoir un impact positif sur l’évolution des infections causées par des pathogènes viraux

invasifs tel que rotavirus et que la souche RBL71 pourrait ainsi jouer un rôle dans la prévention

ou le traitement d’infections entériques aux pathogènes bactériens non invasifs tel que E. coli

O157:H7. Dans ces deux cas, l’inhibition de l’adhésion du pathogène serait le mécanisme

d’action le plus probable. Cette démonstration de l’activité de ces nouvelles souches de

bifidobactéries d’origine humaine contre E. coli O157:H7 et rotavirus, en interférant sur le

mécanisme d’infection de ces entéropathogènes, soutient leur utilisation potentielle chez

l’humain pour prévenir les infections entériques transmises par voie orale.

ii

Abstract

For decades, the use of certain lactic acid bacteria as so-called probiotics has been

suggested in order to stabilize the intestinal microbiota and thus prevent or treat enteric

infections. Consumption of these bacteria, which are normal components of human intestinal

microbiota, is reputed to be beneficial to health. However, their possible role as therapeutic or

prophylactic agents has been studied very little. Five probiotic bifidobacteria isolated from the

feces of newborn infants were first selected and characterized. Among these, a strain of

Bifidobacterium thermacidophilum (called RBL71) demonstrating strong resistance to the

conditions prevailing in the digestive tract, strong adhesion to Caco-2 intestinal cells and

inhibition of the adhesion of Escherichia coli O157:H7 (50%) to Caco-2 cells was administered

via the oral route to BALB/c mice. Mice thus treated before challenge had reduced fecal counts

of E. coli O157:H7 and less intestinal histological damage than the control group. Greater

production of O157:H7-specific antibody was detected in mice receiving the probiotic. In a

second study, the effectiveness of three other strains of bifidobacteria against viral

enteropathogens was examined. A strain of B. thermophilum (called RBL67) demonstrating the

strongest inhibition (98%) of rotavirus attachment to Caco-2 and HT-29 intestinal cells was

administered via the oral route to neonatal CD-1 mice infected with rotavirus. The viral

concentration of the intestinal contents 48 hours after infection was significantly lower in the

probiotic-treated group than in the control group. In addition, the diarrhea was of shorter

duration and rotavirus-specific antibody production was detected in the mice receiving the

probiotic before infection. These results suggest that strain RBL67 has a positive impact on the

evolution of infections by invasive viral pathogens such as rotavirus and that strain RBL71

could thus have a role to play in the prevention or treatment of enteric infections by non-

invasive bacterial pathogens such as E. coli O157:H7. In both cases, inhibition of adhesion of

the pathogen seems to be a plausible mechanism of action. This demonstration of the activities

of these new bifidobacterial strains of human origin against E. coli O157:H7 and rotavirus

suggests their potential for interfering with the mechanism of infection of enteropathogens and

supports their use in humans as possible agents for preventing enteric infections transmitted by

the oral route.

iii

Avant-Propos

Cette thèse est divisée en sept chapitres. Le premier présente une brève revue de

littérature sur les probiotiques et leurs effets sur l’inhibition d’entéropathogènes. Les

mécanismes d’action in vitro et in vivo sont ensuite présentés et suivis d’une description des

principaux micro-organismes entéropathogènes, de leurs mécanismes d’infection et des moyens

de défense de l’hôte face à ces infections. L’hypothèse de travail et les objectifs de cette thèse

sont énoncés à la fin de cette section.

Les cinq chapitres suivants présentent les résultats obtenus lors de mes travaux de

recherche. Ils sont rédigés sous la forme d’article scientifique, en anglais, et accompagnés d’un

résumé en français. Le premier article intitulé: «In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7

by bifidobacterial strains of human origin» a été publié dans International Journal of Food

Microbiology en 2004 (92: 69-78). Il porte sur la sélection et la caractérisation in vitro de

souches de bifidobactéries à fort potentiel probiotique et sur l’étude de l’inhibition de la souche

pathogène E. coli O157:H7 par des souches de bifidobactéries à l’aide d’un test de compétition

in vitro. J’ai contribué à ce travail en accomplissant l’ensemble de la partie expérimentale et en

effectuant la rédaction de l’article avec le soutien scientifique d’Ehab Kheadr et Gwenaëlle Le

Blay.

Le deuxième article de cette thèse est intitulé : «Effect of Bifidobacterium

thermacidophilum probiotic feeding on enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection

in BALB/c mice». Il a été publié dans International Journal of Food Microbiology en 2006

(111: 26-33). Cet article porte sur l’effet de la consommation préventive et thérapeutique d’une

souche sélectionnée de bifidobactérie d’origine humaine à fort potentiel probiotique sur une

infection à E. coli O157:H7 induite chez des souris. J’ai contribué à ce travail en réalisant les

manipulations sur les souris avec l’aide du personnel animalier, l’intégralité des analyses

d’échantillons provenant des animaux et la rédaction de l’article. Nassra Dabour (Université

Laval, Québec, Canada) a effectué l’analyse génétique de la souche de bifidobactérie utilisée

pour cette étude.

iv Le troisième article intitulé : «Quantitative cell attachment assay of enteric viruses to

human cultured intestinal cells using plaque technique and immunofluorescent assay» a été

soumis au Journal of Virological Methods. Il décrit une nouvelle méthode permettant d’évaluer

l’attachement des rotavirus, d’un substitut de norovirus et du virus de l’hépatite A aux cellules

intestinales Caco-2 et HT-29 cultivées in vitro. J’ai contribué à ce travail en accomplissant la

totalité des expériences et la rédaction de l’article.

Le quatrième article inséré dans cette thèse s’intitule: «Inhibitory effect of human

bifidobacteria on the attachment of enteric viruses to intestinal cell lines». Cet article sera

prochainement soumis au journal Applied and Environmental Microbiology. Cette étude porte

sur l’évaluation de la capacité de bifidobactéries d’origine humaine à exclure, à entrer en

compétition et à déplacer les rotavirus, les substituts de norovirus et le virus de l’hépatite A sur

les cellules Caco-2 et HT-29 en culture. J’ai réalisé intégralement la partie expérimentale avec

les modèles cellulaires ainsi que la rédaction de l’article. Ueli Von Ah (ETH, Zürich, Suisse) a

effectué l’analyse génétique des souches de bifidobactéries utilisées lors de cette étude.

Le cinquième article intitulé «Effect of bifidobacterial feeding on heterologous

rotavirus infection of suckling CD-1 mice» sera soumis au journal BMC Microbiology. Cette

étude animale évalue l’effet de la consommation préventive et thérapeutique d’une souche

sélectionnée de bifidobactérie d’origine humaine à fort potentiel probiotique sur une infection à

rotavirus induite chez des souriceaux. J’ai effectué les manipulations sur les souris avec l’aide

du personnel de la division des animaux de laboratoire, l’intégralité des analyses de même que

la rédaction de l’article.

Une conclusion générale sous la forme d’un septième chapitre souligne les résultats

importants de ce projet et présente une vue d’ensemble ainsi que les perspectives de recherche

de ces travaux. Les références bibliographiques citées dans cette thèse sont décrites à la fin du

manuscrit.

v

Remerciements

Je tiens d’abord à remercier cordialement toutes les personnes qui m’ont aidée à mener mon projet de doctorat à terme. Je pense en particulier à:

Ismaïl Fliss, mon directeur, pour son encadrement, sa confiance et son soutien tout au long de mon cheminement en recherche. Je le remercie aussi pour sa vision hors pair et son ‘leadership’ remarquable.

André Darveau, mon co-directeur, pour sa compétence, ses conseils qui m’ont fait progresser, son appui et sa confiance. Je tiens également à le remercier de m’avoir si gentiment accueillie dans son laboratoire pour une partie de mes travaux.

Julie Jean, ma prélectrice, pour son implication dans ce projet, son dynamisme et ses encouragements. Christophe Lacroix de l’Institut fédéral de technologie ETH (Zürich, Suisse) et aussi Michael Gänzle de l’Université de l’Alberta (Edmonton, Canada) pour avoir accepté d’être co-évaluateurs de cette thèse.

Mes collègues Gwenaëlle Le Blay et Ehab Kheadr pour leur aide, leur enthousiasme concernant mon projet et pour les discussions fructueuses que nous avons eues.

Le personnel à l’animalerie pour leur assistance technique indispensable lors des manipulations avec les souris et spécialement Mélanie Pelletier et Sébastien Poulin.

Mes collègues au laboratoire, qui ont contribué à une atmosphère de travail agréable et conviviale: Cécile Cinquin, Guénolée Prioult, Imane Tahiri, Irena Kukavica-Ibrulj et Marguerite Loembé.

Tous les membres du groupe de recherche STELA qui m’ont accompagnée durant ces années et j’aimerais remercier sincèrement Hélène Bissonnette pour son aide précieuse concernant les questions administratives et financières.

Ma famille et tout particulièrement mes parents, Estelle & Jean-Marie, qui m’ont soutenue et encouragée tout au long de mes études.

Enfin, je voudrais remercier mon amoureux, Franck, pour son appui, son aide et ses encouragements.

Ces études ont été supportées financièrement par le Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT) et le Conseil de Recherches en Sciences Naturelles et en Génie du Canada (CRSNG).

vi

À Franck et mes Parents

vii

Table des matières

RÉSUMÉ ...............................................................................................................................I ABSTRACT.......................................................................................................................... II AVANT-PROPOS ................................................................................................................ III REMERCIEMENTS .............................................................................................................. V TABLE DES MATIÈRES...................................................................................................... VII LISTE DES TABLEAUX ...................................................................................................... XII LISTE DES FIGURES.........................................................................................................XIII INTRODUCTION...................................................................................................................1 CHAPITRE 1. REVUE DE LITTÉRATURE..............................................................................3

1.1 LES PROBIOTIQUES.....................................................................................................4

1.1.1 Historique de leur utilisation et définitions ........................................................4 1.1.2 Souches à fort potentiel probiotique...................................................................6 1.1.3 Les Bifidobactéries.............................................................................................7 1.1.4 Critères de sélection des probiotiques ..............................................................10 1.1.5 Allégations santé ..............................................................................................13 1.1.6 Guide pour l’évaluation des probiotiques en utilisation alimentaire................14

1.2 L’ACTIVITÉ ANTIMICROBIENNE DES PROBIOTIQUES CONTRE LES

ENTÉROPATHOGÈNES ...............................................................................................17 1.2.1 Mécanismes d’action : les études in vitro et in vivo.........................................17

1.2.1.1 Compétition spécifique et non-spécifique pour l’adhésion........................ 18 1.2.1.2 Production de substances antimicrobiennes............................................... 20 1.2.1.3 Compétition au niveau de l’utilisation des nutriments............................... 23 1.2.1.4 Stimulation des mécanismes de défense immunitaire................................ 23

1.2.2 Études cliniques................................................................................................24

1.3 LES INFECTIONS ENTÉRIQUES ET RÉPONSES DE L’HÔTE.........................................27 1.3.1 Principales causes d’infections entériques .......................................................27 1.3.2 Infections d’origine bactérienne.......................................................................27

1.3.2.1 E. coli O157:H7 chez l’humain.................................................................. 28 1.3.2.2 Pathogenèse................................................................................................ 29 1.3.2.3 Moyens de lutte et traitements actuels ....................................................... 31

1.3.3 Infections d’origine virale ................................................................................31 1.3.3.1 Rotavirus chez les enfants.......................................................................... 32 1.3.3.2 Pathogenèse................................................................................................ 33 1.3.3.3 Prévention .................................................................................................. 35

1.3.4 Défenses de l’hôte ............................................................................................35 1.3.4.1 Importance de la barrière microbienne ...................................................... 37 1.3.4.2 Modulations des mécanismes de la réponse immunitaire .......................... 40

viii

1.4 BUT, HYPOTHÈSE ET OBJECTIFS DU TRAVAIL..........................................................42 1.4.1 But ....................................................................................................................42 1.4.2 Hypothèse.........................................................................................................42 1.4.3 Objectifs ...........................................................................................................43

CHAPITRE 2. INHIBITION IN VITRO D’ESCHERICHIA COLI O157:H7 PAR DES

SOUCHES DE BIFIDOBACTÉRIES D’ORIGINE HUMAINE IN VITRO INHIBITION OF ESCHERICHIA COLI O157:H7 BY BIFIDOBACTERIAL STRAINS OF HUMAN ORIGIN.........................................45

2.1 RÉSUMÉ ....................................................................................................................46 2.2 ABSTRACT.................................................................................................................47 2.3 INTRODUCTION.........................................................................................................48

2.4 MATERIALS AND METHODS......................................................................................49

2.4.1 Bacterial strains and growth conditions ...........................................................49 2.4.2 Isolation procedures .........................................................................................50 2.4.3 Carbohydrate fermentation...............................................................................50 2.4.4 Lysozyme, acid, bile and hydrogen peroxide tolerance ...................................51 2.4.5 Antagonism between bifidobacteria and E. coli O157:H7...............................51 2.4.6 Caco-2 cell culture............................................................................................51 2.4.7 Bacterial adhesion assay...................................................................................52 2.4.8 Enumeration of adherent bacteria.....................................................................52 2.4.9 Immunofluorescent detection of bacterial adhesion to Caco-2 cells................53 2.4.10 Statistical analysis ............................................................................................53

2.5 RESULTS ...................................................................................................................54

2.5.1 Isolation of bifidobacterial strains ....................................................................54 2.5.2 Carbohydrate fermentation...............................................................................55 2.5.3 Lysozyme, acid, bile and hydrogen peroxide tolerance ...................................55 2.5.4 Antagonism between bifidobacteria and E. coli O157:H7...............................56 2.5.5 Bacterial adhesion to Caco-2 cells ...................................................................57 2.5.6 Inhibition of E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells ..................................59

2.6 DISCUSSION ..............................................................................................................61 2.7 CONCLUSIONS...........................................................................................................64 2.8 ACKNOWLEDGEMENTS.............................................................................................64

ix

CHAPITRE 3. EFFET DU GAVAGE PROBIOTIQUE AVEC B. THERMACIDOPHILUM CONTRE L’INFECTION ENTEROHEMORRAGIQUE A E. COLI O157:H7 CHEZ DES SOURIS BALB/C

EFFECT OF BIFIDOBACTERIUM THERMACIDOPHILUM PROBIOTIC FEEDING ON ENTEROHEMORRHAGIC ESCHERICHIA COLI O157:H7 INFECTION IN BALB/C MICE......................................................................65


3.4 MATERIAL AND METHODS........................................................................................69

3.4.1 Animals ............................................................................................................69 3.4.2 Bacterial strains and growth conditions ...........................................................69 3.4.3 Genetic identification and phenotypic characterization ...................................70 3.4.4 Mice feeding and infection procedure..............................................................71 3.4.5 Feed intake, body weight and body composition measurements .....................72 3.4.6 Histological analysis.........................................................................................73 3.4.7 Measurement of antibodies in fecal samples and sera using enzyme-

linked immunosorbent assay (ELISA) .............................................................73 3.4.8 Statistical analysis ............................................................................................74

3.5 RESULTS ...................................................................................................................74

3.5.1 Genetic identification and phenotypic characterization of strain RBL71 ........74 3.5.2 E. coli O157:H7 infection in BALB/c mice .....................................................75 3.5.3 Effect of B. thermacidophilum RBL71 feeding on fecal bacterial counts,

feed intake, body weight and composition.......................................................78 3.5.4 Histological examination..................................................................................78 3.5.5 Antibody responses to E. coli O157:H7...........................................................80

3.6 DISCUSSION ..............................................................................................................82 3.7 CONCLUSIONS...........................................................................................................84 3.8 ACKNOWLEDGEMENTS.............................................................................................84

CHAPITRE 4. METHODE QUANTITATIVE POUR EVALUER L’ATTACHEMENT DES

VIRUS ENTERIQUES AUX CELLULES INTESTINALES CULTIVEES IN VITRO EN UTILISANT LA TECHNIQUE DES PLAGES DE LYSE ET L’IMMUNOFLUORESCENCE QUANTITATIVE CELL ATTACHMENT ASSAY OF ENTERIC VIRUSES TO HUMAN CULTURED INTESTINAL CELLS USING PLAQUE TECHNIQUE AND IMMUNOFLUORESCENT ASSAY............................................................85


x

4.4 MATERIALS AND METHODS .....................................................................................89 4.4.1 Cell culture .......................................................................................................89 4.4.2 Viruses..............................................................................................................90 4.4.3 Viral attachment assays to Caco-2 and HT-29 cells.........................................91 4.4.4 Viral replication assays ....................................................................................92 4.4.5 Quantification of FCV and HAV by plaque assay ...........................................92 4.4.6 Quantification of rotavirus by indirect immunofluorescent assay ...................93 4.4.7 Statistical analysis ............................................................................................93

4.5 RESULTS AND DISCUSSION........................................................................................94

4.5.1 Sensitivity and specificity of plaque assay and immunofluorescent assay ......94 4.5.2 Viral attachment to Caco-2 and HT-29 cells....................................................96 4.5.3 Verification of the underestimation of virus-cell attachment...........................98 4.5.4 Viral replication in cultured intestinal cells .....................................................98

4.6 CONCLUSION ..........................................................................................................100 4.7 ACKNOWLEDGEMENTS...........................................................................................100

CHAPITRE 5. EFFET INHIBITEUR DES BIFIDOBACTÉRIES HUMAINES SUR

L’ATTACHEMENT DES VIRUS ENTÉRIQUES AUX LIGNÉES CELLULAIRES INTESTINALES

INHIBITORY EFFECT OF HUMAN BIFIDOBACTERIA ON THE ATTACHMENT OF ENTERIC VIRUSES TO INTESTINAL CELL LINES ...........101

5.1 RÉSUMÉ ..................................................................................................................102 5.2 ABSTRACT...............................................................................................................103 5.3 INTRODUCTION.......................................................................................................104

5.4 MATERIALS AND METHODS....................................................................................105

5.4.1 Preparation of bacterial and viral strains ........................................................105 5.4.2 Cell culture .....................................................................................................106 5.4.3 Bifidobacterial adhesion assay .......................................................................107 5.4.4 Assays for antiviral activity of bifidobacteria ................................................107 5.4.5 Plaque assay ...................................................................................................108 5.4.6 Cell culture immunofluorescence assay .........................................................109 5.4.7 Statistical analysis ..........................................................................................109

5.5 RESULTS .................................................................................................................109

5.5.1 Bifidobacterial adhesion to Caco-2 and HT-29 cells .....................................109 5.5.2 Exclusion of enteric viruses by bifidobacteria ...............................................110 5.5.3 Competition between bifidobacteria and enteric viruses ...............................111 5.5.4 Displacement of enteric viruses by bifidobacteria .........................................111

5.6 DISCUSSION ............................................................................................................116 5.7 CONCLUSIONS.........................................................................................................118 5.8 ACKNOWLEDGEMENTS...........................................................................................119

xi

CHAPITRE 6. EFFET DU GAVAGE AVEC DES BIFIDOBACTERIES CONTRE L’INFECTION HETEROLOGUE A ROTAVIRUS CHEZ DES SOURICEAUX CD-1 EFFECT OF BIFIDOBACTERIAL FEEDING ON HETEROLOGOUS ROTAVIRUS INFECTION OF SUCKLING CD-1 MICE...................................120

6.1 RÉSUMÉ ..................................................................................................................121 6.2 ABSTRACT...............................................................................................................122 6.3 INTRODUCTION.......................................................................................................123

6.4 MATERIALS AND METHODS....................................................................................124

6.4.1 Animals ..........................................................................................................124 6.4.2 Cell and viral culture ......................................................................................125 6.4.3 Bacterial strain and growth conditions ...........................................................125 6.4.4 Feeding and viral challenge of suckling mice ................................................126 6.4.5 Determination of rotavirus in intestines .........................................................127 6.4.6 Bacterial counts ..............................................................................................127 6.4.7 Histology ........................................................................................................127 6.4.8 Antibody production.......................................................................................128 6.4.9 Statistical analysis ..........................................................................................129

6.5 RESULTS .................................................................................................................129

6.5.1 Clinical outcome.............................................................................................129 6.5.2 Bifidobacterial counts in mouse intestines.....................................................130 6.5.3 Rotavirus counts in mouse intestines .............................................................131 6.5.4 Histological lesions in mouse intestines during rotavirus infection...............131 6.5.5 Antibody responses to rotavirus .....................................................................133

6.6 DISCUSSION ............................................................................................................134 6.7 CONCLUSIONS.........................................................................................................136 6.8 ACKNOWLEDGEMENTS...........................................................................................136

CHAPITRE 7. CONCLUSION GÉNÉRALE..........................................................................137

BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................140

xii

Liste des tableaux

Tableau 1.1 : Liste des principales souches microbiennes considérées comme

probiotiques. ...................................................................................................6 Tableau 1.2 : Espèces connues de bifidobactéries et leur habitat. ........................................8 Tableau 1.3 : Principaux critères de sélection des probiotiques. ........................................10 Tableau 1.4 : Études cliniques concernant l’efficacité de souches probiotiques

commerciales lors d’infections entériques....................................................25 Tableau 1.5 : Principaux agents infectieux responsables d’infections entériques. .............27 Tableau 1.6 : Rôles des différents groupes bactériens retrouvés dans le microbiote. ........39 Table 2.1 : Carbohydrate fermentation profile of isolated bifidobacteria and

correlation coefficient with known Bifidobacterium species. ......................55 Table 2.2 : Tolerance of bifidobacteria strains to various biochemical factors. .............56 Table 2.3 : Inhibition of E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells by

bifidobacteria strains.....................................................................................59 Table 3.1 : Feed intake and percent change in lean and fat masses of BALB/c mice

seven days after challenge with E. coli O157:H7.........................................77 Table 4.1 : Cell lines used in this study. .........................................................................90 Table 4.2 : Attachment of enteric viruses to human intestinal cells after 90 min...........96 Table 4.3 : Influence of freeze-thaw cycles on the quantitation of enteric viruses

bound to intestinal cells after 90 min............................................................98 Table 5.1 : Adhesion of bifidobacteria to human intestinal cells..................................110 Table 5.2 : Exclusion of enteric viruses from attachment to human enteric cells by

bifidobacteria. .............................................................................................113 Table 5.3 : Competition between enteric viruses and bifidobacteria for

attachment/adhesion sites on human enteric cells. .....................................114 Table 5.4 : Displacement of enteric viruses from human enteric cells by

bifidobacteria. .............................................................................................115

xiii

Liste des figures

Figure 1.1 : Souche de bifidobactérie. Microscopie électronique à balayage. ...................7 Figure 1.2 : Changement du microbiote intestinal en fonction de l’âge.. ..........................9 Figure 1.3 : Guide pour l’évaluation des probiotiques en utilisation alimentaire ............16 Figure 1.4 : Mécanismes d’action proposés des micro-organismes probiotiques

dans le traitement des infections entériques.. ...............................................17 Figure 1.5 : Mécanisme d’inhibition de l’adhésion des pathogènes par un effet

barrière dû à l’adhésion spécifique et non spécifique des probiotiques. ......18 Figure 1.6 : Mode d’action des acides organiques produits par les probiotiques

contre les pathogènes bactériens..................................................................21 Figure 1.7 : E. coli O157:H7. Microscopie électronique à balayage. ..............................28 Figure 1.8 : Pathogénie de la souche entérohémorragique E. coli O157:H7 chez

l’humain ........................................................................................................30 Figure 1.9 : Particules du rotavirus. Microscopie électronique à transmission................33 Figure 1.10 : Pathogénie des rotavirus chez l’humain. . ....................................................34 Figure 1.11 : Défenses antimicrobiennes de l’hôte face à l’intrusion de micro-

organismes pathogènes au niveau du tractus intestinal.. ..............................36 Figure 1.12 : Colonisation microbienne du tractus gastrointestinal humain.. ....................38 Figure 1.13 : Le système immunitaire intestinal.. ..............................................................40 Figure 2.1 : Agarose gel electrophoresis of PCR products from infant

bifidobacterial isolates used in this study.. ...................................................54 Figure 2.2 : Agar spot test showing antagonistic activity of infant bifidobacterial

isolates and B. breve ATCC 15700 against E. coli O157:H7.. .....................57 Figure 2.3 : Bacterial adhesion to the human intestinal cell-line Caco-2.........................58 Figure 2.4 : Inhibition of enterohemorrhagic E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2

cells by infant bifdobacterial isolates............................................................60 Figure 3.1 : Fecal B. thermacidophilum RBL71 and E. coli O157:H7 counts in

group mice during the experiment.. ..............................................................76 Figure 3.2 : Body weights of the five groups of mice during the week following

challenge with E. coli O157:H7....................................................................77 Figure 3.3 : Hematoxylin and eosin stained cross-sections of mouse intestines at

day 7..............................................................................................................79 Figure 3.4 : Periodic acid-Schiff-stained cross-sections of mouse colons at day 7. ........80

xiv

Figure 3.5 : Levels of E. coli O157:H7-specific IgA in feces and IgG+IgM in serum after E. coli O157:H7 challenge. ..................................................................81

Figure 4.1 : Visualization of detection methods used for evaluating viral concentration.................................................................................................95

Figure 4.2 : Attachment of enteric viruses at concentration of 1×106 PFU/well to intestinal epithelial cells at different times post-infection. ...........................97

Figure 4.3 : Replication of enteric viruses in intestinal epithelial cells.. .........................99 Figure 5.1 : Fluorescent micrographs of MA-104 cells used for the determination of

rotavirus titer...............................................................................................112 Figure 6.1 : Body weights of the five groups of mice during the week following

challenge with rotavirus..............................................................................129 Figure 6.2 : Viable bifidobacteria in the intestines of suckling CD-1 mice fed

B. thermophilum for seven days. ................................................................130 Figure 6.3 : Content of infectious rotavirus SA-11 in the intestines of suckling

CD-1 mice after challenge ..........................................................................131 Figure 6.4 : Hematoxylin and eosin-stained cross-sections of the colons of suckling

CD-1 mice at different times post-infection with rotavirus SA-11. ...........132 Figure 6.5 : Specific immunoglobulin production in suckling CD-1 mice after

challenge with rotavirus SA-11.. ................................................................133

1

Introduction

Chaque année, les infections entériques surviennent en grand nombre. Environ 25% de

la population des pays industrialisés serait touchée annuellement conduisant dans certains cas à

des complications sévères et à l’hospitalisation. Ce problème important de santé publique

touche tous les groupes d’âge et particulièrement les populations sensibles telles que les

nourrissons, les enfants et les personnes âgées. Ces infections entériques, ayant comme

principal symptôme des diarrhées pouvant se révéler très graves, demeurent une cause majeure

de morbidité et de mortalité chez l’humain et ce, au niveau mondial. Malgré les nombreux

efforts déployés pour limiter la transmission d’entéropathogènes, la propagation peut être très

rapide et se transformer en épidémie. Le mode de transmission se fait par la voie oro-fécale

avec comme principaux intermédiaires les aliments et l’eau mais un contact direct de personne

à personne peut également être à l’origine des infections entériques. Parmi les agents

étiologiques responsables d’infections entériques, plus de la moitié des cas sont causés par des

virus alors qu’environ le tiers sont dus à des bactéries pathogènes et une très faible proportion

est attribuable aux parasites. Actuellement, ce sont les virus tels que les norovirus, rotavirus,

astrovirus et les bactéries telles que Campylobacter, Salmonella et E. coli qui sont les

pathogènes les plus souvent en cause lors de ces infections entériques.

À ce jour, les moyens généralement utilisés pour lutter contre les infections entériques

sont l’antibiothérapie et la vaccination. Cependant, des problèmes tels que l’émergence de

micro-organismes pathogènes résistants aux antibiotiques et le manque de vaccins pour

plusieurs pathogènes entériques rendent nécessaires le développement de nouveaux traitements.

Depuis quelques années, les bactéries probiotiques ayant des effets bénéfiques sur la

santé reçoivent un engouement croissant. Les facteurs contribuant à cet engouement incluent

l’augmentation de la demande des consommateurs pour des substituts naturels aux

médicaments et l’émergence d’évidences scientifiques et cliniques démontrant l’efficacité de

certaines souches probiotiques. De nombreuses publications mentionnent les bienfaits des

probiotiques sur l’équilibre du microbiote intestinal et leur action contre l’établissement de

micro-organismes pathogènes au niveau intestinal. Cependant, les relations liant ces différentes

populations ne sont que partiellement connues. Il apparaît de plus en plus évident que la

2

prédominance de certains genres bactériens tels que les Lactobacillus et les Bifidobacterium

dans le microbiote intestinal influence positivement l’hôte pour l’aider à se défendre contre des

micro-organismes potentiellement néfastes à sa santé. D’après quelques études récentes

réalisées in vitro et in vivo, les probiotiques agiraient de façon générale en renforçant les

mécanismes de défenses spécifiques et non spécifiques de l’hôte contre l’établissement et le

développement de certains entéropathogènes. Mais des études supplémentaires sont nécessaires

pour déterminer de façon précise le mécanisme d’action de chaque souche probiotique.

Dans cette étude, nous proposons d’évaluer l’effet de bifidobactéries à fort potentiel

probiotique provenant d’isolats humains et n’ayant jamais été testées pour la prévention et le

traitement d’infections entériques occasionnées par des pathogènes fréquents tels

qu’E. coli O157:H7 et rotavirus. L’étude de leurs mécanismes d’action fera également l’objet

d’une attention particulière.

3

Chapitre 1. Revue de littérature

4

1.1 Les probiotiques

1.1.1 Historique de leur utilisation et définitions

Le concept des probiotiques a été introduit pour la première fois au début du siècle

dernier par Elie Metchnikoff, un chercheur russe ayant reçu un Prix Nobel pour ses études.

Il est à l’origine de l’observation scientifique originale du rôle positif joué par certaines

bactéries sur la santé. Metchnikoff (1908) suggéra que « la dépendance des microbes

intestinaux par l’alimentation rend possible l’adoption de mesures pour modifier la microflore

du corps en remplaçant les microbes nocifs par des microbes utiles ». Cette hypothèse venait

appuyer l’observation précédente d’un pédiatre français, Henry Tissier, qui en étudiant la

diarrhée infantile remarqua l’absence de bactéries en forme de Y qui dominent normalement

dans les fèces des jeunes enfants en bonne santé. Tissier suggéra que ces bactéries, maintenant

connues comme étant des bifidobactéries, pouvaient être utilisées pour traiter les patients

atteints de diarrhée afin de les aider à rétablir leur microflore intestinale (Tissier, 1906). Suite à

ces hypothèses, il y eut un intérêt scientifique croissant malgré le manque de résultats positifs et

d’objectivité pour certaines études. Malgré toutes les investigations réalisées, à l’aide des

techniques disponibles à l’époque, le concept demeura sans preuve et fut mis de côté pendant

de longues années. Ce n’est que depuis une vingtaine d’années que la recherche a repris dans ce

domaine. L’amélioration des techniques d’identification et de caractérisation des souches

probiotiques aidant, il est maintenant possible de sélectionner les souches les plus appropriées

pour répondre aux bénéfices santé recherchés.

Le terme probiotique provient de deux mots grecs, pro et bios, qui signifient

littéralement « pour la vie ». Il a été popularisé par Fuller en 1989 lorsqu’il lui donna sa

première définition officielle : « les probiotiques sont des suppléments alimentaires à base de

micro-organismes vivants qui agissent de façon bénéfique sur l’être vivant en améliorant

l’équilibre et la stabilité de sa microflore intestinale ». Cette définition a été révisée à plusieurs

reprises et actuellement, la plus acceptée est celle recommandée par un panel d’experts

mandatés par l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture et

l’Organisation Mondiale de la Santé. Elle indique que les probiotiques sont : « des micro-

5

organismes vivants qui lorsqu’ils sont administrés en quantités suffisantes confèrent un

bénéfice pour la santé de l’hôte » (FAO/WHO, 2002). Tel qu’indiqué, la notion de viabilité est

essentielle (Sanders, 2003). De plus, même s’il en est pas fait mention dans cette définition, la

dose généralement recommandée pour obtenir des effets bénéfiques se situe aux environs de

109 à 1010 bactéries par jour afin d’obtenir environ 108 cellules bactériennes vivantes au

duodénum (Sanders et Huis in’t Veld, 1999). L’apport doit également être régulier puisque ces

dernières ne colonisent pas l’intestin de façon permanente (Ouwehand et al., 2002a). Ceci peut

être dû au fait que la composition du microbiote résident est spécifique à chaque individu et que

les bactéries exogènes ne s’établissent pas facilement (Heyman et Ménard, 2002).

