Rétrovirologie appliquée au diagnostic et au suivi des patients en PED François Simon –...

Rtrovirologie applique au diagnostic et au suivi des patients en PED Franois Simon Constance Delaugerre Service de Microbiologie Service de Microbiologie CHU saint Louis Paris 75475 cedex 10 [email protected] CHU Saint Louis Paris

RETROVIRIDAE Retroviridae : grande famille Associs de nombreuses pathologies incluant : vtumeurs dveloppement plus ou moins rapide vsyndrome neurologique vimmunodficience Tous les rtrovirus ont : une structure une organisation gnomique un mode de rplication similaires

Premire preuve du passage inter espces HIV-1 group N & SIVcpz -1998 env gag-pol virus retrouv uniquement au Cameroun particularit = virus recombinant entre VIH-1 groupe M (rgion Pol) et SIV cpz pour lenveloppe

Un nouveau VIH : passage entre les SIV du gorilles et lespce humaine le groupe P

Diversit du VIH HIV-1 4 groupes HIV-2 HIV-1 O HIV-1M HIV-1N A C virusmosaques B D (E) G H (I) J F A B C D E CRF01-AE* Plus de 40 formes recombinantes ou CRFs ou CRFs CRF04-cpx* K F H G A B CRF02 ? HIV-1 P

Groupe M = sous-types purs & formes recombinantes circulantes actuelles

Distribution gographique des sous-types et des formes recombinantes B B, F1, B/F, C B AG, A, G A, A/G, C, D, F1, F2 G, H, J, K, A/E, O, N C, A, D C B A/E, B B, B/C, A/E A, A/B, B, C

Impacts de la diversit gntique du VIH Diagnostic : dtection du VIH-0 mise en dfaut en 1994 Quantification : sous-quantification/non quantification de sous-types VIH-1 (2) (si CV basse ou indtectable en labsence de ttt, associe un taux de CD4 bas), VIH-2 Sensibilit aux antirtroviraux : Impact du polymorphisme du gne de la protase (5) Prdisposition gntique du sous-type C la rsistance lfavirenz (6), la nvirapine (7), au tnofovir (8) Transmissibilit : TME plus importante des sous-types D (9) Pas dimpact des sous-types sur la rponse au traitement (10, 11) Vaccination : reste lenjeu majeur !

Gnome et protines structurales enzymes Gnes Protines Prcurseurs macro-protines env tat nef rev tat LTR pol gag vif vpu vpr rev p160 p55 p68p31/34 p17 p24 gp120 gp41 gp160 enveloppe capside LTR

VIH - cycle de rplication - interaction GP120 et recepteur CD4 - interaction GP41 et membrane cellulaire fusion des membranes - ARN viral hybride ADN/ARN ADN Reverse transcriptase polymrase - intgration au gnome (intgrase): ADN proviral - activation transcription ADN proviral

Risque de transmission en fonction des stades de linfection Primo-infectionPhase asymptomatique SIDA 1/1000 1/10 000 1/25 1/50 1/1000 Galvin S, Cohen M Nat Rev Micro 2004

Quels sont les examens biologiques qui permettent de faire le diagnostic de linfection VIH-1 ? VIH-2 ?

Les moyens du diagnostic ELISA le plus souvent (en UE) combins ( de 4eme gnration dans lUE) : dtectent Antigne VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2 Tests dit rapides sont des dispostifs unitaires de ralisation simple sans apport de matriel et ne ncessitant pas de chaine du froid Western Blot confirment la prsence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2 LARN plasmatique signe la prsence dun VIH rplicatif partir des cellules infectes. Les tests dit de charge virale quantifie cette rplication en copie de virus par mL de plasma LADN proviral ou ADN intgr correspond la prsence du provirus dans les cellules infectes Les tests de rsistance recherchent la prsence de mutations du gnome VIH sous la pression des antirtroviraux

Cintiques des marqueurs de linfection Cunningham et al

Les moyens du diagnostic Les EIA combins ( de 4eme gnration dans lUE) : dtectent Antigne VIH et anticorps anti VIH1 & VIH2 Les tests dit rapides sont des dispositifs unitaires de ralisation simple sans apport de matriel et ne ncessitant pas de chaine du froid Les Western Blot confirment la prsence des anticorps anti VIH-1 ou VIH-2 LARN plasmatique signe la prsence dun VIH rplicatif partir des cellules infectes. Les tests dit de charge virale quantifie cette rplication en copie de virus par mL de plasma LADN proviral ou ADN intgr correspond la prsence du provirus dans les cellules infectes Les tests de rsistance recherchent la prsence de mutations du gnome VIH sous la pression des antirtroviraux

