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Béryl Laplace-Builhé Groupe Farida Djouad “Cellules souches, Blastème et Régénération” IRMB - INSERM U1183 Régénération : leçon de l’embryologie
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Béryl Laplace-Builhé
Groupe Farida Djouad “Cellules souches, Blastème et Régénération”
IRMB - INSERM U1183
Régénération : leçon de l’embryologie
Les lesions du cartilage articulaire sont permanentes
Le cartilage n’est ni innervé ni vascularisé
Le cartilage possède une capacité très limitée de régénération
Arthrose
Inflammation
Dégradation
du cartilage
arthroseArticulation
normale
Immunothérapies
Inflammation
Dégradation du
cartilage
Ingénierie tissulaire
Arthrose
arthroseArticulation
normale
Cellules souches mésenchymateuses (CSM)
CSM
Differentiation
AdipocyteOsteocyte
Chondrocyte
Immunosuppression
CSM
Lymphocyte TDC
Bone marrowCartilage Synovial Dental pulpMuscle Tonsil Fat placenta Umbilical cord Thymus
Différenciation: état des connaissances
La chondrogenèse est un processus en plusieurs étapes:-formation des condensations mésenchymateuses
-différenciation des CSM en chondrocytes
-maturation en chondrocytes hypertrophiques et calcification
IGF1
BMP2,4,7,14
FGF2,FGFR2
Sox9,5,6Ihh/Ptc/PTHrP
BMP2,7,
FGF18,FGFR3
Stat1, Gli3,2
Runx2, Fra2/JunD
Hypertrophic
Cartilage hypertrophique
Cartilage mature
Chondrocyte
Chondroprogeniteur
proliferation
Matrix
synthesis
calcification
VEGF,
FGF2,FGFR1
Wnt14/catenin
Runx2, Ostérix
TGF, Shh
BMP2,4,7
FGF2,4,8,
10
Wnt3A,7A
Sox9, Gli3
HoxA, HoxD
differentiation
CSM
Chez l’adulte, besoin d’identifier des facteurs qui régulent la différenciation
et l’hypertrophie
Environnement: état des connaissances
Les capacités de différenciation adipogénique des CSM sont inhibées
en présence du TNF- (Suzawa et al., 2003)
Les capacités de différenciation chondrogénique et adipogénique des
CSM sont diminuées chez les patients arthrosiques (Murphy et al., Arthr.
Rheum., 2002)
Rôle de l’environnement inflammatoire sur le
potentiel chondrogénique des CSM?
Potentiel de différenciation des CSM dans un environnement inflammatoire
Environnement: résultats
Le TNFα inhibe la capacité des CSM à se différencier en
chondrocytes et en ostéoblastes
C9
C9
-TN
Fα
MSC based-therapy
Wang et al. Nature Immun. 2014
Cell empowerment
Cell replacement
Anti-inflammatory MSCPro-inflammatory MSC
EffectorT cells TNF
IFN-ɣIL-17IL-1
TGF-β EffectorT cells
MSC
PGE2, IL6, NO, IDO, chemokines
Tregcells
MSC polarization
CSM
Inflammation et TNF
Différenciation
Ingénierie du cartilage
Environnement
Immunosuppression
anti-inflammation
Immunothérapie de la PR
Inflammation
Dégradation du
cartilage
Mécanismes
d’immunosuppression
Facteur
chondrogénique
Appendage amputation outcomes in vertebrates
Regeneration
HHMI
Tissue repair
Regeneration process
Morphallaxis (morphallactic regeneration): occurs in absence of cellproliferation, e.g., hydra
Epimorphosis (epimorphic regeneration): requires cell divisions
-Non-blastemal based regeneration (compensatory regeneration): limiteddedifferentiation and proliferation of the surviving cells in the organ after
injury or amputation (e.g., liver regeneration in mammals, heartregeneration in salamander)
- Blastemal based regeneration:
La régénération est considérée de manière ambiguë par lesbiologiste du développement
La régénération est considérée comme un évènement différentdu développement ou comme un épiphénomène desmécanismes développementaux
Ces deux évènements sont considérés différents car larégénération est souvent étudiée chez l’adulte
Régénération versus développement
Premier niveau:
les mécanismes cellulaires spécifiques
de la régénération
Tissue injury
Scar free wound healingRegeneration scarring
INFLAMMATORY RESPONSE
Second niveau:
les mécanismes génétiques et
moléculaires spécifiques de la
régénération
La régénération du membre de la salamandre requiert la protéine nAGproduites par les cellules de Schwann, protéines qui ne sont pasrequises pour le développement initial du membre (Kumar et al., 2007)
Les gènes Hox (HoxC10 notamment) sont différenciellement exprimésdurant le développement et la régénération du membre de lasalamandre
FGF20a est important pour la régénération chez le zebrafish adulte maisn’est pas requis pour la formation initiale de la nageoire (Whitehead etal., 2005)
L’expression du microRNA-133 doit être réprimé pour permettre larégénération de la nageoire du zebrafish adulte – un tel rôle n’a pas étédémontré durant le développement de la nageoire (Yin et al., 2008)
Régénération du membre chez la salamandre
Il y a des différences significatives entre les processus de régénérationchez l’animal adulte et le développement dans les phases précoces de lavie.