Actuellement, les probiotiques sont disponibles sous différents types de produits. Ils

peuvent être consommés sous la forme de suppléments alimentaires en capsules contenant des

cultures viables lyophilisées ou sous la forme de produits alimentaires fermentés tels que les

yogourts, qui demeurent un véhicule par excellence pour leur consommation (Sanders, 2003;

Parvez et al., 2006). D’autres produits alimentaires incorporant des probiotiques sont également

sur le marché tels que les préparations infantiles, des boissons lactées, des jus de fruits, des

fromages et d’autres actuellement en cours de développement comme la gomme à mâcher. Ces

produits contiennent une ou plusieurs souches probiotiques de genres et d’espèces différents

(Fooks et Gibson, 2002).

6

1.1.2 Souches à fort potentiel probiotique

Les principales souches reconnues en tant que probiotiques chez l’humain sont des

bactéries appartenant aux genres Lactobacillus, Bifidobacterium, Enteroccocus, Streptoccocus

et des levures du genre Saccharomyces. Les espèces associées à chacun de ces groupes sont

présentées au Tableau 1.1.

Tableau 1.1 : Liste des principales souches microbiennes considérées comme probiotiques.

Lactobacilles Bifidobactéries Autres bactéries lactiques

Autres micro-organismes non lactiques

L. acidophilus L. casei L. crispatus L. gasseri L. johnsonii L. paracasei L. plantarum L. reuteri L. rhamnosus

B. adolescentis B. animalis B. bifidum B. breve B. infantis B. lactis B. longum

Enterococcus faecium Streptococcus thermophilus

E. coli (‘Nissle 1917’) Saccharomyces boulardii Saccharomyces cerevisiae

Adapté de Holzapfel et al. (2001)

Parmi ces micro-organismes, les bactéries appartenant aux genres Lactobacillus et

Bifidobacterium sont les plus fréquemment utilisées avec le plus d’applications connues à ce

jour chez l’humain. À titre d’exemples, les souches commerciales de lactobacilles ayant des

propriétés fonctionnelles et des effets cliniques documentés incluent L. rhamnosus GG, L. casei

DN-114 001, L. casei Shirota et L. reuteri comparativement aux bifidobactéries dont la

principale souche, B. lactis Bb12, fait l’objet de plusieurs études (Pedone et al., 2000;

Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001; Chouraqui et al., 2004). Néanmoins, le rôle

non-négligeable de certaines autres souches de bifidobactéries dans la résistance de l’hôte aux

infections a été récemment décrit dans la littérature (Leahy et al., 2005; Picard et al., 2005).

7

1.1.3 Les Bifidobactéries

Les bifidobactéries sont des bâtonnets de morphologies variables dont la plus

caractéristique est une forme en Y (Figure 1.1). Ce sont des bactéries à Gram-positif, non

mobiles, catalases négatives et anaérobies strictes. Leurs conditions optimales de croissance se

situent à des températures entre 37°C et 41°C et à des pH compris entre 6,5 et 7,0. Les

bifidobactéries sont hétérofermentaires et dégradent les hexoses en produisant de l’acide

lactique et acétique dans un ratio molaire de 2:3 (Scardovi, 1986).

Figure 1.1 : Souche de bifidobactérie. Microscopie électronique à balayage. Tiré de Rouvet (2004).

Une approche multiphasique est souvent utilisée pour identifier des bifidobactéries.

Cette approche comprend la présence d’une activité fructose-6-phosphoketolase (F6PPK), une

enzyme clé du genre Bifidobacterium (Ventura et al., 2004). Elle fait également appel à

l’identification par des techniques moléculaires via l’utilisation de sondes spécifiques à la

région 16S ARNr de l’ADN du genre Bifidobacterium (Kaufmann et al., 1997;

Ward et Roy, 2005). Pour l’identification de l’espèce, la technique d’homologie ADN-ADN

demeure la méthode la plus fiable (Biavati et al., 2000).

8 Actuellement, plus de 33 espèces de bifidobactéries sont connues (Tableau 1.2), dont 13

ont été isolées chez l’humain (Leahy et al., 2005). Parmi ces espèces, B. thermacidophilum et

B. thermophilum présentent des caractéristiques particulières. Elles se développent à des

températures allant respectivement jusqu’à 49,5ºC et 47ºC et à des pH inférieurs à 4,5

(Biavati et al., 2000; Dong et al., 2000; Von Ah, 2006).

Tableau 1.2 : Espèces connues de bifidobactéries et leur habitat.

Espèces isolées d’animaux

Espèces isolées d’humains

Autres habitats

B. animalis

B. asteroides

B. boum

B. choerinum B. coryneforme

B. cuniculi

B. gallinarium B. indicum

B. magnum

B. merycicum

B. pseudolongum ssp

B. psychraerophilum B. pullorum B. ruminantium B. saeculare B. suis

B. adolescentis

B. angulatum B. bifidum

B. breve

B. catenulatum B. denticolens

B. dentium

B. gallicum

B. infantis B. inopinatum

B. longum

B. pseudocatenulatum

B. scardovii

B. lactis1

B. minimum2

B. subtile2

B. thermacidophilum3

B. thermophilum2

1 Isolées de laits fermentés. 2 Isolées d’eaux usées. 3 Isolées d’un digesteur anaérobique. Adapté de Biavati et al. (2000); Ventura et al. (2004); Leahy et al. (2005).

Dans le microbiote intestinal humain, les bifidobactéries coexistent avec une large

variété de bactéries (Biavati et al., 2000). Leur établissement dans le tractus digestif se fait

initialement au contact de la flore vaginale et fécale de la mère ainsi que de l’environnement

(Cibik et al., 2004). Elles représentent environ 80% des bactéries dominantes du microbiote

intestinal durant l’enfance et jusqu’à 25% chez l’adulte (Picard et al., 2005). Ainsi, chez

l’enfant en bonne santé ces bactéries sont majoritaires alors qu’en vieillisant, une diminution de

leur nombre s’effectue au profit d’autres genres bactériens tels que les Bacteroides, Eubactéries

et Peptocoques (Figure 1.2).

9

Figure 1.2 : Changement du microbiote intestinal en fonction de l’âge. Tiré de Ballongue (1998).

Outre la proportion en bifidobactéries qui varie au cours de la vie, différentes espèces

se succèdent (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). De façon générale, les espèces B. infantis,

B. breve, B. longum, B. bifidum sont le plus souvent rencontrées chez les enfants alors que les

espèces B. adolescentis et B. longum prédominent chez l’adulte (Ballongue, 1998). Il est

intéressant de noter que toutes ces espèces de bifidobactéries constituant le microbiote humain

peuvent être considérées comme probiotiques (voir Tableau 1.1 de la section 1.1.2). Toutefois,

Liévin et al. (2000) rapportent que toutes les bifidobactéries d’origine humaine n’exercent pas

une action antimicrobienne contre les pathogènes. D’où l’intérêt de réaliser une sélection

rigoureuse des souches probiotiques en fonction des effets santé recherchés.

10

1.1.4 Critères de sélection des probiotiques

Afin de satisfaire à la définition des probiotiques, les micro-organismes doivent

posséder diverses propriétés de survie, d’activité et de persistance dans le tractus digestif qui

leurs permettront d’exercer des effets bénéfiques sur l’hôte. Ces propriétés sont propres à

chaque souche et ne peuvent pas être extrapolées d’une souche à l’autre même au sein d’une

seule espèce (Dunne et al., 2001). Plusieurs critères majeurs de sélection in vitro et in vivo ont

été établis et retenus par différents auteurs (Tableau 1.3).

Tableau 1.3 : Principaux critères de sélection des probiotiques.

Adapté de Klaenhammer et Kullen (1999); Saarela et al. (2000); Ouwehand et al. (2002); Gueimonde et Salminen (2006).

Parmi les critères reliés à la sécurité, l’identification taxonomique de la souche est une

étape importante dans l’établissement de nouvelles souches potentiellement probiotiques

(Holzapfel et al., 2001). Chaque souche doit être identifiée par des techniques moléculaires

fiables et confrontée à une nomenclature actualisée (FAO/WHO, 2002;

Gueimonde et Salminen, 2006). Actuellement, l’hybridation ADN-ADN est la méthode

moléculaire de référence pour identifier l’espèce d’une souche, mais cette méthode est longue

et requiert une large collection de souches de référence (FAO/WHO, 2002). Le séquençage de

l’ADN codant pour l’ARN 16S ribosomal est considéré aussi pertinent (FAO/WHO, 2002).

Dans ce dernier cas, il est recommandé que la technique soit combinée avec des tests

Critères de sécurité

• Identification taxonomique précise • Origine humaine pour utilisation chez l’humain • Souche caractérisée par des techniques phénotypiques et génotypiques • Historique de non pathogénicité et non-invasion de l’épithelium intestinal • Pas de transmission possible de gènes de résistance aux antibiotiques

Critères fonctionnels • Tolérance à l’acidité, à la bile et aux enzymes digestives • Adhésion aux cellules intestinales et persistance dans le tractus intestinal • Production de substances antimicrobiennes (bactériocines, acides

organiques, peroxyde d’hydrogène ou autres composés inhibiteurs) et antagonisme envers les pathogènes

• Immunomodulation • Aptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé

Critères technologiques • Stabilité au cours des procédés de production et dans le produit fini • Conservation des propriétés probiotiques après production • Non modification des propriétés organoleptiques du produit fini

11

phénotypiques pour confirmation. L’origine de la souche est également une condition

importante car l’interaction spécifique avec l’hôte est maximisée lorsqu’elle provient du même

habitat (Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001). Les souches probiotiques doivent également

être sans effet négatif et être sécuritaires pour la santé humaine. À ce titre, les souches

potentiellement probiotiques seront évaluées afin qu’aucun des effets secondaires suivants ne

soient détectés: infections systémiques, activité métabolique nuisible, stimulation immune

excessive chez des individus susceptibles et transfert de gènes (par exemple de résistance aux

antibiotiques) (FAO/WHO, 2002). À ce sujet, les souches de lactobacilles et bifidobactéries

associées aux aliments possèdent un historique de sécurité de longue date et très peu de

corrélations existent entre des infections systémiques et la consommation de ces probiotiques

dans la littérature (Borriello et al., 2003; Marteau et al., 2006).

Pour assurer une fonctionnalité optimale, les souches probiotiques doivent conserver

leur viabilité jusqu’à leur site d’action. Cependant, il existe une controverse autour de ce critère

notamment par rapport à l’effet sur le système immunitaire. Même s’il est reconnu que les

cellules bactériennes mortes peuvent apporter des bénéfices physiologiques (Sanders, 2003), la

définition actuelle des probiotiques insiste sur le paramètre de viabilité (FAO/WHO, 2002).

Avant d’atteindre le tractus intestinal, les probiotiques doivent résister principalement à

l’environnement acide de l’estomac (pH compris entre 2,0 et 3,4) et à la bile sécrétée dans le

duodénum (Dunne et al., 2001; Gueimonde et Salminen, 2006). Le degré de tolérance à ces

conditions diffère pour chaque souche (Havenaar et Huis in’t Veld, 1992). Des tests in vitro

sont réalisés pour sélectionner les probiotiques qui maintiendront leur intégrité cellulaire et leur

activité métabolique lors du passage dans le tractus digestif humain.

La capacité d’adhésion à la muqueuse intestinale est également une des propriétés

essentielles que les souches probiotiques se doivent de posséder (Saarela et al., 2000;

Tuomola et al., 2001). L’adhésion permet d’accroître le temps de rétention des probiotiques

dans l’intestin et met en contact étroit les bactéries et les cellules épithéliales

(Gueimonde et Salminen, 2006). Ainsi, un probiotique ayant un fort pourcentage d’adhésion

pourra éventuellement stimuler le système immunitaire et prévenir l’implantation de

pathogènes sur les cellules épithéliales de l’intestin par des mécanismes de compétition

(Saarela et al., 2000). Les modèles in vitro pour évaluer l’adhésion des probiotiques font appels

à des lignées cellulaires provenant de côlons humains telles que les Caco-2 et HT-29 et à des

12

techniques conventionnelles de détection de l’attachement bactérien telles que l’énumération

par comptages sur plaques, par coloration Gram, par marquage radioactif ou par de nouvelles

approches comme l’ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) et la quantification par

PCR en temps réel (Le Blay et al., 2004; Servin, 2004; Candela et al., 2005). Grâce à ces

techniques, plusieurs études ont montré le potentiel d’adhésion de nombreuses souches de

Lactobacillus et de Bifidobacterium (Chauvière et al., 1992; Bernet et al., 1993;

Crociani et al., 1995; Moroni et al., 2006). La capacité d’adhésion évaluée à l’aide de ces

modèles in vitro est différente pour chaque souche. Ceci est probablement lié à la physiologie

et aux facteurs d’adhésion tels que les composés protéiques, polysaccharides, charges ioniques

et aux acides lipotéichoiques propres à chaque souche bactérienne (Crociani et al., 1995).

Selon Ouwehand et al. (2002b), l’adhésion aux cellules intestinales humaines en culture

n’est pas un critère suffisant pour décrire les interactions mucosales des probiotiques. Ces

auteurs ont proposé que des pièces de tissus humains seraient plus appropriées pour étudier

l’adhésion des probiotiques. Parmi les souches ayant fait l’objet d’études préalables sur Caco-2,

L. rhamnosus GG adhère fortement au tissu provenant du côlon alors que L. johnsonii La1 et

L. casei Shirota le font à un degré moindre. Ces différences d’adhésion sur le tissu peuvent

s’expliquer par la présence de bactéries du microbiote intestinal. Le microbiote résident

pourrait affecter l’adhésion des souches probiotiques au tissu du côlon et ceci n’est

généralement pas pris en compte dans les modèles d’adhésion (Ouwehand et al., 2002b).

Ainsi, certains auteurs soulignent la limitation de certains critères de sélection et

estiment qu’il faut restreindre la surinterprétation de la signification de telles évaluations

(Holzapfel et Schillinger, 2002; Sanders, 2003). Cependant, les tests in vitro et in vivo sont des

moyens utiles et assez simples à mettre en œuvre pour évaluer de façon préliminaire le potentiel

probiotique de chaque souche avant de procéder à des essais cliniques chez l’humain.

Parmi l’ensemble des critères présentés au Tableau 1.3, l’aptitude à produire des effets

bénéfiques sur la santé demeure encore délicat à évaluer dû notamment au fait que les modes

d’action par lesquels les probiotiques exercent un rôle fonctionnel in vivo sont méconnus

(Klaenhammer et Kullen, 1999). Ainsi, comme le soulignent ces auteurs, la compréhension des

mécanismes d’action représente un des défis scientifiques majeurs dans le domaine des

probiotiques.

13 Enfin, du point de vue technologique, les souches probiotiques doivent posséder

plusieurs qualités telles que la facilité à être cultivée à de hautes densités cellulaires tout en

conservant leurs propriétés biologiques et leur stabilité au cours des procédés de production et

d’entreposage (Champagne et al., 2005). À ce titre, de nouvelles technologies permettant de

produire des souches probiotiques à haute viabilité et fonctionnalité sont actuellement

disponibles (Lacroix et Yildirim, 2007).

1.1.5 Allégations santé

De nombreuses allégations santé ont été associées à la consommation de souches

probiotiques. Parmi les principaux effets bénéfiques rapportés dans la littérature (Marteau et al.,

2001; Parvez et al., 2006) nous retrouvons :

- Atténuation de l’intolérance au lactose

- Prévention et traitement des infections entériques

- Diminution des diarrhées associées à la prise d’antibiotiques

- Prévention des allergies alimentaires

- Modulation de la fonction immunitaire (stimulation ou régulation).

Un nombre croissant d’études cliniques réalisées pour vérifier ces allégations a permis

d’avancer certaines explications. Les probiotiques pourraient apporter une quantité

supplémentaire d’enzymes digestives (par exemple des β-galactosidases capables d’hydrolyser

le lactose), créer un effet barrière contre les pathogènes, rétablir l’équilibre du microbiote

résident, dégrader des protéines allergènes et interagir avec le système immunitaire intestinal

pour produire une réponse immune plus efficace (Sanders, 2003; Corthésy et al., 2007).

Bien que les bénéfices santé mentionnés précédemment soient supportés par plusieurs études, il

en existe d’autres qui nécessitent des investigations pour confirmer certains bienfaits. Il s’agit

notamment de l’activité hypocholestérolémiante, de l’effet antihypertenseur, de la prévention

du cancer du côlon, du soulagement des maladies inflammatoires et irritables des intestins et de

la diminution des ulcères induits par Helicobacter pylori (Parvez et al., 2006).

Parmi les allégations santé avec de fortes évidences scientifiques, l’utilisation de micro-

organismes probiotiques pour la prévention et le traitement des désordres gastrointestinaux est

une mesure adaptée et constitue l’application la plus commune des probiotiques car la plupart

14

des effets santé leurs étant attribués sont en rapport direct ou indirect (via le système

immunitaire) avec le tractus gastrointestinal (De Vrese et Marteau, 2007). À ce titre, certains

auteurs qualifient l’utilisation des probiotiques comme étant un traitement d’interférence

microbien contre les infections intestinales (Fooks et Gibson, 2002). Cependant, peu d’études

sont disponibles pour confirmer l’effet prophylactique ou thérapeutique qu’apportent les

bactéries à haut potentiel probiotique contre des pathogènes. Il est néanmoins reconnu que les

probiotiques offrent les avantages d’être accessibles, peu coûteux et sans effet secondaire

notable contrairement aux traitements actuellement utilisés pour prévenir ou traiter ces

infections (vaccination, antibiothérapie).

Avant de développer un produit probiotique avec une application spécifique, tout un

processus complet d’évaluation est nécessaire. La prochaine section synthétise les étapes à

passer afin de démontrer l’efficacité reliée à l’utilisation d’une souche probiotique. Ces étapes

sont similaires en grande partie à celles du processus d’évaluation des produits

pharmaceutiques.

1.1.6 Guide pour l’évaluation des probiotiques en utilisation alimentaire

Récemment, un groupe de travail de l’Organisation des Nations Unies pour

l’Alimentation et l’Agriculture et l’Organisation Mondiale de la Santé a défini les étapes à

suivre pour l’évaluation de l’efficacité des souches probiotiques en utilisation alimentaire

(FAO/WHO, 2002). Cette action était rendue nécessaire afin d’encadrer au niveau international

le nombre croissant d’études réalisées avec d’éventuelles souches probiotiques. La Figure 1.3

présente les principaux points à évaluer.

Les premières étapes du guide concernent l’identification, la caractérisation

fonctionnelle et l’évaluation de la sécurité de la souche probiotique. Les principaux tests

in vitro à réaliser lors de ces étapes ont été décrits précédemment (voir section 1.1.4).

Ces résultats préliminaires obtenus in vitro (par exemple : résistance aux conditions

gastrointestinales, adhésion aux cellules intestinales, capacité d’inhibition des pathogènes)

doivent ensuite être vérifiés à l’aide de modèles animaux. Parallèlement, la sécurité liée à

l’utilisation de la souche probiotique doit être vérifiée de façon in vivo et lors d’une étude

clinique phase 1. Lors de ces études, la FAO et le WHO recommande que les souches

15

probiotiques soient testées entre autres pour leur résistance aux antibiotiques, leur infectivité

dans des modèles animaux immunocompromis et leurs effets secondaires chez l’humain

(Reid et al., 2003).

Par la suite, l’efficacité de la souche probiotique doit être évaluée lors d’une étude

clinique phase 2 réalisée à double insu constituée d’un traitement probiotique et un placebo.

Les résultats de cette étude doivent être statistiquement et biologiquement significatifs avec une

amélioration des symptômes liés à l’infection, une réduction du risque de récidive ou un

rétablissement plus rapide (Reid et al., 2003). Actuellement, des souches comme

L. rhamnosus GG et L. reuteri ont accumulé de solides évidences cliniques, mais elles ne sont

pas encore disponibles au Canada (Reid et Hammond, 2005).

Avant la mise sur le marché du produit probiotique une étude phase 3 est nécessaire

pour comparer l’effet de la souche probiotique à un traitement traditionnel

(par exemple: antibiotiques) (Reid et al., 2003). À la suite de cette dernière étude clinique,

l’allégation santé associée à la souche probiotique testée peut être apposée sur l’étiquette

selon la législation propre à chaque pays (FAO/WHO, 2002). Même si des centaines de

publications sur les probiotiques sont documentées dans la littérature scientifique,

seulement quelques souches agissant au niveau clinique peuvent avoir le statut de

probiotique. Ce jugement n’est possible qu’après avoir considéré l’ensemble des évidences

in vitro, animales et humaines supporté par un mécanisme d’action plausible

(Sanders, 2003).

Actuellement, le développement de produits probiotiques est très actif dans les pays

européens, le Japon, les États-Unis et l’Australie. Au Canada, très peu de produits probiotiques

sont disponibles puisque la recherche dans ce domaine ne fait qu’émerger. Cependant, de plus

en plus d’études rapportent des données démontrant l’efficacité de certaines souches et un

guide de conformité concernant les produits de santé naturels (dont fait partie les probiotiques)

a été élaboré afin de fournir aux principaux intéressés des renseignements clairs en ce qui a trait

aux principaux règlements et lois régissant leur mise en marché (Santé Canada, 2007).

16

Figure 1.3 : Guide pour l’évaluation des probiotiques en utilisation alimentaire. Tiré et traduit de FAO/WHO (2002).

Identification de la souche par des méthodes phénotypiques et génotypiques

• Genre, espèce, souche • Enregistrement de la souche dans une

collection internationale de souches

Évaluation de l’innocuité de la souche • In vitro et/ou animal • Étude clinique phase 1

Caractérisation fonctionnelle • Tests in vitro • Études animales

Étude clinique phase 2 à double insu, randomisée, contrôle placebo ou autre étude appropriée avec un échantillon et des résultats appropriés

pour déterminer si la souche est efficace

Produit probiotique

Deuxième étude indépendante pour

confirmer les résultats

Étude clinique phase 3 pour comparer l’efficacité des probiotiques avec des

traitements standards dans des conditions spécifiques

Allégations santé et étiquetage • Contenu – genre, espèce, désignation de la souche • Nombre minimum de bactéries viables et date d’expiration • Conditions appropriées d’entreposage • Détails des coordonnées du fabricant pour l’information au

consommateur

17

1.2 L’activité antimicrobienne des probiotiques contre les

entéropathogènes

1.2.1 Mécanismes d’action : les études in vitro et in vivo

Les modes d’action par lesquels certains probiotiques exercent des effets protecteurs ou

thérapeutiques ne sont pas complètement élucidés, mais plusieurs mécanismes ont été proposés.

La Figure 1.4 présente les mécanismes d’action majeurs associés aux bactéries probiotiques

pour prévenir la colonisation et la croissance des bactéries pathogènes lors d’infections

entériques. Les mécanismes proposés sont basés sur un nombre limité d’études in vivo

(essentiellement murines) et in vitro. Les prochaines sections présentent des exemples d’études

dans lesquelles ces mécanismes ont été identifiés avec des souches de bifidobactéries et de

lactobacilles.

Figure 1.4 : Mécanismes d’action proposés des micro-organismes probiotiques dans le traitement des infections entériques. Adapté de Calder et Kew (2002); Kaur et al. (2002).

Mécanisme 3 : Production de

substances antimicrobiennes

Probiotiques

Mécanisme 2 : Compétition non-spécifique pour

l’adhésion

Mécanisme 5 : Stimulation des mécanismes de

défense immunitaire

Mécanisme 4 : Compétition au niveau

de l’utilisation des nutriments

Mécanisme 1 : Compétition

spécifique pour l’adhésion

18

1.2.1.1 Compétition spécifique et non-spécifique pour l’adhésion

Les deux premiers mécanismes possibles pour l’action des probiotiques concernent leur

capacité à adhérer à la muqueuse intestinale. Étant donné que la majorité des infections

intestinales sont initiées par l’adhésion des pathogènes aux cellules entérocytaires de l’hôte

certaines bifidobactéries et lactobacilles probiotiques auraient la capacité de bloquer

physiquement l’accès aux entérocytes (Gill, 2003; Servin et Coconnier, 2003; Servin, 2004;

Picard et al., 2005). Ce mécanisme d’action serait similaire à celui exercé par le microbiote

intestinal résident face aux infections microbiennes (Liévin-Le Moal et Servin, 2006).

Les mécanismes de compétition de l’adhésion se font généralement de deux façons. Ils

peuvent survenir de façon spécifique par l’intermédiaire des adhésines ou de façon non

spécifique en impliquant des interactions électrostatiques ou hydrophobes, des forces passives

et stériques (Servin et Coconnier, 2003). Deux exemples de ces modes de compétition sont

présentés à la Figure 1.5.

Figure 1.5 : Mécanisme d’inhibition de l’adhésion des pathogènes par un effet barrière dû à l’adhésion spécifique (a) et non spécifique (b) des probiotiques.

Les études in vitro identifiant le mécanisme de compétition de l’adhésion utilisent pour

la plupart les lignées cellulaires intestinales Caco-2 et HT-29. Ces cellules sont généralement

appropriées à ce type d’expérience car elles présentent une structure similaire aux entérocytes

a

Pathogène

Compétition spécifique

Adhésine Site récepteur

Probiotique

bCompétition non spécifique

Interactions de faibles liaisons

entérocyte

19

que l’on retrouve in vivo (Pinto et al., 1983; Zweibaum et al., 1991). Des études pionnières

effectuées par Bernet et al. (1993) ont démontré que des souches de bifidobactéries humaines

adhérant fortement aux cellules intestinales Caco-2 inhibent l’adhésion de micro-organismes

pathogènes comme E. coli entéropathogénique (EPEC) et Salmonella typhimurium à ces

mêmes cellules lorsque placées en compétition. Ces auteurs ont également observé une

inhibition proportionnelle à la concentration de bifidobactéries ajoutées. Ils ont suggéré que

l’inhibition pouvait être due à un encombrement stérique par la constitution d’un biofilm qui

empêche l’accès des pathogènes aux surfaces cellulaires et par une exclusion des cellules

pathogènes par compétition aux sites spécifiques d’adhésion sur les cellules entérocytaires.

D’autres études de compétition sur des cellules Caco-2 ont démontré que la souche

L. acidophilus est également capable d’inhiber l’adhésion de ces deux mêmes pathogènes

(Coconnier et al., 1993; Bernet et al., 1994). Des mécanismes d’action similaires à ceux

associés aux bifidobactéries ont été suggérés par ces derniers auteurs.

Mack et al. (1999) ont rapporté une inhibition complète de l’adhésion d’E. coli

O157:H7 par l’ajout préalable de la souche L. plantarum 299v sur des cellules HT-29. En effet,

ces auteurs ont montré qu’en utilisant des concentrations croissantes de la souche L. plantarum

(107 à 109 cfu/puits) une inhibition complète de l’adhésion du pathogène (105 cfu/puits) a pu être

obtenu en utilisant la plus forte concentration de probiotiques testée. Ces auteurs ont proposé,

entre autres, que l’adhésion préalable des probiotiques aux cellules intestinales contribuerait à

limiter l’accès des pathogènes aux entérocytes en plus d’augmenter la sécrétion du mucus qui

pourrait lui aussi empêcher l’adhésion des pathogènes aux cellules intestinales.

Par ailleurs, une compétition pour des sites spécifiques de fixation sur le mucus

intestinal a également été évoquée comme un autre mode d’action probable. Le mucus présent

sur la surface de l’épithélium intestinal forme une sorte de gel composé de glycoprotéines,

appelées aussi mucines. La sécrétion de mucines par les cellules en gobelet peut être stimulée

par des facteurs neurogènes et par des changements environnementaux incluant le microbiote

résident et les infections microbiennes (Gill, 2003). En plus de protéger l’épithélium d’un

contact direct avec le contenu intestinal, le mucus intestinal est un site important pour la

colonisation du microbiote normal mais il peut également servir de site d’adhésion pour

certains micro-organismes pathogènes (Gill, 2003).

20 Lors d’expériences in vitro, des souches probiotiques telles que L. casei Shirota et

L. rhamnosus GG ont présenté une capacité d’adhésion plus forte au mucus humain que des

souches pathogénes d’E. coli et de Salmonelles (Lee et al., 2003). Ces souches probiotiques

étaient capables d’exclure et d’entrer en compétition avec les pathogènes de façon significative

sur le mucus (Lee et al., 2003). Le degré de compétition était dépendant de chaque souche et

probablement déterminé par l’affinité respective des adhésines présentes sur la surface des

bactéries aux glycoprotéines du mucus (Lee et al., 2003).

D’autres effets similaires ont été observés avec des bifidobactéries. Collado et al.

(2005) ont montré que des souches de bifidobactéries d’origine humaine entraient également en

compétition pour des sites spécifiques sur le mucus intestinal et qu’un effet inhibiteur supérieur

à 40% pouvait être obtenu avec Listeria monocytogenes et Clostridium difficile alors que les

taux d’inhibition d’E. coli était plus modestes avec près de 20%. Les résultats obtenus

dépendaient des souches testées et ceci pourrait s’expliquer, en partie, par les différentes

molécules impliquées dans l’adhésion des bifidobactéries.

La compétition sur le mucus peut se produire même durant des épisodes de diarrhée. En

effet, Juntunen et al. (2001) ont observé que l’adhésion des souches probiotiques B. lactis

Bb12, L. rhamnosus GG, L. casei Shirota, L. paracasei F19, L. acidophilus LA5 aux mucus

intestinaux isolés d’enfants en santé et d’enfants ayant une diarrhée à rotavirus était similaire.

Ainsi selon ces auteurs les probiotiques pourraient agir même après que l’infection soit

déclenchée.

1.2.1.2 Production de substances antimicrobiennes

Le troisième mécanisme d’action des probiotiques concerne l’inhibition de la croissance

des pathogènes grâce à des composés antimicrobiens. Les bactéries appartenant aux genres

Lactobacillus et Bifidobacterium d’origine humaine peuvent produire des substances

antimicrobiennes, telles que les acides organiques, qui sont actives in vitro et in vivo contre les

micro-organismes entérovirulents impliqués dans les cas de diarrhées (Servin, 2004). L’acide

lactique et acétique sont produits via la fermentation des hexoses par les lactobacilles et

bifidobactéries. Ces acides organiques peuvent diffuser passivement à travers la membrane

21

bactérienne sous leur forme non dissociée (Figure 1.6). Ils acidifient le cytoplasme après

dissociation et inhibent l’activité enzymatique cellulaire des pathogènes acidosensibles

(Deng et al., 1999). Cette diminution du pH peut donc affecter la viabilité des pathogènes

bactériens (Bruno et Shah, 2002; Servin, 2004).

Figure 1.6 : Mode d’action des acides organiques produits par les probiotiques contre les pathogènes bactériens. *X-COOH = CH3-CHOH-COOH dans le cas de l’acide lactique ou

CH3COOH dans le cas de l’acide acétique.

Dans une étude réalisée in vitro, Hütt et al. (2006) ont observé que l’activité

anti-Salmonella produit par trois souches de lactobacilles, L. paracasei 8700:2,

L. plantarum 299V et L. fermentum ME-3, en condition microaérophile de même que l’activité

anti-Shigella de deux bifidobactéries, B. lactis Bb12 et B. longum 46, en condition anaérobie

était associée à un effet du pH. Une corrélation positive entre la production d’acide lactique et

l’activité inhibitrice a été observée. Cependant, la quantité d’acide acétique et l’activité

inhibitrice des lactobacilles et des bifidobactéries cultivées en conditions anaérobiques étaient

corrélées de façon négative.

En utilisant un modèle murin, Asahara et al. (2001) ont observé qu’une infection à

salmonelles induite lors d’un traitement aux antibiotiques pouvait être réduite de façon

importante par la précolonisation de l’intestin avec la souche B. breve Yakult. Selon ces

auteurs, la production d’acides organiques par la souche probiotique et une réduction du pH

fécal seraient importantes pour l’activité anti-infectieuse obtenue contre la souche Salmonella

typhimurium. En utilisant la même souche, ces mêmes auteurs ont observé que la production

d’une forte concentration d’acides organiques peut également jouer un rôle important dans

l’inhibition de la production de toxines par une souche de E. coli O157:H7 dans un modèle

murin (Asahara et al., 2004).