Nature de lantigne de capture des anticorps Virus entier purifi Protines virales natives ou recombinantes Peptides de synthse Dtection des anticorps Totaux (IgG + IgM) IgG ou IgM ELISA combine : dtecte anticorps et antigne Expression des rsultats Qualitatif (positif ; ngatif ; douteux) Quantitatif (titre) Diagnostic indirect : Srodiagnostic de dpistage ELISA

Microplaque ELISA : Les puits color s correspondent des positivit s Test ELISA indirect (Infection par le VIH)

Exemple dautomates EIA (VIH & hpatites et autres ) EIA 4me gnration Ag + Ac Architect Abbott Axym Abbott Vidas bioMrieux Microplaques Behring-Siemens

Tests de diagnostic rapide (TDR) : Utiliss depuis plus de 19 ans Contrles interne des tests Raction positive : Prsence possible danticorps anti VIH-1 C : bande contrle de bon fonctionnement du test T : bande de ractivit anti VIH c c T Test VIKIA VIH , bioMrieux Test Determine HIV 1-2, Inverness

western blot VIH-1 avec les poids molculaires des principaux antignes (New Lav blot 1, Biorad-Pasteur). la confirmation des infections par le Western Blot

Valeurs prdictives la sensibilit d'un test est sa capacit de donner un rsultat positif lorsque linfection est prsente. la spcificit est la capacit d'un test de donner un rsultat ngatif lorsque linfection n'est pas prsente. La valeur prdictive positive est la probabilit que le virus soit prsent lorsque le test est positif. La valeur prdictive ngative est la probabilit que le virus ne soit pas prsent lorsque le test est ngatif. La valeur prdictive est fonction de la sensibilit et de la spcificit du test ainsi que de la prvalence de la condition l'tude

Sensibilit, spcificit, valeur prdictive a reprsente le nombre d'individus malades avec un test positif (les vrais positifs), b reprsente le nombre d'individus non-malades avec un test positif (les faux positifs), c reprsente le nombre d'individus malades avec un test ngatif (les faux ngatifs), d reprsente le nombre d'individus non-malades avec un test ngatif (les vrais ngatifs) maladeNon malade Test + Test - ab cd sensibilit = a / (a + c) spcificit = d / (d + b VPP = a / (a + b) VPN = d / (c + d)

Anticorps anti Enveloppe ARN Annes Phases prcocesInfection chronique Ag p24 AC -p24 p34 Marqueurs molculaires et srologiques lors de linfection par VIH-1

Daprs Cunningham et al 2009 Tests rapides 4 gen EIA

VIH-2 sous type B VIH-2 sous type A WB HIV-1WB HIV-2

Principes gnraux des TDR Immuno-filtration ou immuno-chromatographie ligne contrle Ligne du test Conjug avec or colloidal +proteine A. Ac anti anticorps humain Antigene HIV-1/2 Or Colloidal Conjug la Proteine A AC Humains non HIV Ac HIV-1/2 Prlvement

Sang total : sang non dcant avec globules rouges et plasma, en gnral sang capillaire ou veineux non centrifug. Ne peut tre conserv Le papier filtre serait une alternative Contrle, biologie molculaire Srum ou plasma : recueil aprs centrifugation en milieu spcialis = utilisable pour tous les autres tests, idal pour conservation, traabilit Salive : recueil standardis entre gencive et lvre infrieur : liquide crviculaire ? Les matrices des TDR

TDR versus ELISA Les TDR actuels marqus CE et utiliss sur srum : - ne dtectent que les anticorps -tre considrs comme quivalents en terme de sensibilit en primo infection aux des tests ELISA de troisime gnration pour les meilleurs dentre eux -- difficilement valuable sur sang total /liquide crvicualaire pour les primo infections Les test TDR avec dtection antigne p24 et anticorps : - Marquage CE en 2009 - quivalent quatrime gnration ? - Difficilement valuable pour les primo infections

March mondial anarchique : > 80 tests, nombreux fabricants,vendeurs et revendeurs (voir du mme test !)