Quel est le lien entre la régénération et le développement: uneréactivation?
Nous avons toujours besoin de plus d’études comparatives de ces 2processus – e.g. comparaison du processus de régénération au stadeembryonnaire avec le développement.
Zebrafish larvae and mouse embryos: as models to study
regeneration
AmputationImmune cell recruitment Blastema Regeneration
Larvae (3dpf) 1-12hpA 12-24hpA 3 dpA
Ex vivo culture of mouse embryos
E10.5 Chan et al., 1991
6H 24H0HE10.5
Which cells and environmental signals are involved in blastema formation
• Macrophages• Inflammation
Which cells are at the origins of the blastema:
• Neural crest cells• Mesenchymal cells
Hypothesis
Which cells and environmental signals are involved in blastema formation
• Macrophages• Inflammation
Which cells are at the origins of the blastema:
• Neural crest cells• Mesenchymal cells
Hypothesis
Tissue injury
Scar free wound healingRegeneration scarring
INFLAMMATORY RESPONSE
Chevalier, X. et al. (2013) Nat. Rev. Rheum.
Role of the synovial macrophages in driving
inflammatory and destructive response in osteoarthritis
Depletion of synovial macrophages resulted in a reduction of osteophytes and ameliorates fibrosis and synovial activation (Blom et al. OAC 2004)
State of the art
2013
2012
2011
2014
PNAS, 2013
Crucial role of macrophages for appendage regeneration
Immune response in regenerative species
Xenopus
Early development (stage 53)
Regeneration
Inflammation markers
Blastemalmarkers
Mescher et al, 2013
Late development (stage 57)
No Regeneration
Inflammation markers
Blastemalmarkers
Permissive environment
Regeneration
Non inflammatoryPro Inflammatory
Pro Inflammatory
Non-permissive environment
Scar formation
Non inflammatory
Hypothesis
Do M1/M2 macrophage subtypes exist in regenerative species?
Modified from S. L. M. van Loon et al, 2012
Macrophage subsets in mammals
Zebrafish larvae caudal fin : model to study regeneration
AmputationImmune cell recruitment
Blastema Regeneration
Larve (3dpf) 1-12hpA 12-24hpA 3 dpA
Kawakami et al, 2004
dlx5aJunbjunbl
High conservation of immune cell lineages and effector functions
Genetic amenability
Optical clarity
1. Are macrophages required for fin regeneration in zebrafish larvae?
2. Does zebrafish have different subpopulation of macrophages?
3. Can Macrophages harbor different polarization phenotypes?
4. If so, what are their functions during regeneration?
Questions
TNF-α expressing macrophages are differentially recruited
during caudal fin regeneration
Kinetic of macrophage recruitment during regeneration
Nguyen Chi, Laplace-Builhe et al. eLife 2015
Morphology and behaviour of macrophage phenotypes
Macrophage subsets display different morphology andbehaviour in live zebrafish
tnfa:GFP-F; mpeg1:mCherryF
qRT-PCR Cell sorting by FACSRNA extraction
6hpA
Cell dissociation
Molecular signature of tnfa+ and tnfa- macrophage
populations
Macrophage molecular characterization reveals the conservationof macrophage subtypes between zebrafish and human
What are the roles of these populations duringcaudal fin regeneration?
Nguyen Chi, Laplace-Builhe et al. eLife 2015
M1-like and M2-like macrophage subtypes are differentially
recruited during caudal fin regeneration in zebrafish larvae
Mechanism of macrophage depletion using clodronate
liposomes in vivo
1- Liposome encapsulating clodronate are ingested by macrophages viaendocytosis
2- After fusion with lysosome containing phospholipases the latter disruptthe bilayers of the liposomes and the clodronate will be released into thecytoplasm of the cell
3-Les cellules sont tuées par le clodronate par apoptose
Depletion of early or late macrophages differentially
impairs fin regeneration
Macrophage mediated-TNFa signaling is required for
caudal fin regeneration
Macrophage mediated-TNFa signaling is required for
caudal fin regeneration
Macrophage mediated-TNFa signaling is required for caudal
fin regeneration
Macrophages migrate to the wound in parabiotic larvae
following caudal fin amputation
tnfr1 knock down in stromal cells impairs fin regeneration
Tnfr1 is expressed by stromal cells and needed to mediatemacrophage-induced tnfa-dependent caudal fin regeneration
TNF signalling and macrophages govern fin regeneration in zebrafish larvae
Nguyen Chi, Laplace-Builhé et al. Cell Death and Disease 2017