Hexoses X-COOH*

Probiotique Pathogène

X-COOH → X-COO- + H+

Inactivation des enzymes

fermentation

22 La production d’autres agents antimicrobiens, tels que les bactériocines, ont aussi été

rapportés principalement lors d’études in vitro. Les bactériocines sont définies comme des

composés protéiques ayant une activité inhibitrice contre un large spectre de souches

bactériennes (Klaenhammer, 1993). Elles agissent principalement sur la membrane externe des

bactéries cibles en formant des pores qui mènent à la libération du contenu intracellulaire et à la

mort de la bactérie affectée (Klaenhammer, 1993). Les lactobacilles sont souvent associés à la

production de bactériocines (Fooks et Gibson, 2002). La production de bactériocines par les

souches de bifidobactéries est moins documentée. Néanmoins, il a été rapporté que la souche

B. bifidum NCFB 1454 produit une bactériocine active contre Listeria monocytogenes

(Yildirim et Johnson, 1998).

Un composé antimicrobien produit par des bifidobactéries humaines,

Bifidobacterium spp CA1 et F9, a été identifié récemment et il consistait en une ou plusieurs

molécules lipophiles avec une masse moléculaire de moins de 3,500 Da (Liévin et al., 2000).

Ces auteurs ont démontré que ces composés antimicrobiens étaient actifs contre

Salmonella typhimurium SL1334 et qu’une diminution de 4 logarithmes de l’adhésion du

pathogène aux cellules Caco-2 pouvait être obtenue. Ces auteurs ont également évalué cette

activité antimicrobienne in vivo avec des souris axéniques C3/He/Oujco infectées par

S. typhimurium C5. Les souris recevant les bifidobactéries CA1 et F9 étaient protégées de

l’infection létale comparativement aux souris contrôles qui ne vivaient pas plus de 10 jours

après l’infection. Cependant, même si certaines bactériocines présentent une forte activité

in vitro et in vivo chez les souris contre certains pathogènes, la démonstration de la production

et l’activité des bactériocines dans le tube digestif humain est à établir.

Lors d’expérience in vitro, certains auteurs ont proposé une action synergétique entre

les substances protéiques antimicrobiennes et l’acide organique pour expliquer l’action

inhibitrice des bactéries probiotiques. Ainsi, Gopal et al. (2001) ont mené une série

d’expériences pour étudier l’inhibition in vitro d’une souche d’E. coli O157:H7 par

L. rhamnosus DR20, L. acidophilus HN017 et B. lactis DR10. Le pré-traitement d’E. coli

O157:H7 avec les surnageants de culture des bactéries réduit l’association de ce pathogène avec

les cellules Caco-2 et HT-29. Les molécules inhibitrices sécrétées dans les surnageants par ces

bactéries sont partiellement affectées par des traitements avec la lactate dehydrogénase,

trypsine et protéinase K laissant suggérer que les substances protéiques antibactériennes ne sont

23

pas uniquement responsable de l’inhibition et qu’elles agissent de concert avec l’acide produit.

Selon Servin et al. (2004) ceci s’expliquerait par une diminution du pH qui provoque une

perméabilisation de la membrane externe des bactéries Gram-négatif facilitant ainsi la

pénétration d’autres substances antimicrobiennes telles que les bactériocines.

1.2.1.3 Compétition au niveau de l’utilisation des nutriments

L’inhibition de la croissance des pathogènes peut également s’effectuer par un

processus de restriction des nutriments. Il est évident que la capacité des micro-organismes à

entrer en compétition pour limiter les nutriments disponibles est un facteur non négligeable qui

détermine la composition du microbiote. Ainsi, une augmentation du nombre de bifidobactéries

ou de lactobacilles obtenue lors d’un traitement probiotique permettrait de diminuer les

substrats disponibles pour l’implantation de micro-organismes pathogènes (Fooks et Gibson,

2002). Des équipes de recherche travaillent actuellement sur cette thématique importante afin

de comprendre les interactions complexes entre les groupes microbiens qui ont lieu dans le

côlon.

1.2.1.4 Stimulation des mécanismes de défense immunitaire

Le dernier mécanisme porte sur l’interaction des probiotiques avec le système

immunitaire pour accroître la réponse immune de l’hôte contre des entéropathogènes. Parmi les

effets observés, quelques auteurs soulignent une stimulation de l’immunité adaptative

(IgA, IgG) et innée (macrophages, basophiles, monocytes) par les probiotiques

(Fooks et Gibson, 2002; Gill, 2003; Servin, 2004).

Par exemple, Shu et Gill (2001) ont étudié l’effet d’une souche commerciale de

bifidobactéries administrée sous la forme d’un lait fermenté chez des souris BALB/c et

C57BL/6 dans le but de prévenir l’infection à E. coli O157:H7. La souche de bifidobactéries a

pu réduire la sévérité de l’infection à E. coli O157:H7 et cette réduction a été associée à la

stimulation immunitaire obtenue par l’ingestion de probiotiques. Ces auteurs ont attribué cet

effet protecteur à une réponse en IgA anti-E. coli O157:H7 plus forte chez les souris recevant la

souche probiotique comparativement aux contrôles.

24 Une seule étude animale s’est intéressée à l’activité antagoniste des probiotiques en

relation avec la réponse immune durant une infection entérique virale (Qiao et al., 2002). Dans

cette étude, des rotavirus rhesus ont été administrés par voie orale chez des souris BALB/c

traitées par la suite par des bifidobactéries (B. bifidum et B. infantis). Les niveaux d’IgA

spécifiques aux rotavirus dans les fèces et dans le sérum étaient plus élevés chez les souris

traitées avec des bifidobactéries après l’infection que les souris infectées au rotavirus et ne

recevant pas de bifidobactéries. Les bifidobactéries agiraient dans ce cas comme des adjuvants

en modulant une réponse rapide de la muqueuse et une forte production d’IgA spécifiques pour

atténuer la sévérité de la diarrhée induite par rotavirus.

En résumé, les mécanismes d’action proposés dans cette section présentent l’état actuel

des connaissances sur l’action des probiotiques contre des pathogènes entériques. Cependant, il

est important de noter que les mécanismes associés à des souches particulières ne peuvent pas

être extrapolés à tous les micro-organismes probiotiques. Chaque souche doit être étudiée de

façon indépendante. De plus en plus d’équipes de recherche travaillent actuellement pour

identifier ces mécanismes d’action de probiotiques particuliers contre certains pathogènes.

1.2.2 Études cliniques

Actuellement, la plupart des études cliniques disponibles ayant démontré un effet positif

des probiotiques ont porté sur la prévention et le traitement des diarrhées occasionnées par des

virus (principalement les rotavirus), des bactéries (Campylobacter, Shigella, Salmonella) ou

celles liées à la prise d’antibiotiques (diarrhée opportuniste à Clostridium difficile)

(Tableau 1.4).

Les études cliniques démontrant des effets positifs pour la prévention et le traitement

des infections entériques virales ont principalement été réalisées chez des nourrissons et des

enfants. Les jeunes enfants répondent particulièrement bien aux probiotiques grâce à leur

microbiote intestinal moins complexe comparativement à celui des adultes

(De Vrese et Marteau, 2007).

25

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26 Chez les enfants, la souche L. rhamnosus GG, qui demeure la bactérie probiotique la

plus étudiée, a démontré des résultats positifs sur la diminution de la durée de diarrhée à

rotavirus (Isolauri et al., 1994; Majamaa et al., 1995) et des diarrhées aiguës dues à plusieurs

causes incluant les adénovirus et les rotavirus (Guandalini et al., 2000). D’autres souches

probiotiques ont également démontré un effet bénéfique sur la prévention des infections à

rotavirus. Ainsi, l’équipe de Saavedra (1994) a étudié l’effet prophylactique d’une souche

commerciale B. lactis Bb12 pour contrer ces infections. Cet essai a montré que l’addition de

cette souche probiotique à des formules infantiles distribuées à des nourrissons hospitalisés a

significativement diminué l’incidence de la diarrhée et l’excrétion de rotavirus.

Les évidences cliniques concernant l’efficacité des probiotiques contre les

entéropathogènes d’origine bactérienne sont moins documentées. Hormis les quelques études

présentées au Tableau 1.4, d’autres études concernant l’effet des probiotiques lors des diarrhées

des voyageurs, qui sont causées entre autres par E. coli, Salmonella, Campylobacter et Shigella

(Ericsson, 2003), ont donné des résultats limités et peu convaincants. Même si quelques études

à double insu contrôlées au placebo ont montré par exemple que la souche L. rhamnosus GG

réduit l’incidence de la diarrhée des voyageurs (Dupont, 1997; Hilton et al., 1997), d’autres

auteurs ont noté une incidence non significative chez les voyageurs recevant ces bactéries

comparés au groupe placebo (Oksanen et al., 1990). Pour expliquer ces résultats, certains

auteurs ont avancé qu’il est peu probable qu’une seule souche probiotique ait une action in vivo

contre un large spectre de pathogènes (Leahy et al., 2005).

De par la complexité de mise en oeuvre, les études cliniques chez les humains restent

rares et généralement peu d’études ayant des effets non significatifs sont publiées (Sanders,

2003). Toutefois, ces premiers résultats cliniques sur l’efficacité des probiotiques restent

extrêmement prometteurs. Cependant, il est encore prématuré d’émettre des recommandations

spécifiques applicables en usage clinique pour le traitement de la diarrhée car les études

disponibles réalisées à double insu et contrôlées au placebo ont été effectuées principalement à

l’aide d’un nombre restreint de patients (n <100) (De Vrese et Marteau, 2007). D’autres études

incluant un plus grand nombre de patients sont actuellement nécessaires pour confirmer les

études précédentes, pour accroître leur crédibilité face à la communauté médicale et aussi pour

évaluer l’effet des probiotiques à long terme (Reid et al., 2003; De Vrese et Marteau, 2007).

27

1.3 Les infections entériques et réponses de l’hôte

1.3.1 Principales causes d’infections entériques

Les infections entériques résultent de l’ingestion de micro-organismes pathogènes ou de

leurs toxines (Steer et al., 2000). Il existe une grande variété de bactéries, virus et parasites à

l’origine des infections entériques (Tableau 1.5). Cependant, les micro-organismes d’origine

bactérienne et virale sont le plus souvent impliqués dans les cas rapportés et leur mode de

transmission se fait principalement par la voie oro-fécale (Mead et al., 1999; Tauxe, 2002). Ces

principaux entéropathogènes sont capables d’envahir le tractus intestinal pour s’y multiplier et

causer principalement des symptômes diarrhéiques mais également dans certains cas des

nausées, des vomissements et une altération générale de l’état de santé (Steer et al., 2000).

Tableau 1.5 : Principaux agents infectieux responsables d’infections entériques.

Adapté de Koopmans et al. (2002); Gadewar et Fasano (2005); Lamps (2007).

1.3.2 Infections d’origine bactérienne

Les bactéries pathogènes Campylobacter, Salmonella et E. coli sont les trois causes les

plus communes d’infections entériques au niveau mondial (Fasano, 2001; Lamps, 2007) et

l’incidence de ces micro-organismes demeure préoccupante. De façon générale, les

entéropathogènes bactériens représentent près de 15% des cas de diarrhées dans les pays

développés et plus de 50% dans les pays en voie de développement (DuPont, 2005). Parmi le

pourcentage attribué aux infections entériques bactériennes dans les pays développés, E. coli,

Bactéries Virus Parasites/protozoaires

Campylobacter Salmonella E. coli Shigella Vibrio cholera Clostridium difficile Aeromonas Pleisiomonas Yersinia

Norovirus Rotavirus Astrovirus Adenovirus entériques

(types 40, 41) Hépatite A et E

Entamoeba histolytica Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Microsporidium Isospora belli Cyclospora cayetanensis

28

qui est considérée comme un pathogène émergent, représente le troisième agent étiologique

majeur avec 2 à 5% des cas de diarrhées (Fasano, 2001; Tauxe, 2002).

1.3.2.1 E. coli O157:H7 chez l’humain

Normalement, E. coli est une bactérie retrouvée dans le microbiote intestinal résident de

tous les animaux à sang chaud, incluant les humains. Cependant, depuis sa découverte par

Thomas Escherich en 1855, des centaines de souches d’E. coli pathogènes ayant acquis, dans

l’évolution, une variété de traits de virulence leur permettant d’établir des symptômes

pathophysiologiques ont été identifiées. Décrites en relation avec leurs manifestations cliniques

et l’expression de leurs facteurs de virulence, les souches E. coli pathogènes ont été classées en

six catégories : entéropathogénique (EPEC), entéroinvasive (EIEC), entérotoxigénique (ETEC),

entéroaggrégative (EAEC), diffusément adhérente (DAEC) et entérohémorragique (EHEC).

Ces souches peuvent être distinguées selon leur sérotype défini par leurs antigènes somatiques

(O) et flagellaires (H) ainsi que leurs gènes de virulence. Parmi les souches EHEC, le sérotype

O157:H7 est le plus fréquemment isolé en Amérique du Nord (LeBlanc, 2003).

E. coli O157:H7 est un bacille Gram-négatif de la famille des Enterobacteriaceae

(Figure 1.7). Cette bactérie aérobie peut se multiplier à des températures entre 7ºC et 50ºC,

avec une température optimale de 37ºC. Certaines souches démontrent une forte résistance à

l’acide et peuvent se développer dans les aliments ayant un pH jusqu’à 4,4 (Mao et al., 2003).

Figure 1.7 : E. coli O157:H7. Microscopie électronique à balayage. Tiré de Centers for Disease Control and Prevention (2006).

29 La propagation de l’infection à l’homme peut s’effectuer directement par contacts de

personne à personne via la route oro-fécale, indirectement par contamination croisée ou par la

consommation d’aliments ou d’eau contaminés. De nombreux cas d’infection à E. coli

O157:H7 ont été associés avec la consommation de bœuf haché insuffisamment cuit, de lait

cru, de fruits et légumes ou d’eau contaminée avec des matières fécales (LeBlanc, 2003). Les

symptômes associés aux infections par E. coli O157:H7 sont notamment des crampes

abdominales et des diarrhées susceptibles d’évoluer vers des diarrhées sanguinolentes

(Karch et al., 2005). De la fièvre et des vomissements peuvent également être observés

(LeBlanc, 2003). La période d’incubation est de 3 à 8 jours, avec une moyenne de 3 à 4 jours

(OMS, 2005). Dans la plupart des cas, la guérison s’effectue dans les 10 jours, mais chez un

nombre restreint de patients, l’infection peut parfois se compliquer par un syndrome urémique

hémolytique qui affecte les reins (LeBlanc, 2003).

1.3.2.2 Pathogenèse

E. coli O157:H7 est un entéropathogène non-invasif (Lamps, 2007). Il possède des

facteurs de virulence lui permettant de s’attacher aux cellules intestinales et de libérer des

toxines, connues sous le nom de vérotoxines ou toxines de type Shiga en raison de leur

ressemblance avec les toxines élaborées par Shigella dysenteriae (Figure 1.8). Les vérotoxines

jouent un rôle important dans l’apparition des symptômes gastrointestinaux mais l’étape

cruciale dans la pathogenèse d’E. coli O157:H7 est l’attachement aux cellules de l’hôte

(LeBlanc, 2003). Suite à l’infection, des hémorragies, de l’œdème et une infiltration de

neutrophiles situés au niveau de la lamina propria peuvent se produire au niveau des cellules

intestinales (Nataro et Kaper, 1998).

30

Figure 1.8 : Pathogénie de la souche entérohémorragique E. coli O157:H7 chez l’humain. Adapté de Nataro et Kaper (1998); EcL (2004).

31 Le diagnostic chez l’humain s’effectue soit par l’isolation de la bactérie E. coli

O157:H7 ou la détection de la présence des vérotoxines dans des échantillons fécaux ou la

détection d’une augmentation d’anticorps anti-E. coli O157:H7 dans le sérum (Nataro et Kaper,

1998). L’infection à E. coli O157:H7 étant à déclaration obligatoire, 1038 cas pour l’année

2004 ont été recensés au Canada (Santé Canada, 2006). L’incidence de ces infections varie

avec la classe d’âge, mais l’incidence maximale des cas notifiés s’observe chez l’enfant de

moins de 15 ans (OMS, 2005).

1.3.2.3 Moyens de lutte et traitements actuels

La prévention de l’infection à E. coli O157:H7 exige des mesures de lutte à toutes les

étapes de la chaîne alimentaire, depuis la production jusqu’au traitement, à la fabrication et à la

préparation des aliments, tant dans les établissements commerciaux que dans l’environnement

domestique. Ainsi, les mesures d’hygiène accrues et la cuisson des aliments demeurent des

moyens efficaces pour diminuer l’incidence de ces infections.

Actuellement, l’antibiothérapie est le traitement le plus commun contre les infections à

E. coli O157:H7. Cependant, des études cliniques récentes ont montré que leur utilisation ne

serait pas recommandée car ils peuvent être associés à un risque plus élevé de développer un

syndrome urémique hémolytique chez les enfants et les personnes âgés en plus d’allonger la

durée de la diarrhée (Molbak et al., 2002; Panos et al., 2006). Ces auteurs ont entre autres

attribué cet effet d’allongement de la diarrhée à l’élimination du microbiote intestinal

compétiteur laissant place à la multiplication des E. coli O157:H7 et plus particulièrement si les

souches O157:H7 sont résistantes aux antibiotiques administrés. De plus, en lysant les cellules

les antibiotiques peuvent augmenter la diffusion des toxines (Nataro et Kaper, 1998).

1.3.3 Infections d’origine virale

Les virus sont responsables d’un haut pourcentage de diarrhées chez les individus

quelque soit le groupe d’âge (DuPont, 2005). Parmi les entéropathogènes viraux présentés

précédemment au Tableau 1.5, les norovirus, rotavirus et astrovirus sont les trois causes les plus

communes d’infections entériques virales dans les pays développés (Mead et al., 1999; Clark et

32

McKendrick, 2004). L’hépatite A est également responsable d’un grand nombre de cas

d’infection mais, bien que ce virus soit considéré comme faisant partie des virus entériques, il

produit des effets dommageables principalement au foie contrairement aux autres virus qui

entraîneront de la diarrhée (Blank et al., 2000; Koopmans et al., 2002). Ces infections virales

requièrent souvent une admission à l’hôpital en particulier pour les populations sensibles telles

que les jeunes enfants, les personnes âgées, les femmes enceintes ou les personnes

immunodéprimées (Gerba et al., 1996).

1.3.3.1 Rotavirus chez les enfants

Chez les enfants, les rotavirus sont la cause la plus commune de diarrhées sévères

principalement chez ceux âgés de moins de deux ans (Garbarg-Chenon et Gault, 2003; Lamps,

2007). Ces virus provoquent des symptômes caractérisés par de la fièvre et des vomissements,

suivis d’une diarrhée aqueuse, parfois associée à une déshydratation sévère et létale chez

l’enfant. La diarrhée peut durer de 4 à 5 jours avec un pic vers le 2e jour. Le mode le plus

commun de transmission est la voie oro-fécale à l’aide de vecteurs contaminés tels les mains,

les aliments, l’eau et les objets.

Les rotavirus humains font partie de la famille des Reoviridae. Ces virus possèdent

deux capsides à symétrie icosaédrique non enveloppés contenant de l’ARN bicaténaire

segmenté (Shaw et Greenberg, 1999). Les rotavirus ont une taille moyenne de 70 nm de

diamètre et leur morphologie, en microscopie électronique, s’apparente à une roue d’où le nom

d’origine latine « rota » (Figure 1.9). Il s’agit de virus très résistants aux conditions

gastrointestinales et infectent avec une haute spécificité les entérocytes différenciés et matures

de l’intestin grêle (Michelangeli et Ruiz, 2003).

33

Figure 1.9 : Particules du rotavirus. Microscopie électronique à transmission. Tiré de Centers for Disease Control and Prevention (1981).

1.3.3.2 Pathogenèse

Bien que la compréhension de la pathogenèse associée aux rotavirus soit incomplète,

l’étude du mécanisme d’infection a fait des progrès depuis que des méthodes de culture in vitro

se sont développées au début des années 1980 (Ramig, 2004; Shaw et Greenberg, 1999). Ainsi,

il a pu être déterminé que l’infection des cellules intestinales débute par l’étape cruciale

d’attachement du virus en faisant intervenir deux protéines de la capside virale nommées VP4

et VP7 et un récepteur cellulaire qui est généralement une glycoprotéine (Lopez et Arias, 2003)

(Figure 1.10). Cette interaction initiale entre le virus et la cellule n’est toutefois pas solide et

d’autres liens doivent s’effectuer pour que l’attachement soit irréversible (Levy et al., 1994).

Une fois le virus solidement attaché à la cellule, l’entrée du matériel génétique se fait

directement à travers la membrane cellulaire suite à l’action d’enzymes protéolytiques

(Garbarg-Chenon et Gault, 2003). Le matériel génétique viral détourne alors la machinerie

cellulaire et effectue sa réplication. Suite à l’infection, l’effacement des villosités peut se

produire par contre, l’inflammation est généralement modérée comparativement à d’autres

pathogènes intestinaux (Ramig, 2004).

34

Figure 1.10 : Pathogénie des rotavirus chez l’humain. Adapté de Levy et al. (1994); Clarin (2007).

Attachement + entrée du matériel génétique dans les entérocytes de

l’intestin grêle

Diarrhée

Déséquilibre osmotique

Ingestion des rotavirus

Rotavirus

Acide nucléique

Récepteur

Réplication et libération des virions

Protéine de capside Cellule

épithéliale

35 Le diagnostic chez l’humain s’effectue principalement par des techniques de détection

directe du rotavirus tels que des tests immunoenzymatiques et d’agglutination à partir

d’échantillons fécaux (Garbarg-Chenon et Gault, 2003). Dans les pays développés, les rotavirus

représenteraient 46% des cas de diarrhées sévères requerrant une hospitalisation chez les jeunes

enfants et au niveau mondial, les infections à rotavirus compteraient pour 20% à 40% des

hospitalisations reliées aux gastro-entérites (Kapikian, 1993). Au Québec, le pourcentage

d’infection à rotavirus représenterait 30% des cas de gastro-entérites et le nombre de cas

d’hospitalisation serait évalué à environ 1500 par an (INSPQ, 2002).

1.3.3.3 Prévention

Il existe peu de moyens pour se protéger des infections entériques causées par les

rotavirus. Un vaccin avait été homologué aux États-Unis par la ‘Food and Drug

Administration’ en 1998 (CDCP, 1999). Cependant, il a été retiré du marché en 1999 à cause de

nombreux cas de complications. Depuis, la recherche demeure active pour développer d’autres

vaccins efficaces contre les rotavirus (Desselberger, 2005). Mais, le désavantage de ces vaccins

est, qu’ils sont très onéreux et peu accessibles à une population peu fortunée.

1.3.4 Défenses de l’hôte

Face à l’intrusion de micro-organismes pathogènes dans le tube digestif, le corps

humain possède différents moyens de défenses. Plusieurs lignes de défenses chimiques,

mécaniques et microbiologiques participent à limiter l’accès des pathogènes d’origines diverses

(bactérienne, virale, parasitaire) à la muqueuse intestinale qui est la plus grande partie exposée

à l’environnement externe avec 200 à 300 m2 (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). Ainsi, pour

lutter contre l’établissement infectieux d’entéropathogènes tout au long du tractus digestif, une

première ligne de défense est assurée par des barrières chimiques telles que l’acidité gastrique,

l’activité antimicrobienne d’enzymes pancréatiques, le lysozyme, les sécrétions intestinales et

bactériennes.

Les défenses antimicrobiennes au niveau intestinal sont présentées à la Figure 1.11. Les

pathogènes entériques, qui expriment des facteurs de pathogénicité tels que facteurs d’adhésion,

36

invasines et toxines interagissent avec les cellules des villosités intestinales (Nauciel, 2000). En

réponse à ces pathogènes indésirables, les cellules de Paneth situées à la base des villosités

sécrètent des molécules protéiques antimicrobiennes de même que d’autres cellules situées sur

les villosités. En parallèle, les bactéries intestinales résidentes Gram-négatif et positif

produisent des molécules antibactériennes. Ces substances antimicrobiennes ont un large

spectre d’activité contre une variété de bactéries et les virus enveloppées (Liévin-Le Moal et

Servin, 2006). Cette défense chimique joue un rôle majeur lors des premières heures suivant

l’infection (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). D’autres moyens physiques, tels que la mobilité

de l’intestin par péristaltisme, peuvent contribuer à l’élimination des pathogènes hors de

l’intestin (Ouwehand et al., 2002a; Gill, 2003).

Figure 1.11 : Défenses antimicrobiennes de l’hôte face à l’intrusion de micro-organismes pathogènes au niveau du tractus intestinal. Tiré de Liévin-Le Moal et Servin (2006).

Composés antimicrobiens d’origine bactérienne

Bactéries intestinales résidentes

Pathogènes entériques

Cellules de Paneth

Composés protéiques antimicrobiens produits par les cellules intestinales

Épithélium intestinal

37 Enfin, la présence du microbiote résident sur l’épithélium intestinal constitue un moyen

de défense non spécifique important. Pour illustrer cette importance, il a été estimé que le

tractus intestinal d’un humain héberge approximativement 1013-1014 bactéries viables,

c’est-à-dire plus de 10 fois le nombre total de cellules eucaryotes de tous les tissus du corps

humain réunis (Picard et al., 2005). Cette barrière microbienne sera décrite plus en détails dans

la prochaine section.

1.3.4.1 Importance de la barrière microbienne

Le microbiote résident du tractus gastrointestinal humain contient diverses populations

de bactéries qui jouent un rôle essentiel dans le développement et le bien-être de l’hôte

(Liévin-Le Moal et Servin, 2006). En plus de ses effets nutritionels et physiologiques, le

microbiote intestinal participe à la protection de l’hôte en agissant comme une barrière

microbienne contre l’infection par des pathogènes microbiens (Servin, 2004). Ce rôle est

communément appelé «l’effet barrière».

L’établissement de cet écosystème microbien complexe s’effectue dès les premières

heures de vie d’un nouveau-né, qui en est initialement dépourvu (Steer et al., 2000). Les

premiers germes rencontrés sont des entérobactéries (E. coli essentiellement) et streptocoques

(Cibik et al., 2004). Puis vers le deuxième-troisième jour, apparaissent des espèces variées

appartenant aux genres Bifidobacterium, Lactobacillus, suivent ensuite les Bacteroides et

Clostridiae (Ballongue, 1998). Jusqu’à l’âge de deux ans, le microbiote se diversifiera et

s’établira dans les différents compartiments du tractus digestif tel qu’illustré à la Figure 1.12.

La connaissance des genres et des espèces dominantes, de même que leurs concentrations et

leurs activités biologiques sont utiles pour comprendre l’écologie du tractus gastrointestinal. Le

microbiote de l’estomac est peu élevée avec des concentrations inférieures à 103 cfu/ml et sont

en général des micro-organismes Gram-positifs et aérobiques (Gibson et Beaumont, 1996).

L’intestin grêle constitue une zone de transition entre la population disparate de l’estomac et le

microbiote luxuriant du côlon. En conditions normales, le microbiote de la première partie du

duodénum est similaire à celle de l’estomac. Les espèces dominantes incluent entre autres les

streptocoques et lactobacilles (Mackie et al., 1999). Dans la dernière partie de l’intestin grêle,

le nombre de bactéries Gram-négatifs dépasse celui de Gram-positifs. Les coliformes et

les bactéries anaérobiques telles que les Bacteroides, bifidobactéries et fusobactéries sont

38

régulièrement présents en concentrations substantielles jusqu’environ 108 cfu/ml

(Mackie et al., 1999). À la suite de l’intestin grêle, la concentration bactérienne augmente

rapidement pour atteindre 1010 à 1012 cfu/g (Conway, 1995; Macfarlane et al., 2004). Les

bactéries anaérobiques dépassent les aérobes. Les bactéries dominantes sont les Bacteroides,

bifidobactéries, coques Gram-positifs, clostridia et différentes espèces d’entérobactéries sont

aussi présentes (Guarner, 2006).

Figure 1.12 : Colonisation microbienne du tractus gastrointestinal humain. Adapté de Holzapfel et al. (1998).

En général, les populations bactériennes à l’intérieur du tractus gastrointestinal

coexistent en ayant chacune leur niche écologique nécessaire à leur croissance (Fooks et

Gibson, 2002). Cependant, pour fonctionner de façon optimale, la balance du microbiote

bactérien doit être maintenue de façon équilibrée mais de nombreux facteurs peuvent l’affecter.

La composition globale du microbiote dans l’intestin peut être influencée par l’âge de l’hôte

(voir Figure 1.2), l’état de santé, l’alimentation (riche en sucres ou en protéines) et l’adaptation

de chaque espèce (Ventura et al., 2004). Ceci explique les variations interindividuelles

Jéjunum et Iléon (104 – 108 CFU/ml) Lactobacilles Bacteroides Entérobactéries Bifidobactéries Streptocoques Fusobactéries

Côlon (1010 – 1012 CFU/g) Bacteroides Clostridiae Pseudomonas Bifidobactéries Veillonella Levures Streptocoques Lactobacilles Protozoaires Fusobactéries Proteus Entérobactéries Staphylocoques

Estomac et Duodénum (101 – 103 CFU/ml) Lactobacilles Streptocoques Levures

39

retrouvées dans la population en général (Hopkins et al., 2002). Un autre facteur contributoire

est la consommation de médicaments, en particulier les antibiotiques, qui détruisent les

bactéries et peuvent avoir un impact négatif sur la balance du microbiote intestinal. Ainsi, tous

ces facteurs peuvent déplacer l’équilibre du microbiote contenant des bactéries potentiellement

bénéfiques vers des micro-organismes néfastes comme les clostridia, les réducteurs de

sulphates et les Bacteroides protéolytiques (Salminen et al., 1998).

Le concept des espèces bénéfiques existe depuis longtemps (Liévin et al., 2000). Selon

ce concept, certaines bactéries formant le microbiote intestinal seraient associées à des effets

positifs sur la santé, alors que d’autres sont considérées comme néfastes (Tableau 1.6). Les

bactéries potentiellement favorables pour la santé incluent principalement les genres

Bifidobacterium et Lactobacillus et leur dominance chez les nouveaux-nés nourris au sein leur

procureraient une protection contre les infections intestinales (Picard et al., 2005).

Tableau 1.6 : Rôles des différents groupes bactériens retrouvés dans le microbiote.

Bactéries intestinales Rôles Effet

Bifidobactéries Digestion/ absorption des aliments, stimule la fonction immunitaire, synthèse de vitamines

+

Lactobacilles Digestion/ absorption des aliments, stimule la fonction immunitaire

+

Bacteroides Synthèse de vitamines putréfaction intestinale

+/−

Entérocoques E. coli

Inhibition de bactéries exogènes diarrhée/ constipation

+/−

Streptocoques Stimule la fonction immunitaire production de précurseurs cancéreux

+/−

Ps. aeruginosa Proteus sp.

Putréfaction intestinale −

Staphylocoques Clostridium Veillonellae

Production de précurseurs cancéreux −

Adapté de Salminen et al. (1998); Guarner (2006).

Tel que souligné par Servin et al. (2004), il apparaît de plus en plus évident que les

bactéries appartenant aux genres Bifidobacterium et Lactobacillus possèdent des activités

antimicrobiennes qui participent au système de défense gastrointestinal de l’hôte. Il est ainsi

40

intéressant d’améliorer la composition du microbiote intestinal par les aliments en apportant

des bactéries transitoires. Le but étant d’augmenter le nombre et l’activité des micro-

organismes possédant des propriétés bénéfiques à la santé (voir section 1.1).

1.3.4.2 Modulations des mécanismes de la réponse immunitaire

L’hôte possède également des défenses immunologiques lui permettant de répondre

spécifiquement aux pathogènes entériques. Lorsque ces pathogènes sont en contact avec

l’intestin, une réponse immune peut se produire à partir de sites d’induction constitués de tissus

organisés tels que les follicules lymphoïdes (Plaques de Peyers et nodules lymphatiques

mésentériques) et s’exprimer à partir des sites effecteurs représentés par un nombre élevé de

cellules immunocompétentes situées au niveau de la lamina propria et de l’épithélium mucosal

(Gill, 2003) (Figure 1.13).

Figure 1.13 : Le système immunitaire intestinal. Tiré et traduit de Magalhaes et al. (2007).