Des marquages FDA USA et CE UE diffrents (sauf OraQuick)

Tests rapidesTests ELISA 4 me gnration Avantages facilit demploi, stockage temprature ambiante, ralisable en tout lieu, tout endroit rsultats satisfaisants en termes de sensibilit et de spcificit lors de la phase chronique de linfection grande sensibilit y compris en primo- infection excellente spcificit facilement valuable sur les panels congels, automatisables haut dbit Raliss 37 prix avantageux traabilit et enregistrement informatique des rsultats. Inconvnients manque de sensibilit dans les phases prcoces de linfection manque de traabilit, les rsultats ne pouvant tre enregistrs, subjectivit de lecture problme dlimination des dchets infectieux si utiliss en dehors des circuits de soins habituels prix gnralement lev ncessit de chanes de froid dlectricit et de structures minimales de laboratoire Avantages et limites des systmes de dpistage pour le VIH

R-valuation des 4 tests CE Sur sang total et du test salive et du Determine 4eme gnration en cours St Louis (JM Molina- W Rozembaum F Simon) 4 tests marqus CE pour lutilisation sur sang total, un pour la salive Determine Inverness Insti Biolytical OraQuick sang et salive Vikia bioMrieux

Resultats - patients VIH+ * p 0.02 - 60 tests ont t lus comme ngatifs particulirement avec Oraquick salive - 36 patients, soit 20B, 13 non B, 2HIV-2, 1 HIV0 - taux lev dinvalides avec le Determine 4 th - Aucune dtection dag p24 Ag y compris lors des primo infection y compris en prsence confirme de p24 sur srum 380pg/ml n =200Oraquick Oral fluid Oraquick blood Vikia blood Determine blood Determine 4 th blood INSTI blood Negatif271131072 Douteux1061174 Invalide0004332 Positif163183196185153192 Sensibilit86.5% *94.5%98.5%94.9%95.8%99%

Limites des TDR Difficult dvaluation sur sang total et salive des primo infections Sensibilit moindre (primo-infection) que les tests Elisa donc risque de faux-ngatifs y compris dans les mois suivants la sroconverion en EIA frquence des faux positifs Lecture subjective Archivage difficile (photo ? ) Ngligence des autres IST, absence de TDR pour HBV marqu CE obligeant EIA, cots

Un TDR ngatif 3 mois aprs lexposition suppose signera labsence dinfection pour ce risque Ce dlai est li la moindre sensibilit des TDR en primo infection et lincidence des VIH dans notre pays couple la diversit gnotypiques des souches en circulation Quand rendre un TDR ngatif par rapport un risque

TDR Sang total + ou +/- HIV ngatif Sauf exposition VIH dans les 3 mois prcdents ou situations dimmunosuppression profonde ou de variants rares Recherche Ac ant VIH-1 et VIH-2 et d Ag P24 par un test Elisa 4me gnration (EIA) et par un Western Blot (WB) HIV positif EIA + & WB + Infection VIH confirme A diffrencier entre VIH-1 et VIH-2 - raction non spcifique - Erreur didentification Primo-infection Probable ou VIH-2 TDR Sang total - Nouveau prlvement Nouveau contrle srologique et explorations complmentaires = ARN, suspicion variants EIA WB + ou - EIA + WB + EIA + WB +/- ou -

Aids, test at home for HIV, 21,95 a reliable, fast and discret test

Quantification des CD4

Minicytomtres de flux Apoge A40 Easy Guava CD4Cyflow Counter

Charge virale ARN VIH-1 Suivi biologique de linfection VIH-1 Quantification ARN VIH-1 Plasma EDTA (LCR)

Plasma RNA VIRAL LOAD Ultra sensitive HIV-1P24 Cavidi RT ExaVir Quantification du VIH en PED

La charge virale : une rfrence A D C A D C CRF02 A C D CRF01 F G H J K, CRF11-cpx Group O N P CRF02-AGVIH-2 C Branched DNA (Versant) RT rt PCR (NexSys ; 2010) RT PCR (Monitor) Easy V V1.0, 1.2 RT PCR (LCx HIV RNA) RT rt PCR (m2000rt) NASBA RT rt PCR ( in house ) Siemens RT rt PCR (TaqMan 48) V2.0 RT rt PCR (TaqMan 48) Easy V V 2.0 2010 Re commercialis en Afrique

DBS & DPS pour la charge virale et la rsistance Peut on pooler les plasma pour une surveillance ? Pourrait amliorer le monitoring sans altrer la sensibilit. Richman DDRichman DD, Benson CA, Little SJ et al AIDS. 2009 Oct 23;23Benson CALittle SJ Dried Serum Spots from 47 drug nave and 15 treated patients VL > 100,000 protease 100% RT 100% 10000

Le premier test rapide pour la dtection de lantigne p24 manque de sensibilit Problme de dtection des non B AgP24 (pg/ml) > 400400-100100-5050-5 Rfrence EIA P24 VIDAS 64 517 Determine 4eme G Ag POSITIF 43 10 JC Tardy, Lyon 2009 32 HIV-1 p24 positive sera by EIA Les amliorations de ce type de tests sont en cours. A surveiller

Principe du test HIV RT Cavidi Exavir :

Principe du test HIV RT Cavidi Exavir : 2

Simon et al, AIDS. 2003 Feb 14;17(3):331-6.