41 Le système de défense contre l’intrusion de pathogènes entériques inclut l’immunité

adaptative et innée. L’immunité adaptative est typiquement observée 4 à 7 jours après

l’infection, et ce mécanisme implique la génération d’une mémoire immunologique et

l’expansion des récepteurs appropriés. Après un contact avec un antigène ou un micro-

organisme, le système immunitaire répond par la production d’anticorps protecteurs (IgG, IgA)

et par l’activation de cellules T CD4+ ou CD8+. Cette immunité spécifique peut être locale pour

la protection des muqueuses (IgA), ou périphérique (IgG) pour une réponse plus générale de

l’organisme (Boclé et al., 2005). Au contraire, l’immunité innée est mobilisée dès les premiers

jours pour contrôler l’infection (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). L’immunité innée utilise

essentiellement des mécanismes visant à éliminer de façon rapide et non spécifique des micro-

organismes pathogènes par les phagocytes ou à éliminer des molécules du non soi par la

stimulation de l’activité des lymphocytes natural killer (NK) (Boclé et al., 2005). Contrairement

au système immunitaire adaptatif qui utilise un répertoire hautement diversifié et clonal, le

système immun inné utilise des ensembles de molécules de reconnaissance non clonales

(Liévin-Le Moal et Servin, 2006).

Le développement des connaissances sur la façon dont l’hôte distingue entre les

bactéries intestinales résidentes et les micro-organismes pathogènes a révélé que l’hôte possède

des systèmes hautement sophistiqués pour détecter les antigènes qui appartiennent aux micro-

organismes néfastes (Magalhaes et al., 2007). De plus, il a été suggéré récemment que certaines

bactéries pourraient renforcer les défenses immunes de l’hôte contre l’intrusion de pathogènes

(voir section 1.2.1.4).

42

1.4 But, hypothèse et objectifs du travail

1.4.1 But

Le but de ce projet de recherche était d’évaluer par des modèles in vitro et in vivo le

potentiel de souches de bifidobactéries d’origine humaine à caractère probiotique dans la

prévention et la résistance aux infections entériques bactérienne (E. coli O157:H7) et

virale (rotavirus), deux infections à incidence très élevée chez l’humain. Ce projet visait

également une meilleure compréhension des mécanismes d’action des probiotiques.

1.4.2 Hypothèse

L’analyse critique de la littérature concernant les connaissances actuelles sur le rôle des

probiotiques lors d’infections entériques nous a permis d’établir que i) l’effet des souches de

bifidobactéries sur les infections entériques a très peu été étudié, ii) les interactions des

entéropathogènes bactériens et viraux au niveau intestinal sont encore mal connus et

iii) les mécanismes d’action des probiotiques restent à déterminer. Toutefois, des études

cliniques réalisées avec succès sur un nombre limité de patients et quelques travaux réalisés in

vitro laissent penser que certaines souches probiotiques possédent un rôle significatif lors des

infections entériques en agissant sur les mécanismes de défenses non-spécifiques et spécifiques

de l’hôte. Ces travaux nous ont permis d’émettre l’hypothèse de recherche suivante:

Certaines espèces de bifidobactéries ayant un fort potentiel probiotique peuvent

supplanter l’installation et le développement de pathogènes bactériens et viraux au niveau

intestinal via leur capacité à créer un effet barrière en adhérant à la paroi intestinale ou en

stimulant les défenses immunitaires de l’hôte pour lutter plus efficacement contre ces types

d’infections.

43

1.4.3 Objectifs

Pour vérifier l’hypothèse de recherche cinq objectifs ont été fixés : Objectif 1 : Évaluer l’activité in vitro des bifidobactéries humaines contre la souche pathogène

E. coli O157:H7 à l’aide d’un test de compétition sur des cellules intestinales

(Chapitre 2).

Les bifidobactéries utilisées lors de cette étude proviennent d’une banque de souches du

groupe de recherche STELA de l’Université Laval (Québec, Canada). Elles ont été isolées sur

milieux sélectifs NPNL (Hartemink et Rombouts, 1999) à partir de fèces de nouveaux-nés

allaités au sein (Hôpital St-Sacrement, Québec) (Touré et al. 2003). Cinq souches démontrant

une forte résistance aux conditions sévères du tube digestif (lysozyme, acidité gastrique et sels

biliaires) de même qu’un pouvoir antagoniste élevé mesuré à l’aide de la méthode du spot test

(Tagg et al., 1976) ont été sélectionnées pour effectuer le test de compétition in vitro contre la

souche E. coli O157:H7.

Objectif 2 : Valider l’effet anti-E. coli O157:H7 de la souche Bifidobacterium

thermacidophilum RBL71 à l’aide d’un modèle murin d’infection (Chapitre 3).

Un modèle d’infection à E. coli O157:H7 a été développé chez la souris. Ce modèle a

été choisi pour deux raisons: i) l’anatomie du tractus digestif ressemble à celui de l’homme et

ii) l’utilisation admise de modèles murins dans les recherches scientifiques. Les paramètres

suivants ont été suivis avant, pendant et après infection des souris: poids, analyse de la prise

alimentaire, suivi de la production d’anticorps, histologie et culture microbiologique des

prélèvements fécaux.

Objectif 3 : Développer une méthode in vitro pour évaluer l’attachement des rotavirus aux

cellules intestinales et le comparer à d’autres virus entériques (Chapitre 4).

Des pourcentages de l’attachement viral aux lignées cellulaires Caco-2 et HT-29 ont

été évalués et pris en compte pour la suite du projet. Pour ce faire, des techniques de titration

par immunofluorescence et des essais par plages de lyse ont été effectués.

44

Objectif 4 : Étudier l’effet de souches de bifidobactéries humaines sur l’attachement des

rotavirus aux cellules intestinales par des tests de compétition in vitro et le

comparer à d’autres virus entériques (Chapitre 5).

L’attachement viral a été calculé en tenant compte de l’ajout de trois autres souches de

bifidobactéries humaines provenant de la banque de souches décrite à l’objectif 1. Ainsi un

pourcentage d’inhibition a été calculé et le probiotique ayant obtenu le plus fort taux

d’inhibition a été retenu pour poursuivre l’étude in vivo.

Objectif 5 : Valider l’effet anti-rotavirus de la souche Bifidobacterium thermophilum RBL67 à

l’aide d’un modèle murin d’infection (Chapitre 6).

Une analyse approfondie de l’effet anti-viral obtenu avec le probiotique choisi au

quatrième objectif a été réalisée en utilisant des paramètres similaires à ceux cités à

l’objectif 2.

45

Chapitre 2.

Inhibition in vitro d’Escherichia coli O157:H7 par des souches de bifidobactéries d’origine humaine

In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 by

bifidobacterial strains of human origin

L’objectif de ce chapitre était de caractériser de façon in vitro le potentiel probiotique

des bifidobactéries isolées de fèces de nouveaux-nés et d’étudier l’inhibition de la souche

entérohémorragique Escherichia coli O157:H7 par deux souches de bifidobactéries

pré-sélectionnées en utilisant un test de compétition réalisé à l’aide d’un modèle de cellules

intestinales Caco-2. Les manipulations ont été effectuées au pavillon Comtois (Université

Laval, Québec), dans des laboratoires avec les équipements nécessaires pour la culture

cellulaire, la bactériologie probiotique et pathogène.

Les résultats de ce travail ont été publiés dans la revue International Journal of Food

Microbiology (2004, 92: 69-78). Les auteurs de cet article sont Mélanie Gagnon, Ehab E.

Kheadr, Gwenaëlle Le Blay et Ismaïl Fliss. Ce chapitre présente le contenu intégral de cet

article rédigé en anglais.

46

2.1 Résumé

La capacité d’inhibition in vitro de bifidobactéries isolées de fèces de nouveaux-nés

contre la souche entérohémorragique Escherichia coli serotype O157:H7 ainsi que leur capacité

à diminuer son adhésion aux cellules intestinales Caco-2 ont été évaluées et comparées à celles

des souches références de bifidobactéries provenant de l’organisme ‘American Type Culture

Collection’. Cinq isolats fécaux appartenant au genre Bifidobacterium ont été identifiés et

caractérisés par analyses morphologiques, essai du fructose-6-phosphate phosphoketolase,

réaction de polymérisation en chaîne à l’aide d’amorces spécifiques au 16S rDNA, profil de

fermentation des sucres, résistance au lysozyme, à l’acide, la bile et au peroxide d’hydrogène

ainsi que pour leur faculté à inhiber les bactéries E. coli O157:H7 en utilisant la technique de

diffusion sur gélose. Les isolats de nouveaux-nés ont montré une résistance supérieure au

lysozyme, à l’acide, la bile et une activité antimicrobienne plus élevée que les souches ATCC.

Deux isolats de nouveaux-nés, identifiés B. bifidum RBL71 et B. bifidum RBL460, ont montré

une bonne adhésion et un potentiel significatif pour réduire l’adhésion de E. coli O157:H7 aux

cellules Caco-2. Cet effet est dépendant de la concentration en bifidobactéries. Ces résultats

démontrent que les bifidobactéries isolées de fèces de nouveaux-nés peuvent être utilisées pour

l’amélioration de produits probiotiques dans la protection contre les infections à E. coli

O157:H7.

47

2.2 Abstract

The ability of bifidobacteria isolated from infant feces to inhibit enterohemorrhagic

Escherichia coli serotype O157:H7 in vitro and reduce its adhesion to human enterocyte-like

Caco-2 cells was evaluated in comparison to American Type Culture Collection bifidobacterial

reference strains. Five Bifidobacterium isolates from infant feces were identified and

characterized by morphology, fructose-6-phosphate phosphoketolase assay, polymerase chain

reaction using bifidobacterial 16S rDNA specific primers, carbohydrate fermentation patterns,

resistance to lysozyme, acid, bile and hydrogen peroxide as well as their ability to inhibit

E. coli O157:H7 using the agar spot technique. Infant isolates showed greater resistance to

lysozyme, acid, bile and more antimicrobial activity against E. coli O157:H7 than ATCC

strains. Two infant isolates identified as B. bifidum RBL71 and B. bifidum RBL460 showed

good adhesion and significant potential for reducing adhesion of E. coli O157:H7 to Caco-2

cells. This effect was dependent on bifidobacterial cell concentration. These results show that

bifidobacteria isolated from infants may be useful for improving probiotic formulae with

respect to protection against E. coli O157:H7 infection.

48

2.3 Introduction

Intestinal microbiota is described as a complex ecosystem containing at least

50 genera of bacteria comprising several hundred species (Finegold et al., 1974). The majority

of these bacteria reside in the colon and some are believed to bring health and therapeutic

benefits to the host. The effect of intestinal flora on human health was first proposed by

Metchnikoff (1908). This theory evolved into the concept of probiotics, which are defined as

live microbial feed supplements that benefit the host by improving its intestinal microbial

balance (Fuller, 1989).

Bifidobacteria, normal habitants of the human intestinal tract (Modler, 1994), can reach

a concentration of 1010 colony forming units (cfu)/g of intestinal contents (Tannock, 1995).

These bacteria are believed to provide several health, nutritional and therapeutic benefits to

human hosts including reduction of blood cholesterol (Modler, 1994), improvement of lactose

utilization in malabsorbers (Jiang et al., 1996), deconjugation of bile acids (Lankaputhra and

Shah, 1995) and increased immunity in animal hosts (Gill, 1998). They are considered essential

for maintaining what is described as a healthy equilibrium between beneficial and potentially

harmful microorganisms in the gastrointestinal tract (Sreekumar and Hosono, 1998). Based on

clinical reports, bifidobacteria appear to reduce the incidence of rotaviral infection, traveller’s

diarrhea and antibiotic associated diarrhea (reviewed by McNaught and MacFie, 2001). They

are also reportedly antagonistic towards pathogens belonging to the genera Salmonella,

Escherichia, Proteus, Shigella and Candida (Kanbe, 1991).

To achieve probiotic status, the proposed microorganism must be non-pathogenic and

meet a number of criteria including acid and bile stability, the ability to adhere to the intestinal

mucosa and establish itself in the intestinal ecosystem and the ability to compete with harmful

organisms by reducing nutrient availability or by secreting antimicrobial substances

(McNaught and MacFie, 2001). In addition, a probiotic candidate must exhibit good growth

in vivo, high stability during processing and storage and tolerance to food additives. Selection

of suitable probiotic candidates is the principal basis for improving the biotherapeutic action

and functional properties of probiotic foods and pharmaceutical products. Although many

49

potentially probiotic strains are currently available for commercial use either in the form of

fermented foods or pure culture in powdered, tablet or capsule form, this includes few

bifidobacteria isolated from humans. It therefore appears appropriate to isolate and characterize

new bifidobacteria strains with specific and well-characterized activities, not only to improve

the quality and functional properties of probiotic products but also to advance both applied and

fundamental science in the area of probiotics.

The objectives of the present study were 1) to isolate and characterize bifidobacterial

strains exhibiting high probiotic potential and 2) to evaluate the effectiveness of these isolates

at inhibiting E. coli O157:H7 and preventing its adhesion to Caco-2 cells. Reference strains

from the American Type Culture Collection were included for comparison purposes.

2.4 Materials and methods

2.4.1 Bacterial strains and growth conditions

Bifidobacterium longum ATCC 15707 and ATCC 15708; B. breve ATCC 15700;

B. infantis ATCC 15697; B. adolescentis ATCC 15704; B. bifidum ATCC 15696;

B. pseudolongum ATCC 25526; B. suis ATCC 27531; B. animalis ATCC 27536;

B. thermophilum ATCC 25866 and Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150 were obtained

from the American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). Bifidobacterium RBL71,

RBL81, RBL82, RBL460 and RBL461 were isolated in this study from infant feces. All strains

were maintained as 20% glycerol stock at -80ºC. Bifidobacterial strains were reactivated in

MRS broth (De Man et al., 1960) obtained from Rosell Institute Inc. (Montréal, Québec,

Canada) supplemented with 0.05% (w/v) L-cysteine-hydrochloride (Cys-HCl, Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO) and incubated under anaerobic conditions at 37ºC using an atmosphere

generation system (AnaeroGen, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England).

Escherichia coli O157:H7 was reactivated in Tryptic Soy broth (TSB; Difco, Becton

Dickinson, Franklin Lakes, NJ) and incubated aerobically at 37°C. All strains were subcultured

at least three times prior to the experiments.

50

2.4.2 Isolation procedures

Fecal samples from one-week-old breast-fed infants at Saint-Sacrement Hospital

(Québec, Canada) were collected in anaerobic jars (Oxoid) and analyzed within 1 h.

Approximately 5 g were placed in a stomacher bag, diluted with 45 ml of sterilized peptone

water (0.1%) containing 0.05% (w/v) Cys-HCl and homogenized for 3 min in a LAB blender

80 stomacher (Seward Medical, London, England). Samples were then serially diluted 10-fold

using peptone water and appropriate dilutions were plated on Neomycin Paromomycin

Nalidixic acid Lithium chloride (NPNL) agar (Hartemink and Rombouts, 1999). Plates with

fecal samples were incubated anaerobically at 37°C for 72 h. Three to five colonies from each

medium were re-plated at least five times by streaking on the same medium. Colonies were

then examined by Gram staining and those showing morphological characteristics of

bifidobacteria were subcultured in MRS broth with Cys-HCl and stored at -80°C. The isolates

were tested for intracellular fructose-6-phosphate phosphoketolase (F6PPK) production

(Scardovi, 1986) and for the presence of a specific 1.35 kb sequence of bifidobacterial 16S

rDNA using PCR and Bifidobacterium genus-specific primers lm26-f and lm3-r (Gibco,

Bethesda Research Laboratories, Burlington, Ontario, Canada) by the method of Kaufmann et

al. (1997).

2.4.3 Carbohydrate fermentation

The ability of Bifidobacterium isolates and reference strains (ATCC) to ferment various

carbohydrates was determined using API 50CH strips (BioMérieux, Montréal, Québec,

Canada), according to the manufacturer’s instructions. Results were reported as negative

(nonfermentable sugar), slow (moderately fermentable sugar) or positive (fermentable sugar).

Sugar fermentability was visually estimated based on a 5-point color intensity scale. In order to

identify bifidobacterial isolates at the species level, fermentation profiles were compared with

those of reference strains and matrix coefficient analysis was performed with Stat View F-4.11

(Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA).

51

2.4.4 Lysozyme, acid, bile and hydrogen peroxide tolerance

Tolerance of isolated strains to lysozyme, acidic conditions, bile salts and hydrogen

peroxide was tested using sterile flat-bottom 96-well microtiter plates (Falcon, Becton

Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ). MRS broth with egg white lysozyme (Sigma,

48000 U/mg protein, 100, 200, 300 µg/ml), HCl to adjust the pH to 5.5, 5.0, 4.8, 4.6, 4.4, 4.2 or

4.0, bovine bile salts (Sigma, 0.3% w/v) or hydrogen peroxide (Merck KGaA, Darmstadt,

Germany, 5, 10, 20 and 30 µg/ml), were prepared. Wells containing 200 µl of broth were

inoculated with 20 µl of an overnight culture of bifidobacterial isolate (in triplicate) diluted

1/100 in the same broth. Microplates were incubated anaerobically at 37°C for 18 h. Optical

densities (OD) were read at 650 nm using a Thermomax microplate reader (Molecular Devices,

Opti-Ressources Inc., Charny, Québec, Canada). Resistance to H2O2 and lysozyme was

expressed as the lowest concentration that completely inhibited growth. Acid resistance was the

lowest pH value at which the tested strain had an optical density at least 40% of its level at

pH 6.5.

2.4.5 Antagonism between bifidobacteria and E. coli O157:H7

For detection of antimicrobial activity against E. coli O157:H7, a modification of the

agar spot test described by Tagg et al. (1976) was used. Overnight bifidobacterial culture (2 µl)

in MRS broth was spotted on 1.5% MRS agar plates. Plates were dried for 30 min at room

temperature, incubated anaerobically at 37°C for 18 h and overlaid with 10 ml Tryptic Soy agar

(0.85%) at 45ºC seeded with 1% (v/v) of an overnight culture of E. coli O157:H7 to obtain a

final concentration of 106 cfu/ml. Plates were then incubated aerobically at 37°C for 18 h and

checked for zones of inhibition (clear agar) around the bifidobacterial colonies.

2.4.6 Caco-2 cell culture

Enterocyte-like Caco-2 cells (ATCC HTB-37) were cultured in Dulbecco’s Modified

Eagle medium (DMEM; Gibco) containing containing 4,500 mg of glucose/liter, 4 mM

glutamine and 1 mM sodium pyruvate at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. The medium was

supplemented with 20% fetal calf serum (FCS; Hyclone Laboratories, Logan, UT),

52

1% nonessential amino acids (NEAA; Gibco) and 1% (v/v) antibiotics (100 U/ml penicillin,

100 µg/ml streptomycin; Gibco). For the bacterial adhesion assay, Caco-2 cells were seeded at

1.4 × 104 /cm2 on glass coverslips placed in 6-well tissue culture plates (9.6 cm2 /well, Falcon)

for immunodetection and Gram staining or in 24-well tissue culture plates (2 cm2 /well, Falcon)

for bacterial enumeration. The culture medium was replaced every 48 h, and the monolayers of

Caco-2 cells were used at post confluence after 15 days. The Caco-2 cells were used at between

33 and 36 passages for adherence assays.

2.4.7 Bacterial adhesion assay

The adhesion of bifidobacterial strains to Caco-2 cells was examined separately or in

competition with E. coli O157:H7. Caco-2 cells were washed twice with sterile phosphate-

buffered saline (PBS, 100 mM, pH 7.3) and submerged in antibiotic-free DMEM for 18 h

followed by one wash with PBS prior to bacterial inoculation. Bifidobacteria in overnight

(18 h) MRS culture and E. coli O157:H7 in 7 h Tryptic Soy broth culture were harvested by

centrifugation and washed twice with PBS. Bacteria were diluted in DMEM (pH 7.3, 25ºC) and

2 or 0.5 ml/well of the bacterial suspension was added to the 6-well and 24-well tissue culture

plates, respectively. First, the ability of both E. coli O157:H7 and bifidobacteria to adhere to

Caco-2 cells was evaluated separately at a concentration of 107 cfu/well and expressed as the

ratio of attached to added bacteria. The ability of bifidobacteria to inhibit E. coli O157:H7

adhesion (107 cfu/well) to Caco-2 cells was evaluated by simultaneous addition of 106 to 108

cfu/well of tested bifidobacterial isolate. Plates were incubated anaerobically for 1 h at 37°C,

washed three times with sterile PBS and adhering cells were enumerated on selective media as

described below. Caco-2 cells with adherent bacteria were also fixed in PBS containing

4% (w/v) paraformaldehyde (TAAB, Callera Park, Aldermaston Berks, England) and observed

microscopically with immunofluorescent labeling or Gram stained.

2.4.8 Enumeration of adherent bacteria

Caco-2 cells with adherent bacteria were released from wells using 0.25 ml of trypsin-

EDTA (0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA⋅4Na; Gibco). After 15 min incubation at 37ºC, 0.25 ml

of DMEM supplemented with 20% FCS was added to each well to stop the trypsin reaction and

53

the Caco-2 layer was detached by pipetting. Serial 10-fold dilutions of bacteria in suspension

were then plated on Beerens agar (Beerens, 1990) for Bifidobacterium sp. and on MacConkey

sorbitol agar (Difco) for E. coli O157:H7. Beerens plates were incubated anaerobically for 72 h

and MacConkey plates aerobically for 18 h at 37°C. The effect of Bifidobacterium sp. on the

adhesion of E. coli O157:H7 was calculated as: (A/B) × 100. Where (A) is adherent E. coli

O157:H7 (cfu/well) in the presence of Bifidobacterium sp. and (B) adherent E. coli O157:H7

(cfu/well) in the absence of Bifidobacterium sp.

2.4.9 Immunofluorescent detection of bacterial adhesion to Caco-2 cells

The adhesion of bifidobacterial strains and E. coli O157:H7 was evaluated qualitatively

by indirect immunofluorescence. Paraformaldehyde fixed Caco-2 cells were washed twice

(3 min) with sterile PBS containing 0.05% (v/v) Tween-20 (PBS-T) then blocked for 30 min at

37ºC with 10% (v/v) horse serum (HS), washed three times with PBS-T and held for 2 h at

37ºC in the dark with polyclonal primary antibody, either rabbit anti-bifidobacteria (2 µg/ml in

PBS containing 10% HS) (Prioult et al., 2000) or goat anti-E coli O157:H7 (4 µg/ml in PBS

containing 10% HS) from Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD. Caco-2 cells

with both bacterial species were incubated sequentially with each primary antibody. Then the

preparation was washed five times (5 min) with PBS-T before adding the secondary antibody,

Alexa Fluor 488 conjugated goat anti-rabbit (5 µg/ml in PBS) or Alexa Fluor 568 conjugated

donkey anti-goat (5 µg/ml in PBS) from Molecular probes Inc., Eugene, OR. The preparation

was then held in the dark for 30 min at 37ºC and washed four times (3 min) with sterile PBS–T.

The highlighting of the adherent cells was observed with a confocal microscope (LSM 310;

Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). The Alexa fluorophores have excitation maxima at 488 and

568 nm and emission maxima at 517 and 603 nm respectively (Haugland, 1998). The confocal

laser scanning microscope was equipped with an Ar-ion laser (488 nm) and a He-Ne laser

(543 nm) as excitation sources and two photomultipliers to detect emissions ranging from

515 to 565 nm and from 575 to 640 nm.

2.4.10 Statistical analysis

A one-way analysis of variance (ANOVA) was performed, using Stat View F-4.11

(Abacus Concepts Inc., Berkeley, CA) to test the effects of bifidobacteria on E. coli O157:H7

54

adhesion. Significant differences were accepted at P < 0.05 level. Correlation coefficients were

also analyzed with the Stat View F-4.11.

2.5 Results

2.5.1 Isolation of bifidobacterial strains

Five bifidobacteria coded RBL71, RBL81, RBL82, RBL460 and RBL461 were isolated

from infant stool samples on NPNL agar. Infant isolates showed variable morphological

characteristics and were all positive for the production of fructose-6-phosphate

phosphoketolase. The identity of the isolated strains was confirmed by specific PCR. All

bifidobacterial isolates gave specific amplification as indicated by the presence of the 1.35 kb

16S rDNA specific amplicon (Figure 2.1).

Figure 2.1 : Agarose gel electrophoresis of PCR products from infant bifidobacterial isolates used in this study. PCR products were amplified with Bifidobacterium genus-specific primers lm26-f and lm3-r. Lane 1: size markers generated by HindIII-digested DNA. Lanes 2-6: infant bifidobacterial isolates RBL71; RBL81; RBL82; RBL460 and RBL461, respectively. Lane 7: B. longum ATCC 15707.

1.35 kb

1 2 3 4 5 6 7

55

2.5.2 Carbohydrate fermentation

Table 2.1 shows the results of the carbohydrate fermentation patterns obtained for

bifidobacteria isolated in this study and their correlation coefficients with ATCC reference

strains. Four infant isolates of five were highly correlated with B. bifidum ATCC 15696 and

one isolate, RBL82, showed a weak correlation (0.660) with B. pseudolongum ATCC 25526.

Table 2.1 : Carbohydrate fermentation profile of isolated bifidobacteria and correlation coefficient with known Bifidobacterium species.

Ability to ferment (+) or not (-) the sugara Infant isolates

L-Ara D-Xyl Rib D-Glu Cel Mal Lac Mlz Sta Gln Suggested species

Correlation coefficient

RBL71 - + + + + + + + - - B. bifidum 0.921 RBL81 + + + + + + + + - + B. bifidum

B. adolescentis 0.950 0.949

RBL82 - - + + + + + + - - B. pseudolongum 0.660 RBL460 + + + + + - + + - - B. bifidum 0.921 RBL461 + + + + + + + + - - B. bifidum

B. longum 0.961 0.924

aL-Ara, L-arabiniose; D-Xyl, D-Xylose; Rib, ribose; D-Glu, D-glucose; Cel, cellobiose; Mal, maltose; Lac, lactose; Mlz, melezitose; Sta, starch; Gln, gluconate.

2.5.3 Lysozyme, acid, bile and hydrogen peroxide tolerance

The tolerance of bifidobacterial strains to lysozyme, acidic conditions, bile salts and

H2O2 are given in Table 2.2. All infant isolates tolerated egg white lysozyme up to 300 µg/ml

but only two reference strains did B. breve ATCC 15700 and B. infantis ATCC 15697.

Reference strains appeared to be less inclined to grow at pH 4. Four of five infant isolates

(RBL71, RBL81, RBL460 and RBL461) grew well at pH 4. All strains grew in the presence of

0.3% bile salts except isolate RBL461. The infant isolates RBL81, RBL82 and RBL461

showed resistance to H2O2 up to 10 µg/ml, while RBL71 and RBL460 were more tolerant,

resisting up to 20 µg/ml.

56

Table 2.2 : Tolerance of bifidobacteria strains to various biochemical factors.

a Minimum inhibitory concentration (MIC) b Minimum growth pH c + growth d - no growth

2.5.4 Antagonism between bifidobacteria and E. coli O157:H7

Using the spot test with non buffered media, all bifidobacteria were antagonistic

towards E. coli O157:H7 to varying degrees. Infant and reference strains produced inhibition

zones of larger than 30 mm (Figure 2.2). When the same strains were tested on sodium

bicarbonate buffered (2 g/L) MRS medium, inhibition zones were smaller (13-15 mm).

Source and strain Assay

Lysozyme (µg/ml)a

Acid toleranceb

Bile salts (0.3%)

H2O2 (µg/ml)a

American Type Culture Collection B. breve ATCC 15700 B. longum ATCC 15708 B. infantis ATCC 15697 B. pseudolongum ATCC 25526 Infant isolates RBL71 RBL81 RBL82 RBL460 RBL461

>300 200-300

>300 200-300

>300 >300 >300 >300 >300

4 4 4 4

<4 <4 4

<4 <4

+ c + + +

+ + + + - d

10-20 5-10 5-10

10-20

10-20 5-10 5-10

10-20 5-10

57

Figure 2.2 : Agar spot test showing antagonistic activity of infant bifidobacterial isolates and B. breve ATCC 15700 against E. coli O157:H7. Clear area is zone of inhibition.

2.5.5 Bacterial adhesion to Caco-2 cells

Qualitative adhesion of E. coli O157:H7 to Caco-2 cells, measured by Gram staining

and by immunofluorescence using a specific anti-E. coli O157:H7 antibody is shown in Figure

2.3A-B. Figure 2.3C illustrates an example of immunofluorescent detection with reference

strains B. longum ATCC 15707 and E. coli O157:H7 ATCC 35150 bound to Caco-2 cells in

combined trials. The quantitative adhesion of E. coli O157:H7 and Bifidobacterium sp.,

determined by enumerating on selective agar, is shown in Table 2.3. Expressed as percent of

initially added bacteria (107 cfu/well), E. coli O157:H7 adhered 10.4 ± 0.8% versus 4.2 ± 0.6,

3.2 ± 0.8 and 4.6 ± 1.1%, respectively for B. bifidum RBL71, RBL460 and B. pseudolongum

ATCC 25526.

58

Figure 2.3 : Bacterial adhesion to the human intestinal cell-line Caco-2. (A) Gram staining of E. coli O157:H7 adhesion (magnification ×630), (B) confocal laser-scanning micrograph of E. coli O157:H7 detected with ALEXA 488-labeled antibodies (magnification ×1000), and (C) simultaneous double labeling of B. longum ATCC 15707 (green) and E. coli O157:H7 (red) with ALEXA 488 and 568-labeled antibodies respectively, by immunofluorescence (magnification ×1000).

59

Table 2.3 : Inhibition of E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells by bifidobacteria strains.

a For mixed and single trials E. coli O157:H7 was added at concentration of 2.5×107 CFU/well. b Values are means ± SE of triplicate analyses.

2.5.6 Inhibition of E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells

In the presence of increasing numbers of bifidobacteria (106, 107 and 108 cfu/well), a

progressive reduction in the number of adherent E. coli O157:H7 was generally noted

(Figure 2.4). The reduction of E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells was in the same order

of magnitude regardless of the bifidobacterial strain tested, with more than 50% inhibition for

the highest level of bifidobacteria added per well (108 cfu).

Adhered bacteria (CFU/well)b Culture Bifidobacteria added (CFU/well)

E. coli O157:H7 RBL71 RBL460 B. pseudolongum

Single trialsa

RBL71 5.3 ± 0.4×107 - 2.2 ± 0.4×106 - - RBL460 1.5 ± 0.5×107 - - 4.7 ± 0.1×105 - B. pseudolongum 4.1 ± 0.2×107 - - - 1.9 ± 0.6×106 E. coli O157:H7 - 2.6 ± 0.5×106 - - -

Mixed trialsa

RBL71/ E. coli O157:H7

5.3 ± 0.4×106 5.3 ± 0.4×107 5.3 ± 0.4×108

1.9 ± 0.6×106 1.3 ± 0.4×106 1.2 ± 0.4×106

1.3 ± 0.5×104 1.0 ± 0.6×105 1.9 ± 0.2×106

- -

RBL460/ E. coli O157:H7

1.5 ± 0.5×106 1.5 ± 0.5×107 1.5 ± 0.5×108

2.2 ± 0.4×106 1.4 ± 0.4×106 1.2 ± 0.4×106

- 5.5 ± 0.3×103 1.2 ± 0.3×104 1.6 ± 0.4×105

-

B. pseudolongum/ E. coli O157:H7

4.1 ± 0.2×106 4.1 ± 0.2×107 4.1 ± 0.2×108

1.8 ± 0.2×106 1.6 ± 0.3×106 1.2 ± 0.1×106

- - 9.2 ± 0.3×104 5.8 ± 0.2×105 3.5 ± 0.6×106

60

Figure 2.4 : Inhibition of enterohemorrhagic E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells by infant bifdobacterial isolates, (a) B. bifidum RBL71 and (b) B. bifidum RBL460. To each well of growing Caco-2 cells, 2.5 × 107 cfu of E. coli O157:H7 were added simultaneously with increasing concentrations of bifidobacteria. Values are means ± SE of triplicate analyses. Asterik indicates significant differences (P < 0.05) from trials with E. coli O157:H7 alone ( ).

Table 2.3 shows counts of E. coli O157:H7 adhering to Caco-2 cells in the presence of

B. bifidum RBL71, B. bifidum RBL460 and B. pseudolongum ATCC 25526. Bifidobacteria

produced a significant (P < 0.05) reduction in E. coli O157:H7 adhesion from 10.4% to 5%. On

the other hand, significantly lower numbers of adhering bifidobacteria were observed in

presence of E. coli O157:H7 compared to tests with single species. For the concentration of

approximately 107 cfu/well of added bifidobacteria, decreases of 2.1×106, 4.6×105 and

1.3×106 cfu/well for B. bifidum RBL71 and RBL460 and B. pseudolongum ATCC 25526 were

observed in presence of E. coli O157:H7.

61

2.6 Discussion

In this study, bifidobacteria from infant feces were isolated on NPNL agar.

This medium has been shown to be highly selective for isolating bifidobacteria from infant

stools (Hartemink and Rombouts, 1999). Bifidobacteria are generally characterized as rods of

various shapes and often arranged in ‘V’ patterns called ‘bifid’ arrangements (Scardovi, 1986).

Our isolates were morphologically varied but all were positive for fructose-6-phosphate

phosphoketolase and for the 1.35 kb sequence of Bifidobacterium 16S rDNA amplified using

genus-specific primers lm26-f and lm3-r. Both tests are known to be reliable for identifying the

genus Bifidobacterium (Scardovi, 1986; Kaufmann et al., 1997).

Numerical analysis of sugar fermentation patterns for the isolates identified four of five

as B. bifidum. Zavaglia et al. (1998) used gradient SDS-PAGE and sugar fermentation patterns

to identify infant bifidobacterial isolates and found that B. bifidum, B. longum and B. breve

were predominant. They noted that 14 of 25 isolates had the same simple matching coefficient

for more than one ATCC reference strain and that in most cases carbohydrate fermentation

patterns alone could not lead to an unequivocal identification of bifidobacterial species.

Although four of our isolates from infants are quite likely B. bifidum, RBL82 did not

convincingly match any ATCC strain.

In order to survive in the gastrointestinal tract, a probiotic candidate should be resistant

to salivary lysozyme, gastric acid (HCl) and bile and should be able to establish itself in the

intestinal microbiota (Fuller, 1992). Bifidobacterial isolates grew in the presence of lysozyme

even at 300 µg/ml, which is higher than the physiological intestinal lysozyme concentration

(Suskovic et al., 1997). Lysozyme, known to act mainly on Gram-positive bacteria, is usually

used at a concentration of 100 µg/ml for laboratory cell wall lysis (Suskovic et al., 1997). The

genus Bifidobacterium appears to be more resistant than other Gram-positive bacteria to egg

white or human lysozyme.

62 Growth of isolates RBL71, RBL81, RBL460 and RBL461 in MRS broth appeared

unaffected at pH as low as 4,0. Acidity is believed to be the most detrimental factor affecting

growth and viability of bifidobacteria slowly their growth down significantly below pH 4.5

(Lankaputhra and Shah, 1995; Lankaputhra et al., 1996). Our isolates would therefore be

expected to survive acidic conditions that exist in fermented food products, which may

contribute to increased shelf life.

For bile tolerance, Gilliland et al. (1984) used the same concentration (0.3%) to

distinguish different strains. In our case, tolerance of bile salts at this concentration was

observed consistently among the strains and isolates tested. Only isolate RBL461 did not

tolerate this bile salt concentration.

Resistance to H2O2 was also tested in order to determine if infant bifidobacteria may be

competitive with H2O2-producing organisms when co-cultured in fermented food products or in

the intestinal ecosystem. The minimum inhibitory concentration of H2O2 for the majority of

infant isolates was between 5 to 10 µg/ml while RBL71 and RBL460 were resistant up to

20 µg/ml, which is above the value that Dave and Shah (1997) found to be detrimental to

bifidobacteria in yogurt (17 µg/ml).

The large inhibition zone produced by infant bifidobacteria isolates (Figure 2.2)

indicates antagonistic activity against E. coli O157:H7. The agar spot test has proven useful for

selecting isolates that have the ability to inhibit or compete with harmful bacteria such as

E. coli O157:H7. Gibson and Wang (1994) reported that the antagonistic activity of several

species of bifidobacteria (mainly B. infantis and B. longum) toward both Gram-positive and

Gram-negative pathogens was less related to acid production than to the ability of the tested

strain to excrete broad spectrum antimicrobial substances. When we did the spot test on

bicarbonate buffered MRS agar, the inhibition zone was considerably reduced, but did not

disappear, suggesting that acid production (acetic and lactic) was not the only factor in the

antagonistic activity of the tested bifidobacteria against E. coli O157:H7.

63 Although antagonistic effects are essential, the ability of probiotic bacteria to adhere to

the intestinal epithelium is considered to be the major parameter influencing their colonization

of the intestinal tract and consequently their probiotic efficacy. The binding ability of our

isolates was evaluated using the human colon carcinoma cell line Caco-2 as a cellular model.

This model exhibits structural and functional differentiation in vitro and characteristics of

mature enterocytes (Pinto et al., 1983). In the quantitative trials, B. bifidum RBL71 showed

comparable adhesion to Caco-2 cells with the reference strain B. pseudolongum ATCC 25526,

known as a highly adhesive bacterium among 12 species tested (Crociani et al., 1995).

Because of their adhesiveness and resistance to lysozyme, acid, bile and peroxide,

isolates RBL71 and RBL460 were chosen for the competitive adhesion test with E. coli

O157:H7 on Caco-2 cells. Although their adhesion was reduced in the presence of E. coli

O157:H7, B. bifidum RBL71, RBL460 and B. pseudolongum ATCC 25526 were all able to

reduce E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells by more than 50% in a dose-dependent

manner. Bifidobacteria have been previously reported to inhibit the adhesion of several Gram-

negative pathogens such as enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteropathogenic E. coli (EPEC)

and Salmonella typhimurium (Bernet et al., 1993; Liévin et al., 2000). However, the different

in vitro assay conditions (pH, well size, incubation medium, incubation time, cell lines, etc.)

makes difficult the comparison of our results with those reported in the literature. Mack et al.

(1999) reported complete inhibition of E. coli O157:H7 adhesion by Lactobacillus plantarum

strain 299v to HT-29 cells using lower E. coli O157:H7 counts (105 cfu/well) and slightly

higher counts of tested probiotic strain (107 to 109 cfu/well). In our study, the failure of tested

bifidobacteria to completely inhibit the adhesion of E. coli O157:H7 to Caco-2 cells was

probably due to the higher bacterial load of E. coli O157:H7 (2.5×107 cfu/well). However, the

mechanisms by which lactobacilli or bifidobacteria inhibit pathogen adhesion to human cell

lines in vitro are not fully understood. Steric hindrance rather than blockage of specific

receptors may be involved (Bernet et al., 1993). Additional experiments are needed to

determine the precise mechanism of inhibition observed in our study.

64

2.7 Conclusions

Infant bifidobacterial isolates in this study present interesting probiotic characteristics,

especially greater resistance to gastrointestinal tract conditions (e.g. lysozyme and bile) as well

as good adhesion capacity to Caco-2 cells. The infant isolates also showed greater E. coli

O157:H7 growth inhibiting activity and interference with E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2

cells. These characteristics may enable them to establish in the intestinal tract and to compete

with other bacterial groups. Further studies are needed to characterize the anti-E. coli

antagonistic factors associated with the infant isolates and to evaluate their effectiveness

at inhibiting E. coli O157:H7 in vivo.

2.8 Acknowledgements

This research was supported by the Fonds québécois de la recherche sur la nature et les

technologies (FQRNT), Novalait Inc., the MAPAQ and the Natural Sciences and Engineering

Research Council of Canada. We thank Hélène Chamberland (Recherche en science de la vie et

de la santé, Université Laval, Québec) for her skillful assistance in confocal microscopy.

65

Chapitre 3.

Effet du gavage probiotique avec Bifidobacterium thermacidophilum contre l’infection

entérohémorragique à Escherichia coli O157:H7 chez des souris BALB/c

Effect of Bifidobacterium thermacidophilum probiotic

feeding on enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection in BALB/c mice

L’objectif de ce chapitre était d’étudier de façon in vivo l’effet de la souche probiotique

RBL71 isolée de fèces d’un nouveau-né contre l’infection à E. coli O157:H7 chez les souris.

Ces travaux ont été réalisés au pavillon Vandry (Université Laval, Québec), où des installations

de bioconfinement de niveau 2 étaient disponibles.

Les résultats de ce travail ont été publiés dans la revue International Journal of Food

Microbiology (2006, 111: 26-33). Les auteurs de cet article sont Mélanie Gagnon, Ehab

Kheadr, Nassra Dabour, Denis Richard et Ismaïl Fliss. Ce chapitre présente le contenu entier de

cet article rédigé en anglais.

66

3.1 Résumé

L’efficacité de la souche probiotique Bifidobacterium thermacidophilum RBL71 pour

lutter contre l’infection par la souche entérohémorragique Escherichia coli O157:H7 a été

étudiée en utilisant un modèle murin. Les souris BALB/c ont été gavées avec la souche

probiotique durant 7 jours avant ou après l’inoculation avec la souche E. coli O157:H7. Les

comptes fécaux des souches B. thermacidophilum RBL71 et E. coli O157:H7 ont été suivis

durant une semaine avant ou après l’infection par des méthodes de cultures sélectives alors que

la prise alimentaire, la composition et le poids corporels ont été suivis durant une semaine après

l’infection. L’histologie des tissus intestinaux (jéjunum, iléon et côlon) et la production

d’anticorps IgA dans les fèces et IgG et IgM dans le sérum spécifiques au E. coli O157:H7 ont

été analysées jusqu’à une et deux semaines post-infection, respectivement. L’infection à

E. coli O157:H7, marquée par une perte de poids et des changements histologiques au niveau

intestinal dans le groupe infecté, a été significativement réduit dans les groupes traités avec la

souche B. thermacidophilum RBL71. Le gavage avec cette souche durant 7 jours avant

l’infection a résulté en une prise alimentaire supérieure, un gain de poids et un nombre inférieur

d’E. coli O157:H7 fécaux. Les quantités d’IgA dans les fèces et d’IgG et IgM spécifiques aux

E. coli O157:H7 ont été supérieures chez les souris gavées avec des bifidobactéries. Les

dommages intestinaux étaient également atténués et la réaction des lymphocytes au niveau

mucosal de l’iléon était plus élevée dans le groupe gavé aux bifidobactéries avant infection. Un

degré de protection moindre contre l’infection à E. coli O157:H7 a été observé quand les

bifidobactéries étaient données durant les 7 jours après l’infection. Ces résultats démontrent que

le gavage des souris avec la souche probiotique B. thermacidophilum RBL71 peut réduire la

sévérité de l’infection à E. coli O157:H7 et suggèrent que cette souche représente un bon

candidat pour la prévention de ces infections entériques chez l’humain.

67

3.2 Abstract

The effectiveness of Bifidobacterium thermacidophilum RBL71 as a probiotic against

enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7 infection was studied using a murine model.

BALB/c mice were fed the probiotic for 7 days before or after single challenge with E. coli

O157:H7. Fecal B. thermacidophilum RBL71 and E. coli O157:H7 counts obtained by selective

culturing methods were assessed for one week before and after infection while feed intake,

body weight and composition were monitored during one week after infection. Histology of gut

tissue (jejunum, ileum and colon) and production of fecal IgA antibodies and serum IgG and

IgM antibodies to E. coli O157:H7 were analyzed until one and two weeks post-infection,

respectively. The pathogenicity of E. coli O157:H7, marked by body weight loss and intestinal

histopathological changes in the infected group, was significantly reduced in the

B. thermacidophilum-treated groups. Feeding B. thermacidophilum RBL71 for 7 days before

infection resulted in greater post-challenge feed intake and weight gain and lower fecal levels

of E. coli O157:H7. Post-infection levels of anti-E. coli O157:H7-specific IgA in feces and IgG

and IgM in serum were higher in mice fed bifidobacteria. Intestinal injuries were also

attenuated and reaction of the lymphoid component in the mucosa of the ileum was greater in

the bifidobacteria-fed group. A lesser degree of protection against E. coli O157:H7 infection

was observed when bifidobacteria were given during the seven days after E. coli O157:H7

infection. These results demonstrate that feeding the probiotic B. thermacidophilum RBL71 to

mice can reduce the severity of E. coli O157:H7 infection, and suggest that this strain

represents a good candidate for the prevention of enteric infections in human.

68

3.3 Introduction

Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) serotype O157:H7 is a highly infectious

pathogen that causes gastrointestinal illness with potentially serious consequences in humans

worldwide (Mead and Griffin, 1998). The organism is known to produce one or more Shiga

toxins, which may produce diarrhea, hemorrhagic colitis and life-threatening hemolytic uremic

syndrome in humans and animals (O’Brien and Kaper, 1998; LeBlanc, 2003). The use of

antimicrobial agents to improve the course of illness caused by E. coli O157:H7 is not

supported by conclusive evidence and it is believed that certain antibiotic treatments may

precipitate kidney complications (Molbak et al., 2002). Since the overuse of antibiotics has

already given rise to antibiotic-resistant strains, there is growing interest in developing new

alternatives to control E. coli O157:H7 infections.

Recent reports have focused on novel biotherapeutic agents including probiotics,

defined as live microorganisms which when administered in adequate amounts confer a health

benefit on the host (FAO/WHO, 2002; Marteau et al., 2002; Reid et al., 2003). Consumption of

probiotics such as bifidobacteria has been associated with maintenance of healthy intestinal

microbial balance and prevention of intestinal infections (Duffy et al., 1999; Liévin et al.,

2000). These bacteria have been shown to confer enhanced resistance against infection with

enteric pathogens and a variety of mechanisms have been proposed to explain the effects.

Potential mechanisms to explain the enhanced resistance conferred by bifidobacteria, include

competitive adhesion to intestinal mucosa, production of antimicrobial substances and/or

stimulation of mucosal immunity factors (Servin, 2004). Inhibition of enteric pathogens by

commercial bifidobacteria has been reported in recent studies using in vitro tests. Although

three studies of E. coli O157:H7 infection using animal models with type culture probiotic

strains have been reported (Kim et al., 2001; Shu and Gill, 2001; Asahara et al., 2004), none

have been done using a human fecal bifidobacterial isolate.

69 We have previously reported that a human bifidobacterial strain, coded RBL71, was

able to significantly inhibit E. coli O157:H7 adhesion to Caco-2 cells (Gagnon et al., 2004).

The present study was conducted to evaluate the anti-infectious activity of this strain,

genetically identified as B. thermacidophilum RBL71, against E. coli O157:H7 in a murine

model.

3.4 Material and methods

3.4.1 Animals

Specific-pathogen-free, 6 to 8-week-old female BALB/c mice were obtained from

Charles River (St-Constant, Québec, Canada). The animals were cared for and handled in

conformity with the Canadian Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Canadian

Council on Animal Care, 1993). The experimental protocols were approved by our institutional

animal care committee. The mice were housed individually in a temperature-controlled

environment (22 ± 2°C) with a 12 h light/dark cycle and fed ad libitum standard rodent chow

(Charles River Laboratories, Wilmington, MA) with free access to water throughout the

experiment.

3.4.2 Bacterial strains and growth conditions

Bifidobacterium thermacidophilum RBL71, used in this study, was previously isolated

from fecal samples of 1-week-old breast-fed infant (Gagnon et al., 2004). B. breve ATCC

15700 and Escherichia coli O157:H7 ATCC 35150 were obtained from the American Type

Culture Collection (Rockville, MD). Lactobacillus casei subsp. casei L2A was obtained from

the Lactic Acid Bacteria Research Network culture collection (STELA Dairy Research Group,

Université Laval, Québec, Canada). All strains were maintained in 20% glycerol stock at

-80°C. Bifidobacteria were reactivated in De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) broth obtained from

Rosell Institute Inc. (Montréal, Québec, Canada) supplemented with 0.05% (w/v) L-cysteine-

hydrochloride (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) or Trypticase Phytone Yeast extract

(TPY) broth (Scardovi, 1986) and incubated under anaerobic conditions at 37°C using an

atmosphere generation system (AnaeroGen, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England).

70

Lb. casei was reactivated in MRS broth and incubated aerobically at 37°C. E. coli O157:H7

was reactivated in Tryptic Soy broth (Difco, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) and

incubated aerobically at 37°C. All strains were subcultured at least three times prior to the

experiments.

3.4.3 Genetic identification and phenotypic characterization

The purity of strain RBL71 was ensured by 16S rDNA sequence analysis, using the

PCR amplification protocol proposed by Schürch (2002) with some modifications. Genomic

16S rDNA was amplified using 16S rDNA Bifidobacterium genus-specific primers lm26 (5′-

GATTCTGGCTCAGGATGAACG-3′) and lm3 (5′-CGGGTGCTI∗CCCACTTTCATG-3′)

(Kaufmann et al., 1997). Bifidobacterial purity was verified by using bacterial universal

primers Bak4 (5′-AGGAGGTGATCCARCCGCA-3′) and BakLLW (5′-

AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′) developed by Schürch (2002). The total volume of each

PCR was 50 µl, using 1 µl of template DNA (a single colony suspended in 10 µl of sterile

deionized water). The reaction mixture was composed of 40.5 µl H2O, 5 µl of 10× Taq buffer

(New England Biolabs Ltd., Pickering, Ontario, Canada), 1 µl of dNTP at 10 mM (Amersham

Pharmacia Biotech, Baie d’Urfé, Québec, Canada), 1 µl of each primer (10 µM) and 0.5 µl

(2.5 Units) of Taq DNA polymerase (New England Biolabs). The PCR amplification was

carried out with a GeneAmp 2400 PCR system (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) and parameters

were 3 min at 94°C for lysis of bacterial cells and initial denaturation; 30 s at 94°C, 30 s at

65°C, 2 min at 72°C for 35 cycles and a final extension step of 7 min at 72°C. After cycling,

samples were rapidly cooled to 4°C until analysis. Amplified products were separated by

electrophoresis (pH 8.0, 100 V for 45 min) using i-Mupid mini-electrophoresis unit (Cosmo

Bio Co. Ltd., Tokyo, Japan) in 1% agarose gel (Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada) and

stained with ethidium bromide. Gels were documented using Gene Snap Software version

6.00.26 with a transilluminator and Gene Tools Analysis Software version 3.02.00 (SynGene,

Cambridge, England). PCR-amplified products of approximately 1.4 kb were excised from gels

and purified using Qiagen columns (Qiagen, Mississauga, Ontario, Canada). B. breve and

Lb. casei were used as positive and negative controls, respectively. Automated DNA sequence

analysis was carried out on both strands with a DNA sequencer (ABI Prism 3100, Applied

71

Biosystems, Foster City, CA). Sequence data were assembled and analyzed using the GCG

Wisconsin package 10 (Accelrys, San Diego, CA). Database homology searches were

performed with FASTA network service at the National Center for Biotechnology Information,

USA (www.ncbi.nlm.nih.gov). The phylogenetic tree of the 16S rDNA genes was created by

the neighbor-joining method of Saitou and Nei (1987) and the p-distance measurement and

pair-wise deletion as implemented in the MEGA program (Kumar et al., 2001). The bootstrap

method (Felsenstein, 1985) was employed to determine the statistical confidence of

phylogenetic relationships.

For phenotypic characterization, the ability of strain RBL71 to ferment various

carbohydrates was determined using API 50 CH galleries (BioMérieux, Montréal, Québec,

Canada) according to the manufacturer’s instructions. Concentrations of organic acids (acetic

and lactic) produced after 48 h of anaerobic growth of strain RBL71 in TPY broth were

measured by high-performance liquid chromatography (Waters, Millipore Co., Montréal,

Québec, Canada) using an interaction Ion 300 column (Phenomenex, Torrance, CA) with

H2SO4 (0.0064 N) as mobile phase at a flow rate of 0.4 ml/min and a refractive index detector.

3.4.4 Mice feeding and infection procedure

After an acclimatization period of 48 h, forty-five mice were assigned randomly to one

of the five following experimental groups of nine mice each:

(a) Control group: Not given bifidobacteria, Not challenged.

(b) Infected group: Not given bifidobacteria, Challenged with E. coli O157:H7.

(c) Non infected + feeding group: Given bifidobacteria on days -7 through 0,

Not challenged.

(d) Pre-infection feeding group: Given bifidobacteria on days -7 through 0, Challenged

with E. coli O157:H7.

(e) Post-infection feeding group: Given bifidobacteria on days 0 through 7, Challenged

with E. coli O157:H7.

72 According to procedure schedule, a daily 0.5 ml dose of B. thermacidophilum RBL71

containing 2×109 CFU/ml was administrated intragastrically to mice while infection was

induced on day 0 with a single 0.5 ml dose of E. coli O157:H7 containing 1×1010 CFU/ml

suspended in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.3). Mice in the control group received

0.5 ml of PBS. Bifidobacteria and E. coli O157:H7 cell counts were determined by analyzing

feces from three mice per group every two days. Fecal samples, obtained by manually pressing

the lower abdomen of mice, were analyzed individually by suspending 50 mg with a glass rod

in 0.5 ml of 0.1% (w/v) sterile peptone water to obtain a concentration of 100 mg/ml. The

suspensions were serially diluted 10-fold and appropriate dilutions were plated in triplicate on

MacConkey sorbitol agar (Difco) for E. coli O157:H7 and on Beerens agar (Beerens, 1990) for

bifidobacteria. Beerens plates were incubated anaerobically for 72 h and MacConkey plates

aerobically for 18 h at 37°C. In order to confirm E. coli O157:H7 counts determined on

MacConkey sorbitol agar, sorbitol-negative colonies were randomly selected and suspended in

PBS and tested by the VIP visual immunoassay (VIP EHEC O157:H7, BioControl Systems Inc,

Bellevue, WA).

3.4.5 Feed intake, body weight and body composition measurements

Feed intake was measured by subtracting the amount left uneaten by mice from the

amount provided to the animals. Food spillage was considered when measuring the feed intake.

Animal body weight was monitored daily and expressed as average for each group throughout

the experiment. Body composition was measured by dual-energy X-ray absorptiometry

(DEXA), using a mouse densitometer (PIXImus, Lunar, Madison, WI). Previous data have

shown that the DEXA-estimated values of fat and lean masses are strongly correlated with their

chemical values (Nagy and Clair, 2000). Changes in body fat and lean were determined and

expressed in percentage by subtracting the percent of lean and fat masses measured at day 7

from the estimations obtained at day 0.

73

3.4.6 Histological analysis

On days 0 and 7 after challenge with E. coli O157:H7, two mice from each group were

anaesthetized with an intraperitoneal injection of 0.01 ml/g of a ketamine (15 mg/ml)/xylazine

(1 mg/ml) mixture. Tissue samples taken from the small intestine and colon were fixed in PBS

containing 4% (w/v) paraformaldehyde (TAAB, Callera Park, Aldermaston Berks, England),

and embedded in paraffin. Tissue sections 5 µm thick were cut using a microtome (Model

2040, Reichert-Jung, Vienna, Austria), stained with hematoxylin and eosin (H&E) or periodic

acid-Schiff (PAS) solutions and then examined with a light microscope (Leica Microsystems,

Richmond Hill, Ontario, Canada) by a pathologist kept unaware of sample origin. Images were

acquired by a Coolsnap camera (Photometrics, Tucson, AZ) and Image Pro Plus software 4.5

(Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD).

3.4.7 Measurement of antibodies in fecal samples and sera using enzyme-

linked immunosorbent assay (ELISA)

Fecal IgA antibodies on days 4 and 7 post-infection and serum IgG and IgM antibodies

to E. coli O157:H7 on days 7 and 14 post-infection, were evaluated by ELISA as described by

Shu and Gill (2001). Briefly, 96-well Immulon II microplates (Thermo LabSystems, Franklin,

MA) were coated overnight at 4°C with whole formaldehyde-killed E. coli O157:H7

(1×107 CFU/ml) in 100 µl sterile PBS. The microplates were washed four times with sterile

PBS containing 0.1% (v/v) Tween-20 (PBS-T) and then blocked for 1 h at 25°C under agitation

with 3% (w/v) bovine serum albumin (BSA) to prevent nonspecific binding to plastic. After

four additional washes with PBS-T, the supernatant obtained from fresh fecal suspension

(100 mg/ml) centrifuged at 13,000 × g for 10 min at 4 °C was serial twofold diluted in PBS-T

plus 0.5% (w/v) BSA and dilutions were added to wells in triplicate. The sera obtained from

centrifugation (4,000 × g, 10 min at 4°C) of blood samples taken with a capillary tube by

orbital puncture were serial threefold diluted in PBS-T plus 0.5% (w/v) BSA and dilutions were

added to wells in triplicate. Microplates were then held for 2 h at 37°C. After incubation,

microplates were washed four times with PBS-T and peroxidase-conjugated goat anti-mouse

IgA (α-chain specific) or goat anti-mouse IgG and IgM (H+L) (Kirkegaard and Perry

Laboratories, Gaithersburg, MD) diluted 1:200 and 1:1000 respectively in PBS-T plus 0.5%

74

(w/v) BSA was added and plates were held for 1 h at 37°C. Following five washes with PBS-T,

bound antibody was detected by adding o-phenylenediamine (Sigma) dissolved in phosphate

citrate buffer (pH 5.0) in the presence of H2O2. Optical densities were read on a Thermomax

microplate reader (Molecular Devices, Opti-Ressources, Charny, Québec, Canada) at 450 nm.

Fecal extracts and sera samples from non infected and not B. thermacidophilum RBL71 fed

mice were used as negative controls on each plate. Titers were calculated as log10 (1/Dc) where

the cutoff dilution (Dc) was defined as the dilution yielding twice the absorbance of the

negative controls. Results are expressed as the mean of five mice ± the standard error of the

mean (SEM) for each group.


Significant differences between treatments were tested by analysis of variance using

JMP IN software (SAS Institute, version 4, Cary, NC). Treatment comparisons were performed

using Student t test for fecal E. coli O157:H7 counts, body weights and antibody titers and

Fisher’s least-significant differences (LSD) test for feed intake, lean and fat mass. A P value of

< 0.05 was considered significant.

3.5 Results

3.5.1 Genetic identification and phenotypic characterization of strain

RBL71

The 16S rDNA from strain RBL71 was amplified and the sequence of approximately

1.4 kb, which represents the size of the 16S rDNA, was compared with the available data in

GenBank. The phylogenetic tree (not shown) revealed that the 16S rDNA gene sequence of

strain RBL71 showed high similarity (99%) with the corresponding gene from

B. thermacidophilum.

Bifidobacterial strain RBL71 is a Gram-positive, non-motile, irregular and strictly

anaerobic rod that grows at temperatures up to 46°C with an optimum between 37 and 41°C.

Galactose, D-glucose, D-fructose, melibiose, sucrose, D-raffinose and starch are metabolized

75

while D-mannose, L-sorbose, rhamnose, cellobiose and trehalose are not. Fermentation

products from glucose after 48 h incubation in TPY broth are acetic and lactic acids at molar

ratio of 1.62.

3.5.2 E. coli O157:H7 infection in BALB/c mice

The mean E. coli O157:H7 counts in the feces of infected mice (group b) were

approximately 107 CFU/g within 24 h of the infection (Figure 3.1B). Mice in the infected group

(group b) had significantly lower feed intake during one week after E. coli O157:H7 challenge

(Table 3.1, P < 0.05) and a significant difference in body weight on day 4 (Figure 3.2, P < 0.01)

and also lost more lean mass than control group mice (group a) (Table 3.1, P < 0.05).

Histological examination of mice in the infected group (group b) on day 7 revealed damage to

the intestinal mucosa. The infected jejunum cross-section was irregular and villi were shorter

compared with intestinal epithelia of control mice (group a) (Figure 3.3A and B). Ileal crypts

were atrophic (Figure 3.3C and D) and the colonic epithelial layer was edematous (Figure 3.3E

and F). E. coli O157:H7 infection also caused intestinal inflammation, appearing as a

significant increase in the number of goblet inflammatory cells (Figure 3.4A and B). Significant

increase in production of anti-E. coli O157:H7-specific-IgA in feces and IgG and IgM in serum

has also been observed (Figure 3.5). Reduced activity and ruffled fur were also observed in

infected animals during the 7-day post-challenge period.

76

Figure 3.1 : Fecal B. thermacidophilum RBL71 (A) and E. coli O157:H7 (B) counts in group mice during the experiment (means ± standard deviation, n = 3). (*) Significant difference between pre- or post-infection group and infected group (P < 0.05); (**) Significant difference between pre- or post-infection group and infected group (P < 0.01).

A

B

77

Table 3.1 : Feed intake and percent change in lean and fat masses of BALB/c mice seven days after challenge with E. coli O157:H7.

a Data are means ± SEM, n = 5. Values with different letters are significantly different (P < 0.05). b Relative to day 0.

Figure 3.2 : Body weights of the five groups of mice during the week following challenge with E. coli O157:H7 (means ± SEM, n = 5). (∗) Significant difference between pre-infection feeding group and infected group (P < 0.05); (∗∗) Significant difference between control and infected groups (P < 0.01).

% Change in mass a, b

Experimental group Feed intake (g/mouse) a lean

fat

Control 26.1 ± 0.6 a 1.9 ± 0.5 a 0.3 ± 0.2 a

Infected 19.8 ± 0.7 b -1.1 ± 0.5 b 1.2 ± 0.2 a

Non infected + feeding 25.4 ± 0.9 a 2.6 ± 0.3 a 0.2 ± 0.2 a

Pre-infection feeding 25.3 ± 0.8 a -0.3 ± 0.5 ab 0.3 ± 0.5 a

Post-infection feeding 22.4 ± 0.3 b -0.9 ± 0.5 b 1.1 ± 0.6 a

78

3.5.3 Effect of B. thermacidophilum RBL71 feeding on fecal bacterial

counts, feed intake, body weight and composition

The mean fecal B. thermacidophilum RBL71 counts of mice in the two groups given

B. thermacidophilum one week before infection (groups c and d) were approximately

108 CFU/g on day -5 (Figure 3.1A) while it never exceed 106 CFU/g when given to treated

mice during the seven days following E. coli O157:H7 challenge (group e). Figure 3.1B shows

that E. coli O157:H7 in the feces of pre-infection feeding group (group d) decreased to

10 CFU/g by day 7, which was 3.5 log10 lower than in infected group (group b) and somewhat

lower than in post-infection feeding group (group e).

The mean feed intake was significantly lower in post-infection feeding group (group e)

compared to the control group (group a) and pre-infection feeding group (group d) (Table 3.1,

P < 0.05). Moreover, the body weights of mice in the pre-infection feeding group (group d)

during the week after infection were very similar to those of the mice in the control group

(group a) (Figure 3.2). In contrast, bifidobacterial feeding in the post-infection feeding group

(group e) did not maintain a normal body weight curve. Bifidobacterial feeding for seven days

prior to infection made the final lean loss insignificant compared to control group (group a)

while fat gains were not significantly different for any group (Table 3.1, P < 0.05).

3.5.4 Histological examination

H&E and PAS-stained sections of intestines seven days after E. coli O157:H7 challenge

revealed that intestinal injuries due to infection were attenuated in mice given bifidobacteria

compared to infected mice (group b). Moreover, microvilli in the ileum section of the

bifidobacteria-fed mice before infection (group d) are less atrophied than in infected mice

(group b) and bifidobacteria-fed mice after infection (group e) (Figure 3.3D, G and H).

Nevertheless, an increase in lymphoid components was observed in the ileum of mice given

bifidobacteria before or after infection (Figure 3.3G and H). The number of goblet

inflammatory cells, an indicator of intestinal inflammation (Savkovic et al., 2005), was lower in

the colon of bifidobacteria-fed mice before and after infection than in infected mice (group b) at

day 7 post-infection (Figure 3.4B, C and D).

79

Figure 3.3 : Hematoxylin and eosin stained cross-sections of mouse intestines at day 7. (A) jejunum of a control group mouse; (B) jejunum of an E. coli O157:H7-infected mouse; (C) ileum of a control group mouse; (D) ileum of an E. coli O157:H7-infected mouse; (E) colon of a control group mouse; (F) colon of an E. coli O157:H7-infected mouse; (G) ileum of mouse fed B. thermacidophilum before E. coli O157:H7 infection; (H) ileum of mouse fed B. thermacidophilum after E. coli O157:H7 infection. Black arrows: panel F, edematous colonic epithelia; panels G and H, lymphocyte infiltration (magnification, × 100).