HIV RNA copies/ml Number of samples % detected Vs. 3 (n) 50 -4004271% (30) 401 -2,0003692% (33) 2001 -10,0003597% (35) 10,001 -50,0004698% (45) >50,00042100% (42) Cavidi ExaVir Load V 3.0 JCM Accepts, published online 2009

Plasma RT activity assay for HIV viral load Simon et al, AIDS. 2003 Feb 14;17(3):331-6.

Trousse PCR rt ExaVirLoad version 2 ELISA ultra sensible manufacturer Abbott - Roche bioMrieux CavidiPerkin Elmer Principe real time PCR Activit transcriptase inverse (Seuil 400 copies/ml) Antignmie p24 sensibilise (Seuil 400 copies/ml) Detection Internal control of procedure ELISA targets Pol LTR (NEC152/NEC131) Gag LTR+Gag polgag Sous-types du VIH-1 ? M (A to G) + O + VIH-2 M (A to G) + O ? FDA CE IVD Yes No Timing for results4-6 h 2,5 days 3 h machinery 30000 + Maintenance (5000 /y) 10 000 Cost/test15 $ [10-15 ]15 10

Is Routine Laboratory Monitoring of Patients on HAART Necessary to Improve Treatment Outcomes?

Is Routine Laboratory Monitoring of Patients on HAART Necessary to Improve Treatment Outcomes? The DART Study DART compares outcomes in patients on antiretroviral therapy according to whether they received routine laboratory and clinical monitoring (LCM), or clinically driven monitoring (CDM) alone. LCM group would be monitored in a manner similar to how patients in the developed world are monitored, CDM group would be managed according to clinical symptoms only, without routine access to laboratory tests. James G. Hakim, MBChB, MMed, MSc, FRCP:

Is Routine Laboratory Monitoring of Patients on HAART Necessary to Improve Treatment Outcomes? 3316 participants in Uganda and Zimbabwe World Health Organization (WHO) stage II, III, or IV HIV disease, CD4+ cell count < 200 cells/mm3 Patients were randomized on a 1 to 1 basis to the 2 study arms. Twelve-weekly biochemistry analyses, full blood counts, and CD4+ cell count were conducted in both study arms. Results of all these tests were provided in the LCM arm, CDM arm, results were only provided if clinically indicated or if there was grade 4 toxicity. CD4+ cell count results of patients in the CDM arm were not provided to physicians under any circumstances. James G. Hakim, MBChB, MMed, MSc, FRCP:

Results median CD4+ cell count 86 cells/mm3. more than three quarters had either WHO stage III or IV disease. Most received tenofovir with zidovudine/lamivudine (74% to 75%); 16% in each arm received nevirapine and 9% received abacavir. After 5 years of follow-up, survival rates were high in both study arms90% in the LCM arm vs 87% in the CDM arm. However, access to laboratory monitoring in the LCM arm was associated with a small but significant reduction in survival (hazard ratio [HR] CDM:LCM: 1.35; 95% confidence interval [CI]: 1.10-1.65; P =.004), difference was observed only after 2 years of treatment. James G. Hakim, MBChB, MMed, MSc, FRCP:

2009 Revisions of WHO recommendations on use of Antiretroviral Therapy (ART) HIV/ATC October 2009

Proposed WHO 2009 Criteria for the ART Initiation in adults and adolescents (ART Guidelines Meeting, October/2009) Clinical SituationART initiation Recommendations Quality of Evidence Strength of Recommendatio n WHO clinical stage 3 or 4Start ART irrespective of CD4 Moderate- High Strong WHO clinical stage 1 or 2Need CD4 to decideVery LowStrong CD4 < 350 cells/mm 3 Start ART irrespective of WHO stage ModerateStrong Active TBStart ART irrespective of CD4 ModerateStrong PregnancyStart ART for stage 3/4 or CD4 < 350/mm 3 ModerateStrong Active chronic hepatitis BStart ART irrespective of CD4 LowStrong