80

Figure 3.4 : Periodic acid-Schiff-stained cross-sections of mouse colons at day 7. (A) control group; (B) E. coli O157:H7-infected; (C and D) given B. thermacidophilum for seven days respectively before and after infection (magnification, × 400).

3.5.5 Antibody responses to E. coli O157:H7

Post-infection levels of anti-E. coli O157:H7-specific IgA in feces and IgG and IgM in

serum were higher in mice given bifidobacteria than infected mice (group b). One week after

challenge with E. coli O157:H7, pre-infection feeding group (group d) had significantly higher

mean anti-E. coli O157:H7 IgA titers in comparison to infected group (group b) and post-

infection feeding group (group e) (Figure 3.5A, P < 0.01). Moreover, bifidobacteria had a

significant effect on the IgG and IgM response two weeks after E. coli O157:H7 challenge

whether given before or after infection (Figure 3.5B, P < 0.01). E. coli O157:H7-specific IgA

titer in feces was 1.4 times higher on day 7 and E. coli O157:H7-specific IgG and IgM titer in

serum was 1.5 times higher on day 14 in pre-infection feeding group (group d) than in infected

group (group b). No significant differences were observed between control (group a) and non

infected + feeding group mice (group c).

81

Figure 3.5 : Levels of E. coli O157:H7-specific IgA in feces (A) and IgG+IgM in serum (B) after E. coli O157:H7 challenge in non infected + feeding, infected and in pre- and post-infection feeding groups. Each column shows the mean ± SEM of three and five mice for IgA and IgG+IgM, respectively. (∗∗, P < 0.01).

Serum IgG + IgM

0

1

2

3

Noninfected +feeding

Infected Pre-infectionfeeding

Post-infectionfeeding

Ant

i-E. c

oli

O15

7:H

7 tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 7

Day 14

****

Serum IgG + IgM

0

1

2

3




Ant

i-E. c

oli

O15

7:H

7 tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 7

Day 14

****

****

B

Fecal IgA

0

0,4

0,8

1,2

1,6




Ant

i-E. c

oli

O15

7:H

7 tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 4Day 7****

Fecal IgA

0

0,4

0,8

1,2

1,6




Ant

i-E. c

oli

O15

7:H

7 tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 4Day 7**** ****

A

82

3.6 Discussion

The Bifidobacterium strain used in this study is of human origin and was initially

identified by the presence of fructose-6-phosphate phosphoketolase in cellular extracts

(Scardovi, 1986) and by PCR amplification of a specific 16S rDNA sequence using

Bifidobacterium 16S rDNA targeted primers lm26-f and lm3-r (Kaufmann et al., 1997). Based

on carbohydrate fermentation profile, strain RBL71 has been provisionally classified as

belonging to the same species as B. bifidum ATCC 15696 (Gagnon et al., 2004). Recent

sequencing of its 16S rDNA allowed further identification of strain RBL71 as

B. thermacidophilum. The species B. thermacidophilum was first isolated in China from a

waste-water-treatment anaerobic digester (Dong et al., 2000) and was reported to grow in acidic

medium (pH 4.0) and at temperatures up to 49.5°C. Our strain shared the majority of the

phenotypic characteristics reported for this species. The present in vivo study showed that

B. thermacidophilum RBL71 was able to survive in the gastrointestinal tract of mice following

oral gavage and that this bacterium remained present up to seven days after feeding with no

adverse effects even in normal mice which do not have any bifidobacteria (Ducluzeau and

Raibaud, 1979). Locascio et al. (2001) also found that some bifidobacteria of human origin are

able to persist in the gastrointestinal tract of conventional mice by daily feeding (107 cells per

day per animal) and remained up to five days postfeeding, even if feeding was interrupted. This

genus could become particularly attractive as a probiotic for human beings, since it constitutes

one of the predominant populations of the normal colonic microbiota and is thus well adapted

to this ecosystem.

Previous studies in experimental animals have indicated that some commercial

probiotic strains can increase resistance against colonization and infection by enteropathogenic

bacteria (Shu and Gill, 2001; Asahara et al., 2004; Silva et al., 2004). The present study was

accordingly designed in order to test the probiotic capability of B. thermacidophilum RBL71

and to compare the impact of pre- and post-challenge probiotic feeding on the severity of

gastrointestinal infection by Escherichia coli O157:H7. Our results indicate that feeding

B. thermacidophilum RBL71 prior to E. coli O157:H7 challenge has a more significant impact

on the fecal E. coli O157:H7 counts (Figure 3.1B), body weight (Figure 3.2), intestinal injuries

83

(Figure 3.3 and 3.4) and the production of fecal IgA and serum IgG and IgM antibodies

(Figure 3.5). To our knowledge, this is the first report of a new bifidobacterial strain of human

origin with a prophylactic effect against EHEC O157:H7 infection in a BALB/c mouse model.

Nevertheless, no results published (including ours) clearly demonstrate that bifidobacteria

protect mice significantly against bacterial enteropathogens when administered after infection.

Many mechanisms have been postulated by which bifidobacteria could inhibit

enteropathogens. Suppressing intestinal pathogens by bifidobacteria has been attributed to their

ability to modify the intestinal microenvironment by secreting organic acids, principally acetic

and lactic acids, leading to lower gut pH and by the production of antibacterial compounds

(Fujiwara et al., 1997; Servin, 2004). For example, Asahara et al. (2004) showed that high

concentration of organic acids and low pH in B. breve-colonized intestines of mice play an

important role in the inhibition of toxin production by a clinically isolated Shiga toxin-

producing Escherichia coli O157:H7 whereas Fujiwara et al. (1997) showed that bifidobacteria

produce a proteinaceous factor that inhibits the adherence of some E. coli strains to the GA1

molecule in vitro. Besides the production of organic acids and antimicrobial molecules, others

mechanisms can be implicated in our in vivo model. Recent reports have focused on immune

modulation, and evidence is accumulating that probiotics influence local or systemic immune

responses in a strain-dependent manner (Gill, 2003; Vinderola et al., 2004). In this study an

increase in fecal IgA antibodies reactive with E. coli O157:H7 was detected in mice given

B. thermacidophilum RBL71 before and following oral inoculation with E. coli O157:H7.

However the stimulus and impact of this response, and the role of B. thermacidophilum RBL71

in this response, require further investigation. Recent studies indicate that specific probiotics

strains are potent stimulators of certain cytokines (Gill, 2003; Servin, 2004). Our results

suggest that bifidobacterial feeding influence an intestinal immune reaction against pathogenic

invasion. Moreover, our histological analyses have shown that local intestinal inflammation

caused by E. coli O157:H7 was attenuated in the presence of bifidobacteria. The lower number

of goblet inflammatory cells in mice fed bifidobacteria suggests less intestinal inflammation

and hence decreased severity of the infection. According to Savkovic et al. (2005), increased

numbers of goblet inflammatory cells, an intestinal epithelial response to the inflammation may

increases mucin secretion to form a viscous gel that traps microorganisms and irritants and

limits their access to the epithelium.

84

3.7 Conclusions

This report shows that mice fed with probiotic B. thermacidophilum RBL71 strain have

lower signs of infection as indicated by lower feces E. coli O157:H7 counts, a normal body

weight curve, and lower intestinal damage in animals challenged with the pathogen. Our results

clearly indicated that the consumption of this bifidobacterial strain had a significant impact on

immunological response wich was most significant when administered before rather than after

infection. Together, these findings suggest that B. thermacidophilum RBL71 represents a good

candidate to be used as a probiotic for preventing enteric infection in human.


This work was supported by a grant from the Natural Sciences and Engineering

Research Council of Canada (NSERC) and the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature

et les Technologies (FQRNT). We thank Sébastien Poulin, Pierre Samson and Aristide Pusterla

for skilled technical assistance, Naceur Naïmi for helpful discussions and Stephen Davids for

critical reading of the manuscript.

85

Chapitre 4.

Méthode quantitative pour évaluer l’attachement des virus entériques aux cellules intestinales cultivées

in vitro en utilisant la technique des plages de lyse et l’immunofluorescence

Quantitative cell attachment assay of enteric viruses to human cultured intestinal cells using plaque technique

and immunofluorescent assay

L’objectif de ce chapitre était de développer une méthode pour évaluer l’attachement

des rotavirus ainsi qu’un substitut de norovirus et du virus de l’hépatite A aux lignées

cellulaires intestinales Caco-2 et HT-29. Les manipulations ont été effectuées au pavillon

Marchand (Université Laval, Québec), dans un laboratoire avec les équipements nécessaires

pour la culture cellulaire et la virologie.

Les résultats de ce travail ont été soumis au Journal of Virological Methods.

Les auteurs de cet article sont Mélanie Gagnon, André Darveau, Julie Jean et Ismaïl Fliss.

Ce chapitre présente le contenu intégral de ce manuscrit rédigé en anglais.

86

4.1 Résumé

Un test d’adhésion cellules-virus a été développé afin d’évaluer la capacité

d’attachement d’un rotavirus, d’un virus type norovirus (calicivirus d’origine féline) et du virus

de l’hépatite A sur les cellules de l’épithélium intestinal Caco-2 et HT-29. L’attachement a été

mesuré après une période d’incubation entre virus et cellules de 90 min à 48 h. Le titre en virus

a été déterminé par un test en plaque ou par immunofluorescence (IFA). L’IFA permet de

détecter les virus ayant un faible effet cytopathique (CPE) par spécificité du signal

immunofluorescent contrairement à la méthode classique par plaque qui détecte les virus avec

un CPE élevé. Le pourcentage d’attachement sur les cellules mesuré par ces méthodes varie de

11.5% à 25.4%, dépendamment du virus et de sa concentration ajoutée sur les cellules

entériques. Parmi les virus testés, le norovirus présente la plus forte capacité d’attachement sur

les cellules Caco-2 et HT-29 (respectivement, 25.4 et 20.8% en utilisant une concentration de

106 UFP par puits). L’utilisation de cellules épithéliales d’origine humaine a également permis

d’observer une libération des virus dans le surnageant jusqu’à 48 h après l’infection. Cette

méthode destinée à étudier le pouvoir infectieux de virus contre des cellules entériques

permettra une meilleure compréhension de l’adhésion pathogénique virale. Cette technique

présente également l’avantage d’être applicable aux virus entériques cytopathiques ou non.

87

4.2 Abstract

A virus-cell binding assay was developed for quantification of a rotavirus, norovirus-

surrogate (feline calicivirus) and hepatitis A virus attachment to intestinal epithelial Caco-2 and

HT-29 cells. The viral attachment was measured after incubation periods of 90 min to 48 h on

enteric cells and virus titers were evaluated by plaque assay or by immunofluorescent assay

(IFA). While the traditional plaque assay has the capacity to detect viruses having high

cytopathic effect (CPE), IFA detect the viruses showing low CPE by specific fluorescent signal.

Using these assays, the binding of the tested viruses ranged from 11.5% to 25.4% depending on

the strain and the concentration added on enteric cells. The results indicated that among studied

viruses, the norovirus-surrogate exhibits the highest capacity to attach to Caco-2 and HT-29

cells (25.4% and 20.8%, respectively, using 106 PFU/well). The use of human epithelial cells

has also permitted to find a release of viruses in supernatant until 48 h post-infection. The

developed method to study the viral infectivity of enteric cells would permit to better

understand the pathogenic attachment step involved and this technique had the advantage to

apply to cytopathic and non cytopathic enteric viruses.

88

4.3 Introduction

Rotavirus, noroviruses and hepatitis A virus (HAV) are recognized as leading causes of

gastroenteritis or foodborne hepatitis at the origin of many sporadic and epidemic infections in

humans (Mead et al., 1999; Koopmans et al., 2002; Clark and McKendrick, 2004). These

nonenveloped RNA viruses, all characterized by their resistance to gastrointestinal conditions,

are mainly transmitted via the fecal-oral route through ingestion of contaminated food and

water. Rotaviruses belong to the Reoviridae family while noroviruses (formerly known as

‘Norwalk-like viruses’) belong to the Caliciviridae family. These viruses exhibit a marked

tropism for the enterocytes of the intestinal epithelium and replicate in the proximal small

intestine (duodenum and jejunum) (Michelangeli and Ruiz, 2003). The third enteric virus,

HAV, is classified as the type species of the genus Hepatovirus within the Picornaviridae

family. This major enterically transmitted hepatitis has a different way of infection from the

two precedent viruses. In the case of this virus, the cells of the liver (hepatocytes) are the final

site of replication. The virus is transported to the liver following a viremic stage, during which

virions can be detected in the blood. In addition, Blank et al. (2000) recently reported that HAV

can replicate outside of the liver in the cells of the gut. This recent study suggests that the

intestinal epithelial cells might serve as a primary site of replication.

Viruses are obligatory parasite of living cells that they infect through specific virus-cell

interactions. The target cells of the small intestinal epithelium are highly polarized and display

differential expression of specific proteins on their surfaces which contribute to the numerous

specialized secretory and absorptive functions. However, relatively little is known about the

interactions of nonenveloped viruses with such polarized cells (Blau and Compans, 1996).

In vitro, at the end of the replicative cycle, the progeny particles of most animal viruses are

freely released into the culture medium and spread over the cell monolayer to yield a

generalized cytopathic effect. In the case of enteric viruses, virus-cell interactions are of special

interest because they play important roles in determining the severity of the infection.

Currently, there is no standardized in vitro method available to investigate the infectivity of

major viruses transmitted by contaminated food. A cellular assay would therefore be extremely

valuable to characterize binding of the virus to the cells, a critical step of the replication cycle.

89

Caco-2 and HT-29 cells have been extensively used in the past for bacteriological studies to

evaluate cell association of Salmonella typhimurium (Bernet et al., 1993), Yersinia

enterocolitica (Di Biase et al., 2000) and Listeria monocytogenes (Moroni et al., 2006). By

displaying many of the morphologic and functional properties of mature enterocytes (Rousset,

1986; Zweibaum et al., 1991), these cell lines would be very useful in the development of a

specific assay targeting the binding of the virus to the cells. Recently, our group has

demonstrated the effectiveness of this method to detect bacterial adhesion of Escherichia coli

O157:H7 to Caco-2 cells (Gagnon et al., 2004; Le Blay et al., 2004).

In this study, intestinal Caco-2 and HT-29 cellular models were adapted for the

development of a new viral quantitative assay aimed at the detection of enteric

viruses/enterocytes interactions. Such an assay could be carried out by coupling propagation of

rotavirus, norovirus-surrogate or HAV in sensitive cell lines with plaque assay or

immunofluorescence.

4.4 Materials and Methods

4.4.1 Cell culture

Origin and properties of the cell lines used in this study are listed in Table 4.1.

Enterocyte-like Caco-2 cells (ATCC HTB-37) were cultured as monolayers in 75-cm2 flasks

(Falcon, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) using Dulbecco’s Modified

Eagle medium (DMEM, Gibco, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada) containing glucose

(4,500 mg/liter), supplemented with 20% fetal bovine serum (FBS; Gibco), 1% nonessential

amino acids (Gibco), 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Gibco) at 37°C in a 5%

CO2 atmosphere. HT-29 cells (ATCC HTB-38) were cultured in RPMI 1640 medium (Gibco)

supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine (Gibco), 100 U/ml penicillin

and 100 µg/ml streptomycin (Gibco) at 37°C in 5% CO2. For infection assays, Caco-2 and

HT-29 cells were seeded in 24-well tissue culture plates (Falcon) at a concentration of 2.8×104

and 4×104 cells per well, respectively. The culture medium was replaced every other day, and

the monolayer was used at postconfluence (106 cells/well) after 15 or 21 days of culture for

90

Caco-2 and HT-29, respectively. Culture medium was replaced by DMEM and RPMI 1640

without antibiotics 18 h before the assays were performed.

Monkey kidney FRhK-4 (ATCC CRL-1688) and MA-104 cells (ATCC CRL-2378.1)

were cultured as previously described (Ansari et al., 1988; Mbithi et al., 1991). Briefly, cells

were grown in Eagle’s minimal essential medium (MEM, Gibco) supplemented with 10% fetal

bovine serum, 2 mM L-glutamine, 1% nonessential amino acids, 1% N-2-

hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, 0.1125% sodium

bicarbonate (Gibco), 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Gibco) at 37°C in a 5%

CO2 atmosphere. The FRhK-4 and MA-104 cells were seeded at a concentration of 4.2×104 and

4.7×104 cells per cm2, respectively. Crandell-Reese feline kidney cells (CrFK, ATCC CCL-94)

were cultured as previously described (Bidawid et al., 2003). Briefly, cells were seeded at

concentration of 4.2×104 cells per cm2 and grown in DMEM supplemented with 10% newborn

calf serum (NCS, Gibco), 2 mM L-glutamine, 1% nonessential amino acids, 100 U/ml

penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Gibco) at 37°C in a 5% CO2 atmosphere.

Table 4.1 : Cell lines used in this study.

* Obtained from the American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD).

4.4.2 Viruses

Human rotavirus strain Wa (ATCC VR-2018) was propagated in MA-104 cells as

described by Ansari et al. (1988) with some modifications. Rotavirus suspension was activated

with 16 µg/ml of porcine trypsin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) for 30 min at room

temperature and MA-104 monolayers were infected at an MOI of 1.5. Maintenance medium

Cell line* Origin Tissue

Gastrointestinal tract epithelia Caco-2 Human Colon adenocarcinoma HT-29 Human Colon adenocarcinoma

Monkey epithelia FRhK-4 Rhesus Kidney MA-104 Rhesus Kidney

Other animal tissue CrFK Feline Kidney

91

(MEM + 2% FBS) was added and cells were incubated for 48 h at 37ºC in the presence of 5%

CO2. Feline calicivirus strain F9 (FCV) (ATCC VR-782) was used in these experiments as a

norovirus-surrogate (Bidawid et al., 2003). To prepare an FCV stock, the confluent CrFK

monolayers were infected at multiplicity of infection (MOI) of 0.5 PFU per cell, in

maintenance medium (DMEM + 2% NCS) and incubated at 37°C in 5% CO2 atmosphere for

90 min to allow virus adsorption. Fresh culture medium was added and cells were further

incubated for 18-24 h at 37°C in 5% CO2 atmosphere. Cytopathic HAV strain HM-175 (ATCC

VR-1402) was propagated in FRhK-4 cells as described previously by Mbithi et al. (1991),

with some modifications. Briefly, HAV were allowed to adsorb for 90 min at 37°C in 5% CO2

atmosphere at an MOI of 1 PFU per cell in maintenance medium (MEM + 2% FBS) and the

infected cultures were kept in the growth medium until 80-90% of each monolayer exhibited

cytopathological effects (8 days at 37ºC, 5% CO2). For each of these viruses, viral stock

solution consisted of an infected cell culture supernatant obtained by three freeze (-80ºC) and

thaw (37ºC) cycles followed by a low speed centrifugation (1000 rpm, 10 min) to remove

residual debris. The resulting supernatant was stored in 1-ml fractions at -80ºC until use.

4.4.3 Viral attachment assays to Caco-2 and HT-29 cells

Binding of rotavirus, FCV and HAV to cultured intestinal cells was performed in

24-well culture plates containing respectively 0.9×106 and 2.0×106 cells/well of Caco-2 and

HT-29. Prior to viral inoculation, rotavirus suspension was activated with 16 µg/ml of trypsin

(Sigma) for 30 min at room temperature. FCV and HAV dilutions were done in maintenance

medium (DMEM or MEM + 2% FBS, respectively) and rotavirus in serum free-MEM to obtain

concentrations of 5×104 and 5×106 PFU/ml for each virus. Cell monolayers were washed twice

with sterile PBS and inoculated with 200 µl of viral suspension. Plates were then incubated

anaerobically in jars using an atmosphere generation system (AnaeroGen, Oxoid Ltd.,

Basingstoke, Hampshire, England) for 90 min, 3, 6, 24 or 48 h at 37°C. After incubation,

Caco-2 and HT-29 monolayers were washed twice with sterile PBS. Cells were detached using

250 µl of trypsin-EDTA (0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA⋅4 Na, Gibco) for 15-min at 37°C and

serial 10-fold dilutions were done in serum-supplemented medium. Viral samples were frozen

at -80ºC until viral counts were determined by plaque assay or immunofluorescence.

92

4.4.4 Viral replication assays

The yield of progeny viruses released from Caco-2 and HT-29 cells was evaluated by

collecting supernatant fluids after infection. Equal quantities of virus (200 µl of 5×106 PFU/ml)

were allowed to adsorb to cell surface for 90 min, 3, 6, 24 and 48 h at 37ºC in 24-well tissue

culture plates. Supernatant collected following viral inoculation were stored at -80ºC until virus

titers were measured in FRhK-4, MA-104 or CrFK cells by plaque assay or

immunofluorescence.

4.4.5 Quantification of FCV and HAV by plaque assay

FCV titers were determined by a plaque assay as described by Bidawid et al. (2003)

with some modifications. Briefly, CrFK cells grown overnight in 6-well tissue culture plates

(9.6 cm2/well; Falcon) were washed with sterile phosphate-buffered saline (PBS) and 200 µl of

10-fold serial dilutions of FCV in DMEM with 2% NCS were allowed to adsorb to cells for

90 min at 37°C in a 5% CO2 atmosphere and gently rocked occasionally. Semi-solid overlay

medium (2 ml), consisting of an equal part of DMEM supplemented with 4% NCS and 0.9%

noble agar (Sigma), was then added to each well. Plates were incubated for 2 days at 37°C with

5% CO2. Monolayers were fixed in 3.7% (v/v) formaldehyde and stained with 0.1% (w/v)

aqueous crystal violet to reveal characteristic plaques. HAV titers were also determined by a

plaque assay as described by Mbithi et al. (1993). Briefly, FRhK-4 cell monolayers grown

overnight in 6-well tissue culture plates (Falcon) were washed with sterile PBS and aliquots of

200 µl of 10-fold serial dilutions of HAV samples in MEM with 2% FBS were allowed to

adsorb to cell monolayers for 90 min at 37°C in the presence of 5% CO2. Overlay medium

(2 ml) consisting of an equal part of MEM supplemented with 4% FBS and 1.5% agarose type

II (Sigma) was added to each well. Plates were incubated for 8 days at 37°C with 5% CO2.

Monolayers were fixed in 3.7% (v/v) formaldehyde and stained with 0.1% (w/v) crystal violet

to reveal plaques resulting from the cytopathic effect. Viral counts were expressed in plaque

forming units (PFU)/ml.

93

4.4.6 Quantification of rotavirus by indirect immunofluorescent assay

Rotavirus titers were evaluated by a cell culture immunofluorescence assay as

described by Jean et al. (2002) in 96-well microtiter plates (0.32 cm2/well; Greiner µClear®,

Greiner Bio-One Gmbh, Frickenhausen, Germany) containing a confluent 24-h MA-104 cell

culture. Briefly, rotavirus samples were treated with 16 µg/ml of trypsin (Sigma) for 30 min at

room temperature (22 ± 2 ºC) and serially diluted in MEM medium without FBS. Twenty-five

microliters of each dilution and 200 µl of MEM were added on permissive MA-104 cells in

microtiter plate wells. Cells were then incubated for 24 h at 37ºC in a 5% CO2 atmosphere. The

medium was discarded and 100 µl of 80% (v/v) acetone was added, followed by 30 min of

incubation at 4 °C. In emptied wells, 50 µl per well of anti-rotavirus antibody (1:300, Accurate

Chemical, Westbury, NY) were added and incubated for 30 min at 37°C. The microplates were

washed five times with 200 µl of PBS and 50 µl of fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled

anti-sheep IgG (H+L) antibody (1:3000, Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario, Canada) were

further added, followed by an incubation of 30 min at 37°C. Microplates were washed four

times with 200 µl of PBS and 50 µl of glycerol/PBS (3:1) were added to each well. Cells were

immediately observed under epifluorescence microscope (Leica Microsystems, Richmond Hill,

Ontario, Canada). Each viral titer was determined by five replications and expressed in PFU/ml

by a mathematical formula using the Reed and Muench method (Payment and Trudel, 1993).


Results are expressed as the average of at least three experiments. Significant

differences between means were tested by analysis of variance using JMP IN software (SAS

Institute, version 4, Cary, NC). A P value of ≤ 0.05 was considered significant.

94

4.5 Results and discussion

4.5.1 Sensitivity and specificity of plaque assay and immunofluorescent

assay

FCV and HAV having strong cytopathic activities (cell destruction), plaque assays were

used to determine viral titers of samples obtained in attachment and replication assays. Figure

4.1A shows an example of the observed FCV cytopathic effects. The traditional plaque assay

offers the advantages to detect exclusively infectious viruses by specific titration and to be

suitable for in situ detection. Despite culture techniques are time consuming, repetitive results

are easily obtained. The limit of detection for this assay was about 15 PFU/ml for HAV and

FCV. In contrast, rotavirus causing low cytopathic effect, an immunofluorescent assay (IFA)

was used to evaluate the virus titers (Figure 4.1B). This immunotechnique utilizing

mathematical equations is less sensitive than plaque assay but highly specific detection can be

obtained. A specific signal, characterized by a bright green fluorescence, was obtained under

epifluorescence microscopy. The specificity of IFA was demonstrated using negative controls

for quantification assay. The low background levels obtained confirm the high specificity of the

antibodies employed for visualization and enumeration of rotavirus and allowed a detection

limit corresponding of about 103 PFU of rotavirus/ml. The fluorescence generated was shown

to be proportional to the added virus concentrations tested. Control assays with dilutions in

growth medium of intestinal Caco-2 and HT-29 cells alone on virus permissive cells (CrFK,

FRhK-4 and MA-104) were also performed with both methods and no fluorescence or plaque

lysis were detected.

95

Figure 4.1 : Visualization of detection methods used for evaluating viral concentration. (A) Plaque assay of serial 10-fold dilution of FCV starting at 1×107 PFU/ml in CrFK cells stained with crystal violet two days post-infection. Control well is non infected CrFK cells. (B) Indirect immunofluorescence of rotavirus at concentration of 1×106 PFU/ml in MA-104 cells. The inset shows control non infected MA-104 cells (magnification × 200).

96

4.5.2 Viral attachment to Caco-2 and HT-29 cells

The extent of enteric viruses binding to Caco-2 and HT-29 cells varied among the tested

viral families. Table 4.2 shows that the viruses bound at a higher percentage to Caco-2 than

HT-29 cells. Among the three virus types tested, the norovirus-surrogate FCV showed the

highest levels of attachment on Caco-2 and HT-29 cells with respectively 25.4% and 20.8%

using 106 PFU/well (Table 4.2).

Table 4.2 : Attachment of enteric viruses to human intestinal cells after 90 min

Viral attachment (%)* Virus and concentration added (PFU/well) Caco-2 cells HT-29 cells

Rotavirus 1.5×106 1.5×104

18.4 ± 4.5 13.9 ± 3.5

16.5 ± 5.5 11.5 ± 1.4

FCV 1.2×106 1.2×104

25.4 ± 2.2 20.8 ± 3.0

20.8 ± 1.8 15.8 ± 1.7

HAV 1.3×106 1.3×104

17.9 ± 1.1 19.2 ± 1.7

13.8 ± 2.2 12.1 ± 3.9

* Results are presented as means ± SEM of three replicates.

In contrast, rotavirus and HAV with the same concentration showed moderate binding

ranging from 13.8% to 18.4%. In order to evaluate the influence of contact time on the

reversible binding of viruses, viral suspensions were added to Caco-2 and HT-29 cells for

various periods of time ranging from 1.5 h to 48 h (Figure 4.2). Data show that the majority of

virus binding is reached after a period of 90 min of contact. Kreutz et al. (1994) have also

obtained the highest binding rate using 90 min contact time with FCV infecting CrFK kidney

cells although they have observed that half maximum attachment was reached as early as

15 min after infection. Generally, viruses were detectable up to 24 h of contact with the

exception of rotavirus. The results obtained in these experiments thus suggest that the three

nonenveloped RNA viruses studied had different efficiency of cell binding at different

97

concentrations tested. Moreover, the attachment levels obtained for the three viruses tested

were relatively higher than the rates previously obtained for bacterial enteropathogens as

Listeria monocytogenes LSD530 (Moroni et al., 2006) and enteropathogenic E. coli JPN15

(Bernet et al., 1993) who have shown for instance 6.4% and 11% of Caco-2 cell association,

respectively. The high rates of viral attachment were observed even at lower concentrations

than those of previously reported bacterial assays.

Figure 4.2 : Attachment of enteric viruses at concentration of 1×106 PFU/well to intestinal epithelial cells at different times post-infection. The results shown represent the means ± SEM of three replicate infected cultures.

Caco-2 cells

05

101520

2530

1.5 3 6 24 48

Hours post-infection

Att

achm

ent r

ate

(%)

RotavirusFCVHAV

HT-29 cells

0

510

15

20

2530

1.5 3 6 24 48Hours post-infection

Atta

chm

ent r

ate

(%)

RotavirusFCVHAV

98

4.5.3 Verification of the underestimation of virus-cell attachment

To verify if the viral binding could be completely detected, viral counts were

determined after treating the cells to freeze-thaw cycles. In these experiments, Caco-2 and

HT-29 cells were lysed by repeated freeze–thaw cycles rather than chemical agents like sodium

dodecyl sulphate (SDS) or Triton X-100 to protect the proteins of viruses for the viral

quantification. Table 4.3 shows that only slight differences in viral counts were observed for

one or three freeze-thaw cycles after a contact period of 90 min with Caco-2 and HT-29 cells

suggesting that low internalisation of viral particles occur in this period. In addition, there was

no significant difference regarding the recovery of viruses measured after one or three freeze-

thaw cycles. Similarly to Table 4.3 data, viral recovery was slightly higher for FCV.

Table 4.3 : Influence of freeze-thaw cycles on the quantitation of enteric viruses bound to intestinal cells after 90 min.

a Results are presented as means ± SEM of three replicates. b Freeze-thaw cycle c not significant differences between three freeze-thaw treatment compared to one freeze-thaw (P < 0.05)

4.5.4 Viral replication in cultured intestinal cells

As shown in Figure 4.3, viral titers in the culture supernatants first decreased and then

increased up to 48 hours post-infection following incubation of Caco-2 and HT-29 cells with

the rotavirus and HAV. Moreover, Caco-2 and HT-29 cells infected with rotavirus (106 PFU)

produce more rapidly infectious virus than FCV and HAV (Figure 4.3).

Viral counts (PFU/ml)a Cell lines and viruses

Viral concentration added

(PFU/well) 1 F.-T.b 3 F.-T.

Significance

Caco-2 Rotavirus FCV HAV

1.5×106 1.2×106 1.3×106

7.3 ± 1.6×104 10.9 ± 0.2×104 7.2 ± 0.4×104

8.0 ± 0.8×104 12.0 ± 1.2×104 7.6 ± 0.2×104

n.s.c

n.s. n.s.

HT-29 Rotavirus FCV HAV

1.5×106 1.2×106 1.3×106

6.6 ± 2.2×104 8.3 ± 0.7×104 5.5 ± 0.9×104

8.0 ± 1.0×104 9.3 ± 0.4×104 5.8 ± 0.2×104

n.s. n.s. n.s.

99

Figure 4.3 : Replication of enteric viruses in intestinal epithelial cells. Viruses were added at a concentration of 1×106 PFU/well on human intestinal cells. Culture supernatants were collected at various times post-infection and virus titers measured as described in Materials and Methods.

Caco-2 cells

2

3

4

5

6

7

8

1.5 3 6 24 48


log 1

0 PF

U/m

l RotavirusFCVHAV

HT-29 cells

2

3

4

5

6

7

8

1.5 3 6 24 48


log 1

0 PF

U/m

l RotavirusFCVHAV

100 Release of rotaviruses was measured after 3 hours post-infection. Not surprisingly, both

Caco-2 and HT-29 cells have shown in the past to be permissive to rotavirus and HAV

infections (Blank et al., 2000; Londrigan et al., 2000; Holloway and Coulson, 2006). Results

show that rotavirus and HAV yields were approximately 2-fold more in Caco-2 than in HT-29

at 24 h following inoculation. In contrast, these cell lines appeared to be less permissive for

FCV replication as indicated by lower viral counts. The replication of FCV appears to be a slow

process with the release taking more than 24 h post-infection and the yield viruses never exceed

the input virus dose. Low levels of FCV produced in Caco-2 and HT-29 cells may have been

due to the virus binding without penetration of the cell or penetration occurring by a non-

productive pathway (Sosnovtsev and Green, 2003). Additional data would be required to fully

characterize FCV replication in Caco-2 and HT-29 cells.

4.6 Conclusion

A simple and efficient in vitro method to detect virus-intestinal cells interactions

occurring during foodborne infection was developed. The novel in vitro method proposed

(performed under physiologic condition at 37ºC) using propagation in sensitive cells is

particularly indicated to give quantitative results of viral attachment to intestinal cells since

detection of infectivity of enteric viruses is usually not possible in vivo. This newly approach

may be applied to the vast majority of enterically transmitted cytopathic and non cytopathic

viruses and may be a useful tool for studying new ways to control viral enteric infection for the

protection of human health.


This work was supported by the Fonds Québécois de la Recherche sur la Nature et les

Technologies (FQRNT) and the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada

(NSERC). We thank Irena Kukavica-Ibrulj for skilled technical assistance and fruitful

discussions.

101

Chapitre 5.

Effet inhibiteur des bifidobactéries humaines sur l’attachement des virus entériques

aux lignées cellulaires intestinales

Inhibitory effect of human bifidobacteria on the attachment of enteric viruses to intestinal cell lines

L’objectif de ce chapitre était d’évaluer de façon in vitro l’effet des bifidobactéries

isolées de fèces de nouveaux-nés pour inhiber l’attachement des virus entériques aux cellules

intestinales Caco-2 et HT-29. Pour ce faire, les bifidobactéries ont été ajoutées avant, en même

temps et après l’ajout des virus sur les cellules entériques afin d’évaluer leur impact sur le

pourcentage d’attachement des rotavirus, du substitut de norovirus et du virus de l’hépatite A.

Les trois souches de bifidobactéries humaines utilisées pour cette étude ont été sélectionnées

principalement sur le critère d’adhésion très élevé aux Caco-2 et HT-29. Ce travail a été réalisé

au pavillon Marchand (Université Laval, Québec) dans des laboratoires avec les équipements

nécessaires pour la culture cellulaire, la virologie et la bactériologie.

Les résultats de ce travail seront soumis dans la revue Applied Environmental

Microbiology. Les auteurs de cet article sont Mélanie Gagnon, Julie Jean, André Darveau, et

Ismaïl Fliss. Ce chapitre présente le contenu intégral de ce manuscrit rédigé en anglais.

102

5.1 Résumé

La capacité des souches probiotiques à adhérer à la muqueuse intestinale, à exclure,

à entrer en compétition et à déplacer les pathogènes entériques viraux représente un aspect

important pour traiter des infections entériques virales. La capacité d’adhésion de trois souches

de bifidobactéries humaines aux cellules Caco-2 et HT-29 a été évaluée et comparée avec deux

souches références de bifidobactéries de l’ATCC. L’adhésion des bifidobactéries a varié de

0.8% à 8.6% selon la concentration ajoutée (5×107 ou 5×109 CFU/ml). Le pourcentage

d’attachement de rotavirus, d’un substitut-norovirus (FCV) et de l’hépatite A (HAV) à une

concentration de 104 PFU/puits aux lignées cellulaires en absence de bifidobactéries a varié de

11.5% (rotavirus sur les cellules HT-29) à 20.8% (FCV sur les cellules Caco-2). Le contact des

cellules avec les suspensions de bifidobactéries provenant de nouveaux-nés (5×109 CFU/ml)

pendant 30 min avant l’addition des virus réduit l’attachement des rotavirus de près de 98%.

Pour HAV, une réduction légèrement inférieure de l’attachement viral (près de 85%) sur les

deux lignées cellulaires intestinales a été obtenue avec les mêmes souches probiotiques ajoutées

avant les virus. Au contraire, aucune diminution substantielle de l’attachement des FCV a été

observée dans l’essai d’exclusion. La présence simultanée des bactéries et virus sur les cellules

intestinales produit des réductions variables de l’attachement viral, suggérant que différents

mécanismes sont impliqués dans les essais d’exclusion et compétition alors que la capacité des

bifidobactéries à déplacer les virus attachés est plus limitée. Les souches de bifidobactéries

humaines testées démontrent un potentiel probiotique pour un usage prophylactique contre des

entéropathogènes viraux tel que rotavirus.

103

5.2 Abstract

The ability of probiotic bacteria to adhere to the intestinal mucosa and exclude,

compete with and displace viruses is of great interest for preventing and treating viral enteric

infections. In this study, adhesion of bifidobacteria isolated from human infants and two

ATCC reference strains to Caco-2 and HT-29 cell growth ranged from 0.8% to 8.6% of

applied loads of 5×107 or 5×109 CFU/ml. Percent adhesion increased with increasing bacterial

concentration. Attachment of rotavirus, norovirus-surrogate (FCV) and hepatitis A at

104 PFU/well to cell growth in the absence of bifidobacteria ranged from 11.5% (rotavirus on

HT-29 cells) to 20.8% (FCV on Caco-2 cells). Contacting cells with suspensions of

bifidobacterial isolates from infants (5×109 CFU/ml) for 30 min prior to exposure to virus

reduced rotavirus attachment by about 98%, while HAV attachment was reduced by 85% on

both intestinal cell lines. No substantial decrease in FCV attachment was observed. Contacting

cells with bacteria and virus at the same time produced variable reductions in viral attachment,

suggesting different mechanisms for exclusion and competition, while the ability of the

bifidobacteria to displace attached virus was more limited. These bifidobacteria thus appear to

have potential as probiotics for prophylactic use against viral enteropathogens such as

rotavirus.

104

5.3 Introduction

The rotaviruses, noroviruses and hepatitis A virus (HAV) are major foodborne and

waterborne pathogens and a worldwide public health concern (Koopmans et al., 2002; Clark

and McKendrick, 2004). The infections they cause often require hospitalization particularly in

the case of sensitive populations such as young children, elderly, pregnant women or

immunocompromised persons (Gerba et al., 1996). These viruses are transmitted through the

fecal-oral route by the ingestion of contaminated foods, particularly those that are raw or

minimally processed (Seymour and Appleton, 2001). The first event in the process of infection

is viral attachment to the cells of the intestinal lumen. Rotaviruses and noroviruses infect the

mature epithelial cells lining the villi of the small intestine and replicates locally leading to

diarrhea (Michelangeli and Ruiz, 2003). Recently, Blank et al. (2000) showed that prior to

infecting the liver, HAV can infect intestinal cells and produce new virions therein, which

proceed to their target cells in the liver to cause hepatitis. The nucleocapsids of these three

nonenveloped viruses interact with polarized cells through attachment to a cell glycoprotein

receptor (Levy et al., 1994). Rotavirus and norovirus infections cause structural and functional

damages in cells of the small intestine, observable as shortened and abnormal microvilli

(Koopmans et al., 2002). In contrast, HAV release from intestinal cells occurs without a

cytopathic effect (Blank et al., 2000).

In numerous recent studies, treatments using probiotics have been proposed to prevent

and control enteric infections (Gill, 2003; Sullivan and Nord, 2005; Huebner and Surawicz,

2006; De Vrese and Marteau, 2007). There is increasing evidence that lactobacilli and

bifidobacteria, which are natural components of the gastrointestinal microbiota, possess

antimicrobial activities that contribute to the host gastrointestinal defense system (Servin,

2004). Clinical trials have shown that selected strains of bifidobacteria have the ability to

interfere with pathogens in the intestinal tract (Saavedra et al., 1994; Guarino et al., 1997).

The mechanisms by which bifidobacteria may protect the host from pathogens include

production of inhibitory substances, blockade of adhesion sites and stimulation of the immune

response (Picard et al., 2005) However, no in vitro study has examined interactions between

105

bifidobacteria and enteric viruses. To investigate the interactions between enteric viruses with

bifidobacterial strains on the surface of intestinal cells, we have used cellular models previously

developed (Gagnon et al., 2007). These have proven useful for initial evaluation of intestinal

host-microbial interactions and are inexpensive.

Among the numerous strains of Bifidobacterium that we have previously isolated from

newborn infants, three (coded RBL67, RBL69 and RBL70) have shown strong resistance to

gastrointestinal conditions and high probiotic potential (Touré et al., 2003; Moroni et al., 2006).

In this study, we evaluated the ability of these strains to adhere to the intestinal Caco-2 and

HT-29 cell surfaces and thereby to exclude, compete with and displace a norovirus-surrogate

(feline calicivirus), human rotavirus and hepatitis A virus.


5.4.1 Preparation of bacterial and viral strains

Bifidobacterium sp. RBL67 (Bifidobacterium thermophilum), RBL69 (Bifidobacterium

thermacidophilum) and RBL70 (also Bifidobacterium thermacidophilum) were previously

isolated by Touré et al. (2003) from fecal samples of 1-week-old breast-fed infants. Their

identification was done by 16S rDNA sequence analysis using a PCR amplification protocol

described by Schürch (2002) with minor modifications (Moroni et al., 2006) and subsequently

by DNA-DNA hybridization (von Ah et al., 2007). All other organisms were obtained from the

American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, MD). B. longum ATCC 15707 and

B. pseudolongum ATCC 25526 were used respectively as low and high adhesive reference

bacteria (Crociani et al., 1995). All strains were stocked in 20% glycerol at -80ºC.

Bifidobacteria were cultured in De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) broth (Rosell Institute Inc.,

Montréal, Québec, Canada) supplemented with 0.05% (wt/vol) L-cysteine-hydrochloride

(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) and incubated anaerobically at 37°C for 18 h in jars

using an atmosphere generation system (AnaeroGen, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire,

England).

106 Feline calicivirus strain F9 (ATCC VR-782), a norovirus-surrogate, was propagated in

Crandell’s feline kidney cells (CrFK, ATCC CCL-94) as described by Bidawid et al. (2003).

Human rotavirus strain Wa (ATCC VR-2018) and hepatitis A virus (HAV) strain HM-175

(ATCC VR-1402) were propagated respectively in monkey kidney MA-104 cells (ATCC CRL-

2378.1) and FRhK-4 cells (ATCC CRL-1688) using the methods of Ansari et al. (1988) and

Mbithi et al. (1991, 1992). The viral stock solution consisted of cell culture supernatant

obtained after an infection period followed by three freeze (-80ºC) and thaw (37ºC) cycles and

low speed centrifugation (1000 rpm, 10 min). The supernatant was stored in 1-ml fractions at

-80°C until use.

5.4.2 Cell culture

All cell lines were obtained from the American Type Culture Collection. All cell

culture media and supplements were Gibco brand, obtained from Invitrogen Inc., Burlington,

Ontario, Canada. All cell cultures were incubated at 37ºC in a 5% CO2 atmosphere. Caco-2

cells (ATCC HTB-37) were cultured as monolayers in 75-cm2 flasks (Falcon, Becton

Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) with Dulbecco’s Modified Eagle medium

(DMEM) containing 4,500 mg of glucose/liter, supplemented with 20% (vol/vol) fetal bovine

serum (FBS), 1% (vol/vol) nonessential amino acids, and 1% (vol/vol) antibiotic solution

(100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin). HT-29 cells (ATCC HTB-38) were grown

in RPMI 1640 medium supplemented with 10% (vol/vol) fetal bovine serum and 2 mM

L-glutamine and 1% (vol/vol) antibiotic solution. For bacterial adhesion and viral infection

assays, Caco-2 or HT-29 cells were seeded in 24-well tissue culture plates (Falcon) at 2.8×104

and 4×104 cells per well, respectively. The culture medium was replaced at two-day intervals,

and the cells were used at postconfluence (106 cells/well) after 15 or 21 days of culture for

Caco-2 and HT-29 respectively. Intestinal cell cultures were replenished with DMEM and

RPMI 1640 without antibiotics 18 h before the assays were performed.

FRhK-4 and MA-104 cells were grown as monolayer in Eagle’s minimal essential

medium with Earle’s salts (MEM) supplemented with 10% (vol/vol) fetal bovine serum, 2 mM

L-glutamine, 1% (vol/vol) nonessential amino acids, 1% (vol/vol) HEPES buffer, 0.1125%

(wt/vol) sodium bicarbonate, 1% (vol/vol) antibiotic solution. They were seeded at

107

concentrations of 4.2×104 and 4.7×104 cells per cm2, respectively. CrFK cells were seeded at a

concentration of 4.2×104 cells per cm2 and grown in DMEM supplemented with 10% (vol/vol)

newborn calf serum (NCS), 2 mM L-glutamine, 1% (vol/vol) nonessential amino acids and

1% (vol/vol) antibiotic solution.

5.4.3 Bifidobacterial adhesion assay

The adhesion of Bifidobacterium strains to cultured intestinal cells was examined by

plate count methods as described previously (Gagnon et al., 2004). Briefly, fresh overnight

cultures of bifidobacteria were harvested by centrifugation at 6,000×g for 10 min at 20ºC and

washed twice with sterile phosphate-buffered saline (PBS). Bacteria were then suspended in

DMEM for assays on Caco-2 cells and in RPMI 1640 medium for assays on HT-29 cells at

final concentrations of 5×107 and 5×109 CFU/ml. Caco-2 and HT-29 growth in 24-well plates

was then inoculated with 250 µl of bifidobacterial suspension and incubated anaerobically for

1 h at 37ºC. The suspension was then removed and cells were washed twice with PBS to

eliminate unbound bacteria. Cells with adherent bacteria were released from polystyrene wells

by adding 250 µl of trypsin-EDTA (Gibco) for 15 min and then 250 µl of culture medium

supplemented with FBS was added to each well to stop the trypsin action, followed by pipetting

to dissociate well contents. Serial dilutions of bacteria were plated on Beerens agar (Beerens,

1990) and incubated anaerobically for 72 h at 37°C for subsequent CFU quantification. Each

adhesion assay was conducted in triplicate, using three successive Caco-2 and HT-29 cell

passages. The adhesion capacity was expressed as a percentage, that is, the number of adherent

bacteria divided by total number of bacteria added, multiplied by 100.

5.4.4 Assays for antiviral activity of bifidobacteria

The effect of bifidobacteria on viral attachment to cultured human intestinal cells was

performed in 24-well tissue culture plates. Colonic cells washed once with PBS were infected

with 250 µl of virus at final concentrations of 5×104 or 5×106 PFU/ml. Bifidobacteria (250 µl

of 5×109 CFU/ml) were added either 30 min before (exclusion assay), at the same time as

(competition assay) or 30 min after (displacement assay) the viruses. Plates were incubated

under anaerobic conditions at 37ºC for 90 min, then washed three times with PBS and treated

108

with 250 µl of trypsin-EDTA for 15 min at 37ºC, after which 250 µl of DMEM or RPMI

supplemented respectively with 20% and 10% FBS were added to each well to stop the action

of trypsin and the cell growth was detached by repetitive pipetting. Aliquots were then frozen

and stored at -80ºC until virus quantification by plaque assay (FCV and HAV) or by cell culture

immunofluorescence assay (rotavirus). The diminution of viral attachment to intestinal cells

was calculated as a percentage: 100(1 − Vb/Va), where Va and Vb are the viral counts (PFU/ml)

respectively in the absence and presence of bifidobacteria.

5.4.5 Plaque assay

Quantification of FCV attached to enteric cells was assayed by a plaque assay described

by Bidawid et al. (2003) with some modifications. Briefly, CrFK cell monolayer grown

overnight in 6-well tissue culture plates (9.6 cm2/well; Falcon) was washed with sterile PBS

and then contacted with 300 µl of serial 10-fold dilutions of thawed aliquot for 90 min at 37°C

in a 5% CO2 atmosphere with occasional gentle rocking motion. A semi-solid medium overlay

(equal parts of DMEM supplemented with 4% NCS and 0.9% Sigma noble agar), was then

placed (2 ml) in each well. Plates were incubated for two days and the monolayer was fixed in

3.7% (vol/vol) formaldehyde and stained with 0.1% (wt/vol) crystal violet to examined

characteristic lysis plaques.

HAV attached to enteric cells was titrated by the plaque technique described by Mbithi

et al. (1993). Briefly, FRhK-4 cell monolayer (grown overnight in 6-well culture plates) was

contacted with 200 µl of serial dilutions of thawed aliquot for 90 min at 37°C (5% CO2) with

occasional gentle rocking motion. A 2 ml overlay (equal parts of growth medium with 4% FBS

and 1.5% solution of Sigma type II agarose) was then applied and plates were incubated for

eight days. FRhK-4 cell monolayer was then fixed in 3.7% (vol/vol) formaldehyde and stained

with 0.1% (wt/vol) crystal violet to reveal plaque lysis.

109

5.4.6 Cell culture immunofluorescence assay

Rotavirus titers were evaluated by a cell culture immunofluorescence assay as

described by Jean et al. (2002). Briefly, MA-104 cell overnight culture in 96-well microtiter

plates (0.32 cm2/well; Greiner µClear®, Greiner Bio-One Gmbh, Frickenhausen, Germany) was

contacted with serial 10-fold dilutions (200 µl) of thawed aliquot pre-treated with trypsin

(16 µg/ml). The medium was discarded after 24 h of incubation and replaced with 100 µl of

acetone (80% vol/vol), which was discarded after 30 min at 4ºC, followed by sheep

anti-rotavirus antibody (1:300; Accurate Chemical, Westbury, NY) for 30 min at 37ºC, a wash

with PBS and finally fluorescein isothiocyanate-labeled anti-sheep IgG (H+L) antibody

(1:3000; Sigma) for 30 min at 37ºC. Cells were then observed by epifluorescence microscopy

and viral titer was calculated using the Reed-Muench method (Payment and Trudel, 1993).


A one-way analysis of variance (ANOVA) was performed, using JMP In software

(SAS Institute, version 4, Cary, NC), to test the effects of bifidobacteria on viral attachment.

Student’s t-test was done to analyze differences between viral attachment in the presence and

absence of bifidobacteria. Effects were considered significant at P < 0.05.

5.5 Results

5.5.1 Bifidobacterial adhesion to Caco-2 and HT-29 cells

The measured adhesion of the bifidobacteria to Caco-2 and HT-29 cells is given in

Table 5.1. Adhesive ability was somewhat variable among the five species tested. Percent

adhesion ranged from 1.92% to 8.55% on Caco-2 cells and from 0.75% to 7.15% on HT-29

cells. In general, there was no significant difference between adhesion to Caco-2 cells and to

HT-29 cells. Percent adhesion also increased with bacterial concentration. Among the three

strains isolated from newborn infants, B. thermophilum RBL67 was the most adhesive, at

8.07% and 7.14% for 109 CFU/well on Caco-2 and HT-29 cells, respectively. Slightly less

110

adhesion was observed with B. thermacidophilum (RBL69 and RBL70) at the higher

concentrations.

Table 5.1 : Adhesion of bifidobacteria to human intestinal cells.

Adhesion (%)a Bifidobacterial strain (CFU/well) Caco-2 cells HT-29 cells

Reference strains B. longum ATCC 15707 107 109 B. pseudolongum ATCC 25526 107 109

Infant isolates B. thermophilum RBL67 107 109

1.92 ± 1.26 2.03 ± 0.97

4.64 ± 1.10 8.55 ± 1.84

5.09 ± 0.16 8.07 ± 0.61

0.75 ± 0.38 1.96 ± 0.30

3.89 ± 0.97 7.15 ± 0.33

5.41 ± 0.36 7.14 ± 0.71

B. thermacidophilum RBL69 107 109

3.17 ± 1.44 5.29 ± 0.40

4.01 ± 0.74 5.44 ± 0.74

B. thermacidophilum RBL70 107 109

5.05 ± 0.93 6.33 ± 0.58

3.90 ± 0.20 6.19 ± 0.43

a Means ± standard deviation of triplicate analyses.

5.5.2 Exclusion of enteric viruses by bifidobacteria

The effect of bifidobacteria on enteric virus attachment to enterocyte-like cells was

evaluated using the three isolates from newborns. Table 5.2 shows the reductions in percent

attachment obtained when the bifidobacteria were allowed to adhere first. All three isolates

were able to exclude two of the three enteric viruses, the exception being FCV. For this virus,

exclusion was weak or nil on Caco-2 cells and increased attachment was observed on HT-29

cells. Isolate RBL67 produced the greatest reduction in rotavirus attachment (98%), while

RBL69 brought the greatest reduction in HAV attachment (86% to 92%) on Caco-2 and HT-29

cells using the higher virus concentration tested (106 PFU/well). For HAV, a larger decrease

111

was obtained in general at 104 PFU/well compared to 106 PFU/well. Generally, rotavirus was

the most affected by the presence of bifidobacteria, as indicated by the lower fluorescence

(Figure 5.1).

5.5.3 Competition between bifidobacteria and enteric viruses

Table 5.3 shows the effect of the three isolates on viral attachment to the cells when the

bacteria and virus were added at the same time. In this assay, high reduction of rotavirus

attachment was observed at the concentration of 104 or 106 PFU/ml on Caco-2 and HT-29 cell

lines. A strain-dependent relationship appears for FCV attachment to HT-29 cells. RBL70

giving the smallest reduction (11%) and RBL69 the largest (59%) at 104 PFU/ml. For the most

part, reductions in viral attachment were large at both viral concentrations on both cell lines.

The largest increases in HAV attachment were obtained on HT-29 cells.

5.5.4 Displacement of enteric viruses by bifidobacteria

Table 5.4 shows the displacement of virus from the cell surface by bifidobacteria added

30 minutes after the virus. Small to moderate reductions in viral attachment (10% to 55%) were

observed with all three bifidobacteria. The three bifidobacteria tested were able to significantly

displace rotavirus at 104 PFU/well on Caco-2 cells and at 106 PFU/well only RBL67 and

RBL70 are efficient displacing rotavirus on HT-29 cells.

112

Figure 5.1 : Fluorescent micrographs of MA-104 cells used for the determination of rotavirus titer. (A) Inoculum rotavirus (5×106 PFU/ml) used for exclusion, competition and displacement assays on HT-29 cells; (B and C) Rotavirus at 5×106 PFU/ml applied to HT-29 cells 30 min after (exclusion assay) and simultaneously (competition assay) with B. thermophilum RBL67 at 5×109 CFU/ml, respectively; (D) Controls non infected cells.

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116

5.6 Discussion

Caco-2 and HT-29 cells represent two complementary in vitro intestinal epithelial

models that differ by the formation of a monolayer of polarized differentiated cells in the case

of Caco-2 cells and a multilayer of unpolarized and undifferentiated growth in the case of the

HT-29 line (Rousset, 1986). These cell lines are considered accurate representations of the

in vivo situation, in which both structures are found among proliferating intestinal cells

(Zweibaum et al., 1991). The adhesion of B. thermophilum RBL67 to both cell lines was

comparable to that obtained for B. pseudolongum ATCC 25526, a strain recognized as highly

adhesive (Crociani et al., 1995). This isolate (RBL67) had also a greater capacity to adhere to

Caco-2 cells than an isolate that we previously found to have high adhesiveness and identified

as B. thermacidophilum RBL71 (Gagnon et al., 2006). Moreover, the adhesion of RBL70 was

greater than that reported for RBL71 whereas that of RBL69 was less, even though both of

these isolates have been identified as B. thermacidophilum. Differences in adhesion efficiency

are strain-dependent and probably determined by physiology and factors such as proteinaceous

component, polysaccharide, ionic charge and lipoteichoic acid (Crociani et al., 1995). This

capacity of bifidobacteria to adhere to intestinal cells is considered as an important criterion for

the in vitro selection of probiotics that may colonize (if only transiently) the human intestinal

tract (Alander et al., 1999; FAO/WHO, 2002).

It has been suggested recently that bifidobacteria play a role in acting as a barrier

against infection of the gastrointestinal tract by viral pathogens (Gill, 2003; Servin and

Coconnier, 2003; Servin, 2004). As observed for many invasive enteropathogens, the ability of

enteric viruses to attach to the surface of intestinal epithelial cells is a critical step in infection

(Carter, 2005). On this basis, we examined the abilities of three human bifidobacterial strains to

exclude, compete with and displace three enteric viruses. Exclusion and competition by

bifidobacteria had profiles quite different from those of displacement. Viral attachment

inhibition by exclusion and competition was generally much greater than the inhibition

achieved by displacement. In fact, when added 30 min before or at the same time as enteric

viruses, the three bifidobacterial strains inhibited viral attachment by 51% to 98%, depending

on the concentration added and the cell line. This result differs from those of

117

Botic et al. (2007), who obtained low to moderate inhibition (30% to 60% cell survival) of

vesicular stomatitis virus (VSV) infection of IPEC-J2 (intestinal pig epithelial cell jejunum)

cell monolayer using probiotic L. paracasei A14 at a concentration of 108 lactobacilli/ml. These

authors demonstrated that there was a bacterial dose and contact time dependence for antiviral

effect of probiotic bacteria. Considering that our probiotics concentration and contact time were

different, this could explain the greater inhibition observed in our study. Botic et al. (2007) did

not observed a significant change in the cell survival rate due to virus dilution, while we

observed a virus dose effect on the inhibition of viral attachment.

While the bifidobacteria tested in this study were quite effective in excluding rotavirus

and HAV, all three failed to inhibit FCV attachment even when added 30 min before the virus.

In fact, FCV exhibited a greater capacity to adhere to HT-29 cells in the presence of probiotic

bacteria. This increased attachment (up to 140%) may be explained by a mechanism that

involves a low pH-dependent step. The bifidobacteria acidify the cell culture medium and as

Kreutz et al. (1994) has demonstrated, acidic environment promote FCV attachment, with

maximum binding at pH 6.5. In the case of rotavirus and HAV, this pH-effect was not

observed. The human bifidobacteria in our study were also not very effective at displacing

virus. When they were added 30 min after the viruses, the reduction in viral attachment ranged

from 9% to 55%. Lee et al. (2003) reported similar interactions for two probiotic Lactobacillus

strains, L. rhamnosus GG and L. casei Shirota, against enteropathogenic bacteria such as E. coli

and Salmonella on Caco-2 cells. These authors demonstrated that displacement of pathogenic

bacteria is a very slow process and once the pathogens are attached to their cell receptors,

probiotics have little effect on displacing them. They propose that bacterial adhesins present on

probiotics could bind to the mucosal surface in order to be effective in exclusion and

competition interactions.

The greatest reductions in attachment (86% to 98%) in the exclusion and competition

assays were obtained for rotavirus with all three bifidobacterial isolates. Immunofluorescent

microscopy showed that bifidobacteria diminished rotavirus infection. It is noteworthy that we

observed the greatest inhibition of rotavirus attachment in exclusion and competition assays

with B. thermophilum RBL67, which has previously shown the greatest adhesiveness to Caco-2

and HT-29 cells among the three bifidobacteria isolates. However, further experiments at the

118

molecular level are needed to determine the interactions between this Bifidobacterium and

rotavirus on intestinal cells and to evaluate the impact of such interactions on rotavirus

infectivity.

The antiviral effect of probiotic bacteria may involve any of several possible

mechanisms. The pre- and co-incubation inhibition of viral attachment to human cell lines

in vitro may be due to the formation of a bacterial biofilm that slows down the infectious

process by preventing the access of enterovirulent organisms to the cell surface. This steric

hindrance mechanism has been suggested by Botic et al. (2007) to explain inhibition of VSV

infection by pre-incubation with probiotic bacteria. This non-specific mechanism occurs

independently of the enteric virus tested. Another possible mechanism is based on the ability of

probiotic bacteria to compete with viral pathogens for specific adhesion sites on the same

intestinal mucosal receptors. In the case of the three nonenveloped enteric viruses in the present

study, binding to intestinal glycoprotein receptors could be involved (Levy et al., 1994).

However, Lee and Puong (2002) have suggested that probiotics have specific adhesines that

bind to cellular receptors and that competition between probiotics and pathogens takes place for

attachment to these receptors. The specificity of both the adhesines and the receptors still needs

to be proven by future molecular studies. Inhibition of the attachment of other invasive

enteropathogens to enterocytes by bifidobacteria has also been reported. Bernet et al. (1993)

showed that the human strain B. longum 4 inhibited Salmonella typhimurium association with

Caco-2 cells by 88% in competition assays. Moroni et al. (2006) have shown similar inhibition

of Listeria monocytogenes invasion of Caco-2 and HT-29 cells using bifidobacteria isolated

from newborn infants.

5.7 Conclusions

Our study has shown the probiotic potential of three bifidobacterial isolates from

newborns, B. thermophilum (RBL67) and two variants of B. thermacidophilum (RBL69 and

RBL70), to reduce the attachment of enteric viruses to Caco-2 and HT-29 cell lines. This could

have significant impact on human health with regard to prevention and treatment of enteric

viral infections. The bifidobacteria used in this study were not able to inhibit infection of

119

cultured cell lines by rotavirus, FCV and HAV completely, but significant reductions of viral

attachment were obtained when the bifidobacteria were incubated with the cells prior to or

simultaneous with exposure to virus. The different degrees of inhibition obtained with the

tested bifidobacteria indicate the need for case-by-case characterization of probiotic strains but

suggest potential for adhesive strains as inhibitors of enteropathogenic viral attachment to

enterocytes.

Finally, the cellular models described in this study offer appropriate tools for studying

host-enteric virus interactions in the presence of probiotic bacteria. Better understanding of

these interactions will provide a rational basis for using probiotics as dietary supplements. This

should allow the selection of strains with potential application to the prevention or treatment of

diarrhea caused by enteric viruses. Studies are in progress to confirm and characterize the

antiviral properties of the selected bifidobacteria in a rodent model infected with rotavirus.


This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Research Council of

Canada (NSERC). M.G. was supported by a doctoral fellowship from the Fonds Québécois de

la Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT). We thank Ueli Von Ah for their

technical assistance.

120

Chapitre 6.

Effet du gavage avec des bifidobactéries contre l’infection hétérologue à rotavirus

chez des souriceaux CD-1

Effect of bifidobacterial feeding on heterologous rotavirus infection of suckling CD-1 mice

L’objectif de ce chapitre était d’étudier l’effet de la souche probiotique RBL67 isolée

de fèces d’un nouveau-né contre l’infection à rotavirus chez les souriceaux. Ces travaux ont été

réalisés au pavillon de l’INAF (Université Laval, Québec), où des installations de

bioconfinement de niveau 2 étaient disponibles de même qu’au pavillon Comtois (Université

Laval, Québec), dans un laboratoire de virologie.

Les résultats de ce travail seront soumis dans la revue BMC Microbiology. Les auteurs

de cet article sont Mélanie Gagnon, André Darveau et Ismaïl Fliss. Ce chapitre présente le

contenu intégral de ce manuscrit rédigé en anglais.

121

6.1 Résumé

Une souche Bifidobacterium thermophilum isolée d’un nouveau-né et hautement

adhérente aux cellules Caco-2 et HT-29 a été administrée à des souriceaux CD-1 pour évaluer

sa capacité à inhiber une infection à rotavirus. Les souriceaux ont été gavés avec la souche

probiotique durant sept jours avant ou après une dose unique du rotavirus simien SA-11.

Les comptes de bifidobactéries retrouvés dans les intestins, les titres de rotavirus et l’histologie

des côlons ont été surveillés durant trois jours alors que le poids corporel a été suivi durant une

semaine après l’infection. La production d’anticorps IgA sécrétoires, IgG et IgM sériques

contre les rotavirus SA-11 ont été analysées jusqu’à une semaine et deux semaines,

respectivement. Dans le groupe de souris infectées, de la diarrhée et une forte réponse

spécifique IgG et IgM anti-rotavirus ont été observées après l’inoculation avec la souche

SA-11. Cependant, seulement une réponse marginale en IgA a été obtenue. Après 6 h post-

infection, les bifidobactéries sont détectées aux environs de 107 CFU/g dans les intestins des

souriceaux gavés avec les probiotiques soit avant ou après l’infection. Les rotavirus sont

également présents à une concentration de 103 PFU/g du contenu intestinal au même moment et

avec les mêmes groupes. Toutefois, la concentration de rotavirus était significativement

inférieure (P < 0.05) chez le groupe gavé avant infection à 48 h après l’infection

(103.28 vs 104.63) et a diminué plus rapidement que le groupe gavé après l’infection entre

48 et 72 h. L’analyse histologique a montré que le gavage de bifidobactéries aide à diminuer les

dommages au côlon. Ces résultats suggèrent que la consommation à hautes doses de

B. thermophilum RBL67 peut réduire la sévérité de l’infection à rotavirus chez des souriceaux,

avec un effet maximal obtenu quand le gavage probiotique a lieu avant l’infection.