Proposed WHO 2009 Preferred Regimens for ART Initiation in adults and adolescents (ART Guidelines Meeting, October/2009) Clinical Situation Preferred ART Regimen Quality of Evidence Strength of Recommendatio n ARV naive HIV+ Adults AZT+3TC+NVP or TDF+3TC/FTC+EFV Moderate Strong ARV naive HIV+ Adolescents AZT+3TC+NVP or AZT+3TC+EFV Moderate Strong ARV naive HIV+ pregnant women AZT+3TC+NVP or AZT+3TC+EFV (2 nd trimester onwards) Moderate Low Strong Weak NVP exposed HIV+ pregnant women (no ARV tail, < 12 months) PI containing regimen 3 NRTI Low Very Low Strong Weak ART Naive HIV + with active TB AZT+3TC+EFV or TDF+3TC/FTC+EFV Moderate Strong ART naive HIV+ with active chronic hepatitis B TDF+3TC/FTC+ EFV or TDF+3TC/FTC+ NVP Moderate Strong

Recommendations on Lab Monitoring Recognise and describe the following phases of HIV management : Phase of HIV managementRecommendedDesirable At HIV diagnosisCD4HBsAg, ?HCV test Pre ARTCD4 (6 monthly)Viral Load At start of ARTCD4 Hb for AZT Renal screen for TDF On ARTCD4Viral load At clinical failureCD4Viral load At immunological failureViral load Hb recommended prior to AZT use. TDF can be used in absence of renal screening or monitoring (benefits outweigh the risks). Symptom directed laboratory monitoring for toxicity is recommended. Simplified algorithms for ART failure being developed and evaluated. Viral load threshold of 5000 copies /ml used for detect or confirm treatment failure.

RESISTANCE AUX ANTIRETROVIRAUX

Modlisation de la cintique de dcroissance de la charge virale plasmatique chez un patient qui dbute un traitement antirtroviral efficace Dure du traitement antirtroviral efficace (jours) Seuil de dtection Charge virale en ARN plasmatique 1re phase (T1/2 : 1 jour) 2me phase (T1/2 : 14 jours) Rplication virale rsiduelle Virus issus du rservoir lymphocytaire Eradication ?

Taux derreur de la TI: 1/10.000 nuclotides Production virale: 10 9 -10 10 particules par jour Toutes les mutations pr-existent avant traitement Taux de recombinaison: 5 10 vnements par cycle Evolution constante de la quasiespce Demie-vie dun virus plasmatique = 0.3 jours Demie-vie des cellules infectes = 2.2 jours Pourquoi y a til slection de virus rsistants ?

Pression de slection antirtrovirale Slection de variants rsistants Suppression incomplte Dfaut de puissance Taux plasmatiques insuffisants Dfaut dobservance Pr-existence de rsistance Charge virale Temps Variants sensibles Variants rsistants Dbut du traitement

Mutations de rsistance Prsentes dans les gnes cibles des antirtroviraux : -->TI, protase, gp41, intgrase Elles confrent un avantage rplicatif aux virus en prsence de drogues : -->slection de variants muts Certaines ont un effet ngatif sur la fonction de lenzyme M184V (sauvage) position (mut)

Facteurs influenant le profil de rsistance Barrire gntique de lantirtroviral Concentration de lantirtroviral (plasma, compartiment) Combinaison antirtrovirale (drogues associes) Niveau de charge virale Sous type viral VIH-1

Analyse des mutations des gnes RT, protase, gp 41 VIH-1 associes la rsistance aux traitements antirtroviraux Gnotype de rsistance -VIH1 Choix du premier traitement Gestion des checs virologiques

Mutations aux INTI Didanosine Emtricitabine Lamivudine Stavudine Zidovudine Abacavir Tenofovir www.iasusa.org

u Liste International AIDS Society USA (www.iasusa.org) Corrlation avec donnes phnotypiques u Algorithmes dinterprtation groupe rsistance AC11 - ANRS (www.hivfrenchresistance.org) Corrlation avec rponse clinique Stanford University (www. hivdb.stanford.edu) Pondration des mutations Gnotype de rsistance -VIH1 Analyse des mutations de rsistance gnes RT, protase, gp41, intgrase Interprtation complexe

INDICATIONS DES TESTS DE RESISTANCE (Rapport Yni 2008) RECOMMANDE Primo-infection Ds le diagnostic ou avant initiation du traitement Tous les checs thrapeutiques (rplication virale sous traitement) Grossesse Nouveau-n Enfant (diagnostic et chec) NON RECOMMANDE AES Accident dexposition au sang/sexe

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