122

6.2 Abstract

A strain of Bifidobacterium thermophilum isolated from a newborn and highly adherent

to Caco-2 and HT-29 cells was administrated to suckling CD-1 mice to evaluate its ability to

inhibit rotavirus infection. Pups were fed the probiotic for seven days before or after challenge

with a single dose of simian SA-11 rotavirus. Intestinal Bifidobacterium counts, rotavirus titer

and colon histology were monitored for three days and body weights for one week after

challenge. Immunoglobulin production (secretory IgA, serum IgG and IgM) against rotavirus

SA-11 was analyzed for two weeks post-challenge. In infected mice, diarrhea and strong anti-

rotavirus IgG and IgM responses were observed although only a marginal IgA response was

obtained. Six hours after challenge, bifidobacteria were near 107 CFU/g in the intestine of both

pre- and post-infection-fed mice. Rotavirus was found at 103 PFU/g of intestine at this time in

these same groups but significantly lower in the pre-infection feeding group 48 h after

challenge (103.28 vs 104.63) and decreased faster than in the post-infection feeding group

between 48 and 72 h. Histological analysis revealed that bifidobacteria helped decrease damage

to the colon epithelium. These results suggest that the intake of high doses of the new strain of

B. thermophilum RBL67 can reduce the severity of rotavirus infection in suckling mice, with a

maximal effect being obtained when probiotic feeding takes place before infection.

123

6.3 Introduction

Rotaviruses are one of the most significant causes of acute gastroenteritis in infants and

young children (Sattar et al., 2001; Ramig, 2004). Mortality rates are low in developed

countries, where illness is usually self-limiting (Boshuizen et al., 2003). However, it is

estimated that this infection causes up to 600,000 deaths per year in children under 5 years of

age in developing countries throughout the world (Clark and McKendrick, 2004). Rotavirus

infection is restricted mainly to the small intestinal villus epithelium, where it causes villus

atrophy and cell death (Greenberg et al., 1994). Since the epithelium is the primary target of the

infection, viral attachment there to appears to be crucial for pathogenesis. This is thought to

occur via cell surface receptors containing sialic–acid-like glycolipids or glycoproteins

(Boshuizen et al., 2005). Internalized rotaviruses alter the function of the small intestinal

epithelium with diarrhea as the most likely symptom, which has been attributed to several

different mechanisms, including malabsorption secondary to enterocyte destruction, a virus-

encoded toxin, stimulation of enteric nervous system, and villus ischemia (Boshuizen et al.,

2003; Ramig, 2004). Symptoms of rotavirus infection reflect the balance between host

resistance factors and viral virulence.

Scientific investigation has shown that certain lactic acid bacteria, including

bifidobacteria, can reduce the severity of rotavirus infections in humans and animals (Gill,

2003; Servin, 2004). In clinical trials, feeding of certain probiotic strains has been reported to

reduce the duration, severity, incidence (or combinations thereof) of infantile diarrhea

(Saavedra et al., 1994; Guarino et al., 1997). Phuapradit et al. (1999) have demonstrated that

Bifidobacterium Bb12, a widely known and well documented probiotic strain, protects infants

and young children from symptomatic rotavirus infection. These effects suggest a range of

mechanisms, including competition for attachment sites and stimulation of the immune system.

The mechanisms of action of probiotic bacteria against rotavirus infection have been studied in

most cases using animal models such as piglets and adult mice (Duffy et al., 1994;

Shu et al., 2001; Qiao et al., 2002). The main disadvantage of using these models is the

inability of human rotavirus to replicate efficiently in animals. One alternative approach is to

use of seven to thirteen-day-old suckling mice with heterologous rotavirus strains, which

124

appears to provide a useful model of rotavirus-induced gastroenteritis. Ramig et al. (1988) have

demonstrated that simian rotavirus SA-11 can effectively infect and replicate in the intestine of

nine-day-old suckling mice and cause gastroenteritis, while other rotaviruses appear to replicate

only to a very limited degree or not at all and produce minimal or no disease. The heterologous

virus model has proven useful especially for studying protection against the disease.

We have recently identified and characterized a new strain of Bifidobacterium isolated

from newborn infants as B. thermophilum based on in vitro selection criteria

(Touré et al., 2003; von Ah et al., 2007). This strain has shown ability to survive simulated

gastrointestinal tract conditions, making it of interest as a potential probiotic bacterium.

We have also shown that it has a strong tendency to attach to Caco-2 and HT-29 cells and is

thereby able to decrease the attachment of human rotavirus to these intestinal cell lines by 98%

(Gagnon et al., 2007). In the present study, we aim to evaluate the potential of this

bifidobacterial strain to modulate the immune response and reduce the severity of a nonmurine

rotaviral infection in suckling CD1 mice.


6.4.1 Animals

Timed pregnant CD-1 mice, obtained from Charles River (St-Constant, Québec,

Canada) were fed standard laboratory rodent chow (Charles River Laboratories, Wilmington,

MA), provided with water ad libitum and kept in a temperature-controlled environment

(22 ± 2°C) with a 12 h light/dark cycle. Each dam and its litter was housed in a micro-isolator

cage (Lab Products, Seaford, DE) kept in a cage ventilation rack (Lab Products) that provided a

unidirectional flow of filtered air over the cage hoods. All dams were rotavirus antibody

negative as measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA, described below).

The experiments were performed with the approval of our institutional animal care committee

and animals were cared for and handled in conformity with the Canadian Guide for the Care

and Use of Laboratory Animals (Canadian Council on Animal Care, 1993).

125

6.4.2 Cell and viral culture

MA-104 cells (ATCC CRL-2378.1, from rhesus monkey kidney) obtained from the

American Type Culture Collection (Rockville, MD) were cultured as monolayer in 75-cm2

flasks (Falcon, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) in Eagle’s minimal

essential medium (MEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mM

L-glutamine, 1% nonessential amino acids, 1% N-2-hydroxyethylpiperazine-N′-2-

ethanesulfonic acid (HEPES) buffer, 0.1125% sodium bicarbonate, 1% antibiotic solution

(100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin) at 37°C in a 5% CO2 atmosphere (all medium

components Gibco brand, Invitrogen, Burlington, Ontario, Canada). For viral infection assays,

MA-104 cells were seeded in 6-well tissue culture plates (9.6 cm2/well; Falcon, Becton

Dickinson and Company, Franklin Lake, NJ) at a concentration of 4.7×104 cells per cm2.

Simian rotavirus strain SA-11 (ATCC VR-1565) was propagated and assayed in

MA-104 cells as described by Ramia and Sattar (1979), with some modifications. Prior to

infection, virus suspension was activated with 16 µg/ml of porcine trypsin (Sigma Chemical

Co., St. Louis, MO) for 30 min at room temperature. Cell monolayer grown overnight in 6-well

tissue culture plates was thoroughly washed with sterile phosphate-buffered saline (PBS) to

remove all traces of serum. Each monolayer then received 100 µl of serial 10-fold dilutions of

viral suspension in MEM without FBS and viruses were allowed to adsorb for 60 min at 37ºC

in the presence of 5% CO2. An overlay medium (2 ml) consisting of equal parts of MEM

supplemented with 4% FBS and 1.2% agarose type II (Sigma) plus trypsin at a final

concentration of 6.5 µg/ml was then added to each well. Plates were incubated for 3 days at

37ºC (5% CO2), monolayer was fixed in 3.7% (v/v) formaldehyde and stained with 0.1% (w/v)

aqueous crystal violet solution to reveal plaque lysis resulting from the cytopathic effect.

6.4.3 Bacterial strain and growth conditions

The strain of Bifidobacterium used in this study, RBL67, was previously isolated from

fecal sample from a 1-week-old breast-fed infant by Touré et al. (2003) and genetically

identified as Bifidobacterium thermophilum (GenBank accession no. DQ340558)

(von Ah et al., 2007; Moroni et al., 2006). The strain was maintained as 20% glycerol stock at

126

−80ºC and reactivated in De Man-Rogosa-Sharpe (MRS) broth obtained from Rosell Institute

Inc. (Montréal, Québec, Canada) supplemented with 0.05% (w/v) L-cysteine-hydrochloride

(Sigma) and incubated at 37°C for 18 h in jars using an anaerobic atmosphere generation

system (AnaeroGen, Oxoid Ltd., Basingstoke, Hampshire, England).

6.4.4 Feeding and viral challenge of suckling mice

Three experimental repetitions were done using pups from the litters of fifteen dams

(ten to fourteen pups per litter, total n = 189). Dams and their litters were randomly assigned to

one of the following five treatment groups:

(a) Control group: Not given bifidobacteria, Not challenged.

(b) Infected group: Not given bifidobacteria, Challenged with rotavirus at 9 day-old.

(c) Non infected + feeding group: Given bifidobacteria from 3 to 9 day-old,

Not challenged.

(d) Pre-infection feeding group: Given bifidobacteria from 3 to 9 day-old, Challenged

with rotavirus at 9 day-old.

(e) Post-infection feeding group: Given bifidobacteria from 9 to 15 day-old, Challenged

with rotavirus at 9 day-old.

Bifidobacterial strain RBL67 was given orally at a daily dose of 1×109 CFU in 20 µl of

PBS while a single dose of 1.6×104 PFU of simian rotavirus in 20 µl of PBS with 10% blue

food coloring (McCormick Co., London, Ontario, Canada) added as a tracer. Virus inocula

were not trypsin-activated prior to inoculation and the titer of virus in each inoculum was

verified by titration. Control animals received 20 µl of PBS. After each feeding and

challenging, the pups were returned to their mothers and allowed to suckle. Over the course of

experiment, the animals were observed daily for activity level and their body weight was

measured and expressed as average for each group. Mice were sacrificed for analyses as

described below at 0.5, 3, 6, 24, 30, 48, 54 and 72 hours after challenge, as well as 4, 7 and 14

days after challenge.

127

6.4.5 Determination of rotavirus in intestines

All mice were observed for external signs of disease (diarrhea, dehydration) and

one pup per group was sacrificed by intraperitoneal injection of 0.01 ml/g of a

ketamine/xylazine (respectively 15 mg/ml and 1 mg/ml) mixture. The small and large intestine

was removed aseptically, weighed and placed in 1.0 ml of PBS and homogenized with an Ultra-

Turrax (Janke and Kunkel, Staufen, Germany) on ice for 15 s at 13,500 rpm and 5% antibiotic

solution was added to the homogenate. The suspension was centrifuged at 13,500 rpm for 5 min

to remove debris and frozen at -20ºC before analysis. The presence of rotavirus in the

homogenates was determined by plaque formation on confluent MA-104 cell monolayer as

described above. The limit of detection of rotavirus in the intestinal homogenates is generally

500 PFU/ml.

6.4.6 Bacterial counts

Aliquots of intestinal homogenate (without antibiotics) were diluted in sterile PBS

containing 0.5 g of L-cysteine/liter. Serial 10-fold dilutions of intestinal suspension were then

plated in duplicate on Beerens selective agar (Beerens, 1990) and plates were incubated at 37ºC

for 72 h under anaerobic conditions using an atmosphere generation system (AnaeroGen, Oxoid

Ltd., Basingstoke, Hampshire, England). Anaerobic isolates were confirmed by Gram staining

to be Gram-positive rods and were further identified using API 50CH galleries (BioMérieux,

Montréal, Québec, Canada), according to the manufacturer’s instructions.

6.4.7 Histology

Sections of colon were fixed in PBS containing 4% (w/v) paraformaldehyde (TAAB,

Callera Park, Aldermaston Berks, England), embedded in paraffin, cut into 5 µm slices using a

microtome (Model 2040, Reichert-Jung, Vienna, Austria) and stained with hematoxylin and

eosin (H&E). The morphology of the epithelium was examined using a light microscope (Leica

Microsystems, Richmond Hill, Ontario, Canada) and image were acquired by a Hyper HAD

camera (Sony Ltd., Willowdale, Ontario, Canada) and Image Matrox Inspector software 3.1

(Matrox Electronic Systems Ltd., Dorval, Québec, Canada).

128

6.4.8 Antibody production

The levels of rotavirus-specific secretory IgA in intestinal samples were determined by

ELISA by a protocol similar to that described by Gagnon et al. (2006). Briefly, 96-well

Immulon II microplates (Thermo LabSystems, Franklin, MA) were coated overnight at 4ºC

with a solution (100 µl/well) containing rotavirus SA-11 at a concentration of 8×105 PFU/ml in

2% (v/v) formaldehyde-PBS solution. Microplates were washed four times with sterile PBS

containing 0.1% (v/v) Tween-20 (PBS-T) and then blocked for 1 h at 25ºC under agitation with

3% (w/v) bovine serum albumin fraction V (BSA, Sigma). After four additional washes with

PBS-T, samples of intestinal homogenate (500 mg/ml) centrifuged at 13,000 × g for 5 min and

diluted 1:10 were added in serial two-fold dilutions in PBS-T plus 0.5% (w/v) BSA and the

microplates were then held for 2 h at 37ºC. After incubation, microplates were washed four

times with PBS-T and peroxydase-labeled goat anti-mouse IgA (α-chain specific, Kirkegaard

and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), diluted 1:500 in PBS-T plus 0.5% (w/v) BSA was

added and incubated for 1 h at 37ºC. After washing, 100 µl of the standard solution of

O-phenylenediamine (OPD, Sigma) dissolved in phosphate citrate buffer (pH 5.0) in the

presence of H2O2, was added to each well and plates were held for 15 min at room temperature.

Optical densities were measured at 450 nm on a Thermomax microplate reader

(Molecular Devices, Opti-Ressources, Charny, Québec, Canada).

Rotavirus-specific IgG and IgM in serum samples obtained by centrifuging cardiac

blood from individual mice at 4,000×g for 10 min at 4ºC were detected in serial three-fold

dilutions of serum diluted 1:10 (in PBS-T plus 0.5% (w/v) BSA) using a protocol similar to the

one for IgA with some modifications. Briefly, plates coated with 8×105 PFU/ml of rotavirus

SA-11 were blocked with 3% (v/v) BSA. Specific IgG and IgM were detected by using

peroxidase-conjugated goat anti-mouse (H+L) (Kirkegaard and Perry Laboratories) diluted

1:1000, followed by addition of the OPD-H2O2 substrate. After 15 min of reaction, optical

densities were measured at 450 nm. Intestinal fluid and sera from non infected and not

Bifidobacterium-fed mice were used as negative controls on each plate. Titers were calculated

as log10 (1/Dc) where the cutoff dilution (Dc) was the dilution yielding twice the absorbance of

the negative controls. Results are expressed as the mean of three mice ± the standard error of

the mean (SEM) for the corresponding treatment group.

129


Significant differences between treatments were tested by analysis of variance using

JMP IN software (SAS Institute, version 4, Cary, NC, USA). Treatment comparisons were

performed for rotavirus titers, body weights and antibody titers using Student’s t test. A P value

of < 0.05 was considered significant.

6.5 Results

6.5.1 Clinical outcome

The onset of diarrhea in the infected group (group b) occurred between 24 and 30 h

after infection, with symptoms generally maximal at 54 h and persisting for 18 additional hours

before waning. In contrast, the onset of diarrhea illness in the pre-infection feeding group

(group d) occurred near 48 h after challenge, while in the post-infection feeding group

(group e), the onset of diarrhea was observed between 30 and 48 h thereafter. Recovery began

earlier in the pre-infection feeding group (group d) than in the infected group (group b) and

post-infection feeding group (group e). Reduced activity was also observed in infected animal

groups during the 7-day post-infection. The body weights of the five groups of mice are shown

in Figure 6.1.

Figure 6.1 : Body weights of the five groups of mice during the week following challenge with rotavirus (means ± SEM, n > 30).

130 Comparison of growth curves showed that no weight loss occurs within the five groups

during the experiment but a significant (P < 0.01) delay in weight gain was observed from 24 to

96 h post-infection between the group a and group b mice. The pre-infection feeding mice

(group d) have shown significantly (P < 0.01) delayed weight gain compared to controls at 24 h

post-infection, whereas the post-infection feeding mice (group e) remained significantly smaller

than control mice throughout 72 h post-infection. From 48 to 144 h post-challenge, the group

fed bifidobacteria before challenge had significantly higher body weight than the infected

group (P < 0.05), while the body weights of the infected and post-infection feeding group did

not differ significantly (P < 0.05).

6.5.2 Bifidobacterial counts in mouse intestines

Figure 6.2 shows that bifidobacteria were detected in intestines of the mice at levels

reaching approximately 108 CFU/g intestine when fed for seven days before challenge.

However, the number decreased to 104 CFU/g 72 h after the last bifidobacterial dose. When fed

after challenge with the pathogen, the bifidobacterial population reached nearly 107 CFU/g and

then dropped to about 106 CFU/g within 72 h.

Figure 6.2 : Viable bifidobacteria in the intestines of suckling CD-1 mice fed B. thermophilum for seven days (means ± SEM, n = 3).

131

6.5.3 Rotavirus counts in mouse intestines

The mean rotavirus counts in the intestinal homogenate of the challenged mice are

shown in Figure 6.3. In the infected mice (group b), the virus concentration dropped by nearly

0.5 log10 cycle during the three hours post-infection. In the period from 3-30 h post-infection,

there was an increase in viral concentration followed by a decline in the titer of infectious virus

until 72 h post-infection. Virus was also detected in the intestinal homogenates in mice given

bifidobacteria before or after challenge with rotavirus, but the increase after the initial drop

noted after 3 h was slower and maximal log counts were significantly lower (P < 0.05) than in

the infected mice of group b (respectively 3.28 and 4.63 vs 5.49). The rotavirus titer decreased

more rapidly during the 48-72 h period in the group fed bifidobacteria before challenge than in

the group fed after challenge.

Figure 6.3 : Content of infectious rotavirus SA-11 in the intestines of suckling CD-1 mice after challenge. Titers of virus in the combined small and large intestine were determined at various times post-infection by plaque assay. Data are means ± SEM for three mice per group. (*) P < 0.05 vs infected group; (**) P < 0.01 vs infected group.

6.5.4 Histological lesions in mouse intestines during rotavirus infection

Examination of H&E-stained sections of colon showed evidence of infection with

rotavirus at 48, 54 or 72 h post-challenge in infected mice (group b) compared to control mice

(group a) (Figure 6.4). Fluid accumulated in the intestine was observed at necropsy and dilated

colons with deletion of villi are visible in the micrographs. Sections of colon from mice fed

132

bifidobacteria before challenge showed little evidence of infection, with shortened villi at 6 and

48 h post-challenge followed by a return to virtually normal appearance by 54 h post-challenge.

In contrast, no destruction of enterocytes was observed for up to 48 h in the colons of mice fed

bifidobacteria after challenge but evidence of infection was present by 54 to 72 h post-

challenge. Sections of colon from the non infected group fed bifidobacteria (group c) appeared

similar to those of control mice.

Figure 6.4 : Hematoxylin and eosin-stained cross-sections of the colons of suckling CD-1 mice at different times post-infection (PI) with rotavirus SA-11 (magnification, ×40).

Infected Pre-infection feeding Post-infection feeding

6 h PI

48 h PI

54 h PI

72 h PI

Controls

0.5 h PI

133

6.5.5 Antibody responses to rotavirus

Post-challenge titers of secretory anti-rotavirus-specific IgA are shown in Figure 6.5A.

Feeding bifidobacteria either before or after challenge did not produce an IgA response

different from that obtained for infected mice (group b). In contrast, significantly higher

(P < 0.01) anti-rotavirus-specific IgG and IgM were obtained one week after challenge in mice

fed bifidobacteria before challenge (group d) than in infected mice (group b) (Figure 6.5B).

Two week after challenge with rotavirus, mice fed bifidobacteria after challenge (group e) had

significantly (P < 0.01) higher IgG and IgM titers than infected mice (group b). No significant

differences were observed between control mice (group a) and non infected mice fed

bifidobacteria (group c).

Figure 6.5 : Specific immunoglobulin production in suckling CD-1 mice after challenge with rotavirus SA-11. (A) IgA in the intestinal homogenate; (B) Serum IgG and IgM (means ± SEM, n = 3; ** significantly different, P < 0.01).

Serum IgG + IgM

0

1

2

3

4

Noninfected+ feeding



Ant

i-rot

aviru

s tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 7

Day 14**

**

Serum IgG + IgM

0

1

2

3

4




Ant

i-rot

aviru

s tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 7

Day 14****

****

B

A Secretory IgA

0

0,4

0,8

1,2

1,6




Ant

i-rot

aviru

s tit

ers

(OD

450

nm

)

Day 4Day 7

134

6.6 Discussion

The results of the present study provide evidence that daily feeding of B. thermophilum

is effective in altering the course of rotavirus gastroenteritis in suckling mice. In particular, the

group fed bifidobacteria prior to challenge with rotavirus displayed low incidence of diarrhea

and lower numbers of intestinal rotavirus compared to the infected litters challenged with

rotavirus SA-11 (P < 0.05). Moreover, mice fed bifidobacteria for one week prior to challenge

with rotavirus showed little evidence of deletion of villi. Previous studies in experimental

animals have indicated that some commercial bifidobacteria strains can increase resistance to

rotavirus infection (Duffy et al., 1994; Yasui et al., 1999; Qiao et al., 2002). However, none

have examined the impact of a human bifidobacterial strain before and after challenge with a

rotavirus. To our knowledge, this is the first report of a bifidobacterial strain isolated from

newborn feces with a prophylactic effect against rotavirus infection in a neonatal mouse model.

Several mechanisms have been proposed to explain enhanced resistance to microbial

gastrointestinal pathogens conferred by probiotic strains, including intermicrobial competition

for intestinal attachment sites, production of microbicidal substances, enhancement of

protective immune responses and reductions in host intestinal permeability (Servin, 2004).

However, few in vivo studies have investigated the mechanisms by which the bifidobacteria

produce antiviral effects. Although the exact mechanism is unclear, our previous study

(Gagnon et al., 2007) indicates that bifidobacteria limit the attachment of rotavirus to intestinal

epithelial cells. This effect would be due to the ability of bifidobacteria to bind to glycoprotein

cell receptors and thereby create steric hindrance to viral attachment. Duffy et al. (1994) has

suggested that binding of ingested B. bifidum strain to intestinal epithelial cells affected

attachment and hence replication and shedding of a murine rotavirus in BALB/c mice.

Nevertheless, we have shown that even small numbers of virus are able to infect the intestinal

cells of suckling mice. However, an immunological reaction could be involved in the protective

effect of bifidobacteria against rotavirus infection. Qiao et al. (2002) have suggested that

bifidobacteria act as an adjuvant by stimulating early mucosal and strong humoral rotavirus-

specific immune responses. In contrast with their findings, we did not observe an increased

secretory IgA response in mice fed bifidobacteria but did note a significantly higher humoral

response. O’Neal et al. (2000) have suggested that intestinal IgA is not essential for protection

135

against rotavirus infection and that in the absence of IgA, IgG may play a significant role in

protection against mucosal pathogens. This may explain in part protection obtained in the group

fed bifidobacteria before challenge even though IgA titers were low. The higher serum IgG and

IgM level in these mice than in infected mice one week after challenge may have contributed to

bringing the infection under control more rapidly. However, direct study will be needed to

determine whether B. thermophilum RBL67 is a mucosally active adjuvant in the gut

epithelium.

Suckling mice are an ideal small animal model for studying the physiological

characteristics and disease associated with rotavirus infection (Offit, 1984; Ramig, 1988;

Kubelka et al., 1994) and has proven useful in the study of new ways of protecting against

rotavirus infection. Unlike humans, mice do not harbour bifidobacteria, which facilitates

monitoring of probiotic bifidobacteria introduced into mice and evaluation of their survival in

the mouse gastrointestinal tract. The bifidobacteria isolated from the intestines of suckling mice

on Beerens agar produced characteristic microcolonies which may all presumed to be

B. thermophilum RBL67 provided by feeding. This strain was recovered in high numbers from

the intestinal contents of the mice and therefore has high resistance to gastrointestinal tract

conditions. The viability of probiotic strains is considered important for ensuring their optimal

functionality. After oral administration, these bacteria must overcome two main biological

barriers, the acidic environment of the stomach and bile secreted in the duodenum (Gueimonde

and Salminen, 2006). This property meets the criteria recently proposed by the Food and

Agriculture Organization of the United Nations and the World Health Organization, which have

defined guidelines for evaluating probiotics for food use (FAO/WHO, 2002). These guidelines

also mention that the safety of probiotics should be evaluated in vivo, since they are viable

organisms and could therefore cause side-effects. In the present study, daily supplementation

with B. thermophilum did not produce any obvious adverse or toxic effects, the non-infected

group so treated being comparable to the control mice in every aspect observed.

Nevertheless, our results indicate that administering bifidobacteria after challenge with

rotavirus has little impact on the evolution of the infection. The duration of diarrhea in the

group so treated was longer than the group fed bifidobacteria before challenge. Viral shedding

136

in the intestinal epithelium of the group fed bifidobacteria after challenge was high. However,

in this group, the onset of diarrhea was delayed by 24 h compared to the infected group.

6.7 Conclusions

The experimental findings reported in this study indicate that B. thermophilum RBL67,

a Bifidobacterium of human origin, is active against rotaviral infection and reduces the severity

of the diarrhea associated with this infection. This effect was maximal when probiotic feeding

took place before infection, as demonstrated by shorter diarrheal episode, lower numbers of

virus detected in the intestines and less histological damage to the intestines of the mice.

However, these results need to be verified in other in vivo models before this Bifidobacterium

may be tested in human clinical trials.


This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Research Council of

Canada (NSERC). We thank Julie Jean for providing the rotavirus SA-11 strain; Mélanie

Pelletier, Julie Brassard and Brigitte Dubé for skilled assistance during animal procedures and

Sylvie Roy for the histologic preparation.

137

Chapitre 7. Conclusion générale

Les infections entériques constituent actuellement un des problèmes majeurs dans le

domaine de la santé au niveau mondial. Le manque de vaccins effectifs et l’émergence de

micro-organismes résistants aux antibiotiques ont stimulé la recherche de méthodes alternatives

pour contôler ces infections. Des études cliniques récentes ont fourni des évidences sans

équivoque que la consommation de certaines souches probiotiques peut être efficace dans la

prévention en diminuant l’incidence des diarrhées et/ou dans le traitement en affectant la durée

et la sévérité des diarrhées lors d’infections entériques. Cependant, les mécanismes d’actions

impliqués sont encore méconnus.

Ce travail de doctorat avait pour objectif principal d’évaluer le potentiel de souches de

bifidobactéries d’origine humaine à prévenir et à contrôler les infections entériques

bactériennes et virales. Pour atteindre cet objectif, nous avons adopté une démarche intègrant

des modèles in vitro et in vivo, qui sont des approches logiques permettant d’évaluer le rôle

qu’ont ces bactéries probiotiques contre des entéropathogènes bactériens et viraux. Cette

démarche tient compte également des lignes directrices proposées par la FAO/WHO (2002)

pour l’évaluation des probiotiques et de leurs effets bénéfiques sur la santé. Ainsi, deux

modèles d’infection ont été utilisés: l’un à E. coli O157:H7, l’autre à rotavirus. Cette étude

visait également à identifier et caractériser les mécanismes d’action par lesquels les

probiotiques peuvent contribuer à la défense antimicrobienne de l’hôte.

L’effet de cinq souches de bifidobactéries d’origine humaine sur l’inhibition de la

souche E. coli O157:H7 a été étudié dans un modèle cellulaire intestinal (Chapitre 2). Une

meilleure inhibition de l’adhésion de la souche pathogène a été obtenue avec la souche

B. thermacidophilum RBL71 ayant préalablement été sélectionnée pour ses fortes

caractéristiques probiotiques (résistance aux conditions digestives, adhésion élevée aux cellules

intestinales). Cette souche qui a été administrée oralement à des souris BALB/c infectées avec

E. coli O157:H7, atténue les symptômes d’infection (Chapitre 3). Particulièrement, les souris

gavées avec la souche probiotique durant une semaine avant l’infection ont eu des signes

cliniques d’infection modérés par rapport au groupe de souris infectés seulement. Un modèle

138

in vitro d’infection virale a ensuite été développé (Chapitre 4). Parmi les trois virus entériques

utilisés, les rotavirus ont été sélectionnés pour la suite du projet. L’effet anti-viral de trois

souches de bifidobactéries humaines a été évalué à l’aide d’un test de compétition in vitro

(Chapitre 5). La présence de la souche B. thermophilum RBL67 a significativement diminué

l’attachement du rotavirus aux entérocytes lorsqu’ajouté avant le pathogène viral. Enfin, la

souche RBL67 qui a été administrée une semaine avant l’infection des souriceaux CD-1 au

rotavirus, a réduit la sévérité de la diarrhée comparé aux souriceaux infectés avec le pathogène

seulement (Chapitre 6).

L’ensemble des résultats nous a permis de confirmer notre hypothèse initiale. En effet,

de nouvelles souches de bifidobactéries d’origine humaine ayant subi une sélection rigoureuse

ont démontré un effet antagoniste contre E. coli O157:H7 et rotavirus à travers des modèles

in vitro et in vivo. Toutefois, les mécanismes d’action impliqués n’étaient pas les mêmes. Dans

le cas du modèle bactérien in vitro, des mécanismes impliquant la compétition d’adhésion sur

les entérocytes ont été démontrés. De plus, l’utilisation de souches acidifiantes produisant des

substances antimicrobiennes de nature protéique a permis de diminuer l’infection par E. coli

O157:H7. Dans le modèle in vivo d’infection à E. coli O157:H7, une augmentation de la

réponse spécifique en IgA, IgG et IgM anti-E. coli O157:H7 a possiblement contribué à

diminuer les symptômes d’infection. En comparaison, dans le modèle viral in vitro, un blocage

des récepteurs cellulaires (glycoprotéines) pourrait expliquer la diminution de l’attachement des

rotavirus. Ce phénomène est probablement possible de façon in vivo de même que

l’augmentation des IgG et IgM spécifiques aux rotavirus dans le sérum. Par contre, il est

étonnant de constater qu’aucune augmentation significative des IgA spécifiques au niveau des

muqueuses n’a été détectée.

L’originalité de ce travail, réside dans l’utilisation de souches de bifidobactéries isolées

chez des nouveaux-nés contre des entéropathogènes fréquemment en cause chez l’humain. En

effet, cette thèse représente la première étude sur l’efficacité de souches de bifidobactéries

humaines pour contrer une infection à E. coli O157:H7 et rotavirus. Les résultats de ce projet

de doctorat contribuent de façon significative à l’avancée du rôle positif des bifidobactéries en

apportant de nouvelles connaissances sur leur action antimicrobienne contre des

entéropathogènes et sur leurs mécanismes d’action. Nous avons clairement démontré que les

139

souches B. thermacidophilum RBL71 et B. thermophilum RBL67 ont participé à

l’augmentation de la défense de l’hôte face aux infections entériques bactérienne et virale. De

plus, nous avons trouvé que leur action antimicrobienne était significativement supérieure

lorsque ces bifidobactéries étaient données avant l’infection.

En perspective, nos travaux ouvrent la voie à un grand nombre d’investigations. En

effet, il serait intéressant d’approfondir le mécanisme d’action quant à la stimulation du

système immunitaire par les bifidobactéries à fort potentiel probiotique. Ceci nous permettrait

d’établir hors de tout doute l’effet adjuvant possible avec les bifidobactéries testées.

D’autres études pourraient également être réalisées pour évaluer l’impact de l’ajout de

bifidobactéries transitoires sur le microbiote intestinal résident. Ceci pourrait être évalué par la

quantification des principaux genres bactériens qui se trouvent dans les intestins.

Enfin, le développement de tests à l’aide d’outils génomiques pourrait être mis de

l’avant pour aider à la sélection rapide et efficace des bifidobactéries à caractère probiotique.

Ce travail aura donc permis d’améliorer nos connaissances sur le rôle des probiotiques

dans la prévention des infections entériques et de mieux comprendre les mécanismes impliqués.

Toutefois, d’autres travaux in vivo ainsi que des études cliniques seront nécessaires afin de

compléter la démonstration de l’efficacité des traitements probiotiques. L’utilisation des

bifidobactéries à fort potentiel probiotique constituera alors un moyen peu coûteux et sans effet

secondaire pour lutter contre les infections entériques chez les populations sensibles telles que

les nourrissons, les enfants et les personnes âgées.

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